CN115873717B

CN115873717B - 一株黑曲霉及其在改善发酵海水鱼风味和口感中的应用

Info

Publication number: CN115873717B
Application number: CN202211176055.9A
Authority: CN
Inventors: 王悦齐; 吴燕燕; 汪慧芳; 陈胜军; 赵永强; 杨少玲; 李春生
Original assignee: South China Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy Fishery Sciences
Current assignee: South China Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy Fishery Sciences
Priority date: 2022-09-26
Filing date: 2022-09-26
Publication date: 2023-06-23
Anticipated expiration: 2042-09-26
Also published as: CN115873717A

Abstract

本发明公开了一株黑曲霉及其在改善发酵海水鱼风味和口感中的应用，涉及食品微生物领域。该黑曲霉于2022年7月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.40251，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明利用筛选培养基从发酵梅香鱼中筛选出一株黑曲霉MXL‑21，通过接种该黑曲霉获得的发酵金鲳鱼和发酵海鲈鱼，具有传统发酵梅香鱼特有的香气；与自然发酵金鲳鱼和发酵海鲈鱼相比，挥发性风味化合物的含量和种类均增加。此外，通过接种该黑曲霉发酵海水鱼可以提高发酵海水鱼肉质的弹性和咀嚼性，改善快速发酵海水鱼的风味和口感。

Description

一株黑曲霉及其在改善发酵海水鱼风味和口感中的应用

技术领域

本发明涉及食品微生物领域，特别是涉及一株黑曲霉及其在改善发酵海水鱼风味和口感中的应用。

背景技术

海产品作为全球粮食系统中贸易量最大的商品之一，在1998年至2018年的20年间，全球人均鱼类消费量和食用重量均增加了约1.3倍。直至本世纪中叶，全球人们对鱼类的需求还将增加近一倍。除直接烹饪外，借助腌制发酵、熏制等加工方式制成的相关产品，如干腌鱼和熏鱼等，因其风味独特，深受消费者青睐。

发酵鱼制品是由来自加工环境和原料中的功能性和非功能性微生物群落的相互作用下自发发酵生成。在发酵过程中，微生物群及其酶系对脂质和蛋白质进行水解，促进了其风味或风味前体物质的形成。事实上，制作这些产品的最初目的是为了更好地贮藏易腐烂的鱼制品，但现代社会人们对水产品进行加工则更侧重于追求产品的独特风味。

一系列研究表明通过特定的发酵食品分离得到的本土菌株，不仅具有一定的安全性和环境适应性，将其应用到特定发酵食品中也可进一步改善该食品的风味和口感。传统发酵鱼制品在生产过程中受技术水平、加工条件等因素的限制，依然存在发酵周期长、风味不稳定等问题。因此，从传统发酵鱼制品中筛选出具有较高酯合成酶活性的本土微生物，在将其应用到发酵鱼制品中，对提升发酵鱼制品的风味品质具有重要的意义。黑曲霉是一种广泛运用于食品发酵的真菌。目前，已在酱油的生成中得到广泛的研究及应用，然而尚未出现关于在发酵海水鱼产品中快速改善发酵海水鱼风味和口感的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一株黑曲霉及其在改善发酵海水鱼风味和口感中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明筛选得到一株黑曲霉，将其作为发酵剂接种于海水鱼中进行发酵，可以促进发酵海水鱼中风味物质的生成，达到改善产品风味和口感的作用。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一株黑曲霉(Aspergillus niger)MXL-21，于2022年7月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.40251，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明还提供一种发酵剂，包括上述的黑曲霉。

本发明还提供上述的黑曲霉或发酵剂在制备发酵海水鱼中的应用。

进一步地，所述应用为促进发酵海水鱼中风味物质的生成和改善发酵海水鱼的口感。

进一步地，所述风味物质包括醛类、酮类、醇类、酯类和吡嗪类风味物质。

本发明还提供一种利用上述的黑曲霉改善发酵海水鱼风味和口感的方法，包括以下步骤：

(1)将所述黑曲霉活化培养后，用无菌生理盐水调整浓度为10⁵-10⁷cfu/g，制备成发酵剂；

(2)海水鱼在所述发酵剂中浸泡后，再以传统盐腌发酵的方式密封发酵，得到发酵海水鱼产品。

进一步地，在步骤(1)中，所述活化培养的培养基为YEPD培养基。

进一步地，在步骤(1)中，所述活化培养的培养条件为：30℃，48h。

进一步地，在步骤(1)中，所述发酵剂的菌浓度为10⁵-10⁷cfu/g。

进一步地，在步骤(2)中，所述浸泡的时间为3-4h。

本发明公开了以下技术效果：

本发明利用筛选培养基从发酵梅香鱼中筛选出一株黑曲霉MXL-21，在鱼汁模拟发酵的实验中，其总酯含量相比其他菌株更多。通过接种该黑曲霉获得的发酵金鲳鱼和发酵海鲈鱼，具有传统发酵梅香鱼特有的香气；与自然发酵金鲳鱼和发酵海鲈鱼相比，挥发性风味化合物的含量和种类均增加。此外，通过接种该黑曲霉发酵海水鱼，可以提高发酵海水鱼肉质的弹性和咀嚼性，改善快速发酵海水鱼的风味和口感。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为黑曲霉MXL-21及其他菌株发酵液总酯含量测定；图中a，b，c表示显著性差异(P<0.05)；

图2为黑曲霉MXL-21及其他菌株模拟发酵总酯含量测定；图中a，b，c表示显著性差异(P<0.05)；

图3为黑曲霉MXL-21的碱性吕氏美蓝染液染色结果；

图4为利用黑曲霉MXL-21的26s rRNA鉴定结果构建的统发育树。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

以下实施例中用到的培养基如下：

酵母膏胨葡萄糖琼脂(YPD)(g/L)：葡萄糖20.0g，酵母膏10.0g，蛋白胨20.0g，琼脂粉15.0g，自然pH值，121℃灭菌15min。

酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(YEPD)(g/L)：葡萄糖20.0g，酵母膏10.0g，蛋白胨20.0g，自然pH值，121℃灭菌15min。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)(g/L)：马铃薯200.0g(去皮切块，加水煮沸30min，用八层纱布收集滤液)补满1L，葡萄糖20.0g，琼脂15.0g，自然pH，121℃灭菌15min。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖10.0g，胰蛋白胨10.0g，酵母浸粉5.0g，KH₂PO₄6.0 g，K₂HPO₄2.0 g，MgSO₄·7H₂O 1.0g、橄榄油聚乙烯醇乳化液120mL。(橄榄油乳化液的配置：称取聚乙烯醇4.0g，加水200mL，在沸水浴中加热，搅拌直到溶解，冷却后过滤定容到200mL。将橄榄油与聚乙烯醇溶液按照1:3的体积比混合，再按照15mL/100mL的比例往混合后的溶液中加入吐温80，在组织混匀器上乳化5min，间隔5min，再乳化5min，即可得到橄榄油乳化液，橄榄油乳化液要现配现用。)

实施例1

1、产酯黑曲霉的分离：

本实施例的产酯黑曲霉MXL-21，是从传统发酵梅香鱼中分离筛选获得，具体的分离方法是：

(1)首先，称取发酵梅香鱼肉25g到225mL无菌生理盐水中，用均质机拍打，吸取均浆液1mL置入装有100mLYEPD培养基的三角瓶中，30℃、180r/min摇床培养1～2d至培养基出现浑浊，进行富集培养。接着，将富集培养液用无菌水梯度稀释(10^-5、10^-6、10^-7)，取0.1mL菌液涂布于YPD培养基上，30℃培养3d，获得疑似菌株。之后，将疑似菌株进一步在YPD培养基上划线纯化多次，至纯种为止。最后，将疑似菌株接种于YPD斜面培养基，30℃下培养3d，保藏于4℃，进行后续形态观察及鉴定。

(2)感官筛选

将上述菌株接种到PDA平板上，30℃培养72h，感官分析筛选出使平板具有明显香味(酯香、醇香等)的菌株。

(3)理化筛选

将目的菌株接种在YEPD培养基中，按2％的比例接种于20mL PDA培养基中，30℃、180r/min培养72h后，利用皂化回流法测定总酯含量。测定总酯含量步骤如下：取4mL发酵液置于150mL三角瓶中稀释10倍加2滴酚酞指示剂，用0.1mol/L的NaOH滴定至刚显微红色(不可过量)，再准确加入25mL0.1 mol/L的NaOH。沸水浴中回流皂化0.5h冷却，立即用0.1mol/L的HCl滴定至红色刚好消失为止记下消耗的HCl体积。

总酯含量(以乙酸乙酯计.g/100mL)的计算如下:

式中：N₁为NaOH浓度；N₂为HCl浓度；V₁为滴定用HCl消耗体积；88.12为乙酸乙酯的摩尔质量(g/mol)。

结果分析：通过PDA培养基培养72h根据感官筛选出能产生较明显的酯香、醇香或其他香气的4株菌株：MXL-11、MXL-16、MXL-17和MXL-21。采用皂化回流法对感官嗅闻生香能力较强的4株菌进行总酯的测定，结果见图1。由图1可知，培养72h后发酵液中MXL-21的总酯含量最高为1.52g/100mL。

2、鱼汁模拟发酵

将新鲜的金鲳鱼清洗处理，按鱼块与水质量比为1:10混合，使用匀浆机进行均质。之后，将混合物煮沸，使用纱布进行过滤，将滤液离心得到上清液。加入1wt％的葡萄糖和2wt％的氯化钠，进行灭菌，得到鱼汁发酵培养基。

将MXL-11、MXL-16、MXL-17和MXL-21分别接种在YEPD培养基中进行活化，通过离心机10000r离心4min收集每个菌株的沉淀物，用无菌水洗涤两次，并重新悬浮在与离心的发酵液相同体积的无菌水中，以2％的接种量分别接种在20mL鱼汁发酵培养基中进行发酵实验，30℃，180r/min培养72h。

结果分析：由图2可知，培养72h后模拟发酵液中MXL-21的总酯含量最高，为0.94g/100mL。这个结果在一定程度上说明了MXL-21可能有助于提高发酵鱼中的酯类物质。

3、菌株的鉴定：

使用碱性吕氏美蓝染液对MXL-21进行染色观察，结果见图3。对MXL-21的26srRNA进行鉴定，经系统分类鉴定，系统发育树如图4所示，鉴定为黑曲霉。将该菌株命名为黑曲霉MXL-21，于2022年7月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.40251，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

经26S rRNA基因序列鉴定，测序结果(SEQ ID NO.1)如下：

AAGCGGAGGAAAAGAAACCAACCGGGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAGAGCTCAAATTTGAAAGCTGGCTCCTTCGGGGTCCGCATTGTAATTTGCAGAGGATGCTTCGGGTGCGGCCCCCGTCTAAGTGCCCTGGAACGGGCCGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTCTTGGGCGGGGTGTCCGTGCCCGTGTGAAGCTCCTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAATGGGTGGTAAATTTCATCTAAAGCTAAATACTGGCCGGAGACCGATAGCGCACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTTAAACAGCACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGCGCTTGCGACCAGACTCGCCCGCGGGGTTCAGCCGGCATTCGTGCCGGTGTACTTCCCCGCGGGCGGGCCAGCGTCGGTTTGGGCGGCCGGTCAAAGGCCCCTGGAATGTAGTGCCCTCCGGGGCGTCTTATAGCCAAGGGTGCAATGCGGCCAGCCTGGACCGAGGAACGCGCTTCTGCACGGACGCTGGCATAATGG。

实施例2

1.发酵剂的制备：

将MXL-21在YEPD中，30℃活化48h，10000rpm离心4min收集这株菌的沉淀物，用无菌生理盐水配制成10⁵cfu/g浓度(10⁵-10⁷cfu/g可达相同效果)的发酵剂。

2.原料鱼的发酵：

首先，将新鲜金鲳鱼和海鲈鱼清洗处理，备用。其次，将两种鱼分别在步骤1制备好的发酵剂中浸泡3h(3-4h可达相同效果，以不接菌发酵作为对照)。最后，将鱼的体表及腹腔用海盐涂抹均匀，用盐量为鱼重量的25％(25-30％可达相同效果)，分层放置在发酵池中以传统盐腌发酵的方式进行常温密封发酵。

利用静态顶空-固相微萃取-气相色谱-质谱联用(HS-SPME-GC-MS)技术对发酵鱼制品的酯类挥发性风味组分进行鉴定，测定方法如下：

称取5±1g样品置于20mL萃取瓶中，接着加入100μL的三甲基吡啶(50μg/mL)作为内标。将萃取瓶密封，在60℃水浴中以300rpm的搅拌速度平衡20min后，在相同温度下使用50/30μm二乙烯基苯-羧基-聚二甲基硅氧烷(DVB-CAR-PDMS)萃取挥发物30min。萃取针使用前，在气质进样口活化20min(250℃)。随后，通过配备INNOWAX(0.25mm*0.25μm*60m)色谱柱的Agilent 7890A-5975C气相色谱仪检测挥发性化合物。不分流进样，氦气用作载气，流速为1.2mL/min。初始柱温箱温度为40℃，保持5min后，以5℃/min将温度升至240℃，接着继续以10℃/min升温至250℃并保持6min。质谱仪运行于电子碰撞电离模式，四级杆温度和离子源温度分别设置为150℃和230℃，电子能量为70eV。扫描范围为29～550da。

对发酵鱼制品的挥发性风味组分进行鉴定与分析，其结果如表1所示：

与自然发酵相比，通过发酵黑曲霉发酵的金鲳鱼和海鲈鱼的醛类、酮类、醇类、酯类和吡嗪类等风味物质的种类和含量显著增加。这些物质具有类似麦芽、奶酪样、蘑菇味和坚果味等香气。结果表明发酵黑曲霉有助于提高快速发酵海水鱼的独特风味。借助质构分析仪对4组发酵鱼制品的硬度、弹性和咀嚼性进行测定，其结果如表2所示：与对照组相比，接种了发酵黑曲霉发酵的金鲳鱼和海鲈鱼的硬度均有适当程度的降低，鱼肉的弹性和咀嚼性均提高，说明发酵黑曲霉可以改善快速发酵海水鱼肉的口感，提高鱼肉的质地。

表1

表2

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一株黑曲霉（Aspergillus niger）MXL-21，其特征在于，于2022年7月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.40251，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

2.一种发酵剂，其特征在于，包括权利要求1所述的黑曲霉MXL-21。

3.一种如权利要求1所述的黑曲霉MXL-21或权利要求2所述的发酵剂在制备发酵海水鱼中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用为促进发酵海水鱼中风味物质的生成和改善发酵海水鱼的口感。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述风味物质包括醛类、酮类、醇类、酯类和吡嗪类风味物质。

6.一种利用权利要求1所述的黑曲霉MXL-21改善发酵海水鱼风味和口感的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将所述黑曲霉MXL-21活化培养后，用无菌生理盐水调整浓度为10⁵-10⁷ cfu/g，制备成发酵剂；

（2）海水鱼在所述发酵剂中浸泡后，再以传统盐腌发酵的方式密封发酵，得到发酵海水鱼产品。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述活化培养的培养基为YEPD培养基。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述活化培养的培养条件为：30 ℃，48 h。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤（2）中，所述浸泡的时间为3-4h。