CN108315271A - 一种酵母及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一酵母Saccharomyces sp.ZB118，其保藏编号为GDMCC No：60280。该酵母Saccharomyces sp.ZB118具有很好的增香效果，将其用于酿造酱油等发酵型调味品，可以产生大量醇类、酯类等小分子物质和4‑乙烯基‑2‑甲氧基苯酚等特征酚类香气物质，得到的产品酱香浓郁，产品风味得到显著提升。

Description

一种酵母及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种酵母及其在制备发酵食品中的应用。
背景技术
近年来，随着人们生活水平的提高和健康保健意识的提高，消费者对酱油产品的风味和品质也提出了更高的要求。酱油的风味是酱油的色泽、香气、滋味和体态的综合体现，其中香气是决定酱油风味的重要因素。
目前改善酱油风味的主要手段是在发酵过程中添加增香酵母。例如，申请号为CN02130626.5的专利申请公开了一种在发酵后期人为添加鲁氏酵母和球拟酵母来提高风味方法；申请号为CN201010259885.9的专利申请公开了一种用增香酵母菌提升酱油风味的方法。在发酵过程中添加增香酵母对香气有一定的改善，但风味比较单一，而且这些增香酵母所产生的香气物质主要是酯香和醇香类物质。优良的增香酵母菌种，尤其是酱香型酵母比较缺乏。
4-乙烯基-2-甲氧基苯酚是酱油中的重要香气成分，能显著提高酱油的品质。目前在酱油发酵中能产生4-乙烯基-2-甲氧基苯酚的微生物主要是假丝酵母菌(俗称球拟酵母)。这类酵母产生的香气个人嗜好性较强，在产生4-乙烯基-2-甲氧基苯酚的同时还会产生一些令人不愉悦的气味，并且发酵不易控制，因此应用受到限制。筛选出能产生4-乙烯基-2-甲氧基苯酚的适合酱油发酵的增香酵母，将有助于进一步提升酱油品质。
发明内容
本发明人通过筛选、诱变从优良酱醪中得到一株增香酵母，该酵母具有很好的增香效果，在发酵中可以产生大量醇类、醛类等小分子物质和4-乙烯基-2-甲氧基苯酚等特征酚类香气物质，得到的产品酱香浓郁，能够显著提升酱油、发酵酱等发酵型调味品的风味。
本发明涉及一种酵母Saccharomyces sp.ZB118，其保藏编号为GDMCC No：60280。该酵母被命名为Saccharomyces sp.ZB118,已于2017年11月17日保藏至广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大为GDMCC No：60280。
本发明提供的酵母Saccharomyces sp.ZB118具有以下特征：在麦芽汁琼脂平板上，在30℃条件下培养3天，菌落呈奶酪状，浅褐色，表面平滑，不透明，不反光，边缘整齐，圆形，菌落直径3-5mm。
在麦芽汁液体培养基中，25℃条件下培养2天，菌体浑浊，无菌璞，不产膜，具有丁香气味，有酱香，无不良气味。菌体在5000×电子显微镜下观察，酵母细胞为球形或卵圆形，能看见明显芽体。
本发明还涉及所述的酵母Saccharomyces sp.ZB118在制备发酵食品的用途。
本发明还涉及所述的酵母Saccharomyces sp.ZB118在制备调味料(包括发酵型调味品，例如酱油、酱、醋、豆豉或腐乳等)中的用途。
本发明还涉及一种制备发酵食品的方法，其包括：使用所述的酵母Saccharomycessp.ZB118的步骤。
在一个实施方案中，本发明所述的制备发酵食品的方法，包括以下步骤：
1)制曲，得到成曲；
2)向成曲中加入盐水，混合制成酱醪或酱醅；
3)向酱醪或酱醅中加入所述的酵母Saccharomyces sp.ZB118，发酵。
本发明还涉及一种制备调味料(包括发酵型调味品，例如酱油、酱、醋、豆豉或腐乳等)的方法，包括使用所述的酵母Saccharomyces sp.ZB118的步骤。
在一个实施方案中，本发明所述的制备调味料(包括发酵型调味品，例如酱油、酱、醋、豆豉或腐乳等)的方法，包括以下步骤：
1)制曲，得到成曲；
2)向成曲中加入盐水，混合制成酱醪或酱醅；
3)向酱醪或酱醅中加入所述的酵母Saccharomyces sp.ZB118，发酵。
本发明还涉及一种制备酱油的方法，包括以下步骤：
1)制曲，得到成曲；
2)向成曲中加入盐水，制成酱醪；
3)向步骤2)所获得的酱醅中加入权利要求1所述的酵母Saccharomycessp.ZB118，发酵；或者，
先发酵步骤2)所获得的酱醅，当酱醪的pH值小于或等于5.5时，向酱醪中加入权利要求1所述的酵母Saccharomyces sp.ZB118，继续发酵。
优选地，发酵温度为25～35℃，例如30℃；
优选地，制曲的原料为豆粕和小麦(例如炒小麦)的混合物或者黄豆和面粉的混合物；
进一步优选地，豆粕和小麦的重量比为1:0.8～1.2，例如1:1；
进一步优选地，黄豆和面粉的重量比为1:0.8～1.2，例如1:1；
优选地，所述的酵母Saccharomyces sp.ZB118的添加量为(0.1～10)×106个/g酱醪。
在一个实施方案中，本发明所述的制备酱油的方法，其中发酵温度为25～35℃，例如30℃。
在另一个实施方案中，本发明所述的制备酱油的方法，其中制曲的原料为豆粕和小麦(例如炒小麦)。豆粕和小麦的重量比优选为1:0.8～1.2，例如1:1。
在另一个实施方案中，本发明所述的制备酱油的方法，其中制曲的原料为黄豆和面粉。黄豆和面粉的重量比优选为1:0.8～1.2，例如1:1。
在另一个实施方案中，本发明所述的制备酱油的方法，其中步骤3)中所述的酵母Saccharomyces sp.ZB118的添加量为(0.1～10)×106个/g酱醪。
在另一个实施方案中，本发明所述的制备发酵酱的方法，其中步骤3)中所述的酵母Saccharomyces sp.ZB118的添加量为(0.1～10)×106个/g酱醅。
本发明还涉及一种调味料，由本发明所述的制备调味料的方法制备得到。
本发明还涉及一种酱油，由本发明所述的制备酱油的方法制备得到。
本发明还涉及一种发酵食品，本发明所述的制备发酵食品的方法制备得到。
本发明中，所述的发酵食品是指利用微生物加工制造的食品，包括酸奶，干酪，酒酿，泡菜，酱油、酱、醋、豆豉或腐乳等发酵型调味品，黄酒，啤酒，葡萄酒等。
本发明提供的酵母Saccharomyces sp.ZB118是一株增香酵母，具有很好的增香效果，将其用于酿造酱油等发酵型调味品，可以产生大量醇类、醛类等小分子物质和4-乙烯基-2-甲氧基苯酚等特征酚类香气物质，得到的产品酱香浓郁，柔和醇厚，整体风味更加和谐。
应用本发明提供的酵母Saccharomyces sp.ZB118酿造酱油，可快速高效产生香气物质4-乙烯基-2-甲氧基苯酚，减少酱油生产中香精香料的使用。所得酱油中的关键指标乙醇含量在1.5％～3.5％之间，4-乙烯基-2-甲氧基苯酚在1.5～4ppm之间，同时还有苯乙醇、异戊醇等香气物质，该酱油香气浓郁，口感醇厚，口感和香味评定优于现有技术。
将本发明提供的酵母Saccharomyces sp.ZB118应用于酱油或发酵酱等发酵型调味品的生产，能显著提高酱油等发酵型调味品的香气，并缩短发酵周期，解决现代酱油风味单一问题。同时酵母培养成本低，发酵工艺操作简单，适宜大规模工厂化生产和高端酱油酿制，应用前景广阔。
本发明的有益技术效果
本发明提供的酵母Saccharomyces sp.ZB118具有很好的增香效果，将其用于酿造酱油等发酵型调味品，具有以下一个或多个优点：
1)能够显著提高产品中4-乙烯基-2-甲氧基苯酚等特征酚类香气
物质的含量，产品酱香浓郁；
2)可以提高产品中醇类、醛类等小分子物质的含量；
3)所得产品酱香浓郁，柔和醇厚，整体风味更加和谐；
4)所得产品品质得到提升；
5)酵母培养成本低；
6)发酵工艺操作简单；
7)发酵周期短；
8)适宜大规模工厂化生产。
附图说明
本发明采用以下附图来举例说明本发明的有益效果。应当理解的是，这些仅用于说明本发明的具体实施方案，并不意图限制本发明的范围。
图1为酵母Saccharomyces sp.ZB118的筛选流程图。
图2为酵母Saccharomyces sp.ZB118在麦芽汁琼脂平板上的生长状况。
图3为在5000×电子显微镜下观察到的酵母Saccharomyces sp.ZB118。
图4为添加不同菌种所得酱油的香气、口感评定结果。
图5为添加不同菌种所得酱油中的香气物质种类对比图。
图6为添加不同菌种所得酱油中的香气成分分析对比图。
图7为添加和未添加酵母Saccharomyces sp.ZB118所得酱油的风味对比图。
生物保藏信息
本发明的酵母Saccharomyces sp.ZB118，于2017年11月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，邮政编码：510075，保藏号为GDMCC No：60280。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。除非特别说明，实施例中采用的试剂、方法和设备均为本技术领域常规试剂、方法和设备。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用材料、试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
除非特别说明，本发明实施例所用培养基和试验条件为本领域常规培养基和试验条件。
本发明中，所述百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1酵母的筛选、诱变及鉴定
发明人从佛山市海天调味食品股份有限公司的酱醪中分离并经过紫外、常压等离子体诱变等技术得到一株能产4-乙烯基-2-甲氧基苯酚的菌株，筛选诱变流程参见图1。经鉴定该菌株是一种酵母，将其命名为ZB118，分类名称为Saccharomyces sp.。
在实际生产过程中，发明人发现部分发酵罐的酱醪的风味明显优于其他发酵罐，主要表现为酱香浓郁、口感协调、风味独特。发明人采集优质酱醪，对其进行筛选及诱变，具体方案如下：
取50g酱醪，加至450g无菌水中混合均匀成悬浊液。将悬浊液用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释5～7个梯度。取0.1mL稀释液涂布至含盐量10％(w/w)的PDA琼脂培养基，30℃培养至平板上产生直径约1mm的菌落。挑选平板中的单菌落划线分离3次后，转接至PDA琼脂培养基进行保种操作。
将分离纯化得到的菌种接种至酱油培养基(酱油稀释10倍后，添加1％的葡萄糖、1％的酵母粉，调节pH为5.0，调节盐浓度至20％(w/w))中进行耐盐性发酵测试。于30℃、180rpm震荡培养72h。对发酵样品进行过程记录，选择在含盐培养基能够快速增殖的菌株。筛选出耐盐性较好，生长较迅速，所得培养液经感官鉴评后风味优良的菌种，取在12～24小时能够在培养基中形成明显的浑浊，且发酵结束后发酵液的酱香更加浓郁的菌株为初筛合格菌株(共计32支)。
所选初筛合格的32支菌株，在酱油曲料固态制曲完成后，将初筛菌株按0.1％(w/w)的添加量加至曲料中进行高盐稀态发酵。经180天自然发酵后，过滤后取澄清酱油原液进行感官鉴评及指标检测。优选出风味最好的菌株为目标菌株，命名为ZB001。
将ZB001菌株进行紫外、ARTP(Atmospheric and Room Temperature Plasma，常压室温等离子体)复合诱变。其中紫外诱变的诱变时间分别设定为10s、20s、40s、60s、80s和100s。在对紫外诱变的菌株进行培养后，于含盐量10％(w/w)的PDA琼脂培养基划线分离单菌落。
挑选紫外诱变后的单菌落，添加至含盐量为20％的麦芽汁培养基中，观察培养液生长，对生长较迅速的培养菌液进行ARTP诱变。所用仪器为ARTP诱变育种仪(型号：ARTP-IIIS型，购自无锡源清天木生物科技有限公司)。诱变方式为：取10uL的培养液，均匀涂至ARTP载片上。设定功率120w，气量10SLM，作用时间选择10s、20s、30s、40s、60s、80s。诱变完毕后，每个诱变载片转移至含有10mL麦芽汁培养基的EP管中，涡旋洗脱1.5min。取100uL洗脱液涂布至含盐量10％(w/w)麦芽汁琼脂培养基平板，于28～30℃培养箱中培养24小时。挑选获得的单菌落接种至酱油培养基(酱油稀释10倍后，添加1％的葡萄糖、1％的酵母粉，调节pH 5.0，调节盐浓度至20％(w/w))，30℃培养72小时。采用气相色谱-质谱分析培养液中的香气成分。经过进一步的复合诱变及筛选后，从中筛选出在20％盐分条件下能够快速生长、且4-乙烯基-2-甲氧基苯酚产量较高等综合性状较优的菌株16株。对该16株菌株进行5批次的高盐稀态酱油发酵试验，并对发酵得到的酱油进行感官鉴评。选取综合得分最佳的菌株作为目标菌株ZB118。
所得酵母ZB118在麦芽汁琼脂平板上，在30℃条件下培养3天，菌落呈奶酪状，浅褐色，表面平滑，不透明，不反光，边缘整齐，圆形，菌落直径3-5mm，酵母ZB118在麦芽汁琼脂平板上的生长状况见图2。在麦芽汁液体培养基中，25℃条件下培养2天，菌体浑浊，无菌璞，不产膜，具有丁香气味，有酱香，无不良气味。参见图3，菌体在5000×电子显微镜下观察，酵母细胞为球形或卵圆形，能看见明显芽体。
实施例2酵母ZB118的性能验证
将保藏的酵母ZB118使用YPD斜面培养基活化。挑取一环菌体接种到灭菌的250mLYPD液体培养基中(灭菌条件，115℃，20min)，30℃恒温，180rpm培养48小时，菌体浓度达到1.0×108个/mL以上，得到种子液。YPD液体培养基的配方为：1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖，和水。YPD斜面培养基中另外添加2％琼脂。
将新鲜的上述ZB118种子液以1％接种量接入生酱油中，搅拌均匀，30℃静置反应2周，中间搅拌1-2次。将所得酱油在80℃热处理30min，杀灭微生物。对照样添加同等质量的未接种空白培养液，后续发酵操作与试验样相同。对上述样品进行4-乙烯基-2-甲氧基苯酚检测，结果见表1。
表1 4-乙烯基-2-甲氧基苯酚含量表
从上述结果可以看出，添加本发明菌株ZB118后，酱油中4-乙烯基-2-甲氧基苯酚含量显著提升，浓度达到2.18％。添加ZB118进行发酵后，样品的感官风味变得浓郁，酒香减弱，丁香辛香气味增强，酱香有明显提升。对样品的酱香风味进行感官评定，各样品的酱香风味得分(10分制)如表2所示。
表2发酵菌液酱香比较
酱香得分(10分制)
对照样 2.5
ZB118发酵样 6.1
通过感官鉴评，发现添加了ZB118进行发酵后，酱油样品的酱香风味明显优于对照样，且其趋势和4-乙烯基-2-甲氧基苯酚含量有较好的对应性关系，表明4-乙烯基-2-甲氧基苯酚对酱香作用有一定的指征性。
从以上结果可以看出，ZB118菌株能够显著增强酱油的酱香风味。
实施例3酵母ZB118在高盐稀态酱油酿造中应用
菌体培养：将保藏的酵母ZB118及假丝酵母菌(佛山市海天调味食品股份有限公司自有菌种)分别使用YPD斜面培养基活化；挑取一环菌体接种到灭菌的250mL YPD液体培养基中(灭菌条件，115℃灭菌20min)，30℃恒温，180rpm培养48h，菌体浓度达到1.0×108个/mL以上。
酱油发酵：
(1)豆粕、炒小麦以5：5的比例混合均匀后，按照常规方法制得成曲。
(2)将成曲加入2倍的盐水制得酱醪，盐水浓度为20g/100mL，每5-7天搅拌一次，保证酱醪与盐水混合均匀，以不分层为宜。
(3)发酵过程控制在30℃，酱醪pH下降至5.5以下时，添加预培养成熟的上述酵母ZB118的培养液或假丝酵母培养液，添加量为106个/g酱醪，每周通气搅拌一次，保证酵母的正常增殖发酵(对照样品不添加酵母液，补加等量的20g/100mL盐水)。
(4)发酵4个月后，酱醪经过压榨，沉淀，配兑，灭菌得到成品，并进行感官鉴评，得分结果见表3和图4。
表3酱油香气感官评价结果
香气得分 综合口感
对照样 7.91 8.54
ZB118发酵样1 9.18 8.76
ZB118发酵样2 8.95 8.49
ZB118发酵样3 9.03 8.58
假丝酵母发酵样1 8.54 8.12
假丝酵母发酵样2 8.78 8.35
假丝酵母发酵样3 8.83 8.26
备注：样品1～3为平行对照样，随机抽取30位身体健康，感官鉴评能力稳定的专业鉴评人员进行评定，评分按照1-10分的标准进行，平均得分越高，表示接受程度越高。
30位鉴评人员中，有26位认为试验样品明显好于对照，表现为酱香明显提升，香气丰富，口感协调。同时，30位鉴评人员中的24位认为，假丝酵母发酵的试验样品，在香气浓度上较强烈，但是香气和谐程度却不可接受。综合香气和口感评定表明本发明提供的酵母ZB118在提升酱油香气方面效果显著。
(5)采用气相色谱-质谱分析对上述样品进行主要特征成分分析。使用的气相色谱-质谱分析条件为：DB-WAX弹性石英毛细管色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)；程序升温：从起始温度40℃以5℃/min升温至250℃，保持10min；汽化室温度250℃，进氧量1μL。质谱条件：EI离子源，电子能量70eV，离子源温度150℃，发射电流200uA，电子倍增器电压550V，质量扫描范围30-450amu。载气：He(纯度99.999％)；载气流量：1mL/min。检索NIST0.5和WILLY7.0数据库进行分析。检测结果分析见图5。
参见图5，通过将各类化合物归类对比发现，添加本发明酵母ZB118后发酵所得的酱油中醇类物质相对百分含量提高76％，醛类物质提高31.9％，酚类物质提高64.3％，酮类物质含量保持稳定，酸类和酯类物质有所下降。结果显示，酵母ZB118对酿造酱油风味的贡献主要是提高乙醇、正丙醇、正丁醇、异丁醇、异戊醇和β-苯乙醇等多元醇，糠醛、苯乙醛等醛类物质，以及4-乙烯基-2-甲氧基苯酚等风味特征成分的含量，从而提升酱油的风味品质。
实施例4酵母ZB118在发酵酱油酿造中应用
菌体培养：将保藏的酵母ZB118、假丝酵母菌(佛山市海天调味食品股份有限公司自有菌种)、鲁氏接合酵母(佛山市海天调味食品股份有限公司自有菌种)分别使用YPD斜面培养基活化；挑取一环菌体接种到灭菌的250mLYPD液体培养基中(灭菌条件，115℃灭菌20min)，30℃恒温，180rpm培养48小时，菌体浓度达到108个/ml以上。
酱油发酵中应用：
(1)黄豆、面粉以5:5的比例为原料按照常规方法制得成曲。
(2)将成曲加入2倍的盐水制得酱醪，盐水浓度为20g/100mL，同时添加预培养成熟的上述酵母ZB118、假丝酵母或鲁氏接合酵母的培养液，添加量为106个/g原料，每5-10天进行一次淋油操作，保证上层酱醪具有适量水分。对照样品不添加酵母液，补加等量的20g/100mL盐水。
(3)发酵过程控制30℃，发酵3个月酱醪成熟，抽取成熟酱醪中的原油，煮制灭菌，并进行感官评定，结果见表4。同时采用气相色谱-质谱分析对样品中的香气成分进行分析，分析结果见图6和图7。
表4酱油香气感官评价结果
香气得分 综合口感
对照样 8.21 7.59
ZB118发酵样1 8.97 7.36
ZB118发酵样2 9.02 7.41
假丝酵母发酵样1 9.13 6.59
假丝酵母发酵样2 9..25 6.84
备注：样品1～2为平行对照样，随机抽取18位身体健康，感官鉴评能力稳定的专业鉴评人员进行评定，评分按照1-10分的标准进行，平均得分越高，表示接受程度越高。
18位鉴评人员中，有15位认为试验样品明显好于对照，主要为香气更加浓郁，口感略有下降。而假丝酵母样品，虽然可以提升香气，但是对口感造成显著性下降。综合考虑各方面指标，本发明的酵母ZB118在提升酱油产品香气方面效果显著。
图6是添加不同菌种所得酱油中的香气成分分析对比图，从中可以看出，所述的鲁氏接合酵母发酵的产品，风味偏向于刺激性较强的乙醇及苯乙醇香味，而酱香特征香气成分4-乙烯基-2-甲氧基苯酚及风味较柔和醇厚的乙酸乙酯的含量较低。添加本发明的ZB118发酵所得的酱油，乙酸、乙醇及苯乙醇的含量显著降低，4-乙烯基-2-甲氧基苯酚和乙酸乙酯的含量相对增加，酱香风味提升，并且更为柔和醇厚，整体风味更为和谐。这也验证了本发明在提升酱油酱香等特征香气方面明显优于其所述的鲁氏接合酵母。
图7是添加和未添加ZB118所得酱油的风味对比图。通过对比发现，添加了增酱香酵母ZB118发酵所得的酱油，在香气、鲜味、体态上有明显的提升，酱香、酯香风味也得到明显提升。

Claims (10)

1.酵母Saccharomyces sp.ZB118，其保藏编号为GDMCC No：60280。
2.权利要求1所述的酵母Saccharomyces sp.ZB118在制备发酵食品的用途。
3.权利要求1所述的酵母Saccharomyces sp.ZB118在制备调味料(包括发酵型调味品，例如酱油、酱、醋、豆豉或腐乳等)中的用途。
4.一种制备发酵食品的方法，其包括：使用权利要求1所述的酵母Saccharomycessp.ZB118的步骤。
5.一种制备调味料(包括发酵型调味品，例如酱油、酱、醋、豆豉或腐乳等)的方法，包括使用权利要求1所述的酵母Saccharomyces sp.ZB118的步骤。
6.权利要求4或5所述的制备方法，包括以下步骤：
1)制曲，得到成曲；
2)向成曲中加入盐水，混合制成酱醪或酱醅；
3)向酱醪或酱醅中加入权利要求1所述的酵母Saccharomyces sp.ZB118，发酵。
7.一种制备酱油的方法，包括以下步骤：
1)制曲，得到成曲；
2)向成曲中加入盐水，制成酱醪；
3)向步骤2)所获得的酱醅中加入权利要求1所述的酵母Saccharomyces sp.ZB118，发酵；或者，
先发酵步骤2)所获得的酱醅，当酱醪的pH值小于或等于5.5时，向酱醪中加入权利要求1所述的酵母Saccharomyces sp.ZB118，继续发酵；
优选地，发酵温度为25～35℃，例如30℃；
优选地，制曲的原料为豆粕和小麦(例如炒小麦)的混合物或者黄豆和面粉的混合物；
优选地，所述的酵母Saccharomyces sp.ZB118的添加量为(0.1～10)×106个/g酱醪。
8.一种调味料，由权利要求5或6所述的制备方法制备得到。
9.一种酱油，由权利要求7所述的制备方法制备得到。
10.一种发酵食品，由权利要求4或6所述的制备方法制备得到。
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