CN114507610B - 一株产酱香酿酒酵母菌及其应用 - Google Patents

一株产酱香酿酒酵母菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株产酱香酿酒酵母菌及其应用。所述酿酒酵母已于2020年12月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61361，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。本发明提供一株不仅能够提高酱油、发酵酱等发酵产品的酱香风味，而且能够提升其鲜甜口感及浓厚感的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB433，采用其发酵获得的酱香风味基料，直接添加可用于改善现有调味品酱香风味不足的问题。并且该菌株在高盐环境中具有较好的繁殖能力、发酵产乙醇速度较快的性能，使得其特别适用于高盐稀态大罐发酵酱油的生产应用。

Description

一株产酱香酿酒酵母菌及其应用
技术领域
本发明涉及酱油酿造技术领域，具体为一株产酱香酿酒酵母菌及其应用。
背景技术
酱油酿造是多种微生物的协同作用，酵母菌在其中起着非常重要的主导作用，酒精发酵与酱油酱香风味的形成都离不开酵母菌发酵。目前广泛采用的高盐稀态酱油发酵工艺，在保证酱油品质的同时，还可以进一步缩短发酵时间。但是该种酿造工艺不利于酵母、乳酸菌等常规香气产生微生物的繁殖、生长，限制了酱油酱香风味的提升，酱油浓厚感不足。
目前，有关酱油酱香风味的提高主要是通过后期调配，例如添加酱香风味酵母抽提物的方法获得。近年来，通过自醅方式向酱醪中添加增香酵母菌在提高酱油风味上取得了一定的进展，但总体上存在酵母菌生长缓慢，香气成分单一，酱油浓厚感不足，工艺操作繁琐，生产成本过高等缺点。传统的通过添加增香酵母菌的技术，例如：
中国发明专利“一种用增香酵母菌提升酱油风味的方法”(公开号为CN101904486A)中公开了“一种利用耐盐型酵母菌KS18发酵增香”，生产高品质酱油的方法，但该酵母菌仅提高酱油中氨基酸态氮及总氮含量，发酵过程中产生的香气物质有限，不能解决酱香风味及浓厚口感不足的问题。
因此，寻找新的发酵菌株以提升酱油的酱香风味，酱油浓厚口感等品质是十分必要的，为大罐发酵高品质酱油、发酵酱等发酵调味品以及特殊香型发酵调味品的开发奠定技术基础。
发明内容
本发明的发明人意外地从酱油发酵酱醪中分离筛选获得一株不仅能够显著提升发酵培养液酱香香气、而且在高盐环境中具有较好的繁殖能力、发酵产乙醇速度较快的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)菌株。通过对该菌株进行ARTP诱变后获得酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB433，酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB433菌株适用于在高盐稀态酱油大罐发酵环境下生长繁殖，并且发酵过程中不产生不良气味，发酵所得酱油酱香风味浓郁、鲜甜口感突出及浓厚感好。
采用酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB433发酵获得的酱香风味基料，愈创木酚、4-乙基愈创木酚、谷胱甘肽含量得到显著提升，添加至酱油、黄豆酱和火锅底料中，对这些发酵食品和发酵调味品的风味具有显著的提升作用。
基于上述发现，本发明提供一株酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB433，其保藏编号为GDMCC No:61361。
具体的菌株保藏信息如下：
保藏单位名称：广东省微生物菌种保藏中心，
保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼，
保藏日期：2020年12月22日，
保藏编号：GDMCC No:61361。
本发明所述的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB433的形态学特征如下：
酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB433在麦芽汁琼脂平板上，在30℃条件下培养2天，菌落呈乳白色，表面平滑，不透明，不反光，边缘整齐，圆形，酵母ZB433在麦芽汁琼脂平板上的菌落形态见图1。
酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB433在麦芽汁液体培养基中，30℃条件下培养2天，菌体浑浊，无菌璞，不产膜，有酱香，无不良气味。菌体在显微镜下观察，酵母细胞为球形或卵圆形。
本发明所述的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB433的生理生化实验结果如下：
酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB433菌落重复分离纯化3次以上后分别进行糖类发酵试验、糖类同化试验、氮源同化试验、产酯试验及产酸试验。酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB433在麦芽糖、葡萄糖、蔗糖糖类发酵试验中呈阳性，在乳糖、淀粉、蜜二糖糖类发酵试验中呈阴性；酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB433在麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇糖类同化试验中呈阳性，在乳糖、淀粉糖类同化试验中呈阴性；酿酒酵母菌ZB433在硫酸铵氮源同化试验中呈阳性，在硝酸钾氮源同化试验中呈阴性；酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB433在产酯试验中呈阳性，在产酸试验中呈阴性。
本发明所述的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB433的优点至少包括以下1)至4)中的一项：
1)本发明所述的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB433能够显著提升酱油或发酵酱中愈创木酚、4-乙基愈创木酚含量，并且感官鉴评结果表明发酵所得酱油或发酵酱的酱香风味得以显著提升。
2)本发明所述的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB433耐盐性能好，应用于高盐稀态酱油发酵时，酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB433能够保持较强的繁殖能力，从而提高乙醇发酵速度，显著缩短发酵周期。
3)在合适时机(例如酱油原油中氨基酸态氮≥0.8g/100mL)引种本发明所述的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB433进行发酵，可显著提升成品酱油中谷胱甘肽含量，酱油鲜甜口感突出及浓厚感好。
4)将本发明所述的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB433应用至高盐稀态大罐发酵生产工艺中，能够显著提升发酵酱油品质，且操作简便，生产工艺易控，可达到降低生产成本的目的。
在某些实施方案中，通过接种所述的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB433进行酱油发酵小试试验，相对于出发菌株，所得酱油产品中4-乙基愈创木酚、愈创木酚含量均有显著的增加，例如4-乙基愈创木酚含量的增长率不少于40％，优选不小于45％，更优选不小于50％，特别优选不小于60％；例如愈创木酚含量的增长率不少于50％，优选不小于55％，更优选不小于60％，特别优选不小于65％。
因此，在一方面，本发明提供所述酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB433，其于2020年12月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为：GDMCC No:61361，保藏地址为：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼。
在另一方面，提供了本发明的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB433在酱油发酵中的用途。在某些实施方案中，在氨基酸态氮≥0.8g/100mL酱醪体系接种发酵用于制备酱油。
在另一方面，提供了本发明的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB433用于提高酱油酱香风味中的用途。在某些实施方案中，所述酱香风味酱油指4-乙基愈创木酚、愈创木酚含量显著提升的酱油。
在另一方面，提供了本发明的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB433用于提高酱油浓厚口感中的用途。在某些实施方案中，所述酱油中谷胱甘肽含量得以显著提升。
本发明还提供所述的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB433在制备酱香风味基料中的用途。
本发明还提供一种酱香风味基料的制备方法，包括如下步骤：
ⅰ)提供氨基酸态氮≥0.8g/100mL的发酵酱醪；
ⅱ)将酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB433的种子液接种至所述发酵酱醪中，得到发酵体系x；
ⅲ)对ⅱ)所得所述发酵体系x进行发酵，得发酵体系y；
ⅳ)对ⅲ)所得发酵体系y升温，进行美拉德反应；
ⅴ)对ⅳ)所得反应产物离心，取上清液。
其中，所述ⅴ)所得上清液可通过蒸发/喷雾干燥浓缩处理。
在某些实施方案中，本发明所述的制备方法，其中步骤ⅱ)中接种前，将所述酿酒酵母菌ZB433用生理盐水稀释至106CFU/mL～109CFU/mL(例如107CFU/mL～108CFU/mL)，得到所述种子液，将所述种子液接种至所述发酵酱醪中。
在某些实施方案中，本发明所述的制备方法，其中步骤ⅱ)中所述种子液的接种量为5wt％～10wt％，例如8wt％。
在某些实施方案中，本发明所述的制备方法，其中步骤ⅳ)还可包括，升温前向所述发酵体系y中添加糖。
在某些实施方案中，本发明所述的制备方法，其中步骤ⅳ)还包括，向所述发酵体系y中添加糖，使所述发酵体系y中含糖量为2wt％～5wt％，例如3wt％。
在某些实施方案中，本发明所述的制备方法，其中步骤ⅳ)中所述发酵体系y的温度升高至90℃～100℃，例如95℃。
在某些实施方案中，本发明所述的制备方法，其中步骤ⅳ)中美拉德反应的时间为4h～5h，例如5h。
在某些实施方案中，本发明所述的制备方法，其中步骤ⅴ)中对所述反应产物离心的转速为5000rpm～6000rpm，例如5000rpm。
在某些实施方案中，本发明所述的制备方法，其中步骤ⅴ)中对所述反应产物离心的时间为10min～30min，例如15min。
在某些实施方案中，本发明步骤ⅰ)所述发酵酱醪的制备方法包括如下步骤：
a)取蒸熟大豆拌入面粉，混匀；
b)向a)所得混合物中添加种曲、培养，获得成曲；
c)将b)所述成曲中添加盐水、发酵，获得发酵酱醪。
在某些实施方案中，本发明实施例对大豆的具体种类不做特别限定，包括但不限于黄豆和青豆。
在某些实施方案中，本发明所述的制备方法，其中步骤a)中所述蒸熟大豆与所述面粉的重量比为(1.0～2.0):1.0，例如1.5:1.0。
在某些实施方案中，本发明所述的制备方法，其中步骤c)中所述成曲和所述盐水的重量比为1.0:(1.0～2.5)，例如1.0:(1.5～2.0)。
在另一方面，提供了通过如上所述的制备方法获得的酱香风味基料。
在另一方面，提供了所述的酱香风味基料在发酵调味食品或/和发酵食品中的用途。
在另一方面，提供了所述的酱香风味基料在酱油中的用途。
在另一方面，提供了所述的酱香风味基料在黄豆酱中的用途。
在另一方面，提供了所述的酱香风味基料在制备火锅底料制品中的用途。
本发明的有益效果包括：
本发明通过从酱油发酵酱醪中分离筛选、诱变获得一株不仅能够提高酱油、发酵酱等发酵产品的酱香风味，而且能够提升其鲜甜口感及浓厚感的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB433。采用该菌株发酵获得的酱香风味基料，直接添加可用于改善现有调味品酱香风味不足的问题。并且由于酿酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)ZB433在高盐环境中具有较好的繁殖能力、发酵产乙醇速度较快的性能，使得其特别适用于高盐稀态大罐发酵酱油的生产应用。
附图说明
图1为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZB433的菌落形态；
图2为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZB433的细胞形态。
本发明提供的酿酒酵母，命名为酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB433，该菌株已于2020年12月22日保藏于广东微生物菌种保藏中心，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No:61361；该菌株于2020年12月22日由保藏中心收到并登记入册，经保藏中心于2020年12月22日检测为存活菌株。
具体实施方式
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，本发明实施例所用培养基和试验条件为本领域常规培养基和试验条件。除非特别说明，本发明实施例所用试剂均为市购。
本发明所述的“发酵食品”是指利用有益微生物制取的食品，该食品具有独特的风味。常见的发酵食品主要有谷物发酵制品、豆类发酵制品、乳类发酵制品等。
本发明所述的“发酵调味食品”是指利用发酵微生物并采用独特的酿造工艺制作的营养丰富、风味独特、能够增加菜肴的色、香、味，促进食欲的调味食品。常见的发酵调味食品包括酱油、食醋、酱、豆豉、腐乳等传统发酵调味食品以及具有复合调味作用的新兴发酵调味食品。
本发明所述的发酵调味食品和/或发酵食品包括但不限于酱油、调味酱、黄豆酱或火锅底料。实施例1～实施例5仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。
实施例1、酿酒酵母ZB433菌株的获得
酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB433诱变前起始菌株的筛选，包括以下筛选流程：
1、菌株分离
取佛山市海天(高明)调味食品有限公司酱油发酵，以质量比1:9加入无菌水制成悬浊液，然后用无菌生理盐水梯度稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍后，取0.1mL稀释液涂布至含盐量10wt％的PDA培养基上，30℃培养48h，挑选单菌落进行进一步划线分离纯化3次后，纯化后的菌株接种在斜面PDA培养基上进行保种。
YPD液体培养基：1wt％酵母膏、2wt％蛋白胨、2wt％葡萄糖和水。
YPD固体或者斜面培养基中则另外添加2wt％琼脂。
2、菌株初筛
将上述经分离纯化、培养后的菌株接种至含酱油的筛选培养基中，于30℃、180rpm震荡培养48h，通过测定OD600值和进行香气感官鉴评，挑选在含盐培养基能够快速增殖的菌株，且对发酵所得培养液经感官鉴评后风味优良、酱香更加浓郁的菌种为初筛合格菌株。
含酱油的筛选培养基：酱油稀释10倍后，添加1.5wt％的葡萄糖、1.5wt％的酵母粉，调节pH为5.0，调节盐浓度至10wt％。
测定的OD600值如下表所示：
表1、菌株OD600值的初筛结果
菌株编号 菌株OD600值
CX20FJ170 0.758
CX20FJ172 0.687
CX20FJ176 0.713
CX20FJ177 0.743
CX20FJ180 0.673
CX20FJ182 0.692
CX20FJ185 0.733
CX20FJ188 0.698
CX20FJ191 0.741
CX20FJ195 0.725
CX20FJ197 0.719
CX20FJ199 0.708
香气鉴评方法：召集20名有丰富经验的酱油鉴评人员进行感官鉴评，对上述不同菌株的发酵培养液样品进行盲评，主要评价香气可接受度和鉴别酱香气。结果如下表所示：
表2、发酵培养液的香气鉴评结果
菌株编号 是否有酱香 香气是否愉悦
CX20FJ170 否 否
CX20FJ172 否 是
CX20FJ176 是 否
CX20FJ177 是 是
CX20FJ180 是 是
CX20FJ182 否 是
CX20FJ185 是 是
CX20FJ188 是 是
CX20FJ191 否 是
CX20FJ195 是 是
CX20FJ197 是 是
CX20FJ199 否 否
挑选具有较高OD600值，并且发酵培养液香气浓郁，具有令人愉悦的酱香气的菌株备用。
3、菌株复筛
将上述菌株CX20FJ177、CX20FJ185、CX20FJ195和CX20FJ197，共4株菌株的单菌落接种于PD液体培养基中，30℃、180rpm震荡培养48h，得到上述菌株的种子培养液。
将种子培养液按0.1wt％的添加量分别接种至酱醪发酵液体培养基中进行发酵，30℃、180rpm振荡发酵培养7d，发酵结束后，过滤取澄清酱油原液进行乙醇指标检测。
酱醪发酵液体培养基：取发酵酱油酱醪，其中氨基酸态氮≥0.8g/100mL，盐度：15％，过滤取上清液即为酱醪发酵液体培养基。
采用SPME-GC-MS检测上述酱油原液中的香气物质，检测参数如下：SPME条件：CAR/PDMS萃取头；萃取温度：35℃；取样量：5g；平衡时间：10min；萃取时间：30min；脱附时间：20min；GC条件：进样口温度：250℃，不分流进样；色谱柱：VF-WAX 60m×0.25mm×50μm；升温程序如下表所示：
表3、SPME-GC-MS检测参数
升温速度/(℃/min) 终温/℃ 保持时间/min
0 40 8
5 140 0
30 220 30
检测器：MS，离子源温度：250℃；四级杆温度：150℃。
表4、香气成分结果(半定量检测，以对照例香气物质峰面积为100％计)
项目 乙醇
CAS Number 64-17-5
空白组 100％
CX20FJ177 286.4％
CX20FJ185 325.9％
CX20FJ195 248.7％
CX20FJ197 298.5％
备注：以不接种种子培养液发酵作为空白组，空白组乙醇指标为100％，其他接种初筛菌株种子培养液发酵，乙醇指标换算成相应比值。
从上表4的结果可以看出，优选产乙醇含量最高的酿酒酵母菌菌株CX20FJ185进行后续试验。
4、菌株鉴定
根据细胞形态、生理生化特征和18S rDNA测序等实验数据综合分析，CX20FJ185菌株被鉴定为Saccharomyces cerevisiae。
生理生化试验结果如下表：
表5、生理生化试验结果
Figure BDA0002976532040000121
注：糖类发酵试验中，“+”指无氧时可将糖转化分解为乙醇和二氧化碳，“-”指无氧时不能将糖转化为乙醇和二氧化碳；
糖类同化试验中，“+”指有氧时将糖转化分解，获取能量供菌体生长，“-”指有氧时不能将糖转化分解，不能获取能量供菌体生长；
氮源同化试验中，“+”指有氧时将氮源转化分解，获取能量供菌体生长，“-”指有氧时不能将氮源转化分解，不能获取能量供菌体生长；
产酯试验中，“+”指发酵过程可产酯，“-”发酵过程不产酯；
产酸试验中，“+”指发酵过程可产酸，“-”发酵过程不产酸。
(3)18S ITS rDNA测序
将保藏的酵母菌株CX20FJ185送上海生工生物工程有限公司测序鉴定，菌株CX20FJ185的18S ITS rDNA序列如下SEQ ID No.1所示：
CTGTCTAGTTAAGCAATTTATACAGTGAAACTGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAGTTCCTTTACTACATGGTATAACTGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTTAAAATCTCGACCCTTTGGAAGAGATGTATTTATTAGATAAAAAATCAATGTCTTCGGACTCTTTGATGATTCATAATAACTTTTCGAATCGCATGGCCTTGTGCTGGCGATGGTTCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAGGATAGTGGCCTACCATGGTTTCAACGGGTAACGGGGAATAAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTAATTCAGGGAGGTAGTGACAATAAATAACGATACAGGGCCCATTCGGGTCTTGTAATTGGAATGAGTACAATGTAAATACCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACTTTGGGCCCGGTTGGCCGGTCCGATTTTTTCGTGTACTGGATTTCCAACGGGGCCTTTCCTTCTGGCTAACCTTGAGTCCTTGTGGCTCTTGGCGAACCAGGACTTTTACTTTGAAAAAATTAGAGTGTTCAAAGCAGGCGTATTGCTCGAATATATTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTTTGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACCATCGTAATGATTAATAGGGACGGTCGGGGGCATCAGTATTCAATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTATTGAAGACTAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGACGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGATGATCAGATACCGTCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGGATCGGGTGGTGTTTTTTTAATGACCCACTCGGCACCTTACGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACACAATAAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGATTTTGTGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGCTTAATTGCGATAACGAACGAGACCTTAACCTACTAAATAGTGGTGCTAGCATTTGCTGGTTATCCACTTCTTAGAGGGACTATCGGTTTCAAGCCGATGGAAGTTTGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGACGTTCTGGGCCGCACGCGCGCTACACTGACGGAGCCAGCGAGTCTAACCTTGGCCGAGAGGTCTTGGTAATCTTGTGAAACTCCGTCGTGCTGGGGATAGAGCATTGTAATTATTGCTCTTCAACGAGGAATTCCTAGTAAGCGCAAGTCATCAGCTTGCGTTGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTAGTACCGATTGAATGGCTTAGTGAGGCCTCAGGATCTGCTTAGAGAAGGGGGCAACTCCATCTCAGAGCGGAGAA
5、菌株诱变
将上述鉴定的CX20FJ185(Saccharomyces cerevisiae)菌株进行ARTP(Atmospheric and Room Temperature Plasma，常压室温等离子体)诱变。
具体的，本发明菌株的诱变方法如下：
ARTP诱变育种仪：ARTP-IIIS型，购自无锡源清天木生物科技有限公司。
将菌株接种至YPD液体培养基中，于30℃、180rpm震荡培养48h获得含Saccharomyces cerevisiae鉴定菌株的培养液。
取10μL的培养液，均匀涂至ARTP载片上进行诱变，设定功率120W，气量10SLM，作用时间选择10s、20s、30s、40s、60s、80s。
诱变完毕后，每个诱变载片转移至含有10mL麦芽汁培养基的EP管中，涡旋洗脱2min。
取100μL洗脱液涂布至含盐量15wt％麦芽汁琼脂培养基平板，于28℃～30℃培养箱中培养24小时。
挑选获得的单菌落接种至含酱油的筛选培养基(酱油稀释10倍后，添加1.5wt％的葡萄糖、1.5wt％的酵母粉，调节pH为5.0，调节盐浓度至10wt％。)，30℃培养48小时。
采用气相色谱-质谱分析培养液中的香气成分。从中筛选出在10wt％盐分条件下能够快速生长，且愈创木酚、4-乙基愈创木酚产量较高等综合性状较优的菌株。对筛选的菌株进行3批次的高盐稀态酱油发酵试验，并对发酵得到的酱油进行感官鉴评。从而根据OD600值和香气感官，挑选出比出发菌株相比，生长较快且酱香更浓郁、整体风味更愉悦的6株菌株。
将上述初筛选出的6株酵母菌株依次转接斜面活化后，进行三角瓶扩大培养，保持28℃恒温，180rpm培养48小时，获得菌悬液，然后以1％体积比接种量接种于含酱油的发酵培养基中继续进行发酵小试，28℃～33℃条件下静置发酵72h后停止发酵，采用气相色谱-质谱分析测定其发酵液中4-乙基愈创木酚和愈创木酚的含量，检测结果如下表所示。
表6、香气成分结果(半定量检测，以对照例香气物质峰面积为100％计)
项目 4-乙基愈创木酚 愈创木酚
CAS Number 2785-89-9 90-05-1
CX20FJ185 100％ 100％
CX20YB111 116.8％ 124.5％
CX20YB114 134.8％ 127.1％
CX20YB119 129.0％ 138.7％
CX20YB121 158.9％ 165.7％
CX20YB125 140.1％ 118.9％
CX20YB129 137.8％ 145.8％
备注：以接种CX20FJ185(对照菌株)发酵各项指标为100％，其他诱变菌株发酵指标换算成相应比值。
从上表6的结果可以看出，优选愈创木酚、4-乙基愈创木酚指标最高的酿酒酵母菌菌株CX20YB121进行后续试验。
酿酒酵母菌菌株CX20YB121的形态学特征描述如下：
所得酵母ZB433在麦芽汁琼脂平板上，在30℃条件下培养2天，菌落呈乳白色，表面平滑，不透明，不反光，边缘整齐，圆形，酵母ZB433在麦芽汁琼脂平板上的菌落形态见图1。
在麦芽汁液体培养基中，30℃条件下培养2天，菌体浑浊，无菌璞，不产膜，有酱香，无不良气味。菌体在显微镜下观察，酵母细胞为球形或卵圆形，参见图2。
酿酒酵母菌菌株CX20YB121的生理生化试验结果如下表所示：
表7、生理生化试验结果
Figure BDA0002976532040000161
注：糖类发酵试验中“+”指无氧时可将糖转化分解为乙醇和二氧化碳，“-”指无氧时不能将糖转化为乙醇和二氧化碳；
糖类同化试验“+”指有氧时将糖转化分解，获取能量供菌体生长，“-”指有氧时不能将糖转化分解，不能获取能量供菌体生长；
氮源同化试验“+”指有氧时将氮源转化分解，获取能量供菌体生长，“-”指有氧时不能将氮源转化分解，不能获取能量供菌体生长；
产酯试验“+”指发酵过程可产酯，“-”发酵过程不产酯；
产酸试验“+”指发酵过程可产酸，“-”发酵过程不产酸。
酿酒酵母菌菌株CX20YB121的18S ITS rDNA序列如下SEQ ID No.2所示：
CTGTCTAGTTAAGCAATTTATACAGTGAAACTGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAGTTCCTTTACTACATGGTATAACTGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTTAAAATCTCGACCCTTTGGAAGAGATGTATTTATTAGATAAAAAATCAATGTCTTCGGACTCTTTGATGATTCATAATAACTTTTCGAATCGCATGGCCTTGTGCTGGCGATGGTTCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAGGATAGTGGCCTACCATGGTTTCAACGGGTAACGGGGAATAAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTAATTCAGGGAGGTAGTGACAATAAATAACGATACAGGGCCCATTCGGGTCTTGTAATTGGAATGAGTACAATGTAAATACCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACTTTGGGCCCGGTTGGCCGGTCCGATTTTTTCGTGTACTGGATTTCCAACGGGGCCTTTCCTTCTGGCTAACCTTGAGTCCTTGTGGCTCTTGGCGAACCAGGACTTTTACTTTGAAAAAATTAGAGTGTTCAAAGCAGGCGTATTGCTCGAATATATTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTTTGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACCATCGTAATGATTAATAGGGACGGTCGGGGGCATCAGTATTCAATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTATTGAAGACTAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGACGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGATGATCAGATACCGTCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGGATCGGGTGGTGTTTTTTTAATGACCCACTCGGCACCTTACGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACACAATAAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGATTTTGTGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGCTTAATTGCGATAACGAACGAGACCTTAACCTACTAAATAGTGGTGCTAGCATTTGCTGGTTATCCACTTCTTAGAGGGACTATCGGTTTCAAGCCGATGGAAGTTTGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGACGTTCTGGGCCGCACGCGCGCTACACTGACGGAGCCAGCGAGTCTAACCTTGGCCGAGAGGTCTTGGTAATCTTGTGAAACTCCGTCGTGCTGGGGATAGAGCATTGTAATTATTGCTCTTCAACGAGGAATTCCTAGTAAGCGCAAGTCATCAGCTTGCGTTGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTAGTACCGATTGAATGGCTTAGTGAGGCCTCAGGATCTGCTTAGAGAAGGGGGCAACTCCATCTCAGAGCGGAGAA
6、耐盐性能试验
挑取酿酒酵母菌菌株CX20YB121单菌落接种于PD液体培养基中，30℃、180rpm震荡培养48h，得到酿酒酵母菌CX20YB121种子培养液，将种子培养液按2％分别接种至含10wt％、14wt％和18wt％NaCl的PD液体培养基中，30℃、180rpm震荡培养，测定OD600值并采用气相色谱-质谱分析测定其发酵液中4-乙基愈创木酚和愈创木酚的含量，检测结果如下表所示。
表8、菌株耐盐性能结果
NaCl浓度 OD600值 愈创木酚 4-乙基愈创木酚
10％ 0.764 100％ 100％
14％ 0.726 105.4％ 98.8％
18％ 0.664 96.8％ 102.4％
备注：以10wt％NaCl浓度下，接种菌株CX20YB121发酵香气成份各项指标为100％，NaCl浓度为14wt％、18wt％下，接种菌株CX20YB121发酵香气成份换算成相应比值。
结果如上表所示，酿酒酵母菌CX20YB121在10wt％～18wt％NaCl浓度下可以正常生长，具有较好的耐盐性。随着NaCl浓度升高，酿酒酵母菌CX20YB121生长稍受影响，但发酵液中4-乙基愈创木酚和愈创木酚的含量未受显著影响。
7、菌株保藏
该酿酒酵母菌菌株CX20YB121已于2020年12月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，命名为酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB433，保藏编号为GDMCC No:61361，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。
酿酒酵母菌株CX20YB121与酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB433指同一菌株。
8、遗传稳定性
将上述诱变筛选出的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB433接种于YPD斜面培养基连续传代10代，观察各代菌株的生长情况，并将第1代、第5代和第10代斜面菌种按按上述发酵小试培养方法对菌种进行发酵培养，发酵结束后测定其发酵液中4-乙基愈创木酚和愈创木酚的含量，判断其遗传稳定性，若十代测定4-乙基愈创木酚和愈创木酚的含量误差在10％误差范围内，则表明菌株遗传稳定性良好，具体数据见下表。
表9、传代稳定性检测结果
传代数 4-乙基愈创木酚 愈创木酚
出发菌株 100％ 100％
ZB433第1代 102.4％ 98.6％
ZB433第5代 96.8％ 101.6％
ZB433第10代 95.6％ 98.9％
备注：以出发菌株酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB433发酵各项指标为100％，传代第1代、第5代、第10代发酵指标换算成相应比值。
如表9的结果所示，从发酵液中4-乙基愈创木酚和愈创木酚的检测结果来看，酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB433的遗传稳定性好。
实施例2、在酱油发酵中的应用
采用含18wt％氯化钠的PD液体培养基培养本发明实施例所述的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB433、诱变出发菌株酿酒酵母菌CX20FJ185，30℃、180rpm震荡培养48h，得到菌体活性高，菌体密度大的种子培养液。
将原料黄豆和小麦粉通过圆盘制曲获得成曲，然后将曲料加入盐水进行发酵，当发酵体系中氨基酸态氮≥0.8g/100mL接种种子培养液发酵7d～10d，发酵管理按照常规方法进行。
发酵完成后，检测酱油常规理化指标，采用GC-MS测定愈创木酚和4-乙基愈创木酚，采用四氧嘧啶法测谷胱甘肽的含量，并对酱油的风味进行鉴评，结果如下表所示。
对照组即为按照现有常规的高盐稀态大罐发酵工艺进行发酵制取酱油。
表10、发酵酱油理化指标测试结果
Figure BDA0002976532040000201
/>
备注：对照组发酵酱油各项指标为100％，接种本发明菌株发酵酱油指标换算成相应比值。
本实施例还召集20名有丰富经验的鉴评人员进行感官鉴评。感官鉴评的评价指标包括酱香、浓厚感和综合风味，分值为0分～5分打分，分数越高，该项指标越好，满分5分。感官鉴评结果见下表。
表11、发酵酱油感官鉴评测试结果
Figure BDA0002976532040000202
Figure BDA0002976532040000211
上述结果表明，酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB433应用于酱油发酵，可显著提高愈创木酚、4-乙基愈创木酚、谷胱甘肽含量。通过感官鉴评结果可知，接种酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB433发酵获得的酱油，酱香浓郁，酱油的浓厚口感得到了显著的改善。
实施例3、在黄豆酱酿造中的应用
采用黄豆和小麦粉为原料，按常规方法进行黄豆酱制曲，成曲分别加入1.8倍重量浓度为18％(m/m)的盐水，混匀后进行发酵，当发酵体系中氨基酸态氮≥0.8g/100mL接种种子培养液发酵7d～10d，发酵管理按照常规方法进行。种子培养液分别为酿酒酵母菌ZB433种子液、酿酒酵母菌CX20FJ185种子液。
发酵完成后，检测黄豆酱常规理化指标，采用GC-MS测定愈创木酚和4-乙基愈创木酚，采用四氧嘧啶法测谷胱甘肽的含量，并对黄豆酱的风味进行鉴评，结果如下表所示。
对照组即为按照现有常规的发酵工艺发酵获得黄豆酱。
表12、黄豆酱理化指标测试结果
Figure BDA0002976532040000212
备注：对照组发酵黄豆酱各项指标为100％，接种本发明菌株发酵黄豆酱指标换算成相应比值。
表13、黄豆酱感官鉴评测试结果(0分～5分打分，满分5分)
Figure BDA0002976532040000221
上述结果表明，酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB433应用于黄豆酱发酵，可显著提高愈创木酚、4-乙基愈创木酚、谷胱甘肽含量。通过感官鉴评结果可知，接种酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB433发酵获得的黄豆酱，酱香浓郁，黄豆酱的浓厚口感得到了显著的改善。
实施例4、在酱香风味基料中的应用
采用黄豆和小麦粉为原料，按常规方法进行黄豆酱制曲，成曲分别加入1.8倍重量浓度为18％(m/m)的盐水，混匀后进行发酵，当发酵体系中氨基酸态氮≥0.8g/100mL接种种子培养液发酵7d～10d，发酵管理按照常规方法进行。
将上述制备的酱醪中加入3wt％的葡萄糖，与95℃的条件下，美拉德反应5h后获得酱香型、浓厚口感的固态发酵基料。
将上述酱香型、浓厚口感的固态发酵基料置于5000rpm～6000rpm、10min～30min的条件下离心处理，获得酱香型、浓厚口感的呈味液体基料。
采用GC-MS测定酱香型液体风味基料中愈创木酚、4-乙基愈创木酚浓度，采用四氧嘧啶法测谷胱甘肽浓度，并对风味进行鉴评，结果如表13、14所示。
对照组即为按照现有工艺获得的风味基料，现有工艺中不接种酿酒酵母菌ZB433。
表15、风味基料理化指标测试结果
Figure BDA0002976532040000231
备注：对照组风味基料各项指标为100％，接种本发明菌株制备的风味基料指标换算成相应比值。
表16、风味基料感官鉴评测试结果(0分～5分打分，满分5分)
Figure BDA0002976532040000232
上述结果表明，酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB433应用于风味基料发酵生产，可显著提高愈创木酚、4-乙基愈创木酚含量。通过感官鉴评结果可知，接种酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB433发酵获得的风味基料，酱香浓郁，风味基料的浓厚口感得到了显著的改善。
实施例5、制备的酱香风味基料在酱油、黄豆酱、火锅底料中的应用
对酱油、黄豆酱、火锅底料中分别添加实施例4中接种酿酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)ZB433组所制备的液体风味基料，添加比例分别为2％(重量比)、2.5％(重量比)、3％(重量比)。
添加完毕后以不添加实施例4制备的液体风味基料的酱油、黄豆酱、火锅底料为对照进行感官鉴评，结果如表15所示。
表17、酱香型风味基料应用鉴评结果(0分～5分打分，满分5分)
Figure BDA0002976532040000233
Figure BDA0002976532040000241
上述结果表明，采用酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB433发酵制备的风味基料能够显著改善酱油、黄豆酱和火锅底料的酱香和浓厚感，对上述调味品产品的风味提升具有显著的作用。
如上可知，本发明实施例提供的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB433具有能够显著提升酱油或发酵酱中愈创木酚、4-乙基愈创木酚含量，并且能够显著提升酱油或发酵酱的酱香风味；可以用于酱油、发酵酱等酱香发酵食品的酿造，采用该菌株进行酱油酿造时，当酱油原油中氨基酸态氮≥0.8g/100mL时接种发酵，成品酱油中谷胱甘肽含量得以显著提升，酱油鲜甜口感突出及浓厚感好；本发明实施例的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB433耐盐性高，应用于高盐稀态酱油发酵时，能够促进酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB433健壮生长及繁殖，从而提高乙醇发酵速度，缩短了发酵周期。在现有高盐稀态大罐发酵工艺的基础上，采用本发明实施例酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB433进行接种发酵调控，提高发酵产品品质，并进一步显著缩短发酵周期。本方法操作简便，生产工艺易控，达到了降低了生产成本的目的。
综上，本发明实施例提供一株能够显著提升酱油或发酵酱中愈创木酚、4-乙基愈创木酚含量并改善酱油或发酵酱的酱香风味的酵母菌，该菌株适用于在高盐稀态酱油大罐发酵环境下生长繁殖，并且发酵过程中不产生不良气味，发酵所得酱油谷胱甘肽含量得到了显著提升，酱油酱香风味浓郁、鲜甜口感突出及浓厚感好。遗传稳定，生长旺盛，适合工业化生产。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 佛山市海天（高明）调味食品有限公司
广东海天创新技术有限公司
佛山市海天调味食品股份有限公司
<120> 一株产酱香酿酒酵母菌及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1666
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 1
ctgtctagtt aagcaattta tacagtgaaa ctgcgaatgg ctcattaaat cagttatcgt 60
ttatttgata gttcctttac tacatggtat aactgtggta attctagagc taatacatgc 120
ttaaaatctc gaccctttgg aagagatgta tttattagat aaaaaatcaa tgtcttcgga 180
ctctttgatg attcataata acttttcgaa tcgcatggcc ttgtgctggc gatggttcat 240
tcaaatttct gccctatcaa ctttcgatgg taggatagtg gcctaccatg gtttcaacgg 300
gtaacgggga ataagggttc gattccggag agggagcctg agaaacggct accacatcca 360
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aacgatacag ggcccattcg ggtcttgtaa ttggaatgag tacaatgtaa ataccttaac 480
gaggaacaat tggagggcaa gtctggtgcc agcagccgcg gtaattccag ctccaatagc 540
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ccttacgaga aatcaaagtc tttgggttct ggggggagta tggtcgcaag gctgaaactt 1080
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<211> 1666
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
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ttttgtgggt ggtggtgcat ggccgttctt agttggtgga gtgatttgtc tgcttaattg 1260
cgataacgaa cgagacctta acctactaaa tagtggtgct agcatttgct ggttatccac 1320
ttcttagagg gactatcggt ttcaagccga tggaagtttg aggcaataac aggtctgtga 1380
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tccctgccct ttgtacacac cgcccgtcgc tagtaccgat tgaatggctt agtgaggcct 1620
caggatctgc ttagagaagg gggcaactcc atctcagagc ggagaa 1666

Claims (12)

1.一株酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）ZB433，其特征在于，所述酿酒酵母菌已于2020年12月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61361，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。
2.权利要求1所述的酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）ZB433在酱油发酵中的用途。
3.权利要求1所述的酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）ZB433在制备酱香风味基料中的用途。
4.一种酱香风味基料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
ⅰ）提供氨基酸态氮≥0.8g/100mL的发酵酱醪；
ⅱ）将权利要求1所述的酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）ZB433的种子液接种至所述发酵酱醪中，得到发酵体系x；
ⅲ）对ⅱ）所得所述发酵体系x进行发酵，得发酵体系y；
ⅳ）对ⅲ）所得发酵体系y升温，进行美拉德反应；
ⅴ）对ⅳ）所得反应产物离心，取上清液。
5.根据权利要求4所述的酱香风味基料的制备方法，其特征在于，
步骤ⅱ）中，接种前，将所述酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）ZB433用生理盐水稀释至106CFU/mL～109CFU/mL，得到所述种子液，再将所述种子液接种至所述发酵酱醪中，所述种子液的接种量为5wt%～10wt%；
或/和步骤ⅳ）还包括，升温前向所述发酵体系y中添加糖，向所述发酵体系y中添加糖使所述发酵体系y中含糖量为2wt%～5wt%；
或/和步骤ⅳ）中，所述发酵体系y的温度升高至90℃～100℃，美拉德反应的时间为4h～5h；
或/和步骤ⅴ）中，离心的转速为5000rpm～6000rpm，离心的时间为10 min～30 min。
6.根据权利要求4或者5所述的酱香风味基料的制备方法，其特征在于，
步骤ⅰ）中，所述发酵酱醪的制备方法包括如下步骤：
a）取蒸熟大豆拌入面粉，混匀；
b）向a）所得混合物中添加种曲、培养，获得成曲；
c）在b）所述成曲中添加盐水、发酵，获得发酵酱醪。
7.根据权利要求6所述的酱香风味基料的制备方法，其特征在于，所述大豆为黄豆或/和青豆。
8.根据权利要求6所述的酱香风味基料的制备方法，其特征在于，步骤a）中，所述蒸熟黄豆与所述面粉的重量比为（1.0～2.0）:1.0；
或/和步骤c）中，所述成曲和所述盐水的重量比为1.0:（1.0～2.5）。
9.通过权利要求4至8任一项所述的制备方法获得的酱香风味基料。
10.权利要求9所述的酱香风味基料在制备发酵食品中的用途。
11.权利要求9所述的酱香风味基料在制备发酵调味食品中的用途。
12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，所述发酵调味食品为酱油、黄豆酱或者火锅底料制品。
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