CN113308383B - 一株米曲霉za223及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA223及其应用，本发明提供的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA223，制备得到的酱油原油具有氨基氮、全氮、谷氨酸含量高且还原糖含量低的特点。且就风味物质而言，具备醇类、酯类物质含量高，醛类、酮类、酸类物质含量低的特点，赋予了酱油原油突出的果香味和清雅的风味，可用于生产新型高端果香味酱油。本发明提供的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA223，具有菌丝短薄、产孢子量正常、产孢时间延迟、成曲pH高且曲香清淡的特征，并且成曲所含中性蛋白酶活力和谷氨酰胺酶活力高。
Description
技术领域
本发明属于工业微生物技术领域，尤其涉及一株米曲霉，以及其在酱油酿造中的应用。
背景技术
酱油是在米曲霉等微生物的作用下，将大豆和小麦原料中的蛋白质、淀粉和脂质等营养物质逐步水解形成的鲜咸味美、酱香浓郁的液态调味品。酱油是传统发酵调味品，深受中国、其它亚洲国家乃至世界消费者喜爱，是不可或缺的调味品之一。多年以来，我国对提高酱油品质的研究主要集中在两个方面：一是提升原料利用率方面，主要涉及蛋白酶、淀粉酶等酶活力研究；二是通过发酵过程加入鲁氏酵母、球拟酵母、乳酸菌等其他微生物来提升酱油风味。
酱油在酿造过程中会产生种类繁多且带有特殊香气的挥发性物质，这些挥发性物质对酱油风味影响非常重要。酱油的风味成分主要由原料中的蛋白质、淀粉和脂肪等在微生物酶系的发酵作用下生成，组成复杂，根据研究，酱油中的风味成分超过300种。调控各种风味成分的种类、含量是优化酱油风味的有效手段。而风味成分则主要受到原料、微生物和发酵工艺条件的影响。不同微生物发酵形成的酱油风味会有所区别，目前我国酱油生产用菌种仍以传统的米曲霉为主，米曲霉发酵生成芳香味物质、有机酸、多种醇类和酯类，是香气成分的重要来源。但传统米曲霉难以用于生产一些新型风味酱油，如果香味酱油、蘑菇香味酱油等等。
因此，发掘新的、可提供不同风味物质的米曲霉菌株，对于制备特殊风味的酱油具有重要的意义，也是本领域亟待解决的技术问题。
发明内容
基于上述背景技术，本发明的目的之一是提供一株米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA223，该菌株菌丝短且菌丝量少、产孢子量正常，制曲所得成曲的曲香清淡、pH值高并且中性蛋白酶和谷氨酰胺酶活力高，用该米曲霉菌株发酵酱油的香气组成中，醇类、酯类物质含量高且醛类、酮类和酸类物质含量低，所得酱油感官风味清雅、果香气味突出。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
本发明的主要目的是提供一株米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA223，其于2021年4月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC.No：61635，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。
米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA223菌株的菌落特征如下：豆汁平板培养基培养63h，菌落直径在42mm左右，菌落黄绿色偏黄，圆形，无明显菌丝层，菌丝薄、短且细，孢子细且多，请参见图2。马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基培养63h，菌落直径在21mm左右，菌落浅黄绿色，圆形，菌丝生长稀薄，孢子幼细，请参见图3。察氏琼脂平板培养基培养63h，菌落直径在11mm左右，菌落浅黄色，圆形，菌丝生长短且薄，孢子细，请参见图4。
作为本发明的另一方面，本发明还提供上述米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA223在制曲中的用途。在某些实施方案中，制曲获得的成曲用于制备酱油和/或酱。
作为本发明的另一方面，本发明还提供一种成曲，其由上述的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA223接种于豆类原料或/和小麦类原料中培养而得。
作为本发明的另一方面，本发明还提供上述的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA223在制备酱油和/或酱中的用途。
作为本发明的另一方面，本发明还提供一种果香味酱油和/或酱的制备方法，包括以下步骤：
ⅰ)将上述的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA223接种至豆类原料或/和小麦类原料中制曲培养；
ⅱ)将ⅰ)制备的成曲与氯化钠溶液混合后，发酵。
在某些实施方案中，步骤i)中，培养的温度为25～35℃(例如25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃)。
在某些实施方案中，发酵的方式为高盐稀态发酵。
作为本发明的另一方面，一种果香味酱油和/或酱，其采用如如上所述的制备方法制备。
作为本发明的另一方面，本发明提供上述米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA223在提高酱油和/或酱中醇类、酯类物质含量以及降低酱油和/或酱中醛类、酮类、酸类物质含量的用途。
作为本发明的又一方面，本发明提供了上述米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA223的筛选方法。
本发明具有以下技术优势和积极效果：
1、本发明提供的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA223，制备得到的酱油原油具有氨基氮、全氮、谷氨酸含量高且还原糖含量低的特点。且就风味物质而言，具备醇类、酯类物质含量高，醛类、酮类、酸类物质含量低的特点，赋予了酱油原油突出的果香味和清雅的风味，可用于生产新型高端果香味酱油。
2、本发明提供的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA223，具有菌丝短薄、产孢子量正常、产孢时间延迟、成曲pH高且曲香清淡的特征，并且成曲所含中性蛋白酶活力和谷氨酰胺酶活力高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为获得本发明实施例米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA223菌株的技术路线图；
图2为本发明实施例米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA223菌株在豆汁培养基上的菌落形态图；
图3为本发明实施例米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA223菌株在马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基上的菌落形态图；
图4为本发明实施例米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA223菌株在察氏琼脂平板培养基上的菌落形态图；
图5为采用本发明实施例米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA223菌株制备的酱油原油的香气强度鉴评分析图；
图6为采用本发明实施例米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA223菌株制备的酱油原油鉴评分析图。
本发明提供的米曲霉，命名为米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA223，该菌株已于2021年4月30日保藏于广东微生物菌种保藏中心，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No:61635；该菌株于2021年4月30日由保藏中心收到并登记入册，经保藏中心于2021年4月30日检测为存活菌株。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更详细的描述。但是，应当理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式或实施例。相反地，提供这些实施方式或实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式或实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”的可选范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。
一方面，本发明提供一株米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA223，其于2021年4月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC.No：61635，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。
本发明提供的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA223的菌落特征如下：豆汁培养基平板上培养63h，菌落直径在42mm左右，菌落黄绿色偏黄，圆形，无明显菌丝层，菌丝薄、短且细，孢子细且多，请参见图2。马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上培养63h，菌落直径在21mm左右，菌落浅黄绿色，圆形，菌丝生长稀薄，孢子幼细，请参见图3。察氏琼脂培养基平板培养63h，菌落直径在11mm左右，菌落浅黄色，圆形，菌丝生长短且薄，孢子细，请参见图4。
本发明提供的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA223菌株是以我司保藏米曲霉As3.951为出发菌株，经诱变选育获得。具体的，本发明所述的米曲霉(Aspergillusoryzae)ZA223菌株的诱变选育方法如下(可参考图1)：
(1)以米曲霉As3.951为出发菌株，采用公知诱变方法对出发菌株进行诱变获得突变菌落，交叉使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基、察氏琼脂培养基和豆汁培养基对突变菌落进行平板培养筛选。即在察氏琼脂培养基和马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上挑选与出发菌种As3.951相比具有菌丝细短、菌丝层薄、菌落产孢时间延迟、孢子色泽浅等特点的菌落；在豆汁培养基平板上面挑选与出发菌种As3.951相比具有菌丝生长薄且短细、菌丝层薄、产孢时间延迟且孢子细的菌落。挑选同时满足以上培养基的平板筛选条件的突变菌株转接豆汁培养基的斜面上，培养成熟后进行常规保藏及进一步筛选。
(2)初筛方法为保藏菌种由豆汁培养基斜面活化后转接三角瓶培养，观察米曲霉生长情况。挑选菌丝生长短薄、产孢时间延迟和孢子量略少的突变菌株，采用常规方法检测成曲的发芽率和孢子数，优选发芽率高的菌株进行复筛。
(3)复筛方法为按照常规酱油生产方法进行小规模的制曲，检测制曲成曲pH值、孢子数、中性蛋白酶和谷氨酰胺酶活力，优选综合性能好的菌株进行生产试用。
(4)生产试用为按照常规酱油生产方法进行酱油生产，检测发酵酱油质量和香气物质成分分析。
本发明所述的诱变选育方法中：所使用的马铃薯葡萄糖琼脂培养基、察氏培养基均采用商业培养基。豆汁平板培养基采用豆汁斜面生产配方(KH2PO4 1g，MgSO4 0.5g，(NH4)2SO4 0.5g，可溶性淀粉20g，琼脂粉20g，豆汁1000ml，自然pH)。
本发明如上步骤(1)至(4)所示的ZA223菌株的筛选方法具有普适性，可以广泛应用于丝状真菌的改造。
酱油企业利用本发明提供的方法来改良现用菌株，有效筛选到一株具备上述特性的优良米曲霉菌种；应用该菌株可以实现开发生产新型果香风味等高端酱油产品，可丰富企业的产品品种，扩大销售市场，助力效益提升。
在一个方面，本发明提供上述的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA223在制曲中的用途。制曲获得的成曲可以用来制备酱油，可以理解的是，本发明所述的酱油的种类包括但不限于生抽、老抽等。制曲获得的成曲可以用来制备酱，包括但不限于黄豆酱。
在一个方面，本发明提供上述的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA223在制备酱油和/或酱中的用途。
在一个方面，本发明提供一种果香味酱油和/或酱的制备方法，包括以下步骤：
ⅰ)将上述的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA223接种至豆类原料或/和小麦类原料中制曲培养；
ⅱ)将ⅰ)制备的成曲与氯化钠溶液混合后，发酵。
本发明所述的豆类原料主要是指来源于豆科作物的原料，例如豆粕、黄豆、黑豆，可以是经脱脂处理的豆类，也可以是未经脱脂处理的豆类。本发明所述的小麦类原料可以为小麦、小麦淀粉，也可以是麸皮。可以理解的是，在制备制曲培养基的过程中，为满足米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA223生长、代谢需求，可以对原料在制曲培养基的具体用量进行适应性调整。
在其中一个示例中，培养可以采用适合米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA223的任意条件，优选培养的条件包括先于25℃～35℃条件下培养，再于26℃～30℃条件下培养，例如制曲前期在28℃～35℃(例如28℃、30℃、32℃、35℃)条件下培养，制曲后期在26℃～30℃(例如26℃、28℃、30℃)条件下培养，关于制曲“前期”、“后期”的理解参照本技术领域的常规理解。以下具体实施例以制曲前期温度为30℃、制曲后期温度为28℃为例对制曲进行举例说明，然而这并非是对本发明技术方案的进一步限制。
在其中一个示例中，发酵的方式为高盐稀态发酵。
在一个方面，本发明提供一种果香味酱油和/或酱，其采用如上所述的制备方法制备。
在一个方面，本发明提供如上所述的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA223在提高酱油和/或酱中醇类、酯类物质含量以及降低酱油和/或酱中醛类、酮类、酸类物质含量的用途。
下述实施例中所述试验方法，如无特别说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特别说明，均可从商业途径获得。
下述实施例中，所述百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1、米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA223菌株的获得
本实施例获取米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA223菌株的技术路线请参考图1：
1、菌种诱变
(1)取沪酿As3.951菌株的成熟斜面孢子制成孢子悬液，并对孢子悬液进行ARTP诱变(功率设置为120W，气量10SLM，处理时间控制在0s～300s但不含有0s)。用0.85％的无菌生理盐水将诱变后的孢子悬液逐级稀释到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6浓度，制成孢子稀释液。
(2)取0.2mL孢子稀释液分别涂布于马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板和察氏琼脂培养基平板上，31℃避光培养63h。培养过程中观察并记录菌落的菌丝生长和产孢情况、产孢时间快慢及菌落大小、色泽等。挑选与出发菌种As3.951相比具有菌丝细短、菌丝层薄、菌落产孢时间延迟、孢子色泽浅等特点的菌落。
(3)将上述两种培养基平板上挑选出的目标菌落继续涂布于豆汁培养基平板上，31℃培养63h。培养过程中观察并记录菌落的菌丝生长和产孢情况等。挑选与出发菌种As3.951相比具有菌丝生长薄且短细、菌丝层薄、产孢时间延迟且孢子细、色泽浅的菌落。
(4)选取满足以上平板筛选条件的突变菌株转接豆汁培养基斜面上，培养成熟后进行常规保藏及进一步筛选，菌株编号为ZA223和ZA224。
该步骤中，将诱变后所得菌株分别在马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板、察氏琼脂平板培养基平板以及豆汁培养基平板上培养筛选，该步骤即为图1中提到的“三种平板培养基交叉筛选”。
2、突变菌株筛选
(1)突变菌株的初筛
将步骤(1)诱变获得的2株目标菌种活化并转接于试管斜面培养基上，培养四天。取成熟斜面培养物分别接种于三角瓶培养基中进行扩培(对应图1中的“三角瓶初筛”步骤)，三角瓶培养基和工艺控制等采用常规方法。其中，培养基是由麸皮、豆粉、面粉、水制备而成。
观察并记录培养过程中菌丝生长情况和产孢情况，并进行成曲指标检测。挑选菌丝生长短薄、产孢时间延迟和孢子量略少的突变菌株ZA223和ZA224进行复筛。
成曲指标的检测采用常规检测方法，检测结果见表1。
表1、不同米曲霉菌株三角瓶成曲质量分析结果
| 菌株名称 | 孢子数 | 发芽率 |
| As3.951 | 1.00 | 1.00 |
| ZA223 | 0.79 | 1.00 |
| ZA224 | 0.85 | 1.00 |
备注：以对照菌株As3.951各项指标为1.00，其它突变菌株换算成相应比值。
(2)突变菌株的复筛
将初筛选出的2株菌ZA223和ZA224依次转接斜面活化后，进行三角瓶扩大培养，然后继续进行制曲和发酵小试(对应图1中的“制曲发酵复筛”步骤)，制曲培养基采用大豆、小麦等原料制备。
观察并记录培养过程中曲料菌丝生长情况和产孢情况，并进行成曲气味感官和指标检测，检测结果见表2。根据表2结果可知，相对于出发菌株As3.951，诱变所得菌株ZA223和ZA224的曲香气味清淡、孢子量略少、成曲pH值高、中性蛋白酶活力和谷氨酰胺酶活力都较高。
检测发酵原油中的氨基氮、全氮、还原糖、谷氨酸，检测结果见表3。根据表3结果可知，相对于出发菌株As3.951，诱变所得菌株ZA223和ZA224的发酵原油所含氨基氮、全氮、谷氨酸升高而还原糖降低。
检测发酵原油的香气物质差异分析，检测结果见表4。根据表4结果可知，相对于出发菌株As3.951，诱变所得菌株ZA223和ZA224发酵原油的香气成分组成中，酯类含量高且醛类、酮类和酸类香气组成含量低。
综合制曲酶活指标和发酵原油指标，优选发酵原油酯类香气组分含量高，且醛类、酮类和酸类香气组成含量低的米曲霉菌株ZA223。
表2、不同米曲霉菌株制曲质量分析结果
| 菌株名称 | 曲香气味浓郁度 | 孢子数 | pH值 | 中性蛋白酶活力 | 谷氨酰胺酶活力 |
| As3.951 | 浓郁 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| ZA223 | 清淡 | 0.75 | 1.13 | 1.19 | 1.70 |
| ZA224 | 清淡 | 0.82 | 1.06 | 1.21 | 1.45 |
备注：以对照菌株As3.951各项理化指标为1.00，其它突变菌株换算成相应比值。
表3、不同米曲霉菌株发酵原油质量分析结果
| 菌株名称 | 氨基氮 | 全氮 | 还原糖 | 谷氨酸 |
| As3.951 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| ZA223 | 1.09 | 1.20 | 0.89 | 1.15 |
| ZA224 | 1.05 | 1.05 | 0.83 | 1.17 |
备注：以对照菌株As3.951各项指标为1.00，其它突变菌株换算成相应比值。
表4、不同米曲霉菌株发酵原油其中五类香气物质含量对比分析结果
本实施例筛选到的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA223菌株的菌落特征如下：
豆汁平板培养基培养63h，菌落直径在42mm左右，菌落黄绿色偏黄，圆形，无明显菌丝层，菌丝薄、短且细，孢子细且多(见图2)。
马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基培养63h，菌落直径在21mm左右，菌落浅黄绿色，圆形，菌丝生长稀薄，孢子幼细(见图3)。
察氏琼脂平板培养基培养63h，菌落直径在11mm左右，菌落浅黄色，圆形，菌丝生长短且薄，孢子细(见图4)。
本发明实施例提供的米曲霉，命名为米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA223，该菌株已于2021年4月30日保藏于广东微生物菌种保藏中心，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No:61635。
实施例2、米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA223菌株的效果验证
将诱变筛选的新菌株米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA223与出发菌株As3.951同步展开酱油生产使用，制曲结束后抽样检测指标，发酵结束后检测原油指标，并进行原油感官评比。结果如表5、表6、表7、表8和图5、图6所示。
表5、制曲质量分析
表6、发酵原油质量分析
表7、发酵原油一些主要差异香气物质含量对比分析(GC-MS法)
表8、发酵原油几种主要香气鉴评结果分析(不同喜好度对比)
将本发明菌株米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA223应用于酱油生产，经制曲、发酵压榨后可以得到发酵原油酯类、醇类香气组成(特别是苯甲酸乙酯、丁酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸丁酯、庚酸乙酯、正丙醇、麦芽醇、苯乙醇、异戊醇)含量高，且醛类、酮类和酸类香气组成含量占比低的酱油，经专业鉴评师评定所得原油风味清雅、带有令人愉悦的果香气味，口感滋味丰富适口，与传统酱香型酱油各有特色，适合开发新型高端酱油等调味液。
综上，本发明菌株具有以下技术优势和积极效果：1、本发明提供的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA223，制备得到的酱油原油具有氨基氮、全氮、谷氨酸含量高且还原糖含量低的特点。且就风味物质而言，具备醇类、酯类物质含量高，醛类、酮类、酸类物质含量低的特点，赋予了酱油原油突出的果香味和清雅的风味，可用于生产新型高端果香味酱油。2、本发明提供的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA223，具有菌丝短薄、产孢子量正常、产孢时间延迟、成曲pH高且曲香清淡的特征，并且成曲所含中性蛋白酶活力和谷氨酰胺酶活力高。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所述附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
Claims (8)
1.米曲霉（Aspergillus oryzae）ZA223，其于2021年4月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC.No：61635，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。
2.如权利要求1所述的米曲霉（Aspergillus oryzae）ZA223在制曲中的用途；制曲获得的成曲用于制备酱油和/或酱。
3.一种成曲，其特征在于，其由如权利要求1所述的米曲霉（Aspergillus oryzae）ZA223接种于豆类原料或/和小麦类原料中培养而得。
4.如权利要求1所述的米曲霉（Aspergillus oryzae）ZA223在制备酱油和/或酱中的用途。
5.一种果香味酱油和/或酱的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
ⅰ）将权利要求1所述的米曲霉（Aspergillus oryzae）ZA223接种至豆类原料或/和小麦类原料中制曲培养；
ⅱ）将ⅰ）制备的成曲与氯化钠溶液混合后，发酵。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤i）中，培养的温度为25~35℃。
7.如权利要求5或者6所述的制备方法，其特征在于，步骤ⅱ）中，发酵的方式为高盐稀态发酵。
8.一种果香味酱油和/或酱，其特征在于，其采用如权利要求5至7任一项所述的制备方法制备。
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