CN109022296A - 一株米曲霉za210及其应用 - Google Patents

Abstract

本公开涉及一株米曲霉ZA210，该米曲霉具有菌丝粗壮、发芽率高、原料消耗率低和综合酶活力高，特别是发酵原油全氮指标高，谷氨酸和丙氨酸含量高、精氨酸含量低等优点，应用于酱油生产可以发酵出风味清纯、口感柔和协调、鲜甜突出、滋味丰富的原油，可以轻松实现工业化生产零添加纯酿酱油，实现节能增效。

Description

一株米曲霉ZA210及其应用

技术领域

本发明属于工业微生物技术领域，尤其涉及一株适用于酱油等调味品生产用的米曲霉(Aspergillus oryzae)菌种，本发明还涉及所述米曲霉菌种在酱油等调味品生产中的应用。

背景技术

目前我国酱油生产用菌种仍以传统的米曲霉为主，其中，中科As3.951具有产孢子能力强和产中性蛋白酶活力高的优势而被普遍采用。米曲霉在酿造酱油中所占地位及作用非常重要。

首先，米曲霉最重要的作用是生成蛋白水解酶类，将原料中的大分子水解成小分子物质，构成酱油呈味物质、风味物质或其前体。其次，米曲霉的重要作用是生成芳香物质或其前体，生成的有机酸、多种醇类或转化成的酯类，是香气成分的重要来源；并且米曲霉发酵过程中菌体自溶物质也是构成酱油风味物质的组成部分。米曲霉菌株的酶系组成和发酵性能等都因菌株而不同。

酱油中的甜味来自糖类、甘油、多元醇和一些呈甜味的氨基酸。酱油的酸味是以乳酸为主的有机酸类，既是呈味成分，又关系到酱油的香气。酱油的强烈咸味能刺激人的味觉而增进食欲，除其本身具有这种作用外，盐的咸味与酱油中其他成分之间有一定的平衡关系。随着酱油的熟成，当其中所含有的肽或氨基酸的生成量增加，咸味就会变得柔和。

酱油的苦味主要是源于某些苦味氨基酸和肽。当肽分子中所含疏水性氨基酸比例较高时，就会产生苦味。加谷氨酸或天冬氨酸可使苦味消失，N-谷氨酰胺寡肽具有苦味遮蔽效果。随着酱油中蛋白质水解的进行，苦味逐渐消失，增加了鲜味，最后成为调味的良好风味。

酱油中的鲜味则主要是以谷氨酸为代表的氨基酸和肽类。

中国专利申请201710500507.7(发明名称为酱油原汁及其制备方法)提供了一种酱油原汁及其制备方法，该专利申请采用低盐稀态酿造法生产风味优良的酱油，酿造过程中通过洁净密闭发酵，抑制有害微生物的产生，从而制得风味优良、成本较低的淡盐酱油。上海市酿造科学研究所陈红玲通过发酵后期添加优良的乳酸菌和酵母菌从而酿制出风味更好的酱油(陈红玲，“进一步筛选菌株酿制优质酱油”，《上海调味品》，1990年02期，第7-10页)。

现有酱油生产用米曲霉菌株存在的缺点最突出表现为发酵原油偏酸、偏咸，后苦味较重，需要通过额外添加一定量的鲜味添加剂来调配口感以达到增鲜效果。

发明内容

本发明提供一株米曲霉新菌种，其能够明显降低制曲阶段的原料消耗率、能够高产亮氨酸氨肽酶E、酸性羧肽酶A和谷氨酰胺酶活力，并且该菌株同时保有米曲霉原有的高蛋白酶活力；应用该菌株酿造酱油等调味品，能够进一步提高全氮利用率，有效解决发酵酱油口感偏咸酸、后苦味较重、鲜甜不突出的问题。

风味优良米曲霉菌株具备以下条件：

1、对于高蛋白酶的米曲霉菌种，酱渣中残余含氮量的减少与全氮利用率的提高是紧密相关，而对降低酱渣中的含氮量贡献最大的酶是亮氨酸氨肽酶，蛋白酶分解出的肽在亮氨酸氨肽酶和酸性羧肽酶等酶的协同作用下分解成氨基酸，从而获得高氨基酸率的酱油。

2、高盐稀态发酵酱油因盐分含量高导致原油综合口感不协调，提高乳酸含量且同时降低醋酸含量即感觉咸味有所减弱；当肽和氨基酸的生成量增加时，酱油的咸味同时会变得柔和适口。

3、酱油中的鲜味主要是以谷氨酸为代表的氨基酸和肽类，当发酵原油中的谷氨酸含量增加时，既可使发酵原油鲜味增强，同时可使发酵原油的苦味消失。

4、酱油氨基酸组分中的甘氨酸、丙氨酸都有一定的甜味；当天冬氨酸和呈苦味的精氨酸转化成其他氨基酸时，可使得酱油的口感得到提升，所得酱油的苦味减弱、柔和性好。

本发明提供以下米曲霉新菌种：

1、本发明提供一株米曲霉ZA210(Aspergillus oryzae ZA210)，其分类学名称为Aspergillus oryzae，该菌株于2017年11月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：60279，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮政编码：510075。

2、米曲霉ZA210的菌落特征如下：豆汁平板培养基培养72h，菌落直径在55mm左右，菌落鲜黄绿色，孢子略粗，菌落表面生长较平整，边缘菌丝略长、菌丝层厚薄一般。酪素平板培养基培养96h，菌落直径在21mm左右，透明圈直径在26mm左右，菌落不太规则，边缘菌丝稀薄不明显，中间孢子嫩黄绿色、稀疏分散。

3、本发明米曲霉ZA210菌株是以米曲霉As3.951为出发菌株，经诱变选育获得。具体地，本发明所述的米曲霉ZA210菌株的诱变选育方法如下：

3.1以米曲霉As3.951为出发菌株，采用公知诱变方法对出发菌株进行诱变获得突变菌落，交叉使用酪素平板培养基和豆汁平板培养基对突变菌落进行筛选。即在酪素平板上挑选与出发菌种As3.951相比具有菌丝粗壮、透明圈大、产孢量略少等特点的菌落；在豆汁平板上挑选与出发菌种As3.951相比具有菌丝生长旺盛且周期长、菌丝体含量多、菌落产孢子略少的菌落。挑选同时满足双平板筛选条件的突变菌株转接豆汁斜面，培养成熟后进行常规保藏及进一步筛选。

3.2初筛方法为保藏菌种由豆汁斜面活化后转接三角瓶培养，观察米曲霉生长情况。挑选菌丝生长旺盛和孢子着生正常的突变菌株，采用常规方法检测成曲的发芽率和孢子数，优选发芽率高的菌株进行复筛。

3.3复筛方法为按照常规酱油生产方法进行小规模的制曲，检测制曲成曲孢子数、原料消耗率、中性蛋白酶、亮氨酸氨肽酶E、酸性羧肽酶A和谷氨酰胺酶活力，优选综合酶活力高的菌株进行生产试用。

3.4生产试用为按照常规酱油生产方法进行酱油生产，检测制曲成曲指标和发酵酱油质量。

4、其中，上述3.1所述的酪素平板培养基的配方为：称取6g干酪素，0.36g磷酸二氢钾，0.58g磷酸氢二钠，0.244g硫酸镁，20g琼脂粉，溶于1000mL蒸馏水中，调节pH6.0，分装，0.1Mpa、121℃灭菌20min。豆汁平板培养基采用豆汁斜面生产配方。

因此，在一方面，本发明提供一株米曲霉ZA210。

在另一方面，本发明提供米曲霉ZA210在食品发酵中的用途。在一个实施方案中，食品发酵为酱油发酵。

在又一方面，本发明提供米曲霉ZA210在制曲中的用途。在一个实施方案中，制曲获得的成曲用于制备酱油。

在另一个方面，本发明提供米曲霉ZA210在制备酱油中的用途。

本发明的创新之处在于：

利用米曲霉ZA210发酵的原油风味更加清纯，综合口感柔和适口、鲜甜突出、协调性好，适合用于调味品企业生产零添加高档酱油等产品。

1、米曲霉ZA210具有蛋白分解能力强—蛋白酶、亮氨酸氨肽酶E、酸性羧肽酶A和谷氨酰胺酶活力高，发酵原油氨基氮、全氮和谷氨酸等指标高的特性。由于含氮成分等较高，故所得发酵原油的缓冲能力强，在酱油中的含酸量等量的情况下，所得含氮成分高的发酵原油的口感比含氮成分低的原油更加适口、酸味柔和。

2、利用米曲霉ZA210发酵的原油的谷氨酸含量高，口感鲜味突出。

3、在利用米曲霉ZA210发酵的原油的氨基酸组分中，丙氨酸含量高，精氨酸含量低，所得发酵原油其口感甜味提升、苦味减弱，整体风味得到提升。

本发明具有以下技术优势和积极效果：

1、本发明米曲霉ZA210菌株的筛选方法具有普适性，可以广泛应用于丝状真菌的改造。

2、本发明提供的米曲霉ZA210，具有菌丝粗壮、发芽率高、原料消耗率低和综合酶活力高，特别是发酵原油全氮指标高，谷氨酸和丙氨酸含量高、精氨酸含量低等优点，应用于酱油生产可以发酵出风味清纯、口感柔和协调、鲜甜突出、滋味丰富的原油，可以轻松实现工业化生产零添加纯酿酱油，实现节能增效。

酱油企业利用本发明提供的方法来改良现用菌株，可有效筛选到具备上述特性的优良米曲霉菌种；应用该菌株可以实现生产零添加纯酿等高端酱油产品，既可提升企业的产品口碑，同时效益也会得到显著提升。

附图说明

图1是米曲霉ZA210在豆汁培养基上的菌落形态。

图2是获取米曲霉ZA210的技术路线。

图3是采用米曲霉ZA210获得的原油的鉴评分析结果。

生物保藏信息

一株米曲霉ZA210(Aspergillus oryzae ZA210)，其分类学名称为Aspergillusoryzae，该菌株于2017年11月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：60279，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮政编码：510075。

具体实施方式

下述实施例中所述试验方法，如无特别说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特别说明，均可从商业途径获得。

下述实施例中，所述百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例

实施例1-米曲霉ZA210的筛选获得

1、菌种诱变

取中科As3.951菌株的成熟斜面孢子制成孢子悬液，并对孢子悬液进行ARTP诱变。用0.85％的无菌生理盐水将诱变后的孢子悬液逐级稀释到10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6浓度，制成孢子稀释液。

取0.2mL孢子稀释液涂布于酪素平板培养基上，31℃避光培养96h。培养过程中观察并记录菌落的菌丝生长和产孢情况、透明圈形成的快慢及透明圈大小等。挑选与出发菌种As3.951相比具有菌丝粗壮、透明圈大、产孢量略少等特点的菌落。

将上述酪素平板上挑选出的目标菌落继续涂布于豆汁平板培养基上，31℃培养72h。培养过程中观察并记录菌落的菌丝生长和产孢情况等。挑选与出发菌种As3.951相比具有菌丝生长旺盛且周期长、菌丝体含量多、菌落产孢子略少的菌落。

选取在双平板培养基上面菌落生长好、菌丝粗壮且生长旺盛、孢子生成量略少、透明圈直径大的菌落为目标菌落，转接斜面培养，成熟后进行菌种保藏，编号依次为ZA210-ZA215。

2、诱变菌株筛选

(1)、诱变菌株的初筛

将诱变获得的6株目标菌种活化转接于试管斜面培养基上，培养四天。取成熟斜面分别接种于三角瓶培养基中进行扩培。(三角瓶培养基和工艺控制等采用常规方法。其中，培养基是由麸皮、豆粉、面粉、水制备而成)。挑选菌丝生长旺盛和孢子着生正常的突变菌株ZA210、ZA211、ZA212、ZA213、ZA214、ZA215等检测成曲指标(采用常规检测方法)，检测结果见表1。

表1菌株筛选——三角瓶成曲质量分析结果

备注：以对照菌株As3.951各项指标为1.00，其它诱变菌株换算成相应比值。

优选生长正常和发芽率高的菌株ZA210、ZA211、ZA212、ZA214、ZA215进行复筛。

(2)、诱变菌株的复筛

将初筛选出的5株菌株ZA210、ZA211、ZA212、ZA214、ZA215依次转接斜面活化后，进行三角瓶扩大培养，然后继续进行制曲和发酵小试。(制曲培养基采用大豆、小麦等原料制备)。检测制曲成曲孢子数、原料消耗率、中性蛋白酶、亮氨酸氨肽酶E、酸性羧肽酶A和谷氨酰胺酶活力，检测结果见表2；检测发酵原油氨基氮、全氮、还原糖、谷氨酸等指标，检测结果见表3；检测发酵原油的有机酸含量分析，检测结果见表4；检测发酵原油的氨基酸组成分析，检测结果见表5。

表2菌株筛选——制曲质量分析结果

备注：以对照菌株As3.951各项指标为1.00，其它诱变菌株换算成相应比值。

如表2的制曲质量分析结果所显示的，米曲霉ZA210菌株具有如下特点：(1)孢子生成量略少，菌丝粗壮且生长旺盛；(2)综合酶系高，蛋白酶活力、亮氨酸氨肽酶E活力、酸性羧肽酶A活力和谷氨酰胺酶活力显著提升20％左右，其中酸性羧肽酶A的活力更是提升了36％，因此预期米曲霉ZA210菌株可显著提高发酵原油的理化指标水平。

表3菌株筛选——发酵原油质量分析结果

备注：以对照菌株As3.951各项指标为1.00，其它诱变菌株换算成相应比值。

如表3的结果所示，米曲霉ZA210菌株发酵指标检测结果显示，其具有氨基氮和全氮高、还原糖高和谷氨酸高的优势。上述发酵指标有利于改善发酵原油的鲜味和甜味，使口感更加丰富，因此，米曲霉ZA210菌株具有明显优势。

表4菌株筛选——发酵原油中一些主要呈味氨基酸含量分析结果

如表4的结果所示，米曲霉ZA210菌株所得发酵原油中，甘氨酸、丙氨酸含量均高于对照菌株，而精氨酸和天冬氨酸含量则低于对照菌株。上述发酵指标有利于改善发酵原油的鲜味和甜味，使口感更加丰富，因此，米曲霉ZA210菌株具有明显优势。

表5菌株筛选——发酵原油中几种有机酸含量分析结果

如表5的结果所示，米曲霉ZA210菌株所得发酵原油中苹果酸、乳酸和柠檬酸含量高，焦谷氨酸、乙酸和琥珀酸含量低，有利于呈现酱油的酸味并调和酱油的香气。

因此，综合制曲酶活指标和发酵原油指标，优选全氮收得率、谷氨酸指标最高，有机酸组成中乳酸和柠檬酸含量高、乙酸含量少，氨基酸组成中丙氨酸含量高、精氨酸含量低的米曲霉ZA210菌株。

本实施例选育获得的米曲霉ZA210菌株已经保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：60279。

实施例2-米曲霉ZA210菌株的效果验证

将诱变筛选的新菌株ZA210与出发菌株As3.951同步展开酱油生产使用，制曲结束后抽样检测酶活，发酵结束后检测原油指标，并对原油进行感官评比。

各项指标检测结果如表6、表7、表8、表9所示，感官评比结果见图3。

表6制曲质量分析

如表6的结果所示，米曲霉ZA210菌株孢子数比As3.951略少，菌丝粗壮且生长旺盛，蛋白酶活力、亮氨酸氨肽酶E活力、酸性羧肽酶A活力和谷氨酰胺酶活力均高于As3.951的相应指标。

表7发酵原油质量分析

如表7的结果所示，米曲霉ZA210菌株具有氨基氮和全氮高、还原糖高和谷氨酸高的优势，全氮收得率也显著高于对照菌株。

表8发酵原油中一些主要呈味氨基酸含量分析

如表8的结果所示，米曲霉ZA210菌株所得发酵原油中，甘氨酸、丙氨酸含量均高于对照菌株，而精氨酸和天冬氨酸含量则低于对照菌株。

表9发酵原油中几种有机酸含量分析

如表4的结果所示，与对照菌株相比，采用米曲霉ZA210菌株发酵的原油中苹果酸、乳酸和柠檬酸含量高，焦谷氨酸、乙酸和琥珀酸含量低。

综上可知，将本发明米曲霉ZA210应用于酱油生产，经制曲、发酵压榨后可以得到原料消耗率6.2％、全氮收得率90％、还原糖9.8g/100ml、谷氨酸12.68g/kg、有机酸中乳酸含量6.69g/l、乙酸含量2.24g/l，呈味氨基酸丙氨酸含量5.34mg/ml(占比超过10％)、精氨酸含量2.18mg/ml(占比低于5％)的原油。经专业鉴评师评定，所得原油具有风味清纯、口感柔和协调、鲜甜突出、滋味丰富适口的特征。

上述实施例只是用于对本发明的内容进行阐述，而不是限制；因此在和本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应该认为是包括在权利要求书的范围内。

本说明书中引用的所有出版物和专利申请通过引用并入本文，如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指明通过引用并入。此外，本文所述的任何理论、机制、证明或发现旨在进一步增强对本发明的理解，并且不意图以任何方式将本发明限制到这样的理论、机制、证明或发现。尽管已经在附图和前面的描述中详细地示出和描述了本发明，但是本发明应当被认为是说明性的而不是限制性的。

Claims (6)

1.米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA210，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮政编码：510075，保藏号为GDMCC No：60279。

2.权利要求1的米曲霉ZA210在食品发酵中的用途。

3.权利要求2所述的用途，其中食品发酵为酱油发酵。

4.权利要求1的米曲霉ZA210在制曲中的用途。

5.权利要求4所述的用途，其中制曲获得的成曲用于制备酱油。

6.权利要求1的米曲霉ZA210在制备酱油中的用途。