CN109370924B - 一株米曲霉za112及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA112。本发明还公开了米曲霉ZA112在制曲中的应用，以及制曲获得的成曲用于制备酱油和/或酱。本发明还公开了米曲霉ZA112在制备酱油和/或酱中的应用。本发明提供的米曲霉ZA112，具有大豆蛋白溶出率高、原料利用率高和综合酶活力高等优点，应用于酱油生产可以做到对原料预处理能耗低，发酵过程不用再额外添加各种用途的酶制剂，就可以获得风味鲜甜突出、滋味醇厚、酱香浓郁、留口持久的发酵原油，可以轻松实现工业化生产零添加纯酿酱油，也无需通过后期调配其他添加剂来制造成品，工艺步骤简单、节约了生产成本。

Description

一株米曲霉ZA112及其应用

技术领域

本发明属于食品发酵与食品加工技术领域，涉及米曲霉(Aspergillus oryzae)，具体涉及一种适用于酱油生产的米曲霉ZA112，还涉及所述米曲霉在提高原料利用率方面的应用。

背景技术

酿造酱油是采用大豆为主要原料，加入水，食盐经过制曲和发酵，再在各种微生物繁殖分泌的各种酶的作用下酿造而成，而酿造过程中每生产1Kg酱油约产生0.4Kg酱油渣。酱油渣中仍然含有丰富的原料粗蛋白及大量的碳水化合物、油脂和矿物质等营养成分，不仅造成原料资源的大量浪费，而且易导致全氮和氨基酸态氮含量的不足，严重影响着酿造酱油的鲜味和质量，而全氮和氨基酸态氮主要依赖于微生物对大豆中原料蛋白的水解发酵，由于大豆中细胞壁成分包裹着大豆蛋白，并且阻碍蛋白酶对大豆蛋白的水解作用。因而，大豆中原料蛋白的水解及溶出成为制约酿造酱油中全氮和氨基酸态氮含量的重要因素。大豆细胞壁由90％以上的多糖构成，该多糖主要为纤维素、半纤维素和果胶类物质，它们是由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸等聚合而成。采用生物降解方法破坏大豆细胞壁，是一种安全、高效的选择，细胞壁的生物降解具体是通过阿拉伯聚糖酶打开支链，从而破坏细胞壁，使得大豆蛋白从细胞壁内释放出来，提高大豆中原料蛋白的水解及溶出率，进而提高酿造酱油中全氮及氨基酸态氮的含量。

中国专利申请CN 102972737中公开了高植物蛋白原酿酱油的生产工艺，通过将高蛋白脱脂大豆进行蒸煮膨化、高蛋白小麦进行沸腾烘焙工艺处理后为高蛋白原料中蛋白质和多糖类水解提供有利条件。中国专利申请CN 107495290中公开了微生物发酵酱油及其酿造方法，通过接种中性蛋白酶高活性的米曲霉菌，对豆粕进行蒸煮以及对小麦进行焙炒，采用密闭发酵工艺进行酱油酿造。上述专利虽然都涉及通过对原料进行膨化、蒸煮以破坏原料细胞壁，并且通过蒸煮可使原料蛋白质适度变性，一定程度上为蛋白质及多糖类水解提供有利条件，但存在工艺复杂、生产成本高的问题，发酵过程中额外添加各种用途的酶制剂，进一步增加了生产成本，且现有技术中均未论述米曲霉在提高大豆中原料蛋白的水解及溶出率方面的应用。

发明内容

鉴于以上技术的不足，本发明的目的在于提供一株阿拉伯聚糖酶活性高的米曲霉菌株，阿拉伯聚糖酶能破坏大豆细胞壁，使得大豆蛋白从细胞壁内释放出来,应用该菌株酿造酱油、酱等调味品，不仅能够提高大豆中原料蛋白的溶出及水解率，进而提高酿造酱油中全氮及氨基酸态氮的含量和原料利用率，而且能够提升酿造调味品的风味，避免额外添加鲜味剂，降低了生产成本。

为实现本发明的目的，本发明人通过大量的实验和不懈的探索，最终获得了如下技术方案：

在一个方面，本发明提供了一株米曲霉ZA112，已于2018年11月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC.NO：60493，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮政编码：510075。

本发明的米曲霉ZA112的菌落特征如下：

该菌株在麦麸平板上培养72h，成熟菌落周围透明圈都较清晰，菌落透明圈直径达26mm，菌丝体细、绒、分散密度较不均匀，孢子生长延迟，孢子细密、适量、色泽黄绿色。该菌株在豆汁平板上呈黄色(或呈轮状黄色与浅黄色相间)，菌丝稀薄，孢子细，反面培养基皱褶明显。

本发明的米曲霉ZA112，以沪酿3.042为出发菌株，通过公知诱变方法中紫外诱变获得变异菌株。具体地，本发明所述的米曲霉ZA112菌株的诱变选育方法如下：

(1)米曲霉沪酿3.042为出发菌株，采用公知诱变方法对出发菌株进行诱变，获得突变菌落，使用麦麸培养基对突变菌落进行筛选。即在含麦麸的平板上挑选与出发菌种沪酿3.042相比具有菌丝生长正常、透明圈大、孢子生长延迟，孢子细密、适量、色泽黄绿色的菌落，挑选满足筛选条件的突变菌株转接豆汁斜面，培养成熟后进行常规保藏及进一步筛选。

上述麦麸培养基的配方为(按重量百分比计)：麦麸10％、NH₄NO₃ 0.28％、KH₂PO₄0.2％、MgSO₄·7H₂O 0.08％、NaNO₃ 0.31％、pH 5.5，余量水，灭菌冷却后接种突变菌株(每斜面孢子悬浮液接种2瓶)在30℃条件下培养4d。

(2)初筛方法：将保藏菌种由豆汁斜面活化后转接三角瓶培养，观察米曲霉生长情况，挑选菌丝生长和孢子着生正常的突变菌株，采用常规方法检测成曲孢子数、中性蛋白酶和阿拉伯聚糖酶活力高，优选综合酶活力高的菌株进行复筛。

(3)复筛方法：按照常规酱油生产方法进行小规模的制曲，检测制曲成曲孢子数、中性蛋白酶和阿拉伯聚糖酶活性高，优选综合酶活力高的菌株进行生产试用。其中，生产试用为按照常规酱油生产方法进行酱油生产，检测制曲成曲指标和发酵酱油质量。

本发明提供一株保藏号为GDMCC.NO：60493的米曲霉ZA112及其筛选方法和在酱油等调味品中的应用。

本发明所述米曲霉ZA112具有生长速度快、成曲孢子丰富、中性蛋白酶和阿拉伯聚糖酶活力高、大豆蛋白溶出率高的特征。

本发明所述米曲霉ZA112还具有发酵酱油全氮、氨基酸态氮收得率高的特征。

本发明所述米曲霉ZA112还具有发酵酱油口感鲜甜突出的特征。

因此，在一方面，本发明提供米曲霉ZA112。

在另一方面，本发明提供米曲霉在提高大豆中原料蛋白的水解及溶出率中的应用。

在又一方面，本发明提供所述米曲霉ZA112在食品发酵中的用途。在一个实施方案中，所述食品发酵为酱油和/或酱发酵。

在另一个方面，本发明提供所述米曲霉ZA112在制曲中的用途。在一个实施方案中，所述制曲获得的成曲用于制备酱油和/或酱。

在又一个方面，本发明提供所述米曲霉ZA112在制备酱油和/或酱中的用途。

在另一个方面，本发明提供一种米曲霉的培养方法，其中使用所述的米曲霉ZA112作为培养菌株。

在又一个方面，本发明提供一种制备鲜味剂培养物的方法，其以所述米曲霉ZA112为发酵菌剂。

综上所述，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供的米曲霉ZA112，具有大豆蛋白溶出率高、原料利用率高和综合酶活力高等优点，应用于酱油生产可以做到对原料预处理能耗低，发酵过程不用再额外添加各种用途的酶制剂，就可以获得风味鲜甜突出、滋味醇厚、酱香浓郁、留口持久的发酵原油，可以轻松实现工业化生产零添加纯酿酱油，也无需通过后期调配其他添加剂来制造成品，工艺步骤简单、节约了生产成本；

(2)酱油企业利用本发明提供的方法来改良现用菌株，可以有效筛选到一株具备上述特性的优良米曲霉菌种；应用该菌株进行酱油生产，制曲和发酵环节不用再额外投入其它菌株、工艺和物料等，节约了人力、物力等方面的投入，企业效益会显著得到提高。

附图说明

图1为米曲霉ZA112的获得及应用流程图；

图2为采用米曲霉ZA112发酵所得酱油的感官鉴评结果图。

具体实施方式

本发明提供一株阿拉伯聚糖酶活性高，能够破坏大豆细胞壁，使得大豆蛋白从细胞壁内释放出来，提高大豆中原料蛋白的溶出及水解率，进而提高酿造酱油中全氮及氨基酸态氮的含量的菌株；本发明的另一个目的是提供上述米曲霉的培养方法；本发明的第三个目的是提供一种应用上述米曲霉制备高品质酱油或酱的方法。

本发明提供的米曲霉ZA112，是以沪酿3.042为出发菌株，可通过公知诱变方法中的任一种进行诱变所获得变异菌株。该菌株具有阿拉伯聚糖酶活性高的优点，能够破坏大豆细胞壁，使得大豆蛋白从细胞壁内释放出来，提高大豆中原料蛋白的溶出及水解率，进而提高酿造酱油中全氮及氨基酸态氮的含量。

本发明将通过诱变所得米曲霉ZA112应用于酱油生产，可以做到对原料预处理能耗低、发酵过程不用再额外添加各种用途的酶制剂，就可以获得发酵原油风味鲜甜突出、滋味醇厚、酱香浓郁、留口持久的原油，可以轻松实现工业化生产零添加纯酿酱油，也无需通过后期调配其他添加剂来制造成品，工艺步骤简单、节约了生产成本。

在本发明中，以米曲霉沪酿3.042为出发菌株，该菌株对于本技术领域的专业人员来说是容易获得的菌株，由中国工业微生物研究所和中国普通微生物研究所等保藏机构保藏。本发明的菌株可以通过公知的任意诱变方法来构建，例如紫外线诱变或者硫酸二乙酯诱变、重离子束诱变等。本发明以米曲霉沪酿3.042为出发菌株，经诱变、筛选菌落、豆汁斜面培养后所得米曲霉ZA112常规保藏，已于2018年11月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC.NO：60493，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮政编码：510075。

为了促进对本发明的理解，以下将参考某些实施方式，并且将使用特定语言来描述本发明。然而，应当理解的是，这些具体实施方式不意图限制本发明的范围。所描述的实施方式中的任何改变和进一步的修改，以及本发明的任何进一步应用，均为本领域技术人员通常会想到的。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中，所述百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1 米曲霉菌株诱变

将培养成熟的沪酿3.042菌株的孢子制成孢子悬液，并对孢子悬液进行紫外诱变，经过紫外诱变后的孢子悬液按照10倍梯度稀释法，用无菌生理盐水将孢子悬液稀释到10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6浓度，制成孢子稀释液。

取0.2mL孢子稀释液涂布于麦麸平板培养基上，30℃避光培养4d。在培养过程中观察并记录菌落的生长情况、透明圈形成的快慢、透明圈大小、测量计算圈径比。该过程共观察并记录到32个单菌落，其中菌落生长速度快、圈径比大的菌株有5株。

将上述5株菌株转接到麦麸平板培养基上，30℃培养箱培养5d。在培养过程中观察并记录菌落的生长情况、透明圈形成的快慢、透明圈大小、测量计算圈径比。该过程观察并记录到菌落生长速度快、圈径比大的菌株有5株，分别编号为LA001、LA002、LA003、LA004、LA005。

将上述5株菌株转接豆汁斜面培养基，30℃培养箱培养至成熟后置于4℃冰箱保藏备用。

实施例2 诱变菌株的筛选

(1)诱变菌株的初筛

将上述诱变获得的5株目标菌种活化转接于试管斜面培养基上，培养四天。取成熟斜面分别接种于三角瓶培养基中进行扩培。其中，培养基是由麸皮、豆粉、面粉、水制备而成；三角瓶培养基和工艺控制等采用常规方法。

挑选菌丝生长和孢子着生正常的菌株LA001、LA002、LA003、LA004、LA005检测成曲指标(采用常规检测方法)，检测结果见表1。

表1 菌株筛选三角瓶成曲质量分析结果

菌株	孢子数	中性蛋白酶活力	阿拉伯聚糖酶活力
				As3.042	1.00	1.00	1.00
LA001	0.85	1.18	1.20
				LA002	0.87	1.02	1.06
LA003	0.90	1.08	1.04
				LA004	0.91	1.16	1.21
LA005	0.92	1.20	1.25

备注：以对照菌株沪酿3.042各项指标为1.00，其它诱变菌株换算成相应比值。

优选生长正常和综合酶活力高的菌株LA001、LA004，LA005进行复筛。

(2)诱变菌株的复筛

将上述初筛选出的3株菌LA001、LA004、LA005依次转接斜面活化后，进行三角瓶扩大培养，然后继续进行制曲和发酵小试(制曲培养基采用大豆、小麦等原料制备)。检测制曲成曲孢子数、原料消耗率、中性蛋白酶和阿拉伯聚糖酶的酶活，检测结果见表2；检测发酵原油氨基氮、全氮等指标，检测结果见表3。

表2 菌株筛选制曲质量分析结果

菌株	孢子数	原料消耗率	中性蛋白酶活力	阿拉伯聚糖酶活力
					As3.042	1.00	1.00	1.00	1.00
LA001	0.90	0.95	1.19	1.08
					LA004	0.95	1.00	1.17	1.10
LA005	0.82	0.86	1.22	1.26

备注：以对照菌株沪酿3.042各项指标为1.00，其它诱变菌株换算成相应比值。

表3 菌株筛选发酵原油质量分析结果

菌株	氨基氮	全氮
			As3.042	1.00	1.00
LA001	0.98	1.00
			LA004	1.01	1.02
LA005	1.09	1.12

备注：以对照菌株沪酿3.042各项指标为1.00，其它诱变菌株换算成相应比值。

从上表2和3的结果可以看出，综合制曲酶活指标和发酵原油指标，优选氨基氮、全氮指标最高的米曲霉菌株LA005进行后续试验。

本实施例选育获得的LA005已经由本发明人于2018年11月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，命名为米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA112，保藏编号为GDMCC 60493，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。因此，在本申请中，LA005与ZA112是指同一菌株。

实施例3 米曲霉ZA112菌株遗传稳定性检测

将实施例2筛选出的米曲霉菌株ZA112经豆汁斜面培养基连续传代10代，观察各代菌株的生长情况，并将第1代、第5代和第10代斜面菌种按照实施例1所述方法逐级扩大制备成三角瓶曲和制曲，判断其遗传稳定性，若十代测定孢子数、中性蛋白酶活力和阿拉伯聚糖酶活力误差在10％误差范围内，则表明菌株遗传稳定性良好。具体数据见表4。

表4 米曲霉菌株ZA112传代稳定性的制曲检测结果

检测项目	ZA112第1代	ZA112第5代	ZA112第10代	As3.042
					孢子数	0.85	0.87	0.89	1.00
中性蛋白酶活力	1.22	1.25	1.24	1.00
					阿拉伯聚糖酶活力	1.26	1.24	1.25	1.00

备注：以对照菌株沪酿3.042各项指标为1.00，其它诱变菌株换算成相应比值。

如表4的结果所示，从制曲成曲孢子数、中性蛋白酶和阿拉伯聚糖酶活检测结果来看，米曲霉菌株ZA112的遗传稳定性好。

实施例4 米曲霉ZA112在酱油发酵中的效果

将实施例2诱变筛选获得的米曲霉菌株ZA112与出发菌株沪酿3.042同步展开酱油生产使用，分别将ZA112与沪酿3.042菌株的成曲加入2倍的盐水进行高盐稀态发酵，发酵温度及发酵周期管理按照常规方法进行，发酵结束压榨后所得的酱油进行氨基酸态氮、全氮的检测，检测结果见表5。

表5 米曲霉菌株ZA112发酵酱油质量分析

压榨后剩余的酱渣进行大豆蛋白含量检测，将酱渣大豆蛋白含量检测结果与曲料大豆蛋白含量检测结果进行比较，结果汇总于表6。

表6 米曲霉菌株曲料、酱渣蛋白含量检测结果

本实施例还召集10名有丰富经验的鉴评人员进行感官鉴评。感官鉴评的评价指标包括体态、色泽、香气、鲜味、甜味、苦涩味、咸味、酸味和综合口感，感官鉴评结果总结于表7和图2中。

表7 米曲霉菌株ZA112发酵酱油感官鉴评结果

菌株	体态	色泽	香气	鲜味	甜味	苦涩味	咸味	酸味	综合评分
										ZA112	3.65	3.79	3.52	3.52	3.58	3.78	3.66	3.89	3.67
As3.042	3.42	3.50	2.95	3.04	2.68	3.15	3.25	3.49	2.91

备注：表中数据为10名鉴评人员鉴评结果的平均值。各单项指标评分分值为1～5分，分数越高，该项指标越好。

从表5和6的结果可以看到，将本发明的米曲霉ZA112应用于酱油生产，其原料消耗率进一步降低，经制曲发酵压榨后可以得到全氮1.96g/100ml、氨基酸态氮1.14g/100ml的原油，原料中蛋白利用率达到85.09％。

如表7的结果所示，经专业鉴评人员评定，所得原油具备酱香浓郁、鲜甜突出、滋味醇厚持久的特征。

本文提供的任何和所有实施例或示例性语言的使用仅旨在更好地说明本发明，而不对本发明的范围构成限制，除非另有要求。说明书中的语言不应被解释为指示任何未要求保护的元素对于实施本发明是必要的。

本说明书中引用的所有出版物和专利申请通过引用并入本文，如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指明通过引用并入。此外，本文所述的任何理论、机制、证明或发现旨在进一步增强对本发明的理解，并且不意图以任何方式将本发明限制到这样的理论、机制、证明或发现。尽管已经在附图和前面的描述中详细地示出和描述了本发明，但是本发明应当被认为是说明性的而不是限制性的。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (8)

1.一株米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA112，其已于2018年11月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC 60493，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。

2.权利要求1的米曲霉ZA112在食品发酵中的用途。

3.权利要求2所述的用途，其中食品发酵为酱油和/或酱发酵。

4.权利要求1的米曲霉ZA112在制曲中的用途。

5.根据权利要求4所述的用途，其中制曲获得的成曲用于制备酱油和/或酱。

6.权利要求1的米曲霉ZA112在制备酱油和/或酱中的用途。

7.米曲霉的培养方法，其中使用权利要求1所述的米曲霉ZA112作为培养菌株。

8.制备酱油的方法，其以权利要求1的米曲霉ZA112为发酵菌剂。