CN103555594B - 一种米曲霉及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开米曲霉（Aspergillus oryzae）zw102CCTCC NO：M2013386及其在制备酱油或酱中的应用。通过实施例证明该菌株具有遗传性能稳定,易于扩大培养；同时在制曲阶段产中性蛋白酶活力高、产孢子量少，有利于保持车间现场卫生，避免孢子飞扬；在发酵阶段易于与盐水混合均匀使发酵充分，可提高原料利用率和减少杂菌污染，从而稳定的获得高品质的发酵调味品。本发明米曲霉菌株（Aspergillus oryzae）zw102适用于大规模工业化生产调味品使用，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及一种米曲霉，尤其涉及一种适用于酱油、酱等调味品的米曲霉。
背景技术
目前，中国酱油、酱等调味品生产用菌种仍以传统的米曲霉为主，绝大多数调味品生产企业使用As3.951(沪酿3.042)菌株，其特点主要表现在：
1、-酶系较全。具有蛋白水解酶和肽酶、淀粉酶和糖化酶等，能分解蛋白质和淀粉原料生成较大量的氨基酸和还原糖等酱油、酱所需成分。
2、生长旺盛、产孢能力强。
3、传代遗传稳定性好。
沪酿3.042菌株酶系完整，发酵后酱油、酱风味好，特别是遗传稳定性强，可以说是一株十分优秀的菌株。但由于该菌株生长旺盛、产孢子能力特强的特性，造成扩培各阶段包括制曲成曲的孢子大量着生；出曲过程中及出曲后一段时间内，车间内孢子飞扬，不利于车间环境卫生的保持；而且孢子多的曲料疏水性强，不利于浸泡盐水进行发酵。
除此之外，国内外也有部分调味品生产企业使用酱油曲霉（Asperjillus sojae）菌株，与米曲霉As3.951对比，-酱油曲霉特点主要有：成曲pH高；曲中的α-淀粉酶、酸性蛋白酶、酸性羧基肽酶活性较低；制曲过程中碳水化合物的消耗量少；曲中还原糖、乙醇、氨的含量较多；产孢子能力较弱。此类菌株发酵出品的酱油铵盐含量较高，口感苦味较重；特别是由于产孢性能较弱，不适合大规模酱油、酱生产使用。
专利申请号为“200610012114.3”、名称为“米曲霉菌株及其应用”的专利以及专利申请号为“200610012115.8”、名称为“一株米曲霉菌株及其应用”分别公开了一株米曲霉，特点是成曲颜色鲜艳，手感轻，菌丝结块好，孢子着生好，发酵制备酱油产量高、能耗低。这两个专利文献中，菌株的特性描述中都提到所发明菌株的孢子着生情况，两个菌株的产孢特性都是孢子着生好，与沪酿3.042一样存在着制曲成曲孢子多、不利于车间环境卫生的保持、不利于充分浸泡盐水进行发酵的问题。
制曲就是利用米曲霉产生各种各样的酶的过程，制曲需要获得的是米曲霉产生的各种酶系，而不是获得可以用来传宗接代的米曲霉孢子，所以说米曲霉的孢子不是制曲阶段所需的产物，相反制曲阶段产生太多的米曲霉孢子给酱油生产带来了不利的影响：首先是米曲霉的孢子体积微小、容易飞扬，易污染生产环境，加大了生产环境的清洗难度；其次，米曲霉的孢子是疏水性的，含有大量孢子的曲料浮力增大，易在盐水表面漂浮，不利于盐水及时浸泡到曲料，阻碍了酶对蛋白质和淀粉原料的接触分解，同时也阻碍了盐水对曲料中污染菌的抑制。
《UE336-2米曲霉菌株的诱变选育》介绍以沪酿3.042米曲霉为出发菌株，采用快中子、紫外线、氯化锂等交替诱变育种，筛选出UE336-2新菌种，并测得中性蛋白酶比原菌显著提高，但孢子发芽生长速度对原菌慢2-3h，孢子数明显减少，对制曲管理要求较高，不利于大规模工业化调味品生产使用。
一株优良的酱油生产用米曲霉应具备制曲阶段孢子量少的特点。通过诱变筛选获得产孢子量少、但是产酶量不少的米曲霉菌种，即可解决制曲阶段孢子量多带来的问题，但是产孢量少的米曲霉菌种在种曲阶段产孢量也少，不便于获得足够多的孢子进行制曲，给实际生产带来了困难。现有的米曲霉菌种在种曲和制曲阶段的产孢情况比较一致：种曲产孢多的菌株，制曲产孢也一样丰富，这样的菌株虽然易于产业化应用，但制曲孢子多导致出曲时孢子飞扬，对车间环境影响很大；反之，制曲孢子少的菌株，出曲时几乎没有孢子飞散，但这样的菌株种曲孢子也少，很难获得足够多的孢子用于制曲同时孢子发芽生长速度缓慢，导致制曲管理困难，难以大规模工业化生产应用获得品质优良的调味品。
由此可见，如何提供一株既能易于扩大培养获得高孢子量的种曲，同时又不会在制曲时产生大量孢子的米曲霉菌种，既能满足工业化大生产应用同时又不会对环境造成严重危害的米曲霉菌株，这是本领域目前需要解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种米曲霉，能够满足工业化生产同时对环境危害小。基于此，本发明还提供该米曲霉在制备酱油或酱中的应用。
为解决以上技术问题，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种米曲霉，其保藏编号为CCTCC NO：M2013386。
本发明提供的米曲霉（Aspergillus oryzae）zw102，已于2013年9月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉市武昌珞珈山，保藏编号为CCTCCNO：M2013386。
本发明还提供了米曲霉zw102在制备酱油或酱中的应用。
本发明的米曲霉（Aspergillus oryzae）zw102，即为以沪酿3.042为出发菌株，通过公知诱变方法之一诱变获得变异菌株，在酪蛋白平板上筛选透明圈比对照菌株大且菌丝生长旺盛的菌株。该菌株在麦芽汁琼脂培养基（MEA）上生长快，25℃黑暗条件下培养5天，菌落直径35-37mm，质地绒状；产孢结构大量形成，分生孢子头白色渐变为黄绿色，初期球形，后期辐射状；菌落背面浅褐色，无水溶性色素。分生孢子梗高大，宽4.4-11.9μm，壁明显粗糙；顶囊球形，直径12-20μm，大部分表面可育；产孢结构单层，瓶梗8.0-12.8×4.0-5.1μm；分生孢子近球形，浅黄绿色，表面光滑，4.4-7.6μm。未见有性孢子。
通常认为一株优秀的酱油生产用米曲霉菌种应具备生长旺盛、产孢量多、易于扩大培养的特点，同时具备酶系代谢旺盛、全面，可有效分解蛋白质和淀粉原料形成酱油所需成分，提高原料利用率，还应具备一定的遗传稳定性，利于长期获得质量稳定的发酵酱油。本申请发明人通过长期生产实践和观察研究，结合实际酱油生产过程和分析酱油生产所需菌种的特点，提供一株优良的酱油生产用菌株——米曲霉（Aspergillus oryzae）zw102，具备制曲阶段孢子量少的特点，并且可以同时具备上述特点。
采用培养沪酿3.042菌种的常规方法培养本发明米曲霉菌株（Aspergillusoryzae）zw102种曲，培养时间为64-96h，得到种曲孢子数多、发芽率高的种曲。
将本发明米曲霉菌株（Aspergillus oryzae）zw102在豆汁培养基上连续传代10代，将第1代、第5代、第10代豆汁斜面菌种按照上述方法制作种曲，种曲孢子数、发芽率及酶活性在各代之间稳定，米曲霉菌株（Aspergillus oryzae）zw102直到至少第10代未显示出回复突变，表明遗传稳定性好。
采用制曲曲池或者圆盘制曲机制曲，使用原料为大豆/脱脂大豆和小麦/小麦粉，按照常规方法接入米曲霉菌株（Aspergillus oryzae）zw102，并按常规方法制曲，制曲时间为24-48h，得到孢子数少、中性蛋白酶活力高的制曲成曲，而且制曲成曲中性蛋白酶活力提高20%，孢子数只有沪酿3.042的1/2左右，出曲时，车间内无明显孢子飞扬，车间现场卫生良好。
将上述制曲成曲采用发酵罐进行高盐稀态发酵，盐分浓度、温度管理和发酵周期按照常规方法进行，发酵体系pH为5.3左右时添加鲁氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）。为保证曲料和盐水混合均匀、酱醪不出现分层以及酵母发酵顺利，采用沪酿3.042米曲霉菌株的酱醪在发酵过程中，自落料后至压榨前，需要进行10次以上的搅拌；而采用本发明米曲霉菌株（Aspergillus oryzae）zw102的酱醪则只进行5次左右的搅拌即可保证酱醪均匀发酵，可以缩减一半工作量。终止发酵时氨基氮达到1.0g/100mL以上,全氮达到1.8g/100mL以上,酒精度达到2.0g/100mL以上，乳酸达到7g/kg以上，菌落总数小于1000CFU/mL。感官色泽红壮、有光泽，酱香、豉香味浓郁，口感丰富、鲜咸适中、醇厚绵长。
本发明提供的米曲霉菌株（Aspergillus oryzae）zw102具有遗传性能稳定,易于扩大培养的优点；同时在制曲阶段产中性蛋白酶活力高、产孢子量少，有利于保持车间现场卫生，避免孢子飞扬；在发酵阶段易于与盐水混合均匀使发酵充分，可提高原料利用率和减少杂菌污染，从而稳定的获得高品质的发酵调味品。本发明米曲霉菌株（Aspergillus oryzae）zw102适用于大规模工业化生产调味品使用，应用前景广阔。
生物保藏说明
米曲霉，分类命名为米曲霉zw102（拉丁文名：Aspergillus oryzae zw102），于2013年9月2日在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏地址为武汉市武昌珞珈山，邮政编码为430072，保藏编号为CCTCCNO：M2013386。
附图说明
图1为本发明米曲霉菌株（Aspergillus oryzae）zw102的获得及应用流程图。
具体实施方式
为使本发明的技术方案更加清楚，以下结合附图通过具体的实施例来对本发明进行详细说明。
参见图1，在本发明中，以米曲霉沪酿3.042为出发菌株，该菌株对于本技术领域的专业人员来说是容易获得的菌株，为中国工业微生物研究所和中国普通微生物研究所等保藏机构保藏。本发明的菌株可以通过公知的任意诱变方法来构建，例如紫外线诱变或者硫酸二乙酯诱变、重离子束诱变等。本发明以米曲霉沪酿3.042为出发菌株，经诱变、筛选菌落，豆汁斜面培养后常规保藏。将保藏菌种依次转接三角瓶培养、种曲培养、制曲培养和添加盐水发酵，与沪酿3.042对比菌种特性和发酵成品品质。
下述实施例中，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中，所述百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例一
将沪酿3.042的孢子进行紫外诱变，然后将分生孢子涂布在酪蛋白平板上，根据菌丝旺盛成度和透明圈大小进行筛选。将显示出透明圈比对照菌株大且菌丝生长旺盛的菌株挑选出来，分别编号为zw101、zw102、zw103、zw102、zw105。将上述菌株转接豆汁培养基斜面上培养，成熟后置4℃冰箱保藏备用。
实施例二
将脱脂大豆粉、小麦麸、水按一定比例配置，制备培养基；控制培养基初始水分为65%，分装到150mL三角瓶，并在121℃的条件下灭菌30min。将实施例一中的米曲霉斜面菌种挑取1环孢子接种于三角瓶中，在30℃下培养96h。
将脱脂大豆粉、小麦麸、水按一定比例配置成培养基，控制培养基初始水分为65%，分装到种曲机曲盘中，并用121℃条件灭菌30min。称取0.4%三角瓶成曲接种于种曲培养基上，30℃培养时间为72h，得到种曲孢子数多、发芽率高的种曲。本实施例中的种曲孢子数、发芽率及酶活性检测结果及与沪酿3.042按同样方法制得的种曲的相应检测结果对比见表1。
表1种曲检测结果
| 检测项目 | zw101 | zw102 | zw103 | zw104 | zw105 | 沪酿3.042 |
| 孢子数（亿/g） | 132 | 161 | 153 | 148 | 156 | 149 |
| 差异 | -11.41% | 8.05% | 2.68% | -0.67% | 4.70% | 0.00% |
| 发芽率(%) | 95.7 | 99.2 | 98.6 | 98.5 | 97.8 | 98.2 |
| 差异 | -2.55% | 1.02% | 0.41% | 0.31% | -0.41% | 0.00% |
| 蛋白酶活力(U/g) | 11068 | 10120 | 10425 | 10259 | 10021 | 9062 |
| 差异 | 22.14% | 11.68% | 15.04% | 13.21% | 10.58% | 0.00% |
实施例三
将实施例一中的zw102米曲霉菌种（也即本发明的米曲霉菌株（Aspergillusoryzae）zw102）在豆汁培养基上连续传代10代，将第1代、第5代、第10代豆汁斜面菌种按照实施例二制作三角瓶成曲和种曲，判断其遗传稳定性，具体数据见表2。从种曲孢子数、发芽率及酶活性检测结果来看，米曲霉菌株（Aspergillus oryzae）zw102遗传稳定性好。
表2传代稳定性测试的种曲检测结果
| 检测项目 | zw102第1代 | zw102第5代 | zw102第10代 | 沪酿3.042 |
| 孢子数（亿/g） | 163 | 166 | 162 | 147 |
| 差异 | 10.88% | 12.93% | 10.20% | 0.00% |
| 发芽率(%) | 98.7 | 99.3 | 98.8 | 98 |
| 差异 | 0.71% | 1.33% | 0.82% | 0.00% |
| 蛋白酶活力(U/g) | 10454 | 10120 | 10556 | 9145 |
| 差异 | 14.31% | 10.66% | 15.43% | 0.00% |
实施例四
按照常规方法接入米曲霉菌株（Aspergillus oryzae）zw102，并按常规方法采用普通制曲曲池制曲，在常规制曲生产过程中无需特别处理，即在沪酿3.042制曲生产工艺的基础上，完全正常生产，得到孢子数少、中性蛋白酶活力高的米曲霉菌株（Aspergillus oryzae）zw102制曲成曲。制曲成曲的检查结果见表3。结果表明米曲霉菌株（Aspergillus oryzae）zw102制曲成曲孢子只有沪酿3.042的1/2左右，出曲时，车间内无明显有孢子飞扬，车间现场卫生良好。
表3曲池制曲检测结果
| 检测项目 | zw102 | 沪酿3.042 |
| 孢子数（亿/g） | 1.4 | 2.9 |
| 差异 | -51.72% | 0.00% |
| 蛋白酶活力(U/g) | 2852 | 2526 |
| 差异 | 12.9% | 0.00% |
实施例五
按照常规方法接入米曲霉菌株（Aspergillus oryzae）zw102，并按常规方法采用圆盘制曲机制曲，在常规制曲生产过程中无需特别处理，即在沪酿3.042制曲生产工艺的基础上，完全可以正常生产，得到孢子数少、中性蛋白酶活力高的zw102制曲成曲。制曲成曲的检查结果见表4。zw102制曲成曲孢子只有沪酿3.042的1/2左右，出曲时，车间内无明显有孢子飞扬，车间现场卫生良好。
表4圆盘制曲机制曲检测结果
| 检测项目 | zw102 | 出发菌株沪酿3.042 |
| 孢子数（亿/g） | 1.5 | 3.3 |
| 差异 | -54.54% | 0.00% |
| 蛋白酶活力(U/g) | 3227 | 2820 |
| 差异 | 14.43% | 0.00% |
实施例六
采用大罐高盐稀态发酵，将本发明米曲霉菌株（Aspergillus oryzae）zw102的制曲成曲和盐水按一定比例（如1：2）添加混合发酵。发酵体系pH为5.3左右时添加鲁氏接合酵母。为保证曲料和盐水混合均匀、酱醪不出现分层以及酵母发酵顺利，使用出发菌株沪酿3.042的酱醪在发酵过程中，自落料后至压榨前，需要进行10次以上的搅拌；而使用本发明米曲霉菌株（Aspergillus oryzae）zw102，则只进行5次左右的搅拌即可保证酱醪均匀发酵，可以缩减一半工作量。终止发酵时氨基氮达到1.08g/100mL,全氮达到1.8g/100mL,酒精度达到2.0g/100mL，乳酸达到7g/kg，菌落总数为＜1000CFU/mL。加热配兑成成品酱油，感官色泽红壮、有光泽，酱香、
豉香味浓郁，口感丰富、鲜咸适中、醇厚绵长。理化指标和感官质量都符合酿造酱油国家标准。本发明米曲霉菌株（Aspergillus oryzae）zw102适用于酿造酱油等调味品的大规模工业化生产应用。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种米曲霉（Aspergillus oryzae）zw102，其保藏编号为CCTCC NO：M2013386。
2.权利要求1所述米曲霉zw102在制备酱油或酱中的应用。
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Legal Events
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |