CN101144060A - 可高产中性蛋白酶的米曲霉菌株及其在固态基质上的发酵方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种米曲霉菌株和它在固体培养基上的发酵方法。本发明的高产中性蛋白酶的米曲霉菌株(Aspergillus oryza)ZW－06于2006年7月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会，其保藏号为CGMCC No.1754。本发明的米曲霉菌株可高产中性蛋白酶，所产生的中性蛋白酶除了酶活性高外，还可有效降解饼粕类饲料原料中的胰蛋白酶抑制剂。

Description

可高产中性蛋白酶的米曲霉菌株及其在固态基质上的发酵方法

技术领域

本发明涉及一种米曲霉菌株及其在固态基质上的发酵方法。

背景技术

中性蛋白酶作为一种生物催化剂已广泛应用于食品、酿造、医药等行业。中性蛋白酶的生产也有较为长久的发展历史。然而，目前国内生产的中性蛋白酶大多为工业级，其发酵产物的后处理采用喷雾干燥法，有的甚至还延用硫铵盐析等工艺。少量的食品级中性蛋白酶，由于其制造工艺复杂，价格较为昂贵。目前，无论是应用于畜禽饲料的复合酶或是应用于水产饲料的复合酶中所含的中性蛋白酶基本采用工业级的中性蛋白酶。而针对动物生理和饲料组成而开发的饲料级的高活性中性蛋白酶报导甚少。

胰蛋白酶抑制剂和大豆凝集素是饼粕类饲料原料中的抗营养因子。消除这类物质的方法有物理、化学、生物等多种。胰蛋白酶抑制剂和大豆凝集素本质上也是蛋白质，已有报导多种蛋白酶如中性、碱性蛋白酶能分解植物蛋白中的抗营养因子并使之部分失活，但未见成功利用这些蛋白酶制成水产饲料酶制剂，并能消除水产饲料中植物蛋白抗营养因子如胰蛋白酶抑制剂和大豆凝集素的文献报导。具有高产中性蛋白蛋白酶生产菌的选育及高效能的发酵工艺，提供廉价的以中性蛋白酶为主的水产饲料专用酶，是该产品实行产业化生产的关键前提。

发明内容

本发明解决了现有技术所存在的上述问题，提供了一种高产中性蛋白蛋白酶的米曲霉菌株。

本发明还提供了一种上述米曲霉菌株在固态基质上的发酵方法。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案解决的：

一种可高产中性蛋白酶的米曲霉菌株(Aspergillus oryza)ZW-06，CGMCCNo.1754。

发明人从若干米曲霉菌种、黑曲霉菌种以及从中科院微生物所、中科院土壤所、上海工业微生物所引进的若干米曲霉菌种及从土壤样本中分离获得的不同菌属的菌种，在选择性培养基上经初筛、复筛，获得一株代号为ZW的米曲霉菌株产中性蛋白酶活性最高。选定该菌株作为进一步诱变选育的出发菌株。

出发菌株的选育：初筛：将不同菌属的钭面菌种培养好后，用无菌水制成孢子悬浮液(孢子浓度在10⁴～10⁶个/ml)，分别涂布于初筛平板培养基上，30℃培养2-4天，比较各菌种在初筛平板培养上所产生的透明圈大小，以透明圈大的菌种作为初筛入选菌种。复筛：将初筛入选钭面菌种制成孢子悬浮液(孢子浓度在10⁶～10⁸个/ml)，接入发酵基础培养基(固体)，30℃培养2-4天，培养结束后于35-40℃烘干，按本发明下述的测定方法检测中性蛋白酶活性。以发酵性能优良，产酶活最高的菌株作为出发菌株。

所述的初筛培养基：干酪素0.4％，Na₂PO₄.12H₂O 0.1％，KH₂PO₄0.036％，BaCL₂ 0.4％，琼脂2％。

发酵培养基：麸皮78％，豆粕粉18％，(NH₄)₂SO₄2％，产酶诱导剂2％，加水使培养基含水率达55％-60％。

菌株的复合诱变选育：将在马铃茹葡萄糖琼脂(PDA)斜面上生长成熟的ZW-06#菌株的新鲜孢子，用无菌水洗下，并制成单孢子悬浮液(孢子浓度在107-108个/ml)。分别取2ml单孢子悬浮液于试管，置钴源室进行辐照处理。处理剂量为0(ck)，3万，5万，7万、10万和15万R(伦琴)。经Co60辐照处理后，吸取各处理的悬浮液，逐步稀释101、102、103、104、105、106、107倍，涂布于PDA平板培养基上，每个稀释度3个平板，28-30℃下培养48-72h后，挑取不同形状的单孢菌落于PDA斜面，在28-30℃下培养72-96h后，进行诱变菌种的三角瓶固体发酵的初筛、复筛及菌株间的多重比较，获得目的菌株ZW-06#，所产中性蛋白酶活达15000U/g干基。

本发明所述菌株的具体分离得到为：

菌株初筛：

将斜面上菌株用10ml无菌水冲洗孢子，吸取1ml接入发酵基础培养基，30℃恒温培养48h，进行中性蛋白酶酶活测定。菌株编号7，8，9，23，25，26，27，50，64的菌株酶活提高量都高于对照50％以上，将这些菌株挑出接入斜面，作为复筛的菌株。

菌株复筛

将初筛得到的产中性蛋白酶酶活高于对照菌株50％以上的菌，再次接入发酵基础培养基，每株菌接三瓶，进行酶活测定，将三次结果进行平均，测定结果如下表。其中6和26号菌株中性蛋白酶酶活力最高，比对照提高70％以上。将产酶活力高的6、26号菌株进行传代稳定性试验。

表1菌株再次复筛时酶活测定平均值

菌株号	酶活(U/g)	提高量(％)	菌株号	酶活(U/g)	提高量(％)
						对照668923	901215769137651368013390	74.9852.7451.8048.58	2526275064	1464215754134921365313987	62.4774.8149.7151.5055.20

表2菌株传代实验结果

所得菌种经中国科学院微生物研究所鉴定为一株米曲霉菌种Aspergillusoryza(Ahlb.)E.Cohn。

所得酶菌种的孢子为黄绿色，于2006年7月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会，其保藏号为CGMCC No.1754。

本发明所述的米曲霉菌种(Aspergillus oryza)ZW-06，CGMCC No.1754具有如下生物学特性：

1、形态学特征：菌落在查氏琼脂培养基上，25℃7天直径43-46mm，质地丝绒状，分生孢子结构大量，黄绿色，无渗出液；菌落反面褐色。分生孢子头球形，直大径58-110μm；分生孢子梗生于基质，孢梗茎表面粗糙，直径7.6-8.7μm；顶囊烧瓶状，直径23-30μm全部表面可育；产孢结构单层，瓶梗8.5-11X2.6-3.9mm；分生孢子球形，黄褐色，表面光滑，直径4.6-5.4μm。

2、培养学特性：该菌种的生物学特征：菌落在麦芽汁琼脂培养基上，25℃7天直径65-68mm，质地绒絮状，分生孢子结构大量，无渗出液；菌落反面无色；

本发明所述的米曲霉菌株ZW-06可采用如下发酵方法产生中性蛋白酶：

A.将米曲霉菌株(Aspergillus oryza)ZW-06，CGMCC No.1754接种在斜面培养基上在28-30℃下恒温培养72-96h，成熟，备用；使用时先取出放置室温活化后，用无菌水制成孢子悬浮液，待用；

B.将产酶种子培养基按1-10％(W/W)量接入斜面菌种的孢子悬浮液，接种的固体种子培养基于28-30℃下恒温培养48-72h；菌株成熟后，制取产酶菌种孢子悬浮液，待用；

C.将产酶发酵培养基按1-5％(W/W)接种量接入产酶种孢子悬浮液，充分搅拌混匀后，于30℃培养40-56h；发酵培养过程中，于培养10h起，每隔10h振荡翻曲一次，连续3-4次后静止培养，直至发酵结束；

D、酶曲的后处理：发酵结束后的产物，置35-40℃，烘干，粉碎后筛得酶干曲；

所述的产酶种子培养基为：麸皮80～120份，豆粕粉5～15份，(NH₄)₂SO₄0.5～1.2份，加水使培养基含水率达55％-60％；(均为重量份)

所述的产酶发酵培养基为：麸皮70～88份，豆粕粉10～30份，(NH₄)₂SO₄1.2～3份，产酶诱导剂1～3份，加水使培养基含水率达55％-60％。

作为优选，所述的斜面培养基为经过如下处理后的马铃茹葡萄糖琼脂：去皮马铃茹200份，切成小块后加水800～1200份，煮沸，将其过滤后，滤液中加入葡萄糖10～30份，并补充因蒸发而失去的水分至80～120份，加入琼脂10～30份，自然pH，0.075Mpa下灭菌。

本发明利用提供的可高产中性蛋白酶米曲霉变种，同时采用固体发酵法技术生产中性蛋白酶，其发酵产物的酶活平均可达21500U/g，最高可达23500U/g，比国内同类研究所报导的运用基因工程菌，获得液体发酵中性蛋白酶20000U/mL要高10％以上。且本项技术所采用的米曲霉固体发酵工艺，原料易得，发酵工艺简单。另外，通过对米曲霉ZW-06进行了产酶酶系分析，发现发酵产物中还含有较高的木聚糖酶和纤维素酶，非常适合于用作水产饲料专用酶。这和许波等报导(云南师范大学学报，2005，25(3)：51-56)：“将枯草芽孢杆菌AS1.398的中性蛋白酶功能区和包含前导区序列在内的全长基因克隆巴斯德毕赤酵母SMD1168，经甲醇诱导培养后，采用液体发酵工艺，发酵液中的中性蛋白酶活力达20000U/Ml”相比在发酵工艺和产酶性能上有较大提高。

为了了解本发明所得菌种及其发酵工艺的特性，申请人进行了不同菌种在本发明所述的发酵工艺下产中性蛋白酶的比较试验，还进行了将本发明所述菌种ZW-06在不同培养基上的产中性蛋白酶的比较试验。

一、不同菌种采用本发明所述的发酵工艺下产中性蛋白酶的比较试验：

1)本试验所引用的菌种：米曲霉ZW-06#(本发明的菌种)，米曲霉菌种(本室原有菌种Aspergillus oryza 3.802，引自中科院微生物所)，黑曲霉菌种(诱变菌种Aspergillus niger v. Tiebh，主要产α-半乳糖苷酶)。

2)菌种的培养：将所引用的菌种分别接种在PDA斜面上，于28-30℃下恒温培养72-96h，成熟(长出丰满孢子)后，取出，放存4℃冰箱1-15天。使用时先取出放置室温活化后，用无菌水制成孢子悬浮液，待用。

3).将产酶种子培养基经121℃，30min灭菌。冷却后，按1-10％(W/W)量接入斜面菌种孢子悬浮液，最后接种后的固体种子培养基，于28-30℃下恒温培养48-72h。成熟(基质表面及内部均长出丰满孢子)后，注入冷却的无菌水充分搅拌，用双层纱布在无菌条件下过滤，得到产酶菌种孢子悬浮液，待用。

4).发酵培养基经121℃，30min灭菌，冷却后，按1-5％(W/W)接种量接入产酶种孢子悬浮液，充分搅拌混匀后，装入500ml三角瓶(每瓶20g)，于30℃培养40-56h；发酵培养过程中，于培养10h起，每隔10h振荡翻曲一次，连续3-4次，48h后静止培养，直至发酵结束。

5)、酶曲的后处理：

a.发酵结束后的产物，置35-40℃，鼓风条件下，经15-24h烘干。

b.烘干后的发酵产物，粉碎，过80目筛，得酶干曲。并按所述中性蛋白酶活性试验方法检测。

本试验过程中采用的培养基：

斜面保藏培养基：为马铃茹葡萄糖琼脂(PDA)：去皮马铃茹200g切成小块后加水1000ml煮沸30min，双层纱布过滤，滤液中加入葡萄糖20g，并补充因蒸发而失去的水分至100ml，加入琼脂20g，自然Ph，0.075Mpa下灭菌20min。

产酶种子培养基为：麸皮90％，豆粕粉9％，(NH₄)₂SO₄ 1％，加水使培养基含水率达55％-60％。(固体培养基)

产酶发酵培养基为：麸皮78％，豆粕粉18％，(NH₄)₂SO₄ 2％，产酶诱导剂2％，加水使培养基含水率达55％-60％。

本试验运用多重比较法，每个菌种设三个重复，结果表明，不同菌种采用本技术的发酵工艺，发酵产物中所产中性蛋白酶的活力有较大差异，其中以采用本技术的菌种米曲霉ZW-06#所产中性蛋白酶最高，与其余两个菌种差异极显著，详见表3：表3

菌种	中性蛋白酶活平均数(U/g干曲)	差异显著性
				0.05	0.01
		米曲霉ZW-06(本技术采用菌种)	21432			--	a
米曲霉(本室原有保藏菌种)	9218			--	ab
		黑曲霉(本室原有保藏菌种)	3245			--	ac

二、本发明所得酶菌种ZW-06在不同培养基上的产中性蛋白酶的比较试验：

1)本试验所引用的菌种：米曲霉ZW-06#。

2)菌种的培养：将所引用的菌种分别接种在PDA斜面上，于28-30℃下恒温培养72-96h，成熟(长出丰满黄绿色孢子)后，取出，放存4℃冰箱5-15天。使用时先取出放置室温活化后，用无菌水制成孢子悬浮液，待用。

3).将产酶种子培养基经121℃，30min灭菌。冷却后，按1-10％(W/W)量接入斜面菌种孢子悬浮液，最后接种后的固体种子培养基，于28-30℃下恒温培养48-72h。成熟(基质表面及内部均长出丰满黄绿色孢子)后，注入冷却的无菌水充分搅拌，用双层纱布在无菌条件下过滤，得到产酶菌种孢子悬浮液，待用。

4).发酵培养基经121℃，30min灭菌，冷却后，按1-5％(W/W)接种量接入产酶种孢子悬浮液，充分搅拌混匀后，装入500ml三角瓶(每瓶20g)，于30℃培养40-56h；发酵培养过程中，于培养10h起，每隔10h振荡翻曲一次，连续3-4次，48h后静止培养，直至发酵结束。

5)、酶曲的后处理：

a.发酵结束后的产物，置35-40℃，鼓风条件下，经15-24h烘干。

b..烘干后的发酵产物，粉碎，过80目筛，得酶干曲。并按所述中性蛋白酶活性试验方法检测。

本发明所采用的培养基：

斜面保藏培养基：为马铃茹葡萄糖琼脂(PDA)：去皮马铃茹200g切成小块后加水1000ml煮沸30min，双层纱布过滤，滤液中加入葡萄糖20g，并补充因蒸发而失去的水分至100ml，加入琼脂20g，自然Ph，0.075Mpa下灭菌20min。

产酶种子培养基：麸皮90％，豆粕粉9％，(NH₄)₂SO₄ 1％，加水使培养基含水率达55％-60％。(均为重量百分比)

产酶发酵培养基：

(1)麸皮78％，豆粕粉18％，(NH₄)₂SO₄ 2％，产酶诱导剂2％，加水使培养基含水率达55％-60％。该培养基为本技术采用的发酶产酶培养基。

对照实验(2)所采用的培养基是：麸皮85％，豆粕粉13％，(NH₄)₂SO₄1％，Na₂CO₃1％，加水使培养基含水率达55％-60％。

对照实验(3)所采用的培养基是：麸皮65％，豆粕粉23％，(NH₄)₂SO₄1％，KH₂PO₄ 1％，加水使培养基含水率达55％-60％。

本试验运用多重比较法，每个处理设三个重复，结果表明，本技术获得的产中性蛋白酶菌种-米曲霉ZW-06#在不同产酶发酵培养基上，发酵产物中所产中性蛋白酶的活力有较大差异，其中以采用本技术的发酵培养基所产中性蛋白酶最高，与其余两个发酵培养基间差异极显著，详见表4：

表4

菌种	中性蛋白酶活平均数(U/g干曲)	差异显著性
				0.05	0.01
		产酶发酵培养基(1)	20864			--	a
产酶发酵培养基(2)	13093			--	ab
		产酶发酵培养基(3)	10350			--	ac

本发明的高产中性蛋白酶的米曲霉菌株(Aspergillus oryza)ZW-06于2006年7月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会，其保藏号为CGMCCNo.1754。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。

实施例1：

一、菌种培养：

1、斜面菌种培养：将本技术获得的米曲霉变种ZW-06#接种在马铃茹葡萄糖琼脂培养基(PDA)斜面上，于28-30℃下恒温培养72-96小时，待长出丰满黄绿色孢子后，取出，放存4℃冰箱5-15天。使用时先取出放置室温活化后，用无菌水制成孢子悬浮液(浓度为107-108个/ml)，待用。

2.固体种子培养：将1.8kg麸皮和0.18kg的豆粕粉充分混均，然后以1：1.2-1.5的比例加入1％浓度的(NH₄)₂SO₄溶液，再次充分混匀后，制成固体种子培养基。该培养基经121℃，30min灭菌，冷却后，按1-5％量(W/W)接入斜面菌种孢子悬浮液，充分搅拌均匀，按每瓶500ml三角瓶装入30克含水且接种的培养基。

3.接种后的固体种子培养基，于28-30℃下恒温培养48-72h。待培养基表层和内部长出丰满黄绿色孢子后，取出，置4℃冰箱，待用。

二、产酶发酵培养：

1、取培养成熟待用的固体种子三角瓶，注入冷却的无菌水充分搅拌，用双层纱布在无菌条件下过滤，得到菌种孢子悬浮液。再用无菌水稀释成孢子浓度为107-108个/ml的产酶菌种孢子悬浮液。

2.将发酵培养基按麸皮78％，豆粕粉18％，(NH₄)₂SO₄ 2％，产酶诱导剂2％的比例充分混合，加水使培养基含水率达55％-60％，配制成产酶发酵培养基，装入由二层棉布缝制的布袋。该产酶发酵培养基经121℃，30min灭菌，冷却后，按1-5％(V/W)接种量接入产酶种孢子悬浮液，充分搅拌混匀后，装入无菌透气方盘(60cm×40cm×10cm)，并用保湿透气半自动装置盖于方盘上，以控制培养过程的温、湿度。

3.将接种后的方盘置于30℃培养恒温条件下培养40-56h。发酵培养过程中，于培养10h起，每隔10h翻曲一次，连续3-4次，50h后静止培养，直至发酵结束。

三、后处理：

1.发酵结束后的产物，置35-40℃，鼓风条件下，经15-24h烘干。

2..烘干后的发酵产物，粉碎，过80目筛，得酶干曲。并按所述酶活性试验方法检测。

四、结果：

按上述方法共进行三批次的试验，每批发酵产物按四分法取样，按所述中性蛋白酶活性测定方法，测定三批次的酶活。结果表明，三个批次发酵产物中的中性蛋白酶活在21635U/g-23050U/g之间，平均为22401U/g，说明本技术获得的产酶菌种米曲霉ZW-06#在本技术发酵工艺下，产中性蛋白酶相当稳定。详见表5：表5

批次	平均酶活(U/g)
		No1	21635a
No2	22518a
		No3	23050a
平均	22401

另本发明中性蛋白酶活性测定方法—Folin法具体如下：

1.原理

蛋白酶在一定的温度和pH条件下，水解酪素底物产生含有酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸)，在碱性条件下，将福林试剂(Folin)还原，生成钼蓝与钨蓝，其颜色的深浅与酚基氨基酸含量成正比。通过在660nm测定其吸光度，可得到酶解产生的酚基氨基酸的量，计算出蛋白酶活力，以此代表蛋白酶的总酶活力。

2.酶活单位定义

在(40±0.2)℃、相应的pH条件下(酸性蛋白酶pH3.5，中性蛋白酶pH7.0)，在1min内水解酪蛋白底物，产生相当于1微克酚类化合物(由酪氨酸等同物表示)的酶量，为1个酶活单位，以u/g(u/ml)表示。

3.试剂和溶液

除非另有规定外，试验中所用试剂均为分析纯，所用水为蒸馏水或去离子水。

3.11mol/L及0.1mol/L盐酸溶液

取浓盐酸85ml，加水稀释并定容至1000ml，即为1mol/L盐酸溶液；取100ml1mol/L盐酸溶液，定容至1000ml，即为0.1mol/L盐酸溶液。

3.21mg/ml L-酪氨酸标准贮备溶液

精确称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g，用20ml左右1mol/L盐酸1溶解后，再用蒸馏水定容至100ml，即为1mg/ml酪氨酸标准溶液。

3.3 L-酪氨酸标准使用溶液

吸取1mg/ml酪氨酸标准溶液10.0ml用0.1mol/L盐酸定容至100ml，即得到100μg/ml L-酪氨酸标准液。

分别吸取100μg/ml L-酪氨酸标准液0ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml于10ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，制成每ml分别含L-酪氨酸0μg、10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg的标准使用溶液。

3.4 0.4mol/L碳酸钠(Na2CO3)溶液

称取无水碳酸钠(Na₂CO₃)42.4g，用蒸馏水溶解并定容至1000ml。

3.5福林(Folin)试剂

于2000ml磨口回流装置中加入钨酸钠(Na₂WO₄.2H₂O)100g、钼酸钠(Na₂MoO₄.2H₂O)25g、蒸馏水700ml、85％磷酸50ml、浓盐酸100ml。小火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风厨中加入硫酸锂(Li₂SO₄)50g，加蒸馏水50ml和数滴浓(99％)溴水，再微沸15min，以除去多余的溴(冷后仍有绿色需再加溴水，再煮沸除去过量的溴)，冷却后加蒸馏水定容至1000ml。混匀、过滤。试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。使用时，以1份原Folin试剂与2份蒸馏水混匀，制成稀Folin试剂。

3.6磷酸缓冲液(pH＝7.0)，适用于中性蛋白酶

甲液：称取磷酸氢二钠(Na₂HPO₄.12H₂O)71.64g，用蒸馏水溶解，并定容至1000ml。

乙液：称取磷酸二氢钠(NaH₂PO₄.2H₂O)31.21g，用蒸馏水溶解，并定容至1000ml。

使用溶液：取甲液610ml，加乙液390ml混合均匀，用pH计校正至pH为(7.0±0.05)，备用。

3.7 1.0％酪素溶液

称取酪素1.0000g，先用少量(3ml-4ml)浓乳酸湿润后，(若中性蛋白酶为少量0.5mol/L氢氧化钠溶液)，再加入相应pH缓冲液约80ml，在沸水浴中边加热边搅拌直至完全溶解。冷却后转入100ml容量瓶中，用相应缓冲液定容至刻度。此溶液在4oC冰箱贮存，有效期为3天。

3.8 0.4mol/L三氯乙酸(CCl₃-COOH)溶液(TCL沉淀试剂)

称取三氯乙酸65.4g，用蒸馏水溶解并定容至1000ml。

4.仪器和设备

除普通实验室仪器外，还应有：

4.1恒温水浴锅(40±0.2)℃。

4.2分光光度计

4.3酸度计精度±0.01pH。

4.4分析天平感量0.1mg。

4.5秒表或定时钟。

5测定步骤

5.1标准曲线绘制

按表A.1，分别吸取标准酪氨酸标准使用溶液、0.4mol/L碳酸钠溶液和稀Folin试剂于各管中(每管号平行作3个样)，混匀。

将标准管同时置于40℃水浴，反应20min，取出，迅速冷却至室温，用10mm比色杯，以空白管(0号管)调仪器零点，在分光光度计波长660nm处测吸光度。以酪氨酸量为横座标，以吸光度为纵座标，绘制标准曲线，获得线性回归方程。当吸光度为1时的酪氨酸量(μg)即为比色常数K值。

线性回归系数(r)应在0.9990以上时方可使用(否则须重做)。对每个新配制的Folin试剂制作新的标准曲线。

表1酪氨酸标准曲线

5.2样品的测定

5.2.1待测酶液的制备

固体酶：根据样品酶活大小，称取2g-lOg固体酶样，精确至O.1mg，加入40-200ml蒸馏水，溶解后置40℃水浴浸提30min，用滤纸过滤，再根据样品酶活性大小，二次稀释至适宜浓度(使供试样液与空白液的吸光度之差落在0.2-0.4之间，下同)。液体酶：精确量取液体酶若干ml，根据样品酶活力大小，直接用蒸馏水稀释至适宜浓度，待测。

5.2.2测定程序

——取三支15×150mm试管(一支空白管，二支样品管)。

——分别向三支试管中准确加入稀释好的待测酶液1.0ml。

——将三支试管放入(40±0.2)℃水浴中预热5min，同时将测定底物(1％酪素溶液)置同一温度水浴中预热5min。

——分别向二支样品管中加入1.0ml 1％酪素溶液，准确计时，反应10min，取出。

——迅速、准确向三支试管中加入2ml TCL(沉淀试剂)，于空白管中加入1.0ml1％酪氨酸溶液，摇匀。将三支试管继续置(40±0.2)℃水浴中放置10min，取出，迅速冷却至室温。

——三支试管中反应液用滤纸(Whatmanl号滤纸或新华1号滤纸)过滤。

——另取三支18×180mm的试管(一支空白，二支样品管)分别吸取上述相应的滤出液1.0ml，0.4mol/L碳酸钠溶液5.0ml，稀Foiln试剂1.0ml，摇匀，置(40±0.2)℃水浴中放置20min，取出，迅速冷却至室温。

——以空白管(对照)调仪器零点，在分光光度计波长660nm下，用10mm比色杯，分别测二支样品管中样液的吸光度，取平均值。通过查标准曲线或用线性回归方程求出生成的酪氨酸的含量。

6.酶活力计算

按照下式(A.1)计算样品蛋白酶活力：

$X_1=\frac{A\×K\×V\×4\×N}{1\×W\×10}\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·(A.1)$

式中：

X1———蛋白酶活力，u/g；

A———样品与空白的吸光度差

K———比色常数；

V———样品提取时加入水的量(ml)；

4———酶反应体系总体积(ml)；

N———样品二次稀释时的稀释倍数；

1———参与反应的酶量(ml)；

W———样品重量(g/ml)；

10———反应时间(min)。

7.精密度

同一试样两次测试结果的绝对差值，不得超过算术平均值的10％。

本发明的米曲霉菌株所产生的中性蛋白酶，除了产酶活性高外，还可有效降解饼粕类饲料原料中的胰蛋白酶抑制剂。进一步考察了米曲霉ZW-06所产中性蛋白酶对豆粕中胰蛋白酶抑制剂的钝化作用。结果表明：在豆粕中添加1∶500的质量比的蛋白酶就能钝化豆粕中40％的胰蛋白酶抑制剂，温度对蛋白酶钝化胰蛋白酶抑制剂的影响很小，金属离子的加入普遍抑制蛋白酶对胰蛋白酶抑制剂的降解，酶解时间在30min就能达到最大抑制效果。

本发明的菌株发酵所得中性蛋白酶的活性高，达到23000U/g，且具有对饼粕类饲料原料中的胰蛋白酶抑制剂有较强的钝化作用。因此非常适合于用作水产饲料专用酶。

Claims (3)

1.一种可高产中性蛋白酶的米曲霉菌株(Aspergillus oryza)ZW-06，CGMCCNo.1754。

2.权利要求1所述米曲霉菌株在固态基质上的发酵方法，包括以下步骤：

A.将米曲霉菌株(Aspergillus oryza)ZW-06，CGMCC No.1754接种在斜面培养基上在28-30℃下恒温培养72-96h，成熟，备用；使用时先取出放置室温活化后，用无菌水制成孢子悬浮液，待用；

B.将产酶种子培养基按1-10％(W/W)量接入斜面菌种的孢子悬浮液，接种的固体种子培养基于28-30℃下恒温培养48-72h；菌株成熟后，制取产酶菌种孢子悬浮液，待用；

C.将产酶发酵培养基按1-5％(W/W)接种量接入产酶种孢子悬浮液，充分搅拌混匀后，于30℃培养40-56h；发酵培养过程中，于培养10h起，每隔10h振荡翻曲一次，连续3-4次后静止培养，直至发酵结束；

D、酶曲的后处理：发酵结束后的产物，置35-40℃，烘干，粉碎后筛得酶干曲；

所述的产酶种子培养基为：麸皮80～120份，豆粕粉5～15份，(NH₄)₂SO₄0.5～1.2份，加水使培养基含水率达55％-60％；

所述的产酶发酵培养基为：麸皮70～88份，豆粕粉10～30份，(NH₄)₂SO₄1.2～3份，产酶诱导剂1～3份，加水使培养基含水率达55％-60％。

3.根据权利要求2所述的米曲霉菌株在固态基质上的发酵方法，其特征在于所述的斜面培养基为经过如下处理后的马铃茹葡萄糖琼脂：去皮马铃茹200份，切成小块后加水800～1200份，煮沸，将其过滤后，滤液中加入葡萄糖10～30份，并补充因蒸发而失去的水分至80～120份，加入琼脂10～30份，自然pH，0.075Mpa下灭菌。