CN104711242A

CN104711242A - 一种中性蛋白酶及其应用

Info

Publication number: CN104711242A
Application number: CN201310680346.6A
Authority: CN
Inventors: 李佩佩; 齐建; 王华明; 黄亦钧
Original assignee: Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Current assignee: Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Priority date: 2013-12-12
Filing date: 2013-12-12
Publication date: 2015-06-17
Anticipated expiration: 2033-12-12
Also published as: CN104711242B

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种中性蛋白酶及其应用。本发明构建的里氏木霉工程菌能高效重组表达中性蛋白酶，发酵酶活达到5000U/mL。本发明所述中性蛋白酶的最适pH为7.0，且在pH50-8.0时能保持85%以上的酶活性；最适温度为65℃，且在55-70℃时能保持85%以上的酶活性。所述中性蛋白酶可广泛应用于食品和皮革加工领域。

Description

一种中性蛋白酶及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种中性蛋白酶及其应用。

背景技术

蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称。按其水解多肽的方式，可以将其分为内肽酶和外肽酶两类。内肽酶将蛋白质分子内部切断，外肽酶从蛋白质分子的游离氨基或羧基的末端逐个将肽键水解，而游离出氨基酸，前者为氨基肽酶，后者为羧基肽酶。按其活性中心和最适pH值，又可将蛋白酶分为丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。按其反应的最适pH值，分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。

蛋白酶广泛存在于动物内遭、植物茎叶、果实和微生物中。微生物蛋白酶，主要由霉菌、细菌，其次由酵母、放线菌生产。

蛋白酶已广泛应用在皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面。皮革工业的脱毛和软化已大量利用蛋白酶，既节省时间，又改善劳动卫生条件。蛋白酶还可用于蚕丝脱胶、肉类嫩化、酒类澄清。临床上可作药用，如用胃蛋白酶治疗消化不良，用酸性蛋白酶治疗支气管炎，以及用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶对外科化脓性创口的净化及胸腔间浆膜粘连的治疗，还可用于将组织处理成为单个细胞，进行细胞组织培养。加酶洗衣粉是洗涤剂中的新产品，含碱性蛋白酶，能去除衣物上的血渍和蛋白污物，但使用时注意不要接触皮肤，以免损伤皮肤表面的蛋白质，引起皮疹、湿疹等过敏现象。

目前对于中性蛋白酶的研究还很少，主要在涉及生产高级调味品和食品营养强化剂，以及皮革脱毛、软化、羊毛丝绸脱胶等加工领域。

发明内容

本发明的目的是提供一种中性蛋白酶及其应用。本发明通过将米曲霉（Aspergillus oryzae）的中性蛋白酶基因转入里氏木霉（Trichoderma reesei）中，构建得到里氏木霉工程菌株，能高效分泌表达中性蛋白酶。所述中性蛋白酶能广泛应用于皮革脱毛、软化、羊毛丝绸脱胶等加工领域。

本发明一方面提供了一种中性蛋白酶，其特征在于：

（a）其氨基酸序列为SEQ ID NO:1的中性蛋白酶；

（b）在（a）中的氨基酸上发生取代、缺失或添加一个或数个氨基酸得到的，具有中性蛋白酶活性的酶。

用于编码上述中性蛋白酶的基因，其中一种编码核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

本发明另一方面涉及上述中性蛋白酶的应用。

本发明的里氏木霉工程菌能高效重组表达中性蛋白酶，发酵酶活达到5000U/mL。本发明所述中性蛋白酶的最适作用pH为7.0，且在pH50-8.0时能保持60%以上的酶活性；最适作用温度为65℃，且在55-70℃时能保持85%以上的酶活性。所述中性蛋白酶可广泛应用于食品和皮革加工领域。其中，利用所述中性蛋白酶水解猪皮中的胶原蛋白，水解率高达68%，效率高，污染少，应用效果好。

附图说明

图1为本发明所述中性蛋白酶作用pH-相对酶活曲线。

图2为本发明所述中性蛋白酶作用温度-相对酶活曲线。

具体实施方式

本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，这并不意味着将本发明限定于所述的任何具体方法、实验方案和试剂，因为它们可以改变。

除非在本文中另作限定，本文所用的全部技术术语和科学术语具有本发明所属领域的普通计数人员通常所理解的相同含义。DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 3nd Ed. (Singleton et al., 2006)和COLLINS DICTIONARY BIOLOGY (Hale et al., 2003)为技术人员提供了本发明中所使用的许多术语的一般性解释。

除非另作说明，核酸是按5′至3′方向从左至右书写；氨基酸是按氨基至羧基的方向从左至右书写。

如本文所用，术语“重组”当被用于指代细胞、核酸、蛋白或载体时，表示该细胞、核酸、蛋白或载体已通过导入异源核酸或蛋白或者通过改变天然核酸或蛋白而被修饰。因此，例如，重组细胞是表达在天然(非重组)形式的该细胞中不曾发现的基因，或者表达天然基因。

术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可以互换使用。本文使用氨基酸残基的传统的单字母或三字母代码。

如本文所用，术语“基因”指参与生产多肽的DNA片段，包括编码区之前和之后的区域，以及各编码片段(外显子)之间的插入序列(内含子)。

术语“核酸”包括DNA、RNA，单链或双链的，以及它们的化学修饰物。

术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可以互换使用。

术语“载体”指被设计用来将核酸导入一种或多种细胞类型的多核苷酸序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌粒、序列盒以及类似物。

术语“表达载体”表示包含DNA序列的DNA构建物，所述DNA序列被可操纵的连接于能够影响该DNA在合适宿主中表达的合适的控制序列。此类控制序列可以包括完成转录的启动子、可选的控制转录的操纵子序列、编码mRNA上合适的核糖体结合位点的序列、增强子以及控制转录和翻译的终止的序列。

术语“启动子”表示参与结合RNA聚合酶以启动基因转录的的调控序列。启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。

与另一序列具有某一百分比的序列同一性的多核苷酸或多肽是指，在比较这两个序列时所述百分比的碱基或氨基酸残基是相同的。

由于遗传密码是简并的，所以可以使用一种以上的密码子来编码特定的氨基酸，本发明包括编码特定的氨基酸序列的多核苷酸。

术语“宿主菌株”或“宿主细胞”是指表达载体或DNA构建物的合适宿主，所述表达载体或DNA构建物包含本发明的编码脂肪酶的多核苷酸。具体而言，宿主菌株优选地是丝状真菌细胞。该宿主细胞可以是野生型丝状真菌宿主细胞或者经遗传修饰的宿主细胞。术语“宿主菌株”或“宿主细胞”指由丝状真菌菌株细胞所产生的细胞核原生质体。

下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1 蛋白酶基因的克隆

以米曲霉（Aspergillus oryzae）基因组总DNA为模板，利用上下游引物进行扩增。PCR扩增条件为95℃ 4min；94℃ 30S；55℃ 40S，72℃ 1min 30个循环；72℃ 7min。凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，将扩增产物送北京华大基因进行测序分析。结果显示，回收得到的扩增产物的核苷酸序列为SEQ ID NO:2，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。将上述序列通过NCBI Blast比对分析发现，SEQ ID NO:1与米曲霉的蛋白酶氨基酸序列相似性最高，为83%，是一个新的等位基因。

实施例2 里氏木霉（Trichoderma reesei）工程菌株的构建

将实施例1中回收的扩增产物连接到pMD18-T载体，获得克隆载体pT-Pro质粒，然后用NcoI和KpnI进行双酶切，回收TR片段；取2μl回收产物与NcoI和KpnI双酶切pKDN-5载体连接过夜导入大肠杆菌DH5α，获得重组表达质粒pKDN-Pro。

将里氏木霉菌丝体接种于PDA平板，生长4 天；切取直径约3 cm的菌落置于约YEG（0.5%酵母粉、1%葡萄糖）液体培养基中，30℃、200 rpm振荡培养过夜；多层纱布过滤收集菌丝；将菌丝置于盛有10-20 ml裂解酶液（Sigma L1412）酶解2-3 小时；取出酶解液，加入0.7 M NaCl溶液，轻轻摇晃，倒于三层灭菌擦镜纸过滤，收集滤液，3000 rpm，离心10 min；弃上清，加10-20 ml STC液（20%蔗糖，50mM Tris-Cl，50mM CaCl₂）悬浮，3000 rpm，离心10 min；加适量STC悬浮分装（150 μl/管，10⁸个/ml）。

取2μg pKDN- Pro DNA加入到150μl原生质体中，接着加入500μl 25%PEG轻轻混匀，室温静置25 min；然后分2-3次再加1ml 25%PEG，轻轻混匀，室温静置25min，把原生质体加到50 ml左右熔化后冷却至45-55℃的上层半固体培养基（0.1%MgSO₄, 1%KH₂PO4, 0.6%(NH₄)₂SO₄, 1%葡萄糖, 18.3%山梨醇, 0.35%琼脂糖），轻轻混匀后倒入含100μg/ml潮霉素下层基础培养基平板（2%葡萄糖，0.5%(NH4)₂SO₄, 1.5%KH₂PO₄, 0.06%MgSO₄, 0.06%CaCl₂，1.5%琼脂），28℃黑暗培养数天至转化子长出。将其中一株阳性转化子命名为里氏木霉（Trichoderma reesei）Pro-1。

实施例3 发酵及酶学性质测定

将里氏木霉Pro-1接种于MM发酵培养基（1.5%葡萄糖，1.7%乳糖，2.5%玉米浆，0.44%(NH₄)₂SO₄，0.09%MgSO₄，2%KH₂PO₄，0.04%CaCl₂，0.018%吐温-80，0.018%微量元素，0.018%聚丙二醇-2000）培养，28℃培养48小时，然后25℃培养48小时; 所得发酵液用8层纱布过滤，滤液在14000 g条件下离心10 min，收集上清液；将上清液在浓度为12%的SDS-PAGE胶上进行电泳检测，在38kDa左右处出现一条蛋白带，分子量与预测一致，即为重组表达的蛋白酶。

蛋白酶酶活测定方法如下：

运用福林法测定蛋白酶的活力，使用到的溶液包括：福林使用溶液（一份市售福林溶液与两份水混合，摇匀），碳酸钠溶液（42.4 g/L），三氯乙酸（65.4 g/L），梯度pH值缓冲液，酪蛋白溶液（10.0 g/L）。反应过程如下：试管中加入1ml酶液，40℃温浴2min，加入酪蛋白溶液1ml，摇匀后40℃温浴10min，加入2ml三氯乙酸溶液，摇匀（空白对照先加入三氯乙酸，再加入酪蛋白溶液）。取出静止10min，慢速定性滤纸过滤。取1ml滤液，加碳酸钠溶液5ml，加福林试剂使用溶液1ml，40℃显色20min，于680nm波长，用10mm比色皿测定吸光度。

蛋白酶活力单位的定义为1g固体酶粉（或1 ml液体酶），在一定温度和pH值条件下，1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，即为1个酶活力单位。

采用上述检测方法对本发明里氏木霉工程菌发酵液上清进行酶活检测，结果显示，发酵液酶活高达5000U/mL，说明本发明构建的工程菌能高效分泌表达米曲霉的蛋白酶。

（1）最适pH分析

用pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的缓冲液，在温度50℃条件下测定酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线，结果如图1所示，本发明所述蛋白酶的最适pH为7.0，为一中性蛋白酶，且在pH50-8.0时能保持60%以上的酶活性。

（2）最适温度分析

分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃，pH 7.0的条件下测定酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线。结果如图2所示，本发明所述中性蛋白酶的最适温度为65℃，在55-70℃时能保持85%以上的酶活性。

实施例4 中性蛋白酶在制备胶原多肽中的应用

本发明利用上述中性蛋白酶处理猪皮，制备得到胶原多肽，产量高，污染小。

具体工艺过程如下：

1）猪皮的前处理

清洗新鲜猪皮，去除污物后将猪皮表面的油脂刮除；加入适量的水，加热至100℃，保持5min；取出煮熟的猪皮，稍凉后用刀将其表面的脂肪刮去，拔掉猪毛；然后切成10mm×10mm大小的猪皮块脱脂；

2）皂化法脱脂

脱脂剂为Na₂CO₃，温度40℃，时间40 min，冰箱冷冻保存备用；

3）酶解制备胶原多肽工艺

将前处理过的猪皮加入去离子水，调pH值为7.0-7.5，加入1%-2%本发明所述中性蛋白酶，恒定温度水解1h，沸水浴10 min灭酶，离心弃去沉淀物。

采用甲醛滴定法测定上述猪皮中胶原蛋白的水解率约为68%，可见本发明所述中性蛋白酶可广泛用于胶原多肽的生产。

SEQUENCE LISTING

<110> 青岛蔚蓝生物集团有限公司

<120> 一种中性蛋白酶及其应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 353

<212> PRT

<213> protease enzyme sequence

<400> 1

Met Arg Phe Ile Pro Val Ser Phe Leu Leu Leu Pro Leu Ala Pro Ala

1 5 10 15

Leu Lys Pro Leu Pro Val Glu Val Ala Gly Ser Pro Glu Gly Leu Asp

20 25 30

Val Thr Val Arg Lys Val Gly Asn Pro Arg Ile Lys Ala Val Val Lys

35 40 45

Asn Thr Gly Ser Glu Asp Val Thr Phe Val His Leu Lys Leu Leu Lys

50 55 60

Asp Ala Ala Pro Val Pro Lys Val Phe Leu Phe Arg Asn Ala Thr Glu

65 70 75 80

Val Gln Phe Gln Gly Leu Lys Gln Arg Leu Ile Ser Lys Gly Phe Ser

85 90 95

Asp Asp Pro Phe Arg Thr Leu Ala Pro Gly Ala Thr Ile Glu Asp Glu

100 105 110

Leu Glu Thr Ala Ser Thr Ser Glu Leu Ser Glu Gly Gly Thr Ile Thr

115 120 125

Thr Lys Ser Asn Gly Leu Val Pro Ile Thr Thr Asp Asn Lys Val Thr

130 135 140

Gly Tyr Val Pro Phe Ser Ser Asn Glu Leu Ser Val Asp Val Asp Glu

145 150 155 160

Ala Glu Ala Ala Ser Val Thr Gln Ala Val Lys Ile Leu Glu Leu Arg

165 170 175

Thr Lys Val Thr Ser Cys Ser Gly Ser Arg Leu Ser Ala Leu Gln Thr

180 185 190

Ala Leu Arg Asn Thr Val Ser Leu Ala Arg Ala Ala Ala Thr Ala Ala

195 200 205

Gln Ser Gly Ser Ser Ser Arg Phe Gln Glu Tyr Phe Lys Thr Thr Ser

210 215 220

Ser Pro Thr Arg Ser Thr Val Val Pro Arg Leu Asn Ala Val Ala Lys

225 230 235 240

Glu Ala Ala Ser Thr Ser Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Cys Ser Asp

245 250 255

Val Tyr Gly Tyr Cys Ser Ser Asn Val Leu Ala Tyr Thr Leu Pro Ser

260 265 270

Tyr Asn Ile Ile Ala Asn Cys Asp Leu Asn Tyr Ser Tyr Leu Ser Asp

275 280 285

Leu Thr Ser Thr Cys His Ala Gln Glu Lys Ala Ser Thr Thr Leu His

290 295 300

Glu Phe Pro His Pro Pro Gly Val Ser Thr Pro Gly Thr Asp Asp Phe

305 310 315 320

Gly Ser Gly Tyr Ser Ala Ala Thr Ser Phe Arg Ala Ser Gln Ala Leu

325 330 335

Leu Asn Ala Glu Thr Ser Pro Leu Phe Ala Asn Ala Val Lys Leu Lys

340 345 350

Cys

<210> 2

<211> 1062

<212> DNA

<213> protease gene sequence

<400> 2

atgcgtttca ttcctgtctc ctttcttctt ttgccccttg caccggctct caaacccctt

60

cctgtagagg ttgccggtag tcccgaaggt cttgatgtga ctgttaggaa ggtgggaaat

120

cctcggatca aggccgtggt aaagaacact ggcagcgagg atgtcacctt tgtgcacctc

180

aaattgttga aagatgccgc tccggtgccg aaagtttttc tgttccgcaa tgcgaccgag

240

gttcaattcc agggactcaa gcagcgtctt atctccaaag gtttttccga tgatcctttc

300

agaactcttg cccctggtgc tactatcgag gacgagctcg aaaccgcaag tactagtgaa

360

ctgtccgagg gtggtaccat cacgaccaaa agcaacggtt tagtacctat taccaccgat

420

aacaaggtca ctggatacgt tccattctcc tcgaacgagc tctccgttga tgtagatgaa

480

gctgaggccg cgagtgttac tcaagcagtt aagatcctgg agctccgcac caaggtcact

540

tcctgctctg gcagcagatt gtcggccctt cagactgctc tgagaaacac agtctctttg

600

gcacgtgcag ctgctactgc cgcgcagtcg ggatcttcct cccgtttcca ggagtatttc

660

aagacgacat ccagccccac ccgtagcacc gttgttcctc gcctgaacgc cgttgctaag

720

gaggccgcgt cgacctcttc gggaagtacc acgtactact gcagcgacgt gtatggatac

780

tgcagctcca acgtgcttgc gtataccctt ccgtcttata acatcatcgc caactgcgac

840

ctcaactatt cctatctttc ggacctgact agcacctgcc atgctcaaga aaaggcctcc

900

accaccctgc atgagttccc tcaccccccc ggtgtgtcca cccctggcac tgacgacttt

960

ggatctggat actcggctgc cacctccttc agggccagtc aggctctgct gaatgccgaa

1020

acctctccct tgtttgccaa cgctgtcaag ctcaagtgtt ag

1062

Claims

1.一种中性蛋白酶，其特征在于，

（a）其氨基酸序列为SEQ ID NO:1的中性蛋白酶；

2.编码权利要求1所述中性蛋白酶的基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO: 2。

3.权利要求1所述的中性蛋白酶的应用。

4.一种酶组合物，其特征在于，包含权利要求1所述中性蛋白酶。