CN107201354A - 一种中性蛋白酶及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程领域，具体地，本发明涉及一种中性蛋白酶及其基因和应用。本发明的中性蛋白酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的中性蛋白酶基因，其碱基序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还提供了包含所述中性蛋白酶基因的重组载体，以及包含所述中性蛋白酶基因的重组菌株。本发明运用基因工程技术构建了含有中性蛋白酶基因的重组质粒，并在解淀粉芽孢杆菌中实现了中性蛋白酶的高效表达。构建的中性蛋白酶重组菌株具有较高的应用价值，具有很高的产中性蛋白酶的能力，发酵液中酶活可达到9000U/ml。

Description

一种中性蛋白酶及其基因和应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体地，本发明涉及生物工程技术领域，尤其是一种中性蛋白酶及其基因和应用。

背景技术

蛋白酶是一类可水解蛋白质肽链的酶。中性蛋白酶属于其中一种内切酶，可水解处理各种蛋白质肽键，释放氨基酸或者多肽，其最适pH值为7.0左右。中性蛋白酶具有无工业污染、催化反应速度快、反应条件适应性宽等优点，因此在众多行业中都有应用，例如皮革、纺织、化工、食品、医药等，具有重要的工业价值。

中性蛋白酶在动、植物，微生物中都广泛存在。而与其他来源相比，微生物来源的蛋白酶无论在培养条件、生产成本控制还是在制备规模上都有着极大的优势。其中以细菌蛋白酶居多，特别是芽胞杆菌属细菌，如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等。

近几十年来，随着科学技术的发展，酶的制备、酶分子改造等酶学技术飞速发展，中性蛋白酶的生产与应用范围也不断扩大。自上世纪以来，世界各国研究者一直都致力于中性蛋白酶的生产菌株筛选、酶提取、纯化以及酶学性质的研究和应用工作，并且取得了一定成绩。

当前，我国中性蛋白酶的研究总体水平仍处于初级阶段，从事中性蛋白酶生产与销售的酶制剂企业并不是很多，而且采用的生产菌株大多为上世纪八十年代所开发的诱变菌株，产酶能力下降、不稳定、容易受到酵母及噬菌体的污染，对生产造成一定损失。近些年来随着基因工程技术的不断发展，人们开始借助基因工程改造来获得中性蛋白酶生产菌株。这些菌株具有产量高、生产周期短、成本低等优点。

目前中性蛋白酶市场需求量比较大，但是现有中性蛋白酶生产菌株的生产水平有待提高，亟待研发出中性蛋白酶的高效表达菌株。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种中性蛋白酶及其基因、工程菌(重组菌株)和制备方法。

本发明的另一目的是提供一种制备上述中性蛋白酶的基因工程方法。

本发明的另一目的提供上述中性蛋白酶及基因工程菌的应用。

本发明从枯草芽孢杆菌CRVAB200(Bacillus subtilis)中分离得到一种新的中性蛋白酶。

本发明提供了一种中性蛋白酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

本发明的中性蛋白酶含532个氨基酸，具有良好的热稳定性以及pH稳定性。其最适温度为50℃，在30-70℃之间相对酶活达到80％以上，甚至在80℃保温1h后仍有65％的剩余酶活；其最适pH值为7.0，在pH值6.5-8.0时，相对酶活达到将近80％。

本发明还提供了编码上述中性蛋白酶的基因，具体地，该基因的碱基序列如SEQID NO.2所示：

本发明通过PCR的方法分离克隆了所述中性蛋白酶的编码基因，DNA全序列分析结果表明，中性蛋白酶的编码基因全长1599bp。将中性蛋白酶的编码基因经序列比对后发现与GENBANK ACCESSION Number为CP020102.1的中性蛋白酶基因相似度达98％，为一新的中性蛋白酶。

本发明还提供了包含上述中性蛋白酶基因的重组载体，优选为包含上述中性蛋白酶基因的重组质粒pwB980。所述重组质粒pwB980还含有kan抗性基因、P43启动子序列、SPsacB信号肽序列、枯草芽孢杆菌终止子序列；本发明所述中性蛋白酶基因位于重组质粒pwB980的SPsacB信号肽序列和枯草芽孢杆菌终止子序列之间。

本发明还提供了包含上述中性蛋白酶基因的重组菌株，优选所述重组菌株为解淀粉芽孢杆菌K1(Bacillus amyloliquefaciens)。

本发明还提供了一种制备上述中性蛋白酶的方法，包括以下步骤：

1)用上述包含本申请中性蛋白酶的编码基因的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株使其发酵，诱导重组中性蛋白酶表达；

3)回收并纯化所表达的中性蛋白酶。

其中，优选所述宿主细胞为解淀粉芽孢杆菌，优选将重组表达质粒转化解淀粉芽孢杆菌，得到重组菌株。

所述发酵培养基可以为本领域公知的可以使用的任意培养基，优选为液体培养基，进一步优选地，液体培养基主要成分包括：20-40g/L的玉米粉，20-40g/L的豆饼粉，30-50g/L的麸皮，0.2-0.5g/L的磷酸二氢钾，3-5g/L的磷酸氢二钠，其余为水。

所述发酵温度为29.5℃-35℃，优选30℃。

本发明还提供了上述中性蛋白酶的应用。优选地，提供上述中性蛋白酶在饲料、食品、医药等工业领域中的应用，特别是在上述领域中降解蛋白的应用。

本发明中的中性蛋白酶，具有良好的热稳定性以及pH稳定性。其最适温度为50℃，在30-70℃之间相对酶活达到80％以上，甚至在80℃保温1h后仍有65％的剩余酶活；其最适pH值为7.0，在pH值6.5-8.0时，相对酶活达到将近80％。本发明的中性蛋白酶可应用于饲料、食品、医药等工业领域。

本发明运用基因工程技术构建了含有中性蛋白酶基因的重组质粒，并在解淀粉芽孢杆菌中实现了中性蛋白酶的高效表达。构建的中性蛋白酶重组菌株具有较高的应用价值，具有很高的产中性蛋白酶的能力，在同等发酵条件下，较野生菌酶活提高了近90％。

附图说明

图1为本发明实施例1中性蛋白酶基因的PCR扩增电泳图，其中：1、为中性蛋白酶基因片段，2、为DNA分子量标准；

图2为本发明重组质粒pwb980-npr结构示意图；

图3为本发明重组中性蛋白酶最适温度；

图4为本发明重组中性蛋白酶热稳定性；

图5为本发明重组中性蛋白酶最适pH值；

图6为本发明重组中性蛋白酶pH稳定性。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体

表达载体pwB980购自于Invitrogen公司；枯草芽孢杆菌株168购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)；解淀粉芽孢杆菌K1由土壤中分离。

2、酶类及其它生化试剂

酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。p-nitrophenyl-a-L-arabionfuranoside(pNPAf)购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1、中性蛋白酶基因的获得

枯草芽孢杆菌CRVAB200是在水库附近采集的土壤样品中分离得到。具体为将土壤样品溶于无菌水中，经富集培养后取合适稀释梯度涂布于含1％脱脂牛奶的平板上，根据平板上透明圈的大小筛选得到。

提取枯草芽孢杆菌CRVAB200(Bacillus subtilis)基因组DNA：

(1)取0.5-2mL培养菌液，10000rpm，离心30s，尽可能的吸取上清，收集菌体；

(2)EP管中加200μL缓冲液RB重悬，10000rpm离心30s，弃上清；

(3)对于革兰氏阳性菌：加入120μL溶菌酶，颠倒混匀，37℃水浴30-60min；

(4)12000rpm离心2min，弃上清后将细胞振荡或者吹打重悬于180μL缓冲液RB中；

(5)加RNase A(25mg/mL)溶液20μL，振荡混匀，室温放置5-10min；

(6)加结合液CB 800μL，再加入100μL异丙醇，立刻涡旋振荡充分混匀，此时可能出现絮状沉淀；

(7)将上一步混合物(包括可能有的沉淀)加入一个吸附柱AC中，吸附柱放入收集管中，13000rpm离心30-60s，弃掉废液；

(8)加抑制物去除液IR 500μL，12000rpm离心30s，弃废液；

(9)加入700μL漂洗液WB，12000rpm，离心30s，弃掉废液；

(10)加入500μL漂洗液WB，12000rpm，离心30s，弃掉废液；

(11)将吸附柱AC放回空收集管中，13000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，一面漂洗液中残留乙醇抑制下游反应；

(12)取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μL洗脱缓冲液EB，室温放置3-5min，12000rpm离心1min。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min；

(13)得到的DNA于-20℃保存。

以上述基因组DNA为模板进行PCR扩增中性蛋白酶基因。扩增引物为：上游引物：5’-GCGCAACTCAAGCTTTTGCCTTGCGCAACTTGACCAAGACATCTC-3’；下游引物：

5’-TCTTGGAATTGTGCTGAAGCTAGCTTATAGAATGCCGACAGCCTC-3’。PCR扩增得到约1600bp大小的DNA片段，该片段回收后与Peasy-T3载体进行连接后送测序。经过基因测序得到1599bp的基因片段(SEQ ID NO.2)，经序列比对后发现与GENBANK ACCESSION Number为CP020102.1的中性蛋白酶基因相似度达98％。

实施例2、中性蛋白酶表达载体pwb980-npr的构建

以枯草表达质粒pwb980为模板进行PCR扩增载体片段。扩增引物为：上游引物：5’-GCTAGCTTCAGCACAATTCCAAGAAAAAC-3’；下游引物为：5’-GGCAAAAGCTTGAGTTGCGCCTCCTGCCAG-3’。PCR扩增得到约3738bp大小的载体DNA片段，片段回收后与上述中性蛋白酶基因片段进行多聚物融合PCR(You C,Zhang XZ,Zhang YH(2012)Simple cloning via direct transformation of PCR product(DNA Multimer)toEscherichia coli and Bacillus subtilis.Appl Environ Microbiol 78:1593–1595)，融合产物转化枯草芽孢杆菌B.subtilis 168感受态细胞，涂布在含卡那霉素(25μg/mL)的LB平板上，挑选阳性转化子，提取质粒测序验证，确定成功获得重组质粒pwb980-npr。

实施例3、表达载体pwb980-npr转化解淀粉芽孢杆菌K1

解淀粉芽孢杆菌感受态细胞制备方法如下所述：

(1)接种解淀粉芽孢杆菌K1于5mL LB培养基中，过夜培养。

(2)取2.5mL过夜培养物接入40ml(LB+0.5M山梨醇)中，37℃，200rpm振荡培养至OD₆₀₀为0.6-0.8之间。

(3)将菌液冰水浴10min，然后5000g，4℃离心5min，收集菌体。

(4)用50mL预冷的电转培养基(0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10％葡萄糖)重悬菌体，5000g，4℃离心5min，去上清，如此漂洗4次。

(5)将洗涤后的菌体重悬于1mL电转培养基中，分装于EP管，每管分装60μL。

转化条件如下所述：

(1)将50ng质粒DNA(1-8μL)加入到60μL感受态细胞中，冰上孵育2min，加入预冷的电转杯(1mm)中，电击。电转化参数设置：2.0kv、1mm、电击1次。

(2)电击完毕立即加入1mL复苏培养基(LB+0.5M山梨醇+0.38M甘露醇)

(3)37℃摇床振荡培养3h，培养物涂布在LB平板上，37℃培养24-36h，挑取阳性转化子，获得重组解淀粉芽孢杆菌K1/pwb980-npr。

实施例4、重组解淀粉芽孢杆菌K1/pwb980-npr获取中性蛋白酶的方法

将实施例3中获得的重组解淀粉芽孢杆菌K1/pwb980-npr和枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CRVAB200(野生菌)划线活化。活化培养基为LB平板。挑取单菌落至装有25mL LB的250mL摇瓶中，37℃，220rpm震荡培养8-10小时，培养物作为种子液。

将上述种子液按照10％(V/V)接种量接种于装有50mL发酵培养基的500ml摇瓶中，30℃，220rpm振荡培养，发酵76h。

上述发酵培养基成分为：35g/L的玉米粉，35g/L的豆饼粉，30g/L的麸皮，0.3g/L的磷酸二氢钾，4g/L的磷酸氢二钠，其余为水。

取上述摇瓶发酵液，12000rpm离心10min去除沉淀，测量上清液中的酶活。酶活力单位定义：在一定温度和相应的pH条件下(pH 7.2)，在1min内水解酪蛋白产生相当于1μg酚基氨基酸(由酪氨酸等同物表示)的酶量，即为1个酶活力单位，以U表示(中华人民共和国国家标准，GB/T 28715-2012)。

结果表明，发酵72小时，重组解淀粉芽孢杆菌K1/pwb980-npr的酶活达到9000U/mL，而野生菌酶活为4736U/mL，重组解淀粉芽孢杆菌K1/pwb980-npr的酶活比野生菌提高近90％。

实施例5、重组中性蛋白酶的酶学性质分析

(1)温度对本发明中性蛋白酶酶活力的影响

①最适温度的测定：在pH7.2条件下，在不同温度下测定酶活，最高酶活力定为100％。结果表明(图3)，重组中性蛋白酶的最适温度为50℃，在30-70℃之间相对酶活为80％以上。

②热稳定性的测定：重组中性蛋白酶分别在不同温度下保温2h，每隔20min在pH7.2条件下测定其残余酶活力，未保温的酶活力定为100％。结果表明(图4)，重组中性蛋白酶在50-70℃条件下保温1h剩余酶活在80％以上，保温2h剩余酶活在60％以上；甚至在80℃保温1h后仍有65％的剩余酶活，说明该酶具有良好的热稳定性。

(2)pH对本发明中性蛋白酶酶活力的影响

①最适pH的测定：在40℃条件下，在不同pH下测定酶活，最高酶活力定为100％。结果表明(图5)，重组中性蛋白酶最适pH为7.0，在pH6.5-8.0之间相对酶活达到80％以上。

②pH稳定性的测定：将重组酶在不同pH条件下在40℃保温1h，测定其剩余酶活力，相应pH下未保温的酶活力定为100％。结果表明(图6)，重组中性蛋白酶在pH6.0-8.5范围内剩余酶活力达到80％以上，说明该酶具有良好的pH耐受性。

当然，本发明还可以有多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明的公开做出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明的权利要求的保护范围。

<110> 北京科为博生物科技有限公司

<120> 一种中性蛋白酶及其基因和应用

<160> 2

<210> 1

<211> 532

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌CRVAB200（Bacillus subtilis）

<400> 1

LRNLTKTSLL LAGLCTAAQM VFVTHASAEE SIEYDHTYQT PSYIIEKSPQ KPVQNTTQKE 60

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DIVAHEITHA VYSAGLLYQG EPGALNESIS DIMGAMGISD DWEIGEDVYT PGIAGDSLRS 420

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<210> 2

<211> 1599

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌CRVAB200（Bacillus subtilis）

<400> 2

ttgcgcaact tgaccaagac atctctatta ctggccggct tatgcacagc ggcccaaatg 60

gtttttgtaa cacatgcctc agctgaagaa agcatcgaat acgaccatac gtatcaaacc 120

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tcagtcgaaa aggcgtatga ggctgtcggc attctataa 1599

Claims (10)

1.一种中性蛋白酶，其特征在于，所述中性蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种中性蛋白酶基因，其特征在于，编码权利要求1所述的中性蛋白酶。

3.根据权利要求2所述的中性蛋白酶基因，其特征在于，所述中性蛋白酶基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

4.包含权利要求2或3所述中性蛋白酶基因的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为包含权利要求2或3所述中性蛋白酶基因的质粒pwB980。

6.包含权利要求2或3所述中性蛋白酶基因的重组菌株。

7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

8.一种制备中性蛋白酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用权利要求4或5的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株使其发酵，诱导中性蛋白酶表达；

3)回收并纯化所表达的中性蛋白酶。

9.权利要求1所述中性蛋白酶的应用。

10.权利要求6所述重组菌株的应用。