CN107312781B - 重组金黄色葡萄球菌b型肠毒素蛋白及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白及其制备方法与应用。本发明将优化后的金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的基因的核苷酸序列重组于大肠杆菌表达系统中，通过诱导表达和纯化，得到重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素融合蛋白，制得的重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的浓度不低于2.01mg/mL，纯度＞90％。与现有技术相比，本发明通过控制低温超声条件、选择两次镍琼脂糖亲和层析以及Triton X‑114试剂的添加严格控制去内毒素，为后续蛋白的应用安全提供保障。制得的金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白可光蛋应用于医药和日化领域。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白及其制备方法与应用。
背景技术
葡萄球菌属(Staphy lococcus)中的金黄色葡萄球菌(S.aureus)致病力最强，常引起食物中毒。金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，直径为0.8～1.0μm，呈葡萄状。无芽抱、无鞭毛。需氧和兼性厌氧菌，生长温度在6.5～46℃之间，最适温度为30～37℃。可在pH4.0～9.8范围内生长，最适生长pH7.4。能在15％NaCl和40％胆汁中生长。在普通肉汤固体培养基上能形成光滑、低凸、闪光、边缘整齐的菌落，菌落色素不稳定，但多数为金黄色。
该菌在20～37℃条件下，能产生引起食物中毒的肠毒素。其中，金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)是由金黄色葡萄球菌分泌的一种细菌性超抗原，具有多种生物学活性。超抗原活化T细胞的方式与通常抗原不同，它可不经过抗原提呈细胞(APC)的内化、降解过程，直接与MHCⅡ类分子及TCR-β链的V区结合，选择性地大量扩增和激活T细胞，故表达MHCⅡ类分子的细胞都能与之结合，激活的T细胞能对表达MHCⅡ类分子的靶细胞产生细胞毒作用，这种作用被称为超抗原依赖的细胞介导的细胞毒作用(superantigen-dependent cellmediated cytotoxicity，SDCC)。与此同时还能诱导肿瘤敏感性细胞因子如IFN-γ、TNF-α、IL-2的产生，从而达到间接杀伤肿瘤细胞、抑制肿瘤生长的作用。与普通抗原相比，超抗原SEB不需APC的处理，亦不受MHCⅡ类分子的限制，又由于Vβ基因的多态性，针对某一特定的超抗原，在T细胞库中约有5％～20％细胞可发生反应。基于此，超抗原SEB目前被越来越多地应用于肿瘤治疗方面，成为免疫学研究的一个重要方向。
最早获得的葡萄球菌肠毒素超抗原是从金黄色葡萄球菌的发酵液中提取的。但天然毒素的产量低，其研究和应用方面受到了限制。
发明内容
为了克服现有技术的不足与缺点，本发明的首要目的在于提供一种重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的制备方法。
本发明的另一目的在于提供上述制备方法制备得到的重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白。
本发明的再一目的在于提供上述重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的制备方法，包含如下步骤：
(1)通过全基因合成，得到如SEQ ID NO.1所示的编码重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的基因；
(2)使用引物X5523-1和引物X5523-34对步骤(1)得到的基因进行PCR扩增，得到目的片段并回收纯化；
(3)将步骤(2)回收纯化后的目的产物与载体进行连接，得到重组质粒；
(4)将步骤(3)制得的重组质粒转入宿主细胞中，得到表达重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的菌株；
(5)将步骤(4)制得的表达重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的菌株作为表达菌株，基于大肠杆菌表达系统进行诱导表达；离心收集菌体，洗涤悬浮，然后超声破碎，离心，收集上清，纯化，得到重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白；
步骤(1)中所述的编码重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的基因的核苷酸序列如下所示：
GAGAACCTGTACTTCCAGGGCGAAAGCCAGCCGGACCCGAAACCGGATGAACTGCACAAAAGCAGCAAATTCACCGGCCTGATGGAAAACATGAAAGTGCTGTACGACGACAACCACGTCTCCGCCATCAACGTGAAAAGCATCGATCAGTTCCTGTACTTCGACCTGATCTACTCCATCAAAGACACCAAACTGGGTAACTACGACAACGTCCGCGTCGAGTTCAAAAACAAAGACCTGGCGGACAAGTACAAAGACAAATACGTGGACGTTTTCGGCGCGAACTACTACTACCAGTGCTACTTCTCCAAAAAGACCAACGACATCAACTCCCACCAGACCGATAAACGCAAGACCTGCATGTACGGCGGCGTGACCGAACACAACGGCAACCAGCTGGACAAATACCGCAGCATCACCGTGCGCGTGTTCGAGGACGGCAAAAACCTGCTGAGCTTCGATGTGCAGACCAACAAGAAAAAAGTGACCGCGCAGGAACTGGACTACCTGACCCGTCACTACCTGGTGAAAAACAAAAAACTGTACGAGTTCAACAACTCCCCGTACGAAACCGGCTACATCAAGTTCATCGAAAACGAAAACAGCTTCTGGTACGACATGATGCCGGCGCCGGGCGACAAGTTCGACCAGTCCAAGTACCTGATGATGTACAACGACAACAAAATGGTTGACAGCAAAGACGTGAAAATCGAAGTGTACCTGACCACCAAAAAGAAATAATGA
步骤(2)中所述的引物X5523-1和引物X5523-34的核苷酸序列如下所示：
引物X5523-1：GACACGGTACCGAGAACCTGTACTTCCAG；
引物X5523-34：GTGTCCTCGAGTCATTATTTCTTTTTGGTGGTCAGG；
步骤(3)中所述的载体优选为pET-32a；
步骤(4)中所述的宿主细胞优选为大肠杆菌BL21(DE3)；
步骤(5)中所述的诱导表达的具体操作优选为：将表达重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的菌株进行液体扩大培养至OD值达到0.5～0.6时，添加终浓度为0.5mM的IPTG，220rpm、37℃诱导4h；
所述的液体扩大培养，包含如下步骤：
挑取表达重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的菌株的单菌落于含有终浓度为50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃，220rpm过夜培养，得到种子液；将培养的种子液按1：100体积比接种于含有终浓度为50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃，220rpm培养；
步骤(5)中所述的洗涤悬浮的试剂优选为破碎Buffer，所述的破碎Buffer为含0.1％w/v Triton X-114的1×PBS缓冲液，pH值为7.4；
步骤(5)中所述的超声破碎的条件优选为：冰浴下，超声功率为400～450W，超声时间为5～25min，其中，超声2s，暂停6s为一个循环；
步骤(5)中所述的纯化，包含如下步骤：
(Ⅰ)第一次镍琼脂糖亲和层析
①将Ni-IDA(镍-亚氨基二乙酸，亲和层析介质)装柱，用3倍柱床体积的Bindingbuffer1清洗平衡柱子，流速5mL/min；
②将超声破碎、离心、收集得到的上清上柱，流速为2mL/min；
③5倍柱床体积的Binding buffer1清洗柱子，流速3mL/min；
④Wash Buffer洗杂，流速3mL/min，收集穿透液；
(Ⅱ)酶切去除蛋白标签
将步骤(Ⅰ)收集的穿透液进行透析，然后加入TEV酶，酶切去除标签，得到酶切后的穿透液；
(Ⅲ)第二次镍琼脂糖亲和层析
①将Ni-IDA装柱，用3倍柱床体积的Binding buffer2清洗平衡柱子，流速5mL/min；
②将步骤(Ⅱ)酶切后的穿透液上柱，流速为2mL/min，收集穿透液；
(Ⅳ)过滤
将步骤(Ⅲ)收集的穿透液经过0.22μm CA(醋酸纤维素)滤膜过滤，得到重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白；
步骤(Ⅰ)中所述的Binding Buffer1优选为含0.1％w/v Triton X-114的1×PBS缓冲液，pH值为7.4；
步骤(Ⅰ)中所述的Wash buffer优选为含20mM Imidazole的1×PBS缓冲液，pH值为7.4；
步骤(Ⅱ)中所述的透析优选为采用到pH值为7.4的1×PBS缓冲液透析2h；
步骤(Ⅱ)中所述的酶切的条件优选为25℃酶切过夜；
步骤(Ⅲ)中所述的Binding Buffer2优选为pH值为7.4的1×PBS缓冲液；
一种重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白，通过上述制备方法制备得到；
所述的重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白在医药和日化领域中的应用；
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明通过蛋白序列优化，得到金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的基因的核苷酸序列，将该核苷酸序列重组于大肠杆菌表达系统中，大肠杆菌表达得到的重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素融合蛋白表达水平高，产量高。
(2)与现有技术相比，本发明选用pET-32a载体结合大肠杆菌BL21(DE3)原核表达重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白，其中，pET-32a载体带有His蛋白标签，易于蛋白纯化和鉴定；大肠杆菌BL21(DE3)生长周期短，诱导表达快，产量高。
(3)本发明提供的重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的制备方法更为简单，大幅节约了蛋白产出耗时。
(4)与现有技术相比，本发明通过控制低温超声条件、选择两次镍琼脂糖亲和层析以及Triton X-114试剂的添加严格控制去内毒素，为后续蛋白的应用安全提供保障。
(5)本发明的制备提纯的重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的浓度不低于2.01mg/mL，纯度＞90％。
附图说明
图1是实施例1第二轮扩增得到的编码重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的基因的琼脂糖凝胶电泳检测图；其中，M：DNA marker；1：编码重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的基因。
图2是实施例1酶切后的载体pET-32a的琼脂糖凝胶电泳检测图；其中，M：DNAmarker；1和2：KpnI和XhoI酶切后的载体pET-32a。
图3是实施例1构建好的重组载体pET32a-SEB酶切后的琼脂糖凝胶电泳检测图；其中，M：marker；1：酶切后的重组质粒pET32a-SEB。
图4是实施例3小试培养选择最佳的诱导条件的SDS-PAGE电泳分析图；其中M：Protein Marker；1：阴性对照；2：20℃上清；3：20℃沉淀；4：37℃上清；5：37℃沉淀。
图5是实施例3中第一次镍琼脂糖亲和层析纯化SDS-PAGE电泳分析图；其中，M：marker；1：细菌破碎上清；2：流出(穿透液A)；3：20mM Imidazole洗脱组分(穿透液B)；4：50mM Imidazole洗脱组分(穿透液C)；5：500mM Imidazole洗脱组分(洗脱液D)，loading中含有还原剂。
图6是是实施例3中第二次镍琼脂糖亲和层析纯化SDS-PAGE电泳分析图；其中，M：Protein marker；1：酶切前的穿透液B；2：酶切后的穿透液B；3:流出(穿透液E)；4～5：20mMImidazole洗脱组分(穿透液F)；6：500mM Imidazole洗脱组分(洗脱液G)，loading中含有还原剂。
图7是实施例3纯化过滤后的目的蛋白的SDS-PAGE电泳分析图。
图8是纯化后的融合蛋白和去标签后的目的蛋白的Western Blot分析图；其中，M：Prestained Marker；1：融合蛋白；2：去标签后目的蛋白。
图9是实施例3构建的标准蛋白BSA含量的标准曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1重组质粒pET32a-SEB的构建
(1)扩增编码重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的基因
根据已公开的金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白序列(NCBI Reference Sequence:WP_072497559.1)，重新优化设计金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白序列，根据优化后的基因序列设计合成引物34条，通过第一轮PCR扩增出足够量的目的产物DNA，其中，反应体系(50μL)如下所示：
其中，引物mix为引物X5523-1～X5523-34，共34条，0.4μL×34＝13.6μL；引物序列如下所示：
X5523-1：GACACGGTACCGAGAACCTGTACTTCCAG；
X5523-2：CGGGTCCGGCTGGCTTTCGCCCTGGAAGTACAGGTTCTCG；
X5523-3：GCCAGCCGGACCCGAAACCGGATGAACTGCACAAAAGCAG；
X5523-4：TCCATCAGGCCGGTGAATTTGCTGCTTTTGTGCAGTTCAT；
X5523-5：CACCGGCCTGATGGAAAACATGAAAGTGCTGTACGACGAC；
X5523-6：ACGTTGATGGCGGAGACGTGGTTGTCGTCGTACAGCACTT；
X5523-7：TCTCCGCCATCAACGTGAAAAGCATCGATCAGTTCCTGTA；
X5523-8：ATGGAGTAGATCAGGTCGAAGTACAGGAACTGATCGATGC；
X5523-9：TCGACCTGATCTACTCCATCAAAGACACCAAACTGGGTAA
X5523-10：TCGACGCGGACGTTGTCGTAGTTACCCAGTTTGGTGTCTT；
X5523-11：CAACGTCCGCGTCGAGTTCAAAAACAAAGACCTGGCGGAC；
X5523-12：GTCCACGTATTTGTCTTTGTACTTGTCCGCCAGGTCTTTG；
X5523-13：TACAAAGACAAATACGTGGACGTTTTCGGCGCGAACTACT；
X5523-14：TTTTGGAGAAGTAGCACTGGTAGTAGTAGTTCGCGCCGAA；
X5523-15：CCAGTGCTACTTCTCCAAAAAGACCAACGACATCAACTCC；
X5523-16：TCTTGCGTTTATCGGTCTGGTGGGAGTTGATGTCGTTGGT；
X5523-17：AGACCGATAAACGCAAGACCTGCATGTACGGCGGCGTGAC；
X5523-18：TTGTCCAGCTGGTTGCCGTTGTGTTCGGTCACGCCGCCGT；
X5523-19：GCAACCAGCTGGACAAATACCGCAGCATCACCGTGCGCGT；
X5523-20：TCAGCAGGTTTTTGCCGTCCTCGAACACGCGCACGGTGAT；
X5523-21：CGGCAAAAACCTGCTGAGCTTCGATGTGCAGACCAACAAG；
X5523-22：GTTCCTGCGCGGTCACTTTTTTCTTGTTGGTCTGCACATC；
X5523-23：TGACCGCGCAGGAACTGGACTACCTGACCCGTCACTACCT；
X5523-24：CGTACAGTTTTTTGTTTTTCACCAGGTAGTGACGGGTCAG；
X5523-25：GTGAAAAACAAAAAACTGTACGAGTTCAACAACTCCCCGT；
X5523-26：GAACTTGATGTAGCCGGTTTCGTACGGGGAGTTGTTGAAC；
X5523-27：ACCGGCTACATCAAGTTCATCGAAAACGAAAACAGCTTCT；
X5523-28：CGCCGGCATCATGTCGTACCAGAAGCTGTTTTCGTTTTCG；
X5523-29：GACATGATGCCGGCGCCGGGCGACAAGTTCGACCAGTCCA；
X5523-30：TCGTTGTACATCATCAGGTACTTGGACTGGTCGAACTTGT；
X5523-31：TACCTGATGATGTACAACGACAACAAAATGGTTGACAGCA；
X5523-32：ACACTTCGATTTTCACGTCTTTGCTGTCAACCATTTTGTT；
X5523-33：GACGTGAAAATCGAAGTGTACCTGACCACCAAAAAGAAAT；
X5523-34：GTGTCCTCGAGTCATTATTTCTTTTTGGTGGTCAGG；
第一轮PCR程序为：95℃3min；95℃22sec，55℃20sec，72℃30sec，20cyc；72℃5min；
(2)以第一轮PCR的PCR产物为模板，进行第二轮PCR，得到编码重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的基因序列(或直接由合成公司合成得到优化后序列)，其中，反应体系(50μL)为：
第二轮PCR程序：95℃3min；95℃22sec，58℃20sec，72℃30sec，24cyc；72℃5min；
(3)将载体pET-32a进行双酶切，酶切体系(50μL)为：pET-32a 1μg；10×FD Buffer5μL；KpnI 1μL(10U/μL)；XhoI 1μL(10U/μL)；ddH2O补足50μL；37℃恒温水浴锅中反应2h；
(4)将步骤(2)扩增得到的PCR产物(图1)回收纯化，然后与步骤(3)酶切后的载体(图2)连接；其中，连接体系(20μL)为：无缝克隆酶mix 8.5μL；目的片段：5μL；酶切载体2μL；ddH2O补充至20μL。50℃PCR仪反应1h。
(5)将步骤(4)制得的连接产物转化top10感受态，酶切检测筛选出阳性克隆(图3)，提取质粒pET32a-SEB并进行测序，测序结果如下所示(横线+斜体为KpnI和XhoI酶切位点)：
GGTACCGAGAACCTGTACTTCCAGGGCGAAAGCCAGCCGGACCCGAAACCGGATGAACTGCACAAAAGCAGCAAATTCACCGGCCTGATGGAAAACATGAAAGTGCTGTACGACGACAACCACGTCTCCGCCATCAACGTGAAAAGCATCGATCAGTTCCTGTACTTCGACCTGATCTACTCCATCAAAGACACCAAACTGGGTAACTACGACAACGTCCGCGTCGAGTTCAAAAACAAAGACCTGGCGGACAAGTACAAAGACAAATACGTGGACGTTTTCGGCGCGAACTACTACTACCAGTGCTACTTCTCCAAAAAGACCAACGACATCAACTCCCACCAGACCGATAAACGCAAGACCTGCATGTACGGCGGCGTGACCGAACACAACGGCAACCAGCTGGACAAATACCGCAGCATCACCGTGCGCGTGTTCGAGGACGGCAAAAACCTGCTGAGCTTCGATGTGCAGACCAACAAGAAAAAAGTGACCGCGCAGGAACTGGACTACCTGACCCGTCACTACCTGGTGAAAAACAAAAAACTGTACGAGTTCAACAACTCCCCGTACGAAACCGGCTACATCAAGTTCATCGAAAACGAAAACAGCTTCTGGTACGACATGATGCCGGCGCCGGGCGACAAGTTCGACCAGTCCAAGTACCTGATGATGTACAACGACAACAAAATGGTTGACAGCAAAGACGTGAAAATCGAAGTGTACCTGACCACCAAAAAGAAATAATGACTCGAG
带his蛋白标签的重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的氨基酸序列如下所示：
MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGHMHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTENLYFQGESQPDPKPDELHKSSKFTGLMENMKVLYDDNHVSAINVKSIDQFLYFDLIYSIKDTKLGNYDNVRVEFKNKDLADKYKDKYVDVFGANYYYQCYFSKKTNDINSHQTDKRKTCMYGGVTEHNGNQLDKYRSITVRVFEDGKNLLSFDVQTNKKKVTAQELDYLTRHYLVKNKKLYEFNNSPYETGYIKFIENENSFWYDMMPAPGDKFDQSKYLMMYNDNKMVDSKDVKIEVYLTTKKK
去his蛋白标签的重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白，其氨基酸序列如下所示：
ENLYFQGESQPDPKPDELHKSSKFTGLMENMKVLYDDNHVSAINVKSIDQFLYFDLIYSIKDTKLGNYDNVRVEFKNKDLADKYKDKYVDVFGANYYYQCYFSKKTNDINSHQTDKRKTCMYGGVTEHNGNQLDKYRSITVRVFEDGKNLLSFDVQTNKKKVTAQELDYLTRHYLVKNKKLYEFNNSPYETGYIKFIENENSFWYDMMPAPGDKFDQSKYLMMYNDNKMVDSKDVKIEVYLTTKKK
实施例2表达重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的菌株的构建
取1μL实施例1步骤(5)制得的重组质粒pET32a-SEB转化BL21(DE3)，42℃热击90s，冰上静置2min；然后涂布含有终浓度50μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板上，37℃培养过夜后，挑取单克隆提取质粒并进行测序验证，得到表达重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的菌株。
实施例3重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的制备与纯化
一、小试培养选择最佳的诱导条件
(1)挑取实施例2中的表达重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的菌株的单菌落于试管中加入3mL含有终浓度50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基37℃，220rpm过夜培养；
(2)将过夜培养的菌液按1:100体积比接种于4mL含有终浓度50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养；
(3)当OD值达到0.6时，添加终浓度为0.5mM的IPTG，220rpm，进行如下处理：20℃诱导过夜或37℃诱导4h，未加IPTG诱导剂的作为阴性对照。
(4)4000rpm离心10min收集菌体，弃上清，菌体用500μL PBS(pH7.4)缓冲液洗涤悬浮，冰浴中超声破碎菌体6min，功率400W，超0.5s停1.5s；分别离心收集上清和沉淀，沉淀用500μL包涵体溶解液(8M Urea，50mM Tris-HCl，300mM NaCl，pH8.0)溶解，分别取40μL样品和10μL5×protein loading buffer混匀，沸水浴10min，SDS-PAGE检测。
检测结果如图4所示，37℃诱导4h条件最佳。
二、大量培养与蛋白纯化
(1)如小试培养步骤(2)和(3)所示，培养菌液，然后将培养的菌液按1:100体积比接种于4L含有终浓度50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养；当OD值达到0.6时，添加终浓度为0.5mM IPTG，37℃，220rpm，4h诱导，离心收集细胞菌体；
(2)超声破碎菌体(控制内毒素)
①将收集的细菌菌体用破碎Buffer(含0.1％w/v Triton X-114的1×PBS缓冲液，pH7.4)洗涤悬浮，冰浴中超声破碎菌体，功率400W，20min(超声2S，暂停6S为一个循环)；
②超声完毕，15000rpm，4℃，离心20min，收集上清进行下一步纯化；
(3)第一次镍琼脂糖亲和层析(控制内毒素)
①10mL Ni-IDA装柱，用3倍柱床体积的Binding buffer1(含0.1％w/v Triton X-114的1×PBS缓冲液，pH 7.4)清洗平衡柱子，流速5mL/min；
②细菌破碎上清上柱，流速为2mL/min，收集穿透液A；
③5倍柱床体积的Binding buffer1清洗柱子，流速3mL/min；
④Wash Buffer1(含20mM Imidazole的1×PBS缓冲液，pH 7.4)洗杂，流速3mL/min，收集穿透液B即为纯化后的融合蛋白(蛋白大小为45.7KD)；
⑤Wash Buffer2(含50mM Imidazole的1×PBS缓冲液，pH 7.4)洗杂，流速3mL/min，收集穿透液C；
⑥Elution Buffer(含500mM Imidazole的1×PBS缓冲液，pH7.4)洗脱，流速2mL/min，收集洗脱液D；其中，图5为细菌破碎上清、穿透液A、穿透液B、穿透液C和洗脱液D的SDS-PAGE电泳检测结果。
(4)酶切去除蛋白标签
将(3)中收集的穿透液B在1×PBS缓冲液(pH7.4)中透析2h，然后向透析袋内加入TEV酶，25℃酶切过夜去除标签；
(5)第二次镍琼脂糖亲和层析
①取5mL Ni-IDA装柱，用3倍柱床体积的Binding buffer2(1×PBS缓冲液，pH7.4)清洗平衡柱子，流速5mL/min；
②将步骤(4)酶切后的穿透液B上柱，流速为2mL/min，收集穿透液E；
③2倍柱床体积的Binding buffer2清洗柱子，流速3mL/min；
④Wash Buffer1(含20mM Imidazole的1×PBS缓冲液，pH 7.4)洗杂，流速3ml/min，收集穿透液F；
⑤Elution Buffer(含500mM Imidazole的1×PBS缓冲液，pH7.4)洗脱，流速2mL/min，收集洗脱液G；其中，图6为酶切前的穿透液B、酶切后的穿透液B、穿透液E、穿透液F和洗脱液G的SDS-PAGE电泳检测结果。
(6)将步骤(5)收集得到的穿透液E经过0.22μm CA滤膜过滤，得到重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白(去标签的目的蛋白，蛋白大小为28.4KD)，其中，图7为该蛋白的SDS-PAGE电泳检测结果图。
将步骤(3)制得的纯化后的融合蛋白(穿透液B)和步骤(6)制得的去标签的目的蛋白进行Western Blot分析，其中，一抗是兔抗his标签(Sangon Biotech，编号：D110002)，二抗为羊抗兔(Sangon Biotech，编号：D110058)；结果如图8所示，图8泳道2没有条带证明蛋白标签去除干净。
采用SK3071非干扰型蛋白定量试剂盒测定去标签后的目的蛋白的浓度(待测样品体积为10μL)，根据图9和表1所测蛋白吸收值可知，目的蛋白浓度为2.01mg/mL。
表1蛋白量和对应测量的480nm波长处的吸收值
本发明质粒构建耗时10个工作日；表达检测耗时5个工作日；表达纯化及检测耗时10个工作日。耗时短，操作简单，成本低，制得的重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白纯度高，活性好。可进一步分装500μL/tube，-80℃保存，或冻干。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 曾庆明
<120> 重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白及其制备方法与应用
<160> 36
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Glu Ser Gln Pro Asp Pro Lys Pro Asp
1 5 10 15
Glu Leu His Lys Ser Ser Lys Phe Thr Gly Leu Met Glu Asn Met Lys
20 25 30
Val Leu Tyr Asp Asp Asn His Val Ser Ala Ile Asn Val Lys Ser Ile
35 40 45
Asp Gln Phe Leu Tyr Phe Asp Leu Ile Tyr Ser Ile Lys Asp Thr Lys
50 55 60
Leu Gly Asn Tyr Asp Asn Val Arg Val Glu Phe Lys Asn Lys Asp Leu
65 70 75 80
Ala Asp Lys Tyr Lys Asp Lys Tyr Val Asp Val Phe Gly Ala Asn Tyr
85 90 95
Tyr Tyr Gln Cys Tyr Phe Ser Lys Lys Thr Asn Asp Ile Asn Ser His
100 105 110
Gln Thr Asp Lys Arg Lys Thr Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Glu His
115 120 125
Asn Gly Asn Gln Leu Asp Lys Tyr Arg Ser Ile Thr Val Arg Val Phe
130 135 140
Glu Asp Gly Lys Asn Leu Leu Ser Phe Asp Val Gln Thr Asn Lys Lys
145 150 155 160
Lys Val Thr Ala Gln Glu Leu Asp Tyr Leu Thr Arg His Tyr Leu Val
165 170 175
Lys Asn Lys Lys Leu Tyr Glu Phe Asn Asn Ser Pro Tyr Glu Thr Gly
180 185 190
Tyr Ile Lys Phe Ile Glu Asn Glu Asn Ser Phe Trp Tyr Asp Met Met
195 200 205
Pro Ala Pro Gly Asp Lys Phe Asp Gln Ser Lys Tyr Leu Met Met Tyr
210 215 220
Asn Asp Asn Lys Met Val Asp Ser Lys Asp Val Lys Ile Glu Val Tyr
225 230 235 240
Leu Thr Thr Lys Lys Lys
245
<210> 2
<211> 744
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gagaacctgt acttccaggg cgaaagccag ccggacccga aaccggatga actgcacaaa 60
agcagcaaat tcaccggcct gatggaaaac atgaaagtgc tgtacgacga caaccacgtc 120
tccgccatca acgtgaaaag catcgatcag ttcctgtact tcgacctgat ctactccatc 180
aaagacacca aactgggtaa ctacgacaac gtccgcgtcg agttcaaaaa caaagacctg 240
gcggacaagt acaaagacaa atacgtggac gttttcggcg cgaactacta ctaccagtgc 300
tacttctcca aaaagaccaa cgacatcaac tcccaccaga ccgataaacg caagacctgc 360
atgtacggcg gcgtgaccga acacaacggc aaccagctgg acaaataccg cagcatcacc 420
gtgcgcgtgt tcgaggacgg caaaaacctg ctgagcttcg atgtgcagac caacaagaaa 480
aaagtgaccg cgcaggaact ggactacctg acccgtcact acctggtgaa aaacaaaaaa 540
ctgtacgagt tcaacaactc cccgtacgaa accggctaca tcaagttcat cgaaaacgaa 600
aacagcttct ggtacgacat gatgccggcg ccgggcgaca agttcgacca gtccaagtac 660
ctgatgatgt acaacgacaa caaaatggtt gacagcaaag acgtgaaaat cgaagtgtac 720
ctgaccacca aaaagaaata atga 744
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gacacggtac cgagaacctg tacttccag 29
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgggtccggc tggctttcgc cctggaagta caggttctcg 40
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gccagccgga cccgaaaccg gatgaactgc acaaaagcag 40
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tccatcaggc cggtgaattt gctgcttttg tgcagttcat 40
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caccggcctg atggaaaaca tgaaagtgct gtacgacgac 40
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acgttgatgg cggagacgtg gttgtcgtcg tacagcactt 40
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tctccgccat caacgtgaaa agcatcgatc agttcctgta 40
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atggagtaga tcaggtcgaa gtacaggaac tgatcgatgc 40
<210> 11
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tcgacctgat ctactccatc aaagacacca aactgggtaa 40
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tcgacgcgga cgttgtcgta gttacccagt ttggtgtctt 40
<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
caacgtccgc gtcgagttca aaaacaaaga cctggcggac 40
<210> 14
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gtccacgtat ttgtctttgt acttgtccgc caggtctttg 40
<210> 15
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tacaaagaca aatacgtgga cgttttcggc gcgaactact 40
<210> 16
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ttttggagaa gtagcactgg tagtagtagt tcgcgccgaa 40
<210> 17
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ccagtgctac ttctccaaaa agaccaacga catcaactcc 40
<210> 18
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tcttgcgttt atcggtctgg tgggagttga tgtcgttggt 40
<210> 19
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
agaccgataa acgcaagacc tgcatgtacg gcggcgtgac 40
<210> 20
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ttgtccagct ggttgccgtt gtgttcggtc acgccgccgt 40
<210> 21
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcaaccagct ggacaaatac cgcagcatca ccgtgcgcgt 40
<210> 22
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tcagcaggtt tttgccgtcc tcgaacacgc gcacggtgat 40
<210> 23
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
cggcaaaaac ctgctgagct tcgatgtgca gaccaacaag 40
<210> 24
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gttcctgcgc ggtcactttt ttcttgttgg tctgcacatc 40
<210> 25
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tgaccgcgca ggaactggac tacctgaccc gtcactacct 40
<210> 26
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
cgtacagttt tttgtttttc accaggtagt gacgggtcag 40
<210> 27
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gtgaaaaaca aaaaactgta cgagttcaac aactccccgt 40
<210> 28
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gaacttgatg tagccggttt cgtacgggga gttgttgaac 40
<210> 29
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
accggctaca tcaagttcat cgaaaacgaa aacagcttct 40
<210> 30
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
cgccggcatc atgtcgtacc agaagctgtt ttcgttttcg 40
<210> 31
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gacatgatgc cggcgccggg cgacaagttc gaccagtcca 40
<210> 32
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
tcgttgtaca tcatcaggta cttggactgg tcgaacttgt 40
<210> 33
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
tacctgatga tgtacaacga caacaaaatg gttgacagca 40
<210> 34
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
acacttcgat tttcacgtct ttgctgtcaa ccattttgtt 40
<210> 35
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gacgtgaaaa tcgaagtgta cctgaccacc aaaaagaaat 40
<210> 36
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gtgtcctcga gtcattattt ctttttggtg gtcagg 36
Claims (6)
1.一种重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的制备方法，其特征在于包含如下步骤：
（1）通过全基因合成，得到如SEQ ID NO.1所示的编码重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的基因；
（2）使用引物X5523-1和引物X5523-34对步骤（1）得到的基因进行PCR扩增，得到目的片段并回收纯化；
（3）将步骤（2）回收纯化后的目的产物与载体进行连接，得到重组质粒；
（4）将步骤（3）制得的重组质粒转入宿主细胞中，得到表达重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的菌株；
（5）将步骤（4）制得的表达重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的菌株作为表达菌株，基于大肠杆菌表达系统进行诱导表达；离心收集菌体，洗涤悬浮，然后超声破碎，离心，收集上清，纯化，得到重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白；
步骤（2）中所述的引物X5523-1和引物X5523-34的核苷酸序列如下所示：
引物X5523-1：GACACGGTACCGAGAACCTGTACTTCCAG；引物X5523-34：GTGTCCTCGAGTCATTATTTCTTTTTGGTGGTCAGG；
步骤（3）中所述的载体为pET-32a。
2.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的制备方法，其特征在于：
步骤（4）中所述的宿主细胞为大肠杆菌BL21（DE3）。
3.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的制备方法，其特征在于：
步骤（5）中所述的诱导表达的具体操作为：将表达重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的菌株进行液体扩大培养至OD值达到0.5～0.6时，添加终浓度为0.5mM的IPTG，220rpm、37℃诱导4h。
4.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的制备方法，其特征在于：
步骤（5）中所述的洗涤悬浮的试剂为破碎Buffer，所述的破碎Buffer为含0.1%w/vTriton X-114的1×PBS缓冲液，pH值为7.4。
5.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的制备方法，其特征在于：
步骤（5）中所述的超声破碎的条件为：冰浴下，超声功率为400～450W，超声时间为5～25min，其中，超声2s，暂停6s为一个循环。
6.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的制备方法，其特征在于：
步骤（5）中所述的纯化，包含如下步骤：
（Ⅰ）第一次镍琼脂糖亲和层析
①将Ni-IDA装柱，用3倍柱床体积的Binding buffer1清洗平衡柱子，流速5mL/min；
②将超声破碎、离心、收集得到的上清上柱，流速为2mL/min；
③5倍柱床体积的Binding buffer1清洗柱子，流速3mL/min；
④Wash Buffer洗杂，流速3mL/min，收集穿透液；
（Ⅱ）酶切去除蛋白标签
将步骤（Ⅰ）收集的穿透液进行透析，然后加入TEV酶，酶切去除标签，得到酶切后的穿透液；
（Ⅲ）第二次镍琼脂糖亲和层析
①将Ni-IDA装柱，用3倍柱床体积的Binding buffer2清洗平衡柱子，流速5mL/min；
②将步骤（Ⅱ）酶切后的穿透液上柱，流速为2mL/min，收集穿透液；
（Ⅳ）过滤
将步骤（Ⅲ）收集的穿透液经过0.22μm CA滤膜过滤，得到重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白。
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