CN103965302A - 一种重组超抗原seb突变体，其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组超抗原B型金黄色葡萄球菌肠毒素突变体，还公开了其制备方法及应用。本发明提取来源于天然金黄色葡萄球菌的肠毒素SEB基因组，得到基因组后针对与毒性相关的氨基酸位点进行定点突变，获得本发明的金黄色葡萄球菌肠毒素突变体。本发明的SEB突变体活性增强且毒性减弱，可做为抗肿瘤免疫治疗药物或免疫系统功能调节药物，具有较好的市场前景。

Description

一种重组超抗原SEB突变体,其制备方法及应用

技术领域：

本发明属于医药生物技术领域，涉及一种金黄色葡萄球菌肠毒素，具体地说涉及一种B型金黄色葡萄球菌肠毒素(SEB)，还涉及其制备方法及应用。

背景技术：

目前从微生物的代谢产物中分离到30000种以上的天然产物，其中很大一部分都具有生物活性，它们有望被开发成药物。已经面世的微生物相关药物已过百种。超抗原(superantigen，SAg)是一种高效的免疫调节蛋白，它无需抗原递呈细胞的加工，而直接与抗原递呈细胞的MHC-II抗原结合槽外侧及T细胞受体Vβ片段结合，在APC外形成MHC-SAg-TCR三元复合体而激活T细胞，其诱导T淋巴细胞的强烈增殖分化和细胞因子的分泌的能力是普通抗原的2000-50000倍，只需极低浓度(1-10pg/mL)即可激活T细胞库中30％-70％的多克隆T细胞产生很强的免疫应答。基于以上特点，超抗原作为一种理想的免疫调节剂有望开发成一种新型的肿瘤免疫治疗药物。

金黄色葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal enterotoxins，SEs)是一类具有代表性的超抗原。国内早在上世纪九十年代就将高聚生(HAS)用于临床肿瘤治疗，据报道其起效成分主要为肠毒素C2(SEC2)。高聚生临床应用于癌症放、化疗及手术治疗后的联合用药，在提高癌症患者的细胞免疫功能，抑制肿瘤细胞生长，保护化疗患者的骨髓造血功能等方面都有明显的作用，常见的副反应为发热和局部肿痛。超抗原SEB作为金葡菌肠毒素家族中的一员，其刺激T细胞能力远强于SEC2，国内外对其在抗肿瘤方面的研究还比较少。我们实验室首次对SEB进行无标签表达，为进一步进行SEB分子改造奠定了基础。

由于SE_s属于细菌外毒素，在一定浓度下会引起食物中毒，还有可能导致发热、呕吐、腹泻、中毒性休克等症状。近年来有研究显示超抗原在体内和体外试验中均能产生免疫抑制效应，高剂量和重复给药会导致T细胞无能，从而导致抗肿瘤活性降低这在某种程度上限制了其在临床抗肿瘤免疫治疗中的应用。这种肠毒素活性和免疫抑制效应影响了SEs作为超抗原在抗肿瘤免疫治疗中的使用。然而，其毒性和超抗原活性间并无必然联系(T.Harris，D.Grossman，J.Kappler，P. Marrack，R.Rich，M.Betley，Lack of completecorrelation between emetic and T-cell-stimulatory activities of staphylococcalenterotoxins.Infection and immunity61(1993)3175.)，国外学者在研究SEB中毒救治疫苗时发现将组氨酸位点突变为酪氨酸可以降低其毒性，但保持刺激淋巴细胞增殖的能力(S.Korolev，D.Pinelis，V.Savransky，J.Komisar，P. Vogel，K.Fegeding，Toxicity of the staphylococcal enterotoxin B mutants withhistidine-to-tyrosine substitutions.Toxicology187(2003)229-238.)。但目前尚未有将超抗原SEB进行多点突变，而降低毒副作用，增强抗肿瘤活性的报道。

发明内容：

为了进一步提高SEB的免疫调节效应、增强抗肿瘤活性并降低毒副作用，达到为肿瘤生物治疗提供安全有效的候选药物的目的，本发明提供一种重组超抗原SEB突变体。

本发明的重组超抗原SEB突变体，是在SEB的第32位组氨酸及173位的酪氨酸分别突变为谷氨酰胺(Glutamine，Q)和谷氨酸(Glutamicacid，E)，其氨基酸序列如序列表中序列2所示，其编码核苷酸序列如序列表中序列1所示。

本发明还公开了包含上述重组超抗原SEB突变体编码基因的表达载体，该表达载体可以是原核表达载体，也可以是真核表达载体，在原核表达载体中，可以选择包括pET-32a的多种表达载体。

本发明还公开了上述包含上述表达载体的表达菌株，根据上述原核或真核表达载体可以选择多种表达菌株。对应原核表达载体可以选择包括大肠杆菌的多种基因工程菌株，在大肠杆菌中可以选择包括E.coli BL21(DE3)的多种基因工程表达菌株。

本发明还提供了上述重组超抗原SEB突变体的制备方法：

提取来源于天然金黄色葡萄球菌的基因组，扩增得到肠毒素SEB基因，针对与毒性相关的32位组氨酸位点及173位的酪氨酸位点进行定点突变，分别突变为中性氨基酸谷氨酰胺(Glutamine，Q)和酸性氨基酸谷氨酸(Glutamicacid，E)。突变体的获得可采用本领域已知的多种方法实现上述目的。例如可以采用重叠PCR的方法，以重组质粒pGEM-T-SEB为模板，采用引物对1、2扩增得到SEB-H32Q，以引物对3、4扩增获得SEB-H32Q/K173E，其核苷酸序列如序列表中序列1所示。

得到突变基因SEB(H32Q/K173E)后克隆至克隆载体，可以选择包括pGEM-T在内的多种克隆载体，经酶切后亚克隆至表达载体中，可以选择包括pET-32a在内的多种表达载体，转化大肠杆菌，优选大肠杆菌BL21(DE3)，可以通过IPTG诱导表达等多种表达方式进行表达，获得可溶性的超抗原突变蛋白。获得的超抗原突变体可以通过多种方式进行纯化，例如经羧甲基纤维素钠弱阳离子柱(CM柱)分离纯化，获得超抗原活性增强的超抗原突变蛋白纯品。

本发明还公开了重组超抗原SEB突变体的用途。本发明进行了以下试验。在细胞毒活性测试中，本发明的突变体蛋白在极低浓度范围内均能起到良好的杀伤肿瘤作用，对正常细胞杀伤较弱。在刺激人外周血淋巴细胞(PBMC)增殖试验中，本发明的突变体在较低浓度下与野生型SEB(wtSEB)相比具有显著性差异。在体内抗肿瘤作用筛选试验中，SEB(H32Q/K173E)突变体表现现出强大的抗肿瘤作用，与同剂量的wtSEB对照组相比有显著差异。在兔发热试验中，本发明的突变体引起新西兰兔发热的能力较野生型SEB下降明显。

通过以上实验验证，本发明的重组超抗原SEB突变体活性增强且毒性减弱，可以用于制备临床抗肿瘤免疫治疗药物和免疫功能调节药物，具有良好的临床应用前景及重要的经济效益和社会效益。

本发明的技术方案具有如下优点：

1.本发明利用基因定点突变技术，构建了超抗原活性和抗肿瘤效应显著增强且毒性降低的SEB突变蛋白，无标签，可成功在大肠杆菌中实现可溶性表达。本发明可提供直接用于生产该超抗原突变蛋白的基因工程菌株。

2.本发明实现SEB突变体基因的异源表达，并提供了制备该超抗原突变蛋白的方法。操作简单易行，所得蛋白具有产量高，纯度高，且结构稳定的特点。此种高效表达纯化的方法更适合医药工业化生产的需要。

3.本发明中的SEB突变体蛋白通过基因定点突变技术获得，其在对SEB蛋白中与毒性相关的32位碱性氨基酸组氨酸进行替换，从而使32位的组氨酸(Histidine，H)和173位的赖氨酸(Lysine，K)变为中性氨基酸谷氨酰胺(Glutamine，Q)和酸性氨基酸谷氨酸(Glutamicacid，E)，获得了活性提高、毒性减弱的超抗原，进而得到适合临床应用的生物技术制剂。

4.本发明构建并获得的重组SEB突变体蛋白，提高了超抗原抗肿瘤活性并降低其致热毒性，是作为肿瘤免疫治疗和生物反应调节剂更为合适的超抗原候选药物。

附图说明：

图1SEB(H32Q/K173E)突变体蛋白重组表达载体的构建。图1A为重组克隆载体的BamH I和Nde I双酶切结果。M为DNA marker；1，2均为目的酶切产物。图1B为酶切鉴定重组表达质粒(pET-32a)。其中M为DNA marker，1-6分别是突变体的重组质粒的酶切鉴定。(酶切结果显示，从pET32-(a)质粒上切下了大小约为720bp的DNA片段，表明我们的目的片段成功插入pET32-(a)质粒上。后经生工生物公司测序验证确为突变序列。)

图2SEB(H32Q/K173E)突变体蛋白SDS-PAGE及Western Blot鉴定。图2A为本发明SEB(H32Q/K173E)突变体蛋白的表达纯化电泳图谱，M为低分子量蛋白Marker，1代表wtSEB，2代表SEB(H32Q/K173E)。图2B为WesternBlot鉴定结果，1代表wtSEB阳性对照，2代表SEB(H32Q/K173E)，3代表BSA阴性对照。

图3超抗原体外杀伤试验。PBMC存在下，SEB(H32Q/K173E)突变体、wtSEB对正常人脑微血管内皮细胞HBMEC，人肝癌细胞系SMMC-7721，宫颈癌细胞系Hela，胃癌细胞系BGC-823生长呈不同程度的抑制。(其中纵坐标为抑瘤率，横坐标为各蛋白的剂量梯度)。各蛋白对细胞的杀伤作用IC50值详见表1。

图4不同浓度超抗原刺激下淋巴细胞增殖情况(其中纵坐标为表示增殖的荧光强度，横坐标为各突变体蛋白的剂量梯度)。在本试验条件下，SEB(H32Q/K173E)突变体0.01ng/ml-1000ng/ml均能刺激淋巴细胞显著增殖(P＜0.01)，且极低剂量下(0.01ng/ml-0.1ng/ml)刺激增殖能力优于wtSEB。

图5体内抗肿瘤作用筛选试验图示。图5A为间隔3天给药抑瘤效果图。图5B为连续给药抑瘤效果图。(不同给药途经下SEB(H32Q/K173E)突变体均显示出良好的抗肿瘤效果，且较低剂量抑瘤作用明显。)

图6本发明中肠毒素SEB突变蛋白的新西兰兔致热活性检测结果(其中纵坐标为表示温度上升值，横坐标为各突变体蛋白的作用时间)。在静脉给予5μg/kg超抗原时，SEB(H32Q/K173E)突变体组新西兰兔体温升高明显弱于wtSEB对照组。

具体实施方式：

实施例一重组超抗原SEB突变体的制备

一、材料：

1.1主要仪器

PCR扩增仪(德国Whatman Biometra公司)，电热恒温水浴锅(北京市长风仪器仪表公司)，AKTA FPLC蛋白纯化仪(美国GE公司)，聚丙烯酰胺凝胶电泳仪(美国BIORAD公司)

1.2菌株及主要试剂

天然金黄色葡萄球菌肠毒素SEB产毒株ATCC(14458)，购自ATCC(美国标准生物品收藏中心)；pET-32(a+)表达载体，购自Novagen公司；大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)为invitrogen公司产品；基因克隆载体pGEM-T，购自Promega公司；NdeI、BamHI，购自TaKaRa Biotechnology公司；T4DNA连接酶，购自New England BioLabs公司；IPTG，购自AMRESCO公司；质粒提取试剂盒，广州东盛公司；基因组DNA提取试剂盒，赛百盛公司。

二、方法结果：

1.超抗原突变蛋白表达载体的构建：

根据GeneBank中的SEB Gen(AF410775))针对与毒性相关的32位组氨酸位点及173位的酪氨酸位点进行定点突变，分别突变为中性氨基酸谷氨酰胺(Glutamine，Q)和酸性氨基酸谷氨酸(Glutamicacid，E)。具体为从天然金黄色葡萄球菌肠毒素SEB产毒株ATCC(14458)中提取基因组，用引物对1扩增得到SEB基因，克隆至基因克隆载体pGEM-T，构建质粒pGEM-T-SEB；用重叠PCR的方法，以重组质粒pGEM-T-SEB为模板，采用引物对2、3扩增得到SEB-H32Q，以引物对4、5扩增获得SEB-H32Q/K173E，其核苷酸序列如序列表中序列1所示。

引物对1为，SEB-F：5’-ccatatggagagtcaaccagatcctaaaccagatgagttgc-3’，见序列表中序列3和SEB-R：5’-gcggatccctttttctttgtcgtaagataaacttcaatcttc-3’，见序列表中序列6；

引物对2为，SEB-F：5’-ccatatggagagtcaaccagatcctaaaccagatgagttgc-3’，见序列表中序列3和32Q-R：5’-gatttaacgtttattgctgatacctgattatc-3’，见序列表中序列4；

引物对3为，32Q-F：5’-gataatcaggtatcagcaataaacgttaaatc-3’，见序列表中序列5和SEB-R：5’-gcggatccctttttctttgtcgtaagataaacttcaatcttc-3’，见序列表中序列6

引物对4为，SEB-F：5’-ccatatggagagtcaaccagatcctaaaccagatgagttgc-3’，见序列表中序列3和173E-R：5’-gttaaattcatagagttccttatttttcacc-3’，见序列表中序列7

引物对5为，173E-F：5’-ggtgaaaaataaggaactctatgaatttaac-3’见序列表中序列8和SEB-R：5’-gcggatccctttttctttgtcgtaagataaacttcaatcttc-3’，见序列表中序列6；

取接种于LB培养基的天然金黄色葡萄球菌肠毒素SEB产毒株，提取基因组DNA，作为PCR的模板，以引物对1扩增出肠毒素SEB基因。PCR反应条件如下：

PCR反应参数为96℃5min、94℃60s、72℃60s、50℃60s、25个循环，最后72℃延伸10min。采用1.5％琼脂糖电泳观察所扩增的PCR产物。

将PCR产物克隆至基因克隆载体pGEM-T，构建出克隆质粒pGEM-T-SEB，并将该质粒转化大肠杆菌DH5α。

取接种于LB培养基的含pGEM-T-SEB质粒的DH5α菌体，提取质粒DNA，作为PCR的模板。PCR反应条件如下：

PCR反应参数为96℃5min、94℃60s、72℃60s、50℃60s、25个循环，最后72℃延伸10min。采用1.5％琼脂糖电泳观察所扩增的PCR产物。

具体PCR过程如下：

以提取质粒为模板，

以引物对2扩增出SEB基因1位-116位的核酸片段；

以引物对3扩增出SEB基因97位-717位的核酸片段；

以SEB-F和SEB-R为引物，以引物对2和3扩增出的核酸片段为模板，PCR得到SEB-H32Q；

以扩增得到的SEB-H32Q为模板，

以引物对4扩增出SEB基因1位-533位核酸片段；

以引物对5扩增出SEB基因504位-717位核酸片段；

以SEB-F和SEB-R为引物，已引物对4和5扩增出的核酸片段为模板，PCR得到SEB-H32Q/K173E；

再以T4DNA连接酶将上述产物连入经同样双酶切的pET-32a表达载体，构建成表达载体pET-32a-SEB-H32Q/K173E。酶切体系如下：

转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞(转化操作按J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著的《分子克隆实验指南》第三版P96-99)，通过酶切验证及DNA测序鉴定正确重组克隆。(结果见图1A，B)

2.超抗原突变蛋白的诱导表选和纯化：接种转化了表达载体的BL21(D3)单菌落于含100μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃过夜培养，以1∶100(体积比)的接种量转接一次，37℃摇床培养至OD₆₀₀为0.6加入终浓度1mM的IPTG，30℃诱导表达4小时而后以8000rpm的速度离心收集菌体，重悬于1/10体积的平衡缓冲液A(5.0mM磷酸盐缓冲液，pH7.0)，以5ml/min速度上样于预先平衡好的CM-弱阳离子交换柱，以含0.5M NaCl的平衡缓冲液B(4.0mM磷酸盐缓冲液，pH7.4)平衡缓冲液洗柱5个体积，洗去非特异性结合的杂蛋白，最后以平衡缓冲液A进行洗脱，收集紫外吸收峰在100nm时洗脱产物即为超抗原突变蛋白，洗脱产物用PBS透析除盐，通过SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白的表达及纯化效果(参见图2A)。(如图2A所示，目的蛋白SEB-H32Q/K173E经IPTG诱导表达后主要以可溶性形式存在，通过离子交换柱获得较高纯度的突变蛋白，可用于进一步的生物学活性试验。)

实施例二纯化蛋白的Western-blot鉴定

一、材料：

1.1主要仪器

ST-1型半干式转移电泳槽，大连竞迈生物科技公司

1.2主要试剂

鼠抗wt-SEB单抗，羊抗小鼠IgG/HRP，购自SANTA CRUZ公司；牛血清白蛋白(BSA)，购于北京百奥康生物公司；SDS、ECL显影液，购于美国Sigma公司；SuperWest Pico Trial Kit，购自Thermo公司。余同前实施例。

二、方法结果：

制备好的蛋白经SDS-PAGE电泳后以半干法转膜。以1mA/cm²的电量，恒流转移1h。转移完毕后取下硝酸纤维素膜，用5％脱脂奶粉4℃封闭过夜。封闭结束后弃封闭液，用PBST洗膜，7min/次×3次。加入用PBST稀释好的一抗，室温孵育1h。用PBST洗膜后加入PBST稀释好的酶标二抗(羊抗小鼠IgG/HRP)，室温轻摇45min。PBST洗膜后在纤维素膜上加入SuperWest Pico Trial Kit试剂，暗室中压片，显影。(如图2B所示，SEB-H32Q/K173E经Western-blot鉴定突变体后条带单一清晰，仍然保持着wtSEB的特异性。)

实施例三细胞毒活性测试(MTS检测)

一、材料：

1.1主要仪器

Bx60-32FB2-E01荧光显微镜，日本Olympus公司；酶联免疫吸附仪，美

国SPECTRA MAX PLUS

1.2主要试剂、耗材

MTS检测试剂盒，购自Promega公司；细胞培养瓶、培养板等耗材及RPMI1640培养基，购自GIBCO公司；Ficoll-PaqueTM PLUS淋巴细胞分离液分离，购自GE公司

1.3细胞系

人肿瘤细胞(人肝癌细胞系SMMC-7721，宫颈癌细胞系Hela，胃癌细胞系BGC-823)，正常人脑微血管内皮细胞HBMEC，均购于中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。余同前实施例。

二、方法结果：

取状态良好的各种人的细胞，台盼蓝法测细胞存活率＞95％，5×10³个细胞/孔加入96孔细胞培养板A中。将来源于健康志愿者的外周血等梯度离心，淋巴细胞分离液分离。新鲜分离出外周血淋巴细胞并计数，调整淋巴细胞(PBMC)浓度为8×10⁵/孔加入96孔细胞培养板B中。将纯化的SEB-H32Q/K173E突变体蛋白及野生SEB蛋白分别以5ng/ml的终浓度开始，逐级5倍稀释为一系列浓度梯度的超抗原受试物加入B板各孔，每个浓度设三个复孔。同时设对照孔(单纯肿瘤、单纯PBMC、PBMC与肿瘤混合孔)。24h后将A、B板共同培养，72h后每孔加入100μl无血清RPMI1640和20μl MTS染色剂，继续培养2h后检测490nm的OD值。肿瘤生长抑制率按如下公式计算，同时求IC50(细胞生长抑制率达50％时的药物浓度，结果见表1)。

$\mathrm{TGI}=\frac{(\mathrm{Am}-\mathrm{Alym})-(\mathrm{Atest}-\mathrm{Alym})}{(\mathrm{Am}-\mathrm{Alym})}\×100\%.$

Am为PBMC与肿瘤混合孔OD值均值，Alym为单纯PBMC孔OD值均值，Atest为各实验孔OD值均值。试验中同时设超抗原与肿瘤细胞混合对照。结果发现不加PBMC超抗原对肿瘤细胞生长并无影响。突变体蛋白在极低浓度范围内即能起到良好的杀伤肿瘤作用，对正常细胞杀伤较弱，体现出良好的临床应用前景，结果如图3。

表1wtSEB及其H32Q/K173E突变体对不同细胞的杀伤作用IC₅₀值

实施例四刺激人外周血淋巴细胞(PBMC)增殖

一、材料：

Luminescent ATP Cell Viability Assay Reagent，购自Promega公司，余同前实施例

二、方法结果：

密度梯度离心新鲜分离出外周血淋巴细胞(PBMC)，以含10％NCS的RPMI1640培养基混悬成单细胞悬液计数后以10⁵cell/孔加入96孔板中，再加入100μl不同浓度的蛋白溶液，使其终浓度为0.01～1000ng/ml。37℃5％CO2培养箱培养72h。用荧光检测试剂(Luminescent ATP Cell Viability Assay Reagent)检测淋巴细胞增殖情况。(结果参见图4，在0.01ng/ml-1000ng/ml浓度范围均可以刺激PBMC增殖，且SEB-H32Q/K173E突变体在较低浓度下(0.01ng/ml-0.1ng/ml)与wtSEB相比具有显著性差异(P＜0.05))

实施例五体内抗肿瘤作用筛选试验(一)

一、材料：

Nod/Scid鼠，购于中国医学科学院实验动物研究所，人肝癌SMMC-7721细胞株，购于中国医学科学院基础医学研究所细胞中心，余同前实施例

二、方法结果：

建立人源化的严重免疫缺陷型小鼠Nod/Scid鼠的肿瘤模型，对wtSEB及SEB(H32Q/K173E)双点突变体进行评价。健康雄性Nod/Scid鼠(5-6周龄)腹腔接种人肝癌SMMC-7721细胞5*10⁶cell/只试验第0天接种肿瘤，隔日腹腔注射1.5*10⁷PBMC，给予PBMC后开始i.p.注射超抗原4次，间隔3天。接瘤35天后脱颈椎处死小鼠，计瘤个数并称重，统计抑瘤率。(抑瘤率(％)＝(肿瘤模型组瘤重-给药组瘤重)/肿瘤模型组瘤重×100％)。(结果见表2。在所建立的敏感动物模型-人源化Nod/Scid鼠的模型中，低剂量的SEB(H32Q/K173E)突变体表现现出强大的抗肿瘤作用，与同剂量的wtSEB对照组相比有显著差异(P＜0.05)。本试验所选用的突变体蛋白具有代表性，提示本发明中的突变蛋白进一步开发成为临床抗肿瘤药物和免疫调节药物的前景良好。)

表2SEB(H32Q/K173E)双点突变体对Nod/Scid鼠移植瘤

SMMC-7721生长的影响()

A列：**P＜0.01，a与肿瘤模型组相比；B列：*P＜0.05，b与PBMC组相比；c与同剂量下wtSEB对照组相比。

实施例六体内抗肿瘤作用筛选试验(二)

一、材料：

新西兰兔，购于军科院实验动物中心；VX2兔肿瘤细胞，购于上海佛雷堡生物科技发展有限公司细胞库；余同前实施例

二、方法结果：

建立具有完整免疫系统的新西兰兔肿瘤模型，对wtSEB及SEB(H32Q/K173E)双点突变体进行评价，并考察不同给药方式的治疗效果。2-2.5kg雌性健康新西兰兔(购于军科院实验动物中心)，右后腿肌肉接种体内传代的兔VX-2肿瘤块。试验第0天接种肿瘤，而后于瘤径达到1-1.2cm按瘤径分组。于此后按不同给药方案于给药，每三天测量瘤径；于第22天解剖称瘤重统计抑瘤率。(抑瘤率(％)＝(肿瘤模型组瘤重-给药组瘤重)/肿瘤模型组瘤重×100％)。

方案一

设肿瘤模型组和SEB-H32Q/K173E3.75μg/kg、7.5μg/kg、15μg/kg治疗组，及wtSEB对照组(7.5μg/kg)，每组4-6只新西兰兔。按0.05g/只接瘤，而后于瘤径达到1-1.2cm按瘤径随机分组。于此后第1、4、7d给药3次，每两天测量瘤径；第22天解剖称瘤重。(结果见图5A)

方案二

设肿瘤模型组和SEB-H32Q/K173E3.75μg/kg、1.25μg/kg及wtSEB对照组(3.75μg/kg)，每组4只新西兰兔。按0.05g/只接瘤，而后于瘤径达到1-1.2cm按瘤径随机分组。于此后第连续每天给药，每两天测量瘤径；第22天解剖称瘤重。(结果见图5B。)

在所建立的敏感动物模型-新西兰兔肿瘤模型中，低剂量的SEB(H32Q/K173E)突变体表现出强大的抗肿瘤作用；相同剂量下，SEB(H32Q/K173E)突变体组抗肿瘤作用明显强于wtSEB对照组。本实施例所选用给药剂量下，方案一中SEB(H32Q/K173E)3.75μg/kg剂量组表现出良好的抑瘤效果，试验中有3只动物出现肿瘤消退，试验结束时抑瘤率达到90％。方案二选用小剂量连续给药，各组肿瘤生长缓慢。提示本发明中的突变蛋白具有良好的抗肿瘤效果，且具有较大的用药安全范围。

实施例七兔发热毒性试验

一、材料：

新西兰兔，购于军科院实验动物中心，余同前实施例

二、方法结果：

选用对超抗原敏感的新西兰兔模型，评价wtSEB及SEB(H32Q/K173E)突变体的致热毒性。试验选用每天体温波动不超过0.5℃的雄性新西兰兔(购于军事医学科学院动物中心，体重2-2.5kg)。试验前每只兔子体温保持稳定1小时，且初始体温保持在38.6-39.5℃的健康新西兰兔每组3只，分别静脉给予5μg/kg的经0.22μm微孔滤膜过滤的超抗原及无菌PBS(溶剂对照)，观察其在4小时内的体温变化情况。(参见图6。结果发现SEB(H32Q/K173E)引起新西兰兔发热的能力较wtSEB下降明显，更具有临床药用应用前景。)

上述一系列实验证实，通过基因工程方法获得的高纯度重组金葡菌肠毒素SEB(H32Q/K173E)突变体蛋白仍然保持其超抗原活性，极低浓度(0.01ng/ml)便可以刺激人外周血淋巴细胞显著增殖；经SEB(H32Q/K173E)突变体刺激的淋巴细胞对各种肿瘤细胞均有显著的杀伤作用，但对正常的人脑微血管内皮细胞杀伤很弱。体内试验证明，与野生型SEB相比，SEB(H32Q/K173E)双点突变体的致热毒性明显降低。在较低剂量下(450ng/只)SEB(H32Q/K173E)突变体蛋白即可以显著抑制肝癌SMMC-7721在人源化免疫缺陷小鼠体内的生长；相同剂量下(150ng/只)SEB(H32Q/K173E)突变体与野生型SEB对照组相比有显著性差异(p＜0.05)。综上所述，本发明提供的重组SEB(H32Q/K173E)突变体活性增强且毒性降低，可以用于免疫调节剂及抗肿瘤候选药的研究开发。

Claims (10)

1.一种重组超抗原SEB突变体，其特征在于在SEB的第32位组氨酸及173位的酪氨酸分别突变为谷氨酰胺和谷氨酸，其氨基酸序列如序列表中序列2所示。

2.根据权利要求1所述的重组超抗原SEB突变体，其特征在于其编码核苷酸序列如序列表中序列1所示。

3.包含权利要求1或2所述突变体编码基因的表达载体，其特征为原核表达载体。

4.权利要求3所述表达载体，为pET-32a-mSEB。

5.包含权利要求3所述表达载体的基因工程表达菌株，其特征为大肠杆菌。

6.权利要求5所述表达菌株，为大肠杆菌BL21(DE3)。

7.权利要求1或2所述重组超抗原SEB突变体的制备方法，包括如下步骤：

(1)提取金葡菌基因组，并克隆得到wtSEB基因；；

(2)采用重叠PCR的方法，分别扩增获得32位和173位两个突变位点的左右两侧的重叠PCR产物；

(3)以获得的重叠PCR产物为模板进行PCR扩增获得序列表中序列1所示的SEB突变基因；

(4)将得到的SEB突变基因克隆至原核表达载体，通过大肠杆菌进行表达。

8.根据权利要求7所述制备方法，其中原核表达载体为pET-32a，大肠杆菌为BL21(DE3)。

9.权利要求1或2所述重组超抗原SEB突变体在制备肿瘤免疫治疗药物中的用途。

10.权利要求1或2所述重组超抗原SEB突变体在制备免疫功能调节剂中的用途。