CN1522156A

CN1522156A - 用于人类治疗的新的工程化超抗原

Info

Publication number: CN1522156A
Application number: CNA028131045A
Authority: CN
Inventors: G; G·福尔斯贝里; E·埃尔兰松; P·安通松; B·瓦尔泽
Original assignee: Active Biotech AB
Current assignee: Active Biotech AB
Priority date: 2001-06-28
Filing date: 2002-06-19
Publication date: 2004-08-18
Anticipated expiration: 2022-06-19
Also published as: RU2307837C2; BRPI0210568B1; CA2451847A1; WO2003002143A1; BG108499A; PL216516B1; CN1522156B; CA2451847C; SE0102327D0; US20100111978A1; UA85993C2; SK16112003A3; KR100961054B1; EE05475B1; ZA200309150B; PL368048A1; NZ529827A; NO20035773L; NO333676B1; DK1406657T3

Abstract

本发明涉及组合物和使用方法，其中，所述组合物包括细菌超抗原和抗体部分的结合物。更具体地说，所述细菌超抗原已被修饰，以减弱血清反应性并保留超抗原活性。

Description

用于人类治疗的新的工程化超抗原

发明背景

技术领域

本发明涉及免疫和增生性疾病(例如癌症)领域。更具体地说，本发明涉及组合物和使用方法，其中所述组合物包含经过修饰以降低血清反应性的超抗原。

相关技术

超抗原(SAg)构成了一组细菌和病毒蛋白，这种蛋白在激活大部分T细胞群体方面是极为有效的。超抗原是在不进行加工的情况下直接连接在主要组织相容性复合物(MHC)上的。实际上，超抗原未经加工地结合在II类MHC分子上的抗原结合沟(groove)的外部，从而避免了常规肽结合位点上的大部分多型性(polymorphism)。结合的机制取决于与Vβ链上的T细胞受体(TCR)结合的超抗原，而不是与T细胞受体(TCR)超变环(hypervariable loops)结合的超抗原。

就结构和功能而言，葡萄球菌肠毒素(SEs)是一组同源的超抗原(Papageorgiou等，2000)。已知它们是人类食物中毒和中毒性休克综合症的主要原因。

为了对实体瘤进行佐剂治疗，已开发了一种新的基于SAg的肿瘤治疗方法。它通过将肿瘤专一性单克隆抗体的Fab部分和激活T细胞的SAg整合在单一重组融合蛋白上，利用了免疫系统的两个主要的分支(arm)。与肿瘤细胞结合的Fab-SAg蛋白能引发SAg激活的细胞毒性T细胞直接通过超抗原抗体依赖型细胞介导的细胞毒性(SADCC)杀伤肿瘤细胞。另外，激活的T细胞能产生肿瘤和前炎细胞因子，分别克服了肿瘤异质性和大分子摄入问题。

基于超抗原的肿瘤治疗方法已取得了某些成功，不过，一个需要解决的临床问题是全身性免疫系统的激活。已在结肠直肠癌和胰腺癌的临床实验中研究了具有野生型SEA的融合蛋白(Alpaugh等，1998)。尽管获得了令人鼓舞的结果，但也发现了局限性。首先，这种产品的毒性很大。其次，预先形成的抗患者体内超抗原的抗体使得定量用药很复杂。另外，这种产品是免疫原性的。因此，仅有可能对有限数量的患者进行循环重复的治疗。

直到本发明之前，基于SAg的治疗方法都是剂量限制型的。本发明首次对超抗原进行了修饰，导致血清反应性降低，并保留了超抗原活性。因此，本发明是新的并且是非显而易见的。

发明概述

以上对本发明的特征和技术优点进行了相当概括地描述，以便更好地理解下面对本发明所做的详细说明。下面将对本发明的其他特征和优点进行描述，这些特征和优点构成了本发明权利要求的主题。本领域技术人员应当理解，本发明的构思和具体实施方案可以方便地用作改进或设计用于实现本发明的相同目的的其他结构的基础。本领域技术人员也应认识到，这种等同方案没有超出所附权利要求书中限定的本发明的构思和范围。被认为是本发明的特征的这些新的特征，通过下面的结合附图所进行的说明，可以更好地理解它的组构和操作方法，以及其他目的和优点。不过，应当指出的是，每一幅附图仅仅是为了说明和描述目的而提供的，而不是用作对本发明范围的限定。

在本发明中，提供了一种包括细菌超抗原和抗体部分(moiety)的结合物(conjugate)，其中超抗原是包括A-E区的低效价超抗原，A区是TCR结合位点，而B-E区决定与II类MHC分子的结合；并且编码超抗原的DNA序列被取代，使得在A区中有不超过15个氨基酸残基被不同的氨基酸替代，这样，与它所来源的超抗原相比，取代的超抗原具有减弱了的血清反应性；并且，其中所述抗体部分是完整长度的抗体或任何其他分子结合抗体活性片段，所述抗体部分是针对癌相关细胞表面结构的。超抗原的例子包括，但不局限于葡萄球菌肠毒素(SE)，酿脓链球菌外毒素(SPE)，金黄色葡萄球菌中毒性休克综合症毒素(TSST-1)，促有丝分裂链球菌(streptococcal mitogenic)外毒素(SME)和链球菌超抗原(SSA)。在具体实施方案中，葡萄球菌肠毒素是葡萄球菌肠毒素A(SEA)或葡萄球菌肠毒素E(SEE)。

在具体实施方案中，A区中被取代的氨基酸残基的位置选自：20，21，24，27，173和204。同样，C区可以包括不超过15个氨基酸残基的取代。所述取代可以发生在79，81，83和84位氨基酸残基上进行。另外，E区可以包括不超过15个氨基酸残基的取代，其中取代可以在227位氨基酸残基上进行。

在本发明的另一实施方案中，提供了一种包括细菌超抗原和抗体部分的结合物，其中超抗原是包括A-E区的低效价超抗原，A区是TCR结合位点，而B-E区决定与II类MHC分子的结合；并且超抗原的氨基酸序列被取代，使得在B区有不超过15个氨基酸残基被不同的氨基酸替代，这样，与它所来源的超抗原相比，取代的超抗原具有减弱了的血清反应性；并且，其中所述抗体部分是完整长度的抗体或任何其他分子结合抗体活性片段，所述抗体部分是针对癌相关细胞表面结构的。特别地，B区中被替代的氨基酸残基的位置可选自：34，35，39，40，41，42，44，45和49。

本发明的另一实施方案，提供了一种包括细菌超抗原和抗体部分的结合物，其中超抗原是包括A-E区的低效价超抗原，A区是TCR结合位点，而B-E区决定与II类MHC分子的结合；并且所述超抗原的氨基酸序列被取代，使得在C区有不超过15个氨基酸残基被不同的氨基酸替代，这样，与它所来源的超抗原相比，取代的超抗原具有减弱了的血清反应性；并且，其中所述抗体部分是完整长度的抗体或任何其他分子结合抗体活性片段，所述抗体部分是针对癌相关细胞表面结构的。在具体实施方案中，所述癌选自：肺癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌、卵巢癌、胃癌、宫颈癌和前列腺癌。C区中被替代的氨基酸残基的位置选自：74，75，78，79，81，83和84。

超抗原的例子包括，但不局限于葡萄球菌肠毒素(SE)，酿脓链球菌外毒素(SPE)，金黄色葡萄球菌中毒性休克相关毒素(TSST-1)，促有丝分裂链球菌外毒素(SME)和链球菌超抗原(SSA)。在具体实施方案中，葡萄球菌肠毒素是葡萄球菌肠毒素A(SEA)或葡萄球菌肠毒素E(SEE)。

在具体实施方案中，所述结合物还可以包括A区中不超过15个氨基酸残基的取代。A区的取代可以在20，21，24，27，173或204位氨基酸残基上进行。另外，所述结合物可以包括E区的不超过15个氨基酸残基的取代。特别地，E区的取代可以在227位氨基酸残基上进行。

在另一个具体实施方案中，所述结合物可以含有包括以下取代的SSE氨基酸序列：R20G，N21T，S24G，R27K，K79E，K81E，K83S，K84S和D227S，或包括以下取代的SEE氨基酸序列：R20G，N21T，S24G，R27K，K79E，K81E，K83S，K84S和D227A。另外，所述结合物可以包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

在另一实施方案中，所述结合物可以包括抗体部分，例如，但不局限于Fab片段。特定的Fab片段可以包括C215Fab或5T4Fab。

另外，所述结合物还可以包括细胞因子，例如白介素。在具体实施方案中，所述白介素是IL2或它的具有基本上与天然IL2相同的生物学活性的衍生物。

另一实施方案包括含有细菌超抗原和抗体部分的结合物，其中超抗原是包括A-E区的低效价超抗原，A区是TCR结合位点，而B-E区决定与II类MHC分子的结合；并且，所述超抗原的氨基酸序列被取代，使得D区上有不超过15个氨基酸残基被不同的氨基酸残基替代，这样，与它所来源的超抗原相比，取代的超抗原具有减弱了的血清反应性；并且，其中所述抗体部分是完整长度的抗体或任何其他分子结合抗体活性片段，所述抗体部分是针对癌相关细胞表面结构的。D区中被替代的氨基酸残基的位置选自：187，188，189和190。

在另一实施方案中，提供了一种包括细菌超抗原和抗体部分的结合物，其中超抗原是包括A-E区的低效价超抗原，A区是TCR结合位点，而B-E区决定与II类MHC分子的结合；并且，所述超抗原的氨基酸序列被取代，使得E区有不超过15个氨基酸残基被不同的氨基酸替代，这样，与它所来源的超抗原相比，取代的超抗原具有减弱了的血清反应性；并且，其中所述抗体部分是完整长度的抗体或任何其他分子结合抗体活性片段，所述抗体部分是针对癌相关细胞表面结构的。在具体实施方案中，葡萄球菌肠毒素是葡萄球菌肠毒素A(SEA)或葡萄球菌肠毒素E(SEE)。另外，E区中被替代的氨基酸残基位置选自：217，220，222，223，225和227。

在一具体实施方案中，所述结合物还包括A区中不超过15个氨基酸残基的取代。特别地，A区的取代可以在20，21，24，27，173和204位氨基酸残基上进行。

在另一具体实施方案中，所述结合物还包括B区中的不超过15个氨基酸残基的取代，其中，所述取代可以在34，35，39，40，41，42，44，45和49位氨基酸残基上进行。

另外，所述结合物可以包括C区的不超过15个氨基酸残基的取代。具体地说，C区的取代可以在74，75，78，79，81，83和84位氨基酸残基上进行。另外，所述结合物还可以包括D区的不超过15个氨基酸残基的取代，其中所述取代可以在187，188，189和190位氨基酸残基上进行。

在其他具体实施方案中，提供了一种含有治疗有效量的结合物的药用组合物，其中所述结合物包括细菌超抗原和抗体部分，其中超抗原是包括A-E区的低效价超抗原，A区是TCR结合位点，而B-E区决定与II类MHC分子的结合；并且，所述超抗原的氨基酸序列被取代，使得在C区有不超过15个氨基酸残基被不同的氨基酸替代，这样，与它所来源的超抗原相比，取代的超抗原具有减弱了的血清反应性；并且，其中所述抗体部分是完整长度的抗体或任何其他分子结合抗体活性片段，所述抗体部分是针对癌相关细胞表面结构的。特别地，C区中被替代的氨基酸残基的位置选自：74，75，78，79，81，83和84。

在其他实施方案中，所述药用组合物可以含有一种结合物，该结合物包括A区的不超过15个氨基酸残基的取代，其中A区的取代是在20，21，24，27，173和204位氨基酸残基上进行的。另外，所述药用组合物还可以包括E区的不超过15个氨基酸残基的取代。特别地，E区的取代可以在227位氨基酸残基上进行。

在具体实施方案中，所述药用组合物可以含有一种结合物，该结合物含有SEE氨基酸序列(SEQ ID NO：ID NO：7)以及以下其他取代：R20G，N21T，S24G，R27K，K79E，K81E，K83S，K84S和D227S。

在另一具体实施方案中，所述药物组合物可以含有SEE氨基酸序列(SEQ ID NO：ID NO：7)以及以下其他取代：R20G，N21T，S24G，R27K，K79E，K81E，K83S，K84S和D227A。另外，所述药用组合物含有具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的结合物。

在其他具体实施方案中，所述药用组合物包括抗体部分，例如Fab片段。特别地，所述Fab片段是C215Fab或5T4Fab。所述药用组合物还可以包含细胞因子，例如白介素。所述白介素可以是IL2或它的具有基本上与天然IL2相同生物学活性的衍生物。

本发明的另一实施方案包括一种通过激活哺乳动物的免疫系统治疗所述哺乳动物的癌症的方法，包括给所述哺乳动物施用治疗有效量的结合物，其中所述结合物包括细菌超抗原和抗体部分，其中所述超抗原是包括A-E区的低效价超抗原，A区是TCR结合位点，而B-E区决定与II类MHC分子的结合；并且所述超抗原的氨基酸序列被取代，使得在C区有不超过15个氨基酸残基被不同的氨基酸所替代，这样与它所来源的超抗原相比，取代的超抗原具有减弱了的血清反应性；并且，其中所述抗体部分是完整长度的抗体或任何其他分子结合抗体活性片段，所述抗体部分是针对癌相关细胞表面结构的。所述癌的例子包括，但不局限于肺癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌、卵巢癌、胃癌、宫颈癌和前列腺癌。具体地说，C区中被替代的氨基酸残基的位置选自：74，75，78，79，81，83和84。

在其他实施方案中，A区还可以包括不超过15个氨基酸残基的取代，其中所述取代是在20，21，24，27，173和204位氨基酸残基上进行的。另外，E区还可以包括不超过15个氨基酸残基的取代。特别地，E区的取代可以在227位氨基酸残基上进行。所述结合物可以包括SEE氨基酸序列(SEQ ID NO：ID NO：7)以及下列其他取代：R20G，N21T，S24G，R27K，K79E，K81E，K83S，K84S和D227S，或以下取代：R20G，N21T，S24G，R27K，K79E，K81E，K83S，K84S和D227A。另外，所述结合物具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

附图说明

以下附图构成了本说明书的一部分，并且被用于对本发明的某些方面作进一步说明。通过参考一个或多个附图并结合本文所提供的具体实施方案的详细说明，可以更好地理解本发明。

图1表示由人抗SEA识别的肽片段，所述肽片段是从由抗SEA柱上洗脱的SEA/E-18的胃蛋白酶消化物中鉴定的。在用与质谱仪(MS)结合的反相HPLC纯化所述片段之前和之后鉴定所述片段。在亲和纯化之前和之后，在相同的驻留时间出现在消化物中的片段被认为是阳性的。

图2是被鉴定的七种不同的肽，以线条形式显示在SEA/E-120的氨基酸序列上方。浅灰色标记表示与SEA/E-18相比，SEA/E-120中的残基已被取代过。

图3是被用作构建SEA/E-18的比较计算机模型的模板的SEA，SED和SHE的结构序列比对。用黑色方框标出结构保守区。

图4是SEA，SEE，SEA/E-18和SEA/E-120的多重序列比对。以线条形式显示在所述比对上方的是5个不同的区A-E，其中，包括SEA/E-120上的所有取代。

图5是重叠在SEA(1SXT，灰色)上的SEA/E-18模型(黑色)。

图6是相当于鉴定的血清反应性肽的SEA/E-18的区域。

图7是闪烁亲近测定法(SPA)，用该方法测定结合在C215FabSEA，C215FabSEA/E-18，-65，-97，-109，-110，-113或-120上的125I人抗SEA与链亲和素PVT珠上的生物素结合的抗-小鼠F(ab)2上的专一性结合。

图8A和图8B表示介导针对肿瘤的细胞毒性的能力。图8A表示通过超抗原抗体依赖型细胞毒性测定SADCC测定的细胞毒性。图8B表示超抗原介导T细胞杀伤II类MHC表达细胞的效率，它会导致系统细胞毒性，这种毒性可能导致以超抗原依赖型细胞毒性测定SDCC形式衡量的副作用。所有新的嵌合体都使它在SDCC方面的作用降低了至少一个对数值，对于C215FabSEA/E-120来说，可以高达3个对数值。

图9是SEA/E-120模型的条形图。残基G20，T21，G24和K27的侧链是用灰色标记的，残基S34，S39，S40，E41，K42，A44，T49，T74，A75，S78，E79，E81，S83和S84的侧链是用灰色标记的，残基T217，S220，T222，S223，S225的侧链是用黑色标记的，而残基S227的侧链是用浅灰色标记的。

图10是5T4FabSEA/E-120的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)，它具有来自鼠5T4抗体的可变区，和来自鼠C242抗体的恒定区。1-458号位置是A链，而459-672号位置是B链。

发明详述

本领域技术人员可以理解的是，在不超出本发明范围和构思的前提下，可以对本申请所披露的发明提出各种实施方案和改进。

在本说明书中“一个/一种(a或an)”可以表示一个/一种(one)或多个/多种。在本文的权利要求书中，当它与词语“包括/含有(comprising)”组合使用时，词语“一个/一种(a或an)”可以表示一个/一种(one)或一个/一种以上。在本文中，“另一个/另一种”可以表示至少第二个/种或更多个/种。

本文所使用的术语“抗体”，表示免疫球蛋白分子，它能够专一性结合在抗原的特殊表位上。在本文中，抗体意在广义地表示任何免疫学结合制剂，如IgG，IgM，IgA，IgD和IgE。抗体可以是来自天然来源或来自重组来源的完整的免疫球蛋白，并且，可以是完整免疫球蛋白的免疫活性部分。本发明的抗体能够以多种形式存在，例如，包括多克隆抗体，单克隆抗体，Fv，Fab和F(ab)₂，以及单链抗体和人源化抗体(Harlow等，1988；Bird等，1988)。

本文所使用的术语“抗原”被定义为能引起免疫反应的分子。所述免疫反应可能包括抗体产生，专一性免疫学感受态细胞的激活，或同时包括这两者。抗原可以来自有机体，蛋白/抗原的亚基，灭活的或失活的完整细胞或裂解物。因此，技术人员可以理解的是，任何大分子，实际上包括所有蛋白都可以用作抗原。另外，抗原可以来自重组DNA。

本文所使用的术语“癌”被定义为增生性疾病或恶性瘤(肿瘤)。其例子包括，但不局限于乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌，宫颈癌，皮肤癌，胰腺癌，结肠直肠癌和肺癌。

本文所使用的术语“结合物”被定义为与抗体或抗体片段融合或结合的超抗原或超抗原变体的融合蛋白。

本文所使用的术语“免疫原性的”或“免疫原性”被定义为能引起免疫反应的物质或分子。

本文所使用的术语“主要组织相容性复合物”或“MHC”被定义为特殊的基因类型，其中的很多基因编码参与抗原呈递的、在进化上相关的细胞表面蛋白，这些蛋白是组织相容性的最重要的决定子。I类MHC或MHC-I主要在对CD8T淋巴细胞的抗原呈递中起作用。II类MHC或MHC-II，主要在对CD4T淋巴细胞的抗原呈递中起作用。

本文所使用的术语“血清反应性的”或“血清反应”被定义为由于血清的作用而导致的反应或作用。本领域技术人员可以理解的是，患者或动物的血清含有针对多种抗原或分子的中和抗体或预先形成的抗体或内源抗体。因此，血清反应性涉及血清中中和抗体的反应。

本文所使用的术语“超抗原”被定义为一种类型的分子，这种分子能够通过与II类MHC分子和T细胞受体的Vβ结构域结合刺激T细胞亚型，刺激表达特定VβV基因片段的T细胞的激活。

本文所使用的术语“T细胞受体”被定义为由通过二硫键连接的高度可变的α或β链的杂合双体组成的受体，它是以与不可变的CD3链的复合物形式在细胞膜上表达的。具有这种类型受体的T细胞通常被称为α：βT细胞。由可变的γ和δ链组成的另一种受体是在一亚类T细胞上表达的CD3。

本文所使用的术语“治疗有效的”被定义为能有效治疗疾病或症状的药用组合物的用量。

本文所使用的术语“变体”表示分别不同于参考蛋白或肽的蛋白或肽。在本说明书的下文和其他地方，将对这种含义的变体作更详细地说明。例如，变体核酸序列上的变化可以是沉默的，即这种变化可能不会改变由所述核酸序列所编码的氨基酸。当改变被局限于这种类型的沉默变化时，一种变体将编码具有与参考肽相同的氨基酸序列的肽。所述变体的核酸序列的变化，可以改变由所述参考核酸序列所编码的肽的氨基酸序列。所述核酸序列变化可能导致在由所述参考序列编码的肽上的氨基酸取代、添加、缺失、融合或截短，正如下文所披露的。一般，氨基酸序列的差异是有限的，因此，参照物和变体的序列总体上是非常相似的，并且，在很多区域是相同的。变体和参考肽在氨基酸序列上的差别可能是一个或多个取代、添加、缺失、融合或截短，上述变化能够以任何组合形式出现。变体还可以是本发明肽的片段，该片段与参考肽序列的差别是比参考序列短，如具有末端或内部缺失。本发明肽的另一种变体还包括基本上保留了所述肽的相同的功能或活性的肽。变体还可以是(i)其中的一个或多个氨基酸残基被保守性或非保守性氨基酸残基所取代的肽，并且所述取代的氨基酸残基可能是或不是由遗传密码所编码的氨基酸残基，或(ii)其中的一个或多个氨基酸残基包括一个取代基团的肽，或(iii)其中的成熟肽与另一种化合物融合的肽，如能延长所述肽的半寿期的化合物(例如，聚乙二醇)，或(iv)有其他氨基酸与所述成熟肽融合的肽，如前导或分类序列或被用于纯化成熟肽的序列。变体可以通过诱变技术制备，包括应用于核酸、氨基酸、细胞或有机体的诱变技术，或者通过重组方法制备。上文所定义的所有变体，都被视为属于本领域技术人员通过本文的介绍和现有技术中可以得出的范围。

本文所使用的术语“生物学活性”表示一种特定分子的内在特征，例如，某些细胞的激活或与某些受体的结合。本文所使用的定义主要是定性的而不是定量性质的。

I.超抗原的修饰

本发明涉及通过减弱其血清反应性对超抗原进行修饰，以便降低它的免疫原性。本领域技术人员可以理解的是，血清反应性表示分子或抗原与血清中中和抗体的反应。具体地说，本发明涉及包括细菌超抗原和抗体部分的结合物，其中，所述超抗原是包括A-E区的低效价超抗原，A区是TCR结合位点，而B-E区决定与II类MHC分子的结合；并且，所述超抗原的氨基酸序列是取代过的，使得在A区上有不超过15个氨基酸残基被不同的氨基酸所取代，这样，与它所来源的超抗原相比，取代过的超抗原具有减弱了的血清反应性；并且，其中，所述抗体部分是完整长度的抗体或任何其他分子结合抗体活性片段，所述抗体部分是针对癌相关细胞表面结构的。

A.超抗原

可用于本发明中的细菌超抗原包括，但不局限于葡萄球菌肠毒素(SE)，酿脓链球菌外毒素(SPE)，金黄色葡萄球菌中毒性休克相关毒素(TSST-1)，促有丝分裂链球菌外毒素(SME)和链球菌超抗原(SSA)。本领域技术人员可以理解的是，上面所列举的超抗原的三维结构可以从蛋白数据库(PDB，www.rcsb.org)。另外，本领域技术人员可以从GenBank获得上面所列举的超抗原的核酸序列和氨基酸序列(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/GenbankSearch.html)。

在具体实施方案中，所述超抗原是低效价超抗原。本领域技术人员已知并且理解的是，人类血清通常含有高效价的抗超抗原的抗体。例如，对于葡萄球菌超抗原来说，相对效价为：TSST-1＞SEB＞SEC-1＞SEC2＞SEA＞SED＞SEE。本领域技术人员可以理解的是，所述相对效价表示免疫原性问题和与血清反应性相关的问题或与中和抗体相关的问题。因此，本发明涉及使用诸如SEA或SEE的低效价超抗原，避免经肠胃外途径施用超抗原的血清反应性。

另外，明确已知和理解的是，超抗原或葡萄球菌肠毒素的蛋白序列和免疫学交叉反应性被划分成两种相关的类型。一种类型包括SEA，SEE，SED和SHE。第二种类型是SPEA，SEC，SEB和SSA。因此，本发明还涉及使用低效价超抗原的用途，以便减轻或消除本发明采用高效价或内源抗葡萄球菌肠毒素的抗体时所出现的交叉反应性。

B.超抗原的变体

超抗原蛋白的氨基酸序列变体可以是取代、插入或缺失的。所述变体可以按照已知方法纯化(例如，硫酸铵)，HPLC，离子交换层析(包括免疫亲和层析)或各种大小分离(沉降，凝胶电泳，凝胶过滤)。

取代(substitutional)变体或替代(replacement)变体通常包括在所述蛋白上的一个或多个位点上进行的一个氨基酸对另一个氨基酸的交换。取代可以是保守性的，就是说，一种氨基酸被具有类似形状和电荷的另一种氨基酸所取代。保守性取代在本领域中是众所周知的，并且包括，例如，以下变化：丙氨酸至丝氨酸；精氨酸至赖氨酸；天冬酰胺至谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸至谷氨酸；半胱氨酸至丝氨酸；谷氨酰胺至天冬酰胺；谷氨酸至天冬氨酸；甘氨酸至脯氨酸；组氨酸至天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸至亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸至缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸至精氨酸；甲硫氨酸至亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸至酪氨酸，亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸至苏氨酸；苏氨酸至丝氨酸；色氨酸至酪氨酸；酪氨酸至色氨酸或苯丙氨酸；和缬氨酸至异亮氨酸或亮氨酸。

因此，本发明人认为，可以对基因的DNA序列进行各种改变而又不会明显丧失所述蛋白的生物学用途或活性，正如下文所讨论的。所述活性是对T细胞反应的诱导，导致了对肿瘤细胞的细胞毒性。另外，所述超抗原对II类MHC分子的亲和力降低了，而对超抗原细胞毒性的影响很小。

在产生上述变化时，可以考虑氨基酸的亲水性指数。亲水性氨基酸指数在赋予一种蛋白的相互作用生物学功能方面的重要性为本领域所普遍理解(Kyte和Doolittle，1982)。人们认为，氨基酸的相对亲水性特征决定了所得到的蛋白的二级结构，而二级结构反过来又确定了所述蛋白与其他分子的相互作用，例如，与酶，底物，受体，DNA，抗体，和抗原等的相互作用。

已根据其疏水性和电荷特征，为每一种氨基酸确定了一个亲水性指数(Kyte和Doolittle，1982)，它们是异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。

本领域已知的是，某些氨基酸可以被具有类似亲水性指数或得分，并且仍然能产生具有类似生物学活性的蛋白，即仍然能获得生物学功能等同蛋白的其他氨基酸所取代。在产生上述变化时，优选其亲水指数在±2范围内的氨基酸取代，特别优选在±1范围内的氨基酸取代，更优选在±0.5范围内的氨基酸取代。

本领域可以理解的是，类似氨基酸的取代能够以亲水性为基础有效进行。被引入本文作为参考的美国专利4,554,101指出，由相邻氨基酸的亲水性决定的蛋白的最大局部平均亲水性与该蛋白的生物学特性相关。正如在美国专利4,554,101中所详细披露的，为氨基酸残基规定了以下亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。

可以理解的是，一种氨基酸可以取代具有类似亲水性值的另一种氨基酸，并且仍然能获得生物学等同的和免疫学等同的蛋白。在上述变化中，优选其亲水性值在±2范围内的氨基酸取代，特别优选±1范围内的氨基酸取代，更优选±0.5范围内的氨基酸取代。

C.融合蛋白

一种特殊类型的插入变体是融合蛋白。这种分子通常具有天然分子的所有或主要部分，在它的N-或C-末端与第二种肽的全部或一部分连接。例如，本发明的融合蛋白包括诸如抗体片段的免疫学活性结构域，以靶向特定的肿瘤细胞。

另外，在融合结合点上或靠近该结合点处包括一个裂解位点，将有利于在纯化之后除去外源多肽。其他有用的融合包括诸如来自酶的活性位点的功能结构域，糖基化结构域，其他细胞导向信号或跨膜区的连接。

D.结构域转变

可以通过取代各种蛋白的同源片段产生一系列感兴趣的变体。在某些场合下，这种改变被称为“结构域”转变。

结构域转变包括使用不同的，不过，在这种情况下，是使用相关的多肽制备嵌合分子。通过比较各种SAg蛋白，人们可以预测所述分子在功能上重要的区。然后就可以改变所述分子上的相关的结构域，以便确定所述区对SAg功能的重要性。所述分子可能具有其他价值，即这种“嵌合体”可能有别于天然分子，但可以提供相同的功能。

E.蛋白的纯化

需要纯化SAg或它的变体。蛋白纯化技术为本领域技术人员所熟知。在一种水平上，所述技术包括细胞背景与肽和非肽级份的初步分离。在所述蛋白与其他蛋白分离之后，可以通过层析和电泳技术，对感兴趣的蛋白作进一步的纯化，以便实现部分或完全纯化(或纯化至同质)。特别适合制备纯的肽的分析方法是离子交换层析，排阻层析；聚丙烯酰胺凝胶电泳；等电点聚焦。纯化肽的特别有效的方法是快速蛋白液相层析或甚至是HPLC。

本发明的某些方面涉及纯化，并且在特定实施方案中，涉及编码蛋白或肽的大体纯化。本文所使用的术语“纯化的蛋白或肽”意在表示可以从其他成分中分离的组合物，其中，所述蛋白或肽相对其天然可获得的状态纯化到任何程度。因此，纯化的蛋白或肽还表示离开了其天然存在环境的蛋白或肽。

一般，“纯化的”表示已进行过分离以便除去各种其他成分的蛋白或肽组合物，并且，所述组合物基本上保留了其表达的生物学活性。在使用术语“半纯化的”时，该定义表示一种组合物，其中，所述蛋白或肽构成了该组合物的主要成分，如占该组合物蛋白的大约50％，大约60％，大约70％，大约80％，大约90％，大约95％或更高。

通过阅读本说明书，本领域技术人员可以了解用于对蛋白或肽的纯化程度进行定量的各种方法。例如，所述方法包括测定一种活性级份的活性，或通过SDS/PAGE分析，评估一种级份中的多肽含量。一种用于评估级份纯度的优选方法是计算所述级份的比活性，并将该比活性与原始提取物的比活性进行比较，并由此计算出纯度，在本文中通过“-纯化倍数”评估。当然，用于表示活性量的实际单位取决于被选择用于跟踪其纯化的特定测定技术，以及所表达的蛋白或肽是否具有可检测的活性。

适用于蛋白纯化的各种技术为本领域技术人员所熟知。例如，所述技术包括用硫酸铵沉淀，PEG，抗体等或通过加热变性，然后进行离心(层析步骤，如离子交换层析，凝胶过滤层析，反相层析，羟基磷灰石和亲和层析)等电点聚焦；凝胶电泳和上述及其他技术的复合。正如本领域所普遍公知的，人们认为进行各种纯化步骤的顺序可以改变，或者某些步骤可以省略，并仍然能获得适合制备基本上纯化的蛋白或肽的方法。

众所周知的是，采用不同的SDS/PAGE条件，多肽的迁移率可以改变，有时候是显著改变(Capaldi等，1977)。因此，可以理解的是，在不同的电泳条件下，纯化的或部分纯化的表达产物的表观分子量可能不同。

高效液相层析(HPLC)的特征是能以卓越的峰分辨率非常快速的分离。这一目的是通过使用非常小的颗粒和高压来保持适当的流速而实现的。分离可以通过数分钟时间完成，或者至多用1小时完成。另外，仅需要很小体积的样品，因为，所述颗粒是如此之小，并且是紧密填充的，空隙体积只占床体积的非常小的比例。另外，样品浓度不必太大，因为带是如此狭窄，对样品的稀释作用非常有限。

凝胶层析或分子筛层析是一种特殊类型的以分子大小为基础的分配层析。支持凝胶层析的理论，是用包括小孔的惰性物质的细小颗粒制备的数，在分子通过或绕过所述孔时根据分子的大小可以将较大的分子从较小的分子中分离。只要用于制备所述颗粒的材料不吸收所述分子，决定流速的唯一因素就是其大小。因此，只要其形状是相对稳定的，所述分子就是按逐渐缩小的尺寸从所述柱上洗脱的。凝胶层析在用于分离具有不同大小的分子时是非常卓越的，因为分离不取决于诸如pH，离子强度，温度等的所有其他因素。另外，实际上不存在吸收，具有较小的扩散区，并且洗脱体积仅与分子量相关。

亲和层析是取决于要分离的物质与能够专一性与之结合的分子之间的比亲和力的层析方法。这是一种受体-配体类型的相互作用。所述柱材料是通过结合配偶体之一与不溶性基质的共价结合而合成的。然后，所述柱材料能够从溶液中专一性地吸收所述物质。洗脱是通过将条件改变成不能发生结合的条件而完成的(如pH，离子强度，温度等)。

F.变体的诱变

本发明预期，改变超抗原对II类MHC分子的亲和力，可以减弱所述超抗原的毒性。因此，减弱了的对MHC II型分子的亲和力导致了减弱了的血清反应性或减弱了的与中和抗体或内源或预先形成的抗体之间的血清反应。

在具体实施方案中，可以通过诱变修饰超抗原的决定与II类MHC分子结合的部分。诱变可以通过多种标准的诱变方法进行。突变是在有机体中以数量或结构形式发生的变化过程。突变可能涉及单一基因、基因模块或整个染色体的核苷酸序列的修饰。单一基因的改变可能是点突变的结果，这种突变涉及在DNA序列上的单一核苷酸碱基、添加或取代，或者它们可能是包括大量核苷酸的插入或缺失的改变的结果。

一种特别有用的诱变技术是丙氨酸扫描诱变，其中，用氨基酸——丙氨酸分别取代大量的残基，以便可以测定失去侧链相互作用的影响，同时降低了蛋白构像大规模微扰的危险(Cunningham等，1989)。

近年来，已开发出了利用少量蛋白评估配体结合的平衡常数的技术(美国专利5,221,605和5,238,808)。利用少量材料进行功能测定的能力可以被用于开发用于抗体饱和诱变的高效、体外方法。本发明人通过将PCR诱变与体外转录/翻译组合在一起进行蛋白突变体的高处理量制备，绕过了克隆步骤。在这里，PCR产物被直接用作突变体单链抗体的体外转录/翻译的模板。由于它的高效率，可以用这种方法产生所有十九种氨基酸取代，并进行分析，现在可以对感兴趣的多种残基进行饱和诱变，这种方法可以被称为体外扫描饱和诱变(Burks等，1997)。

体外扫描饱和诱变提供了一种用于获取大量结构信息的快速方法：(i)鉴定能调节配体结合专一性的残基，(ii)根据能保留活性的氨基酸和能在特定位点上破坏活性的氨基酸的鉴定，更好地理解配体结合，(iii)评估活性位点或蛋白亚结构域的总体可塑性，(iv)鉴定能导致增强结合的氨基酸取代。

结构-导向位点专一性诱变是一种用于蛋白-配体相互作用的解剖和工程的有效工具(Wells，1996，Braisted等，1996)。该技术通过将一个或多个核苷酸序列变化导入特定的DNA，提供了对序列变体的制备和检测。

位点专一性诱变使用编码所需突变的DNA序列的特殊寡核苷酸序列，以及足够数量的相邻的、未修饰过的核苷酸。这样，引物序列就具有足够的大小和复杂性，以便能在所跨过的缺失结合点两侧形成稳定的双体。优选长度为大约17-25个核苷酸的引物，该序列接头两侧的大约5-10个残基是改变了的。

该技术通常采用一种噬菌体载体，这种载体是以单链和双链形式存在的。用于位点专一性诱变的载体，包括诸如M13噬菌体的载体。所述噬菌体载体是可以通过商业渠道获得的，并且它们的用途为本领域技术人员所普遍公知。双链质粒同样通常被用于定点诱变，它消除了将感兴趣的基因从噬菌体转移到质粒上的步骤。

一般，人们首先获得单链载体，或者将双链载体的两条链解链。在所述载体的序列上包括编码蛋白的DNA序列或遗传因子。然后，将合成制备的具有需要的突变序列的寡核苷酸引物与所述单链DNA制剂退火，在选择杂交条件时，要考虑错配程度。用诸如大肠杆菌聚合酶I的DNA聚合酶(Klenow片段)处理杂交的产物，以便完成具有突变的链的合成。因此，形成了杂合双链，其中，一条链编码原始的非突变序列，而第二条链具有需要的突变。然后将所述杂合双链载体用于转化诸如大肠杆菌细胞的合适的宿主细胞，并且筛选包括具有突变了的序列排列的重组载体的克隆。

有关蛋白的特定残基的功能作用和信息含量的综合性信息最好是通过饱和诱变获得的，其中，检查了所有19种氨基酸取代。该方法的缺陷是，多残基饱和诱变的后勤保障(logistics)是令人恐惧的(Warren等，1996，Brown等，1996；Zeng等，1996；Burton和Barbas，1994；Yelton等，1995；Jackson等，1995；Short等，1995；Wong等，1996；Hilton等，1996)。必须研究数百个，甚至可能是数千个位点专一性突变体。不过，改进的技术使得突变体的生产和快速筛选更为直接。有关“walkhrough”诱变的说明还可以参见美国专利美国专利5,798,208和5,830,650。

定点诱变的其他方法披露于美国专利5,220,007；5,284,760；5,354,670；5,366,878；5,389,514；5,635,377；和5,789,166中。

除了用上述诱变技术生产的生物学功能等同物之外，本发明者认为，还可以制备在结构上类似的化合物，以便模拟本发明超抗原或结合物的关键部分。可以被称为肽模拟物的所述化合物，能够以与本发明结合物相同的方式使用，因此，它们也是功能等同物。

Johnson等(1993)披露了能模拟蛋白二级和三级结构的因子的某些模拟物。支持肽模拟物用途的潜在合理性是，蛋白的肽主链主要是以这种方式使氨基酸侧链取向的形式存在的，能够促进分子的相互作用，如抗体和/或抗原的相互作用。因此，肽模拟物被设计成能够进行类似于天然分子的分子相互作用。

肽模拟物概念的某些成功的应用，一直集中在蛋白内的β转角的模拟物方面，已知这种模拟物是具有高度抗原性的。同样，正如本文所披露的，可以通过基于计算机的程序预测多肽内的β-转角结构。一旦确定了所述转角的组成氨基酸，就可以构建模拟物，以便获得氨基酸侧链的重要因子的类似的空间取向。

其他方法集中在将小的、含有多个二硫键蛋白用作引诱结构模板，以便生产能模拟大型蛋白的结合位点的生物学活性构像，Vita等，(1998)。某些毒素在进化方面保守的结构基序是小的(30-40个氨基酸)、稳定的，并且可以发生突变。该基序由β折叠和α螺旋组成，在其内部核心通过3个二硫键连接。

已利用环状L-五肽和D-氨基酸的肽成功地模拟了βII转角(Weisshoff等，1999)。另外，Johannesson等(1999)报导了具有反向回转诱导特性的双环三肽。

现有技术中已披露了用于制备特殊结构的方法。例如，α螺旋模拟物披露于以下美国专利中：5,446,128；5,710,245；5,840,833；和5,859,184。这种结构使得肽或蛋白的热稳定性更高，同时还增强了对蛋白水解降解作用的抗性。披露了六，七，十一，十二，十三和十四员环状结构。

例如，用于制备构像局限性β回转和β突起的方法披露于以下美国专利中：5,440,013；5,618,914；和5,670,155。β回转可以改变侧链取代基，而不改变相应的主链构像，并且具有通过标准合成方法整合到肽上的合适的末端。其他类型的模拟回转包括反向和γ回转。反向回转模拟物披露于美国专利5,475,085和5,929,237中，而γ回转模拟物披露于美国专利5,672,681和5,674,976中。

G.超抗原的表达

本发明还涉及表达载体和宿主细胞的用途。将已进行过工程改造以便包括所述结合物的核酸序列的表达载体导入或转入宿主细胞，以便生产本发明的结合物。

可以对宿主细胞进行遗传工程改造，以便整合核酸并且表达本发明的肽。可以通过磷酸钙转染，DEAE-葡聚糖介导的转染，转位，显微注射，阳离子脂类介导的转染，电穿孔，转导，摩擦加载(scrape loading)，冲击导入，感染或其他方法将核酸序列导入宿主细胞。所述方法披露于多种标准试验室手册中，如Davis，等，BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，(1986)和Sambrook，等，MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)。

合适的宿主细胞的典型例子包括细菌细胞，如链球菌，葡萄球菌，大肠杆菌，链霉菌属和枯草芽孢杆菌细胞；真菌细胞，如酵母细胞和曲霉属细胞；昆虫细胞，如果蝇属S2和夜蛾属Sf9细胞；动物细胞，如CHO，COS，HeLa，C127，3T3，BHK，293和Bowes黑素瘤细胞。

II.癌症治疗

在本发明中，将相应的超抗原与抗体或抗体片段结合，以便靶定并且破坏癌细胞。癌症的例子包括，但不局限于肺癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌、卵巢癌、胃癌、宫颈癌和前列腺癌。

在本发明的一个方面，所述癌细胞必须具有某种可被用于靶定的标记，即，不存在于其他大部分细胞上的标记。存在多种肿瘤标记，并且这些标记中的任意一种都适用于本发明含义上的靶定。本发明的具体目标包括抗体。本发明涉及到的抗体包括，但不局限于Fab片段。Fab片段的例子包括C215Fab或5T4Fab。除了Fab之外，其他常见的肿瘤标记包括癌胚抗原，前列腺专一性抗原，泌尿肿瘤相关抗原，胎儿抗原，酪氨酸酶(p97)，gp68，TAG-72，HMFG，Sialyl Lewis抗原，MucA，MucB，PLAP，雌激素受体，层粘连蛋白受体，erb B和p155。

本发明的另一方面涉及用免疫刺激分子作抗原，或者更优选与另一种抗原结合，如与诸如IL-2，IL-4，IL-12，GM-CSF，肿瘤坏死因子的细胞因子结合；与干扰素α，β，和γ结合；与F42K和其他细胞因子类似物结合；与诸如MIP-1，MIP-1β，MCP-1，RANTES，IL-8的趋化因子结合；或与诸如FLT3配体的生长因子结合。所述刺激分子可以与本发明的结合物结合，或者作为佐剂与本发明的结合物组合使用。

可用于本发明中的一种具体的细胞因子是IL2或具有与天然IL2基本上相同的生物学活性的衍生物。白介素-2(IL-2)，最初被命名为T细胞生长因子I，是T细胞增殖的高效诱导剂，并且是所有T淋巴细胞亚群的生长因子。IL-2是抗原独立型增殖因子，它能在静息细胞中诱导细胞循环周期进程，因此，可以克隆表达激活的T-淋巴细胞。由于新分离的白血细胞也能分泌IL-2，并且能对它作出反应，能够起着所述细胞的自泌生长调节剂的作用，能够使ATL恶化。IL2还能促进激活的B-细胞的增殖，不过，这种促进作用需要诸如IL4的其他因子的存在。在体外，IL2还能刺激少突胶质细胞的生长。由于它对T细胞和B-细胞的作用，IL2是免疫反应的中心调节剂。它还在抗炎反应，造血和肿瘤监督方面发挥作用。IL-2能刺激INF-γ在外周白血细胞中的合成，并且还能诱导和IL-1，TNF-α和TNF-β的分泌。除了在LAK细胞增殖方面的活性之外，杀肿瘤细胞因子分泌的诱导(淋巴因子激活的杀伤细胞)，可能是决定IL2的抗肿瘤活性的主要因素。

本发明还可应用于患有癌症或增生性疾病的患者。给所述患者施用的量是治疗有效量或能对癌症或疾病产生治疗作用的用量。所述结合物的施用可以通过肠胃外或滋养途径施用。典型的滋养途径包括，但不局限于口服、直肠、含服和面颊。典型的肠胃外途径包括，但不局限于腹膜内，静脉内，皮下，肌内，经真皮，经肿瘤，和经血管。

III.药用组合物

本发明的化合物可以单独使用或者与诸如治疗化合物的其他化合物组合使用。

适合注射使用的药物形式包括无菌水溶液和/或分散液；包括芝麻油、花生油和/或含水丙二醇的制剂；和/或用于临时制备无菌注射溶液和/或分散液的无菌粉末。在所有场合下，所述剂型必须是无菌的和/或必须是达到便于注射的程度存在的流体形式。在生产和/或储存条件下，它必须是稳定的，和/或必须是防腐的，以便能抗诸如细菌和/或真菌的微生物的污染作用。

可以用适合与诸如羟丙基纤维素的表面活性剂混合的水中制备游离碱和/或可以药用的盐形式的活性化合物的溶液。还可以用甘油，液体聚乙二醇，和/或它们的混合物，和/或在油中制备分散液。在常见的保存和/或使用条件下，所述制剂含有能抑制微生物生长的防腐剂。

本发明的结合物能够以中性和/或盐的形式制备成组合物。可以药用的盐，包括酸加成盐(与蛋白的游离氨基形成的盐)和/或与诸如盐酸和/或磷酸的无机酸和/或诸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等的有机酸形成的盐。与游离羧基形成的盐还可源于无机碱，例如钠、钾、铵、钙和/或铁的氢氧化物，和/或诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等的有机碱。有关将肽治疗剂用作活性成分的内容，可以参见以下美国专利的技术：4,608,251；4,601,903；4,599,231；4,599,230；4,596,792；和/或4,578,770，以上每一份专利都被引入本文作为参考。

所述载体还可以是溶剂和/或分散介质，例如，它含有水，乙醇，多元醇(例如，甘油，丙二醇和/或液体聚乙二醇等)，它们的合适的混合物，和/或植物油。例如，通过使用诸如卵磷脂的包衣剂，通过保持分散液的需要的粒度和/或通过使用表面活性剂可以保持适当的流动性。对微生物的抑制作用可以通过各种抗细菌和/或抗真菌制剂产生，例如，对羟基苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚，山梨酸，硫柳汞等。在很多场合下，优选添加等渗剂，例如，糖和/或氯化钠。通过在该组合物中使用能延缓吸收的制剂，例如，单硬脂酸铝和/或凝胶可以延长注射组合物的吸收时间。

无菌注射溶液是通过将活性化合物添加到合适的溶剂中，根据需要添加上面所列举的各种其他成分，然后通过过滤消毒而制备的。一般，分散液是通过将各种消毒的活性成分添加到无菌媒介物中制备的，所述媒介物含有所述碱性分散介质和/或上面所列举的需要的其他成分。对于用于制备无菌注射溶液的无菌粉末来说，优选的制备方法是真空干燥和/或冷冻干燥技术，这种技术能产生所述活性成分和任何来自前面的消毒过滤溶液的任何其他需要成分的粉末。还涉及用于直接注射的和/或高浓度溶液的制备，其中，可以使用DMSO作为溶剂，以便导致非常迅速的渗透，将高浓度的活性制剂输送到一个小的部位。

在配制时，溶液能够以与剂型兼容的形式施用和/或以治疗有效的用量施用。所述制剂可以方便地以多种剂型施用，如上文所披露的可注射的溶液形式，不过也可以采用药用释放胶囊等。

例如，为了以水溶液形式肠胃外施用，所述溶液在必要时应当是适当缓冲过的和/或首先用足够的盐水和/或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液特别适用于静脉内、肌内、皮下和/或腹膜内施用。就此而言，通过阅读本说明书，本领域技术人员可以了解可以使用的无菌含水介质。例如，可以将一个剂量溶解在1毫升等渗氯化钠溶液中和/或添加到1000毫升皮下输液中和/或在推荐的输液位点注射(例如，参见＂Remington′s Pharmaceutical Sciences＂15th Edition，1035-1038页和/或1570-1580页)。根据接受治疗的对象的条件，必须对剂量进行某些改变。负责施用的人员可以在任何情况下决定给特定受治对象施用的适当剂量。

所述活性结合物和/或制剂可以配制在治疗混合物中，以便每个剂量含有大约0.0001-1.0毫克，和/或大约0.001-0.1毫克，和/或大约0.1-1.0和/或甚至大约10毫克。还可以使用多个剂量。

除了为了肠胃外施用，如静脉内、关节内和/或肌内注射而配制的化合物之外，其他可以药用的形式可以包括，例如片剂和/或其他用于口服的固体；脂质体制剂；定时释放胶囊；和/或目前使用的任何其他形式，包括乳酪。

在本发明中，人们还可以使用鼻腔溶液和/或喷雾剂，气溶胶和/或吸入剂。鼻腔溶液是为了通过鼻腔通道以液滴和/或喷雾形式施用而设计的水溶液。鼻腔溶液是这样制备的，使它们在很多方面类似于鼻腔分泌液，以便保持正常的纤毛(ciliary)作用。因此，含水的鼻腔溶液通常是等渗的和/或略微缓冲过的，以便将pH保持在5.5-6.5。另外，如果必要的话，在该制剂中可以添加类似于在眼部制剂中使用的抗微生物防腐剂，和/或合适的药物稳定剂。各种商业化鼻腔制剂是已知的和/或包括，例如，抗生素和/或抗组胺和/或被用于哮喘的预防。

适用于其他施用方式的其他制剂包括阴道栓剂和/或阴道用药。还可以使用直肠用药和/或栓剂。栓剂是具有各种重量和/或形状的固体剂型，通常是含有药物的，以便插入直肠、阴道和/或尿道。在插入之后，栓剂会软化，熔化和/或溶解在腔液中。一般，对于栓剂来说，可以使用传统的粘接剂和/或载体，例如，聚亚烷基二醇和/或甘油三酯；所述栓剂可以用含有0.5％-10％，优选1％-2％的活性成分的混合物制成。

口服制剂包括所述常用的赋形剂，例如，药用级的甘露糖醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，纤维素，碳酸镁等。所述组合物可以采用溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂和/或粉末形式。在某些特定实施方案中，口服组合物可以含有惰性稀释剂和/或可同化的食用载体，和/或可以将它们包装在硬和/或软的外壳状凝胶胶囊中，和/或可以将它们压缩成片剂，和/或将它们直接掺入饮用食品中。对于口腔治疗施用来说，所述活性化合物可以与赋形剂结合和/或以可摄入的片剂、面颊片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、薄片等形式使用。所述组合物和/或制剂应当含有至少0.1％的活性化合物。当然，所述组合物和/或制剂的百分比可以改变和/或通常占单位剂量重量的大约2-大约75％，和/或优选25-60％。所述治疗用途的组合物中活性化合物的用量是这样的，以便可以获得合适的剂量。

片剂、锭剂、丸剂、胶囊等还可以含有以下成分：粘接剂，如黄蓍胶，合欢胶，玉米淀粉，和/或凝胶；赋形剂，如磷酸钙；崩解剂，如玉米淀粉，马铃薯淀粉，藻酸等。润滑剂，如硬脂酸镁；和/或增甜剂，如蔗糖，乳糖和/或糖精，和/或芳香剂，如薄荷，白珠树油，和/或樱桃芳香剂。当所述剂量单位形式是胶囊时，除了上述类型的材料之外，它可以含有液体载体。各种其他材料可以作为包衣剂存在和/或以其他形式修饰所述剂量单位的物理形态。例如，可以用虫胶，糖和/或这两者对胶囊进行包衣。酏剂糖浆可以含有活性化合物蔗糖作为甜味剂，甲基和/或丙基对羟基苯甲酸酯作为防腐剂，染料和/或芳香剂，如樱桃和/或橙香精。

在某些实施方案中，可以利用液体制剂和/或纳米胶囊(nanocapsules)将结合物和/或制剂和/或基因治疗载体，包括野生型和/或反义载体导入宿主细胞。

纳米胶囊通常能以稳定和/或可再现的方式保持化合物。为了避免由于细胞内聚合物超载所导致的副作用，应当使用能够在体内分解的聚合物设计超细颗粒(大小为0.1微米)。满足上述要求的生物可降解的聚烷基氰基丙烯酸纳米颗粒可用于本发明，和/或所述颗粒可以方便地制备。

在本发明的一个实施方案中，所述结合物可以与一种液体结合。与液体结合的结合物可以胶囊化于脂质体的含水的内部，分布在脂质体的脂双层内，通过同时与脂质体和寡核苷酸结合的连接分子连接在脂质体上，限制在脂质体内，与脂质体配合，分散在含有一种液体的溶液中，与液体混合，与液体组合，作为悬浮液包含在一种液体中，含有微胶团或与微胶团复合，或以其他方式与液体结合。本发明的所述液体或液体/结合物结合的组合物，并不局限于任何特定结构的溶液。例如，它们能够作为微胶团存在于双层结构中，或具有收缩的结构。它们还可以简单地分散在溶液中，有可能形成聚集物，这些聚集物在大小或形状方面都不一致。

脂类是脂肪物质，它可以是天然存在的或合成的脂类。例如，脂类包括天然存在于细胞质中的脂肪液滴，以及为本领域技术人员所熟知的类型的化合物，它们含有长链脂族烃及其衍生物，如脂肪酸、醇、胺、氨基醇、和醛。

可以将磷脂用于制备本发明的脂质体，并且可以带有正电荷、负电荷和中性电荷。可以利用磷酸二乙酯赋予脂质体负电荷，并且可以利用硬脂酰胺赋予脂质体正电荷。脂质体可以由一种或多种磷脂组成。

带中性电荷的脂类可以包括不带电荷的脂类，基本上不带电荷的脂类，或相等数量的电正电荷和带负电荷的脂类的混合物。合适的磷脂包括磷脂酰胆碱以及其他为本领域技术人员所熟知的磷脂。

适用于本发明的脂类可以从商业来源获得。例如，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(“DMPC”)可以从Sigma公司获得，磷酸二鲸蜡酯(＂DCP＂)是从K&K实验室获得的(Plainview，NY)；胆甾醇(＂Chol＂)是从CalbiochemBehring获得的；二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(＂DMPG＂)和其他脂类可以从Avanti Polar Lipids公司(Birmingham，Ala.)获得。用氯仿或氯仿/甲醇配制的脂类乳液，可以在大约-20℃下保存。优选仅将氯仿用作溶剂，因为它比甲醇更容易挥发。

来自天然来源的磷脂，如卵或大豆磷脂酰胆碱，大脑磷脂酸，大脑或植物磷脂酰肌醇，心脏心磷脂和植物或细菌磷脂酰乙醇胺优选不被用作主要磷脂，即占总的磷脂组成的50％或更高，因为所得到的脂质体不稳定，并且具有渗漏性。

当磷脂分散在水中时，根据脂与水的摩尔比，能形成除了脂质体以外的多种结构。在低比例条件下，脂质体是优选的结构。脂质体的物理特征取决于pH，离子强度和/或二价阳离子的存在。脂质体可以表现出与离子和/或极性物质的低的可渗透性，不过，在较高温度下，会发生相转变，这种转变会明显改变其可渗透性。所述相转变包括从被称为凝胶状态的紧密堆积的、有序的结构向被称为流体状态的疏松堆积的、有序程度较低的结构的转变。这一过程发生在特有的相转变温度下和/或导致对离子、糖和/或药物的可渗透性的提高。

脂质体通过四种不同的机制与细胞相互作用：诸如巨噬细胞和/或嗜中性粒细胞的网状内皮细胞系统的吞噬细胞的胞吞作用；通过非专一性弱疏水性和/或静电力吸附在细胞表面上，和/或通过与细胞表面成分的专一性相互作用吸附在细胞表面上；通过将脂质体的脂双层插入血浆膜上与血浆细胞膜融合，同时将脂质体的内含物释放到细胞质中；和/或将脂质体脂类转移到细胞和/或亚细胞膜上，和/或相反，而不会与脂质体成分有任何联系。改变脂质体配方，可以改变工作机制，不过，可以同时通过一种以上机制工作。

脂质体介导的寡核苷酸输送和外源DNA在体外的表达已非常成功。Wong等(1980)证实了脂质体介导的输送和外源DNA在培养的鸡胚胎、HeLa和肝癌细胞中表达的可能性。Nicolau等(1987)通过静脉内注射，在大鼠体内成功地实现了脂质体的转移。

在本发明的某些实施方案中，所述脂类可以与血凝病毒(HVJ)结合。已证实这一过程能促进与细胞膜的融合，并且促进脂质体胶囊化的DNA进入细胞(Kaneda等，1989)。在其他实施方案中，所述脂类可以是复合的，或者用于与核非组蛋白染色体蛋白(HMG-1)结合(Kato等，1991)。在其他实施方案中，所述脂类可以是配合的或者与HVJ和HMG-1组合使用。就是说，所述表达载体已成功地用于寡核苷酸在体外和体内的转移和表达，然后可将其用于本发明。当在所述DNA构建体使用细菌启动子时，它还可能需要在所述脂质体内包括合适的细菌聚合酶。

用于本发明的脂质体可以通过不同方法制备。脂质体的大小根据合成方法而改变。悬浮在水溶液中的脂质体通常是球形小泡形状的，具有脂肪双层分子的一个或多个同心层。每一层包括通过结构式XY表示的分子的平行排列，其中，X是亲水性部分，而Y是疏水性部分。在含水悬浮液中，所述同心层是这样排列的，以便所述亲水性部分倾向于保持与水相接触，而疏水性区倾向于自我结合。例如，当水相存在于脂质体内和没有脂质体时，所述脂类分子可以形成具有XY-YX排列的被称为片层的双层。当一种以上脂类分子的亲水性和疏水性部分彼此结合时，可以形成脂类的聚集物。所述聚集物的大小和形状取决于很多不同的变量，如所述溶剂的性质和其他化合物在溶液中的存在。

本发明范围内的脂质体可以按照已知的实验室技术制备。在一种优选实施方案中，脂质体是通过在诸如玻璃杯、梨形烧瓶的容器中，在溶剂中混合脂质体脂类而制备的。所述容器的体积应当比预期的脂质体悬浮液的体积大10倍。使用旋转蒸发器，在大约40℃的温度下，在负压条件下除去溶剂。溶剂通常是在大约5分钟-2小时内除去的，这取决于所需要的脂质体的体积。在真空条件下，在干燥器中对所述组合物进行进一步干燥。干燥的脂类通常在大约1周之后扔掉，因为随着时间的推移很有可能变质。

可以在用无菌的、无热源的水中制备的大约25-50mM磷脂中，通过摇晃直到所有脂类薄膜被重新悬浮对干燥的脂类进行水合。然后可以将含水的脂质体分成等分样品，分别装入小瓶中冷冻干燥，并且在真空条件下密封。另外，脂质体还可以按照其他已知实验室方法制备：Bangham等(1965)的方法，该文献的内容被引入本文作为参考；Gregoriadis的方法，披露于DRUG CARRIERS IN BIOLOGY AND MEDICINE，G.Gregoriadis等(1979)pp.287-341，该文献的内容被引入本文作为参考；和由Szoka和Papahadjopoulos(1978)所披露的反相蒸发方法。上述方法在滞留含水材料的能力方面以及水空间-脂类比例方面有所不同。

按上述方法制备的脂类或冷冻干燥的脂质体可以脱水，并且用抑制肽的溶液重建，并且用合适的溶剂，例如DPBS稀释到合适的浓度。然后通过斡旋搅拌器剧烈搅拌该混合物。通过以29000×g的速度离心除去未胶囊化的核酸，并且洗涤脂质体沉淀。将洗涤过的脂质体重新悬浮在适当的总磷脂浓度中，例如大约50-200mM。胶囊化的核酸的量可以按照标准方法确定。在确定胶囊化于脂质体制剂中的核酸的量之后，可以将所述脂质体稀释到合适的浓度，并且在4℃下保存待用。

含有脂质体的药用组合物通常包括无菌的、可以药用的载体或稀释剂，如水或盐水溶液。

IV.实施例

为了说明本发明的优选实施方案，提供了以下实施例。本领域技术人员可以理解的是，在下面的实施例中所披露的技术表示由本发明人所发现的技术，这些技术能有效实施本发明，因此，被认为构成了实施本发明的最佳方式。不过，本领域技术人员通过阅读本说明书可以理解，在不超出本发明的构思和前提的情况下，可以对本文所披露的具体实施方案进行多种改变，并且仍然能获得相似或类似的结果。

实施例1

体外诱变

通过基于聚合酶链式(PCR)的方法制备不同的超抗原抗体。

简单地说，PCR产物包括位于每一个末端的两个独特的限制酶位点。对于亚克隆方法来说，使用pUC19(GIBCO BRL Life Technologies，Middlesex，U.K.)，它是按照QIAprep Spin Miniprep Kit Protocol制备的(QIAGEN，Hilden，Germany)。为了有利于进一步分析，包括不影响氨基酸序列的点突变。PCR反应是用Taq DNA聚合酶和含有15mM MgCl2的合适的PCR缓冲液(Roche Molecular Biochemicals，Basel，Switzerland)在Perkin Elmer Amp PCR系统2400上进行的。用合适的限制酶裂解PCR产物和载体过夜。通过在TAE缓冲液(Sigma-Aldrich)中用含有0.5μg/ml溴化乙锭(Sigma-Aldrich，Steinheim，Germany)的1％的琼脂糖凝胶(GIBCOBRL Life Technologies)电泳，纯化所述裂解产物。将含有DNA的片段从所述凝胶上切除，并且用CONSERTTM快速凝胶提取系统(GIBCO BRLLife Technologies)提取。在室温下连接载体和插入片段(T4 DNA连接酶，Roche Molecular Biochemicals)3-4小时。按照细胞所附带的说明书将连接混合物转入大肠杆菌菌株DH5α(GIBCO BRL Life Technologies)。通过DNA测序证实阳性克隆。通过在37℃下用RsrII/HindIII将正确的序列裂解过夜，并且连接在表达载体上(Dohlsten等，1994)。将Fab的可变部分换成C215，以便适合家养动物模型。最后将所述构建体电穿孔到大肠杆菌K12菌株UL635(xyl-7，ara-14，T4R，ΔompT)中。

实施例22

人抗SEA结合区的鉴定

由人抗-SEA识别的区是从SEA或SEA和SEE具有D227A取代的嵌合变体的胃蛋白酶消化物中鉴定的。SEA/E-18以前称之为SEE/A-A(Antonsson等，1997)。

在37℃下用0.5％的胃蛋白酶，10mM HCl，150mM NaCl(w/w)培养每一种超抗原60分钟。用2M Tris-HCl pH 8.0中和所述肽混合物，并且加样到具有固定的人抗SEA的1ml HiTrap柱上(Amersham PharmaciaBiotech，Uppsala，Sweden)。将PBS，8.1mM Na₂HPO₄，1.5mM KH₂PO₄，137mM NaCl，2.7mMKCl，pH7.3用作洗涤缓冲液，并且用0.1M乙酸，pH3.0洗脱抗体结合片段。在纯化之前和之后，用和质谱仪(MS)连接的HPLC鉴定有关片段(图1)。层析是在C18柱(2×250mm)(VEDAC^TM，Hesperia，California，USA)上，使用用0.1％三氟乙酸配制的10-60％乙腈线性梯度溶液，在40℃下用30分钟时间完成的。质量测定是通过使用电子喷射MS进行的(Finnigan LCQ，Thermoquest，San Jose，California，USA)。在亲和纯化之前和之后的相同驻留时间内存在于消化物中的片段被认为是阳性的(图2)。

实施例3

分子模型化

所述嵌合超抗原SEA/E-18是基于SEE序列的，所不同的是，靠近N-末端的4个氨基酸残基来自SEA，并且在C-末端部分具有一个D227A取代(图3和图4)(Antonsson等，1997)。

简单地说，将可以从PBD获得的与SEE具有更高序列相同性的超抗原的三维结构用作模板，构建SEAE-18的同源模型，即SEA(1ESF，Shard等，1SXT，Sundstrom等1996A)，SED(Sundstrom等，1996B)和SEH(1ENF)(Hakansson等，2000)。SEA与SEE最为类似，序列相同性为80％。SED与SEE的序列相同性为60％，而SHE与SEE的序列相同性为50％。

模型构建是用INSIGHTII软件(MSI，San Diego)中的HOMOLOGY组件进行的。比较三种超抗原SEA，SED和SHE的结构，并且确定结构保守区(SCRs)(图3)。所述区通常作图于所述分子的规则的二级结构上。加载SEA/E-18的原始结构，并且缝合在来自SEA结构的SCRs上(图5)。使用与SEA协调的1SXT，所不同的是，N-末端的前9个残基，其中使用1ESF。SCRs之间的区在大多数情况下是柔性环状区，并且是由SEA和SED构成的。大部分环是由SEA构成的，以下残基除外：Gln19，Ile140，Asp141，Lys142，Ser189，Gly191，Asp200，Pro206，Asp207和Leu224，这些残基是由SED构成的。在SCRs内的某些部位表现出与SED的更高的序列相似性，因此，使用SED作为结构模板构建的(Ile37，Glu49，Asn50，Thr51，Leu52，Ser195和Thr218)(图3)。

由于SEA被用作SEA/E-18上的大多数残基的结构模板这一事实，不会出现具有重叠的侧链的问题。修复了SCRs之前和之后的剪接点。首先将取代的侧链松开，然后，能量最小化和分子动态模拟松开了SCRs内的所有侧链，使用HOMOLOGY中的标准方法。每次松开一个环状区，首先使用能量最小化的1000个步骤，然后是分子动力学的1000个步骤。首先，将这种巧妙的方法应用于所述环状侧链上，然后应用于所述环的所有原子上。所有模拟都使用100kcal/埃2力常数的CVFF力场，使用一个2fs的时间步骤。

使用INSIGHTII中的PROSTAT组件，检测最终模型上的坏区。未检测到坏区。包装好的蛋白内部与SEA相比，没有明显差别。所有残基末端处在ramachandran图的允许范围内。在比较Cα原子时，1SXT与模型的重叠得到了0.4埃的RMSD。两种结构之间的主要差别出现在β9-β10环上(残基His187-Thr193)(图5)。

新的超抗原变体的新的模型是用SEA/E-18模型作模板构建的。直接改变所述模型上的特定氨基酸残基。最有利的侧链构像是通过简单的空间位阻检索选择的，然后进行短时间的能量最小化。

实施例4

培养和纯化

C215FabSEA/E嵌合体是以融合蛋白形式在大肠杆菌K12菌株UL635中表达的，使用具有IPTG诱导的LacUV-5启动子和卡那霉素抗性基因的质粒。

简单地说，在25℃下，在振荡烧瓶中培养存在于20％甘油中的冷冻(-70℃)母液的细菌22-24小时，所述烧瓶中含有(每升)2.5g(NH₄)₂SO₄，3g KH₂PO₄，2g K₂HPO₄，0.5g柠檬酸钠，1g MgSO₄·H₂O，0.05g卡那霉素，12g葡萄糖一水合物，和1ml微量元素溶液，不过，不含Na₂MoO₄·2H₂O。将所述细胞生长到AbS₆₂₀为2-3，并且将10ml培养基用于接种1升发酵罐(Belach Bioteknik，Sweden)，起始体积为800毫升。发酵罐中的培养基含有(每升)2.5g(NH₄)₂SO₄，9g K₂HPO₄，6gK₂HPO₄，0.5g柠檬酸钠，1g MgSO₄·7H₂O，0.05g卡那霉素，23.1g葡萄糖一水合物，和1ml如上文所述的微量元素。通过25％NH₃的滴定将pH保持稳定在7.0，通气速度为1升/分钟，温度为25℃。在分批培养期间，通过将搅拌速度从400rpm调整到2000rpm将溶解的氧气保持在30％，并且在补料分批培养期间通过调节葡萄糖的补充(60％w/v)保持。当在620nm波长下的吸收值为45时，通过添加0.1mM异丙基β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导产物形成。在发酵之后，通过在-20℃下离心除去细胞，然后进行纯化。

所述纯化方法被分成三个步骤。首先将DNA从培养上清液中除去，通过溶解在0.2M NaCl，pH7.4中的0.19％聚乙烯亚胺(w/v)，使用流速为12毫升/分钟的蠕动泵。以7500×g的速度离心30分钟之后，收集上清液。

将其加样到60毫升蛋白-G Sepharose 4，速流柱(AmershamPharmacia Biotech)上，使用14毫升/分钟的流速。用PBS洗涤所述柱，并且用100mM乙酸，0.025％Tween 20，pH3.0进行洗脱。收集洗脱的产物，并且用1M NaOH将pH调整到比理论等电点低1.5个单位，过滤(0.2μm)，并且用0.025％Tween 20稀释4倍。通过离子交换层析除去降解的变体。将样品的离子强度调整到2mS/cm，并且将所使用柱是SP-Sepharose-HP，Hiload 16/10(Amersham Pharmacia Biotech)。洗脱以4.0毫升/分钟的流速进行50分钟，使用0-55％缓冲B的线性梯度，100mMNaAc，400mM NaCl，0.025％Tween 20，pH5.0，在缓冲液A中，10mMNaAc，0.025％Tween 20，pH5.0。

实施例5

血清反应性

通过闪烁亲近测定(SPA)测定超抗原变体和人抗SEA之间的反应性。

在室温下，在微量滴定板(OptiPlate，Packard Instruments)上将链亲和素包衣的PVT珠，150μg珠/孔(Amersham Pharmacia Biotech)与生物素结合的抗小鼠IgG的F(ab)2片段，3μg/mg珠一起培养30分钟。所述珠以1∶2的稀释比例与C215Fab结合的超抗原一起预培养，其中，在所述孔中的最高最终浓度为40nM。最后，将其与1nM125I结合的亲和纯化的人抗SEA抗体一起培养，通过Top-Counter(Packard Instruments)测定□-闪烁的量。

还通过酶联免疫吸附测定ELISA，测定超抗原变体的人抗SEA反应性(Cavallin等，2000)。所述结果类似于在SPA中获得的结果。

实施例6

生物学功能

通过标准4h ⁵¹Cr-释放测定，比较了诱导超抗原抗体依赖性细胞细胞毒性SADCC和超抗原依赖性细胞细胞毒性SDCC的能力。

简单地说，用于SDCC的目标是人B-细胞淋巴瘤Raji细胞，而SADCC的目标是人结肠直肠癌Colo205细胞。用⁵¹Cr标记所述细胞，并且在V型微量滴定孔中稀释到50000细胞/毫升的浓度。作为效应细胞，对于SADCC来说，将SEA反应性人T细胞系以效应细胞与靶细胞的45∶1的比例使用，而对于SDCC来说以30∶1的比例使用。对于SADCC来说，以10^-9-10^-16M的浓度添加SAg变体，而对于SADCC来说，添加的浓度为10^-7-10^-14M。收集上清液，并且通过TopCount(Packard Instruments)测定⁵¹Cr的释放。通过以下公式计算专一性细胞毒性的百分比：100×[(cpm实验释放-cpm背景释放)/cpm总释放-cpm背景释放]]。

实施例7

抗体表位的鉴定

在患者体内，预先存在的抗超抗原的抗体已经使它的临床应用复杂化，需要在治疗中调整其剂量(Alpaugh等，1998)。限制预先产生的抗体的影响的另一种方法是修饰决定T细胞受体结合的超抗原区(Antonsson等，1997)。不过，本发明通过使用遗传工程除去超抗原的抗体表位，进一步改善了超抗原的治疗潜力。

已发现，与SEA相比，SEE表现出抗体反应性的显著减弱(Antonsson等，1997)。不幸的是，通过这种减弱，在与肿瘤反应性Fab融合时的肿瘤杀伤性能也有明显减弱(Antonsson等，1997)。因此，研究了SEA和SEE的嵌合结构。在将来自SEA的相应的氨基酸导入SEE的TCR结合区的4个位点上时，获得了需要的特性。在SEE上的这些取代：Arg20Gly，Asn21Thr，Ser24Gly和Arg27Lys(A区)，产生了嵌合体SEA/E-18(图4)(Antonsson等，1997)。与SEE相比，该嵌合体的抗体反应性降低了50％以上，而保留了与SEA同样有效的细胞毒性水平。另外，为了降低超抗原和II类MHC之间的亲和力，它能减弱SDCC，并因此改善了治疗范围，SEA/E-18还包括取代Asp227Ala(Abrahmsen等，1995)。

为了进一步减弱人抗SEA识别SEA/E-18的能力，测定了所述超抗原内的抗体结合表位。用固定化的抗SEA抗体固定来自SEAwt或SEA/E-18的部分胃蛋白酶消化物的肽/片段。在纯化之后，用LC-MS确定肽序列(图1)。因此，在所述氨基酸序列上定位了与抗体识别相关的潜在部位。显然，大部分回收的肽位于已知是与II类MHC相互作用的区域周围(Abrahmsen等，1995)(图2和图6)。将基于SEA的晶体结构(Schad等，1995；Sundstrom等，1996 A)的SEA的三维结构(Schad等，1995；Sundstrom等，1996)和SEA/E-18的计算机模型(图5)用于对所鉴定的肽内的表面裸露的残基进行定位。以下残基被确定为抗体结合表位上的暴露的和潜在的候选残基：Glu34，Lys35，Glu39，Asn40，Lys41，Glu42，Asp44，Asp45，Glu49，Lys74，Asp75，Asn78，Lys79，Lys81，Lys83，Lys84，Asp173，His187，Ser189，Glu190，Gln204，Lys217，Asn220，Glu222，Asn223，His225和Asp227(表1)。

然后取代所述残基，以便减弱与抗体的结合。不断地在制备具有进一步改善的SAg变体的新的计算机模型，以便证实和比较用后者所获得的结果。具体地说，研究了侧链的影响，并且鉴定了能影响蛋白稳定性的变化。

实施例8

修饰超抗原，以减弱血清反应性

鉴定的残基的抗体结合水平最初是通过SEA/E-18中的2-6个同时取代表征的。因此，获得了以下SAg变体SEA/E-62(Lys217Thr，Asn220Ala，Glu222Thr，Asn223Ala，His225Ala)(E区)，SEA/E-63(Ser189Asp，Glu190Ala)(D区)，SEA/E-64(Glu34Lys，Lys35Glu，Glu39Lys，Asn40Ser，Lys41Glu，Glu42Lys)(B区)，SEA/E-65(Lys79Glu，Lys81Glu，Lys83Glu，Lys84Glu)(C区)，SEA/E-74(Asp44Ala，Asp45Ala，Glu49Thr)(B区)和SEA/E-75(Lys74Thr，Asp75Ala，Asn78Ser)(C区)(表1，图4)。

为了研究来自人IgG-文库的抗SEA抗体是否能够识别不同的SAg变体，开发出了闪烁亲近测定方法(SPA)。与SEA/E-18相比，修饰过的变体都具有较低的识别程度(表1)。结合能力的最明显的减弱是由在SEA/E-65上进行的取代所导致的。在SPA分析中，观察到了超过40％的减弱(图7)。不过，很多取代也能导致大肠杆菌产量水平的降低，此外，生物学活性偶然也会减弱。通过仔细研究所述取代，我们能够确定每一个变体内的决定性残基，并且将它们排除或进行修饰，以便获得更好的特征。一般，与疏水性更高的取代相比，亲水性取代能提高产量水平。

当所述变体是组合的时，如SEA/E-91包括SEA/E-63，SEA/E-65和修饰过的SEA/E-74(具有野生型Asp45)，抗体结合的减弱是协同加强的(表1)。在SPA分析中具有最突出的结果，与SEA/E-18相比，结合能力降低了将近70％的变体是SEA/E-110，它是SEA/E-63，SEA/E-75和修饰过的SEA/E-62(SEA/E-97)，SEA/E-64(SEA/E-108)，SEA/E-65(SEA/E-84)，和SEA/E-74(wt Asp45)的组合(图7，表1)。决定抗体结合能力减弱的大部分的修饰是在SEA/E-109内(Glu34Ser，Glu39Ser，Asn40Ser，Lys41Glu，Glu42Lys，Asp44Ala，Glu49Thr，Lys74Thr，Asp75Ala，Asn78Ser，Lys79Glu，Lys81Glu，Lys83Ser，Lys84Ser)，它是SEA/E-75和修饰过的SEA/E-64(SEA/E-108)，SEA/E-65(SEA/E-84)和SEA/E-74(wt Asp45)的组合。这是因为含有所述取代的超抗原变体在SPA分析中都表现出良好的减弱。

因此，与SEA/E-18相比，在SEA/E-62，SEA/64，SEA/E-65和SEA/E-74中的残基取代导致了抗体反应性20％-40％的减弱(表1)。

表1

实施例9

影响产量水平的替代

如上文所述，在超抗原表面上的某些取代导致了大肠杆菌生产水平的降低。所述取代的很多组合甚至不可能生产。因此，决定研究明显会导致产率降低的所述残基的其他修饰。能影响产率，而不减弱与抗体的结合的取代不再进一步研究。相反，使用了野生型残基。

在最初的超抗原变体中SEA/E-64上的残基Lys35，对表达水平具有负面影响。当在35号位置上使用野生型残基，同时用丝氨酸取代Glu34和Glu39时，得到了SAg变体SEA/E-108，其产率从23mg/l提高到30mg/l。不过，抗体反应性的减弱得到保持。当对SEA/E-65上的残基Lys79，Lys81，Lys83和Lys84上导入谷氨酸取代时，得到了仅为1.5mg/l的产量水平。由于与SEA/E-18相比，抗体反应性降低了43％这一事实，进行了鉴定更好的取代的努力。在产量和减弱的抗体反应性方面的最佳组合被证实为SEA/E-84，在83和84号位置上具有丝氨酸残基，而在79和81号位置上具有保留的谷氨酸(表1)。与SEA/E-18相比，产量水平提高了10倍，而抗体反应性减弱了41％(表1)。与SEA/E-18相比，产量水平提高了10倍，而抗体反应性减弱了41％(表1)。通过在SEA/E-62上的取代Lys217Thr，Asn220Ala，Glu222Thr，Asn223Ala，His225Ala和Asp227Ala同样使产量水平降低了10倍以上，达到1.0mg/l。不过，通过更换取代丝氨酸的丙氨酸，得到了SEA/E-97，获得了48mg/ml的产量水平(表1)。

有趣的是，当SEA/E-65与更多的变体，如SEA/E-63和修饰过的SEA/E-74组合时，如在SEA/E-91中那样，将低的产量水平恢复到12mg/l(表1)。另一方面，超抗原抗体SEA/E-110的表达水平仅为0.5mg/l和14mg/l，不过，当去掉取代Asp174Ala，His87Ala，Ser188Thr，Ser189Asp，Glu190Ala和Gln204TAhr时，导致SEA/E-120，SEA/E-110的产量水平提高到30mg/l(表1)。

将大量的取代导入所述超抗原，可以导致与大肠杆菌表达相关的问题。至少有三种不同的机制造成这种现象：减弱了的热动力学，受到破坏的天然折叠途径，或新导入的蛋白裂解位点。尽管本研究的目的是除去表面上的抗原表位，这些表位最有可能不会影响任何主要的结构主链，总是存在这样的可能性，即新的结构取决于除了野生型构建体以外的其他残基，以便保持其稳定性。因此，一直在制备新的计算机模型，以便预测和证实所述取代残基在新结构中的位置。这样，我们可以在早期超抗原变体中鉴定决定性残基，这些残基会导致有关问题，例如，表达水平，并且获得具有野生型残基或更好的取代的改善了的变体(表1)。

总之，为了获得更好的产量水平，应当将残基Lys83，Lys84，Asn220，Asn223，His225和Asp227取代成丝氨酸，而不是丙氨酸，另外，为了避免表达水平的降低，应当保留残基Lys35，Asp173，his187，Ser188，Ser189，Glu190和Gln204。

实施例10

评估不同Sac变体的生物学功能

因为超抗原主要是为了肿瘤治疗而设计的(Dohlsten等，1994)，重要的是要减弱新型超抗原变体上的针对肿瘤的细胞毒性的取代。因此，通过SADCC测定，测定了所有介导新的超抗原变体的这种针对肿瘤的细胞毒性的能力(图3)。另外，超抗原介导II类MHC表达细胞的T细胞杀伤的效率导致了全身性细胞毒性，这种毒性可导致通过SDCC测定的副作用(图3)。对于临床应用来说，SDCC应当尽可能地低，以便提高治疗的范围。

SAg变体的大部分临床设置具有与SEA/E-18相同水平的肿瘤专一性细胞毒性效力(表1)。具有取代Lys74Thr，Asp75Ala和Asn78Ser的SEA/E-75除外，与SEA/E-18相比它降低了10倍，以及具有取代Glu34Lys，Lys35Glu，Glu39Lys，Asn40Ser，Lys41Glu和Glu42Lys的SEA/E-64与SEA/E-18相比降低了5倍(表1)。有趣的是，在SEA/E-75上减弱的活性仅出现在该变体中，在与其他取代的组合中，例如，在SEA/E-109中，观察到了完整的活性(表1)。另外，与SEA/E-18相比，SEA/E-75的SDCC活性没有改变。因此，取代Lys74Thr，Asp75Ala和Asn78Ser，有可能干扰仅对抗体决定性细胞毒性的相互作用。

本文所披露的大部分超抗原变体没有表现出SDCC的明显减弱。与SEA/E-18相比，仅观察到了最初的变体SEA/E-62，SEA/E-63，SEA/E-64，SEA/E-65和SEA/E-74的SDCC活性的略微减弱。

所有超抗原变体含有取代过的残基Asp227Ala或Ser。已知这种取代能将对II类MHC的亲和力减弱100倍，并因此减弱SDCC活性(Abrahmsen等，1995)。不过，由于具有N-末端取代的SAg变体SEA/E-109比具有C-末端取代的SEA/E-18相比表现出的减弱比SEA/E-113的减弱低，这表明，在SEA/E-109内，已改变了对SDCC重要的，并且极有可能与II类MHC结合的其他残基(图8)。

因此，导致最大减弱的残基是SEA/E-83中的Lys79Ser和Lys81Ser，和SEA/E-74中的取代Asp45Ala。所述大部分取代位于以前已证实与II类MHC相互作用的残基周围(Abrahmsen等，1995)。

实施例11

新型超抗原变体的设计

为了设计最佳超抗原变体，对所有有利的取代进行组合，得到了优良的SEA/E-120(图4和图9)。

首先，将C-末端所有有利的修饰，即残基Asp173Ala，Ser189Thr，Glu190Ala，Lys217Thr，Asn220Ser，Glu222Thr，Asn223Ser，His225Ser和Asp227Ser，以及Gln204Thr组合在一起，形成SAg变体SEA/E-113。该变体在抗SEA反应性方面表现出预期的减弱，以及可接受的表达水平，但具有略微降低的生物学活性(表1，图7和图8A和图8B)。将N-末端的所有有利的取代，即残基Glu34Ser，Glu39Ser，Asn40Ser，Lys41Glu，Glu42Lys，Asp44Ala，Glu49T，Lys74T，Asn78Ser，Lys79Glu，Lys81Glu，Lys83Ser和Lys84Ser组装成SEA/E-109。对该超抗原变体来说，观察到的抗SEA反应性的显著降低，同时具有高水平的表达，甚至是改善了的生物学特征(表1，图7和图8A和图8B)。不过，在将两种变体SEA/E-113和SEA/E-109组合成SEA/E-110时，产量和生物学功能都显著降低(表1)。当野生型残基Ser189，Glu190和Gln204被再次用于SEA/E-115中时，生物学效力得到完全恢复(表1)，但是，产量水平仍然处在低水平上。该变体的分子模拟表明，残基Asp173，His187和Ser188对于折叠的稳定可能是重要的，并且随后会导致较高的产率。

进行了若干不同的组合，以便评估所述残基，得到了SEA/E-118和SEA/E-122(表1)。最佳产量是用在所有三个位置上都具有野生型残基的SEA/E-120获得的。与以前制备的SEA/E-21，SEA/E-74，SEA/E-97，SEA/E-108和SEA/E-109一起，它们只是一些产量水平能达到20mg/l以上的SAg变体(表1)。在不同变体之间的生物学活性或抗体反应性方面没有显著差异。

新型结合物的设计

通过遗传学方法将SEA/E-120融合在肿瘤反应性抗体5T4的Fab部分上(Dohlsten等，1994)(图10)。

5T4的抗原是在多种不同的肿瘤上表达的，如小细胞肺癌，乳腺癌，肾细胞癌，胰腺癌，卵巢癌和结肠癌。还对5T4的野生型序列进行取代，以便获得较高的产率。在重链上：His41Pro，Ser44Gly，Ile69Thr和Val113Gly，而在轻链上：Phe10Ser，Thr45Lys，Ile63Ser，Phe73Leu，Thr77Ser，Leu78Val和Leu83Ala。

尽管已对本发明的这些优点进行了详细说明，应当理解的是，在不超出有所附权利要求书所限定的构思和范围的前提下，可以进行各种改变，取代和替代。另外，本发明的范围并不是要局限于在本说明书中所披露的方法的具体实施方案、仪器、产品、组合物、方式、方法和步骤。本领域普通技术人员通过本发明的说明书可以了解现有的或以后要开发的方法、仪器、产品、组合物、方式、方法或步骤，可以发挥与本文所披露的相应实施方案相同的功能或者大体相同的结果，它们也可用于本发明中。因此，所附权利要求书的范围包括这样的方法、仪器、产品、组合物、方式、方法或步骤。

本领域普通技术人员可以理解的是，本发明能很好地实现所述目标，并且获得上面所提到的目的和优点，以及其所固有的优点。本文所披露的组合物、方法、方案和技术表示本发明的优选实施方案，并且被认为是代表性的，而不被认为是对本发明范围的限定。本领域技术人员可以想到的变化形式和其他用途属于本发明构思的范围，或者属于由所附权利要求书的范围所限定的范围。

引用的参考文献

在本说明书中所提到的所有专利和出版物，是本发明所属技术领域技术人员水平的指标。所有专利和文献在这里都以相同的程度引入本文作为参考，就如同每一份文献被专门和分别指明被引作参考文献一样。

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美国专利5,221,605

美国专利5,238,808

美国专利5,798,208

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美国专利5,220,007

美国专利5,284,760

美国专利5,354,670

美国专利5,366,878

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美国专利5,446,128

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美国专利5,840,833

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美国专利5,672,681

美国专利5,674,976

美国专利4,608,251

美国专利4,601,903

美国专利4,599,231

美国专利4,599,230

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序列表

<110>FORSBERG，GORAN

ERLANDSSON，EVA

ANTONSSON，PER

WALSE，BJORN

<120>用于人类治疗的新的工程化超抗原

<130>P02188USO；10104199

<140>TBA

<141>2001-06-20

<160>7

<170>PatentIn version 3.0

<210>1

<211>672

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>肽

<222>(1)..(672)

<223>结合蛋白

<400>1

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Leu Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Thr Met Ile Thr Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val

115 120 125

Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala

195 200 205

Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Ser Gly Gly

210 215 220

Pro Ser Glu Lys Ser Glu Glu Ile Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys

225 230 235 240

Ser Glu Leu Gln Gly Thr Ala Leu Gly Asn Leu Lys Gln Ile Tyr Tyr

245 250 255

Tyr Asn Ser Lys Ala Ile Thr Ser Ser Glu Lys Ser Ala Asp Gln Phe

260 265 270

Leu Thr Asn Thr Leu Leu Phe Lys Gly Phe Phe Thr Gly His Pro Trp

275 280 285

Tyr Asn Asp Leu Leu Val Asp Leu Gly Ser Thr Ala Ala Thr Ser Glu

290 295 300

Tyr Glu Gly Ser Ser Val Asp Leu Tyr Gly Ala Tyr Tyr Gly Tyr Gln

305 310 315 320

Cys Ala Gly Gly Thr Pro Asn Lys Thr Ala Cys Met Tyr Gly Gly Val

325 330 335

Thr Leu His Asp Asn Asn Arg Leu Thr Glu Glu Lys Lys Val Pro Ile

340 345 350

Asn Leu Trp Ile Asp Gly Lys Gln Thr Thr Val Pro Ile Asp Lys Val

355 360 365

Lys Thr Ser Lys Lys Glu Val Thr Val Gln Glu Leu Asp Leu Gln Ala

370 375 380

Arg His Tyr Leu His Gly Lys Phe Gly Leu Tyr Asn Ser Asp Ser Phe

385 390 395 400

Gly Gly Lys Val Gln Arg Gly Leu Ile Val Phe His Ser Ser Glu Gly

405 410 415

Ser Thr Val Ser Tyr Asp Leu Phe Asp Ala Gln Gly Gln Tyr Pro Asp

420 425 430

Thr Leu Leu Arg Ile Tyr Arg Asp Asn Thr Thr Ile Ser Ser Thr Ser

435 440 445

Leu Ser Ile Ser Leu Tyr Leu Tyr Thr Thr Ser Ile Val Met Thr Gln

450 455 460

Thr Pro Thr Ser Leu Leu Val Ser Ala Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr

465 470 475 480

Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Ala Trp Tyr Gln Gln

485 490 495

Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Ser Tyr Thr Ser Ser Arg

500 505 510

Tyr Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp

515 520 525

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Ala Ala Val Tyr

530 535 540

Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr

545 550 555 560

Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe

565 570 575

Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys

580 585 590

Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile

595 600 605

Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln

610 615 620

Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr

625 630 635 640

Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His

645 650 655

Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Ser

660 665 670

<210>2

<211>233

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>肽

<222>(1)..(233)<223>嵌合蛋白

<400>2

Ser Glu Lys Ser Glu Glu Ile Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys Ser

1 5 10 15

Glu Leu Gln Gly Thr Ala Leu Gly Asn Leu Lys Gln Ile Tyr Tyr Tyr

20 25 30

Asn Ser Lys Ala Ile Thr Ser Ser Glu Lys Ser Ala Asp Gln Phe Leu

35 40 45

Thr Asn Thr Leu Leu Phe Lys Gly Phe Phe Thr Gly His Pro Trp Tyr

50 55 60

Asn Asp Leu Leu Val Asp Leu Gly Ser Thr Ala Ala Thr Ser Glu Tyr

65 70 75 80

Glu Gly Ser Ser Val Asp Leu Tyr Gly Ala Tyr Tyr Gly Tyr Gln Cys

85 90 95

Ala Gly Gly Thr Pro Asn Lys Thr Ala Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr

100 105 110

Leu His Asp Asn Asn Arg Leu Thr Glu Glu Lys Lys Val Pro Ile Asn

115 120 125

Leu Trp Ile Asp Gly Lys Gln Thr Thr Val Pro Ile Asp Lys Val Lys

130 135 140

Thr Ser Lys Lys Glu Val Thr Val Gln Glu Leu Asp Leu Gln Ala Arg

145 150 155 160

His Tyr Leu His Gly Lys Phe Gly Leu Tyr Asn Ser Asp Ser Phe Gly

165 170 175

Gly Lys Val Gln Arg Gly Leu Ile Val Phe His Ser Ser Glu Gly Ser

180 185 190

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195 200 205

Leu Leu Arg Ile Tyr Arg Asp Asn Thr Thr Ile Ser Ser Thr Ser Leu

210 215 220

Ser Ile Ser Leu Tyr Leu Tyr Thr Thr

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<210>3

<211>233

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>肽

<222>(1)..(233)

<223>嵌合蛋白

<400>3

Ser Glu Lys Ser Glu Glu Ile Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys Ser

1 5 10 15

Glu Leu Gln Gly Thr Ala Leu Gly Asn Leu Lys Gln Ile Tyr Tyr Tyr

20 25 30

Asn Glu Lys Ala Ile Thr Glu Asn Lys Glu Ser Asp Asp Gln Phe Leu

35 40 45

Glu Asn Thr Leu Leu Phe Lys Gly Phe Phe Thr Gly His Pro Trp Tyr

50 55 60

Asn Asp Leu Leu Val Asp Leu Gly Ser Lys Asp Ala Thr Asn Lys Tyr

65 70 75 80

Lys Gly Lys Lys Val Asp Leu Tyr Gly Ala Tyr Tyr Gly Tyr Gln Cys

85 90 95

Ala Gly Gly Thr Pro Asn Lys Thr Ala Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr

100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

Thr Ser Lys Lys Glu Val Thr Val Gln Glu Leu Asp Leu Gln Ala Arg

145 150 155 160

His Tyr Leu His Gly Lys Phe Gly Leu Tyr Asn Ser Asp Ser Phe Gly

165 170 175

Gly Lys Val Gln Arg Gly Leu Ile Val Phe His Ser Ser Glu Gly Ser

180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

His Ile Ala Leu Tyr Leu Tyr Thr Thr

225 230

<210>4

<211>233

<212>PRT

<213>葡萄球菌

<400>4

Ser Glu Lys Ser Glu Glu Ile Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys Ser

1 5 10 15

Glu Leu Gln Gly Thr Ala Leu Gly Asn Leu Lys Gln Ile Tyr Tyr Tyr

20 25 30

Asn Glu Lys Ala Lys Thr Glu Asn Lys Glu Ser His Asp Gln Phe Leu

35 40 45

Glu His Thr Ile Leu Phe Lys Gly Phe Phe Thr Asp His Ser Trp Tyr

50 55 60

Asn Asp Leu Leu Val Asp Phe Asp Ser Lys Asp Ile Val Asp Lys Tyr

65 70 75 80

Lys Gly Lys Lys Val Asp Leu Tyr Gly Ala Tyr Tyr Gly Tyr Gln Cys

85 90 95

Ala Gly Gly Thr Pro Asn Lys Thr Ala Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr

100 105 110

Leu His Asp Asn Asn Arg Leu Thr Glu Glu Lys Lys Val Pro Ile Asn

115 120 125

Leu Trp Leu Asp Gly Lys Gln Asn Thr Val Pro Leu Glu Thr Val Lys

130 135 140

Thr Asn Lys Lys Asn Val Thr Val Gln Glu Leu Asp Leu Gln Ala Arg

145 150 155 160

Arg Tyr Leu Gln Glu Lys Tyr Asn Leu Tyr Asn Ser Asp Val Phe Asp

165 170 175

Gly Lys Val Gln Arg Gly Leu Ile Val Phe His Thr Ser Thr Glu Pro

180 185 190

Ser Val Asn Tyr Asp Leu Phe Gly Ala Gln Gly Gln Tyr Ser Asn Thr

195 200 205

Leu Leu Arg Ile Tyr Arg Asp Asn Lys Thr Ile Asn Ser Glu Asn Met

210 215 220

His Ile Asp Ile Tyr Leu Tyr Thr Ser

225 230

<210>5

<211>203

<212>PRT

<213>葡萄球菌

<400>5

Ala Leu His Lys Lys Ser Glu Leu Ser Ser Thr Ala Leu Asn Asn Met

1 5 10 15

Lys His Ser Tyr Ala Asp Ala Asn Pro Ile Ile Gly Ala Asn Lys Ser

20 25 30

Thr Gly Asp Gln Phe Leu Glu Asn Thr Leu Leu Tyr Lys Ala Phe Phe

35 40 45

Leu Leu Ile Asn Phe Asn Ser Ala Glu Met Ala Gln His Phe Lys Ser

50 55 60

Lys Asn Val Asp Val Tyr Ala Ile Arg Tyr Ala Ala Ala Cys Arg Thr

65 70 75 80

Ala Cys Thr Tyr Gly Gly Val Thr Pro His Ala Gly Asn Ala Leu Lys

85 90 95

Ala Arg Lys Lys Ile Pro Ile Asn Leu Trp Ile Ile Gly Val Gln Lys

100 105 110

Glu Val Ser Leu Asp Lys Val Gln Thr Asp Lys Lys Asn Val Thr Val

115 120 125

Gln Glu Leu Asp Ala Gln Ala Arg Arg Tyr Leu Gln Lys Asp Leu Lys

130 135 140

Leu Tyr Asn Ala Ile Gln Arg Gly Lys Leu Glu Phe Asp Ser Ala Ala

145 150 155 160

Ala Ser Lys Val Ser Tyr Asp Leu Phe Asp Val Ala Gly Asp Phe Pro

165 170 175

Glu Lys Gln Leu Arg Ile Tyr Ser Asp Asn Lys Thr Leu Ser Thr Glu

180 185 190

His Leu His Ile Asp Ile Tyr Leu Tyr Glu Ala

195 200

<210>6

<211>217

<212>PRT

<213>葡萄球菌

<400>6

Glu Asp Leu His Asp Lys Ser Glu Leu Thr Asp Leu Ala Leu Ala Asn

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Ala Tyr Gly Gln Tyr Asn His Pro Phe Ile Lys Glu Asn Ile Lys Ser

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Asp Glu Ile Ser Gly Glu Lys Asp Leu Ile Phe Arg Asn Gln Gly Asp

35 40 45

Ser Gly Asn Asp Leu Arg Val Lys Phe Ala Thr Ala Asp Leu Ala Gln

50 55 60

Lys Phe Lys Asn Lys Asn Val Asp Ile Tyr Gly Ala Ser Phe Tyr Tyr

65 70 75 80

Lys Cys Glu Lys Ile Ser Glu Asn Ile Ser Glu Cys Leu Tyr Gly Gly

85 90 95

Thr Thr Leu Asn Ser Glu Lys Leu Ala Gln Glu Arg Val Ile Gly Ala

100 105 110

Asn Val Trp Val Asp Gly Ile Gln Lys Glu Thr Glu Leu Ile Arg Thr

115 120 125

Asn Lys Lys Asn Val Thr Leu Gln Glu Leu Asp Ile Lys Ile Arg Lys

130 135 140

Ile Leu Ser Asp Lys Tyr Lys Ile Tyr Tyr Lys Asp Ser Glu Ile Ser

145 150 155 160

Lys Gly Leu Ile Glu Phe Asp Met Lys Thr Pro Arg Asp Tyr Ser Phe

165 170 175

Asp Ile Tyr Asp Leu Lys Gly Glu Asn Asp Tyr Glu Ile Asp Lys Ile

180 185 190

Tyr Glu Asp Asn Lys Thr Leu Lys Ser Asp Asp Ile Ser His Ile Asp

195 200 205

Val Asn Leu Tyr Thr Lys Lys Lys Val

210 215

<210>7

<211>233

<212>PRT

<213>葡萄球菌

<400>7

Ser Glu Lys Ser Glu Glu Ile Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys Ser

1 5 10 15

Glu Leu Gln Arg Asn Ala Leu Ser Asn Leu Arg Gln Ile Tyr Tyr Tyr

20 25 30

Asn Glu Lys Ala Ile Thr Glu Asn Lys Glu Ser Asp Asp Gln Phe Leu

35 40 45

Glu Asn Thr Leu Leu Phe Lys Gly Phe Phe Thr Gly His Pro Trp Tyr

50 55 60

Asn Asp Leu Leu Val Asp Leu Gly Ser Lys Asp Ala Thr Asn Lys Tyr

65 70 75 80

Lys Gly Lys Lys Val Asp Leu Tyr Gly Ala Tyr Tyr Gly Tyr Gln Cys

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Ala Gly Gly Thr Pro Asn Lys Thr Ala Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr

100 105 110

Leu His Asp Asn Asn Arg Leu Thr Glu Glu Lys Lys Val Pro Ile Asn

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Leu Trp Ile Asp Gly Lys Gln Thr Thr Val Pro Ile Asp Lys Val Lys

130 135 140

Thr Ser Lys Lys Glu Val Thr Val Gln Glu Leu Asp Leu Gln Ala Arg

145 150 155 160

His Tyr Leu His Gly Lys Phe Gly Leu Tyr Asn Ser Asp Ser Phe Gly

165 170 175

Gly Lys Val Gln Arg Gly Leu Ile Val Phe His Ser Ser Glu Gly Ser

180 185 190

Thr Val Ser Tyr Asp Leu Phe Asp Ala Gln Gly Gln Tyr Pro Asp Thr

195 200 205

Leu Leu Arg Ile Tyr Arg Asp Asn Lys Thr Ile Asn Ser Glu Asn Leu

210 215 220

His Ile Asp Leu Tyr Leu Tyr Thr Thr

225 230

Claims

1.一种包括细菌超抗原和抗体部分的结合物，其中，

超抗原的氨基酸序列包括A-E区，其中A区位于TCR结合位点内，并且决定与TCR的结合，而B-E区决定与II类MHC分子的结合，

超抗原的氨基酸序列被取代，使得B-E区中有一个或多个氨基酸残基被一个或多个不同的氨基酸残基所替代，这样，与它所来源的超抗原相比，取代的超抗原具有减弱了的血清反应性，

并且，其中所述抗体部分是完整长度的抗体或任何其他抗原结合抗体活性片段，所述抗体部分是针对癌相关细胞表面结构的。

2.如权利要求1的结合物，其中超抗原是葡萄球菌肠毒素(SE)，酿脓链球菌外毒素(SPE)，金黄色葡萄球菌中毒性休克综合症毒素(TSST-1)，促有丝分裂链球菌外毒素(SME)或链球菌超抗原(SSA)。

3.如权利要求2的结合物，其中超抗原是葡萄球菌肠毒素A(SEA)或E(SEE)。

4.如权利要求3的结合物，其中在SEE的C区中79，81，83和84位的氨基酸残基中的一个或多个被替代。

5.如权利要求4的结合物，其中在SEE的A区中20，21，24，27，173和204位和E区中的227位的一个或多个氨基酸残基也被替代。

6.如权利要求5的结合物，其中在SEE的B区中34，35，39，40，41，42，44，45，49位，和/或在SEE的C区中74，75，78位，和/或在SEE的D区中187，188，189，190位，和/或在SEE的E区中217，220，222，223，225位的一个或多个氨基酸残基也被替代。

7.如权利要求6的结合物，其中已将以下氨基酸残基替代导入SEE序列：R20G，N21T，S24G，R27K，K79E，K81E，K83S，K84S和D227S(或A)。

8.如权利要求6的结合物，其中超抗原具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列(SEA/E-120)。

9.如上述权利要求中任意一项的结合物，其中抗体部分是Fab片段。

10.如权利要求9的结合物，其中抗体部分是C215Fab。

11如权利要求9的结合物，其中抗体部分是5T4Fab。

12.如权利要求1的结合物，它具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

13.如上述权利要求中任意一项的结合物，它还包括细胞因子。

14.如权利要求13的结合物，其中细胞因子是白介素。

15.如权利要求14的结合物，其中白介素是IL2或它的具有基本上与天然IL2相同的生物学活性的衍生物。

16.如上述权利要求中任意一项的结合物，它用于治疗癌症。

17.如权利要求16的结合物，其中癌症选自：肺癌，乳腺癌，结肠癌，肾癌，胰腺癌，卵巢癌、胃癌、宫颈癌和前列腺癌。

18.权利要求1-15中任意一项的结合物在生产用于治疗癌症的药物中的用途。

19.如权利要求18的用途，其中药物适于静脉内施用。

20.一种药用组合物，它包括治疗有效量的权利要求1-15中任意一项的结合物作为活性成分。

21.如权利要求20的组合物，其中活性成分包括细胞因子。

22.如权利要求21的组合物，其中细胞因子是结合物的一部分。

23.如权利要求21的组合物，其中细胞因子是以非结合成分形式存在于组合制剂中的，用于同时、分别或依次用于抗癌治疗。

24.如权利要求21-23中任意一项的组合物，其中所述超抗原具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列，所述抗体部分是C215Fab，而所述细胞因子是IL2或它的基本上与天然IL2具有相同的生物学活性的衍生物。

25.如权利要求21-23中任意一项的组合物，其中所述超抗原具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列，所述抗体部分是5T4Fab，而所述细胞因子是IL2或它的基本上与天然IL2具有相同的生物学活性的衍生物。

26.一种通过激活哺乳动物的免疫系统治疗所述哺乳动物体内的癌症的方法，该方法包括给所述哺乳动物施用治疗有效量的包括超抗原和抗体部分的结合物，其中，

所述超抗原包括A-E区，A区在TCR结合位点内，并且决定与TCR的结合，C-E区决定与II类MHC分子的结合，

所述超抗原的氨基酸序列被取代，使得A-E区中任意一个中的一个或多个氨基酸残基被一个或多个不同的氨基酸残基替代，这样，与它所来源的超抗原相比，取代的超抗原具有减弱了的血清反应性，

并且，其中所述抗体部分是完整长度的抗体或任何其他的抗原结合抗体活性片段，所述抗体部分是针对癌相关细胞表面结构的。

27.如权利要求26的方法，其中超抗原是葡萄球菌肠毒素(SE)，酿脓链球菌外毒素(SPE)，金黄色葡萄球菌中毒性休克综合症毒素(TSST-1)，促有丝分裂链球菌外毒素(SME)或链球菌超抗原(SSA)。

28.如权利要求27的方法，其中超抗原是葡萄球菌肠毒素A(SEA)或E(SEE)。

29.如权利要求28的方法，其中在SEE的C区中79，81，83和84位的氨基酸残基中的一个或多个被替代。

30.如权利要求29的方法，其中在SEE的A区中20，21，24，27，173和204位和E区中227位的一个或多个氨基酸残基也被替代。

31.如权利要求30的方法，其中在SEE的B区中34，35，39，40，41，42，44，45，49位，和/或在SEE的C区中74，75，78位，和/或在SEE的D区中187，188，189，190位，和/或在SEE的E区中217，220，222，223，225位的一个或多个氨基酸残基也被替代。

32.如权利要求31的方法，其中已将以下氨基酸残基替代导入SEE序列：R20G，N21T，S24G，R27K，K79E，K81E，K83S，K84S和D227S(或A)。

33.如权利要求32的方法，其中超抗原具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列(SEA/E-120)。

34.如权利要求33的方法，其中抗体部分是Fab片段。

35.如权利要求34的方法，其中抗体部分是C215Fab。

36.如权利要求34的方法，其中抗体部分是5T4Fab。

37.如权利要求26的方法，其中结合物具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

38.如权利要求26-37中任意一项的方法，它还包括细胞因子。

39.如权利要求38的方法，其中细胞因子是白介素。

40.如权利要求39的方法，其中白介素是IL2或它的具有基本上与天然IL2相同的生物学活性的衍生物。

41.如上述权利要求中任意一项的方法，其中癌症选自：肺癌，乳腺癌，结肠癌，肾癌，胰腺癌，卵巢癌、胃癌、宫颈癌和前列腺癌。