ES2564041T3 - Un nuevo superantígeno modificado genéticamente para terapia humana - Google Patents

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Abstract

Un conjugado que comprende un superantígeno bacteriano y un resto de anticuerpo, en el que el superantígeno es la enterotoxina E estafilocócica (SEE), en el que la secuencia de aminoácidos del superantígeno comprende las regiones A a E, en el que la región A está dentro del sitio de unión al TCR y determina la unión al TCR, y las regiones B a E determinan la unión a las moléculas de MHC de clase II, en el que se han introducido los siguientes reemplazos de restos de aminoácidos dentro de la región C: K79E, K81E, K83S, K84S, y en el que se han introducido los siguientes reemplazos de restos de aminoácidos dentro de la región A: R20G, N21T, S24G, R27K, y en la que opcionalmente también los aminoácidos en la posición 173 y/o la posición 204 dentro de la región A se ha/han sustituido, y en el que se ha introducido la sustitución D227S(o A) dentro de la región E, y en el que se han sustituido uno o más de los restos de aminoácidos en las posiciones 34, 35, 39, 40, 41, 42, 44, 45 y 49 dentro de la región B y/o en las posiciones 74, 75, 78 dentro de la región C y/o las posiciones 187, 188, 189, 190 dentro de la región D y/o en la posición y/o en las posiciones 217, 220, 222, 223, 225 dentro de la región E, de forma que el superantígeno sustituido tiene una serorreactividad reducida en comparación con la del superantígeno del cual deriva, y en el que el resto de anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa o cualquier otro fragmento activo de anticuerpo de unión a antígeno, que está dirigido contra una estructura de superficie celular asociada a cáncer.

Description

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en gel de poliacrilamida; enfoque isoeléctrico. Un procedimiento particularmente eficaz de purificación de péptidos es la cromatografía líquida rápida de proteínas o incluso la HPLC.
Ciertos aspectos de la presente invención se refieren a la purificación, y en realizaciones particulares, a la purificación sustancial, de una proteína o péptido codificados. La expresión “pepticuerpo o péptido purificado”, tal como se usa en el presente documento, pretende referirse a una composición, que puede aislarse de otros componentes, en la que la proteína o péptido está purificado hasta un grado con respecto al estado en que puede obtenerse de manera natural. Por tanto, una proteína o péptido purificado también se refiere también a un péptido que está libre del entorno en el que puede producirse de manera natural.
Generalmente, “purificado” se referirá a una proteína o péptido que se ha sometido a fraccionamiento para eliminar otros diversos componentes y que conserva sustancialmente su actividad biológica expresada. Cuando se usa la expresión “sustancialmente purificada”, esta designación hará referencia a una composición en la que la proteína o péptido forma el componente principal de la composición, de modo que constituye aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 95 % o más de las proteínas en la composición.
Los expertos en la técnica conocerán diversos procedimientos para cuantificar el grado de purificación de la proteína
o péptido a la luz de la presente divulgación. Estos incluyen, por ejemplo, determinar la actividad específica de una fracción activa, o evaluar la cantidad de los polipéptidos dentro de una fracción mediante análisis de SDS/PAGE. Un procedimiento preferido para evaluar la pureza de una fracción es calcular la actividad específica de la fracción, comparar la actividad con la actividad específica del extracto inicial y, por tanto, calcular el grado de pureza, evaluado en la presente memoria descriptiva mediante un “veces el número de purificación”. Las unidades reales usadas para representar la cantidad de actividad de unión dependerán por supuesto, de la técnica de ensayo concreta elegida para seguir la purificación y si la proteína o péptido expresada exhibe o no una actividad de unión detectable.
Los expertos en la técnica conocerán bien diversas técnicas adecuadas para su uso en la purificación de proteínas. Éstas incluyen, por ejemplo, precipitación con sulfato de amonio, PEG, anticuerpos y similares o mediante desnaturalización térmica, seguida de centrifugación; etapas de cromatografía tales como cromatografía de intercambio iónico, de filtración en gel, de fase inversa, de hidroxilapatita y de afinidad; enfoque isoeléctrico; electroforesis en gel; y combinaciones de tales y otras técnicas. Tal como se conoce generalmente en la técnica, se cree que el orden de realización de las diversas etapas de purificación puede cambiarse o que ciertas etapas puedan omitirse, y todavía de como resultado un procedimiento adecuado para la preparación de una proteína o péptido sustancialmente purificado.
Se sabe que la migración de un polipéptido o polipéptido puede variar, algunas veces de manera significativa, con diferentes condiciones de SDS/PAGE (Capaldi y col., 1977). Por tanto, se apreciará que, en condiciones de electroforesis diferentes, pueden variar los pesos moleculares aparentes de los productos de expresión purificados o parcialmente purificados.
La cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) se caracteriza por una separación muy rápida con una extraordinaria resolución de los picos. Esto se consigue mediante el uso de partículas muy finas y presión alta para mantener un caudal adecuado. La separación se puede conseguir en cuestión de minutos, o como máximo de una hora. Además, solo se necesita un muy pequeño volumen de la muestra porque las partículas son tan pequeñas y están tan empaquetadas que el volumen del hueco es una fracción muy pequeña del volumen del lecho. Asimismo, la concentración necesaria de la muestra no tiene que ser muy grande porque las bandas son tan estrechas que existe muy poca dilución de la muestra.
La cromatografía en gel, o la cromatografía en tamiz molecular, es un tipo especial de cromatografía de partición que se basa en el tamaño molecular. La teoría que subyace a la cromatografía en gen es que la columna, que se prepara con partículas muy pequeñas de una sustancia inerte que contiene poros pequeños, separa las moléculas más grandes de las moléculas más pequeñas a medida que atraviesan o rodean los poros, en función de su tamaño. Siempre que el material del cual están hechas las partículas no adsorba las moléculas, el único factor que determina la velocidad del flujo es el tamaño. Por tanto, las moléculas se eluyen de la columna en tamaño decreciente, siempre que la forma sea relativamente constante. La cromatografía en gel no tiene igual para la separación de moléculas de diferente tamaño, ya que la separación es independiente de todos los demás factores, tales como el pH, la resistencia iónica, la temperatura etc. Asimismo, no hay prácticamente adsorción, menos diseminación en zona y el volumen de elución está relacionado de un modo simple con el peso molecular.
La cromatografía de afinidad es un procedimiento cromatográfico que depende de la afinidad específica entre una sustancia que se va a aislar y una molécula a la que se puede unir específicamente. Esta es una interacción de tipo receptor-ligando. El material de la columna se sintetiza acoplando de forma covalente una de las parejas de unión a una matriz insoluble. El material de la columna puede adsorber específicamente la sustancia de la solución. La elución se produce cambiando las condiciones en las que no se producirá la unión (alterar el pH, la fuerza iónica, la temperatura etc.).
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F. Mutagénesis de variantes
La presente invención contempla que la modificación de la afinidad del superantígeno para las moléculas MHC de clase II puede disminuir la toxicidad del superantígeno. Por lo tanto, la afinidad disminuida por el las moléculas de MHC de clase II da como resultado una serorreactividad disminuida o una reacción disminuida con anticuerpos neutralizantes o anticuerpos endógenos o preformados.
En realizaciones específicas se emplea la mutagénesis para modificar la región del superantígeno que determina la unión moléculas de MHC de clase II. La mutagénesis se lleva a cabo mediante diversos procedimientos mutagénicos estándar. La mutación es el proceso por el cual se producen cambios en la cantidad o la estructura de un organismo. La mutación puede implicar la modificación de la secuencia de nucleótidos de un solo gen, bloques de genes o un cromosoma entero. Los cambios en genes individuales pueden ser la consecuencia de mutaciones puntuales, que implican la eliminación, adición o sustitución de una única base nucleotídica dentro de una secuencia de ADN, o pueden ser la consecuencia de cambios que implican la inserción o supresión de un gran número de nucleótidos.
Una técnica de mutagénesis particularmente útil es la mutagénesis de barrido de alanina en la que un número de restos están sustituidos de forma individual por el aminoácido alanina de modo que se pueden determinar los efectos de la pérdida de interacciones de la cadena lateral, al tiempo que se minimiza el riesgo de perturbaciones a gran escala en la conformación de la proteína (Cunningham y col., 1989).
En los últimos años, se han desarrollado técnicas para la estimación de la constante de equilibrio para la unión al ligando usando cantidades minúsculas de proteína (Patentes de Estados Unidos 5.221.605 y 5.238.808). La capacidad de realizar ensayos funcionales con pequeñas cantidades de material puede explotarse para desarrollar metodologías in vitro altamente eficientes para la mutagénesis de saturación de los anticuerpos. Los inventores omiten las etapas de clonación mediante la combinación de la mutagénesis por PCR con transcripción / traducción in vitro acoplada para la generación de alto rendimiento de mutantes de la proteína. Aquí, los productos de PCR se utilizan directamente como molde para la transcripción / traducción in vitro de los anticuerpos de cadena sencilla mutantes. Debido a la alta eficiencia con la que se pueden generar las 19 sustituciones de aminoácidos y analizar de esta manera, ahora es posible llevar a cabo mutagénesis de saturación en numerosos restos de interés, un proceso que puede describirse como mutagénesis de saturación de barrido in vitro (Burks y col., 1997).
La mutagénesis de saturación de barrido in vitro proporciona un procedimiento rápido para la obtención de una gran cantidad de información de estructura-función, incluyendo: (i) identificación de restos que modulan la especificidad de unión al ligando, (ii) una mejor comprensión de la unión del ligando basada en la identificación de los aminoácidos que retienen la actividad y los que suprimen la actividad en un lugar determinado, (iii) una evaluación de la plasticidad general de un sitio activo o subdominio de proteína, (iv) identificación de las sustituciones de aminoácidos que dan como resultado un aumento de la unión.
La mutagénesis específica de sitio guiada por estructura representa una potente herramienta para la disección y modificación genética de las interacciones proteína-ligando (Wells, 1996, Braisted y col., 1996). La técnica proporciona la preparación y el análisis de las variantes de secuencia mediante la introducción de uno o más cambios en la secuencia de nucleótidos en un ADN seleccionado.
La mutagénesis específica de sitio utiliza secuencias de oligonucleótidos específicas que codifican la secuencia de ADN de la mutación deseada, así como un número suficiente de nucleótidos adyacentes, sin modificar. De este modo se proporciona una secuencia de cebador con el tamaño y la complejidad suficientes para formar un dúplex estable en ambos lados de la unión de deleción que se atraviesa. Se prefiere un cebador de aproximadamente 17 a 25 nucleótidos de longitud, con aproximadamente de 5 a 10 restos a ambos lados de la unión de la secuencia que está siendo alterada.
La técnica típicamente emplea un vector bacteriófago que existe tanto en una forma de cadena sencilla como de cadena doble. Los vectores útiles en la mutagénesis dirigida al sitio incluyen vectores tales como el fago M13. Estos vectores fagos están disponibles comercialmente y su uso es generalmente bien conocido por los expertos en la técnica. Los plásmidos de doble cadena también se usan rutinariamente en la mutagénesis dirigida al sitio, lo que elimina la etapa de transferir el gen de interés de un fago a un plásmido.
En general, una primera obtiene un vector de cadena simple, o fusiona dos cadenas de un vector de doble cadena, que incluye dentro de su secuencia una secuencia de ADN que codifica la proteína o elemento genético deseado. Un cebador de oligonucleótido que lleva la secuencia mutada deseada, preparado sintéticamente, se hibrida después con la preparación de ADN monocatenario, teniendo en cuenta el grado de apareamientos erróneos cuando se seleccionan las condiciones de hibridación. El producto hibridado se somete a enzimas de polimerización de ADN tales como polimerasa I de E. coli (fragmento de Klenow) con el fin de completar la síntesis de la cadena portadora de la mutación. Por lo tanto, se forma un heterodúplex, en el que una cadena codifica la secuencia original no mutada y la segunda cadena porta la mutación deseada. Este vector heterodúplex se utiliza después para transformar las células huésped apropiadas, tales como células de E. coli, y se seleccionan los clones que incluyen vectores recombinantes portadores de la disposición de la secuencia mutada.
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La información completa sobre el significado funcional y el contenido de la información de un resto de proteína dado se pueden obtener mejor mediante mutagénesis de saturación en la que se examinan las 19 sustituciones de aminoácidos. El inconveniente de este enfoque es que la logística de la mutagénesis de saturación de múltiples restos es enorme (Warren y col., 1996, Brown y col., 1996; Zeng y col., 1996; Burton y Barbas, 1994; Yelton y col., 1995; Jackson y col., 1995; Short y col., 1995; Wong y col., 1996; Hilton y col., 1996). Se deben estudiar cientos, y posiblemente incluso miles, de mutantes específicos del sitio. Sin embargo, la mejora de las técnicas hace que la producción y la detección rápida de mutantes sean mucho más sencillas. Véanse también, las patentes de Estados Unidos 5.798.208 y 5.830.650, para una descripción de mutagénesis "del recorrido".
Otros procedimientos de mutagénesis dirigida al sitio se divulgan en las Patentes de Estados Unidos 5.220.007; 5.284.760; 5.354.670; 5.366.878; 5.389.514; 5.635.377; y 5.789.166.
Además de los equivalentes funcionales biológicos que se producen utilizando técnicas de mutagénesis mencionadas anteriormente, los presentes inventores también contemplan que se pueden formular compuestos de estructura similar para imitar las partes clave de la superantígeno o conjugado de la presente invención. Tales compuestos, que pueden denominarse peptidomiméticos, pueden usarse de la misma manera que los conjugados de la invención y, por lo tanto, son también equivalentes funcionales.
Ciertos miméticos que imitan a los elementos de estructura secundaria y terciaria de de proteínas se describen en Johnson y col., (1993). El fundamento subyacente al uso de miméticos peptídicos es que la estructura peptídica de las proteínas existe principalmente para orientar las cadenas laterales de aminoácidos de modo que se faciliten las interacciones moleculares, como las de los anticuerpos y/o los antígenos. Un mimético peptídico se diseña de este modo para permitir interacciones moleculares similares a la molécula natural.
Algunas aplicaciones exitosas del concepto de mimético peptídico se han centrado en miméticos de giros β dentro de proteínas, que se sabe que son altamente antigénicos. Probablemente se pueda predecir la estructura del giro β dentro de un polipéptido mediante algoritmos basados en ordenador, como se trata en el presente documento. Una vez determinados los aminoácidos componentes del giro, pueden construirse los miméticos para lograr una orientación espacial similar de los elementos esenciales de las cadenas laterales de aminoácidos.
Otros enfoques se han centrado en el uso de pequeñas proteínas que contienen varios disulfuro como atractivos moldes estructurales para la producción de conformaciones biológicamente activas que imitan los sitios de unión de proteínas grandes. Vita y col., (1998). Un motivo estructural que parece estar conservado evolutivamente en ciertas toxinas es pequeño (30-40 aminoácidos), estable y de alta permisividad para la mutación. Este motivo se compone de una lámina beta y una hélice alfa unidas en puente en el núcleo interior por tres disulfuros.
Los giros beta II se han imitado con éxito utilizando L-pentapéptidos cíclicos y aquellos con D-aminoácidos (Weisshoff y col., 1999). Asimismo, Johannesson y col., (1999) informan sobre tripéptidos bicíclicos con propiedades de inducción de giro inverso.
En la técnica se han divulgado procedimientos para generar estructuras específicas. Por ejemplo, los miméticos de alfa-hélice se divulgan en las patentes de Estados Unidos 5.446.128; 5.710.245; 5.840.833; y 5.859.184. Estas estructuras hacen que el péptido o la proteína sean más estables térmicamente y también aumentan la resistencia a la degradación proteolítica. Se divulgan seis, siete, once, doce, trece y catorce estructuras de miembros de anillo.
Se describen procedimientos para generar giros beta conformacionalmente restringidos y protuberancias beta, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos 5.440.013; 5.618.914; y 5.670.155. Los giros beta permiten sustituyentes laterales cambiados sin tener cambios en la correspondiente conformación del armazón y tienen extremos apropiados para su incorporación en péptidos por procedimientos de síntesis convencionales. Otros tipos de giros miméticos incluyen giros inversos y gamma. Los miméticos de giro inverso se divulgan en las patentes de Estados Unidos 5.475.085 y 5.929.237, y los miméticos de giro gamma se describen en las patentes de Estados Unidos 5.672.681 y 5.674.976.
G. Expresión de los superantígenos
La presente invención también implica el uso de vectores de expresión y células huésped. Estos vectores de expresión, que se han modificado genéticamente para contener la secuencia de ácido nucleico de los conjugados, se introducen o se transforman en las células huésped para producir los conjugados de la presente invención.
Las células huésped pueden modificarse genéticamente para incorporar secuencias de ácidos nucleicos y expresar péptidos de la presente invención. La introducción de secuencias de ácido nucleico en la célula huésped puede efectuarse mediante transfección mediada por fosfato cálcico, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección, microinyección, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, carga de raspaduras, introducción balística, infección u otros procedimientos. Dichos procedimientos se describen en muchos manuales de laboratorio estándar, tales como Davis y col., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, (1986) y Sambrook, y col., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).
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Los ejemplos representativos de células huésped apropiadas incluyen células bacterianas, tales como estreptococos, estafilococos, E. coli, Streptomyces y células de Bacillus subtilis; células fúngicas, tales como células de levadura y células de Aspergillus; células de insecto tales como células de Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células animales tales como CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293 y células de melanoma de Bowes.
II. Tratamiento del cáncer
En la presente invención, un superantígeno se conjuga con un anticuerpo o un fragmento de un anticuerpo para atacar y destruir las células cancerosas. Ejemplos de cáncer incluyen, entre otros, cáncer de pulmón, mama, colon, riñón, páncreas, ovarios, estómago, cuello uterino y próstata.
En un aspecto de la presente invención, la célula tumoral debe tener algún marcador que sea susceptible de atacar, es decir, no está presente en la mayoría de las otras células. Existen muchos marcadores tumorales y cualquiera de estos puede ser adecuado para la orientación en el contexto de la presente invención. Las dianas específicas de la presente invención incluyen anticuerpos. Los anticuerpos que se contemplan en la presente invención incluyen, entre otros, el fragmento Fab. Los ejemplos del fragmento Fab incluyen C215Fab o 5T4Fab. Además de Fab, otros marcadores tumorales frecuentes incluyen el antígeno carcinoembrionario, antígeno específico de próstata, antígeno asociado a un tumor urinario, antígeno fetal, tirosinasa (p97), gp68, TAG-72, HMFG, antígeno sialil de Lewis, MucA, MucB, PLAP, receptor de estrógeno, receptor de laminina, erb B y p155.
Se contempla que la presente invención se puede administrar a un paciente que sufre cáncer o una enfermedad proliferativa. La cantidad administrada al paciente es una cantidad terapéuticamente eficaz o una cantidad que tiene como resultado el tratamiento del cáncer o la enfermedad. La administración del conjugado puede ser a través de una vía parenteral o alimentaria. Los ejemplos de vías alimentarias incluyen, entre otras, la oral, rectal, sublingual y bucal. Los ejemplos de vías parenterales incluyen, entre otras, las vías intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intramuscular, intradérmica, intratumoral e intravascular.
III. Composiciones farmacéuticas
Los compuestos de la presente invención se pueden emplear solos o junto con otros compuestos, tales como compuestos terapéuticos.
Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones y/o dispersiones acuosas estériles, formulaciones incluyendo aceite de sésamo, aceite de cacahuete y/o propilenglicol acuoso, y/o polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones y/o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y/o debe ser fluida de modo que se pueda introducir con facilidad en las jeringuillas. Debe ser estable en las condiciones de la fabricación y/o almacenamiento y/o debe conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y/u hongos.
Las soluciones de los compuestos activos como base libre y/o sales farmacológicamente aceptables se pueden preparar en agua, mezcladas adecuadamente con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones también se pueden preparar en glicerol, polietilenglicoles líquidos y/o sus mezclas y/o en aceites. En condiciones habituales de almacenamiento y/o uso, estas preparaciones contienen un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos.
El conjugado de la presente invención se puede formular en una composición en una forma neutra y / o de sal. Entre las sales farmacéuticamente aceptables se incluyen las sales de adición ácida (formadas con los grupos amino libre de la proteína), y/o que se forman con ácidos inorgánicos, tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico y/o fosfórico, y/o dichos ácidos orgánicos como acético, oxálico, tartárico, mandélico y/o similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden derivar de bases inorgánicas, tales como, por ejemplo, los hidróxidos sódico, potásico, amónico, cálcico y/o férrico, y/o bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y/o similares. En cuanto al uso de agentes terapéuticos peptídicos como principios activos, se puede usar la tecnología de las patentes de EE.UU. 4.608.251; 4.601.903; 4.599.231; 4.599.230; 4.596.792; y / o 4.578.770.
El vehículo también puede ser un disolvente y/o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, un poliol (por ejemplo glicerol, propilenglicol y/o polietilenglicol líquido, y/o similares), mezclas adecuadas de los mismos, y/o aceites vegetales. Se puede mantener la fluidez apropiada, por ejemplo, por el uso de un recubrimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y/o por el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos se puede conseguir mediante varios agentes antibacterianos y/o antifúngicos, por ejemplo parabenes, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y/o similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo azúcares y/o cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede efectuar mediante el uso en las composiciones de agentes retardantes de la absorción, por ejemplo monoestearato de aluminio y/o gelatina.
Se preparan soluciones inyectables estériles mediante la incorporación de los compuestos activos en la cantidad requerida en el disolvente adecuado con varios de los otros principios enumerados anteriormente, según se requiera, seguido por esterilización filtrada. En general, las dispersiones se preparan mediante la incorporación de los diversos principios activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y/o los
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otros principios requeridos de los enumerados en lo que antecede. En el caso de los polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos de preparación preferidos son las técnicas de secado al vacío y/o liofilización, que dan un polvo del principio activo más cualquier principio deseado adicional a partir de una solución del mismo previamente filtrada para esterilizar. También se contempla la preparación de soluciones más, y / o altamente, concentradas para la inyección directa, en las que se prevé el uso de DMSO como disolvente para dar como resultado una penetración extremadamente rápida, la liberación de altas concentraciones de los agentes activos en una pequeña área.
Tras la formulación, las soluciones se administrarán de un modo compatible con la formulación de dosificación y/o una cantidad tal que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en diversas formas de dosificación, tales como el tipo de soluciones inyectables descritas anteriormente, pero también se pueden usar cápsulas de liberación de fármaco y/o similares.
Para administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución se tamponará adecuadamente, en caso necesario, y/o el diluyente líquido se convierte primero en isotónico con suficiente solución salina y/o glucosa. Estas soluciones acuosas concretas son especialmente adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea y/o intraperitoneal. A este respecto, los medios acuosos estériles que pueden emplearse serán conocidos por los expertos en la técnica a la luz de la presente divulgación. Por ejemplo, una dosificación puede disolverse en 1 ml de solución isotónica de NaCl y/o añadirse a 1.000 ml de fluido de hipodermoclisis y/o inyectarse en el sitio de infusión propuesto, (véase por ejemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences" 15ª Edición, páginas 1035-1038 y/o 1570-1580). Necesariamente se producirá alguna variación en la dosis en función de la afección del sujeto que se esté tratando. La persona responsable de la administrará determinará, en cualquier caso, la dosis adecuada para el sujeto individual.
El conjugado y / o los agentes activos se pueden formular dentro de una mezcla terapéutica para comprender de aproximadamente 0,0001 a 1,0 miligramos, y / o de aproximadamente 0,001 a 0,1 miligramos, y / o de aproximadamente 0,1 a 1,0 y / o incluso de aproximadamente 10 miligramos por dosis y / o así sucesivamente. También pueden administrarse varias dosis.
Además de los compuestos formulados para la administración parenteral, tal como inyección intravenosa, intraarticular y/o intramuscular, otras formas farmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, comprimidos y/u otros sólidos para administración oral; formulaciones liposómicas; cápsulas de liberación prolongada; y/o cualquier otra forma utilizada en la actualidad, incluyendo cremas.
También se pueden usar soluciones y / o pulverizaciones nasales, aerosoles, aerosoles y / o inhalantes en la presente invención. Las soluciones nasales son normalmente soluciones acuosas diseñadas para administrar en los conductos nasales en gotas y / o aerosoles. Las soluciones nasales se preparan de manera que sean similares en muchos aspectos a las secreciones nasales, de manera que se mantiene la acción ciliar normal. Por lo tanto, las soluciones nasales acuosas normalmente son isotónicas y / o ligeramente tamponadas para mantener un pH de 5,5 a 6,5. Además, en la formulación se pueden incluir conservantes antimicrobianos, similares a los utilizados en las preparaciones oftálmicas, y / o estabilizadores farmacológicos adecuados, si se requiere. Se conocen varias preparaciones nasales comerciales y / o pueden incluir, por ejemplo, antibióticos y / o antihistamínicos y / o se utilizan para la profilaxis del asma.
Formulaciones adicionales que son adecuadas para otros modos de administración incluyen supositorios vaginales y / o pesarios. También se puede usar un pesarlo y / o supositorio rectal. Los supositorios son formas de dosificación sólidas de varios pesos y / o formas, por lo general medicadas, para la inserción en el recto, la vagina y / o la uretra. Después de la inserción, los supositorios se ablandan, se funden y / o disuelven en los fluidos de la cavidad. En general, para los supositorios, aglutinantes y/o vehículos tradicionales pueden incluir, por ejemplo, polialquilenglicoles y/o triglicéridos; tales supositorios pueden estar formados por mezclas que contienen el principio activo en el intervalo de 0,5 % a 10 %, preferentemente de 1 % a 2 %.
Las formulaciones orales incluyen dichos excipientes empleados habitualmente, por ejemplo calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio y/o similares. Estas composiciones toman la forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida y/o polvos. En ciertas realizaciones definidas, las composiciones farmacéuticas orales comprenderán un diluyente inerte y / o un vehículo comestible asimilable, y / o se pueden encerrar en cápsulas de gelatina de cubierta dura y / o blanda, y / o se pueden comprimir para formar comprimidos, y / o se pueden incorporar directamente en el alimento de la dieta. Para el fin de la administración terapéutica oral, los compuestos activos pueden incorporarse con excipientes y/o usarse en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y/o similares. Tales composiciones y/o preparaciones deben contener al menos 0,1 % de compuesto activo. El porcentaje de las composiciones y/o preparaciones puede, por supuesto, variarse y/o puede estar, de forma conveniente, entre aproximadamente 2 a aproximadamente un 75 % del peso de la unidad y/o preferentemente entre 25–60 %. La cantidad de compuestos activos en tales composiciones terapéuticamente útiles es tal que se obtendrá una dosificación adecuada.
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azúcares y / o fármacos.
Los liposomas interactúan con las células a través de cuatro mecanismos diferentes: endocitosis mediante células fagocíticas del sistema reticuloendotelial tales como macrófagos y / o neutrófilos; adsorción a la superficie celular, ya sea mediante fuerzas hidrofóbicas y/o electrostáticas débiles e inespecíficas y / o mediante interacciones específicas con componentes de la superficie celular; fusión con la membrana plasmática celular mediante inserción de la bicapa lipídica del liposoma en la membrana plasmática, con liberación simultánea de contenidos liposomales en el citoplasma; y / o por transferencia de lípidos liposomales a las membranas celulares y / o subcelulares, y / o viceversa, sin ninguna asociación de los contenidos del liposoma. La variación de la formulación del liposoma puede alterar qué mecanismo es operativo, aunque más de uno puede operar al mismo tiempo.
La liberación de oligonucleótidos mediada por liposomas y la expresión de ADN extraño in vitro han tenido mucho éxito. Wong y col., (1980) demostraron la viabilidad de la liberación mediada por liposomas y la expresión de ADN extraño en células de embrión de pollo cultivado, HeLa y de hepatoma. Nicolau y col., (1987) consiguieron con éxito la transferencia de genes mediada por liposomas en ratas después de la inyección intravenosa.
En ciertas realizaciones de la invención, el lípido puede asociarse con un virus hemaglutinante (VHJ). Se ha demostrado que esto facilita la fusión con la membrana celular y estimula la entrada en la célula de ADN encapsulado en liposomas (Kaneda y col., 1989). En otras realizaciones, el lípido puede formar complejos o se puede usar junto con proteínas cromosómicas nucleares no histonas (HMG–1) (Kato y col., 1991). En otras realizaciones más, el lípido puede formar complejos ose puede usar junto con HVJ y HMG-1. Estos vectores de expresión se han empleado con éxito en la transferencia y expresión de un oligonucleótido in vitro e in vivo, por lo que son aplicables para la presente invención. Cuando se emplea un promotor bacteriano en la construcción de ADN, también será deseable incluir dentro del liposoma una polimerasa bacteriana apropiada.
Los liposomas utilizados según la presente invención se pueden preparar por diferentes métodos. El tamaño de los liposomas varía dependiendo del procedimiento de síntesis. Un liposoma suspendido en una solución acuosa generalmente tiene la forma de una vesícula esférica, que tiene una o más capas concéntricas de moléculas de bicapa lipídica. Cada capa consiste en una matriz paralela de moléculas representadas por la fórmula XY, en la que X es un resto hidrófilo e Y es un resto hidrófobo. En suspensión acuosa, las capas concéntricas se disponen de manera que los restos hidrófilos tienden a permanecer en contacto con una fase acuosa y las regiones hidrófobas tienden a autoasociarse. Por ejemplo, cuando las fases acuosas están presentes tanto dentro como fuera del liposoma, las moléculas lipídicas pueden formar una bicapa, conocida como lamela, de la disposición XY-YX. Se pueden formar agregados de lípidos cuando las partes hidrófilas e hidrófobas de más de una molécula de lípido se asocian entre sí. El tamaño y la forma de estos agregados dependerán de muchas variables diferentes, tales como la naturaleza del disolvente y la presencia de otros compuestos en la solución.
Los liposomas dentro del alcance de la presente invención se pueden preparar de acuerdo con técnicas de laboratorio conocidas. En una realización preferida, los liposomas se preparan mezclando lípidos liposomales en un disolvente en un recipiente, por ejemplo, un vaso, un matraz en forma de pera. El recipiente debe tener un volumen diez veces mayor que el volumen de la suspensión de liposomas prevista. Mediante el uso de un evaporador rotatorio se elimina el disolvente a aproximadamente 40 ºC a presión negativa. El disolvente normalmente se elimina en de aproximadamente 5 minutos a 2 horas, dependiendo del volumen deseado de los liposomas. La composición se puede secar adicionalmente en un desecador al vacío. Los lípidos secos generalmente se desechan después de aproximadamente 1 semana debido a una tendencia a deteriorarse con el tiempo.
Los lípidos secos se pueden hidratar en fosfolípido a aproximadamente 25–50 mM en agua estéril, libre de pirógenos agitando hasta que se vuelve a suspender toda la película de lípido. Los liposomas acuosos se pueden separar después en alícuotas, cada una colocada en un vial, liofilizada y sellada al vacío.
En la alternativa, los liposomas pueden prepararse de acuerdo con otros procedimientos de laboratorio conocidos: el método de Bangham y col., (1965); el método de Gregoriadis, como se describe en DRUG CARRIERS IN BIOLOGY AND MEDICINE, G. Gregoriadis ed. (1979) pp. 287–341; y el procedimiento de evaporación de fase inversa como describen Szoka y Papahadjopoulos (1978). Los procedimientos mencionados anteriormente se diferencian en sus respectivas capacidades para atrapar material acuoso y sus relaciones espacio acuoso-lípido respectivas.
Los lípidos secos o liposomas liofilizados preparados como se ha descrito anteriormente pueden deshidratarse y reconstituirse en una solución de péptido inhibidor y diluirse hasta una concentración apropiada con un disolvente adecuado, por ejemplo, DPBS. Después, la mezcla se agita enérgicamente un mezclador de vórtice. El ácido nucleico encapsulado se elimina mediante centrifugación a 29.000 x g y los sedimentos de liposomas se lavan Los liposomas lavados se resuspenden a una concentración de fosfolípidos totales adecuada, por ejemplo, aproximadamente 50 a 200 mM. La cantidad de ácido nucleico encapsulado se puede determinar de acuerdo con procedimientos estándar. Después de la determinación de la cantidad de ácido nucleico encapsulado en la preparación de liposomas, los liposomas se pueden diluir a concentraciones apropiadas y almacenarse a 4 ºC hasta su uso.
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Una composición farmacéutica que comprende los liposomas por lo general incluirá un vehículo o diluyente estéril farmacéuticamente aceptable, tal como agua o solución salina.
IV. Ejemplos
Los ejemplos siguientes se han incluido para demostrar las formas de realización preferidas de la invención. Los expertos en la técnica deben apreciar que las técnicas divulgadas en los ejemplos siguientes representan técnicas descubiertas por el inventor para funcionar bien en la práctica de la invención y, por tanto, se puede considerar que constituyen modos preferidos para su práctica.
En los siguientes ejemplos, se utilizan diferentes superantígenos; sin embargo, solo los conjugados que comprenden el superantígeno enterotoxina estafilocócica E (VEA) con las modificaciones establecidas en las reivindicaciones están de acuerdo con la invención, los otros superantígenos y conjugados se incluyen por motivos ilustrativos y comparativos.
Ejemplo 1
Mutagénesis in vitro
Las diferentes variantes superantígenos se hicieron usando un procedimiento basado en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Brevemente, los productos de PCR contenían dos sitios de enzimas de restricción únicos, uno en cada extremo. Para el procedimiento de subclonación, se usó pUC19 (GIBCO BRL Life Technologies, Middlesex, Reino Unido), preparado de acuerdo con el protocolo del kit QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN, Hilden, Alemania). Se incluyeron mutaciones puntuales que no afectaban a la secuencia de aminoácidos, para facilitar su posterior análisis. La reacción PCR se realizó en un sistema de PCR de Perkin Elmer Geneamp 2400 con Taq ADN polimerasa y el tampón de PCR apropiado que contenía MgCl2 15mM (Roche Molecular Biochemicals, Basilea, Suiza). Los productos de la PCR y los vectores se escindieron durante la noche con las enzimas de restricción apropiadas. Se purificaron usando electroforesis en gel de agarosa al 1 % (GIBCO BRL Life Technologies) que contenía 0,5 µg/ml de bromuro de etidio (Sigma–Aldrich, Steinheim, Alemania) en tampón TAE (Sigma–Aldrich). El ADN que contiene el fragmento se escindió del gel y se extrajo usando el sistema CONSERT™ Rapid Gel Extraction (GIBCO BRL Life Technologies). El vector y el inserto se ligaron (ADN ligasa de T4, Roche Molecular Biochemicals) a temperatura ambiente durante 3-4 horas. La mezcla de ligación se transformó en la cepa de Escherichia coli DH5 (GIBCO BRL Life Technologies) según las instrucciones adjuntas con las células. Los clones positivos se verificaron mediante secuenciación del ADN. Las secuencias correctas se escindieron con RsrII/HindIII a 37 ºC durante la noche y se ligaron en el vector de expresión (Dohlsten y col., 1994). Las partes variables de los Fab se cambiaron por C215 para adaptarse a los modelos animales internos. Finalmente, la construcción se sometió a electroporación en la cepa de Escherichia coli UL635 K12 (xyl–7, ara–14, T4R, ΔompT).
Ejemplo 2
Identificación de regiones de unión anti-SEA humanas
Las regiones reconocidas por los anticuerpos anti-SEA humanos se identificaron a partir de un digerido con pepsina de SEA o una variante quimérica de SEA y SEE, SEA / E-18, descrito anteriormente como SEE / A-A (Antonsson y col., 1997) con la sustitución D227A.
Cada superantígeno se incubó con 0,5 % de pepsina HCl 10 mM, NaCl 150 mM (p / p) durante 60 minutos a 37 ºC. La mezcla de péptidos se neutralizó con Tris-HCl 2M a pH 8,0 y se aplicó en una columna de 1 ml de HiTrap (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) con anti-SEA humano inmovilizado. Se usó PBS, Na2HPO4 8,1 mM, KH2PO4 1,5 mM, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM a pH 7,3 como tampón de lavado y los fragmentos de unión al anticuerpo se eluyeron usando ácido acético 0,1 M a pH 3,0. Los fragmentos se identificaron tanto antes como después de la purificación usando HPLC acoplada a un espectrómetro de masas (EM) () (FIG.1). La cromatografía se llevó a cabo en una columna C18 (2x250mm) (VYDAC™, Hesperia, California, EE.UU.) utilizando un gradiente lineal de 10 a 60 % de acetonitrilo en ácido trifluoroacético al 0,1 % durante 30 minutos a 40 ºC. La determinación de la masa se realizó utilizando EM con electropulverización (Finnigan LCQ, Thermoquest, San Jose, California, EE.UU.). Los fragmentos encontrados en el digerido al mismo tiempo de retención tanto antes como después de la purificación por afinidad se consideraron positivos (FIG.2).
Ejemplo 3
Modelización molecular
El superantígeno quimérico SEA/E–18 se basó en la secuencia de SEE a excepción de cuatro restos de aminoácidos cerca del extremo N que eran de SEA y una sustitución en la parte del extremo C de D227A (FIG. 3 y FIG. 4) (Antonsson y col., 1997).
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mS/cm y la columna utilizada fue SP-Sepharose-HP, Hiload 16/10(Amersham Pharmacia Biotech). La elución se realizó con un flujo de 4,0 ml/min durante 50 minutos utilizando un gradiente lineal de 0–55 % de tampón B, NaAc 100 mM, NaCl 400mM, 0,025 % de Tween 20, pH 5,0 en tampón A, NaAc 10 mM, 0,025 % de Tween 20, a pH 5,0.
Ejemplo 5
Serorreactividad
La reactividad entre las variantes del superantígeno y el anti-SEA humano se midió en un ensayo de proximidad de centelleo (SPA).
En una placa de microtitulación (OptiPlate, Packard Instruments) se incubaron perlas de PVT recubiertas con estreptavidina, 150 µg de perlas/pocillo (Amersham Pharmacia Biotech) durante 30 minutos a temperatura ambiente con fragmentos F(ab)2 de IgG anti-ratón conjugados con biotina, 3 µg/mg de perlas. Las perlas se preincubaron con superantígenos conjugados con C215Fab en una serie de dilución a 1:2, en la que la concentración final más alta en los pocillos fue 40 nM. Finalmente se incubaron con 1 nM de anticuerpos anti-SEA humanos purificados por afinidad conjugados con 125I y la cantidad de □-centelleo se midió en una Top–Counter (Packard Instruments).
La reactividad anti-SEA humana para las variantes del superantígeno también se midió en un ensayo de inmunosorción ligado a enzimas, ELISA (Cavallin y col., 2000). Los resultados fueron similares a los obtenidos en el SPA.
Ejemplo 6
Función biológica
La capacidad para inducir citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo de superantígeno, CCDAS y citotoxicidad celular dependiente de superantígeno, CCDS se comparó en un ensayo estándar de liberación de 51Cr en 4 horas.
En resumen, las dianas que se utilizaron para la CCDS fueron células de linfoma de células B Raji humanas y las dianas de la CCDAS fueron células de carcinoma colorrectal humano Colo205. Las células se marcaron con 51Cr y se diluyeron a una concentración de 50.000 células / ml a los pocillos de microtitulación en forma de V. Como células efectoras, se usó una línea de linfocitos T humanos reactivos a SEA en una relación entre el efector y la diana de
45:1 para la CCDAS y de 30:1 para la CCDS. Se agregaron variantes Sag en concentraciones de 10–9–10–16m para la CCDAS y de 10–7–10–14M para la CCDS. Se recogieron los sobrenadantes y la liberación de 51Cr se midió en una TopCount (Packard Instruments). El porcentaje de citotoxicidad específica se calculó como 100 x [(cpm de liberación experimental – cpm de liberación de fondo) / (cpm de liberación total -cpm de de liberación de fondo)].
Ejemplo 7
Identificación de epítopos de anticuerpos
En los pacientes, los anticuerpos preexistentes contra superantígenos han complicado su aplicación clínica, ya que requiere el ajuste de su dosis en la terapia (Alpaugh y col., 1998). Otro enfoque para limitar el impacto de los anticuerpos preformados era modificar la región del superantígeno responsable de la unión al receptor de linfocitos T (Antonsson, y col., 1997). Sin embargo, la presente invención ha mejorado aún más el potencial terapéutico de los superantígenos mediante el uso de ingeniería genética para eliminar los epítopos del anticuerpo del superantígeno.
Se encontró que SEE mostraba una fuerte reducción en la reactividad del anticuerpo en comparación con SEA (Antonsson y col., 1997). Desafortunadamente, con esta reducción también se produjo una notable disminución de las propiedades de destrucción del tumor cuando se fusiona a un Fab reactivo con el tumor (Antonsson y col., 1997). Por lo tanto, se investigaron las construcciones quiméricas de SEA y SEE. Al introducir los aminoácidos correspondientes de SEA en cuatro posiciones en la región de unión al TCR de SEE, se obtuvieron las propiedades deseadas. Estas sustituciones Arg20Gly, Asn21Thr, Ser24Gly y Arg27Lys (región A) en SEE, dieron como resultado la quimera SEA/E–18 (FIG. 4) (Antonsson y col., 1997). Esta quimera mostró una reducción de más de un 50 % en la reactividad de los anticuerpos, como en SEE, al tiempo que conserva el nivel eficiente de citotoxicidad, como SEA. Además, para disminuir la afinidad entre el superantígeno y el MHC de clase II, que reducen la CDS y, con ello, mejoran la ventana terapéutica, SEA / E-18 contiene también la sustitución Asp227Ala (Abrahmsén y col., 1995).
Para disminuir aún más la capacidad de anti-SEA humano para reconocer SEA/E–18, se determinaron los epítopos de unión al anticuerpo dentro de los superantígenos. El péptido / fragmentos de un digerido parcial con pepsina de cualquiera de SEA silvestre o SEA/E–18 se capturaron utilizando anticuerpos anti-SEA inmovilizados. Después de la purificación, las secuencias peptídicas se identificaron utilizando CL-EM (Fig. 1). De este modo las posibles áreas que participan en el reconocimiento de anticuerpos se localizaron en la secuencia de aminoácidos. Cabe destacar que la mayoría de los péptidos recuperados se encuentran alrededor de las regiones que se sabe que interaccionan con el MHC de clase II (Abrahmsén y col., 1995) (FIG. 2 y FIG. 6). La estructura tridimensional de SEA (Schad y col., 1995; Sundström y col., 1996) y un modelo de ordenador de SEA/E–18 (FIG. 5), basado en la estructura cristalina de
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