ES2224133T3 - Proteinas c3 humanas modificadas. - Google Patents

Abstract

PROTEINAS NATIVAS DE LA VIA DEL COMPLEMENTO MODIFICADAS, DE FORMA QUE LA PROTEINA ES CAPAZ DE FORMAR UNA CONVERTASA C3 ESTABLE. PREFERIBLEMENTE LA PROTEINA MODIFICADA ES UNA PROTEINA C3 HUMANA. SE PROPORCIONAN ASIMISMO SECUENCIAS DE ADN QUE CODIFICAN PARA DICHAS PROTEINAS, JUNTO CON ESTRUCTURAS DE ADN. SE DESCRIBEN TAMBIEN CONJUGADOS QUE COMPRENDEN DICHAS PROTEINAS Y UNA FRACCION CON ESPECIFICIDAD DE UNION, POR EJEMPLO UN ANTICUERPO, ASI COMO LOS USOS DE DICHAS PROTEINAS Y/O SUS CONJUGADOS, EN TERAPIA.

Description

Proteínas C3 humanas modificadas.

La presente invención se refiere a nuevas proteínas humanas modificadas capaces de formar convertasas C3 estables, a secuencias de DNA que codifican tales proteínas y al uso de tales proteínas como agentes terapéuticos, particularmente para usar en el agotamiento de niveles de proteínas de la ruta del complemento.

El sistema del complemento funciona en la respuesta inmunitaria de seres humanos y otros vertebrados, siendo de principal importancia en las funciones efectoras, tales como fagocitosis, citolisis y reclutamiento de células que inducen respuestas inflamatorias locales [15]. Estas propiedades son deseables para la eliminación de patógenos invasores, tales como bacterias, pero no son deseables cuando son accionados para actuar contra tejidos huésped (por ejemplo, en la lesión por reperfusión post-isquémica [3]) o contra material terapéutico extraño (por ejemplo, rechazo hiperagudo de xenoinjertos [7]). Ha habido intentos de eliminar estas propiedades no deseables explotando derivados de proteínas reguladoras del complemento cuya función normal es suprimir la activación del complemento [10, 18].

El sistema del complemento comprende proteínas sobre la superficie de las células (receptores y reguladores) así como en fase fluida (plasma sanguíneo y otros ambientes extracelulares). La etapa crítica para la generación de respuestas es la conversión proteolítica de C3 en los fragmentos C3b y C3a. C3a es una anafilatoxina que, como C5a, atrae células cebadas al sitio de la estimulación, dando como resultado una liberación local de histamina, vasodilatación y otros efectos inflamatorios. La C3b naciente tiene una capacidad para unirse a superficies alrededor de su sitio de generación. Esta C3b dirige a continuación el ataque por los componentes citolíticos del complemento (C5-C9).

La C3b unida a la superficie, y sus productos de degradación, también funcionan como ligandos para receptores de C3 que median, por ejemplo, la fagocitosis [15]. Existen dos rutas distintas de activación del complemento que dan como resultado ambas la conversión de C3 en C3b y las respuestas subsiguientes. La ruta clásica es accionada comúnmente por complejos de anticuerpo con antígeno, que inician una cascada enizmática que implica las proteínas C1q, C1r, C1s, C2 y C4. La ruta alternativa depende de un bucle de activación que implica la propia C3 y que requiere factores B y D.

La conversión de C3 en C3b (o C3i) produce un producto que puede combinarse con el factor B, dando C3bB (o C3iB). Estos complejos son activados por factor D para generar C3bBb, que es una convertasa C3 capaz de segmentar más C3 en C3b, conduciendo a más C3bBb e incluso a más conversión de C3. Bajo ciertas circunstancias, el complejo C3bBb se estabiliza mediante la asociación con el regulador positivo properdina (P). Sin embargo, este bucle de retroalimentación positiva normalmente está limitado a una marcha lenta por las proteínas reguladoras, principalmente el factor H y el factor I.

El factor H (y moléculas asociadas con la célula estructuralmente relacionadas) (i) desplaza B y Bb de C3b y (ii) actúa como un cofactor para el factor I que segmenta C3b en iC3b evitando de ese modo cualquier recombinación con factor B para formar más convertasas C3. La ruta se "dispara" en la generación amplificada de C3b en presencia de superficies, tales como muchas paredes celulares bacterianas, que se unen a C3b naciente e impiden su regulación por los factores H e I. La C3b naciente también es capaz de unirse a células endógenas. Las superficies de células endógenas normalmente expuestas al complemento se protegen por lo tanto adicionalmente mediante reguladores unidos a la membrana tales como MCP, DAF y CR1 que actúan de una manera similar al factor H.

Existen unos pocos estados naturales raros en los que la regulación en fase fluida normal no puede producirse y la conversión espontánea de C3 da como resultado finalmente un agotamiento generalizado de C3 de la circulación: (i) deficiencias genéticas de factor H o I [13], (ii) la presencia de anticuerpos (factores nefríticos) que se unen a C3bBb e impiden la disociación [4], y (iii) contacto con una proteína en veneno de cobra, llamado factor del veneno de cobra (CVF), que se combina con factor B y forma una enzima convertasa C3 que no contiene C3b y no está afectada por factores H e I [14]. Estas ilustran la importancia fisiológica normal de la regulación a la baja del complemento en ausencia de activación específica.

También existen circunstancias en las que se produce una activación específica, pero no se desea, particularmente cuando se dirige contra tejidos del huésped (por ejemplo, tejido dañado por isquemia o cirugía) o contra material extraño aportado deliberadamente con propósitos terapéuticos (tal como un xenoinjerto, un órgano artificial o una membrana de diálisis). La activación del complemento da como resultado un ataque y un daño adicional no deseables, de modo que en estos casos sería beneficioso bloquear o inhibir la activación y la respuesta.

Sistemas existentes para prevenir el daño mediado por el complemento se han orientado al uso de proteínas reguladoras a la baja (CR1, MCP, DAF y factores H e I) para inhibir la activación del complemento. Inhibidores del complemento, como factor I, factor H y derivados solubles de las proteínas unidas a la membrana CR1, DAF, MCP, suprimen el bucle de amplificación en fase fluida de la ruta alternativa. Por lo tanto, han existido intentos de usar estas moléculas, particularmente CR1 (que parece ser la más potente) para reducir el daño mediado por el complemento en modelos de situaciones fisiológicas [10, 18].

El factor H está presente endógenamente en plasma sanguíneo en altas concentraciones (típicamente 0,3-0,5 mg/ml [15]), de modo que aunque los niveles incrementados de inhibidores amortigüen las reacciones en fase fluida, su potencia es débil de modo que tendrían que administrarse in vivo grandes cantidades de proteínas purificadas (por ejemplo, probablemente por encima de 5 mg/kg de peso corporal de CR1 soluble). Además, la ruta alternativa es activada por superficies en las que el efecto del factor H ya está impedido. Aunque esto no necesariamente reduce concomitantemente las actividades de otros inhibidores, los mismos factores sugieren que es improbable que sean completamente o universalmente eficaces.

El factor de veneno de cobra (CVF) tiene la propiedad de generar una convertasa C3 estable que puede usarse experimentalmente para agotar el complemento en mamíferos in vivo, y en otras muestras (por ejemplo, plasma sanguíneo humano) in vitro. El CVF es potente (por ejemplo, 40 \mug/kg pueden destruir la actividad del complemento de un ratón [16]). Sin embargo, existen desventajas que lo hacen inadecuado para uso terapéutico en seres humanos.

En primer lugar, se obtiene a partir de veneno de cobra (una fuente difícil de obtener y peligrosa de manejar) y por lo tanto debe purificarse cuidadosamente de las neurotoxinas del veneno. También existe la dificultad obvia de obtener suministros. Este problema no puede vencerse fácilmente clonando y expresando el gen ex vivo, debido a que existen modificaciones post-traduccionales que se producen en la serpiente (procesamiento proteolítico específico) que pueden ser difíciles (o imposibles) de reproducir in vitro.

Además, las enzimas y las condiciones de digestión requeridas para este procesamiento son actualmente desconocidas. En segundo lugar, la proteína es de origen extraño (para los seres humanos) y por lo tanto inmunogénica. Esto impide su uso terapéutico repetido, que se requeriría para descomplementar a un paciente durante muchas semanas (por ejemplo, para permitir la supervivencia de un xenoinjerto).

Aunque el CVF tiene algunas homologías estructurales y funcionales con C3 humana [17], también tiene diferencias fundamentales en ambos aspectos (por ejemplo, estructura de la cadena, sitio de biosíntesis, insensibilidad a reguladores del complemento, formación de una convertasa C3 estable). No se deriva del equivalente de cobra de C3 que es conocido, habiéndose clonado y sometido a secuenciación, y que en estructura y función básicas se asemeja a C3 humana más estrechamente que el CVF [8].

El CVF es un producto específico del veneno de un animal de gran distancia evolutiva con respecto al homo sapiens. Por lo tanto, no es práctico usar manipulaciones genéticas para modificar esta proteína hasta un producto que pueda usarse no inmunogénicamente en seres humanos.

Se ha ideado ahora una estrategia alternativa que se basa en sortear la regulación fisiológica y, en lugar de inhibir la activación del complemento, hace que el sistema se sobreactive. Esto tiene dos aplicaciones. En primer lugar, puede usarse in vivo para activar el complemento hasta que uno o más componentes se agotan, dando como resultado una pérdida de capacidad para producir respuestas locales a cualquier estimulación subsiguiente (tal como un xenoinjerto). En segundo lugar, la sobreactivación no regulada puede localizarse deliberadamente en una diana particular (por ejemplo, un virus o una célula infectada viralmente) para incrementar la sensibilidad de esta diana a respuestas destructoras mediadas por el complemento.

El término "reguladores de la activación del complemento" se usa aquí para incluir todas las proteínas que actúan para inhibir la amplificación de la conversión de C3, y no pretende restringirse en significado a aquellas proteínas cuyos genes están situados en el locus genético RCA. Sin embargo, no incluye "reguladores al alza" tales como properdina. "Conversión de C3" se define como la conversión proteolítica de C3 en C3b y C3a, a no ser que se indique otra cosa, y "convertasa C3" (o simplemente "convertasa") se define como una enzima (típicamente un complejo de dos o más componentes proteínicos; por ejemplo C3bBb, C3iBb, CVFBb o C4b2a) que cataliza esta reacción.

Así, en un primer aspecto la invención proporciona una proteína C3 humana modificada capaz de formar una convertasa C3 estable, en donde dicha proteína modificada se selecciona del grupo que consiste en:

(a)

una proteína C3 en la que Arg-1303, Arg-1320 o ambas se reemplazan por otro aminoácido;

(b)

una proteína C3 que tiene susceptibilidad reducida a Factor H y/o Factor I con relación a la convertasa C3 humana natural, teniendo dicha proteína uno o más cambios de aminoácidos con relación a convertasa C3 humana natural en la región correspondiente a los residuos de aminoácido 752-754 y/o los residuos 758-780 de convertasa C3 humana natural; y

(c)

una proteína C3 que tiene cambios de aminoácidos con relación a convertasa C3 humana natural en los residuos de aminoácido 1427, 1431 y/o 1433 de convertasa C3 humana natural.

Típicamente, se usarán proteínas de la ruta del complemento modificadas de la misma especie.

La modificación de la secuencia que codifica DNA de C3, por ejemplo usando mutagénesis dirigida al sitio, puede producir una variante de C3 que es resistente a proteínas reguladoras del complemento mientras que retiene propiedades funcionales positivas (segmentación hasta C3b mediante convertasa C3) y características de integridad estructural (estructura correcta de la cadena en presencia de un enlace tioléster). La invención descrita aquí se refiere a formas genéticamente modificadas de proteínas del complemento naturales, por ejemplo C3 humana, cuyo fragmento C3b adquiere la propiedad de ser resistente a la regulación fisiológica del complemento. Debido a esta resistencia, estas
moléculas pueden generar formas estabilizadas de la convertasa C3 correspondiente que producen la conversión amplificada de C3 en C3b, y productos de degradación ulteriores, en ambientes fisiológicos (por ejemplo in vivo).

En una modalidad, la invención se refiere a una proteína C3 humana modificada capaz de formar una convertasa C3 estable, en donde dicha proteína modificada es una proteína C3 en la que Arg-1303, Arg-1320 o ambos se reemplazan por otro aminoácido.

En otra modalidad, la invención se refiere a una proteína C3 humana modificada capaz de formar una convertasa C3 estable, en donde dicha proteína modificada es una proteína C3 que tiene susceptibilidad reducida a Factor H y/o Factor I con relación a convertasa C3 humana natural, teniendo dicha proteína uno o más cambios de aminoácidos con relación a convertasa C3 humana natural en la región correspondiente a los residuos de aminoácido 752-754 y/o los residuos 758-780 de convertasa C3 humana natural. Un ejemplo se muestra en la Figura 6.

En otra modalidad más, la invención se refiere a cambios de aminoácidos con relación a convertasa C3 humana natural en los residuos de aminoácido 1427, 1431 y/o 1433 de convertasa C3 humana natural.

i) Susceptibilidad reducida a las acciones inhibidoras del factor H y proteínas relacionadas (por ejemplo MCP, DAF, CR1). Por ejemplo, en C3 humana los residuos 767-776 y 1209-1271 se han relacionado con la unión a factor H [20, 24], y la substitución de uno o más de estos residuos u otros residuos también asociados con la acción de estas proteínas podría reducir la unión de una o más de estas proteínas reguladoras.

ii) Velocidad reducida de disociación de C3bBb. Pueden introducirse mutaciones que podrían reforzar la interacción entre C3b y Bb. Esto podría dar como resultado tanto una reducción en la descomposición espontánea de la enzima como disminuir la eficacia del factor H (y reguladores relacionados) para desplazar Bb de C3b.

Estas mutaciones son deseables para reducir las velocidades de la descomposición de C3bBb tanto espontánea como mediada por factor H. Incluso en ausencia de factor H, el complejo C3bBb en fase fluida tiene una semivida de solo aproximadamente 10 minutos a 37ºC en presencia de properdina [6].

iii) Los residuos de C3 humana 752-761 están relacionados con la unión a factor B. Es una región altamente conservada en C3 y se encuentra una secuencia estrechamente relacionada en C4. Como C4 se une al homólogo del factor B C2, la fuerte similitud de esta región entre C3 y C4, junto con su alta conservación en C3, apoya adicionalmente su papel en C3 como un sitio que se une a factor B. Así, los cambios en esta región podrían tener efectos sobre la afinidad para B y sobre la estabilidad de C3bBb.

iv) La resistencia a otros reguladores de la activación del complemento, tales como CR1, DAF y MCP, también sería deseable. El modo de acción de estos reguladores es totalmente similar al factor H, de modo que no se requeriría necesariamente mutagénesis adicional. De forma similar, algunos organismos patógenos expresan sus propios inhibidores de la activación del complemento que a menudo son estructuralmente y funcionalmente homólogos al factor H (por ejemplo, péptido secretor del virus de Vaccinia []). Estas moléculas protegen a los invasores contra respuestas inmunitarias y sería ventajoso poder atacarlos con enzimas convertasa C3 elegidas resistentes a estas
defensas.

v) Mutaciones que incrementan la estabilización de la convertasa C3 mediante porperdina. La actividad de la properdina es estabilizar el complejo C3bBb, retardando la disociación espontánea y dependiente del factor H. Esta estabilización es ineficaz en fase fluida, pero parece ser más importante al amplificar el proceso una vez que ya ha comenzado sobre una superficie activante adecuada [5]. Incrementar su actividad (incrementando su afinidad) puede perturbar el equilibrio en fase fluida y de ese modo promover la conversión de C3 espontánea. Esto debe ser particularmente útil en combinación con las otras modificaciones descritas previamente.

vi) Mutaciones que evitan que el C3bBb posea actividad de convertasa C5. Cuando se usa para agotar C3 activa de la circulación, un efecto secundario no deseable podría ser la generación de grandes cantidades de péptidos anafilácticos. El más potente de estos es C5a, que se segmenta de C5 mediante algunas enzimas convertasa C3. Esta reacción depende probablemente de la afinidad de la convertasa para otra molécula de C3b [11], y así puede someterse a supresión mediante mutaciones en la C3 que eliminan esta interacción.

vii) Actividad mejorada de la convertasa C3. El sitio activo de la enzima convertasa C3 C3bBb exhibe una porción Bb. El componente C3b funciona presumiblemente para imponer una conformación activa sobre Bb y/o para unirse y orientar el substrato que ha de activarse mediante Bb. Esto no se conoce, pero en cualquier caso puede haber margen para mejorar la actividad de la convertasa a través de mutaciones en C3.

viii) Expresión en una forma funcional. C3 de tipo salvaje requiere la conversión en C3b antes de que pueda combinarse en un nuevo complejo de convertasa C3. Cuando se usa in vivo, un requisito para la conversión en C3b (o C3i) retrasaría la acción de la C3 modificada. Por lo tanto, sería deseable administrar la porción en una forma capaz de una formación de convertasa inmediata o administrar complejos de convertasa preformados. Por lo tanto, es ventajoso generar un reactivo funcionalmente similar a C3b ex vivo. Esto podría alcanzarse in vitro (por ejemplo, mediante proteolisis).

ix) Modificaciones en la proteína natural que sirven para introducir nuevos sitios de segmentación de modo que las regiones peptídicas requeridas para la unión a factor B se retienen pero las requeridas exclusivamente para la unión a factor H pueden eliminarse específicamente. Por ejemplo, pueden introducirse sitios tales que la forma similar a C3b de la C3 modificada puedan segmentarse adicionalmente en una forma que todavía se une a factor B pero es menos susceptible a la inactivación por factores H e I.

x) Modificaciones en otras regiones que pueden afectar a la interacción de C3b con factor B y/o factor H.

La invención se basa en invertir el sistema tradicional promoviendo la conversión de C3 para agotar C3 y de ese modo inhabilitar el sistema. Una aplicación adicional de la invención es el potencial de promover la conversión de C3 en un sitio particular y de ese modo reclutar los mecanismos efectores dependientes del complemento para atacar a una diana específica.

Por lo tanto, el efecto final será incrementar la cantidad de conversión de C3 cuando la proteína modificada se administra a un medio fisiológico (por ejemplo la sangre) que contiene reguladores de la activación del complemento. Esta actividad puede usarse a continuación para agotar ese medio de C3 natural o para localizar la conversión de C3 en una diana deseada.

El análogo de C3 cuyo fragmento C3b es resistente a las acciones de factor I (por ejemplo, el derivado descrito en el ejemplo 1) se uniría a factor B, y a continuación se segmentaría mediante factor D y finalmente se disociaría en una forma inactiva. En ausencia de inactivación por factor I, la C3b modificada sería capaz de unirse repetidamente a nuevas moléculas de factor B y de ese modo promover su inactivación. Por lo tanto, otra aplicación potencial de las modificaciones descritas en esta invención sería la inactivación de la ruta alternativa mediante el consumo de la actividad de factor B. Un sistema análogo también podría usarse para modificar C4 para promover el consumo de C2 y de ese modo inhabilitar la ruta clásica de activación del complemento.

La invención incluye cualquier otra proteasa usada de una manera análoga para la enzima C3bBb que conduce a la segmentación de C3 en C3b, a pesar de la presencia de reguladores de la activación del complemento.

La invención también incluye secuencias de DNA que codifican para una proteína de la invención así como constructos de DNA que comprenden tales secuencias de DNA.

"Secuencias de DNA" incluyen todas las otras secuencias de ácido nucleico que, en virtud de la degeneración del código genético, también codifican para la secuencia de aminoácidos dada o que son substancialmente homólogas a esta secuencia. Estas secuencias también se incluyen así dentro del alcance de la invención.

Secuencias de ácido nucleico que son "substancialmente homólogas" también están dentro del alcance de la presente invención. La "homología substancial" puede determinarse tanto en la categoría de los ácidos nucleicos como en la categoría de los aminoácidos. En la categoría de los ácidos nucleicos, secuencias que tienen homología substancial pueden considerarse las que se hibridan a las secuencias de ácido nucleico de la invención bajo condiciones restrictivas (por ejemplo, a de 35 a 65ºC en una solución salina de aproximadamente 0,9M). En la categoría de los aminoácidos, una secuencia proteínica puede considerarse substancialmente homóloga a otra secuencia proteínica si un número significativo de los aminoácidos constituyentes exhibe homología. Al menos 55%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% e incluso 99%, en orden creciente de preferencia, de los aminoácidos pueden ser homólogos.

Según se analiza previamente, las proteínas de la invención pueden usarse para alcanzar efectos de activación del complemento localizados. Un modo de asegurar esto es conjugar la proteína a un resto que se unirá a la diana deseada. Así, en otro aspecto la invención proporciona un conjugado que comprende una proteína de la invención conectada a un resto de unión específica, por ejemplo una proteína de unión específica. Un ejemplo de tal proteína sería un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

Las proteínas de la invención están destinadas a administrarse a un sujeto para provocar un efecto terapéutico deseado. Por lo tanto, a ese fin la invención también proporciona:

a) Una proteína de la invención para usar en terapia;

b) El uso de una proteína o un conjugado de la invención en la fabricación de un medicamento para usar en el agotamiento de niveles de proteína de la ruta del complemento, y en particular para usar en la prevención del rechazo de materia extraña;

c) Una formulación farmacéutica que comprende una o más proteínas o conjugados de la invención junto con uno o más portadores y/o excipientes farmacéuticamente aceptables; y

d) Un método para reducir la proteína de la ruta del complemento en un mamífero, que comprende administrar al mamífero una proteína de la invención, preferiblemente en la forma de una formulación farmacéutica.

Las formulaciones farmacéuticas pueden presentarse en formas de dosis unitaria que contienen una cantidad predeterminada de ingrediente activo por dosis. Tal unidad puede contener, como mínimo, por ejemplo, 1 mg de ingrediente activo y preferiblemente 2-3 mg. El límite superior que puede contener tal dosis unitaria dependerá de muchos factores tales como el estado que se trata, la ruta de administración y la edad, el peso y el estado del paciente así como de consideraciones económicas. Como un ejemplo, una forma de dosis unitaria puede contener tanto como 10 mg o incluso 100 mg de ingrediente activo.

Las proteínas de la invención podrían usarse in vivo para inhabilitar el sistema del complemento. Circunstancias en las que esto puede ser deseable incluyen las siguientes:

(a) Para prevenir la destrucción o el daño mediados por el complemento a un trasplante, particularmente un xenoinjerto (material trasplantado de una especie de animal diferente), y especialmente un xenoinjerto discordante (donde la especie donante y receptora están discordantemente relacionadas). El receptor sería descomplementado antes de la operación y se mantendría en este estado hasta que el trasplante se hubiera adaptado o se hubiera reemplazado por un órgano más compatible.

El tratamiento inicial podría realizarse varios días antes del trasplante. La descomplementación adicional podría requerirse en momentos de crisis de rechazo. Los tratamientos pueden estar acompañados por el uso de reactivos antihistamínicos para controlar las respuestas inflamatorias generales (por ejemplo, vasodilatación) que resultan probablemente de la generación de C3a y/o C5a.

La descomplementación también puede ser beneficiosa en el uso de órganos o tejidos artificiales (por ejemplo, membranas de diálisis de riñones artificiales) que activan el sistema del complemento. Según se describe previamente, la proteína puede administrarse como la forma inactivada, una forma funcionalmente similar a C3b o una convertasa C3 activa preformada (como C3bBb). Estas pueden administrarse mediante cualquier ruta por la que la convertasa activa encuentre la C3 en circulación (por ejemplo, intravenosamente, subcutáneamente, etc.).

Otra alternativa sería un tratamiento ex vivo, por ejemplo transfundiendo la circulación a través de una matriz que tiene la convertasa activa. Esto podría tener la ventaja de permitir que péptidos anafilácticos (C3a y C5a) y otros mediadores inflamatorios de bajo peso molecular (por ejemplo, histamina y óxido nítrico) se retiraran (por ejemplo, mediante diálisis) antes de que la sangre (o el plasma) descomplementada se devolviera al paciente.

(b) Para evitar el daño mediado por el complemento resultante de cirugía principal. El paciente debe descomplementarse, como previamente, preferiblemente antes de la operación (pero si es necesario después) y mantenerse en este estado hasta que se ha disminuido el peligro de una lesión interna adicional debida a un ataque inmune dependiente del complemento.

(c) Para minimizar el daño mediado por el complemento resultante de una lesión no quirúrgica. En estos casos, la descomplementación debe realizarse después de la lesión inicial, pero las formulaciones y los métodos de administración son propensos a ser por lo demás similares a los descritos previamente. Esto puede ser particularmente útil cuando la recuperación implica la reperfusión de un tejido isquémico mediante la circulación (por ejemplo, isquemia de miocardio, congelación, quemaduras, etc.).

(d) Para disminuir el daño mediado por el complemento resultante de interacciones anticuerpo-antígeno. Las respuestas defensivas mediadas por el complemento son particularmente no deseables en enfermedades autoimunes que pueden incluir glomerulonefritis, anemia hemolítica, miastenia grave y artritis inducida por colágeno tipo II. Inhabilitar el sistema del complemento durante episodios de enfermedad graves puede aliviar el estado.

(e) Para hacer a una diana patógena específica más susceptible a mecanismos inmunes mediados por el complemento. En este sistema, el objetivo no es usar la convertasa C3 sobreactiva para producir agotamiento generalizado de C3, sino en cambio usar la convertasa localmente para concentrar la conversión de C3 en una diana determinada. La diana puede ser un organismo patógeno, tal como una bacteria, un virus u otro parásito, o una célula o tejido huésped perjudicial, tal como una célula tumoral o una célula viralmente infectada. La convertasa C3 podría localizarse en la diana mediante administración local (por ejemplo, inyección directa, posiblemente en un medio que retarda su dispersión en la circulación general), o combinando con un resto de orientación, por ejemplo un anticuerpo. Así, la proteína modificada podría conectarse a una inmunoglobulina específica mediante reticulación química de las proteínas o enlazando las secuencias que codifican DNA y expresando (y purificando) la proteína de fusión (por ejemplo, en el caso de IgG, la cadena pesada o ligera podría ligarse a C3 y coexpresarse con C3, o ambas cadenas podrían combinarse dentro de un polipéptido de fusión completo), o mediante la incorporación de secuencias de codificación específicas (por ejemplo, para dominios similares a la "cremallera de leucina") al DNA de ambos socios de fusión (por ejemplo, C3 modificada y anticuerpo específico) de modo que los productos expresados, cuando se mezclan entre sí, se autoasocian para formar conjugados estables. La proteína de fusión podría administrarse a continuación localmente o a la circulación general.

También podrían usarse liposomas (que tienen el anticuerpo sobre la superficie con la proteína modificada sobre la superficie o dentro del liposoma) y/o viriones (por ejemplo, manipulados para expresar las proteínas sobre su superficie) para el coaporte de anticuerpo y proteína modificada. Esta estrategia podría usarse directamente, sola o en combinación con otros tratamientos, en cualquier fase del proceso de enfermedad. Puede ser particularmente apropiado para usar en la eliminación de cualesquiera células cancerosas que queden en la circulación después de la eliminación quirúrgica de un tumor. Los conjugados de anticuerpo-proteína modificada también podrían usarse ex vivo para eliminar tejido patógeno. Por ejemplo, para destruir células leucémicas de una médula ósea extraída y a continuación devolver las células sanas restantes al paciente.

Alternativamente, linfocitos que no se adaptan a los tipos del MHC del receptor podrían eliminarse de una médula ósea antes del trasplante. Además, la proteína modificada podría conectarse a un antígeno y esta combinación podría usarse, in vivo o ex vivo, para atacar linfocitos de reactividades no deseables (por ejemplo, contra el trasplante o el propio tejido).

La misma tecnología sería aplicable para tratar otras especies, usando un derivado de proteína modificada humana o un análogo similar elaborado para esa especie.

Características preferidas de cada aspecto de la invención son como para cada otro aspecto y viceversa.

La invención se describirá ahora por medio de los siguientes ejemplos, que no debe considerarse de ningún modo que limiten la invención. Los ejemplos se refieren a los dibujos adjuntos, en los que:

La Figura 1: muestra la secuencia proteínica predicha de C3 humana según se codifica en PC3;

(usando el código de aminoácidos de una letra estándar).

La Figura 2: muestra la secuencia de cDNA en PC3;

(usando el código de desoxinucleótidos de una letra estándar para la hebra de sentido, escrita 5'-3').

La Figura 3: muestra una visualización de proteínas modificadas de la invención.

La Figura 4: muestra el efecto de diversas mutaciones para C3 humana que reemplazan Arg 1303 o Arg 1320 durante la segmentación mediada por factor I en estos sitios.

Nota

1.

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Muestras marcadas biosintéticamente con [35S].

2.

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Reacciones realizadas a una intensidad iónica normal.

3.

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Inmunoprecipitado con anti-C3.

4.

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SDS-PAGE bajo condiciones reductoras.

5.

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Autorradiografía.

La Figura 5: muestra la resistencia mejorada de C3 humana que incorpora la mutación Arg 1303 \rightarrow Gln 1303 a la inactivación por factores I y H.

La Figura 6: muestra un análisis de la segmentación de una convertasa C3 mutada en los residuos de aminoácido 752-754 y 758-760.

Esta es una fotografía de una transferencia Western desarrollada a partir de un gel de SDS-PAGE con poliacrilamida al 7,5% (condiciones reductoras), después de la transferencia electroforética sobre nitrocelulosa, sondando con un anticuerpo anti-(C3 humana) de oveja, y el desarrollo con anticuerpo anti-(inmunoglobulina de oveja) acoplado con peroxidasa de rábano picante y Enhance ChemiLuminescence (método y reactivos de detección de Amersham, Reino Unido) registrada sobre película de rayos X. Las reacciones de segmentación y el procedimiento de detección se realizaron como se describe en el Ejemplo 4 con referencia a los resultados mostrados en la Figura 3.

Clave:

Trazos 1-4:

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C3 de tipo salvaje (expresada en células COS)

Trazos 5-8:

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C3 mutante (residuos 752-754 cambiados por Gly-Ser-Gly y también cambiándose los residuos 758-770 por Gly-Ser-Gly) (expresado en células COS)

Trazos 1,5:

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sin adición

Trazos 2,6:

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+ CVFBb

Trazos 3,7:

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+ factores H + I

Trazos 4,8:

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+ CVFBb + factores H + I

Las bandas indicadas por flechas son:

A:

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cadena alfa de C3

B:

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cadena alfa' de C3

C:

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cadena beta de C3

D:

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producto de segmentación de 68 kDa de la cadena alfa' de C3

E:

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cadena pesada de IgG

La Figura 7: muestra un análisis de la segmentación de factor B radiomarcado por factor D, en presencia de C3's (C3i's) de tipo salvaje y mutante.

Se muestra una fotografía de la autorradiografía del gel de SDS-PAGE. Todas las muestras contenían factor D y factor B marcado con ^{125}I y se incubaron durante 3 horas a 37ºC.

Las muestras en los trazos numerados también incluían:

1.

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Tampón solo

2.

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C3 tipo salvaje 1/125

3.

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C3 tipo salvaje 1/25

4.

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C3 tipo salvaje 1/5

5.

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C3 mutante 1/25 (residuos 1427 Gln, 1431 Asp y 1433 Gln)

6.

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C3 mutante 1/5

7.

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C3 mutante no diluida

Las bandas indicadas por flechas son:

A.

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\;

\;

factor B marcado con ^{125}I no segmentado (93 kDa)

B.

\;

\;

\;

\;

producto de segmentación de 60 kDa ("Bb")

C.

\;

\;

\;

\;

producto de segmentación de 33 kDa ("Ba")

La Figura 8: muestra un estudio de SDS-PAGE que ilustra la formación de un conjugado entre C3i e IgG.

Este es un colorante de Coomassie de un gel de SDS-PAGE con acrilamida al 4% recorrido bajo condiciones no reductoras. Los trazos numerados contienen muestras de:

1.

\;

\;

\;

\;

PDP-IgG

2.

\;

\;

\;

\;

C3i

3.

\;

\;

\;

\;

mezcla de reacción de PDP-IgG + C3i

Se indican mediante flechas:

A.

\;

\;

\;

\;

Probablemente conjugado de C3i-IgG (350 kDa)

B.

\;

\;

\;

\;

C3i (200 kDa)

C.

\;

\;

\;

\;

IgG (150 kDa)

La Figura 9: demuestra que el conjugado orienta la actividad de convertasa C3 contra eritrocitos de oveja.

(Esta gráfica muestra el % de eritrocitos de oveja sometidos a lisis después del revestimiento con diluciones del conjugado C3i-IgG, PDP-IgG o C3i seguido por lavado, generación de convertasas C3 con properdina y factores B y D, y finalmente desarrollo de la lisis mediante NGPS en CFD/EDTA, según se describe en los métodos. Sólo el conjugado produce lisis y esta lisis es dependiente de la dosis).

Los siguientes métodos y definiciones estándar son aplicables a todos los ejemplos.

Todos los componentes del complemento mencionados son de origen humano, a no ser que se especifique otra cosa, usando tecnología estándar para todas las proteínas y sus fragmentos derivados (por ejemplo, como los contenidos en la referencia [15]). Además, el término "C3i" se refiere a cualquier forma molecular de C3 sin un enlace tioléster intacto, pero que retiene el polipéptido C3a sobre la cadena alfa.

El cDNA y la secuencia de codificación de C3 humana se numeran como se muestra en la Figura 2, usando la numeración usada en la base de datos de nucleótidos EMBL (derivada de la referencia [2]). La secuencia mostrada es la del presente constructo ("PC3"), que carece de los 11 primeros nucleótidos de la región no traducida 5' presentada en la referencia [2], y de ahí que la primera base se numere 12. El codón de iniciación putativo son los nucleótidos número 61-63, el codón para el residuo de serina aminoterminal de la cadena beta son los nucleótidos 127-129 y el codón para el residuo de serina aminoterminal de la cadena alfa son los nucleótidos 2074-2076.

La secuencia proteínica se numera de acuerdo con la secuencia precursora que se muestra en la Figura 1, que es una traducción predicha de la secuencia de DNA del Apéndice 1 (se espera que los aminoácidos 1-22 comprendan una secuencia de señal que se retira durante la biosíntesis y se espera que los aminoácidos 668-671 se retiren cuando el precursor se segmenta en las cadenas alfa y beta).

Las siguientes abreviaturas tienen los siguientes significados; CVF, factor de veneno de cobra; ELISA, ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas; E. coli, Escherichia coli; kb, kilobase; HSV-1, virus del herpes simple tipo 1; PBS, solución salina tamponada con fosfato. COS-1 es una línea celular derivada de células de riñón de mono. Las siguientes son endonucleasas de restricción: AflII, DraI, DraIII, EcoRI, EcoRV, HindIII, NaeI, NheI, XbaI.

Métodos estándar

Métodos para procedimientos biológicos moleculares estándar, tales como aislamientos de plásmidos, electroforesis en gel de agarosa y ligaciones de DNA, pueden encontrarse en la referencia [21]. DNA de doble hebra se sometió a secuenciación usando el estuche "Sequenase version 2.0" suministrado por "United States Biochemicals". La expresión de C3 se midió mediante un ensayo ELISA usando placas de plástico pre-revestidas con anti-(C3 humana) de oveja policlonal purificada por afinidad a la que se añadían muestras de sobrenadante de cultivo. Se detectó C3 unida con un anticuerpo de rata monoclonal para C3 conjugada a fosfatasa alcalina y el substrato cromogénico, fosfato de p-nitrofenol. Lo ensayos se calibraron con C3 de plasma humano purificada.

Los métodos para la purificación de proteínas del complemento y CVF y para la preparación de anticuerpos anti-C3 purificados por afinidad usados en los análisis pueden encontrarse en la referencia [28]. Reactivos equivalentes también pueden adquirirse de Sigma chemical company LTD.

Secuencia que codifica cDNA de C3

La presente secuencia que codifica cDNA de C3 se construyó a partir de dos segmentos aislados de una biblioteca de cDNA de hígado humano cebado aleatoriamente transportada en el vector pGEM4 (Promega). Cinco oligodesoxinucleótidos, correspondientes a segmentos conocidos en la secuencia de codificación de C3 humana, se radiomarcaron con polinucleótido quinasa de T4 y [\gamma-32P]ATP y se usaron para sondar transferencias de filtro de la biblioteca a partir de placas de agarosa. Los clones que contenían insertos de aproximadamente 4 kb se aislaron. La digestión con endonucleasas de restricción, la hibridación a sondas oligodesoxinucleotídicas específicas y el análisis de la secuencia parcial demostraban que uno de estos ("A13") incluía el extremo 5' del mensajero de 5,1 kb, mientras que el otro ("B44") se extendía hasta el extremo 3'.

Por lo tanto, estos insertos se solapan en aproximadamente 3 kb, incluyendo un sitio de enzima de restricción EcoRI único. La sección 5' incompleta de A13 se cortó con EcoRI y NheI y se reemplazó por el segmento completo aislado de B44 mediante digestión con EcoRI y XbaI. Ambos trozos se purificaron mediante electroforesis en gel en agarosa de bajo punto de fusión antes de ligarse entre sí con DNA ligasa de T4 para producir un vector ("PGC3") que contenía 5,1 kb de DNA que codifica toda la proteína precursora de C3.

Las secuencias conectoras 5' con la región de codificación de C3 contenían dos ATG's que eran sitios de iniciación de la traducción falsos potenciales. Estos se retiraron por lo tanto mediante mutagénesis de plásmidos con huecos, según se describe en el método del ejemplo 1, usando un PL-ATC-3 oligodesoxinucleotídico (tagggagacc ggaagcttgc cctctccctc tgtccctctg t) que perdía aproximadamente 50 pares de bases del DNA conector/adaptador, sin alterar la secuencia de codificación de C3. Este vector mutado, 7,7 kb, que contiene 5,1 kb de secuencia de cDNA de C3 más 2,6 kb de secuencia del vector PGEM4 (Promega), se denomina PC3.

La región de codificación de C3 del plásmido PGC3 se sometió a secuenciación completamente y revelaba sólo cuatro diferencias con respecto a una secuencia de cDNA de C3 humana (alelo "S") previamente publicada [2].

(i) los cambios C2481\rightarrowG y C2805\rightarrowT no alteran la codificación;

(ii) T1001\rightarrowC codifica la forma polimórfica HAV 4-1-(Leucina314\rightarrowProlina) descrita previamente [20]; y

(iii) G2716\rightarrowA codifica Valina886\rightarrowIsoleucina, que no se ha presentado previamente en C3 humana, aunque se encuentra Ile en esta posición en C3 de ratón y rata.

La presente secuencia incluye codones de inicio y detención, con una secuencia de señal completa y, por lo tanto, debe codificar C3 funcional.

Se han detectado mediante ELISA niveles de hasta 1,7 \mug/ml de C3 de tipo salvaje expresada en sobrenadantes de cultivo de células COS-1 (transfectadas usando lipofectamina y el vector de expresión pcDNA3 (Invitrogen)). No se produjo C3 detectable mediante células transfectadas con vector pcDNA3 solo. Por otra parte, el análisis del producto expresado mediante reacciones de segmentación seguido por inmunoprecipitación, SDS-PAGE e inmunotransferencia demostraba que:

(i) el producto de traducción primario se ha procesado correctamente en la forma bicatenaria madura;

(ii) este producto era, como la C3 natural, segmentable hasta C3b mediante convertasa C3 (CVFBb); y

(iii) la proteína expresada no era, como la C3 natural, segmentable mediante factor H más I, pero se hacía segmentable después de la conversión en C3b mediante la enzima convertasa C3. Esto confirma que el presente plásmido de partida puede traducirse en C3 funcional.

Para una descripción alternativa de una construcción y la expresión de una secuencia que codifica C3, véase la referencia [25].

Ejemplo 1 Producción de C3 que tiene los residuos de arginina en ambos sitios de segmentación de factor I (posiciones de aminoácido 1303 y 1320) convertidos en residuos de glutamina para evitar la segmentación del fragmento C3b mediante factor I a) Mutagénesis

Los oligodesoxinucleótidos mutagénicos usados eran QRI1 (caactgcccagccaaagctccaagatcacc), QRI2 (gccagcctcct
gcaatcagaagagaccaag) y AFL4149 (taataaattcgaccttaaggtcaccataaaac), así como los correspondientes oligodesoxinucleótidos antisentido QRI1n (ggtgatcttggagctttggctgggcagttg), QRI2n (cttggtctcttctgattgcaggaggctggc) y AFL149n (gttttatggtgaccttaaggtcgaatttatta).

QRI1 y QRI1n especifican la substitución de arginina por glutamina en el sitio de segmentación del factor I en el residuo de aminoácido 1303 en la secuencia precursora de C3 (cambiando G3968C3969 por AA en la secuencia de cDNA) y QRI2 y QRI2n efectúan la misma substitución en el sitio de segmentación del factor en el residuo de aminoácido 1320 (cambiando el nucleótido G4019 por A).

AFL4149 y AFL4149n introducen un sitio de segmentación para la endonucleasa de restricción AflII en la posición 4149 en la secuencia de cDNA (cambiando C4149 por T) sin alterar la secuencia de aminoácidos codificada. Estos dos cebadores se usaron como marcadores, permitiendo que se identificara una mutagénesis satisfactoria sobre la base de la segmentación del producto de DNA mediante AflII.

La mutagénesis se efectuó usando el método del "plásmido con huecos". Una partida de PGC3 ("UPGC3"), enriquecida en uridina en lugar de timidina, se preparó mediante crecimiento en la cepa de E. Coli CJ236 en presencia de 0,25 \mug/ml de uridina. Este plásmido se digirió con SmaI y el producto de 7,2 kb ("US1") se purificó en gel de agarosa para retirar un fragmento de 0,5 kb de la secuencia de C3 (residuos 1463-1947). El otro componente del plásmido con huecos ("DN2") se preparó digiriendo PGC3 con DraIII más NaeI y purificando el trozo de 5,1 kb dos veces mediante electroforesis en gel de agarosa. Se mezclaron 200 ng de DN2 con aproximadamente 500 ng de US1 en 50 \mul de H_{2}O, se calentaron hasta 100ºC y se enfriaron lentamente hasta por debajo de 50ºC, antes de añadir de 20 \mul a 25 \mul de tampón 2XT7 (Tris/HCl 100 mM/pH 7,4/MgCl_{2} 14 mM, NaCl 100 mM, ditiotreitol 2 mM y 1 mM de cada uno de ATP, dATP, dCTP, dTTP y dGTP) más 10 nmol de cada cebador mutagénico fosforilado en 5' (una reacción usaba QRI1, QRI2 más AFL4149, otra reacción usaba QRI1n, QRI2n más AFL4149n). Las mezclas se volvieron a calentar hasta 70ºC durante 5 minutos y se enfriaron lentamente (durante 30-60 minutos) hasta 20ºC. A 0ºC, se añadieron 10 unidades de DNA polimerasa de T7 más 80 unidades de DNA ligasa de T4. La mezcla (volumen total 50 \mul) se incubó en primer lugar a 0ºC, durante 5 minutos, a continuación a temperatura ambiente durante 5 minutos y finalmente a 37ºC durante 3 horas. Se usó 1 \mul de cada mezcla para transformar 100 \mul de E. Coli XL1 supercompetente (Stratagene) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Las colonias resistentes a ampicilina se rastrearon con respecto a la segmentación con AflII y los mutantes satisfactorios se hicieron crecer en cultivos de 100 ml a partir de los cuales los plásmidos se aislaban y se sometían a secuenciación (usando un cebador de secuenciación C3pa-3876, cttcatggtgttccaagcct, que se ajusta a los nucleótidos 3876-3895 de cDNA de C3) para caracterizar mutaciones en los sitios de segmentación del factor I.

Para un procedimiento alternativo para la mutagénesis de "plásmidos con huecos", véanse las referencias [26, 27].

b) Transferencia de DNA mutante a vector de expresión eucariótico

Los fragmentos que codifican C3 de plásmidos mutantes se cortaron mediante digestión doble con HindIII y NaeI. También se incluyó DraI para incapacitar el plásmido residual. La secuencia que codifica C3 se purificó en gel de agarosa y se ligó en vector pcDNA3 (Invitrogen) que se había linealizado con enzimas HindIII y EcoRV y desfosforilado con fosforilasa intestinal de ternero. Se usaron mezclas de ligación para transformar E. coli XL1 supercompetentes, que a continuación se cultivaron en placa sobre placas de cultivo que contenían ampicilina.

Una selección aleatoria (tres o cuatro) de colonias resistentes a ampicilina se hizo crecer en cultivos de 2-3 ml y se realizó el aislamiento a pequeña escala del DNA plasmídico. Los plásmidos que contenían el inserto correcto se identificaron mediante digestión del DNA plasmídico con nucleasas de restricción EcoRI, HindIII y AflII. Las colonias correspondientes crecían en cultivos de 100 ml y los plásmidos se purificaban mediante el procedimiento estándar. Estos mutantes se construyeron originalmente a partir de PGC3 y así retenían los dos ATG's 5' a la región de codificación. Esta región (más las 3 kb 5' de la secuencia que codifica C3) se cortó por lo tanto con HindIII más EcoRI y se recolocó mediante ligación del mismo segmento cortado de PC3. Estos vectores reconstruidos se prepararon mediante el procedimiento estándar y se usaron para la transfección de células COS.

c) Expresión de C3's de tipo salvaje y mutante

Mutantes y C3 de tipo salvaje se expresaron transitoriamente a partir de plásmidos transfectados en células COS-1 usando lipofectamine® (GIBCO) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Típicamente, 1-1,5 x 10^{5} células por pocillo de una placa de cultivo de 6 pocillos estándar se transfectaron con 2-4 \mug de plásmido usando 9 ml de reactivo de lipofectamine. Los sobrenadantes se ensayaron con respecto a la secreción de C3 y se obtuvieron rendimientos típicos de 0,3-1,7 \mug por ml de sobrenadante 3-6 días después de la transfección.

Resultados a) Generación de mutantes

Los siguientes mutantes, nombrados de acuerdo con las secuencias oligodesoxinucleotídicas mutagénicas que se habían incorporado, se han aislado hasta ahora:

(i) 3 mutantes con mutaciones tanto QRI1 como QRI2 más AFL4149: C3M-26, C3M-58 y C3M-61;

(ii) 1 mutante con QRI1 y QRI2 pero sin AFL4149: C3M-8; y

(iii) 1 mutante con QRI2 y AFL4149 pero sin QRI1: C3M-51 (usado en el ejemplo 3)

b) Convalidación de que los efectos funcionales se debían a las mutaciones introducidas específicamente en los sitios de segmentación del factor I

La secuenciación ha confirmado la ausencia de otras alteraciones en 178-350 bases alrededor de la región mutada de cada mutante. La secuencia de un mutante producido mediante este procedimiento, C3M-51 (véase el ejemplo 3), se ha analizado a través de todo el "hueco" (bases 2463-5067) usado en la mutagénesis y no se encontraron otras desviaciones de la secuencia de tipo salvaje.

Por otra parte, la secuenciación representativa de un total de 2922 bases de todos los mutantes no ha revelado mutaciones de punto simple que podrían haber sido provocadas por errores mediados por polimerasa. Los mutantes expresados presentaban todos la estructura bicatenaria y la segmentación por convertasas C3 característica de C3 natural. En resumen, es improbable que los mutantes usados contengan cambios no deseados aunque no se hayan vuelto a someter a secuenciación completamente.

Ejemplo 2 Producción de C3 que tiene el residuo de arginina en un sitio de segmentación de factor I (posición del aminoácido 1303) convertido en un residuo de glutamina

Se siguió el procedimiento del Ejemplo 1, excepto que solo se usaron en la mutagénesis oligodesoxinucleótidos mutagénicos AFL4149 más QRI1 o AFL4149n más QRI1n (es decir ni QRI2 ni QRI2n).

Resultados a) Mutantes obtenidos

Se aislaron 2 mutantes con QRI1 y AFL4149 pero sin QRI2: -C3M-I23,27. Se expresó el mutante C3M-I23, según se describe en el Ejemplo 1.

Esta proteína se segmentó mediante CVFBb. El producto similar a C3b era relativamente (en comparación con el tipo salvaje) resistente a la segmentación en la posición 1303 mediante factores I y H, pero todavía podía segmentarse en la posición 1320. Este derivado de C3b es por lo tanto parcialmente resistente a factor I.

Ejemplo 3 Producción de C3 que tiene el residuo de arginina en un sitio de segmentación de factor I (posición del aminoácido 1320) convertido en un residuo de glutamina

Se siguió el procedimiento del Ejemplo 1, excepto que solo se usaron en la mutagénesis oligodesoxinucleótidos mutagénicos AFL4149 más QRI2 o AFL4149n más QRI2n (es decir, ni QRI1 ni QRI1n). Además, el método usado en el Ejemplo 1 también daba un mutante con QRI2 y AFL4149, pero sin QRI1.

Resultados a) Mutantes obtenidos

Se aislaron 3 mutantes con QRI2 y AFL4149 pero sin QRI1: -C3M-51, C3M-Q2, C3M-Q13. Se expresó el mutante C3M-51, como se describe en el Ejemplo 1. Esta proteína era segmentable mediante CVFBb. El producto similar a C3b no se segmentaba fácilmente en la posición 1320 mediante los factores I y H, pero todavía podía segmentarse en la posición 1303. Este derivado de C3b es por lo tanto parcialmente resistente a factor I.

Ejemplo 4 Análisis de los efectos funcionales de las mutaciones

Los sobrenadantes (100-400 \mul) de células COS transfectadas se incubaron a 37ºC durante 2 h con:

células COS se transfectaron con pcDNA3 que tenía los insertos de:

1)

\;

\;

\;

\;

\;

la secuencia de C3 no mutada;

2)

\;

\;

\;

\;

\;

mutante C3M-I23 (que codifica Arg^{103}\rightarrowGln);

3)

\;

\;

\;

\;

\;

mutante C3M-26 (que codifica Arg^{103}\rightarrowGln, Arg^{1320}\rightarrowGln);

y

4)

\;

\;

\;

\;

\;

mutante C3M-51 (que codifica Arg^{1320}\rightarrowGln).

Se pretrataron 200 \mul de los sobrenadantes de cultivo, tomados 3 días después de la transfección, con fluoruro de fenilmetanosulfonilo 2 mM (0ºC, 15 minutos) y a continuación se incubaron a 37ºC durante 2 horas con lo siguiente:

A)

\;

\;

\;

\;

\;

sin adición;

B)

\;

\;

\;

\;

\;

convertasa C3 preformada, CVFBb (10 \mul de 200 \mul que contenían 6,6 \mug de CVF, 100 \mug de factor B y 1,4 \mug de factor D en solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía MgCl_{2} 10 mM, preincubados a 37ºC, 15 minutos);

C)

\;

\;

\;

\;

\;

factores H (5 \mug) e I (1 \mug); y

D)

\;

\;

\;

\;

\;

CVFBb más factores H e I.

Estos se inmunoprecipitaron a continuación añadiendo 0,6 \mug de anti-(imunoglobulina de C3 humana) de oveja purificada por afinidad a temperatura ambiente y añadiendo después de 1 hora 20 \mul de una suspensión al 5% de células de especies de estreptococos del Grupo C fijadas con formalina lavada (proteína G) (Sigma). Después de 45 minutos a temperatura ambiente, las partículas se lavaron una vez en PBS, NaN_{3} 5 mM, y una vez en Tris/HCl 20 mM, NaCl 137 mM, Tween 20 al 0,1% (v/v), pH 7,6, antes de eluir en SDS al 1%/2-mercaptoetanol al 2% (90-100ºC, 5 minutos). Estos eluatos se separaron mediante SDS-PAGE, se sometieron a electrotransferencia sobre nitrocelulosa y las 3 bandas de C3 detectadas sondando con anti-(imunoglobulina de C3 humana) de oveja purificada por afinidad seguido por anti-(inmunoglobulina de oveja) de burro acoplada a peroxidasa de rábano picante (Sigma) y detección usando los substratos "Enhanced Chemiluminescence" suministrados por Amersham. Se muestra una fotografía de una exposición de 2 minutos a película de rayos X. Las bandas derivadas de C3 visibles están indicadas mediante flechas marcadas y las muestras individuales (1-4, A-D) son las que se acaban de describir. (La banda prominente de aproximadamente 50 kDa (entre las bandas de 46 y 68 kDa) presente en todas las muestras es la cadena pesada de la IgG usada en la inmunoprecipitación y detectada mediante la anti-(inmunoglobulina de oveja) de burro acoplada a peroxidasa de rábano picante).

Resultados (véase la Figura 3)

1. Todas las muestras no tratadas (1-A, 2-A, 3-A, 4-A) contienen bandas de la migración correcta para cadenas alfa y beta de C3, indicando que todos los mutantes se expresan y son procesados post-traduccionalmente de forma correcta. La presencia de bandas de 43 ó 46 kDa en estas muestras indica la presencia de alguna actividad similar a factor H + factor I en el medio de cultivo. La hidrólisis espontánea de C3 durante el período biosintético de 3 días produce C3i que se segmenta mediante esta actividad. En la C3 no mutada, esto genera bandas de 43 kDa y 75 kDa (la banda de 75 kDa es invisible debido a que (i) está oculta por la cadena beta de 75 kDa y (ii) el anticuerpo usado para revelar la transferencia Western tiene poca actividad hacia esta porción de la cadena alfa de C3: su presencia se confirmó subsiguientemente resondando con un anticuerpo monoclonal de rata, "Clon-3", que es específico para esta región). La adición de factores H e I sin CVFBb (1-C, 2-C, 3-C, 4-C) no segmentaba la C3 restante indicando que esta representaba C3 activa (tioléster intacto).

2. La C3 no mutada (1) se segmenta mediante CVFBb y el producto de C3b se segmenta adicionalmente mediante enzimas endógenas en 1-B o factores H e I añadidos en 1-D. La banda de 43 kDa indica segmentación en Arg^{1320} y la banda de 68 kDa (visible en exposiciones más prolongadas) indica segmentación en Arg^{1303}.

3. El mutante C3M-I23 (Arg^{1303}\rightarrowGln) se segmentó mediante CVFBb y el producto era relativamente resistente a actividad similar a factor H e I endógena (2-B), persistiendo cantidades distintas de cadena alfa' (C3b), pero todavía era segmentable cuando se añadían factor H e I adicionales (2-D). El producto de 43 kDa indica segmentación en Arg^{1320} (una banda tenue de 71 kDa que representa el otro fragmento de la cadena alfa' podría observarse en exposiciones más prolongadas) pero no estaba presente banda de 68 kDa, mostrando que este mutante es resistente a la segmentación en la Gln^{1303} mutada.

4. El mutante C3M-26 (Arg^{1303}\rightarrowGln,Arg^{1320}\rightarrowGln) se segmentó mediante CFVBb y el producto similar a C3b (alfa') era resistente a actividad similar a factor H e I endógena (3-B). También era muy resistente a los factores adicionales H e I (3-D) en comparación con la C3 no mutada (1) y otros mutantes (2 y 4). Había una cantidad pequeña de producto de 46 kDa que indicaba alguna segmentación en la Gln^{1303} mutada (el fragmento de 68 kDa adjunto también era visible en exposiciones más prolongadas). Había poco 43 kDa o era indetectable, que correspondería a cualquier segmentación en Gln^{1320}. Por lo tanto, la mutación Arg\rightarrowGln en la posición 1303 es menos eficaz que aquella en la posición 1320 al prevenir la segmentación por factor I. (Esta segmentación residual lenta también podría producirse en el mutante C3M-I23 (Arg^{1303}\rightarrowGln), pero el producto intermedio de 46 kDa probablemente está siendo rápidamente procesado hasta 43 kDa mediante segmentación adicional en la Arg^{1320} no mutada).

5. El mutante C3M-51 (Arg^{1320}\rightarrowGln) era segmentable por CVFBb y el producto se segmentó mediante actividad similar a factor H e I endógena (4-B) y mediante factor H e I adicional (4-D). El producto de 46 kDa (y una banda de 68 kDa tenue) indica segmentación en Arg^{1303}. Sin embargo, la ausencia de una banda de 43 kDa indica que no está segmentada en la Gln^{1320} mutada.

Ejemplo 5 Comparación de diversas substituciones de aminoácido en la posición 1303 1. Introducción

Los ejemplos previos describían mutaciones de arg 1303 y arg 1320 hasta residuos de glutamina. Ambas mutaciones impartían resistencia a la segmentación en esas posiciones mediante factor I. Sin embargo, había un grado pequeño pero detectable de segmentación en gln 1303. Por lo tanto, se ha realizado y probado un número de otras substituciones de aminoácidos en esta posición. La segmentación se produce, en orden decreciente de eficacia, cuando el residuo 1303 es: Arg > Tyr > [Cys o Trp] > Gln > [Glu o Gly]. Estos resultados son inesperados debido a que (i) todas las segmentaciones mediadas por factor I humano presentes en la naturaleza conocidas se producen C-terminales a residuos de arginina, de modo que se habría deducido que la enzima tenía un requerimiento de arginina; y (ii) si se segmentaba en otros residuos, podría predecirse que tendrían que ser electrostáticamente similares a arg, es decir, un residuo básico (lys o his), (por ejemplo, la tripsina se segmenta selectivamente C-terminal a arg, lys o his), de modo que no podría haberse predecido la segmentación de la substitución por tirosina.

Por lo tanto, la substitución de arg 1303 por glicina o ácido glutámico se prefiere con el propósito de crear un derivado de C3 resistente a la inactivación por factor I.

2. Métodos

2.1 Mutagénesis: el cebador mutagénico degenerado usado era:

caactgcccagc (gt) (ag) (cg) agctccaagatcacc (las letras entre paréntesis indican mezcla de bases en esa posición). Se construyeron mutantes mediante el método del plásmido con huecos (según se describe en los ejemplos previos) o mediante el "método del megacebador" (V. Picard y otros, Nuc. Acid Res 22:2587-91, (1994)), en el que el cebador aguas arriba era caccaggaactgaatctagatgtgtccctc y el cebador aguas abajo gttttatggtgaccttaaggtcgaatttatta. Todas las mutaciones se realizaron sobre plantillas en las que el DNA que codifica C3 ya se había mutado de modo que el residuo de aminoácido 1320 era glutamina y se había introducido un sitio de restricción para AflII en la posición 4149 (según se describe en los ejemplos previos) y se confirmaron mediante secuenciación de DNA.

2.2 Expresión: se expresaron mutantes en células COS usando el vector pcDNA3 según se describe en los ejemplos previos, marcado biosintéticamente con [^{35}S]metionina en medio libre de suero.

2.3 Ensayo: los sobrenadantes se tratan con CVFBb (formado mediante la reacción de CFV con factores B y D en tampón que contiene magnesio) y factores H e I seguido por inmunoprecipitación con anti-C3 y separación mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS realizada bajo condiciones reductoras (según se describe en los ejemplos previos). El gel se fijó, se trató con reactivo "Amplify" de Amersham, se secó y se expuso a película autorradiográfica para dar el resultado mostrado en la figura.

3. Resultados

La segmentación mediada por factor I en la posición 1303 (sitio 1) sin segmentación en 1320 (sitio 2) (donde se ha mutado hasta glutamina) produce bandas de 46 y 68 kDa. Puede observarse que la segmentación se produce en el orden: arg(R) > tyr(Y) > cys(C) y trp(W) > gln(Q) > gly(G) y glu(E). El tipo salvaje (arginina en ambas posiciones) se segmenta en ambas posiciones para producir fragmentos de 43 (demasiado pequeños para ser visibles sobre este gel) y 68 kDa.

4. Figura

Los resultados se muestran en la Figura 4. Los residuos en el sitio 1 (posición 1303) y el sitio 2 (1320) se indican previamente en los trazos respectivos.

Ejemplo 6 Demostración de la resistencia mejorada a la inactivación por factores I y H después de la mutación de arg 1303 por gln 1. Introducción

Los ejemplos previos demuestran que la conversión de arg 1303 o arg 1320 en glutamina hacen a ese sitio resistente a la segmentación por factor I. La mutación de ambos sitios forma una molécula que es resistente a la segmentación en cualquier sitio. Aquí, se demostró adicionalmente que la mutación de arg 1303 por gln sola (sin alteración de arg 1320) da como resultado una resistencia considerable, en comparación con el tipo salvaje, a la inactivación funcional por los factores I y H.

2. Método

2.1 Expresión: La preparación de la mutación arg 1303\rightarrowgln se describió en el ejemplo previo. Esta se transfectó en CHO (una línea celular de laboratorio común derivada de células de ovario de hámster chino) mediante el método del fosfato cálcico y los transfectantes estables se seleccionaron sobre la base de la resistencia a G418 ("Geneticin" disponible de Sigma). Los sobrenadantes de cultivo celular se recogieron y la C3 expresada se purificó parcialmente mediante precipitación con sulfato sódico (fracción de 10-20% (p/v)) y cromatografía de intercambio iónico sobre Q-sepharose y mono-Q-sepharose (A W Dodds Methods Enzymol 223: 46 (1993)).

2.2 Ensayo: Se revistieron eritrocitos de oveja con anticuerpo monoclonal SO16 (R A Harrison y P J Lachmann Handbook of Experimental Immunology 4ª Edición capítulo 39 (1986)) y 4,4 ml de una suspensión al 5% (v/v) se incubó a continuación con aproximadamente 10 \mug de C2, 24 \mug de C4 y 1 \mug de C1 (componentes humanos purificados) durante 10 minutos a 37ºC en CFD (R A Harrison y P J Lachmann, previamente). Se incubaron a continuación 0,8 ml de esta mezcla durante 105 minutos con 0,25 ml que contenían el mutante semipurificado o C3 de tipo salvaje y EDTA hasta una concentración final de 12,5 mM. Las células se lavaron a continuación en CFD y se usaron en CFD que contenía gelatina al 0,1% (p/v) (CFD-gel). La unión del radioligando con el anticuerpo anti-C3 monoclonal clon 4 marcado con [^{125}I] se usó para confirmar que se depositaban cantidades similares de C3b de tipo salvaje o
mutante.

Para el ensayo, se diluyeron 40 \mul de una suspensión al 5% de células en 250 \mul de CFD-gel y se incubaron partes alícuotas de 50 \mul con 50 \mul de diluciones que contenían CFD-gel de factores I y H hasta concentraciones finales de 100, 10, 1 y 0 \mug/ml cada una, a 37ºC durante 10 minutos. Se añadieron a continuación 0,9 ml de CFD, las células se nodulizaron mediante centrifugación y se lavaron dos veces más con 1 ml de CFD cada vez. Las células se resuspendieron a continuación en 100 \mul de CFD-gel que contenían 100 \mug/ml de factor B, 100 \mug/ml de properdina, 1 \mug/ml de factor D y NiCl_{2} 0,3 mM. Después de 10 minutos a 37ºC, se añadieron 0,9 ml de CFD que contenía EDTA 10 mM y suero de cobaya normal al 2% (v/v). Después de 30 minutos más a 37ºC, las células no sometidas a lisis se nodulizaron mediante centrifugación y el grado de lisis se determinó midiendo la absorbancia del sobrenadante a 412 mm. El equivalente de absorbancia a 100% de lisis se determinó a partir de una parte alícuota de células sometidas a lisis en agua y de ahí se calculó el porcentaje de lisis.

Este ensayo mide la capacidad de C3b depositada para formar una convertasa C3bBbP funcional. La conversión en iC3b evita la formación de convertasa y la lisis subsiguiente en suero/EDTA.

3. Resultados

El resultado mostrado en la figura indica que se requiere más de diez veces más factor I y factor H para suprimir la actividad hemolítica del mutante arg 1303\rightarrowgln, cuando se compara con el tipo salvaje. Por lo tanto, esta mutación es ventajosa para la creación de un derivado de C3 cuyo producto C3b es resistente a la inactivación por factores H e I. El efecto podría deberse a la mayor resistencia a la segmentación en la posición 1303 (cuando la arg se muta por gln) o a una mayor resistencia a la segmentación en la posición 1320 cuando la segmentación puede tener lugar en primer lugar en la posición 1303.

4. Figura

Los resultados se muestran en la Figura 5. El eje x indica la concentración de factores H e I. Q1 representa la mutación arg 1303\rightarrowgln. El % de lisis se mide como se describe en los métodos.

Análisis

Las características esenciales de C3 humana, con respecto a variantes modificadas descritas aquí, son como sigue:

(i) La molécula tiene un derivado funcionalmente similar a C3b ya que puede combinarse con factor B humano funcionalmente activo, que a continuación puede ser segmentado por factor D humano para formar una enzima capaz de segmentar C3 humana.

(ii) Las secuencias de aminoácidos de los derivados son más homólogas a C3 de seres humanos que a C3 de cualquier otra especie para la que se conoce actualmente una secuencia, o a cualquier otra secuencia proteínica actualmente conocida. Características estructurales de C3 presentes en proteína de tipo salvaje, pero no necesariamente en derivados modificados, incluyen las siguientes:

(a) La secuencia que codifica DNA y la secuencia proteínica traducida para la variante de C3 humana usada en los ejemplos de la invención descritos aquí se dan en las Figuras 2 y 1, respectivamente. Esta secuencia proteínica difiere de la secuencia publicada [2] en solo dos aminoácidos (los detalles se dan en los ejemplos). Se supone que muchas variaciones son compatibles con la función de C3, aun cuando la mayoría no estará presente en la población.

(b) El producto de traducción primario se procesa proteolíticamente en dos cadenas conectadas por disulfuro, alfa (residuos 672-1663) y beta (residuos 23-667), con la retirada de la secuencia de señal (residuos 1-22).

(c) La proteína madura contiene un enlace tioléster entre los residuos Cys1010 y Gln1013.

(d) La convertasa C3 segmenta C3 para retirar C3a (residuos 672-748). Esta reacción es seguida por la rotura del enlace tioléster.

(e) En presencia de factor H, el factor I segmenta C3b entre los residuos Arg1303 y Ser1304, y entre Arg1320 y Ser1321.

Modificaciones realizadas en la molécula de C3 natural Substitución de Arg1303 por Gln

Esta modificación es en un sitio de segmentación de C3b por factor I. El efecto es reducir la velocidad de segmentación por factor I en esta posición. El cambio por glutamina se seleccionó para retirar la carga positiva de la arginina, que es probable que sea importante para la actividad de serina proteasa del factor I, mientras que retiene un carácter hidrófobo y un tamaño de cadena lateral similar que debe minimizar cualesquiera interrupciones en la estructura terciaria de la proteína. Una evidencia que apoya esta suposición es que la mutación no evitaba el procesamiento en una estructura bicatenaria, la formación de un tioléster o la segmentación de C3 por convertasa C3. La mutación de Arg1303 por otro aminoácido puede alcanzar un efecto similar o incluso superior, según se demuestra en el Ejemplo 5.

También es posible reducir esta segmentación mutando Ser1304 (la otra cara del sitio de segmentación) u otros residuos implicados en la interacción enzima-substrato.

Substitución de Arg1320 por Gln

Esta modificación es en el otro sitio de segmentación de C3b por factor I. El efecto es reducir drásticamente (virtualmente suprimir) la velocidad de segmentación por factor I en esta posición. El cambio por glutamina se realizó con los mismos criterios descritos previamente y esta mutación tampoco evitaba el procesamiento en una estructura bicatenaria, la formación de un tioléster o la segmentación de C3 por convertasa C3. De nuevo, la mutación por otro aminoácido puede alcanzar el mismo efecto, como también la mutación de Ser1321 u otros residuos implicados en la interacción enzima-substrato.

Cuando están en combinación, las dos mutaciones, Arg1303-Gln y Arg1320-Gln, protegen la C3b de la inactivación y de ahí mantienen su capacidad para formar parte de una convertasa C3bBb activa. También podrían usarse otras mutaciones (incluyendo combinaciones de mutaciones) que suprimen ambas reacciones de segmentación (por ejemplo Arg 1303 Glu o Arg 1303 Gly podrían usarse en combinación con Arg 1320 Gln).

Ejemplo 7 Diversas mutaciones que reducen la interacción de C3b/C3 con factor H 7.1 Introducción

Otros laboratorios han producido una evidencia basada en los efectos de péptidos sintéticos (Ganu, V.S. y Muller-Eberhard, H.J., 1985, Complement 2:27; Becherer, J.D. y otros, 1992, Biochemistry 31: 1787-1794), o la mutagénesis limitada (Taniguchi-Sidle, A. e Isenman, D.E., 1994 J. Immunol. 153: 5285-5302) para sugerir que los residuos 752-761 en la secuencia primaria del transcrito C3 (véase la figura 1) podían estar implicados en la interacción con factor H. Sin embargo, otra evidencia publicada sugiere que solo los residuos 777-776 están implicados en la interacción con factor H, mientras que los residuos 752-761 son importantes para la interacción con factor B (Fishelson, 1991, Mol. Immunol. 28:545-552). Se conjeturó que una mutagénesis más extensiva de esta región podía reducir la afinidad para factor H y por lo tanto ser deseable para el objetivo de crear un derivado de C3 que fuera resistente a factor H. Por otra parte, se supuso que los residuos importantes para mutar podrían ser los residuos ácidos prominentes (ácidos aspártico y glutámico) y que sería deseable cambiarlos por residuos neutros menos propensos a mediar interacciones fuertes. En este ejemplo, se cambió el residuo 752-754 de Asp-Glu-Asp por Gly-Ser-Gly, en combinación con cambiar los residuos 758-760 de Glu-Glu-Asn por Gly-Ser-Gly. El producto presentado producía las características de segmentación de acuerdo con una reducción en la susceptibilidad a factor H. Esto proporciona una evidencia de que C3 puede modificarse para reducir la unión de factor H y de ahí la susceptibilidad a factores H e I. Estas modificaciones son deseables para la creación de una convertasa C3 que es estable bajo condiciones fisiológicas.

7.2 Método

Los métodos de mutagénesis, expresión y análisis se han descrito en los ejemplos previos. El oligonucleótido mutagénico que se sintetizaba tenía la secuencia:

agtaacctgggttcgggcatcattgcaggatcgggcatcgtttcc.

7.3 Resultados

Los resultados de las reacciones de segmentación se muestran en la Figura 6. Estos indican que:

1. La adición de CVFBb a C3 de tipo salvaje daba como resultado la eliminación de la cadena alfa (trazo 2) debido a que la C3b que se forma es susceptible a las bajas concentraciones de factor I y H en el sobrenadante de cultivo. C3i que se habría formado durante la expresión o esta incubación subsiguiente se ha roto hasta iC3i del mismo modo. La adición de factores I y H exógenos (trazos 3 y 4) por lo tanto no es diferente de los trazos 1 y 2, respectivamente, debido a que el propio medio contiene suficiente actividad de factor H e I para efectuar la segmentación completa.

2. En contraste, el tratamiento de la C3 mutante con CVFBb (trazo 6) no da como resultado la desaparición de la cadena alfa. Existe alguna generación de alfa', correspondiente a C3b, pero algo o todo de esta permanece, indicando que la persistencia de la cadena alfa no es meramente el resultado de un fallo de segmentación por CVFBb. La cadena alfa no segmentada restante en el trazo 2 puede no presentar por lo tanto C3i que no se ha segmentado por las actividades endógenas de factores H e I, aunque también es posible que algo de esta represente C3 natural que persiste si el mutante ha adquirido una resistencia parcial a CVFBb. La adición de altas concentraciones de factores H e I exógenos (trazos 7 y 8) produce el agotamiento de cadenas alfa y alfa', indicando que (i) el mutante no es completamente resistente a estos factores y (ii) la cadena alfa no segmentada por CFVBb en el trazo 2 se deriva predominantemente a partir de C3i (que es segmentable por factores H e I pero no por CVFBb) en vez de a partir de C3 natural (que es segmentable por CFVBb pero no por factores H e I). Sin embargo, no toda la cadena alfa se segmenta, incluso en el trazo 8, probablemente debido a la resistencia a factores H e I.

Por lo tanto, la mutación de los residuos 752-754 y los residuos 758-760 puede generar una molécula de C3 que todavía puede ser segmentada por convertasas C3, pero es parcialmente resistente a las acciones de factores H e I. En vista de otros datos publicados, esto se debe lo más probablemente a que las mutaciones han modificado una región que está implicada en la interacción con factor H y de ahí han dado como resultado una afinidad reducida para factor H.

Ejemplo 8 Un sitio en C3 que puede mutarse para modificar la interacción de C3i con factor B 8.1 Introducción

Los ejemplos previos han demostrado que las mutaciones en C3 pueden modular las interacciones con factores H e I. Para descubrir otros sitios en C3 que podrían interactuar con factor B, se compararon las secuencias conocidas de moléculas de C3 de diferentes especies, así como con secuencias disponibles para C4 y otras proteínas homólogas. Se identificó la región correspondiente a los residuos 1427-1433 de C3 humana que podían estar implicados en funciones específicas de C3 y C4. Esto podría incluir interacciones con factor B (o su homólogo, C2, en el caso de C4) pero no necesariamente, debido a que otras funciones potenciales incluyen formación del tioléster, conversión en C3b (o forma C4b), interacción con substrato C3 y/o C5 en actividad de convertasa e interacción con factor I y sus cofactores. Por lo tanto, residuos seleccionados se mutaron por los residuos correspondientes (basándose en alineamientos de secuencia) encontrados en otra proteína homóloga, en este caso C5 humana. Así, el residuo 1427 se cambió de una Arg a una Gln, el residuo 1431 de una Lys a Asp y el residuo 1433 de una Glu a una Gln. Se encontró que el mutante resultante era susceptible a segmentación por convertasa C3 (CVFBb) y el producto C3b era segmentable por factores H e I. Sin embargo, este mutante no apoyaba la conversión de factor B en Bb más Ba, que depende de la unión de factor B a C3i (o C3b). Por lo tanto, se tiene la evidencia de que la mutación de esta región ha disminuido la interacción con factor B. Aunque esto no es deseable para la generación de una convertasa C3 superactiva, proporciona una indicación de que estas modificaciones en esta región de C3 también alterarían la interacción con factor B, y algunas de estas probablemente incrementarán la afinidad. Como consecuencia, tales mutaciones también pueden incrementar la estabilidad y la actividad de la enzima convertasa bimolecular, C3bBb (o C3iBb).

8.2 Métodos

Los alineamientos mostrados en la Tabla 1 ilustran más adelante por qué se considera que esta región era un candidato para la mutagénesis. Se conjeturó que los caracteres de ciertos residuos estaban bien conservados en C3 y C4 pero eran claramente diferentes en las otras proteínas. Los residuos 1427, 1431 y 1433 se seleccionaron debido a que su naturaleza cargada podría ser indicativa de grupos implicados en interacciones proteína-proteína. Los cambios se realizaron en los residuos correspondientes en C5 humana debido a que estos presentaban propiedades electrostáticas muy diferentes, pero dentro del contexto de algunos otros residuos conservados que podrían indicar una estructura local similar.

TABLA 1 Alineamientos de secuencias de C3 y moléculas relacionadas para la región de residuos 1427-1435 de C3 humana

1

Los métodos de mutagénesis, expresión y análisis de reacciones de segmentación de C3 eran como los descritos en los ejemplos previos (Ejemplos 1-4). El oligonucleótido mutagénico se sintetizó con la secuencia:

tggtgttgaccaatacatctccgactatcagctggacaa.

Ensayo para la renovación de factor B

El producto expresado se purificó del medio de células COS mediante purificación por afinidad sobre una columna de Clon-3-Sepharose según se describe en el Ejemplo 9. Este método da como resultado una conversión considerable de la forma rota del tioléster, C3i. Se aisló C3 de tipo salvaje mediante el mismo procedimiento. Las diluciones de la C3 de tipo salvaje (1/5, 1/25 y 1/125) se efectuaron sobre un gel de SDS-PAGE (condiciones reductoras) junto con la C3 mutante, y la tinción con plata indicaba que el mutante estaba presente en una concentración equivalente a ligeramente menos que el 1/25 pero mucho mayor que la dilución 1/125 del tipo salvaje. Las mismas diluciones se usaron en el ensayo de renovación de factor B. Se incubaron 5 \mul de estas C3's con 25 \mul de CFD-G que contenía 5 \mug/ml de factor D y aproximadamente 1,6 \mug/ml de factor B marcado con ^{125}I (aproximadamente 1000-2000 dpm/\mul) durante 3 h a 37ºC. Las muestras se analizaron a continuación mediante SDS-PAGE (condiciones reductoras) con autorradiografía del gel secado. Los resultados se muestran en la Figura 7.

8.3 Resultados

Según se muestra en la Figura 7, la segmentación clara de factor B se produce incluso con una dilución 1/25 de la C3 de tipo salvaje (C3i). En contraste, no se observó segmentación significativa en presencia de la C3 mutante, incluso no diluida, que debe estar a una concentración superior que la muestra 1/125 del tipo salvaje.

Por lo tanto, este mutante parece tener una capacidad deteriorada para apoyar la segmentación de factor B, lo más probablemente debido a una reducción en su afinidad de unión para factor B. Por lo tanto, esta es una región de C3 que puede mutarse para modular la interacción entre C3i (o C3b) y factor B y quizás también la estabilidad de la convertasa (C3iBb o C3bBb).

Ejemplo 9 Purificación de moléculas de C3 mutantes expresadas 9.1 Introducción

Este ejemplo demuestra cómo las moléculas de C3 mutantes pueden aislarse de un medio de expresión, tal como el medio de cultivo de células eucarióticas transfectadas. Mediante purificación por afinidad simple, las moléculas de C3 se obtienen con pureza suficiente para pruebas funcionales y para la conjugación a anticuerpo mediante el método descrito en el Ejemplo 10. Aunque la elución de un anticuerpo está acompañada por la hidrólisis de una proporción considerable del tioléster interno, el producto C3i todavía es un precursor adecuado para la generación de una convertasa C3 activa, así como para la producción de conjugados de C3i-anticuerpo. También es probable que este sistema sea útil como parte de la preparación requerida para el uso in vivo.

9.2 Método Purificación por afinidad sobre Clon-3-Sepharose

El Clon-3 es un anticuerpo monoclonal de rata que es específico para C3 y sus derivados, incluyendo C3b y C3i (Lachmann, P.J. y otros, 1980, J. Immunol. 41:503-515). Están disponibles otros anticuerpos monoclonales contra C3 y en algunos casos se han usado satisfactoriamente para aislar C3 de pequeñas cantidades de plasma humano (Dodds, A.W., 1993, Methods Enzymol. 223:46-61) y por lo tanto también son propensos a ser aplicables para el aislamiento de moléculas expresadas ex vivo. La fracción de IgG se acopló a Sepharose CL-4B usando bromuro de cianógeno (la metodología puede encontrarse en Harrison y Lachmann, 1986, Handbook of Experimental Immunology, 4ª edición, Ed.s Weir, Herzenberg, Blackwell and Herzenberg; Blackwell, Oxford). Los sobrenadantes de cultivo se hicieron pasar directamente a través de una columna de esta resina (recirculada) o en primer lugar se concentraron mediante precipitación con Na_{2}SO_{4} al 25% (p/v) y resolubilización y diálisis en PBS, NaN_{3} 5 mM. La columna se lava a continuación satisfactoriamente con (i) PBS, NaN_{3} 5 mM y (ii) PBS que contiene NaCl 1 M. La C3 unida se eluye con tampón de borato Na 50 mM, pH 10,5, y se neutraliza inmediatamente mediante la recogida de fracciones de 0,9 ml en 0,1 ml de Tris/HCl 1 M, pH 7. El material se dializa a continuación en PBS, NaN_{3} 5
mM.

Preparación de C3 que tiene una "Etiqueta de His"

Una "Etiqueta de His" es una hebra de residuos de histidina que presenta afinidad para columnas que tienen iones níquel. Este método se ha empleado para ayudar al aislamiento de proteínas expresadas. Se cree que esto podría ser útil para el aislamiento de moléculas de C3 mutante expresadas de modo que se ha usado mutagénesis de inserción para generar un plásmido que codifica C3 con una cola de 6 residuos de histidina en el extremo carboxi (inmediatamente carboxiterminal al residuo 1663). Esta localización para la etiqueta de His se seleccionó a fin de minimizar la interferencia con la síntesis, el plegamiento, el procesamiento y la formación de enlaces disulfuro de la C3 naciente. El residuo 1661 es un residuo de cisteína que está implicado en un enlace disulfuro con un residuo previo en la secuencia (probablemente Cys 1537; Dolmer, K. y Sottrup-Jensen, L., 1993, FEBS-Lett 315: 85-90) y por lo tanto parece prudente realizar la inserción más allá de esta secuencia característica estructural. La mutación se introdujo usando la técnica del "plásmido con huecos" usada en el Ejemplo 1, usando el oligonucleótido mutagénico sintetizado con la secuencia:

tgggtgccccaaccatcatcatcatcatcattgaccacaccccc.

La incorporación de la secuencia correcta se confirmó mediante secuenciación de DNA. Esta secuencia de DNA puede transferirse ahora a un vector de expresión. Después de la transfección de células eucarióticas, debe ser posible aislar la C3 expresada mediante afinidad para una columna que tiene iones níquel, o mediante cualquier otra matriz con afinidad específica para la "Etiqueta de His".

9.3 Resultados

Un número de C3 mutantes se ha purificado sobre el Clon-3-Sepharose, incluyendo las descritas en los Ejemplos 1 y 2 expresadas en células CHO. Los productos retenían la capacidad de apoyar la segmentación de factor B por factor D. Se usó el mismo método para aislar el mutante descrito en el Ejemplo B2, expresado en células COS. La tinción con plata de geles de SDS-PAGE indicaba que los productos aislados no eran 100% puros, sino que a menudo parecían ser mayores que o iguales a 50% puros. Esto viene de materiales de partida que contienen generalmente menos de 10 \mug/ml de C3 en suero de ternero fetal al 10% (v/v) más otras proteínas celulares. Además, las C3's no se degradaban durante el aislamiento y la actividad de factor H e I endógena parecía haberse eliminado.

La purificación en virtud de la "Etiqueta de His" implica condiciones de elución más suaves de una columna que tiene iones níquel. Por ejemplo, se ha usado EDTA. La aplicación de este método a C3 debe permitir por lo tanto el aislamiento sin ruptura del enlace tioléster interno.

Ejemplo 10 Conjugación de C3i a anticuerpo y uso para orientar la actividad de convertasa C3 contra una célula particular 10.1 Introducción

Un aspecto de la invención es que las convertasas C3 estables derivadas de moléculas de C3 mutantes provocarán una conversión de C3 mejorada que, si se localiza en un sitio diana particular, promoverá el ataque dependiente del complemento de esa diana. El sistema favorable para orientar la respuesta es acoplar la molécula de C3 mutante, como el derivado C3i o C3b, a un anticuerpo específico para la diana deseada. En este ejemplo, se demuestra una metodología de trabajo para la formación de tales conjugados, que es aplicable a moléculas de C3i o C3b mutantes y puede usarse sobre material purificado por afinidad de un sistema de expresión, incluso si el tioléster de C3 se ha roto en el procedimiento. Acoplando C3i a un anticuerpo que se une específicamente a eritrocitos de oveja, se muestra adicionalmente que el conjugado fija C3i a la superficie de los eritroticos de modo que puede formarse una convertasa, C3iBbP, que inicia la lisis de estas células cuando se suministran otros componentes del complemento en la forma de suero de cobaya normal (en EDTA para evitar la formación de novo de convertasas C3). De ahí que la conjugación a anticuerpo pueda usarse para orientar una molécula de C3i para iniciar el ataque dependiente del complemento de un tipo de célula particular. Este ejemplo usa C3i de tipo salvaje, procedente de plasma humano, que forma una convertasa C3 in vitro. In vivo, C3i y C3b de tipo salvaje son rotas por el factor H e I. Por lo tanto, una C3 mutante, construida de acuerdo con los planes de esta patente para ser resistente a factores H e I y por lo tanto formar una convertasa C3 estable, sería ventajosa en un contexto fisiológico.

10.2 Método (i) Generación y purificación de conjugado de C3i-anticuerpo

El anticuerpo usado era la fracción de IgG aislada de un antisuero anti-(eritrocito de oveja) de conejo policlonal. Se incubaron 1,1 mg con 75 nmol de SPDP en tampón de conjugación, pH 7,5 (KH_{2}PO_{4} 20 mM, Na_{2}HPO_{4} 60 mM, NaCl 0,12 M) durante 2 horas a temperatura ambiente. El PDP-IgG se purificó mediante filtración en gel sobre una columna Superose-6 (Pharmacia) (en un tampón de fosfato, pH 7,4, que contenía NaCl 0,5 M). La reducción de una muestra con ditiotreitol se usó para estimar cuatro grupos de PDP acoplados por molécula de IgG. Se preparó C3i mediante el tratamiento de C3 purificada con metilamina 0,1 M, pH 7,2 (2 h a 37ºC). Se retiró metilamina en exceso mediante filtración en gel seguido por diálisis en tampón de conjugación. Se mezclaron 18 nmol de C3i con 1,7 nmol de PDP-IgG en 1,26 ml de tampón de conjugación y se incubaron durante 1 día a temperatura ambiente seguido por 1,5 días a 4ºC. La Figura 8 muestra un gel de SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie de la mezcla de reacción de conjugación que muestra la aparición de una especie de aproximadamente 350 kDa que no estaba presente en PDP-IgG o C3i. Esta especie se purificó parcialmente mediante filtración en gel en la columna Superose-6 en un tampón de fosfato, pH 7,4, que contenía NaCl 0,5 M, y a continuación se dializó en PBS. Se eluía antes de la C3, en un volumen a partir del cual podía estimarse un peso molecular de 300-400 kDa mediante calibración con patrones del peso molecular globulares. Las concentraciones de conjugado, anticuerpo libre y C3 no acopladas se estimaron a partir de un gel de SDS-PAGE teñido con Coomassie (condiciones no reductoras). La SDS-PAGE bidimensional (primera dimensión no reducida, segunda dimensión reducida) revelaba un patrón compatible con un conjugado 1:1 entre IgG y C3i.

(ii) Demostración de que el conjugado C3-anticuerpo puede usarse para orientar actividad de convertasa contra una célula particular

Se incubaron 20 \mul de diluciones del conjugado (0 (sin conjugado), 1/100, 1/50, 1/10) con 100 \mul de aproximadamente 1% (v/v) de eritrocitos de oveja (prelavados en CFD) durante 1 hora a 37ºC. Se realizaron incubaciones paralelas con cantidades equivalentes de PDP-IgG (sin C3) y C3 sola. Las células se lavaron a continuación 4 veces en CFD y se resuspendieron hasta 100 \mul en CFD-G. 50 \mul de esto se sometieron a lisis con 150 \mul de H_{2}O, seguido por la adición de 800 \mul de CFD que contenían EDTA 10 mM y 2% de NGPS (v/v). Los otros 50 \mul de células revestidas con conjugado se incubaron durante 15 minutos a 37ºC con 50 \mul de CFD-G que contenía 190 \mug/ml de factor B, 2 \mug/ml de factor D, 20 \mug/ml de properdina y NiCl_{2} 0,6 mM, seguido por lisis con 900 \mul de CFD que contenía EDTA 10 mM y NGPS al 2% (v/v). Después de 30 minutos a 37ºC, las células se nodulizaron mediante centrifugación (2000 x g, aproximadamente 3 minutos) y la absorbancia óptica del sobrenadante se midió a 412 nm. Usando las muestras tratadas con H_{2}O como 100% de lisis, y un blanco de tampón carente de células, se calculó el % de lisis, según se muestra en la Figura 9. El conjugado producía lisis dependiente de la dosis, mientras que ni el PDP-IgG ni la C3i sola generaban ninguna lisis significativamente por encima de la observada en ausencia de cualquiera de tales tratamientos.

10.3 Sumario de resultados

El método usado ha resultado sastisfactorio para acoplar C3i a IgG según se muestra mediante:

1. La formación de una banda de tamaño apropiado (aproximadamente 350 kDa) para un conjugado de C3:IgG 1:1 mostrado mediante SDS-PAGE en la Figura 8.

2. La SDS-PAGE bidimensional (primera dimensión no reducida, segunda dimensión reducida) indicaba que esta especie contenía tanto IgG como C3i.

3. La elución característica de esta especie sobre filtración en gel está de acuerdo de nuevo con una molécula de aproximadamente 350 kDa.

4. El conjugado presenta una actividad hemolítica que no es presentada por PDP-IgG o C3i (Figura 9).

La actividad hemolítica (Figura 9) demuestra además que:

1. La actividad anti-(eritrocito de oveja) específica ha localizado la C3i en la membrana de la célula diana (eritrocito de oveja), evitando que se elimine mediante lavado (en contraste con C3i) libre.

2. El conjugado retiene la actividad de la C3i ya que todavía es capaz de formar una convertasa C3 mediante reacción con properdina y factores B y D.

3. Esta convertasa puede iniciar el ataque dependiente del complemento de la diana, en este caso activando la ruta lítica (C5-9) para someter a lisis al eritrocito.

Datos adicionales de otros laboratorios muestran que el factor de veneno de cobra puede acoplarse a un anticuerpo y estos conjugados pueden orientar la activación del complemento contra un tipo de célula particular (Vogel, 1988, Targeted. Diagn. Ther., 1:191-224; Muller, B. y Muller-Ruchholtz, W., 1987, Leuk. Res. 11:461-468; Parker, C.J., White, V.F. y Falk, R.J., 1986, Complement 3:223-235; Petrella, E.C. y otros, 1987, J. Immunol. Methods 104:159-172). Estos datos apoyan el argumento de que C3 modificada de modo que es capaz de formar una convertasa C3 estable, como factor de veneno de cobra, podría usarse para orientar respuestas mediadas por el complemento, según se esboza en esta invención.

Ejemplo 11 Demostración de que la moléculas de C3 mutante inducen la renovación de factor B en suero humano normal 11.1 Introducción

Un propósito principal de la invención descrita aquí es el agotamiento consuntivo de la actividad del complemento a partir de fluidos biológicos. La invención describe métodos para la fabricación de moléculas de C3 que son resistentes a la regulación a la baja por factores H e I. En este estado, se unirán a factor B y generarán convertasas C3 activas. La actividad de estas convertasas se demuestra mediante el ensayo hemolítico empleado en el Ejemplo 6. Tal convertasa consumirá por lo tanto C3. Si la convertasa es inestable, se disociará sin mucha conversión de C3. Sin embargo, esto permitirá la unión de factor B reciente y su conversión en Bb y Ba. Así, la C3 mutante promoverá el consumo de factor B, conduciendo finalmente a la inhabilitación de la ruta alternativa, y su incapacidad para amplificar la estimulación de la ruta clásica. Si se forma una convertasa C3 estable, la renovación de factor B se reducirá, pero el consumo de C3 se incrementará. Por lo tanto, ambas situaciones pueden ser deseables. En este ejemplo, se demuestra que las moléculas de C3 mutante que están modificadas para hacerlas resistentes a factor I, pero sin ninguna modificación para modificar la estabilidad de la convertasa, promueven la renovación acelerada de factor B en suero humano. La C3 de tipo salvaje, en contraste, no provoca renovación significativa, presumiblemente debido a que la C3i de tipo salvaje es rápidamente degrada por factores H e I.

11.2 Método

Los mutantes preparados son como sigue:

Q1R2

\;

\;

Arg1303 cambiada por Gln (Ejemplo 2)

Q1Q2

\;

\;

Arg1303 cambiada por Gln, más Arg1320 cambiada por Gln (Ejemplo 1)

E1Q2

\;

\;

Arg1303 cambiada por Glu, más Arg1320 cambiada por Gln (Ejemplo 5)

Estos mutantes se expresaban todos en células CHO y a continuación se purificaban mediante precipitación con Na_{2}SO_{4}, seguido por purificación por afinidad sobre Clon-3-Sepharose, según se describe en el Ejemplo B3. La C3 de tipo salvaje (R1R2) se aislaba de forma similar. Mediante SDS-PAGE con tinción con plata, la concentración de Q1 estaba entre 1/5 y 1/25 del tipo salvaje, la concentración de Q1Q2 era aproximadamente la de 1/5 del tipo salvaje y la concentración de E1Q2 estaba entre 1/25 y 1/125 de tipo salvaje. Todas las preparaciones contenían probablemente una mayoría de moléculas rotas en el tioléster (C3i).

Se incubaron 10 \mul de estas preparaciones de C3 con 10 \mul de una solución de suero humano normal al 20% (v/v) en PBS que contenía MgCl_{2} 1 mM y aproximadamente 300 ng de factor B marcado con ^{125}I (aproximadamente 2-300.000 ppm) durante 1 hora a 37ºC. Se analizaron a continuación 5 \mul mediante SDS-PAGE (condiciones reductoras). El gel secado se expuso a película autorradiográfica para indicar las posiciones de las bandas correspondientes al factor B intacto y sus productos de segmentación. Estos se cortaron a continuación y se contaron para determinar exactamente el grado de segmentación. El valor obtenido en tampón solo se substrajo como fondo (que abarcaba no solo la segmentación de fondo sino también productos de degradación y otras impurezas presentes en la preparación del radioligando).

11.3 Resultados

Los grados resultantes de segmentación con factor B se muestra más adelante:

1/25 de tipo salvaje

\hskip0,5cm

1,49%

1/5 de tipo salvaje

\hskip0,7cm

2,74%

Q1R2

\hskip2,4cm

6,19%

Q1Q2

\hskip2,4cm

7,41%

E1Q2

\hskip2,4cm

6,42%

Por lo tanto, los mutantes resistentes a factor I producen todos niveles mayores de segmentación con factor B que las cantidades equivalentes de C3 de tipo salvaje (C3i). Con dosis mayores o incubaciones más prolongadas, debe resultar la inactivación completa de la ruta alternativa.

Las abreviaturas usadas en los siguientes ejemplos incluyen: CFD, diluyente de fijación del complemento (definido en Harrison y Lachmann, 1986, Handbook of Experimental Immunology, 4ª edición, Ed.s Weir, Herzenberg, Blackwell and Herzenberg; Blackwell, Oxford); CFD-G, CFD que contiene 0,1% (p/v) de gelatina; PBS, solución salina tamponada con fosfato; NGPS, suero de cobaya normal; SDS-PAGE, electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS; SPDP, N-succinimidil-3-[2-piridilditio]propionato.

Referencias

1. Bergmann, M. y Fruton, J.S. (1941) Adv. Enzymol., 1:63-98.

2. de Bruijn, M.H. y Fey, G.H. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:708-712

3. Crawford-MH y otros (1988) Circulation. 78:1449-58

4. Daha, M.R. y van Es, L.A. (1982) Immunol. 43:33-38.

5. Farries, TC; Lachmann, PJ y Harrison, RA (1988) Biochem. J. 252:47-54

6. Farries, TC; Lachmann, PJ y Harrison, RA (1988) Bíochem. J. 253:667-75

7. Forty, J; Hasan, R; Cary, N; White, DJ y Wallwork, J (1992) Transplant. Proc. 24:488-9

8. Fritzinger, D.C. y otros (1992) J. Immunol. 149:3554-3562

9. Harrison, R.A. y Lachmann, P.J. (1980) Mol. Immunol. 17:9-20.

10. Kalli, K.R., Hsu, P. y Fearon, D.T. (1994) Springer Semin. Immunopathol. 15:417-431.

11. Kinoshita, T; Takata, Y; Kozono, H; Takeda, J; Hong, KS y Inoue, K (1988) J. Immunol. 141:3895-901

12. McNearney, TA; Odell, C; Holers, VM; Spear, PG; Atkinson, JP (1987) J. Exp. Med. 166:1525-35

13. Nicol, P.A.E. y Lachmann, P.J. (1973) Immunol. 24:259-275

14. Pangburn, MK y Muller-Eberhard, HJ (1984) Springer Semin. Immunopathol. 7:163-92

15. Rother, K. y Till, G.O. (eds) (1988) "The complement System" (Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Alemania)

16. Van den Berg, C.W., Aerts, P.C. y Van Dijk, H. (1991) J. Immunol. Methods 136:287-294.

17. Vogel, CW; Smith, CA y Muller-Eberhard, HJ (1984) J. Immunol. 133:3235-41

18. Weisman, HF y otros (1990) Science 249:146-51.

19. Wu, R. (ed.) (1993) Methods Enzymol. 217: ch.s 12-14 (Academic Press, San Diego, U.S.A.)

20. Botto, M, Fong, K.Y., So, A.K., Koch, C. y Walport, M.J. (1990) J. Exp. Med. 172:1011-7

21. Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. (1989) "Molecular Cloning. A Laboratory Manual" segunda edición (Cold Spring Harbor Laboratory Press)

22. Fishelson, Z.(1991) Mol. Immunol. 28:545-52.

23. Taniguchi-Sidle, A y Isenman, D.E. (1993) Mol. Immunol. 30:54.

24. Lambris, J.D., Avila, D., Becherer, J.D. y Muller, Eberhard, H.J. (1988) J. Biol. Chem. 263:12147-50.

25. Taniguchi-Sidle, A. e Isenman, D.E. (1992) J. Biol. Chem. 267:635-643.

26. Hofer, B. y Kuhlein, B. (1993) Methods Enzymol. 217:173-189.

27. Morinaga, Y., Franceschini, T., Inouye, S. e Inouye, M. (1984) Bio-technology 2:636-639.

28. Harrison, R.A. y Lachmann, P.J. (1986) "Handbook of Experimental Immunology"(eds Weir, Herzenberg, Blackwell and Herzenberg; Blackwell, Oxford) 4ª ed.

29. Kotwal, G., J., y Moss, B., Nature (1988) 335 (6186):176-8.

Claims (27)

1. Una proteína C3 humana modificada capaz de formar una convertasa C3 estable, en donde dicha proteína modificada se selecciona del grupo que consiste en:

(a)

una proteína C3 en la que Arg-1303, Arg-1320 o ambas se reemplazan por otro aminoácido;

(b)

una proteína C3 que tiene susceptibilidad reducida a Factor H y/o Factor I con relación a la convertasa C3 humana natural, teniendo dicha proteína uno o más cambios de aminoácidos con relación a convertasa C3 humana natural en la región correspondiente a los residuos de aminoácido 752-754 y/o los residuos 758-780 de convertasa C3 humana natural; y

(c)

una proteína C3 que tiene cambios de aminoácidos con relación a convertasa C3 humana natural en los residuos de aminoácido 1427, 1431 y/o 1433 de convertasa C3 humana natural.

2. Una proteína de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la proteína está modificada mediante la substitución de Arg-1303, Arg-1320 o ambas por otro aminoácido.

3. Una proteína de acuerdo con la reivindicación 2, en la que Arg-1303, Arg-1320 o ambas se reemplazan por glutamina, tirosina, cistina, triptófano, ácido glutámico o glicina.

4. Una proteína de acuerdo con la reivindicación 3, en la que Arg-1320 se reemplaza por glutamina.

5. Una proteína de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4, en la que Arg-1303 se reemplaza por ácido glutámico, glicina o glutamina.

6. Una proteína de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene susceptibilidad reducida a Factor H y/o Factor I con relación a convertasa C3 humana natural, teniendo dicha proteína uno o más cambios de aminoácidos con relación a convertasa C3 humana natural en la región correspondiente a los residuos de aminoácido 752-754 y/o los residuos 758-780 de convertasa C3 humana natural.

7. Una proteína de acuerdo con la reivindicación 6, en la que el uno o más cambios de aminoácidos son cambios de residuos de aminoácidos ácidos hasta residuos de aminoácidos neutros.

8. Una proteína de acuerdo con la reivindicación 6 o la reivindicación 7, en el que los cambios de residuos de aminoácidos son cambios de Asp-Glu-Asp por Gly-Ser-Gly.

9. Una proteína de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene cambios de aminoácidos relativos a convertasa C3 humana natural en los residuos de aminoácido correspondientes a los residuos 1427, 1431 y/o 1433 de convertasa C3 humana natural.

10. Una secuencia de DNA que codifica para una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

11. Un constructo de DNA (por ejemplo, un vector) que comprende una secuencia de DNA de acuerdo con la reivindicación 10.

12. Una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para usar en terapia.

13. Un conjugado que comprende una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, conectada a un resto de unión específica.

14. Un conjugado de acuerdo con la reivindicación 13, en el que el resto de unión específica es una proteína de unión específica.

15. Un conjugado de acuerdo con la reivindicación 14, en el que la proteína de unión específica es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

16. El uso de una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o de un conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en la fabricación de un medicamento para usar en el agotamiento de niveles de proteína de la ruta del complemento.

17. El uso de acuerdo con la reivindicación 16, en el que el medicamento es para usar en la prevención del rechazo de materia extraña.

18. El uso de acuerdo con la reivindicación 16, en el que el medicamento es para usar en la localización y/o la amplificación de la conversión y la deposición de proteína del complemento endógena en un sitio específico.

19. Una formulación farmacéutica que comprende una o más proteínas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o un conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, junto con uno o más portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables.

20. Una formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 19, que es para usar en el agotamiento de niveles de proteína de la ruta del complemento.

21. Una formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 20, que es para usar en la evitación del rechazo de materia extraña.

22. Una formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 19, que es para usar en la localización y/o la amplificación de la conversión y la deposición de proteína del complemento en un sitio específico.

23. Una formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 22, que es para usar en el agotamiento de niveles de proteína de la ruta del complemento.

24. Una formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 23, que es para usar en la prevención del rechazo de material extraña.

25. Una formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 22, que es para usar en la localización y/o la amplificación de la conversión y la deposición de la proteína del complemento en un sitio específico.

26. Un método para reducir proteína de la ruta del complemento en un mamífero, que comprende administrar al mamífero una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

27. Un método de acuerdo con la reivindicación 25, en el que la proteína se administra en la forma de una formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 22.