CZ290596B6 - Modifikovaný lidský C3 protein, DNA sekvence kódující tento protein, DNA konstrukt obsahující tuto DNA sekvenci, konjugát obsahující uvedený protein, pouľití uvedeného proteinu a konjugátu a farmaceutický prostředek obsahující uvedený protein nebo konjugát - Google Patents

Abstract

Modifikovan² lidsk² C3 protein schopn² tvo°it stabiln C3 konvert zy a zvolen² z mno iny, zahrnuj c C3 protein, ve kter m je aminokyselinov² zbytek Arg-1303 nebo/a aminokyselinov² zbytek Arg-1320 nativn lidsk C3 konvert zy nahrazen jin²m aminokyselinov²m zbytkem; C3 protein, kter² m sn enou citlivost na faktor H nebo/a faktor I vzhledem k nativn lidsk C3 konvert ze a m alespo jednu substituci jin²m aminokyselinov²m zbytkem vzhledem k nativn lidsk C3 konvert ze v oblasti aminokyselinov²ch zbytk 752 a 754 nebo/a aminokyselinov²ch zbytk 758 a 780 nativn lidsk C3 konvert zy; a C3 protein, kter² m alespo jednu substituci jin²m aminokyselinov²m zbytkem vzhledem k nativn lidsk C3 konvert ze v aminokyselinov²ch zbytc ch 1427, 1431 nebo/a 1433 nativn lidsk C3 konvert zy, jako i DNA sekvence k duj c tento protein, DNA kostrukt obsahuj c tuto DNA sekvenci, konjug t obsahuj c uveden² protein, pou it uveden ho proteinu a konjug tu a farmaceutick² prost°edek obsahuj c uveden² protein nebo konjug t.\

Description

Modifikovaný lidský C3 protein, DNA sekvence kódující tento protein, DNA konstrukt obsahující tuto DNA sekvenci, konjugát obsahující uvedený protein, použití uvedeného proteinu a konjugátu a farmaceutický přípravek obsahující uvedený protein nebo konjugát

Oblast techniky

Vynález se týká modifikovaného lidského C3 proteinu schopného tvořit stabilní C3 konvertázy, DNA sekvence kódující tento protein, DNA konstruktu obsahujícího tuto DNA sekvenci, konjugátu obsahujícího uvedený protein, použití uvedeného proteinu a konjugátu a farmaceutického přípravku obsahujícího uvedený protein nebo konjugát.

Dosavadní stav techniky

Existuje několik řídce se přirozeně vyskytujících stavů, kdy nemůže proběhnout normální regulace tekutinové fáze a spontánní C3 konverze nakonec vede k obecnému vyloučení C3 proteinu z cirkulace. Tyto stavy zahrnují: 1) genetickou nedostatečnost faktoru H nebo faktoru I (13), 2) přítomnost protilátek typu nefritických faktorů, které se váží na C3bBb a brání tak obvyklé disociaci (4), a působení proteinu kobřího jedu, který je nazýván faktor kobřího jedu (CVF) a který se slučuje s faktorem B a tvoří enzym C3 konvertátu, který neobsahuje C3B a není takto aktivován faktory Hal. Tyto tři stavy ilustrují normální fyziologický průběh supresivní regulace (regulace „down“) komplementu za absence specifické aktivace.

Existují také stavy, kdy specifická aktivace existuje, aleje nežádoucí, zejména je-li namířena proti tkáním hostitele v případě poškození tkáně ischemií nebo chirurgií nebo proti cizorodému materiálu úmyslně podanému za terapeutickým účelem (jako je xenograft, arteficiální orgán nebo dialyzační membrána). Aktivace komplementu vede k nežádoucímu ataku a dalšímu poškození, takže v těchto případech bude vhodné blokovat nebo inhibovat aktivaci a odpověď.

Existující přístupy k prevenci komplementem zprostředkovaného poškození jsou zaměřeny na užití „down“ regulačních proteinů (CR1, MCP, DAF a faktorů Hal) k inhibici aktivace komplementu. Inhibitory komplementu jako faktor I, faktor H a solubilní deriváty membránových vazebných proteinů CR1, DAF, MCP suprivují kapalná-fáze amplifikační smyčky alternativní dráhy. Proto se zkoušelo užití těchto molekul, zejména CR1 (který se zdá být nejúčinnější) k redukci komplementem zprostředkovaného poškození na modelech fyziologických situací (10,18).

Faktor H je endogenně přítomen v krevní plazmě ve vysoké koncentraci (typicky 0,3 až 0,5 mg/ml), takže ačkoliv vysoké hladiny inhibitorů mírní reakci v kapalné fázi, jejich účinek je slabý, ačkoliv velké množství purifikovaných proteinů může být podáno in vivo (t.j. pravděpodobně až 5 mg/kg tělesné hmotnosti solubilního CR1). Navíc, alternativní dráha je aktivována povrchy, kde je efektu faktoru H již zabráněno. Zatímco toto ne nezbytně konkomitantně redukuje aktivity jiných inhibitorů, stejné faktory napovídají, že nejsou pravděpodobně kompletně nebo univerzálně efektivní.

Faktor kobřího jedu (CVF) způsobuje generování stabilní C3 konvertázy, která může být použita experimentálně kdepleci komplementu u zvířat in vivo, a v jiných vzorcích (t.j. lidské krevní plazmě) in vitro. CVF je potentní (t.j. 40 pg/kg může zrušit aktivitu komplementu u myši (16)). Nicméně, jsou zde nevýhody, které mohou znemožnit jeho terapeutické užití u lidí.

Nejprve je získán z kobřího jedu (obtížný zdroj k získání a nebezpečný) a musí pak být pečlivě purifikován od neurotoxinů jedu. Je také samozřejmě obtížné získání zásob. Tento problém nemůže být snadno překonán klonováním a expresí genu ex vivo, jelikož existují posttranslační modifikace, které probíhají u hada (specifické proteolytické zpracování), které může být obtížné

-1 CZ 290596 B6 (nebo nemožné) reprodukovat in vitro. Navíc, enzymy a podmínky trávení vyžadované pro toto zpracování jsou dosud neznámé. Za druhé, protein je cizorodého původu (pro lidi) a proto je imunogenní. Toto vylučuje jeho opakované terapeutické užití, jak může být žádoucí pro dekomplementaci pacienta po mnoho týdnů (t.j. pro dovolení přežití xenograftu).

Ačkoliv má CVF některé strukturální a funkční homologie s lidským C3 (17), má také velkou odlišnost v některých ohledech (t.j. struktuře řetězce místě biosyntézy, insenzitivitě na regulátory komplementu, formování stabilní C3 konvertázy). Není derivován od kobřího C3 ekvivalentu, který je znám, byl klonován a sekvencován, a který se ve většině struktury a funkce podobá lidskému C3 více než CVF (8).

CVF je specifický produkt jedu zvířete velké evoluční odlišnosti od homo sapiens. Není proto možné užít genetické manipulace k modifikaci tohoto proteinu na produkt, který může být neimunogenicky použit u lidí.

Nyní byla vyvinuta alternativní strategie, spočívající v překlenutí fyziologické regulace a, místo inhibice aktivace komplementu, způsobuje super aktivaci systému. Má dvě aplikace. První, může být použita in vivo k aktivaci komplementu dokud není jedna nebo více komponent vyčerpána, což vede ke ztrátě schopnosti produkovat lokální odpověď na jakoukoliv další zátěž (jako je xenograft). Za druhé, neregulovaná superaktivace může být úmyslně lokalizována na jednotlivý cíl (t.j. virus nebo virem infikovanou buňku) ke zvýšení senzitivity tohoto cíle na komplementem zprostředkovanou destruktivní odezvu.

Termín „regulátory komplementové aktivace“, jak je zde použit, zahrnuje všechny proteiny, které inhibují zesílení C3 konverze, a není omezen na ty proteiny, jejichž geny jsou v RCA genetickém místě. Nemůže nicméně zahrnovat „regulátory up“, jakým je například properdin. „C3-konverze“ je definována jako proteolytická konverze C3 na C3b a C3a, pokud není výslovně uvedeno jinak, a „C3 konvertáza“ je definována jako enzym (typicky komplex dvou nebo více proteinových složek, jakými jsou například C3bBb, C3iBb, CVFBb nebo C4b2a), který katalyzuje uvedenou konverzi.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je modifikovaný lidský C3 protein schopný tvořit stabilní C3 konvertázy a zvolený z množiny, zahrnující C3 protein, ve kterém je aminokyselinový zbytek Arg-1303 nebo/a aminokyselinový zbytek Arg-1320 nativní lidské C3 konvertázy nahrazen jiným aminokyselinovým zbytkem; C3 protein, který má sníženou citlivost na faktor H nebo/a faktor I vzhledem k nativní lidské C3 konvertáze a má alespoň jednu substituci jiným aminokyselinovým zbytkem vzhledem k nativní lidské C3 konvertáze v oblasti aminokyselinových zbytků 752 až 754 nebo/a aminokyselinových zbytků 752 až 754 nebo/a aminokyselinových zbytků 758 až 780 nativní lidské C3 konvertázy; a C3 protein, který má alespoň jednu substituci jiným aminokyselinovým zbytkem vzhledem k nativní lidské C3 konvertáza v aminokyselinových zbytcích 1427, 1431 nebo/a 1433 nativní lidské C3 konvertázy.

Výhodně jsou v uvedeném proteinu aminokyselinový zbytek Arg-1303 nebo/a aminokyselinový zbytek Arg-1320 nativní lidské C3 konvertázy nahrazeny aminokyselinovým zbytkem zvoleným z množiny, zahrnující glutaminový, tyrosinový, cystinový, tryptofanový a glycinový zbytek a zbytek kyseliny glutamové.

Výhodně je v uvedeném proteinu aminokyselinový zbytek Arg-1320 nativní lidské C3 konvertázy nahrazen glutaminovým zbytkem.

-2 CZ 290596 B6

Výhodně je v uvedeném proteinu aminokyselinový zbytek Arg-1303 nativní lidské C3 konvertázy nahrazen glycinovým zbytkem nebo glutaminovým zbytkem nebo zbytkem kyseliny glutamové.

Výhodně v uvedeném proteinu alespoň jedna substituce aminokyselinového zbytku nativní lidské C3 konvertázy jiným aminokyselinovým zbytkem zahrnuje substituci kyselého aminokyselinového zbytku neutrálním aminokyselinovým zbytkem.

Výhodně v uvedeném proteinu substituce aminokyselinových zbytků nativní lidské C3 konvertázy jinými aminokyselinovými zbytky zahrnuje substituci aminokyselinových zbytků Asp-Glu-Asp aminokyselinovými zbytky Gly-Ser-Gly.

Předmětem vynálezu je rovněž DNA sekvence kódující uvedený protein.

Předmětem vynálezu je rovněž DNA konstrukt, například vektor, obsahující uvedenou DNA sekvenci kódující uvedený protein.

Předmětem vynálezu je dále uvedený protein podle vynálezu pro použití v terapii.

Předmětem vynálezu je dále konjugát tvořený uvedeným proteinem podle vynálezu vázaný na specifickou vazebnou skupinu, kterou je výhodně specifický vazebný protein, kterým je výhodně specifická protilátka nebo její antigen vázající fragment.

Předmětem vynálezu je také použití uvedeného proteinu podle vynálezu nebo uvedeného konjugátu podle vynálezu pro výrobu léčiva určeného pro snížení hladiny proteinů komplementové dráhy.

Předmětem vynálezu je také použití uvedeného proteinu podle vynálezu nebo uvedeného konjugátu podle vynálezu pro výrobu léčiva určeného pro preventivní potlačení odmítavé reakce organismu na cizorodý materiál.

Předmětem vynálezu je také použití uvedeného proteinu podle vynálezu nebo uvedeného konjugátu podle vynálezu pro výrobu léčiva určeného pro lokalizaci nebo/a zesílení endogenní konverze proteinů komplementované dráhy a depozici na specifické místo.

Předmětem vynálezu je konečně farmaceutický prostředek obsahující alespoň jeden uvedený protein podle vynálezu nebo alespoň jeden uvedený konjugát podle vynálezu a alespoň jeden farmaceuticky přijatelný nosič nebo/a alespoň jednu farmaceuticky přijatelnou pomocnou látku.

Výraz „nativní“ je zde třeba chápat jako přirozeně se vyskytující, což znamená získatelný v přírodě. Tato definice takto zahrnuje jakýkoliv přirozeně se vyskytující protein komplementové dráhy, který je modifikován výše uvedeným způsobem. Není zde záměrem omezovat se pouze na druhově specifické proteiny. Modifikovaný lidský protein může být takto například použit jako stabilní C3 konvertáza u jiných druhů savců. Typicky budou použity modifikované proteiny komplementové dráhy stejného druhu, například použitím lokálně řízené mutageneze může produkovat variantu C3 proteinu, která je rezistentní ke komplementovým regulačním proteinům při zachování pozitivní funkční vlastnosti (štěpení na C3b C3 konvertázou) a vlastnosti strukturní celistvosti (správná struktura řetězce, a přítomnost thiolesterové vazby). Zde popsaný vynález se týká geneticky modifikovaných forem nativních komplementových proteinů, například lidského C3, jehož C3b fragment získává vlastnosti rezistence na fyziologickou regulaci komplementu. Díky této rezistenci mohou tyto molekuly generovat stabilizované formy, korespondující C3 konvertázy, která produkuje amplifikovanou konverzi C3 na C3b, a později degradační produkty, ve fyziologickém prostředí (t.j. in vivo).

V preferovaném provedení poskytuje vynález modifikovaný C3 protein, který je rezistentní na štěpení faktorem I.

Tohoto může být dosaženo modifikací zbytků proteinu v proteolytických místech.

Zejména preferované provedení vynálezu se týká modifikovaného lidského C3 proteinu, kde protein je modifikován nahrazením buď Arg-1303, nebo Arg-1320 nebo obou jinou aminokyselinou. Jinou aminokyselinou může být tyrosin, cystin, tryptofan, glutamin, kyselina glutamová nebo glycin. Arg-1303 je preferovaně nahrazen glutamovou kyselinou nebo glycinem (méně výhodně glutaminem). Arg-1320 je preferovaně nahrazen glutaminem.

Jiné strategie pro produkci vhodných modifikovaných proteinů vynálezu zahrnují:

(i) Redukovanou citlivost na inhibiční účinek faktoru H a příbuzných proteinů (tj. MCP, DAF, CR1). Například, lidské C3 zbytky 767-776 a 1209-1271 byly implikovány ve vazbě faktoru H (20,24), a nahrazení jednoho nebo více těchto zbytků nebo jiných zbytků také asociovaných s akcí těchto proteinů by mohlo redukovat vazbu jednoho nebo více z těchto regulačních proteinů.

(ii) Redukovaná rychlost disociace C3bBb. Mohou být zavedeny mutace, které mohou posílit interakce mezi C3b a Bb. Toto může vést jak k redukci ve spontánní dekompozici enzymu, tak omezení efektivity faktoru H (a příbuzných regulátorů) ve vyjmutí Bb z C3b.

Tyto mutace jsou žádoucí k redukci stupně jak spontánní, tak faktorem H mediované dekompozice C3bBb. I za absence faktoru H má tekutá fáze C3bBb komplexu poločas pouze okolo 10 min při 37 °C za přítomnosti properdinu (6).

(iii) Lidská C3 rezidua 752-761 jsou implikována ve vazbě faktoru B. Toto je vysoce konzervovaný region C3, a těsně příbuzná sekvence je nacházena vC4. Jak C4 váže faktor B homolog C2, spolu s jeho vysokou konzervací v C3, silná similarita tohoto regionu mezi C3 a C4 dále podporuje jeho roli vC3 jako faktor B vazebné místo. Tak mohou mít změny v tomto regionu efekt na B afinitu a na stabilitu C3bBb.

(iv) Rezistence na jiné regulátory aktivace komplementu jako je CR1, DAF, a MCP mohou být také žádoucí. Způsob akce těchto regulátorů je podobný jako u faktoru H, takže další mutageneze není nezbytně nutná. Podobně, některé patogenní organismy exprivují jejich vlastní inhibitory aktivace komplementu, které jsou často strukturálně a funkčně homologní faktoru H (t.j. Vaccinia virus sekretomí peptid). Tyto molekuly chrání útočníka proti imunitní odpovědi, a mohlo by být výhodné, aby bylo možno je atakovat cílenými C3 konvertáza enzymy rezistentními na tuto obranu.

(v) Mutace, které zvyšují stabilizaci C3 konvertázy properdinem. Aktivitou properdinu je stabilizovat C3bBb komplex, zpomalovat spontánní a na faktoru H závislou disociaci. Tato stabilizace je neúčinná v kapalné fázi, ale zdá se být významnější v amplifikačním procesu jednou nastartovaném vhodným aktivačním povrchem (5). Zvýšení jeho aktivity (zvýšením jeho afinity) může narušit rovnováhu v kapalné fázi, a tak započít spontánní C3 konverzi. Toto může být zejména užitečné v kombinaci s jinými modifikacemi výše popsanými.

(vi) Mutace, které zabraňují C3bBb vykazovat C5 konvertázovou aktivitu. Při užití kdepleci aktivního C3 z cirkulace může být nežádoucím vedlejším účinkem generace velkého množství anafylaktických peptidů. Nejpotentnějším z nich je C5a, který je štěpen z C5 některými C3 konvertáza enzymy. Tato reakce je pravděpodobně závislá na afinitě konvertázy kjiné molekule C3b (11), a tak může být subjektem pro supresi mutacemi C3, které odstraní tuto interakci.

-4CZ 290596 B6 (vii) Zlepšená aktivita C3 konvertázy. Aktivní místa C3bBb C3 konvertáza enzymu jsou umístěna v Bb části. C3b komponenta má předpokládané za funkci vytvoření aktivní konformace na Bb a/nebo vazbu a konformaci substrátu, který má být zpracován Bb. Toto není známé, ale v obou případech zde může být možnost pro zvýšení aktivity konvertázy prostřednictvím mutací vC3.

(viii) Exprese ve funkční formě. Divoký typ C3 vyžaduje konverzi na C3b před tím, než může být kombinován do nového C3 konvertáza komplexu. Je-li použit in vivo, může požadavek na konverzi na C3b (nebo C3i) odložit akci modifikovaného C3. Bylo proto žádoucí buď podat protein ve formě schopné okamžitého formování konvertázy, nebo podat přeformované konvertázové komplexy. Je proto výhodné vytvářet funkční C3b-podobná činidla ex-vivo. Tohoto může být dosaženo in vitro (t.j. proteolýzou).

(ix) Modifikace nativního proteinu, které slouží k zavedení nových míst štěpení tak jako jsou peptidové regiony požadované pro faktor B vazbu ponechány a ty, které jsou požadovány exkluzivně pro faktor H vazbu, mohou být specificky odstraněny. Například mohou být zavedena taková místa, že C3b-podobná forma modifikovaného C3 může být dále štěpena do formy, která stále váže faktor B, aleje méně citlivá na inaktivaci faktorem Hal.

(x) Modifikace v jiných regionech, které mohou ovlivňovat C3b interakce s faktorem B a/nebo faktorem H

Vynález je založen na obrácení klasického přístupu navozením C3 konverze k depleci C3 a tak vyřazení systému. Další aplikací vynálezu je potenciál k navození C3 konverze v jednotlivém místě, a tak získání komplement dependentních efektorových mechanismů k ovlivnění specifického cíle.

Proto posledním efektem bude zvýšení množství C3 konverze tehdy, je-li modifikovaný protein podán do fyziologického média (t.j. krve), obsahujícího regulátory komplementové aktivace. Tato aktivita pak může být použita buď k depleci nativního C3 média, nebo k lokalizaci C3 konverze do požadovaného místa.

Analog C3, jehož C3b-fragment je rezistentní na účinek faktoru I (t.j. deriváty popsané v příkladu 1) může vázat faktor B, který pak bude štěpen faktorem D a eventuálně disociován v inaktivní formě. Za absence inaktivace faktorem I bude modifikovaný C3b schopný opakovaně vázat nové molekuly faktoru B a tak spustit jeho inaktivaci. Proto bude jinou potenciální aplikací modifikací popsaných v tomto vynálezu inaktivace alternativní dráhy konsumpcí aktivity faktoru B. Analogický přístup může také být použit k modifikaci C4 ke spuštění konsumce C2, a tak vyřazení klasické dráhy aktivace komplementu.

Vynález zahrnuje jakoukoliv jinou proteázu použitou analogickým způsobem kC3bBb enzymu, která vede ke štěpení C3 na C3b, navzdory přítomnosti regulátorů aktivace komplementu.

Vynález také zahrnuje DNA sekvence, které kódují protein vynálezu stejně jako DNA konstrukty obsahující takové DNA sekvence.

„DNA sekvence“ zahrnují všechny další sekvence nukleových kyselin které, díky degeneraci genetického kódu, také kódují dané aminokyselinové sekvence, nebo které jsou v podstatě homologní k těmto sekvencím. Tyto sekvence jsou tak také zahrnuty v rozsahu vynálezu.

Sekvence nukleových kyselin, které jsou „v podstatě homologní“ jsou také zahrnuty v rozsahu vynálezu. „Podstatná homologie“ může být hodnocena na úrovni nukleových kyselin nebo na úrovni aminokyselin. Na úrovni nukleových kyselin mohou být za sekvence, mající podstatou homologii považovány ty, které hybridizují se sekvencemi nukleových kyselin podle vynálezu za přísných podmínek (například, při 35 až 65 °C v solném roztoku asi 0,9M). Na aminokyselinové

-5CZ 290596 B6 úrovni může být proteinová sekvence považována za podstatně homologní kjiné proteinové sekvenci, jestliže signifikantní množství přítomných aminokyselin vykazuje homologii. Alespoň 55%, 70 %, 80%, 90%, 95% nebo 99%, ve zvyšujícím se stupni, aminokyselin může být homologní.

Jak bylo zmíněno výše, mohou být proteiny vynálezu použity k dosažení lokalizovaných efektů aktivace komplementu. Jednou cestou potvrzení tohoto je konjugace proteinu se skupinou, která se bude vázat na požadovaný cíl. Tak v dalším aspektu vynález poskytuje konjugát zahrnující protein vynálezu navázaný na specifickou vazebnou skupinu, například specifický vazebný protein. Příkladem takového proteinu může být protilátka nebo její antigen vazebný fragment.

Proteiny podle vynálezu jsou zamýšleny pro podání subjektům pro zvýšení žádoucího terapeutického efektu. Proto vynález také poskytuje:

a) Protein podle vynálezu pro použití v terapii.

b) Užití proteinů nebo konjugátů podle vynálezu ve výrobě léčiv pro užití v depleci hladin proteinů komplementované dráhy, a zejména pro užití v zabránění rejekce cizorodého materiálu.

c) Farmaceutickou formulaci, zahrnující jeden nebo více proteinů nebo konjugátů podle vynálezu společně s jedním nebo více farmaceuticky akceptovatelnými nosiči a/nebo excipienty.

d) Metodou redukce proteinů komplementové dráhy u savců, která zahrnuje podání proteinu podle vynálezu savcům, výhodně ve formě farmaceutické formulace.

Farmaceutické formulace mohou být přítomny v jednotkové dávkové formě, obsahující předem určené množství aktivní složky na dávku. Taková jednotka může obsahovat minimum, například 1 mg aktivní přísady, a preferovaně 2 až 3 mg. Horní hranice, kterou taková jednotková dávka může obsahovat, bude záviset na množství faktorů jako jsou podmínky léčby, způsob podání a věk, hmotnost a stav pacienta stejně jako ekonomické úvahy. Například může jednotková dávková forma obsahovat 10 mg nebo až 100 mg aktivní přísady.

Proteiny podle vynálezu mohou být použity in vivo k vyřazení komplementového systému. Okolnosti, kdy toto může být žádoucí zahrnují následující:

a) Aby se zabránilo komplementem zprostředkované destrukci nebo poškození transplantátu, zejména xenograftu (materiál transplantovaný od jiných druhů zvířat), a zejména nesouhlasného xenograftu (kde jsou druh dárce a příjemce nesouhlasné). Příjemce by měl být dekomplementován před operací a udržován v tomto stavu dokud bude transplantát buď přijat, nebo nahrazen více kompatibilním orgánem.

Počáteční léčba bude provedena během několika dní před transplantací. Další dekomplementace může být žádoucí v období rejekční krize. Léčba může být spojena s užitím antihistaminik ke kontrole všeobecné zánětlivé odpovědi (t.j. vasodilatace), pravděpodobně jako odpovědi na generování C3a a/nebo C5a.

Dekomplementace může být také výhodná při použití arteficiálních orgánů nebo tkání (t.j. arteficiální ledvinové dialyzační membrány), které aktivují komplementový systém. Jak je popsáno výše, může být protein podán v buď neaktivované formě, funkční C3b-podobné formě nebo jako předformovaná C3 konvertáza (jako C3bBb). Tyto mohou být podány jakoukoliv cestou, kde se aktivní konvertáza setká s cirkulujícím C3 (t.j. intravenózně, subkutánně atd.).

Jinou alternativou bude ex vivo léčba, například transfundováním oběhu přes matrici, nesoucí aktivní konvertázu. Toto by mělo mít tu výhodu, že dovolí odstranění anafylaktických peptidů

-6CZ 290596 B6 (C3a a C5a) a jiných zánětlivých mediátorů nízké molekulární hmotnosti (t.j. histamin a oxid dusný) předtím, než je dekomplementovaná krev (nebo plazma) vrácena pacientovi.

b) K zabránění komplementem zprostředkovaného poškození v důsledku většího chirurgického zákroku. Pacient by měl být dekomplementován, jak je popsáno výše, výhodně před operací (ale je-li to nutné po ní) a udržován v tomto stavu do té doby, než nebezpečí dalšího vnitřního poškození bude zmírněno díky na komplementu závislém imunitním ataku.

c) K minimalizaci komplementem zprostředkovaného poškození v důsledku nechirurgického poranění. V těchto případech musí být dekomplementace provedena po počátečním poškození, ale formulace a metody podání jsou jinak stejné jako ty, které jsou popsány výše. Toto může být zejména užitečné, když zotavení vyžaduje reperfuzi ischemické části cirkulací (t.j. ischemie myokardu, omrzliny, spáleniny atd.).

d) K minimalizaci komplementem zprostředkovaného poškození v důsledku interakce protilátka-antigen. Komplementem zprostředkovaná obranná odpověď je zejména nežádoucí u autoimunitních chorob, které mohou zahrnovat glomerulonefritidu, hemolytickou anemii, myastenii gravis a typ II kolagenem indukované artritidy. Vyřazení komplementového systému v průběhu některých epizod choroby může zmírnit příznaky.

e) K vytvoření specifického patogenního cíle více citlivého ke komplementem zprostředkovaným imunitním mechanismům. V tomto přístupu není cílem použít superaktivní C3 konvertázu k produkci generalizované deplece C3, ale místo toho použít konvertázu lokálně ke koncentraci C3 konverze do požadovaného cíle. Cílem může být patogenní organismus, jako je bakterie, virus nebo jiný parazit, nebo nadbytečná buňka nebo tkáň hostitele jako je nádorová buňka nebo virem infikovaná buňka. C3 konvertáza může být lokalizovaná na cíl buď lokálním podáním (t.j. přímou injekcí, pokud možno v médiu, které zpomaluje jeho uvolnění do systémové cirkulace), nebo kombinací s cílovou skupinou, tj. protilátkou. Takto modifikovaný protein může být navázán na specifický imunoglobulin buď chemickým zesítěním proteinů, nebo připojením DNA kódující sekvence a expresí (tj. v případě IgG) může být těžký nebo lehký řetězec připojen k C3 a ko-exprivován s C3, nebo mohou být oba řetězce kombinovány v jednom kompletním fúzním polypeptidu nebo inkorporací specifické kódující sekvence (t.j. pro „leucinzipper“- podobné domény) k DNA obou fúzních partnerů (t.j. modifikovaného C3 a specifické protilátky) tak, že exprivované produkty, jsou-li smíchány dohromady, samy asociují za vytváření stabilních konjugátů. Fúzní proteiny mohou pak být podány lokálně nebo do systémové cirkulace.

Liposomy (nesoucí protilátku na povrchu s modifikovaným proteinem buď na povrchu nebo uvnitř liposomu) a/nebo viriony (t.j. zpracované tak, aby exprivovaly proteiny na svém povrchu), mohou být také použity pro ko-dopravu protilátky a modifikovaného proteinu. Tato strategie může být použita přímo, samotná nebo v kombinaci s jinou léčbou, ve kterémkoliv stadiu chorobného procesu. Může být zejména vhodná pro užití v eliminaci jakýchkoliv nádorových buněk, které zůstaly v cirkulaci po chirurgickém odstranění tumoru. Konjugáty protilátkamodifikovaný protein mohou být také použity ex vivo k eliminaci patogenní tkáně. Například pro usmrcení leukemických buněk z extrahované kostní dřeně a pak pro navrácení zbylých zdravých buněk pacientovi.

Alternativně mohou být eliminovány lymfocyty, které neodpovídají MHC typu příjemce, z kostní dřeně před transplantací. Také modifikovaný protein může být navázán na antigen, a tato kombinace může být použita, buď in vivo nebo ex vivo, k ovlivnění lymfocytů nežádoucí reaktivity (t.j. proti transplantátu nebo vlastní tkáni).

Stejná technologie může být použita k léčbě jiných druhů, použitím jak derivátů lidského modifikovaného proteinu, tak podobných analogů připravených pro ten který druh.

-7CZ 290596 B6

Preferované rysy každého aspektu vynálezu jsou pro každý další aspekt mutatis mutandis.

Vynález bude nyní popsán prostřednictvím následujících příkladů, které nejsou konstruovány jako omezení vynálezu.

Příklady se vztahují k připojeným obrázkům.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obr. 1: ukazuje předpokládanou proteinovou sekvenci lidského C3, jak je kódovaná v PC3, (užitím standardního jednopísmenného kódu aminokyselin).

Obr. 2: ukazuje sekvenci cDNA v PC3, (užitím standardního jednopísmenného kódu pro deoxynukleotidy pro „sense“ řetězec, psaný 5-3').

Obr. 3: ukazuje vizualizaci modifikovaných proteinů podle vynálezu.

Obr. 4: ukazuje efekt různých mutací lidského C3, které nahrazují Arg 1303 nebo Arg 1320, na faktorem I-léčené štěpení v těchto místech.

N.B.

1. (35S) - biosynteticky značené vzorky.

2. Reakce provedené při normální iontové síle.

3. Imunoprecipitace s anti-C3.

4. SDS-PAGE za redukčních podmínek.

5. Autoradiografie.

Obr. 5: ukazuje zvýšenou rezistenci lidského C3 inkorporujícího Arg 1303 -> Gin 1303 mutaci k inaktivaci faktory 1 a H.

Obr. 6: ukazuje analýzu štěpení C3 konvertázy mutované v aminokyselinových zbytcích 752-754 a 758-760.

Toto je fotografie Western Blot vyvíjeného ze 7,5% polyakrylamidového SDS-PAGE gelu (redukční podmínky), po elektroforetickém transferu do nitrocelulózy, probování ovčí anti-lidskou C3 protilátkou a vývoji s křenovou peroxidázou spojenou s anti-ovčí imunoglobulinovou protilátkou a metodou Enhanced ChemiLuminiscence (metoda a detekční reagens od Amersham, UK) zachycenou na rentgenovém filmu. Štěpící reakce a detekční procedura byly provedeny jak je popsáno v příkladu 4 s odkazem na výsledky ukázané na obr. 3.

Klíč:

Dráhy 1,5: žádná adice

Dráhy 2,6: + CVFBb

Dráhy 3,7: + faktory H + I

Dráhy 4,8: + CVFBb + faktory Η +1

-8CZ 290596 B6

Proužky označené šipkami jsou:

A: C3 alfa - řetězec

B: C3 alfa' - řetězec

C: C3 beta - řetězec

D: 68 kDa produkt štěpení C3 alfa' - řetězce

E: těžký řetězec IgG

Obr. 7: ukazuje analýzu štěpení radioznačeného faktoru B faktorem D, za přítomnosti divokého typu C3 a mutantního C3 (C3i).

Je uvedena fotografie autoradiografu SDS-PAGE gelu. Všechny vzorky obsahují faktor D a ‘I-značený faktor B, a byly inkubovány po 3 hodiny při 37 °C.

Vzorky v číslovaných drahách také zahrnují:

1. Pufr samotný

2. 1/125 C3 divokého typu

3. 1/25 C3 divokého typu

4. 1/5 C3 divokého typu

5. 1/25 mutantního C3 (zbytky 1427 Gin, 1431 Asp a 1433 Gin)

6. 1/5 mutantního C3

7. neředěný mutantní C3

Proužky označené šipkou jsou:

A. Neštěpený ^l25I-značený faktor B (93 kDa).

B. 60 kDa produkt štěpení („Bb“)

C. 33 kDa produkt štěpení („Ba“)

Obr. 8: ukazuje SDS-PAGE studii, ilustrující vytváření konjugátů mezi C3i a IgG.

Toto je Coomassie barvení 4% akrylamidového SDS-PAGE gelového průběhu za neredukujících podmínek. Počítané dráhy obsahují vzorky:

1. PDP-IgG

2. C3i

3. PDP-IgG + C3i reakční směs

Šipkou jsou označeny:

A. Pravděpodobný C3i-IgG konjugát (350 kDa)

B. C3i (200 kDa)

C. IgG (150 kDa)

Obr. 9: demonstruje, že konjugát zaměřuje C3 konvertázovou aktivitu proti ovčím erytrocytům. (Tento graf ukazuje % lýze ovčích erytrocytů po potažení roztokem buď C3i-IgG konjugátu, nebo PDP-IgG nebo C3i následovaným promytím, generací C3 konvertázy properdinem a faktory B a D, a závěrečným vývojem lýze NGPS v CFD/EDTA, jak je popsáno v metodách. Pouze konjugát produkuje lýzi a tato lýze je závislá a dávce.

Následující standardní metody a definice jsou aplikovatelné na všechny příklady.

-9CZ 290596 B6

Všechny zmiňované komponenty komplementu jsou lidského původu, pokud není jinak specifikováno, a je použito standardní terminologie pro všechny proteiny a jejich odvozené fragmenty (t.j. jak je obsaženo v odkazu (15)). Navíc termín „C3i“ označuje jakoukoliv molekulární formu C3 bez intaktní thiolesterové vazby, ale zachovávající C3a polypeptid na alfa 5 řetězci.

Lidská C3 cDNA a kódující sekvence jsou značeny jak ukazuje obr. 2, užitím značení užívaného v EMBL nukleotidové databáze (odvozené od odkazu (2)). Ukázaná sekvence je sekvencí našeho konstruktu ('PC3'), který postrádá prvních 11 nukleotidů z 5' netranslatovaného regionu 10 popsaného v odkazu (2), a proto je první báze značena 12. Putativní iniciační kodon jsou nukleotidy 61-63, kodon pro aminoterminální serinový zbytek beta řetězce jsou nukleotidy 127-129, a kodon pro aminoterminální serinový zbytek alfa řetězce jsou nukleotidy 2074-2076.

Proteinová sekvence je značena v souladu s prekurzorovou sekvencí jak je ukázáno na obrázku 1, 15 která je předpokládané translací DNA sekvence dodatku 1 (u aminokyselin 1-22 se očekává, že zahrnují signální sekvenci, která je odstraněna během biosyntézy, a u aminokyselin 668-671 se očekává, že jsou odstraněny, je-li prekurzor štěpen na alfa a beta řetězce).

Následující zkratky mají následující význam: CVF-faktor kobřího jedu, ELISA- enzymová 20 vazebná imunoadsorbentní zkouška, E. coli - Escherichia coli, kb - kolobáze, HSV-1 - Herpes simplex virus typu 1, PBS- fosfátový pufrovací salinický roztok. COS-1 je buněčná linie odvozená od buněk opičích ledvin. Následující jsou restrikční endonukleázy: AflII, Dral, DralII, EcoRI, EcoRV, HindlII, Nael, Nhel, Xbal.

Standardní metody

Metody pro standardní biologické procedury jako je izolace plazmidů, gelová elektroforéza na agaróze a DNA ligace mohou být nalezeny v odkazech (21). Dvouřetězcová DNA byla sekvenována užitím 'Sequenase version 2,0' kitu poskytnutého 'United States Biochemicals'. 30 C3 exprese byla měřena ELISA plastických plátů předem potažených afmitně purifikovanou polyklonální ovčí anti- lidský C3 protilátkou, na které byly přidány vzorky supernatantu kultury. Vazba C3 byla detekována monoklonální krysí protilátkou kC3 konjugovanému s alkalickou fosfatázou, a chromogenímu substrátu, p-nitrofenol fosfátu. Zkoušky byly kalibrovány s purifikovaným C3 lidské plazmy.

Metody pro purifikaci proteinů komplementu a CVF, a pro přípravu afmitně purifikovaných antiC3 protilátek užívaných v analýze mohou být nalezeny v odkaze (28). Ekvivalentní činidla mohou být také získána od Sigma Chemical Company LTD.

C3 cDNA kódující sekvence

Naše C3 cDNA kódující sekvence byly konstruovány ze dvou segmentů izolovaných z náhodné „primer“ lidské jatemí cDNA knihovny nesené ve vektoru pGEM4 (Promega). Pět oligodeoxynukleotidů, korespondujících známým segmentům v lidské C3 kódující sekvenci, bylo radio45 značeno T4 polynukleotid kinázou a (gama-32P) ATP a užito ke zkoušení filtrových transferů knihovny zagarózových plátů. Byly izolovány dva klony obsahující inzerty přibližně 4 kb.

Digesce restrikční endonukleázou, hybridizace na specifické oligodeoxynukleotidové proby a částečná sekvenční analýza ukázaly, že jedna z nich (Ά13') zahrnuje 5'- konec 5,1 kb sekvence, zatímco druhá ('B44') dosahuje k 3'- konci.

Tyto inzerty se proto přesahují přibližně o 3 kb, včetně jedinečného EcoRI místa pro restrikční enzym. Nekompletní 5' sekce AI3 byla rozrušena EcoRI a Nhel, a nahrazena kompletním segmentem izolovaným zB44 digescí EcoRI a Xbal. Obě části byly purifikovány gelovou

-10CZ 290596 B6 elektroforézou na agaróze s nízkou teplotou tání přes společnou ligací T4 DNA ligázou za vytvoření vektoru ('PGC3') obsahujícího 5,1 kb DNA, kódující celý C3 prekurzorový protein.

Linker sekvence 5' k C3 kódujícímu regionu obsahovaly dva ATG, které jsou potenciálními falešnými startovacími místy translace. Tyto byly proto odstraněny „gapped - plasmid“ mutagenezí, jak je popsáno v metodě příkladu 1, užitím oligodeoxynukleotidu PL-ATC-3 (tagggagacc ggaagcttgc cctctccctc tgtccctctg t), který deletoval přibližně 50 párů bází linker/adaptor DNA, bez alterace C3 kódující sekvence. Tento mutovaný vektor, 7,7 kb obsahující 5,1 kb C3 cDNA sekvence plus 2,6 kb sekvence z PGEM4 vektoru (Promega) je označen jako PC3.

C3 kódující region PGC3 plazmidu byl kompletně sekvenován a vykazoval pouze čtyři odlišnosti od dříve publikované lidské C3 („S“ alela) cDNA sekvence (2).

(i) Změny C2481 ->G, a C2850 ->T nealterují kódování, (ii) TI 001 -^C kóduje dříve popsanou HAV 4-1- (leucin 314 —>prolin) polymorfní formu (20), a (iii) G2716—>A kóduje valin 886-> izoleucin, která nebyla dříve popsána v lidském C3, ačkoliv Ile je nacházen v této poloze u myšího a krysího C3.

Naše sekvence zahrnuje start a stop kodony, s kompletní signální sekvencí a měla by proto kódovat funkční C3.

Hladiny exprimovaného divokého typu C3 vyšší než 1,7 pg/ml v supernatantu kultury COS-1 buněk (transfektovaných užitím lipofectaminu a pcDNA3 (Invitrogen) expresního vektoru) byly detekovány ELISA. Žádný detekovatelný C3 nebyl produkován buňkami transfektovanými samotným pcDNA3 vektorem. Navíc, analýza expresního produktu štěpícími reakcemi následovanými imunoprecipitací, SDS-PAGE a imunoblottingem demonstrovala, že:

(i) primární translační produkt byl správně zpracován do zralé dvouřetězcové formy, (ii) tento produkt byl, jako nativní C3, štěpitelný na C3b C3 konvertázou (CVFBb), a (iii) exprivovaný protein nebyl, jako nativní C3, štěpitelný faktorem H plus I, ale stal se štěpitelným po konverzi na C3b enzymem C3 konvertázou. Toto potvrzuje, že náš počáteční plazmid může být translatován do funkčního C3.

Pro alternativní popis konstrukce a exprese C3 kódující sekvence viz odkaz (25).

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Produkce C3, který má argininové zbytky v obou štěpících místech faktoru I (aminokyselinová poloha 1303 a 1320) konvertována na glutaminové zbytky z důvodu zabránění štěpení C3b fragmentu faktorem I.

a) Mutageneze

Užité mutagenní oligodeoxynukleotidy byly QRI1 (caactgcccagccaaagctccaag a t c a c c),

QRI2 (gccagcctcctgcaatcagaagagaccaag), a AFL4149

- 11 CZ 290596 B6 (taataaattcgaccttaaggtcaccataaaac), stejně jako korespondující „antisense“ oligodeoxynukleotidy QRIln (ggtgatcttggagctttggctgggcagttg), QRI2n (cttggtctcttctgattgcaggaggctggc) a AFL4149n (gttttatggtgaccttaaggtcgatttatta).

QRI1 a QRI2 specificky nahrazují arginin glutaminem ve štěpících místech pro faktor I v aminokyselinovém zbytku 1303 v C3 prekurzorové sekvence (změnou G3968C3969 na AA v cDNA sekvenci) a QRI2 a QRI2n uskutečňují stejnou substituci ve štěpícím místě pro faktor v aminokyselinovém zbytku 1320 (změnou nukleotidu G4019 na A).

AFL4149 a AFL4149n zavádí štěpící místo pro restrikční endonukleázu Af 1II v poloze 4149 do cDNA sekvence (změnou C4149 na T) bez alterace kódované aminokyselinové sekvence. Tyto dva primery byly použity jako markéry, které dovolují identifikaci úspěšné mutageneze na podkladě štěpení DNA produktu Aflll.

Mutageneze byla uskutečněna „gapped plasmid“ metodou. Dávka PGC3 ('UPGC3'), obohacená uridinem v místě thymidinu, byla připravena růstem v E. coli kmenu CJ236 za přítomnosti 0,25 pg/ml uridinu. Tento plazmid byl tráven Smál a 7,2 kb produkt ('US 1') byl purifikován na agarózovém gelu pro odstranění 0,5 kb fragmentu z C3 sekvence (zbytky 1463-1947). Jiná komponenta „gapped plazmidu“ ('DN2') byla připravena trávením PGC3 DralII plus Nael a purifikací 5,1 kb části dvakrát na agarózové gelové elektroforéze. 200 ng DN2 bylo smíseno s přibližně 500 ng US1 v 50 μΐ H₂O, zahřáto na 100 °C a pomalu ochlazeno pod 50 °C před přidáním 20 μΐ až 25 μΐ 2XT7 pufru (lOOmM Tris/HCl/pH 7,4/ 14 mM MgCl₂, 100 mMNaCl, 2mM dithiotreitolu a lmM ATP, dATP, dCTP, dTTP, a dGTP) plus 10 nmol každého 5'-fosforylovaného mutagenního primeru (jedna reakce použila QRI1, QRI2 plus AFL4149, jiná reakce užila QRIln, QRI2n plus AFL4149n). Směs byla znovu zahřáta na 70 °C po 5 min a pomalu ochlazena (v průběhu 30 až 60 min) na 20 °C. Při 0 °C bylo přidáno 10 jednotek T7 DNA polymerázy plus 80 jednotek T4 DNA ligázy. Směs (celkový objem 50 μΐ) byla inkubována nejprve při 0 °C po 5 min, pak při pokojové teplotě po 5 min a nakonec při 37 °C po 3 h. 1 μΐ každé směsi byl použit pro transformaci 100 μΐ superkompetentní XL1 E.coli (Stratagene) podle instrukcí výrobce.

Ampicilin rezistentní kolonie byly vyšetřovány na Aflll štěpení a úspěšné mutanty byly kultivovány v 100 ml kultury, ze které byly izolovány a sekvenovány plazmidy (užitím sekvenčního primeru C3pa-3876, cttcatggtgttccaagcct, odpovídajícího nukleotidům 3876-3895 C3 cDNA) pro charakterizaci mutací ve štěpících místech pro faktor I.

Pro alternativní protokol pro „gapped plasmid“ mutagenezi viz odkazy (26, 27).

b) Transfer mutantní DNA do eukaryotního expresního vektoru.

C3 kódující fragment z mutantních plazmidů byl excidován dvojitou digescí HindlII a Nael. Dral byl také použit pro inkapacitaci reziduálního plazmidu. C3 kódující sekvence byla purifikována na agarózovém gelu a ligována do pcDNA3 vektoru (Invitrogen), který byl linearizován HindlII a EcoRV enzymy a defosforylován telecí střevní fosforylázou. Ligační směs byla užita k transformaci superkompetentní XL1 E.coli, která byla pak umístěna na kultivační pláty obsahující ampicilin.

Náhodný výběr (tři nebo čtyři) ampicilin rezistentních kolonií byl kultivován ve 2-3 ml kulturách za malé škály izolace plazmidové DNA. Plazmidy obsahující správný inzert byly identifikovány digescí plazmidové DNA restrikčními endonukleázami EcRI, HindlII, a Aflll. Korespondující kolonie byly kultivovány ve 100 ml kultury a plazmidy byly purifikovány standardní procedurou. Mutanty byly původně konstruovány zPGC3 a tak zachovávaly dva ATG 5' ke kódujícímu

- 12CZ 290596 B6 regionu. Tento region (plus 5' 3kb C3 kódující sekvence) byl proto excidován HindlII plus EcoRI a nahrazen ligací stejného segmentu vyříznutého zPC3. Tyto rekonstruované vektory byly připraveny standardními procedurami a užity pro transfekci COS buněk.

c) Exprese divokého typu C3 a mutantního C3.

Mutantní a divoký typ C3 byly transientně exprivovány plazmidy transfektovanými do COS-1 buněk užitím lipofectaminu (GIBCO) podle instrukcí výrobce. Typicky bylo transfektováno 1 až 1,5 x 10’ buněk na jamku standardního 6 jamkového kultivačního plátu 2-4 pg plazmidu za použití 9 μΐ lipofectaminového činidla. Supematanty byly hodnoceny na C3 sekreci, a typicky bylo získáno 0,3 až 1,7 pg na ml 3-6 dní po transfekci.

Výsledky

a) Generace mutantů

Následující mutanty, pojmenované podle mutagenních oligonukleotidových sekvencí, které byly inkorporovány, byly dosud izolovány:- (i) 3 mutanty s jak QRI1, tak QRI2 mutací plus AFL4149: C3M-26, C3M-58, a C3M-61, (ii) 1 mutant s jak QRI1, tak QRI2 mutací, ale bez AFL4149: C3M-8 (iii) 1 mutant s QRI2 a AFL4149, ale bez QRI1: C3M-51 (užity v příkladu 1).

b) Potvrzení, že funkční efekty byly způsobeny mutacemi specificky zavedenými do faktor 1 štěpících míst.

Sekvenování potvrdilo nepřítomnost jiných alterací v 178-350 bázích okolo mutovaného regionu každého mutantu. Sekvence jednoho mutantu produkovaného tímto postupem, C3M-51 (viz příklad 3), byla analyzována pro celý „gap“ (báze 2463-5067) užitý v mutagenezi, a žádné jiné odchylky od divokého typu sekvence nebyly nalezeny.

Navíc, reprezentativní sekvenování celkem 2922 bází ze všech mutantů neodhalilo žádnou jednoduchou mutaci, která by mohla být způsobena polymerázou zprostředkovanými chybami. Exprivované mutanty všechny vykazovaly dvouřetězcovou strukturu a štěpení C3 konvertázou, charakteristické pro nativní C3. Souhrnně, užité mutanty pravděpodobně neobsahují žádné nežádoucí změny, ačkoliv nebyly kompletně resekvenovány.

Příklad 2: Produkce C3, který má argininový zbytek v jednom štěpícím místě faktoru I (aminokyselinová poloha 1303) konvertovaný na glutaminový zbytek

Byl sledován postup příkladu 1 s tou výjimkou, že v mutagenezi byly použity pouze mutagenní oligonukleotidy AFL4149 plus QRI1 nebo AFL4149n plus QRIln (t.j. bez QRI2 nebo QRI2n).

Výsledky

a) Získané mutanty:

Byly získány 2 mutanty s QRI1 a AFL4149, ale bez QRI2:-C3M-I23,27. Mutant C3M-I23 byl exprivován jak je popsáno v příkladu 1.

- 13CZ 290596 B6

Tento protein byl štěpitelný CVFBb. C3-b podobný produkt byl relativně (ve srovnání s divokým typem) rezistentní na štěpení faktory I a H v pozici 1303, ale stále mohl být štěpen v poloze 1320. Tento C3b derivát je proto částečně rezistentní na faktor I.

Příklad 3: Produkce C3, kteiý má argininový zbytek v jednom štěpícím místě faktoru I (aminokyselinová poloha 1320) konvertovaný na glutaminový zbytek

Byl sledován postup příkladu 1 s tou výjimkou, že v mutagenezi byly použity pouze mutagenní oligonukleotidy AFL4149 plus QRI2 nebo AFL4149n plus QRI2n (t.j. bez QRI1 nebo QRIln).

Navíc, metoda použitá v příkladu 1 také produkovala jeden mutant s QRI2 a AFL4149, ale bez QRI1.

Výsledky

a) Získané mutanty:

Byly izolovány 3 mutanty s QRI2 a AFL4149, ale bez QRI1:-C3M-51, C3M-Q2, C3M-Q13. Mutant C3M-51 byl exprivován jak je popsáno v příkladu 1. Tento protein byl štěpitelný CVFBb. C3-b podobný produkt nebyl snadno štěpen faktory I a H v poloze 1320, ale stále mohl být štěpen v poloze 1303. Tento C3b derivát je proto částečně rezistentní na faktor I.

Příklad 4: Analýza funkčních efektů mutací

Supematanty (100-400 pl) z transfektovaných COS buněk byly inkubovány při 37 °C po 2 h s:

COS buňky byly transfektovány pcDNA3 nesoucími inzerty:-

1) nemutované C3 sekvence

2) mutantní C3M-I23 (kódující Arg¹³⁰³ —>Gln)

3) mutantní C3M-26 (kódující Arg¹’°^J ->Gln, Arg¹³²⁰ ->Gln) a

4) mutantní C3M-51 (kódující Arg^lj20 ->Gln) ^{200 * * * * * * * * * * * * *}

200 μΐ supematantů kultur, odebraných 3 dny po transfekci, bylo předošetřeno 2mM fenylmethansulfonyl fluoridem (0 °C, 15 min) a pak inkubováno při 37 °C po 2 hodiny s následujícími:

A) žádná příměs

B) přeformovaná C3 konvertáza, CVFBb (10 μΐ z 200 μΐ obsahujících 6,6 μg CVF, 100 μg faktoru B a 1,4 μg faktoru D ve fosfátovém pufrovacím salinickém roztoku (PBS) obsahujícím mM MgCl₂, preinkubovaném při 37 °C, 15 min),

C) faktory H (5 μg) a I (1 pg), a

D) CVFBb plus faktory Hal.

Tyto byly poté imunoprecipitovány přidáním 0,6 pg afinitně purifikovaného ovčího anti-lidského C3 imunoglobulinu při pokojové teplotě a po 1 hodině přidáním 20 μΐ 5% suspenze promytých formalinem fixovaných buněk Streptococcus sp. skup. C (protein G) (Sigma). Po min při pokojové teplotě byly částice jednou promyty v PBS, 5 mM NaN₃, a jednou v 20 mM

Tris/HCl, 137 mM NaCl, 0,1% (obj./obj.) Tween 20, pH 7,6, před eluací v 1% SDS/2%

- 14CZ 290596 B6

2-merkaptoetanolu (90-100 °C, 5 min). Tyto eluáty byly separovány SDS-PAGE, elektroblotovány do nitrocelulózy a C3 proužek byl detekován probováním s afinitně purifikovaným ovčím anti-lidským imunoglobulinem následovaným křenová peroxidáza konjugovaným oslím anti-ovčím imunoglobulinem (Sigma) a detekcí užitím „Enhanced Chemiluminiscence“ substráty poskytnutými Amersham. Je ukázána fotografie 2 minutové expozice na rentgenový film. Viditelné C3-odvozené proužky jsou indikovány značenou šipkou, a jednotlivé vzorky (1—4, A-D) jsou ty, které byly právě popsány. (Prominentní proužek okolo 50 kDa (mezi 46-68 kDa proužky) přítomný ve všech vzorcích je těžký řetězec IgG užitý v imunoprecipitaci a detekovaný křenová peroxidáza - konjugátový oslí anti-ovčí imunoglobulin).

Výsledky (viz obrázek 3)

1. Všechny neošetřené vzorky (1-A, 2-A, 3-A, 4-A) obsahovaly proužky korektní migrace pro alfa a beta řetězce C3, indikujíc tak, že všechny mutanty jsou exprivovány, a posttranslačně zpracovány správně. Přítomnost 43 nebo 46 kDa proužků v těchto vzorcích indikuje přítomnost některé faktoru H + faktoru I-podobné aktivity v kultivačním médiu. Spontánní hydrolýza C3 během 3denní biosyntetické periody produkuje C3i, který je štěpen touto aktivitou. V nemutovaném C3 toto generuje proužky 43 kDa a 75 kDa (75 kDa není viditelný, jelikož (i) je zakryt 75 kDa beta řetězcem, a (ii) protilátka použitá k vývoji Western blot má velmi malou aktivitu k této části C3 alfa řetězce:- jeho přítomnost byla následovně potvrzena reprobováním krysí monoklonální protilátkou, ,,Clone-3“, která je specifická pro tento region). Přidání faktorů H a I bez CVFBb (1-C, 2-C, 3-C, 4-C), neštěpilo zbývající C3 indikujíc tak, že tento reprezentuje aktivní C3 (thiolester intaktní).

2. Nemutovaný C3 (1) je štěpen CVFBb a C3b produkt je dále štěpen endogenními enzymy v 1-B nebo přidanými faktory Hal v 1-D. 43 kDa proužek indikuje štěpení v Arg¹³²⁰, a 68 kDa proužek (viditelný při delší expozici) indikuje štěpení v Arg¹³⁰³.

3. Mutantní C3M-I23 (Arg^l30'->Gln) byl štěpitelný CVFBb a produkt byl relativně rezistentní na endogenní aktivitu faktorů H a I-podobná (2-B), s persistujícím malým množstvím alfa řetězce (C3b), ale stále štěpitelný, pokud byl extra přidán faktor H a I. 43 kDa produkt indikuje štěpení v Arg¹³²⁰, (slabý proužek 71 kDa reprezentující jiný fragment alfa řetězce může být viditelný při delší expozici), ale nebyl přítomen žádný 68 kDa proužek, ukazujíc tak, že mutant je rezistentní na štěpení v mutovaném Gin¹³⁰³.

4. Mutant C3M-26 (Arg¹³⁰³->Gln, Arg¹³²⁰—>Gln) byl štěpitelný CVFBb a C3b-podobný produkt (alfa') byl rezistentní na endogenní aktivitu faktoru H a I (3-B). Byl také velmi rezistentní na adiční faktory H a I (3-D) ve srovnání s nemutovaným C3 (1) a jinými mutanty (2 a 4). Bylo zde malé množství produktu o 46 kDa, což indikuje nějaké štěpení v mutovaném Gln^lj03 (doprovázející 68 kDa fragment byl také viditelný při delší expozici). Byl zde málo nebo vůbec nedetekovatelný 43 kDa, který by korespondoval s jakýmkoliv štěpením v Gin¹³²⁰. Proto je Arg->Gln mutace v poloze 1303 méně efektivní než ta v poloze 1320 v zabránění štěpení faktorem I. (Toto malé reziduální štěpení se také může vyskytovat u mutantu C3M-I23 (Arg¹³⁰³—>Gln), ale 46 kDa intermediát je pravděpodobně rychle zpracován na 43 kDa dalším štěpením v nemutovaném Arg¹³²⁰).

5. Mutant C3M-51 (Arg¹³²⁰->Gln) byl štěpitelný CVFBb a produkt byl štěpený endogenní aktivitou faktoru Hal (4—B), a adičními faktory H a I (4-D). 46 kDa produkt (a slabý 68 kDa proužek) indikují štěpení v Arg¹³⁰³. Nicméně, absence 43 kDa proužku indikuje, že není štěpen v mutovaném Gin¹³²⁰.

-15CZ 290596 B6

Příklad 5 Srovnání různých aminokyselinových substitucí v poloze 1303

1. Úvod

Předchozí příklady popisují mutace arg 1303 a arg 1320 na glutaminové zbytky. Obě mutace udělují rezistenci na štěpení faktorem I v těchto polohách. Nicméně, je zde malý, ale detekovatelný stupeň štěpení v gin 1303. Proto bylo provedeno množství jiných aminokyselinových substitucí v této poloze a testováno. Štěpení se vyskytuje, s klesající účinností, je-li zbytek 1303: Arg>Tyr>(Cys nebo Trp) > Gin > (Glu nebo Gly). Tyto výsledky jsou neočekávané, jelikož (i) všechna známá přirozeně se vyskytující lidská faktorem I zprostředkovaná štěpení mají C-konec k argininovému zbytku, a tak bylo vydedukováno, že enzym má požadavek pro arginin, a (ii) jestliže bude štěpen v jiném zbytku lze předpokládat, že by mělo být elektrostaticky podobné argininu, t.j. bazický zbytek (Lys nebo His), (t.j. trypsin selektivně štěpí C-konec k arg, lys nebo his), a tak nemůžeme předpokládat štěpení tyrosinové substituce.

Proto je substituce arg 1303 glycinem nebo kyselinou glutamovou preferována za účelem vytvoření derivátu C3 rezistentního na inaktivaci faktorem I.

2. Metody

2.1 Mutageneze: degenerování použitých mutagenních primerů bylo: caactgcccagc(gt)(ag)(cg)agctccaagatcacc (písmena v závorkách indikují směs bází v těchto pozicích). Mutanty byly konstruovány buď „gapped plasmid“ metodou (jak byla popsána v dřívějších příkladech), nebo „megaprimerovou“ metodou (V. Picard et al., Nuc Acid Res 22:2587-91, (1994)), ve které „upstream“ primer byl caccaggactgaatctagatgtgtccctc a „downstream“ primer byl gttttatggtgaccttaaggtcgaatttatta. Všechny mutace byla provedeny na templátech, ve kterých C3- kódující DNA byla už mutovaná tak, že aminokyselinovým zbytkem 1320 byl glutamin, arestrikční místo pro AflII bylo zavedeno do polohy 4149 (jak je popsáno v dřívějších příkladech) a toto bylo potvrzeno sekvencováním.

2.2 Exprese: mutanty byly exprivovány v COS buňkách užitím pcDNA3 vektoru jak je popsáno v dřívějších příkladech biosynteticky značeny (³⁵S) methioninem v séru prostém médiu.

2.3 Zkouška: supematanty byly ošetřeny CVFBb (vytvořeného reakcí CVF s faktory B a D v hořčík obsahujícím pufru) a faktory Hal následovanými imunoprecipitací s anti-C3 a separací SDS-polyakrylamidovou gelovou elektroforézou provedenou za redukčních podmínek (jak je popsáno v dřívějších příkladech). Gel byl fixován, ošetřen Amersham „Amplifý“ činidly, sušen a exponován na autoradiografickém filmu za získání výsledků uvedených na obrázku.

3. Výsledky

Faktorem I zprostředkované štěpení v poloze 1303 (místo 1), bez štěpení v 1320 (místo 2) (kde toto bylo mutováno na glutamin) produkovalo proužky 46 a 68 kDa. Může být pozorováno, že se štěpení vyskytuje v pořadí: arg(R) > tyr(Y) > cys(C) > a trp(W) > gln(Q) > gly(G) a glu(E). Divoký typ (arginin v obou pozicích) je štěpen v obou polohách za produkce fragmentů 43 (příliš malý na to, aby byl viditelný na tomto gelu) a 68 kDa.

4. Obrázek

Výsledky jsou ukázány na obrázku 4. Zbytky v místě 1 (poloha 1303) a místě 2 (1320) jsou indikovány nad příslušnými dráhami.

- 16CZ 290596 B6

Příklad 6 Demonstrace zvýšené rezistence na inaktivaci faktory I a H po mutaci arg 1303 na gin.

1. Úvod

Předchozí příklady demonstrují, že konverze buď arg 1303, nebo arg 1320 na glutamin učiní toto místo rezistentní na štěpení faktorem I. Mutace obou míst vytvoří molekulu, která je rezistentní na štěpení v obou místech. Zde dále demonstrujeme, že mutace arg 1303 na gin samotná (bez alterace arg 1320) vede ke srovnatelné rezistenci, ve srovnání s divokým typem, na funkční inaktivaci faktory I a H.

2. Metoda

2.1 Exprese: Příprava arg 1303->gln mutace byla popsána v dřívějším příkladu. Tato byla transfektována do CHO (obecná laboratorní buněčná linie odvozená od ovariálních buněk čínského křečka) kalcium-fosfátovou metodou a stabilní transfektanty byly selektovány na podkladě rezistence na G418 („Geneticin“ dostupný u Sigma). Supematanty buněčných kultur byly shromážděny a exprivovaný C3 byl částečně purifikován precipitací síranem sodným (10-20% (hmotn./obj.) frakce), a iontovou výměnou chromatografií na Q-sepharose a mono-Qsepharose (A W Dodds Methods Enzymol 223:46 (1993)).

2.2 Zkouška: Ovčí erytrocyty byly potaženy SO16 monoklonální protilátkou (R A Harrison a P J Lachmann, Handbook of Experimental Immunology 4^th Edition kap. 39 (1986)) a 4,4 ml 5% (obj/obj.) suspenze pak bylo inkubováno s přibližně 10 pg C2, 24 pg C4 a 1 pg Cl (purifikované lidské komponenty) po 10 min při 37 °C v CFD (R A Harrison and P J Lachman supra). 0,8 ml této směsi pak bylo inkubováno po 105 min s 0,25 ml obsahujícími semi-purifikovaný mutant nebo divoký typ C3 a EDTA do koncové koncentrace 12,5 mM. Buňky byly pak promývány v CFD a použity v CFD obsahující 0,1% (hmotn./obj.) želatiny (CFD-gel). Radioligand vázaný s (^12:>I)-značenou klon 4 monoklonální anti-C3 protilátkou byl použit pro potvrzení toho, že bylo deponováno stejné množství C3b divokého typu nebo mutantního C3b.

Pro zkoušku bylo rozpuštěno 40 pl 5% suspenze buněk v 250 pl CFD-gelu a 50 pl aliquoty byly inkubovány s 50 pl CFD-gelu obsahujícího rozpuštěné faktory I a H v konečné koncentraci 100, 10, 1 a 0,1 pg/ml každého, při 37 °C po 30 min. 0,9 CFD pak bylo přidáno, buňky byly peletovány centrifugací a promyty dvakrát více než 1 ml CFD pokaždé. Buňky pak byly resuspendovány v 100 pl CFD-gelu, obsahujícího 1 pg/ml faktoru B, 100 pg/ml properdinu, 1 pg/ml faktoru D a 0,3 mM NiCh- Po 10 minutách při 37 °C, 0,9 ml CFD obsahujícího 10 mM EDTA a 2% (obj./obj.) normálního morčecího séra. Po dalších 30 min při 37 °C byly nelyžované buňky peletovány centrifugací, a stupeň lýze byl určen měřením absorbance supematantu při 412 nm. Absorbanční ekvivalent ke 100% lýze byl určen z aliquoty buněk lyžovaných ve vodě, a proto bylo kalkulováno procento lýzy.

Tato zkouška měří schopnost deponovaného C3b formovat funkční C3bBbP konvertázu. Konverze iC3b brání formování konvertázy a následné lýze v sérum/EDTA.

3. Výsledky

Výsledky ukázané na obrázku indikují, že více než desetkrát více faktoru I a faktoru H je požadováno pro dosažení hemolytické aktivity argl303->gln mutantu ve srovnání s divokým typem. Tato mutace je proto výhodná pro vytvoření derivátu C3, jehož produkt C3b je rezistentní na inaktivaci faktory Hal. Efekt může být buď díky vyšší rezistenci na štěpení v poloze 1303 (je-li arg mutován na gin), nebo díky vyšší rezistenci na štěpení v poloze 1320, je-li štěpení nejprve umístěno v poloze 1303.

- 17CZ 290596 B6

4. Obrázek

Výsledky jsou ukázány na obrázku 5. X osa indikuje koncentraci faktorů H a I. Q1 reprezentuje argl303-»gln mutaci. % lýze je měřeno jak popisuje metoda.

Diskuse

Základní rysy lidského C3, s ohledem na modifikované varianty zde popsané, jsou:

(i) Molekula má funkční C3b-podobný derivát, ve kterém může být kombinován s funkčním aktivním lidským faktorem B, který pak může být štěpen lidským faktorem D za vytváření enzymu schopného štěpení lidského C3.

(ii) Aminokyselinová sekvence derivátů je více homologní k lidskému C3 než kC3 z jiných druhů, pro které je sekvence nyní známá, nebo jakékoliv jiné nyní známé proteinové sekvenci. Strukturální rysy C3 přítomné v divokém typu, ale ne nezbytně v modifikovaných derivátech, zahrnují následující:

a) DNA kódující sekvence a sekvence translatovaného proteinu pro variantu lidského C3 užitého v příkladech podle vynálezu zde popsaných jsou dány v obrázcích 2 a 1, v příslušném pořadí. Tato proteinová sekvence se liší od publikované sekvence (2) v právě dvou aminokyselinách (detaily jsou dány v příkladech). Bylo předpokládáno, že více variací je kompatibilních s C3 funkcí, třebaže většina není přítomná v populaci.

b) Primární translační produkt je proteolyticky zpracován do dvou disulfidicky vázaných řetězců, alfa (zbytky 672-1663) a beta (zbytky 23-667), s odstraněním signální sekvence (zbytky 1-22).

c) Zralý protein obsahuje thiolesterovou vazbu mezi zbytky CyslOlO a Gin 1013.

d) C3 konvertáza štěpí C3 za odstranění C3a (zbytky 672-748). Tato reakce je provázena rozbitím thiolesterové vazby.

e) Za přítomnosti faktoru H štěpí faktor 1 C3b mezi zbytky Arg 1303 a Ser 1304, a mezi Argl320 a Serl321.

Modifikace provedené na nativní C3 molekule

Nahrazení Arg 1303 Gin

Tato modifikace je v jednom místě štěpení C3b faktorem I. Efektem je redukce rychlosti štěpení faktorem I v této poloze. Změna na glutamin byla vybrána kvůli odstranění pozitivního náboje argininu, který je pravděpodobně důležitý pro serin proteázovou aktivitu faktoru I, protože udržuje hydrofilní charakter a podobnou velikost postranního řetězce, což může minimalizovat jakékoliv disurpce v terciální struktuře proteinu. Důkazem podporujícím tento předpoklad je to, že mutace nebrání zpracování do dvouřetězcové struktury, formování thiolesteru nebo štěpení C3 C3 konvertázou. Mutace Argl303 na jinou aminokyselinu může dosáhnout podobného nebo i vyššího efektu, jak je demonstrováno v příkladu 5.

Je také možné redukovat toto štěpení mutováním Serl304 (jiná strana štěpícího místa) nebo jiných zbytků zahrnutých v interakci enzym-substrát.

-18CZ 290596 B6

Nahrazení Argl320 Gin

Tato modifikace je v jiném místě štěpení C3b faktorem I. Efektem je drastická redukce (prakticky zrušení) stupně štěpení faktorem I v této poloze. Změna na glutamin byla provedena za stejných podmínek jako jsou popsány výše, a tato mutace také nebránila zpracování do dvouřetězcové struktury, formování thiolesteru nebo štěpení C3 C3 konvertázou. Opět, mutace jiné aminokyseliny může vést k stejnému efektu, jako například mutace Serl321, nebo jiných zbytků zahrnutých v interakci enzym-substrát.

Při kombinaci dvou mutací, Argl303->Gln a Argl320->Gln. je předcházeno C3b inaktivaci a proto zachování jeho schopnosti vytvářet část aktivní C3bBb konvertázy. Jiné mutace (včetně kombinací mutací), které ruší obě štěpící reakce, mohou byl také použity (například Argl303 Glu nebo Argl303 Gly může být použita v kombinaci s Arg 1320 Gin).

Příklad 7 Různé mutace, které redukují interakce C3b/C3i faktorem H

7.1 Úvod

Jiné laboratoře produkovaly důkazy založené buď na vlivu syntetických peptidů (Ganu, V.S. and Muller - Eberhard, H. J., 1985, Complement 2:27. Becherer, J. D. et al., 1992,

Biochemistry 31:1787-1794), nebo limitované mutageneze (Taniguchi - Sidle, A. and Isenman, D. E., 1994, J. Immunol. 153: 5285 -5302), které naznačují, že zbytky 752-761 v primární sekvenci C3 transkriptu (viz obr. 1) mohou být zahrnuty v interakci s faktorem H. Nicméně, jiní publikovali důkazy, které naznačují, že v interakci s faktorem H jsou zahrnuty pouze zbytky 767-776, zatímco zbytky 752-761 jsou důležité pro interakci s faktorem B (Fishelson, 1991, Mol. Immunol. 28:545-552). Předpokládejme, že více extenzivní mutageneze tohoto regionu může redukovat afinitu pro faktor H a proto byt žádoucí pro objektivní vytváření C3 derivátu, který je rezistentní na faktor H. Navíc se domníváme, že významnými zbytky pro mutaci mohou být prominentní kyselá rezidua (kyselina aspartová a glutamová) a že bude žádoucí změnit je na neutrální zbytky, které s menší pravděpodobností mediují silné interakce. V tomto příkladu jsme změnili zbytky 752-754 z Asp - Glu-Asp na Gly-Ser-Gly v kombinaci se změnou zbytků 758 - 760 z Glu-Glu-Asn na Gly-Ser-Gly. Produkt vykazoval redukované štěpící charakteristiky konzistentní s redukcí citlivosti na faktor H. Toto poskytuje důkaz, že C3 může být modifikován k redukci vazby faktoru H, a proto citlivosti na faktory Hal. Tyto modifikace jsou žádoucí pro vytvoření C3 konvertázy, která je stabilní za fyziologických podmínek.

7.2 Metoda

Metody mutageneze, exprese a analýzy byly popsány v dřívějších příkladech. Mutagenní oligonukleotid, který byl syntetizován, měl sekvenci:

agtaacctgggttcggggcatcattgcaggatcgggcatcgtttcc.

7.3 Výsledky

Výsledky štěpících reakcí jsou ukázány na obr. 6. Tyto indikují, že:

1. Adice CVFBb k divokému typu C3 vede k eliminaci alfa řetězce (dráha 2), jelikož C3b, který je formován, je citlivý na nízké koncentrace faktoru I a H v supematantu kultury. C3i, který byl vytvořen během exprese nebo následné inkubace, byl rozrušen na iC3i stejným způsobem. Přidání exogenních faktorů I a H (dráhy 3 a 4) se zde neliší od drah 1 a 2, protože médium samo obsahuje dostatek aktivity faktoru H a I k efektu kompletního štěpení.

-19CZ 290596 B6

2. Oproti tomu ošetření mutantu C3 CVFBb (dráha 6) nevede k vymizení alfa řetězce. Je zde určité generování alfa, korespondujícího k C3b, ale některé z těchto všech zbývají, indikujíc tak, že perzistence alfa řetězce není jenom výsledkem selhání štěpení CVFBb. Zbývající neštěpený 5 alfa řetězec v dráze 2 může proto reprezentovat C3i, který nebyl štěpen endogenní aktivitou faktorů Hal, ačkoliv je také možné, že některé z nich reprezentují nativní C3 perzistující tehdy, je-li pro mutant požadována parciální rezistence na CVFBb. Přidání vysokých koncentrací exogenních faktorů H a I (dráha 7 a 8) produkuje depleci alfa a alfa' řetězců, což indikuje, že (i) mutant není kompletně rezistentní na tyto faktory a (ii) alfa řetězec neštěpený CVFbb v dráze 2 je 10 predominantně odvozen od C3i (který je štěpitelný faktory Hal, ale ne CVFBb) než od nativního C3 (který je štěpitelný CVFBb, ale ne faktory H a I). Stále ještě není štěpen všechen alfa řetězec, jako v dráze 8, pravděpodobně z důvodu rezistence na faktory Hal.

Proto mohou mutace zbytků 752-754 a zbytků 758-760 generovat C3 molekulu, která stále ještě 15 může být štěpena C3 konvertázou, aleje parciálně rezistentní na účinek faktorů H a I. Ve světle nově publikovaných dat je toto pravděpodobně z důvodu mutací, které modifikovaly region, který'je zahrnut v interakci s faktorem H a proto vedou k redukované afinitě k faktoru H.

Příklad 8 Místo v C3, které může být mutován pro modifikaci interakce C3i s faktorem B

8.1 Úvod

Předchozí příklady demonstrovaly, že mutace C3 mohou modulovat interakce s faktory Hal. Pro 25 objevení nových míst v C3, která mohou interagovat s faktorem B jsme srovnávali známé sekvence C3 molekuly od různých druhů, stejně jako dostupné sekvence pro C4 a jiné homologní proteiny. Identifikovali jsme region korespondující zbytkům 1427-1433 lidského C3, který může být zahrnut v C3 a C4 specifických funkcích. Tyto mohou zahrnovat interakce s faktorem B (nebo jeho homologem, C2, v případě C4), ale ne nezbytně, protože jiné potenciální funkce 30 zahrnují formování thiolesteru, konverzi na C3b (nebo C4b formu), interakci se substrátem C3 a/nebo C5 v konvertázové aktivitě a interakci s faktorem I a jeho kofaktory. Proto byly selektované zbytky mutovány do korespondujících zbytků (podle seřazení sekvence) nacházených v jiných homologních proteinech, v tomto případě lidském C5. Tak byl změněn zbytek 1427 z Arg na Gin, zbytek 1431 z Lys na Asp, a zbytek 1433 zGlu na Gin. Výsledný 35 mutant byl shledán citlivým na štěpení C3 konvertázou (CVFBb) a C3b produkt byl štěpitelný faktory Hal. Nicméně, tento mutant nepodporoval konverzi faktoru B na Bb plus Ba, která je závislá na vazbě faktoru B na C3i (nebo C3b). Proto máme důkaz, že tento refion má menší interakci s faktorem B. Zatímco je toto nežádoucí pro generování superaktivní C3 konvertázy, poskytuje to indikaci, že jiné modifikace tohoto regionu C3 budou také alterovat interakci 40 s faktorem B, a některé z nich budou pravděpodobně zvyšovat afinitu. Následek takových mutací může také zvyšovat stabilitu a aktivitu biomolekulámího konvertázového enzymu C3bBb (nebo C3iBb).

8.2 Metody

Přehled ukázaný v tabulce 1 dále dokládá, proč se domníváme, že tento refion je kandidátem pro mutagenezi. Předpokládáme, že charakter jistých zbytků byl dobře konzervován vC4 a C4, ale mírně se lišil u obou proteinů. Zbytky 1427, 1431 a 1433 byly vybrány, jelikož jejich přirozený náboj může být ukazatelem skupiny zahrnuté v protein - protein interakcích. Byly provedeny 50 změny ke korespondujícím zbytkům v lidském C5, protože vykazovaly velmi odlišné elektrostatické vlastnosti, ale v kontextu některých jiných konzervovaných zbytků, které mohou indikovat podobnou lokální strukturu.

-20CZ 290596 B6

Tabulka 1

Připojení sekvencí C3 a příbuzných molekul k regionu zbytků 1427-1435 lidského C3

Zbytek (člověk)

Protein	Druh	1427	1428	1429	1430	1431	1432	1433	1434	1435
C3	člověk	R	Y	I	s	K	Y	E	L	D
	myš	R	Y	I	S	K	Y	E	M	N
	krysa	R	Y	I	S	K	Y	E	M	D
	morče	R	Y	I	S	K	Y	E	L	D
	králík	R	Y	I	s	K	Y	E	L	N
	kobra	R	Y	I	s	K	F	E	I	D
	Xenopus	R	Y	I	s	K	Y	E	V	N
	pstruh	R	Y	I	E	K	F	E	M	D
C4	člověk	R	Y	v	S	H	F	E	T	E
	myš	R	Y	v	S	H	F	E	T	D
Slp	myš	R	Y	v	S	H	F	E	T	D
C3/C4-	„haglish“	N	Y	I	V	Q	Y	E	I	R
podobný	mihule	K.	Y	I	S	N	Y	E	I	T
C5	člověk	Q	L	F	T	D	Y	Q	I	K
	myš	Q	L	L	T	D	Y	Q	I	K
A2M	člověk	P	T	V	K	M	L	E	R	S
	myš	P	s	V	K	R	L	Q	D	Q
	krysa	P	T	V	K	M	L	E	R	s
PZP	člověk	P	T	V	K	M	L	E	R	s
Murinogl obulin	myš	P	T	V	K	K	L	E	R	L
A1M	krysa	P	s	V	K	K	L	Q	D	Q
A1M	g.křeček	P	T	v	K	K	L	E	R	s
A1I3	krysa	P	T	v	K	K	L	E	R	L

Metody mutageneze, exprese a analýzy C3 štěpících reakcí byly stejné, jako jsou popsány v předcházejících příkladech (příklady 1-4). Mutagení oligonukleotid byl syntetizován se sekvencí: tggtgttgaccaatacatctccgactatcagctggacaa.

Zkouška pro obrat faktoru B

Exprivovaný produkt byl purifíkován z média COS buněk afinitní purifikací na koloně Cloně - 3 - Sepharose jak popisuje příklad 9. Tato metoda vedla ke značné konverzi thiolester rozrušené formy C3i. Divoký typ C3 byl izolován stejnou procedurou. Diluovaný divoký typ C3 (1/5, 1/25 a 1/125) byl zpracován na SDS-PAGE gelu (redukční podmínky) spolu s mutantním C3, a barvení stříbrem indikovalo, že mutant byl přítomen v koncentraci ekvivalentní ko něco méně než 1/25, ale o něco více než 1/25 ředění divokého typu. Stejná ředění byla použita ve zkoušce na obrat faktoru B. 5 μΐ těchto C3 bylo inkubováno s 25 μΐ CFD-G obsahujícího 5 μg/ml faktoru D a přibližně 1,6 μg/ml ¹²⁵I-značeného faktoru B (přibližně

-21 CZ 290596 B6

1000-2000 dpm/μΐ) po 3 h při 37 °C. Vzorky pak byly analyzovány SDS-PAGE (redukční podmínky) s autioradiografií sušeného gelu. Výsledky jsou ukázány na obr. 7.

8.3 Výsledky

Jak ukazuje obr. 7, zřetelné štěpení faktoru BV se vyskytuje ještě v 1/125 ředění divokého typu C3 (C3i). Oproti tomu, žádné signifikantní štěpení nebylo pozorováno v přítomnosti mutantního C3, ani neředěného, který byl v koncentracích vyšších než 1/125 vzorek divokého typu.

U tohoto mutantu se proto jeví, že má porušenou schopnost podporovat štěpení faktoru B, nej pravděpodobněji redukci afinity vazby pro faktor B. Z tohoto důvodu je toto region C3, který může být mutován pro modulaci interakce mezi C3i (nebo C3b) a faktorem B a také snad stabilitu konvertázy (C3iBb nebo C3bBb).

Příklad 9 Purifikace exprivovaných C3 mutantních molekul

9.1 Úvod

Tento příklad demonstruje, jak mohou být mutantní C3 molekuly izolovány z expresního média, jako je kultivační médium transfektováných eukaryotických buněk. Jednoduchou afmitní purifikací jsou C3 molekuly získány v čistotě dostatečné pro funkční testy a pro konjugaci s protilátkou metodou popsanou v příkladu 10. Ačkoliv eluce z protilátky je spojena s hydrolýzou značné části vnitřních thiolesterů je C3i produkt stále ještě vhodným prekurzorem pro generaci aktivní C3 konvertázy, stejně jako pro produkci C3i-protilátkových konjugátů. Tento přístup je také pravděpodobně využitelný jako část přípravy vyžadované pro in vivo užití.

9.2 Metoda

Afmitní purifikace na Cloně - 3 - Sepharose

Cloně - 3 je krysí monoklonální protilátka, která je specifická pro C3 a jeho deriváty, včetně C3b a C3i (Lachmann, P. J. et al., 1980, J. Immunol. 41:503-515). Jsou dosažitelné jiné monoklonální protilátky proti C3 a v některých případech byly úspěšně použity v izolování C3 z malých množství lidské plazmy (Dodds, A. W., 1993, Methods Enzymol. 223:46-61) a jsou proto také pravděpodobně aplikovatelné pro izolování molekul exprivovaných ex vivo. IgG frakce byla spojena na Sepharosa CL-4B užitím kyanobromidu (metodologie může být nalezena v Harrison and Lachman, 1986, Handbook of Experimental Immunology, 4. vyd., vyd. Weir, Herzenberg, Blackwell and Herzenberg, Blackwell, Oxford). Supernatanty kultur byly buď přímo vloženy do kolon této pryskyřice (re-cirkulované), nebo nejprve koncentrovány precipitací s 25% (hmotn./obj.) Na₂SO₄, a resolubilizací a dialýzou do PBS, 5 mM NaN₃. Kolony pak byly promývány postupně (i) PBS, 5 mM NaN₃ a (ii) PBS obsahujícím 1M NaCl. Vazba C3 se eluuje s 50 mM boritanu sodného pufrem, pH 10,5, a je okamžitě neutralizována odebíráním 0,9 ml frakcí do 0,1 ml 1M Tris/HCl pH 7. Materiál je pak dialyzován do PBS, 5mM NaN₃.

Příprava C3 nesoucího „His - Tag“ „His-Tag“ je vlákno histidinových zbytků, které vykazuje afinitu pro kolony nesoucí ionty niklu. Tato metoda byla využita pro izolaci exprivovaných proteinů. Domnívali jsme se, že může byt užitečná pro izolaci exprivovaných mutantních C3 molekul a tak jsme užili inzertní mutageneze pro vytvoření plazmidu kódujícího C3 s připojenými 6 histidinovými zbytky na karboxy konci (přímo na karboxy konec ke zbytku (1663). Toto umístění pro His - Tag bylo vybráno tak, aby minimalizovalo interferenci se syntézou, skládáním, zpracováním a tvorbou disulfídových vazeb nascentní C3. Zbytek 1661 je cysteinový zbytek, který je zahrnut

-22CZ 290596 B6 v disulfidové vazbě na zbytek v sekvenci dřívější (pravděpodobně Cys 1537, Dolmer, K. and Sottrup - Jensen, L., 1993, FEBS-Lett 315: 85—90) a proto se zdá být opatrné udělat inzerci za tímto strukturálním rysem. Mutace byly zavedeny použitím „gapped plasmid“ techniky užité v příkladu 1, užitím syntetizovaného mutagenního oligonukleotidu se sekvencí: tgggtgccccaaccatcatcatcatcatcattgaccacaccccc.

Inkorporace korektní sekvence byla potvrzena DNA sekvenováním. Tato DNA sekvence může nyní být transferována do expresního vektoru. Po transfekci eukaryotních buněk by mělo být možné izolovat exprivovaný C3 díky afinitě pro kolonu nesoucí ionty niklu, nebo jakoukoliv jinou matrici se specifickou afinitou pro „His - Tag“.

9.3 Výsledky

Množství mutantního C3 bylo purifikováno na Cloně - 3 - Sepharose, včetně těch, které jsou popsané v příkladu 1 a 2 a jsou exprivovány v CHO buňkách. Produkty si uchovávají schopnost podporovat štěpení faktoru B faktorem D. Stejná metoda byla použita k izolaci mutantů popsaných v příkladu B2, exprivovaných v COS buňkách. Barvení stříbrem SDS-PAGE gelů indikovalo, že izolované produkty nebyly 100% čisté, ale obvykle se zdály být více než nebo alespoň 50% čisté. Toto vychází z počátečních materiálů obyčejně obsahujících méně než 10 pg/ml C3 v 10% (obj./obj.) fetálním telecím séru plus jiné celulámí proteiny. Navíc nebyly C3 degradovány v průběhu izolace a aktivita endogenní faktorů H a I se zdála být odstraněna.

Purifikace pomocí „His - Tag“ vyžaduje mírnější eluční podmínky z kolon nesoucích ionty niklu. Například byla použita EDTA. Aplikace této metody na C3 může proto dovolit izolaci bez porušení vnitřní thiolesterové vazby.

Příklad 10 Konjugace C3i protilátky a užití k cílené aktivitě C3 konvertázy proti jednotlivým buňkám

10.1 Úvod

Jedním aspektem vynálezu je, že stabilní C3 konvertázy odvozené od mutantních C3 molekul budou zvyšovat konverzi C3, která, je-li lokalizovaná na určité cílové místo, nastartuje na komplementu závislý útok na tento cíl. Upřednostňovaný přístup pro zacílení odpovědi je spojení mutantní C3 molekuly, buď C3i nebo C3b derivátu, s protilátkou specifickou pro žádoucí cíl. V tomto příkladě demonstrujeme pracovní metodologii pro vytváření takových konjugátů, která je aplikovatelná na mutantní C3i nebo C3b molekuly a může být použita na materiálu afínitně purifikovaném z expresního systému, když byl thiolester C3 porušen při zpracování. Spojením C3i s protilátkou, která se specificky váže na ovčí erytrocyty jsme dále ukázali, že konjugát fixuje C3i na povrch erytrocytu tak, že může být formována konvertáza, C3iBbP, která iniciuje lýzu těchto buněk, když jsou jiné komponenty komplementu poskytnuty ve formě normálního morčecího séra (v EDTA kvůli zabránění de novo formaci C3 konvertázy). Proto může být konjugovaná protilátka použita k zaměření C3 molekuly pro iniciaci komplement dependentního ataku jednotlivých typů buněk. Tento příklad využívá divoké formy C3i, z lidské plazmy, který formuje C3 konvertázu in vitro. In vivo je divoký typ C3i a C3b porušen faktory Hal. proto může být v tomto kontextu výhodné použití mutantního C3, konstruovaného podle plánu tohoto patentu tak, aby byl rezistentní na faktory Hala proto vytvářel stabilní C3 konvertázu.

-23 CZ 290596 B6

10.2 Metoda (i) Generování a purifikace C3 i - protilátka konjugátu

Užitou protilátkou byla IgG frakce izolovaná od polyklonálního králičího anti-ovčí erytrocyt antiséra. 1,1 mg bylo inkubováno s 75 nmol SPDP vkonjugačním pufru, pH 7,5 (20 mM KH7PO4, 60 mM Na₂HPO₄, 0,12 M NaCl) po 2 h při pokojové teplotě. PDP-IgG byl purifikován gelovou filtrací na Superose - 6 koloně (Pharmacia) (ve fosfátovém pufru, pH 7,4, obsahujícím 0,5 M NaCl). Redukce vzorku dithiothreitolem byla užita k hodnocení 4 PDP skupin připojených na molekulu IgG. C3i byl připraven ošetřením purifikovaného C3 0,1 M methylalaminu, pH 7,2 (2h při 37 °C). Přebytečný methylamin byl odstraněn gelovou filtrací následovanou dialýzou do konjugačního pufru. 18 nmol C3i bylo smíseno s 1,7 nmol PDP-IgG v 1,26 ml konjugačního pufru a inkubováno po 1 den při pokojové teplotě a potom po 1,5 dne při 4 °C. Obrázek 8 ukazuje Coomassie Blue barvený SDS-PAGE gel konjugační reakční směsi, vykazující přítomnost druhu o přibližně 350 kDa, který nebyl přítomen ani v PDP-IgG, ani v C3i. Tento druh byl parcilně purifikován gelovou filtrací na Superose - 6 koloně ve fosfátovém pufru, pH 7,4, obsahujícím 0,5 M NaCl a pak dialyzován do PBS. Tento se eluuje před C3, v objemu, ze kterého může být hodnocena molekulární hmotnost 300-400 kDa kalibrací s globulárními standardy molekulární hmotnosti. Koncentrace konjugátu, volné protilátky a nenavázaného C3 byly hodnoceny z Coomassie - barveného SDS-PAGE gelu (neredukující podmínky). Dvoudimenzionální SDS-PAGE (první dimenze neredukovaná, druhá dimenze redukovaná) odhalil vzorky kompatibilní s 1 : 1 konjugátem mezi IgG a C3i.

(ii) Demonstrace toho že C3i - protilátka konjugát může být použit k zaměření aktivity konvertázy proti jednotlivém buňkám.

μΐ rozpuštěného konjugátu (0 (bez konjugátu), 1/100, 1/50, 1/10) bylo inkubováno se 100 μΐ přibližně 1% (obj./obj.) ovčích erytrocytů (předem promytých v CFD) po 1 h při 37 °C. Paralelní inkubace byly provedeny s ekvivalentním množstvím PDP-IgG (bez C3) a s C3 samotným. Buňky pak byly 4 krát promývány v CFD a resuspendovány do 100 μΐ v CFD-G. 50 μΐ z nich bylo lyžováno s 150μ1Η₂Ο, po které následovalo přidání 800 μΐ CFD obsahujícího lOmMEDTA a 2% (obj./obj.) NGPS. Dalších 50 μΐ konjugátem potažených buněk bylo inkubováno po 15 min při 37 °C s 50 μΙ CFD-G obsahujícího 190pg/ml faktoru B, 2 μg/ml faktoru D, 20 μg/ml properdinu a 0,6 mM NiCl₂, a potom následovala lýza 900 μΐ CFD obsahujícího 10 mM EDTA a 2% (obj./obj.) NGPS. Po 30 min při 37 °C byly buňky peletovány centrifugací (2000 x g, asi 3 min) a byla měřena optická absorbance supematantu při 412 nm. Užitím H₂O ošetřených vzorků jako 100%lýzy a čistého pufru postrádajícího buňky, bylo kalkulováno % lýze, jak ukazuje obr. 9. Konjugát produkoval lýzu dependentní na dávce, zatímco ani PDP-IgG, ani C3i sám negeneroval žádnou lýzu signifikantně vyšší než byla pozorována za absence jakéhokoliv ošetření.

10.3 Souhrn výsledků

Použitá metoda se ukázala být úspěšnou pro spojení C3i s IgG jak je ukázáno:

1. Formováním proužku vhodné velikosti (okolo 350 kDa) pro 1 : 1 C3 : IgG konjugát ukázaný SDS-PAGE na obr. 8.

2. Dvoudimenzionálním SDS-PAGE (první dimenze neredukovaná, druhá dimenze redukovaná) indikujícím, že tento druh obsahoval jak IgG, tak C3i.

3. Eluční charakteristika tohoto druhu na gelové filtraci je opět konzistentní s molekulou okolo 350 kDa.

-24CZ 290596 B6

4. Konjugát vykazuje hemolytickou aktivitu, která není vykazována ani PDP-IgG, ani C3i (obr. 9).

Hemolytická zkouška (obr. 9) dále demonstrovala, že:

1. Specifická anti- ovčí erytrocyt protilátka lokalizována C3i na membránu cílové buňky (ovčího erytrocytu), a tak zabránila jeho odstranění promýváním (oproti volnému C3 i).

2. Konjugát udržoval aktivitu C3i ve které byl stále ještě schopen vytvářet C3 konvertázu reakcí s properdinem a faktory B a D.

3. Tato konvertáza může iniciovat komplement - dependentní atak na cíl, v tomto případě aktivací dráhy lýzy (C5-9) k lýze erytrocytu.

Další data z jiných laboratoří ukazují, že faktor kobřího jedu může být připojen na protilátku a že tento konjugát může namířit aktivaci komplementu na jednotlivé typy buněk (Vogel, 1988, Targeted. Diagn. Ther., 1:191-224, Muller, B. and Muller - Ruchholtz, W., 1987, Leuk. Res. 11:461 - 468, Parker, C. J., White, V. F. and Falk, R. J., 1986, Complement 3:223 -235, Petrella, E. C. et al., 1987, J. Immunol. Methods 104:159-172). Tato data podporují tvrzení, že C3 modifikovaný tak, že je schopný vytvářet stabilní C3 konvertázu. jako faktor kobřího jedu, může být užit k zacílení komplementem zprostředkované odpovědi, jak je zdůrazněno v tomto vynálezu.

Příklad 11 Demonstrace toho, že mutantní molekuly C3 indukují obraz faktoru B v normálním lidském séru.

11.1 Úvod

Hlavním účelem zde popsaného vynálezu je konsumpční deplece aktivita komplementu z biologických tekutin. Vynález popisuje metody pro vý robu C3 molekul, které jsou rezistentní na „down - regulaci“ faktory H a I. V tomto stavu budou vázat faktor B a generovat aktivní C3 konvertázy. Aktivita těchto konvertáz je demonstrována hemolytickou zkouškou využitou v příkladu 6. Taková konvertáza bude proto konzumovat C3. Jestliže je konvertáza nestabilní, bude disociovat bez velké C3 konverze. Nicméně dovolí vazbu čerstvého faktoru B, a jeho konverzi na Bb a Ba. Tak mutantní C3 započne konsumpci faktoru B, vedoucí nakonec k vyřazení alternativní dráhy, a znemožnění amplifikace stimulace klasickou dráhou. Jestliže je vytvořena stabilní C3 konvertáza, bude obrat faktoru B redukován, ale konsumpce C3 bude zvýšena. Obě situace mohou proto být žádoucí. V tomto příkladu demonstrujeme, že mutantní C3 molekuly, které jsou modifikovány k rezistenci na faktor I, ale bez jakékoliv modifikace k ovlivnění stability konvertázy, započnou akcelerovaný obrat faktoru B v lidském séru. Oproti tomu divoký typ C3 nezpůsobuje žádný signifikantní obrat, pravděpodobně díky tomu, že divoký typ C3 i je rychle degradován faktory Hal.

11.2 Metoda

Připravené mutanty jsou následující:

Q1R2 Argl303 zaměněn za Gin (příklad 2)

Q1Q2 Argl303 zaměněn za Gin, plus Argl320 zaměněn za Gin (příklad 1) E1Q2 Argl303 zaměněn za Glu, plus Argl320 zaměněn za Gin (příklad 5)

Tyto mutanty byly všechny exprivovány v CHO buňkách a pak purifikovány precipitací s Na₂SO4, pak následovala afinitní purifikace na Cloně - 3 - Sepharose, jak popisuje příklad B3.

-25CZ 290596 B6

Divoký typ C3 (R1R2) byl izolován podobně. Podle SDS-PAGE s barvením stříbrem byla koncentrace 01 mezi 1/5 a 1/25 divokého typu, a koncentrace Q1Q2 byla 1/ divokého typu, a koncentrace E1Q2 byla mezi 1/25 a 1/125 divokého typu, a koncentrace E1Q2 byla mezi 1/25 a 1/125 divokého typu. Všechny preparáty pravděpodobně obsahovaly většinu molekul s rozrušeným thiolesterem (C3 i).

μΐ těchto C3 preparátů bylo inkubováno s 10 μΐ roztoku 20% (obj./obj.) normálního lidského séra v PBS obsahujícím 1 mM MgCl₂ a přibližně 300 ng ¹²'I-značeného faktoru B (přibližně 2-300 00dpm) po 1 hodinu při 37 °C. 5 μΐ bylo pak analyzováno SDS-PAGE (redukční podmínky). Sušený gel byl exponován na autoradiografickém filmu pro indikaci pozice proužků korespondující s intaktním faktorem B a jeho produkty štěpení. Tyto pak byly excidovány a pečlivě zkoumány pro určení stupně štěpení. Hodnoty získané v pufru samotném byly odečteny jako pozadí (zahrnujíc nejenom pozadí štěpení, ale také degradační produkty a jiné nečistoty přítomné v přípravě radioligandu).

11.3 Výsledky

Výsledné stupně štěpení faktoru B jsou ukázány níže:

1/25 Divoký typ 1,49%

1/5 Divoký typ 2,74%

Q1R1

Q1R2

Q1Q2

6,19%

7,41%

6,42%

Podle toho všechny faktory I rezistentní mutanty produkovaly vyšší úroveň štěpení faktoru B než ekvivalentní množství divokého typu C3 (C3i). Při vyšších dávkách nebo delší inkubaci může být výsledkem kompletní inkapacitace alternativní dráhy.

Zkratky použité v předešlých příkladech zahrnují:

CFD - komplement fixační rozpouštědlo (definované Harrison and Lachmann, 1986, Handbook of Experimental Immunology, 4^lh edn., Ed.s Weir, Herzenberg, Blackwell and Herzenberg, Blackwell, Oxford), CFD-G, CFD obsahující 0,1% (hmotn./obj.) želatinu, PBS fosfátový pufrovací salinický roztok, NGPS, normální morčecí sérum, SDS-PAGE SDS-polyakrylamid gelová elektroforéza, SPDP N - Succimidyl - 3 - (2—pyridyldithio)propionát.

Odkazy:

1. Bergmann, M. & Fruton, J. S. (1941) Adv. Enzymol., 1:63-98.

2. de Bruijn, Μ. H. & Fey, G. H. (1985), Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 82:708-712

3. Crawford-MH et al. (1988) Circulation. 78:1449-58

4. Daha, M. R. & van Es, L. A. (1982) Immunol. 43:33-38.

5. Farries, TC; Lachmann, PJ & Harrison, RA (1988) Biochem. J. 252:47-54

6. Farries, TC; Lachmann, PJ & Harrison, RA (1988) Biochem. J. 253:667-75

7. Fořty, J; Hasan, R; Cary, N; White, DJ & Wallwork, J. (1992) Transplant. Proč. 24:488-9

8. Fritzinger, D. C. et al. (1992) J. Immunol. 149:3554-3562

-26CZ 290596 B6

9. Harrison, R. A. & Lachmann, P. J. (1980) Mol. Immunol. 17:9-20.

10. Kalii, K. R., Hsu, P. & Fearon, D. T. (1994) Springer Semin. Immunopathol. 15:417-431.

11. Kinoshita, T; Takata, Y; Kozono, H; Takeda, J; Hong, KS & Inoue, K (1988) J. Immunol. 141:3895-901

12. McNeamey, TA; Oděli, C; Holers, VM; Spear, PG; Atkinson, JP (1987) J. Exp. Med. 166:1525-35

13. Nicol, P. A. E. & Lachmann, P. J. (1973) Immunol. 24:259-275

14. Pangburn, MK & Muller-Eberhard, HJ (1984) Springer Semin. Immunopathol. 7:163-92

15. Rother, K. & Till, G. O. (eds) (1988) „The complement Systém“ (Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany)

16. Van den Berg, C. W., Aerts, P. C. & Van Dijk, H. (1991) J. Immunol. Methods 136:287294.

17. Vogel, CW; Smith, CA & Muller-Eberhard, HJ (1984) J. Immunol. 133:3235—41

18. Weisman, HF et al. (1990) Science 249:146-51.

19. Wu, R. (ed.) (1993) Methods Enzymol. 217: ch.s 12-14 (Academie Press, San Diego, U.S.A.)

20. Botto, M, Fong, K. Y., So, A. K„ Koch, C. & Walport, M. J. (1990) J. Exp. Med 172: 1011-7

21. Sambrook, J., Fritsch, E. F. & Maniatis, T. (1989) „Molecular Cloning. A Laboratory Manual“ second edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press)

22. Fishelson, Z. (1991) Mol. Immunol. 28:545-52.

23. Taniguchi-Sidle, A & Isenman, D. E. (1993) Mol. Immunol. 30:54.

24. Lambris, J. D., Avila, D., Becherer, J. D. & Muller, Eberhard, H. J. (1988) J. Biol. Chem. 263:12147-50.

25. Taniguchi-Sidle, A. and Isenman, D. E. (1992) J. Biol. Chem. 267:635-643.

26. Hofer, B. and Kuhlein, B. (1993) Methods Enzymol. 217:173-189.

27. Morinaga, Y., Franceschini, T., Inouye, S. and Inouye, M. (1984) Bio-technology 2:636639.

28. Harrison, R. A. and Lachmann, P. J. (1986) „Handbook of Experimental Immunology“ (eds Weir, Herzenberg, Blackwell and Herzenberg; Blackwell, Oxford) 4^th ed.,

29. Kotwal, G., J., and Moss, B., Nátuře (1988) 335 (6186):176-8.

Claims (16)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Modifikovaný lidský C3 protein schopný tvořit stabilní C3 konvertázy a zvolený z množiny, zahrnující C3 protein, ve kterém je aminokyselinový zbytek Arg-1303 nebo/a aminokyselinový zbytek Arg-1320 nativní lidské C3 konvertázy nahrazen jiným aminokyselinovým zbytkem; C3 protein, který má sníženou citlivost na faktor H nebo/a faktor I vzhledem k nativní lidské C3 konvertáze a má alespoň jednu substituci jiným aminokyselinovým zbytkem vzhledem k nativní lidské C3 konvertáze v oblasti aminokyselinových zbytků 752 až 754 nebo/a aminokyselinových zbytků 758 až 780 nativní lidské C3 konvertázy; a C3 protein, který má alespoň jednu substituci jiným aminokyselinovým zbytkem vzhledem k nativní lidské C3 konvertáze v aminokyselinových zbytcích 1427, 1431 nebo/a 1433 nativní lidské C3 konvertázy.
2. 2. Modifikovaný lidský C3 protein podle nároku 1, ve kterém jsou aminokyselinový zbytek Arg-1303 nebo/a aminokyselinový zbytek Arg-1320 nativní lidské C3 konvertázy nahrazeny aminokyselinovým zbytkem zvoleným z množiny, zahrnující glutaminový, tyrosinový, cystinový, tryptofanový a glycinový zbytek a zbytek kyseliny glutamové.
3. 3. Modifikovaný lidský C3 protein podle nároku 2, ve kterém je aminokyselinový zbytek Arg-1320 nativní lidské C3 konvertázy nahrazen glutaminovým zbytkem.
4. 4. Modifikovaný lidský C3 protein podle nároku 2 nebo 3, ve kterém je aminokyselinový zbytek Arg-1303 nativní lidské C3 konvertázy nahrazen glycinovým zbytkem nebo glutaminovým zbytkem nebo zbytkem kyseliny glutamové.
5. 5. Modifikovaný lidský C3 protein podle nároku 1, ve kterém alespoň jedna substituce aminokyselinového zbytku nativní lidské C3 konvertázy jiným aminokyselinovým zbytkem zahrnuje substituci kyselého aminokyselinového zbytku neutrálním aminokyselinovým zbytkem.
6. 6. Modifikovaný lidský C3 protein podle nároku 1 nebo nároku 5, ve kterém substituce aminokyselinových zbytků nativní lidské C3 konvertázy jinými aminokyselinovými zbytky zahrnuje substituci aminokyselinových zbytků Asp-Glu-Asp aminokyselinovými zbytky Gly-Ser-Gly.
7. 7. DNA sekvence kódující protein podle některého z nároků 1 až 6.
8. 8. DNA konstrukt, například vektor, obsahující DNA sekvenci podle nároku 7.
9. 9. Protein podle některého z nároků 1 až 6 pro použití v terapii.
10. 10. Konjugát tvořený proteinem podle některého z nároků 1 až 6 vázány na specifickou vazebnou skupinu.
11. 11. Konjugát podle nároku 10, ve kterém specifickou vazebnou skupinou je specifický vazebný protein.
12. 12. Konjugát podle nároku 11, ve kterém specifickým vazebným proteinem je protilátka nebo její antigen-vázající fragment.
13. 13. Použití proteinu podle některého z nároků 1 až 6 nebo konjugátu podle některého z nároků 10 až 12 pro výrobu léčiva určeného pro snížení hladiny proteinů komplementové dráhy.

    -28CZ 290596 B6
14. 14. Použití proteinu podle některého z nároků 1 až 6 nebo konjugátu podle některého z nároků 10 až 12 pro výrobu léčiva určeného pro preventivní potlačení odmítavé reakce organismu na cizorodý materiál.

    5
15. 15. Použití proteinu podle některého z nároků 1 až 6 nebo konjugátu podle některého z nároků 10 až 12 pro výrobu léčiva určeného pro lokalizaci nebo/a zesílení endogenní konverze proteinů komplementové dráhy a depozici na specifické místo.
16. 16. Farmaceutický prostředek, vyznačený tím, že obsahuje alespoň jeden protein podle 10 některého z nároků 1 až 6 nebo alespoň jeden konjugát podle některého z nároků 10 až 12 a alespoň jeden farmaceuticky přijatelný nosič nebo/a alespoň jednu pomocnou látku.