SK29697A3 - Modified human c3 proteins - Google Patents

Modified human c3 proteins Download PDF

Info

Publication number
SK29697A3
SK29697A3 SK296-97A SK29697A SK29697A3 SK 29697 A3 SK29697 A3 SK 29697A3 SK 29697 A SK29697 A SK 29697A SK 29697 A3 SK29697 A3 SK 29697A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
protein
factor
convertase
arg
amino acid
Prior art date
Application number
SK296-97A
Other languages
English (en)
Inventor
Richard A Harrison
Timothy C Farries
Original Assignee
Imutran Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB9418147A external-priority patent/GB9418147D0/en
Priority claimed from GBGB9509102.1A external-priority patent/GB9509102D0/en
Application filed by Imutran Ltd filed Critical Imutran Ltd
Publication of SK29697A3 publication Critical patent/SK29697A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/472—Complement proteins, e.g. anaphylatoxin, C3a, C5a
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Vynález sa týka proteínu natívnej komplementovej dráhy, ktorý je modifikovaný tak, že je schopný vytvárať stabilné C3 konvertázy, DNA sekvencie, kódujúce tento proteín, jeho použitia v terapii, konjugátu, kde špecifickou väzobnou skupinou je špecifický väzobný proteín, farmaceutickej formulácie, obsahujúcej takýto proteín a spôsobu redukcie proteínov komplementovej dráhy podaním takéhoto proteínu cicavcovi.
Doterajší stav techniky
Existuje niekoľko vzácne sa prirodzene vyskytujúcich podmienok, kedy normálna regulácia tekutinovej fázy nemôže prebehnúť a spontánna C3 konverzia nakoniec vedie do generalizovanej deplécie C3 z cirkulácie; (í) genetická deficiencia faktoru H alebo I (13), (ii) prítomnosť protilátok (nefritických faktorov), ktoré sa viažu na C3bBb a bránia disociácii (4) a (iii) kontakt s proteínom kobrieho jedu nazývaný faktor kobrieho jedu (CVF), ktorý sa kombinuje s faktorom B a formuje C3 konvertáza enzým, ktorý neobsahuje C3b a nie je ovplyvnený faktormi H a I (14). Toto ilustruje normálny fyziologický význam down regulácie komplementu za absencie špecifickej aktivácie.
Existujú tiež okolnosti, kedy sa špecifická aktivácia vyskytuje, ale je nežiaduca, hlavne ak je namierená proti tkanivám hostiteľa (t.j. u poškodenia tkaniva ischémiou alebo chirurgiou) alebo proti cudzorodému materiálu úmyselne podanému za terapeutickým účelom (ako je xenograft, arteficiálny orgán alebo dialyzačná membrána). Aktivácia komponentu vedie k nežiaducemu ataku a ďalšiemu poškodeniu, takže v týchto prípadoch bude vhodné blokovať alebo inhibovať aktiváciu a odpoveď.
Existujúce prístupy k prevencii komplementom sprostredkovaného poškodenia sú zamerané na použitie down regulačných proteínov (CR1,
MCP, DAF a faktorov H á I) na inhibíciu aktivácie komplementu. Inhibítory komplementu ako faktor I, faktor H a solubilné deriváty membránových väzobných proteínov CR1, DAF, MCP suprivujú kvapalnú - fázu amplifikačnej slučky alternatívnej dráhy. Preto sa skúšalo použitie týchto molekúl, hlavne CR1 (ktorý sa zdá byť najúčinnejší) na redukciu komplementom sprostredkovaného poškodenia na modeloch fyziologických situácií (10, 18).
Faktor H je endogénne prítomný v krvnej plazme vo vysokej koncentrácii (typicky 0,3 až 0,5 mg/ml), takže hoci vysoké hladiny inhibítorov miernia reakciu v kvapalnej fáze, ich účinok je slabý, hoci veľké množstvo purifikovaných proteínov môže byť podané in vivo (t.j. pravdepodobne až 5 mg/kg telesnej hmotnosti solubilného CR1). Naviac, alternatívna dráha je aktivovaná povrchmi, kde je efektu faktoru H už zabránené. Zatiaľ čo toto nie nevyhnutne konkomitantne redukuje aktivity iných inhibítorov, rovnaké faktory naznačujú, že nie sú pravdepodobne kompletne alebo univerzálne efektívne.
Faktor kobrieho jedu (CVF) spôsobuje generovanie stabilnej C3 konvertázy, ktorá môže byť použitá experimentálne na depléciu komplementu u zvierat in vivo a v iných vzorkách (t.j. ľudskej krvnej plazme) in vitro. CVF je potentný (t.j 40 pg/kg môže zrušiť aktivitu komplementu u myši (16)). Avšak tu sú nevýhody, ktoré môžu znemožniť jeho terapeutické použitie u ľudí.
Najprv je získaný z kobrieho jedu (problematický zdroj na získanie a nebezpečný) a musí potom byť starostlivo purifikovaný od neurotoxínov jedu. Je tiež samozrejmé ťažké získanie zásob. Tento problém nemôže byť ľahko prekonaný klonovaním a expresiou génu ex vivo, pretože existujú posttranslačné modifikácie, ktoré prebiehajú u hada (špecifické proteolytické spracovanie), ktoré môže byť ťažké (alebo nemožné) reprodukovať in vitro. Naviac, enzýmy a podmienky trávenia vyžadované pre toto spracovanie sú doteraz neznáme. Po druhé, proteín je cudzorodého pôvodu (pre ľudí), a preto je imunogénny. Toto vylučuje jeho opakované terapeutické použitie, ako môže byť žiaduce pre dekomplementáciu pacienta po mnoho týždňov (t.j. kvôli dovoleniu prežitia xenograftu).
Hoci má CVF niektoré štrukturálne a funkčné homológie s ľudským C3 (17), má tiež veľkú odlišnosť v niektorých ohľadoch (t.j. štruktúre reťazca, mieste biosyntézy, insenzitivite na regulátory komplementu, formovania stabilnej C3 konvertázy). Nie je derivovaný od kobrieho C3 ekvivalentu, ktorý je známy, bol klonovaný a sekvencovaný a ktorý sa vo väčšine štruktúry a funkcie podobá ľudskému C3 viac ako CVF (8).
CVF je špecifický produkt jedu zvieraťa veľkej evolučnej odlišnosti od homo sapiens. Nie je preto možné použiť genetické manipulácie na modifikáciu tohto proteínu na produkt, ktorý môže byť neimunogenicky použitý u ľudí.
V súčasnosti bola vyvinutá alternatívna stratégia, spočívajúca v preklenutí fyziologickej regulácie a namiesto inhibície aktivácie komplementu spôsobuje super aktiváciu systému. Má dve aplikácie. Prvá môže byť použitá in vivo na aktiváciu komplementu, kým nie je jedna alebo viacero komponentov vyčerpané, čo vedie k strate schopnosti produkovať lokálnu odpoveď na akúkoľvek ďalšiu záťaž (ako je xenograft). Po druhé, neregulovaná superaktivácia môže byť úmyselne lokalizovaná na jednotlivý cieľ (t.j. vírus alebo vírusom infikovanú bunku) kvôli zvýšeniu senzitivity tohto cieľa na komplementom sprostredkovanej deštruktívnej odpovedi.
Termín regulátory komplementovej aktivácie ako je tu použitý, zahrňuje všetky proteíny, ktoré inhibujú amplifikáciu C3 konverzie, nie je obmedzený na tie proteíny, ktorých gény sú umiestnené v RCA genetickom lokuse. Nemôže však zahrňovať up-regulátory ako je properdín. C3 konverzia je definovaná ako proteolytická konverzia C3 na C3b a C3a, ak nie je inak uvedené a C3 konvertáza (alebo jednoducho konvertáza) je definovaná ako enzým (typicky komplex dvoch alebo viacerých proteínových komponentov, napríklad C3bBb, C3iBb, CVFBb alebo C4b2a), ktorý katalyzuje túto reakciu.
Podstata vynálezu
Teda v prvom aspekte vynález poskytuje natívny proteín komplementovej dráhy tak, že tento proteín je schopný vytvárať stabilnú C3 konvertázu.
Natívnym sa myslí prirodzene sa vyskytujúci, t.j. že ho možno získať v prírode. Tak definícia zahrňuje akýkoľvek prirodzene sa vyskytujúci proteín komplementovej dráhy modifikovaný ako je definované vyššie. Nie je úmyslom sa obmedzovať na druhovo špecifické proteíny. Inými slovami, modifikovaný ľudský proteín môže byť napríklad použitý ako stabilná C3 konvertáza v iných druhoch cicavcov. Typicky budú použité modifikované proteíny komplementovej dráhy z rovnakého druhu.
Modifikácia C3 DNA kódujúcej sekvencie, napríklad použitím miestne riadenej mutagenézy, môže produkovať variant C3, ktorý je rezistentný na komplement regulačné proteíny, zatiaľ čo si udržiava pozitívne funkčné vlastnosti (štiepenie na C3b C3 konvertázou) a vlastnosti štrukturálnej integrity (správna štruktúra reťazca a prítomnosť tiolesterovej väzby). Tu popísaný vynález sa týka geneticky modifikovaných foriem natívnych komplementových proteínov, napríklad ľudského C3, ktorého C3b fragment získava vlastnosti rezistencie na fyziologickú reguláciu komplementu. Vďaka tejto rezistencii môžu tieto molekuly generovať stabilizované formy korešpondujúcej C3 konvertázy, ktorá produkuje amplifikovanú konverziu C3 na C3b, a neskôr degradačné produkty, vo fyziologickom prostredí (t.j. in vivo).
V preferovanom vyhotovení poskytuje vynález modifikovaný C3 proteín, ktorý je rezistentný na štiepenie faktorom I.
Toto sa môže dosiahnuť modifikáciou zvyškov proteínu v proteolytických miestach.
Najmä preferované vyhotovenie vynálezu sa týka modifikovaného ľudského C3 proteínu, kde proteín je modifikovaný nahradením buď Arg-1303, alebo Arg-1320 alebo obidvoch inou aminokyselinou. Inou aminokyselinou môže byť tyrozín, cystín, tryptofán, glutamín, kyselina glutamová alebo: glycín. Arg-1303 je preferovane nahradený glutamovou kyselinou alebo glycínom (menej výhodne glutamínom). Arg-1320 je preferovane nahradený glutamínom.
Iné stratégie pre produkciu vhodných modifikovaných proteínov vynálezu zahrňujú:
(i) Redukovanú citlivosť na inhibičný účinok faktoru H a príbuzných proteínov (t.j. MCP, DAF, CR1). Napríklad ľudské C3 zvyškov 767-776 a 12091271 boli implikované vo väzbe faktoru H (20, 24) a nahradenie jedného alebo viacerých týchto zvyškov alebo iných zvyškov tiež asociované s akciou týchto proteínov by mohlo redukovať väzbu jedného alebo viacerých z týchto regulačných proteínov.
(ii) redukovaná rýchlosť disociácie C3bBb. Môžu byť zavedené mutácie, ktoré môžu posilniť interakcie medzi C3b a Bb. Toto môže viesť ako k redukcii v spontánnej dekompozícii enzýmu, tak k obmedzeniu efektivity faktoru H (a príbuzných regulátorov) vo vyňatí Bb z C3b.
Tieto mutácie sú žiaduce na redukciu stupňa ako spontánnej, tak faktorom H mediovanej dekompozície C3bBb. I za absencie faktoru H má tekutá fáza C3bBb komplexu polčas iba okolo 10 minút pri 37 °C za prítomnosti properdínu (6).
(iii) Ľudské C3 rezíduá 752-761 sú implikované vo väzbe faktoru B. Toto je vysoko konzervovaný región C3, a tesne príbuzná sekvencia sa nachádza v C4. Ako C4 viaže faktor B homológ C2, spolu s jeho vysokou konzerváciou v C3, silná similarita tohto regiónu medzi C3 a C4 ďalej podporuje jeho úlohu v C3 ako faktor B väzobné miesto. Tak môžu mať zmeny v tomto regióne efekt na B afinitu a na stabilitu C3bBb.
(iv) Rezistencia a iné regulátory aktivácie komplementu ako je CR1, DAF a MCP môžu byť tiež žiaduce. Spôsob akcie týchto regulátorov je podobný ako u faktoru H, takže ďalšia mutagenéza nie je nevyhnutne nutná. Podobne, niektoré patogénne organizmy exprivujú ich vlastné inhibítory aktivácie komplementu, ktoré sú často štrukturálne a funkčne homológne faktoru H (t.j. Vaccinia vírus sekretórny peptid). Tieto molekuly chránia útočníka proti imunitnej odpovedi a mohlo by byť výhodné, aby bolo možné ich atakovať cielenými C3 konvertáza enzýmami rezistentnými na túto obranu.
(v) Mutácie, ktoré zvyšujú stabilizáciu C3 konvertázy properdínom. Aktivitou properdínu je stabilizovať C3bBb komplex, spomaľovať spontánnu a od faktora H závislú disociáciu. Táto stabilizácia je neúčinná v kvapalnej fáze, ale zdá sa byť významnejšia v amplifikačnom procese raz naštartovanom vhodným aktivačným povrchom (5). Zvýšenie jeho aktivity (zvýšením jeho afinity) môže narušiť rovnováhu v kvapalnej fáze a tak začať spontánnu C3 konverziu. Toto môže byť hlavne užitočné v kombinácii s inými modifikáciami vyššie popísaným.
(vi) Mutácie, ktoré bránia C3bBb vykazovať C5 konvertázovú aktivitu. Pri použití na depléciu aktívneho C3 z cirkulácie môže byť nežiaducim vedľajším účinkom generácia veľkého množstva anafylaktických peptidov. Najpotentnejším z nich je C5a, ktorý je štiepený z C5 niektorými C3 konvertáza enzýmami. Táto reakcia je pravdepodobne závislá od afinity konvertázy k inej molekule C3b (11), a tak môže byť subjektom pre supresiu mutáciami C3, ktoré odstránia túto interakciu.
(vii) Zlepšená aktivita C3 konvertázy. Aktívne miesta C3bBb C3 konvertáza enzýmu sú umiestnené v Bb časti. C3b komponent má predpokladane za funkciu vytvorenie aktívnej konformácie na Bb a/alebo väzbu a konformáciu substrátu, ktorý má byť spracovaný Bb. Toto nie je známe, ale v obidvoch prípadoch tu môže byť možnosť pre zvýšenie aktivity konvertázy prostredníctvom mutácií v C3.
(viii) Expresia vo funkčnej forme. Divoký typ C3 vyžaduje konverziu na C3b predtým, ako môže byť kombinovaný do nového C3 konvertáza komplexu. Ak je použitý in vivo, môže požiadavka na konverziu na C3vb (alebo C3i) odložiť akciu modifikovaného C3. Bolo preto žiaduce buď podať proteín vo forme schopnej okamžitého formovania konvertázy, alebo podať preformované konvertázové komplexy. Je preto výhodné vytvárať funkčné C3b-podobné činidlá ex-vivo. Toto sa môže dosiahnuť in vitro (t.j. proteolýzou).
(ix) Modifikácie natívneho proteínu, ktoré slúžia na zavedenie nových miest štiepenia tak, ako sú peptidové regióny požadované pre faktor B väzbu ponechané a tie, ktoré sa požadujú exkluzívne pre faktor H väzbu, môžu byť špecificky odstránené. Napríklad môžu byť zavedené také miesta, že C3bpodobná forma modifikovaného C3 môže byť ďalej štiepená do formy, ktorá stále viaže faktor B, ale je menej citlivá na inaktiváciu faktorom H a I.
(x) Modifikácie v iných regiónoch, ktoré môžu ovplyvňovať C3b interakcie s faktorom B a/alebo faktorom H.
Vynález je založený na obrátení klasického prístupu navodením C3 konverzie k deplécii C3, a tak vyradení systému. Ďalšou aplikáciou vynálezu je potenciál k navodeniu C3 konverzie v jednotlivom mieste, a tak získanie komplement dependentných efektorových mechanizmov na ovplyvnenie špecifického cieľa.
Preto posledným efektom bude zvýšenie množstva C3 konverzie vtedy, ak je modifikovaný proteín podaný do fyziologického média (t.j. krvi), obsahujúceho regulátory komplementovej aktivácie. Táto aktivita potom môže byť použitá buď na depléciu natívneho C3 média, alebo na lokalizáciu C3 konverzie do požadovaného miesta.
Analóg C3, ktorého C3b-fragment je rezistentný na účinok faktoru I (t.j. deriváty popísané v príklade 1) môže viazať faktor B, ktorý potom bude štiepený faktorom D a eventuálne disociovaný v inaktívnej forme. Za absencie inaktivácie faktorom I bude modifikovaný C3b schopný opakovane viazať nové molekuly faktoru B, a tak spustiť jeho inaktiváciu. Preto bude inou potenciálnou aplikáciou modifikácií popísaných v tomto vynáleze inaktivácia alternatívnej dráhy konzumpciou aktivity faktoru B. Analogický prístup môže tiež byť použitý na modifikáciu C4 k spusteniu konzumpcie C2, a tak vyradenie klasickej dráhy aktivácie komplementu.
Vynález zahrňuje akúkoľvek inú proteázu použitú analogickým spôsobom k C3bBb enzýmu, ktorá vedie k štiepeniu C3 na C3b, navzdory prítomnosti regulátorov aktivácie komplementu.
Vynález tiež zahrňuje DNA sekvencie, ktoré kódujú proteín vynálezu rovnako ako DNA konštrukty obsahujúce takéto DNA sekvencie.
DNA sekvencie zahrňujú všetky ďalšie sekvencie nukleových kyselín, ktoré, vďaka degenerácii genetického kódu, tiež kódujú dané aminokyselinové sekvencie, alebo ktoré sú v podstate homológne k týmto sekvenciám. Tieto sekvencie sú tak tiež zahrnuté v rozsahu vynálezu.
Sekvencie nukleových kyselín, ktoré sú v podstate homológne, sú tiež zahrnuté v rozsahu vynálezu. Podstatná homológia môže byť hodnotená na úrovni nukleových kyselín alebo na úrovni aminokyselín. Na úrovni nukleových kyselín môžu byť za sekvencie, majúce podstatnú homológiu považované tie, ktoré hybridizujú so sekvenciami nukleových kyselín vynálezu za prísnych podmienok (napríklad, pri 35 až 65 °C v soľnom roztoku asi 0,9M). Na aminokyselinovej úrovni môže byť proteínová sekvencia pokladaná za podstatne homológnu k inej proteínovej sekvencii, ak signifikantné množstvo prítomných aminokyselín vykazuje homológiu. Aspoň 55%, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % alebo 99 %, vo zvyšujúcom sa stupni, aminokyselín môže byť homológne.
Ako bolo uvedené vyššie, môžu byť proteíny vynálezu použité na dosiahnutie lokalizovaných efektov aktivácie komplementu. Jednou cestou potvrdenia tohto je konjugácia proteínu so skupinou, ktorý sa bude viazať na požadovaný cieľ. Tak v ďalšom aspekte vynález poskytuje konjugát zahrňujúci proteín vynálezu naviazaný na špecifickú väzobnú skupinu, napríklad špecifický väzobný proteín. Príkladom takéhoto proteínu môže byť protilátka alebo jej antigén väzobný fragment.
Proteíny podľa vynálezu sú zamýšľané na podanie subjektom kvôli zvýšeniu žiaduceho terapeutického efektu. Preto vynález tiež poskytuje:
a) Proteín podľa vynálezu pre použitie v terapii.
b) Použitie proteínov alebo konjugátov podľa vynálezu vo výrobe liekov pre použitie v deplécii hladín proteínov komplementovej dráhy a hlavne pre použitie na zabránenie rejekcie cudzorodého materiálu.
c) Farmaceutickú formuláciu, zahrňujúcu jeden alebo viacero proteínov alebo konjugátov vynálezu spoločne s jedným alebo viacerými farmaceutický akceptovateľnými nosičmi a/alebo excipientmi.
d) Metódu redukcie proteínov komplementovej dráhy u cicavcov, ktorá zahrňuje podanie proteínu podľa vynálezu cicavcom, výhodne vo forme farmaceutickej formulácie.
Farmaceutické formulácie môžu byť prítomné v jednotkovej dávkovej forme, obsahujúcej vopred určené množstvo aktívnej zložky na dávku. Takáto jednotka môže obsahovať minimum, napríklad 1 mg aktívnej prísady a preferovane 2 až 3 mg. Horná hranica, ktorú takáto jednotková dávka môže obsahovať, bude závisieť od množstva faktorov ako sú podmienky liečenia, spôsob podania a vek, hmotnosť a stav pacienta rovnako ako ekonomické úvahy. Napríklad môže jednotková dávková forma obsahovať 10 mg alebo až 100 mg aktívnej prísady.
Proteíny podľa vynálezu sa môžu použiť in vivo na vyradenie komplementového systému. Okolnosti, kedy toto môže byť žiaduce, zahrňuje nasledujúce:
a) Aby sa zabránilo komplementom sprostredkovanej deštrukcii alebo poškodeniu transplantátu, hlavne xenograftu (materiál transplantovaný od iných druhov zvierat) a hlavne nesúhlasného xenograftu (kde sú druh darcu a príjemcu nesúhlasné). Príjemca by mal byť dekomplementovaný pred operáciou a udržiavaný v tomto stave, dokiaľ bude transplantát buď prijatý alebo nahradený viac kompatibilným orgánom.
Počiatočné liečenie bude vykonané v priebehu niekoľkých dní pred transplantáciou. Ďalšia dekomplementácia môže byť žiaduca v období rejekčnej krízy. Liečenie môže byť spojené s použitím antihistaminík na kontrolu všeobecnej zápalovej odpovede (t.j. vazodilatácie), pravdepodobne ako odpovede na generovanie C3a a/alebo C5a.
Dekomplementácia môže byť tiež výhodná pri použití arteficiálnych orgánov alebo tkanív (t.j. arteficiálne ľadvinové dialyzačné membrány), ktoré aktivujú komplementový systém. Ako je popísané vyššie, môže byť proteín podaný v buď neaktivovanej forme, funkčnej C3b-podobnej forme alebo ako predformovaná C3 konvertáza (ako C3bBb). Tieto môžu byť podané akoukoľvek cestou, kde sa aktívna konvertáza stretne s cirkulujúcim C3 (t.j. intravenózne, subkutánne, atď).
Inou alternatívou bude ex vivo liečenie, napríklad transfundovaním obehu cez matricu, nesúcu aktívnu konvertázu. Toto by malo mať tú výhodu, že dovolí odstráneniu anafylaktických peptidov (C3a a C5a) a iných zápalových mediátorov nízkej molekulárnej hmotnosti (t.j. histamín a oxid dusný) pred tým, ako je dekomplementovaná krv (alebo plazma) vrátená pacientovi.
b) Na zabránenie komplementom sprostredkovaného poškodenia v dôsledku väčšieho chirurgického zákroku. Pacient by mal byť dekomplementovaný, ako je popísané vyššie, výhodne pred operáciou (ale ak je to nevyhnutné - po nej) a udržiavaný v tomto stave do tej doby, kým nebezpečenstvo ďalšieho vnútorného poškodenia bude zmiernené vďaka od komplementu závislého imunitného ataku.
c) Na minimalizáciu komplementom sprostredkovaného poškodenia v dôsledku nechirurgického poranenia. V týchto prípadoch musí byť dekomplementácia vykonaná po počiatočnom poškodení, ale formulácia a metódy podania sú inak rovnaké ako tie, ktoré sú popísané vyššie. Toto môže byť hlavne užitočné, keď zotavenie vyžaduje reperfúziu ischemickej časti cirkuláciou (t.j. ischémia myokardu, omrzliny, spáleniny, atď.).
d) Na minimalizáciu komplementom sprostredkovaného poškodenia v dôsledku interakcie protilátka - antigén. Komplementom sprostredkovaná obranná odpoveď je hlavne nežiaduca u autoimunitných chorôb, ktoré môžu zahrňovať glomerulonefritídu, hemolytickú anémiu, myasténiu gravis a typ II kolagénom indukovanej artritídy. Vyradenie komplementového systému v priebehu niektorých epizód choroby môže zmierniť príznaky.
e) Na vytvorenie špecifického patogénneho cieľa viac citlivého ku komplementom sprostredkovaným imunitným mechanizmom. V tomto prístupe nie je cieľom použiť superaktívnu C3 konvertázu k produkcii generalizovanej deplécie C3, ale namiesto toho použiť konvertázu lokálne ku koncentrácii C3 konverzie do požadovaného cieľa. Cieľom môže byť patogénny organizmus, ako je baktéria, vírus alebo iný parazit, alebo nadbytočná bunka alebo tkanivo hostiteľa ako je nádorová bunka alebo vírusom infikovaná bunka. C3 konvertáza môže byť lokalizovaná na cieľ buď lokálnym podaním (t.j. priamou injekciou, pokiaľ možno v médiu, ktoré spomaľuje jeho uvoľnenie do systémovej cirkulácie) alebo kombináciou s cieľovou skupinou, t.j. protilátkou. Takto modifikovaný proteín môže byť naviazaný na špecifický imunoglobulín buď chemickým zosieťovaním proteínov alebo pripojením DNA kódujúcej sekvencie a expresiou (a čistením) fúzneho proteínu (t.j. v prípade IgG môže byť ťažký alebo ľahký reťazec pripojený k C3 a ko-exprivovaný s C3 alebo môžu byť obidva reťazce kombinované v jednom kompletnom fúznom polypeptide) alebo inkorporáciou špecifickej kódujúcej sekvencie (t.j. pre leucin-zipper- podobné domény) k DNA obidvoch fúznych partnerov (t.j. modifikovaného C3 a špecifické protilátky) tak, že exprivované produkty, ak sú zmiešané dohromady, samotné asociujú za vytvárania stabilných konjugátov. Fúzne proteíny môžu potom byť podané lokálne alebo do systémovej cirkulácie.
Liposómy (nesúce protilátku na povrchu s modifikovaným proteínom buď na povrchu alebo vo vnútri liposómu) a/alebo virióny (t.j. spracované tak, aby exprivovali proteíny na svojom povrchu), môžu byť tiež použité pre kodopravu protilátky a modifikovaného proteínu. Táto stratégia môže byť použitá priamo, samotná alebo v kombinácii s inou liečbou, v ktoromkoľvek štádiu chorobného procesu. Môže byť zrejme vhodná na použitie v eliminácii akýchkoľvek nádorových buniek, ktoré zostali v cirkulácii po chirurgickom odstránení tumoru. Konjugáty protilátka - modifikovaný proteín môžu byť tiež použité ex vivo na elimináciu patogénneho tkaniva. Napríklad pre usmrtenie leukemických buniek z extrahovanej kostnej drene a potom pre navrátenie zvyšných zdravých buniek pacientovi.
Alternatívne môžu byť eliminované lymfocyty, ktoré nezodpovedajú MHC typu príjemcu z kostnej drene pred transplantáciou. Tiež modifikovaný proteín môže byť naviazaný na antigén a táto kombinácia sa môže použiť buď in vivo alebo ex vivo, na ovplyvnenie lymfocytov nežiaducej reaktivity (t.j. proti transplantátu alebo vlastnému tkanivu).
Rovnaká technológia sa môže použiť na liečenie iných druhov, použitím ako derivátov ľudského modifikovaného proteínu, tak podobných analógov pripravených pre ten - ktorý druh.
Preferované rysy každého aspektu vynálezu sú pre každý ďalší aspekt mutatis mutandis.
Vynález bude teraz popísaný prostredníctvom nasledujúcich príkladov, ktoré nie sú konštruované ako obmedzenie vynálezu.
Príklady sa vzťahujú k pripojeným obrázkom.
Popis obrázkov na pripojených výkresoch
Obr. 1: ukazuje predpokladanú proteínovú sekvenciu ľudského C3, ako je kódovaná v PC3,
Obr. 2: ukazuje sekvenciu cDNA v PC3,
Obr. 3: ukazuje vizualizáciu modifikovaných proteínov podľa vynálezu.
Obr. 4: ukazuje efekt rôznych mutácií ľudského C3, ktoré nahradzujú Arg 1303 alebo Arg 1320, na faktorom l-spôsobené štiepenie v týchto miestach.
Obr. 5: ukazuje zvýšenú rezistenciu ľudského C3 irikorporujúceho Arg 1303 > Gin 1303 mutáciu na inaktiváciu faktormi I a H.
Obr. 6: ukazuje analýzu štiepenia C3 konvertázy mutovanej v aminokyselinových zvyškoch 752-754 a 758-760.
Obr. 7: ukazuje analýzu štiepenia rádioznačeného faktoru B faktorom D, za prítomnosti divokého typu a mutantného C3 (C3i)
Obr. 8: ukazuje SDS-PAGE štúdiu, ilustrujúcu vytváranie konjugátov medzi C3i a IgG.
Obr. 9: demonštruje, že konjugát zameriava C3 konvertázovú aktivitu proti ovčím erytrocytom.
Nasledujúce štandardné metódy a definície sú aplikovateľné na všetky príklady.
Všetky uvedené komponenty komplementu sú ľudského pôvodu, pokiaľ nie je inak špecifikované a je použitá štandardná terminológia pre všetky proteíny a ich odvodené fragmenty (t.j. ako je obsiahnuté v odkaze (I5). Naviac termín C3i označuje akúkoľvek molekulárnu formu C3 bez intaktnej tiolesterovej väzby, ale zachovávajúca C3a polypeptid na alfa reťazci.
Ľudská C3 cDNA a kódujúca sekvencia sú značené ako ukazuje obr. 2, použitím značenia používaného v EMBL nukleotidovej databáze (odvodenej od odkazu (2)). Ukázaná sekvencia je sekvenciou nášho konštruktu (PC3’), ktorý nemá prvých 11 nukleotidov z 5' netranslatovaného regiónu popísaného v odkaze (2), a preto je prvá báza značená 12. Putatívny iniciačný kodón sú nukleotidy 61-63, kodón pre aminoterminálny serínový zvyšok beta reťazca sú nukleotidy 127-129, a kodón pre aminoterminálny serínový zvyšok alfa reťazca sú nukleotidy 2074-2076.
Proteínová sekvencia je značená v súlade s prekurzorovou sekvenciou ako je ukázané na obr. 1, ktorá je predpokladane transláciou DNA sekvencie dodatku 1 (u aminokyselín 1-22 sa očakáva, že zahrňujú signálnu sekvenciu, ktorá je odstránená počas biosyntézy a u aminokyselín 668-671 sa očakáva, že sú odstránené, ak je prekurzor štiepený na alfa a beta reťazce).
Obr. 7: ukazuje analýzu štiepenia rádioznačeného faktoru B faktorom D, za prítomnosti divokého typu C3 a mutantného C3 (C3i)
Je uvedená fotografia autorádiografu SDS-PAGE gélu. Všetky vzorky obsahujú faktor D a 125|_značený faktor B a boli inkubované po 3 hodiny pri 37 °C.
Vzorky v číslovaných dráhach tiež zahrňujú:
1. Pufor samotný
2. 1/125 C3 divokého typu
3. 1/25 C3 divokého typu
4. 1/5 C3 divokého typu
5. 1/25 mutantného C3 (zvyšky 1427 Gin, 1431 Asp a 1433 Gin)
6. 1/5 mutantného C3
7. neriedený mutantný C3
Prúžky označené šípkou sú:
A. Neštiepený 125|_značený faktor B (93 kDa).
B. 60 kDA produkt štiepenia (Bb)
C. 33 kDa produkt štiepenia (Ba)
Obr. 8: ukazuje SDS-PAGE štúdiu, ilustrujúcu vytváranie konjugátov medzi C3i a IgG.
Toto je Coomassie farbenie 4 % akrylamidového SDS-PAGE gelového priebehu za neredukujúcich podmienok. Počítané dráhy obsahujú vzorky:
1. PDP-lgG
2. C3i
3. PDP-lgG + C3i reakčná zmes
Šípkou sú označené:
A. Pravdepodobný C3i-lgG konjugát (350 kDa)
B. C3i (200 kDa)
C. IgG (150 kDa)
Obr. 9: demonštruje, že konjugát zameriava C3 konvertázovú aktivitu proti ovčím erytrocytom. Tento graf ukazuje % lýzie ovčích erytrocytov po potiahnutí roztokom buď C3i - IgG konjugátu, alebo F'DP-lgG alebo C3i nasledovaným premytím, generáciou C3 konvertázy properdínom a faktormi B a D a záverečným vývojom lýzie NGPS v CFD/EDTA, ako je popísané v metódach. Iba konjugát produkuje lýziu a táto lýzia je závislá od dávky.
Nasledujúce štandardné metódy a definície sú aplikovateľné na všetky príklady.
Všetky uvedené komponenty komplementu sú ľudského pôvodu, pokiaľ nie je inak špecifikované a je použitá štandardná terminológia pre všetky proteíny a ich odvodené fragmenty (t.j. ako je obsiahnuté v odkaze (I5). Naviac termín C3i označuje akúkoľvek molekulárnu formu C3 bez intaktnej tiolesterovej väzby, ale zachovávajúca C3a polypeptid na alfa reťazci.
Ľudská C3 cDNA a kódujúca sekvencia sú značené ako ukazuje obr. 2, použitím značenia používaného v EMBL nukleotidovej databáze (odvodenej od odkazu (2)). Ukázaná sekvencia je sekvenciou nášho konštruktu (PC31), ktorý nemá prvých 11 nukleotidov z 5' netranslatovaného regiónu popísaného v odkaze (2), a preto je prvá báza značená 12. Putatívny iniciačný kodón sú nukleotidy 61-63, kodón pre aminoterminálny serínový zvyšok beta reťazca sú nukleotidy 127-129, a kodón pre aminoterminálny serínový zvyšok alfa reťazca sú nukleotidy 2074-2076.
Proteínová sekvencia je značená v súlade s prekurzorovou sekvenciou ako je ukázané na obr. 1, ktorá je predpokladane transláciou DNA sekvencie dodatku 1 (u aminokyselín 1-22 sa očakáva, že zahrňujú signálnu sekvenciu, ktorá je odstránená počas biosyntézy a u aminokyselín 668-671 sa očakáva, že sú odstránené, ak je prekurzor štiepený na alfa a beta reťazce).
Nasledujúce skratky majú nasledujúci význam: CVF - faktor kobrieho jedu, ELISA - enzýmová väzobná imunoadsorbentná skúška, E. coli Escherichia coli, kb - kilobáza, HSV-1 - Herpes simplex vírus typu T, PBS fosfátový pufrovací salinický roztok. COS-1 je bunečná línia odvodená od buniek ovčích ľadvín. Nasledujúce sú reštrikčné endonukleázy: Afill, Dral, Dralll, EcoRI, EcoRV, Hindlll, Nael, Nhel, Xbal.
Štandardné metódy
Metódy pre štandardné biologické procedúry ako je izolácia plazmidov, gelová elektroforéza na agaróze a DNA ligácia môžu byť zistené v odkazoch (21). Dvojreťazcová DNA bola sekvenovaná použitím Sequenase version 2.0 gitu poskytnutým United States Biochemicals. C3 expresia bola meraná ELISA skúškou použitím plastických plátov vopred potiahnutých afinitne purifikovanou polyklonálnou ovčou anti-ľudský C3 protilátkou, na ktorej boli pridané vzorky supernatantu kultúry. Väzba C3 bola detekovaná monoklonálnou krysou protilátkou k C3 konjugovanému s alkalickou fosfatázou a chromogénnemu substrátu, p-nitrofenol fosfátu. Skúšky boli kalibrované s purifikovaným C3 ľudskej plazmy.
Metódy pre purifikáciu proteínov komplementu a CVF a pre prípravu afinitne purifikovaných anti-C3 protilátok používaných v analýze môžu byť nájdené v odkaze (28). Ekvivalentné činidlá sa môžu tiež získať od Sigma Chemical Company LTD.
C3 cDNA kódujúce sekvencie . Naše C3 cDNA kódujúce sekvencie boli konštruované z dvoch segmentov izolovaných z náhodne vybratej ľudskej pečeňovej cDNA knižnice nesenej vo vektore pGEM4 (Promega). Päť oligodeoxynukleotidov, korešpondujúcich známym segmentom v ľudskej C3 kódujúcej sekvencii, bolo rádioznačené T4 polynukleotid kinázou a (gama-32P) ATP a použité na skúšanie filtrových transferov knižnice z agarózových plátov. Boli izolované dva klony obsahujúce inzerty približne 4 kb. Digescia reštrikčnou endonukleázou, hybridizácia na špecifické oligodeoxynukleotidovej skúške a čiastočná sekvenčná analýza ukázali, že jedna z nich (A13) zahrňuje 5-koniec 5,1 kb sekvencie, zatiaľ čo druhá (B44) dosahuje k 3'-koncu.
Tieto inzerty sa preto presahujú približne o 3 kb, vrátane jedinečného EcoRI miesta pre reštrikčný enzým. Nekompletné 5'-sekcie A13 boli rozrušené EcoRI a Nhel a nahradené kompletným segmentom izolovaným z B44 digesciou EcoRI a Xbal. Obidve častí boli purifikované gellovou elektroforézou na agaróze s nízkou teplotou topenia pred spoločnou ligáciou T4 DNA ligázou za vytvorenia vektoru (PGC3) obsahujúceho 5,1 kb DNA, kódujúcej celý C3 prekurzorový proteín.
Linkér sekvencie 5' k C3 kódujúcemu regiónu obsahovali dva ATG, ktoré sú potenciálnymi falošnými štartovacími miestami translácie. Tieto boli preto odstránené gapped - plasmid mutagenézou, ako je popísané v metóde príkladu 1, použitím oligodeoxynukleotidu PL-ATC-3 (tagggagacc ggaagcttgc cctctccctc tgtccctctg t), ktorý deletoval približne 50 párov báz linkér/adaptor DNA, bez alterácie C3 kódujúcej sekvencie. Tento mutovaný vektor, 7,7 kb obsahujúci 5,1 kb C3 cDNA sekvencie plus 2,6 kb sekvencie z PGEM4 vektoru (Promega) je označený ako PC3.
C3 kódujúci región PGC3 plazmidu bol kompletne sekvenovaný a vykazoval iba štyri odlišnosti od prv publikovanej ľudskej C3 (S alela) cDNA sekvencie (2).
(i) Zmeny C2481 >G a C2850 > T nealterujú kódovanie, (ii) T1001 >C kóduje prv popísanú HAV 4-1-(leucín 314 > prolín) polymorfnú formu (20), a (iii) G2716 >A kóduje valín 886 > izoleucín, ktorá nebola prv popísaná v ľudskom C3, hoci lle sa nachádza v tejto polohe u myšieho a krysieho C3.
Naša sekvencia zahrňuje štart a stop kodóny, s kompletnou signálnou sekvenciou a mala by preto kódovať funkčné C3.
Hladiny exprivovaného divokého typu C3 vyššie ako 1,7 pg/ml v supernatante kultúry COS-1 buniek (transfektovaných použitím lipofectamínu a pcDNA3 (Invitrogén) expresného vektora) boli detekované ELISA. Žiaden detekovateľný C3 nebol produkovaný bunkami transfektovanými samotným pcDNA3 vektorom. Naviac, analýza expresného produktu štiepiacimi reakciami nasledovanými imunoprecipitáciou, SDS-PAGE a imunoblottingom demonštrovala, že:
(i) primárny translačný produkt bol správne spracovaný do zrelej dvojreťazcovej formy, (ii) tento produkt bol, ako natívny C3, štiepiteľný na C3b C3 konvertázou (CVFBb) a (iii) exprivovaný proteín nebol, ako natívny C3, štiepiteľný faktorom H plus I, ale stal sa štiepiteľným po konverzii na C3b enzýmom C3 konvertázou. Toto potvrdzuje, že náš počiatočný plazmid môže byt:’ translatovaný do funkčného C3.
Pre alternatívny popis konštrukcie a expresie C3 kódujúcej sekvencie pozri odkaz (25).
Príklady vyhotovenia vynálezu
Príklad 1
Produkcia G3, ktorý má arginínové zvyšky v obidvoch štiepiacich miestach faktoru I (aminokyseiinová poloha 1303 a 1320), konvertovaná na glutamínové zvyšky z dôvodu zabránenia štiepenia C3b fragmentu faktorom I.
a) Mutagenéza
Použité mutagénne oligodeoxynukleotidy boli QRI1 (caactgcccagccaaagctccaagatcacc), QRI2 (gccagcctcctgcaatcagaagagaccaag) aAFL4149 (taataaattcgaccttaaggtcaccataaaac), rovnako ako korešpondujúce antisense oligodeoxynukleotidy QRI1n, (ggtgatcttggagctttggctgggcagttg), QRI2n (cttggtctcttctgattgcaggaggctggc) a AFL4149n (gttttatggtgaccttaaggtcgatttatta).
QRI1 a QRI2 špecificky nahradzujú arginín glutaimínom v štiepiacich miestach pre faktor I v aminokyselinovom zvyšku 1303 v C3 prekurzorovej sekvencii (zmenou G3968C3969 na AA v cDNA sekvencii) a QRI2 a QRI2n uskutočňujú rovnakú substitúciu na štiepiacom mieste pre faktor v aminokyselinovom zvyšku 1320 (zmenou nukleotidu G4019 na A).
AFL4149 a AFL4149n zavádza štiepiace miesto pre reštrikčnú endonukleázu Ag1 II v polohe 4149 do cDNA sekvencie (zmenou C4149 na T) bez alterácie kódovanej aminokyselinovej sekvencie. Tieto dva primery boli použité ako markéry, ktoré dovoľujú identifikáciu úspešnej mutagenézy na podklade štiepenia DNA produktu Af1 II.
Mutagenéza bola uskutočnená gapped plasmid metódou. Dávka PGC3 (UPGC3), obohatená uridínom v mieste tymidínu, bola pripravená rastom v E. coli kmeňa CJ236 za prítomnosti 0,25 pg/ml uridínu. Tento plazmid bol trávený Smal a 7,2 kb produkt (US1) bol purifikovaný na agarózovom geli kvôli odstráneniu 0,5 kb fragmentu z C3 sekvencie (zvyšky 1463-1947). Iný komponent gapped plasmidu (DN2) bola pripravený trávením PGC3 Drali] plus Nael a purifikáciou 5,1 kb časti dvakrát na agarózovej gelovej elektroforéze. 200 ng DN2 bolo zmiešané s približne 500 ng US1 v 50 μΙ H2O, zahriate na 100 °C a pomaly ochladené pod 50 °C pred pridaním 20 μΙ až 25 μΙ 2XT7 pufru (100 mM Tris/HCI/pH 7,4), 14 mM MgCl2, 100 mM NaCI, 2 mM ditiotreitolu a 1 mM ATP, dATP, dCTP, dTTP a dGTP) plus 10 nmól každého 5'fosforylovaného mutagénneho primeru (jedna reakcia použila QRI1, QRI2 plus AFL4149), iná reakcia použila QRI1n, QRI2n plus AFL4149n). Zmes bola znova zahriata na 70 °C po 5 min. a pomaly ochladená (v priebehu 30 až 60 min.) na 20 °C. Pri 0 °C bolo pridaných 10 jednotiek T7 DNA polymerázy plus 80 jednotiek T4 DNA ligázy. Zmes (celkový objem 50 μΙ) bola inkubovaná najprv pri 0 °C po 5 min., potom pri izbovej teplote po 5 min. a nakoniec pri 37 °C po 3 h. 1 μΙ každej zmesi bol použitý pre transformáciu 100 μΙ superkompetentnej XL1 E. coli (Stratagene) podľa inštrukcií výrobcu.
Ampicilín rezistentné kolónie boli vyšetrované ria Aflll štiepenie a úspešné mutanty boli kultivované v 100 ml kultúry, z ktorej boli izolované a sekvenované plazmidy (použitím sekvenčného primeru C3pa-3876, cttcatggtgttccaagcct, zodpovedajúci nukleotidom 3876-3895 C3 cDNA) pre charakterizáciu mutácií v štiepiacich miestach pre faktor I.
Pre alternatívny protokol pre gapped plasmid mutagenézu pozri odkazy (26, 27).
b) Transfer mutantnej DNA do eukaryotného expresného vektoru
C3 kódujúci fragment z mutantných plazmidov bol excidovaný dvojitou digesciou Hindlll a Nael. Dral bol tiež použitý pre inkapacitáciu reziduálneho plazmidu. C3 kódujúca sekvencia bola purifikovaná na agarózovom geli a ligovaná do pcDNA3 vektoru (Invitrogen), ktorý bol linearizovaný Hindlll a EcoRV enzýmu a defosforylovaný teľacou črevnou fosforylázou. Ligačná zmes bola použitá na transformáciu superkompetentnej XL1 E. coli, ktorá bola potom umiestnená na kultivačné pláty obsahujúce ampicilín.
Náhodný výber (tri alebo štyri) ampicilín rezistentných kolónií -bol kultivovaný v 2 - 3 ml kultúrach za malej škály izolácie plazmidovej DNA. Plazmidy obsahujúce správny inzert boli identifikované digesciou plazmidovej DNA reštrikčnými endonukleázami EcoRi, Hindlll a Aflll. Korešpondujúce kolónie boli kultivované v 100 ml kultúry a plazmidy boli purifikované štandardnou procedúrou. Mutanty boli pôvodne konštruované z PGC3 a tak zachovávali dva ATG 5' ku kódujúcemu regiónu. Tento región (plus 5' 3kb C3 kódujúce sekvencie) bol preto excidovaný Hindlll plus EcoRI a nahradený ligáciou rovnakého segmentu vyrezaného z PC3. Tieto rekonštruované vektory boli pripravené štandardnými procedúrami a použité pre transfekciu COS buniek.
c) Expresia divokého typu C3 a mutantného C3
Mutantný a divoký typ C3 boli transientne exprivované plazmidy transfektovanými do COS-1 buniek použitím lipofectamínu (GIBCO) podľa inštrukcií výrobcu. Typicky bolo transfektovaných 1 až 1,5 x 105 buniek na jamku štandardného 6 jamkového kultivačného plátu 2 - 4 pg plazmidu za použitia 9 pl lipofectamínového činidla. Supernatanty boli hodnotené na C3 sekréciu a typicky bolo získané 0,3 až 1,7 pg na ml 3 - 6 dní po transfekcii. Výsledky
a) Generácia mutantov
Nasledujúce mutanty, pomenované podľa mutagénnych oligonukleotidových sekvencií, ktoré boli inkorporované, boli doteraz izolované:
(i) 3 mutanty s ako QRI1, tak QRI2 mutáciou plus AFL4149: C3M-26, C3M-58 a C3M-61, (ii) 1 mutant s ako QR11, tak QRI2 mutáciou, ale bez AFL4149: C3M-8 (iii) 1 mutant s QRI2 a AFL4149, ale bez QRI1; C3M-51 (použitý v príklade 1).
b) Potvrdenie, že funkčné efekty boli spôsobené mutáciami špecificky zavedenými do faktor I štiepiacich miest.
Sekvenovanie potvrdilo neprítomnosť iných alterácií v 178-350 bázach okolo mutovaného regiónu každého mutantu. Sekvencia jedného mutantu produkovaného týmto postupom, C3M-51 (pozri príklad 3), bola analyzovaná pre celý gap (báza 2463-5067) použitý v mutagenéze a žiadne iné odchýlky od divokého typu sekvencie neboli nájdené.
Naviac, reprezentatívne sekvenovanie celkom 2922 báz zo všetkých mutantov neodhalilo žiadnu jednobodovú mutáciu, ktorá by mohla byť spôsobená polymerázou sprostredkovanými chybami. Exprivované mutanty všetky vykazovali dvojreťazcovú štruktúru a štiepenie C3 konvertázou charakteristické pre natívne C3. Súhrnne, použité mutanty pravdepodobne neobsahujú žiadne nežiaduce zmeny, hoci neboli kompletne resekvenované.
Príklad 2
Produkcia C3, ktorý má arginínový zvyšok v jednom štiepiacom mieste faktoru I (aminokyselinová poloha 1303) konvertovaný na glutamínový zvyšok
Bol sledovaný postup príkladu 1 s tou výnimkou, že v mutagenéze boli použité iba mutagénne oligonukleotidy AFL4149 plus QRI1 alebo AFL4149n plus QRI1n (t.j. bez QRI2 alebo QRI2n).
Výsledky
a) Získané mutanty
Boli získané 2 mutanty s QRI1 a AFL419, ale bez QRI2: - C3M -123, 27. Mutant C3M-I23 bol exprivovaný ako je popísané v príklade 1.
Tento proteín bol štiepiteľný CVFBb. C3-b podobný produkt bol relatívne (v porovnaní s divokým typom) rezistentný na štiepenie faktormi I a H v pozícii 1303, ale stále mohol byť štiepený v polohe 1320. Tento C3b derivát je preto čiastočne rezistentný na faktor I.
Príklad 3
Produkcia C3, ktorý má arginínový zvyšok v jednom štiepiacom mieste faktoru I (aminokyselinová poloha 1320) konvertovaný na glutamínový zvyšok
Bol sledovaný postup príkladu 1 s tou výnimkou, že v mutagenéze boli použité iba mutagénne oligonukleotidy AFL4149 plus QRI2 alebo AFL4149n plus QRI2n (t.j. bez QRI1 alebo QRHn).
Naviac, metóda použitá v príklade 1 tiež produkovala jeden mutant s QRI2 a AFL4149, ale bez QRI1.
Výsledky
a) Získané mutanty
Boli izolované 3 mutanty s QRI2 a AFL4149, ale bez QRI1: - C3M-51, C3M-Q2, C3M-Q13. Mutant C3M-51 bol exprivovaný ako je popísané v príklade 1. Tento proteín bol štiepiteľný CVFBb. C3-b podobný produkt nebol ľahko štiepený faktormi I a H v polohe 1320, ale stále mohol byť štiepený v polohe 1303. Tento C3b derivát je preto čiastočne rezistentný na faktor I.
Príklad 4
Analýza funkčných efektov mutáciou
Supernatanty (100 - 400 μΙ) z transfektovaných COS buniek boli inkubované pri 37 °C po 2h s:
COS bunky boli transfektované pcDNA3 nesúcimi inzerty:
1. nemutované C3 sekvencie
2. mutantné C3M-I23 (kódujúce Arg^303 > Gin)
3. mutantné C3M-26 (kódujúce Arg1303 > Gin, Arg1320 > Gin) a
4. mutantné C3M-51 (kódujúce Arg^323 > Gin)
200 μΙ supernatantov kultúr, odobraných 3 dni po transfekcii, bolo predošetrené 2 mM fenylmetánsulfonyl fluoridom (0 °C, 15 min.) a potom inkubované pri 37 °C po 2 hodiny s nasledujúcimi.
A. žiadna prímes
B. preformovaná C3 konvertáza, CVFBb (10 μΙ z 200 μΙ obsahujúcich 6,6 μg CVF, 100 μg faktoru B a 1,4 μg faktoru D vo fosfátovom pufrovacom salinickom roztoku (PBS) obsahujúcom 10 mM MgC^, preinkubovanom pri 37 °C, 15 min.).
C. faktory H (5 pg) a I (1 pg), a
D. CVFBb plus faktory H a I.
Tieto boli potom imunoprecipitované pridaním 0,6 pg afinitne purifikovaného ovčieho anti-ľudského C3 imunoglobulínu pri izbovej teplote a po 1 hodine pridaním 20 μΙ 5 % suspenzie premytých formalínom fixovaných buniek Streptococcus sp. skupiny C (proteín G) (Sigma). Po 45 min. pri izbovej teplote boli častice raz premyté v PBS, 5 mM NaN3 a raz v 20 mM Tris/HCI, 137 mM NaCI, 0,1 % (obj./obj.) Tween 20, pH 7,6, pred eluáciou v 1 % SDS/2 % 2-merkaptoetanolu (90 - 100 °C, 5 min.). Tieto eluáty boli separované SDSPAGE, elektroblotované do nitrocelulózy a C3 prúžok bol detekovaný testovaním s afinitne purifikovaným ovčím anti-ľudským C3 imunoglobulínom nasledovaným chrenovou peroxidázou konjugovanýrn oslím anti-ovčím imunoglobulínom (Sigma) a detekciou použitím Enhancecl Chemiluminiscence substrátmi poskytnutými Amersham. Je ukázaná fotografia 2 minútovej expozície na rentgenový film. Viditeľne C3-odvodené prúžky sú indikované značenou šípkou a jednotlivé vzorky (1-4, A-D) sú tie, ktoré boli práve popísané. (Prominentný prúžok okolo 50 kDa (medzi 46-68 kDa prúžky) prítomný vo všetkých vzorkách je ťažký reťazec IgG použitý v imunoprecipitácii a detegovaný chrenová peroxidáza - konjugovaný oslí anti-ovčí imunoglobulín). Výsledky (pozri obrázok 3)
1. Všetky neošetrené vzorky (1-A, 2-A, 3-A, 4-A) obsahovali prúžky korektnej migrácie pre alfa a beta reťazce C3, indikujúc tak, že všetky mutanty sú exprivované a posttranslačne spracované správne. Prítomnosť 43 alebo 46 kDa prúžkov v týchto vzorkách indikuje prítomnosť niektorého faktoru H + faktoru I - podobnej aktivity v kultivačnom médiu. Spontánna hydrolýza C3 počas 3 dennej bibsyntetickej periódy produkuje C3i, ktorý je štiepený touto aktivitou. V nemutovanom C3 toto generuje prúžky 43 kDa a 75 kDa (75 kDa nie je viditeľný, pretože (i) je zakrytý 75 kDa beta reťazcom a (ii) protilátka použitá na vývoj Western blot má veľmi malú aktivitu k tejto časti C3 alfa reťazca: - jeho prítomnosť bola nasledovne potvrdená pretestovaním krysou monoklonálnou protilátkou, Clone-3, ktorá je špecifická pre tento región). Pridanie faktorov H a I bez CVFBb (1-C, 2-C, 3-C, 4-C) neštiepilo zvyšný C3 indikujúc tak, že tento reprezentuje aktívny C3 (tiolester intaktný).
2. Nemutovaný C3 (1) je štiepený CVFBb a C3b produkt je ďalej štiepený endogénnymi enzýmami v 1-B alebo pridanými faktormi H a I v 1-D, 43 k a prúžok indikuje štiepenie v Arg1320 a 68 kDa prúžok (viditeľný pri dlhšej expozícii) indikuje štiepenie v Arg^3^3.
3. Mutantný C3M-I23 (Arg^3Q3 >Gln) bol štiepiteľný CVFBb a produkt bol relatívne rezistentný na endogénnu aktivitu faktorov H a l-podobná (2-B), s perzistujúcim malým množstvom alfa reťazca (C3b), ale stále štiepiteľný, pokiaľ bol extra pridaný faktor H a l, 43 kDa produkt indikuje štiepenie v Arg^323 (slabý prúžok 71 kDa reprezentujúci iný fragment alfa reťazca môže byť viditeľný pri dlhšej expozícii), ale nebol prítomný žiaden 68 kDa prúžok, ukazujúc tak, že mutant je rezistentný na štiepenie v mutovanom Gin1333.
4. Mutant C3M-26 (Arg”!333 >Gln, Arg”!323 >Gln) bol štiepiteľný CVFBb a C3b-podobný produkt (alfa) bol rezistentný na endogénnu aktivitu faktoru H a I (3-B). Bol tiež veľmi rezistentný na adičné faktory H a I (3-D) v porovnaní s nemutovaným C3 (1) a inými mutantmi (2 a 4). Bolo tu malé množstvo produktu o 46 kDa, čo indikuje nejaké štiepenie v mutovanom Gin”*333 (sprevádzajúci 68 kDa fragment bol tiež viditeľný pri dlhšej expozícii). Bol tu málo alebo vôbec nedetegovateľný 43 kDa, ktorý by korešpondoval s akýmkoľvek štiepením v Gln1320 preto je Arg >Gln mutácia v polohe 1303 menej efektívna ako tá v polohe 1320 v zabránení štiepenia faktorom I. (Toto malé reziduálne štiepenie sa tiež môže vyskytovať u mutantu C3M-I23 (Arg”!333 >Gln), ale 46 kDa intermediát je pravdepodobne rýchlo spracovaný na 43 kDa ďalším štiepením v nemutovanom Arg”!323).
5. Mutant C3M-51 (Arg”!323 >Gln) bol štiepiteľný CVFBb a produkt bol štiepený endogénnou aktivitou faktoru H a l (4-B) a adičnými faktormi H a I (4D). 46 kDa produkt (a slabý 68 kDa prúžok) indikujú štiepenie v Arg”!333). Avšak absencia 43 kDa prúžku indikuje, že nie je štiepený v mutovanom Gin”!323.
Príklad 5
Porovnanie rôznych aminokyselinových substitúcií v polohe 1303
1. Úvod
Predchádzajúce príklady popisujú mutácie arg 1303 a arg 1320 na glutamínové zvyšky. Obidve mutácie udeľujú rezistenciu na štiepenie faktorom I v týchto polohách. Avšak je tu malý, ale detegovateľný stupeň štiepenia v gin 1303. Preto bolo vykonané množstvo iných aminokyselinových substitúcií v tejto polohe a testované. Štiepenie sa vyskytuje s klesajúcou účinnosťou, ak je zvyšok 1303: Arg > Tyr > (Cys alebo Trp) > Gin > (Glu alebo Gly). Tieto výsledky sú neočakávané, pretože (i) všetky známe prirodzene sa vyskytujúce ľudské faktorom I sprostredkované štiepenia majú C-koniec k arginínovému zvyšku, a tak sa vydedukovalo, že enzým má požiadavku pre arginín a (ii) ak bude štiepený v inom zvyšku, možno predpokladať, že by mal byť elektrostaticky podobný arginínu, t.j. bázický zvyšok (Lys alebo His), (t.j. trypsín selektívne štiepi C-koniec k arg, lys alebo his), a tak nemôžeme predpokladať štiepenie tyrozínovej substitúcie.
Preto je substitúcia arg 1303 glycínom alebo kyselinou glutamovou preferovaná za účelom vytvorenia derivátu C3 rezistentného na inaktiváciu faktorom I.
2. Metódy
2.1. Mutagenéza: degenerovanie použitých mutagénnych primerov bolo: caactgcccagc(gt)(ag)(cg)agctccaagatcacc (písmená v zátvorkách indikujú zmes báz v týchto pozíciách). Mutanty boli konštruované buď gapped plasmid metódou (ako bola popísaná v skorších príkladoch) alebo megaprimerovou metódou (V. Picard et al., Nuc. Acid Res. 22, 2587 - 2591 (1994)), v ktorej upstream primer bol caccaggaactgaatctagatgtgtccctc a downstream primer bol gttttatggtgaccttaaggtcgaatttatta. Všetky mutácie boli vykonané na templátoch, v ktorých C3 - kódujúca DNA bola už mutovaná tak, že aminokyselinovým zvyškom 1320 bol glutamín a reštrikčné miesto pre Af1 II bolo zvedené do polohy 4149 (ako je popísané v skorších príkladoch) a toto bolo potvrdené sekvencovaním.
2.2. Expresia: mutanty boli exprivované v COS bunkách použitím pcDNA3 vektoru ako je popísané v skorších príkladoch, biosynteticky značené (35s) metionínom v sérum zbavenom médiu.
2.3. Skúška: supematanty boli ošetrené CVFBb (vytvoreného reakciou CVF s faktormi B a D v horčík obsahujúcom pufre) a faktormi H a I nasledovanými imunoprecipitáciou s anti-C3 a separáciou SDS-polyakrylamidovou gelovou elektroforézou vykonanou za redukčných podmienok (ako je popísané v skorších príkladoch). Gel bol fixovaný, ošetrený Amersham Amplify činidlami, sušený a exponovanými na autorádiografickom filme za získania výsledkov uvedených na obrázku.
3. Výsledky
Faktorom I sprostredkované štiepenie v polohe 1303 (miesto 1), bez štiepenia v 1320 (miesto 2) (kde toto bolo mutované na glutamín) produkovalo prúžky 46 a 68 kDa. Môže sa pozorovať, že sa štiepenie vyskytuje v poradí: arg(R) > tyr(Y) > cys(C) > a trp(W) > gln(Q) > gly(G) a glu(E). Divoký typ (arginín v obidvoch pozíciách) je štiepený v obidvoch polohách za produkcie fragmentov 43 (príliš malý na to, aby bol viditeľný na tomto geli) a 68 kDa.
4. Obrázok
Výsledky sú ukázané na obrázku 4. Zvyšky v mieste 1 (poloha 1303) a mieste 2 (1320) sú indikované nad príslušnými dráhami.
Príklad 6
Demonštrácia zvýšenej rezistencie na inaktiváciu faktormi I a H po mutácii arg 1303 na gin
1. Úvod
Predchádzajúce príklady demonštrujú, že konverzia buď arg 1303 alebo arg 1320 na glutamín urobí toto miesto rezistentné na štiepenie faktorom I. Mutácia obidvoch miest vytvorí molekulu, ktorá je rezistentná na Štiepenie v obidvoch miestach. Tu ďalej demonštrujeme, že mutácia arg 1303 na gin samotná (bez alterácie arg 1320) vedie k porovnateľnej rezistencii, v porovnaní s divokým typom, na funkčnú inaktiváciu faktormi I a H.
2. Metóda
2.1. Expresia: Príprava arg 1303 > gin mutácie bola popísaná v skoršom príklade. Táto bola transfektovaná do CHO (všeobecná laboratórna bunečná línia odvodená od ovariálnych buniek čínskeho škrečka) kalcium - fosfátovou metódou a stabilné transfektanty boli selektované na podklade rezistencie na G418 (Geneticin dostupný u Sigma). Supernatanty bunečných kultúr boli zhromaždené a exprivovaný C3 bol čiastočne purifikovaný precipitáciou síranom sodným (10 - 20 % (hmot./obj.) frakcia) a iónovou výmenou chromatografiou na Q-Sepharose a mono-Q-Sepharose (A. W. Dodds Methods Enzymol. 223, 46 (1993)).
2.2. Skúška: Ovčie erytrocyty boli potiahnuté SO16 monoklonálnou protilátkou (R. A. Harrison a P. J. Lachmann, Handbook of Experimental Immunology, 4th Edition, kap. 39 (1986) a 4,4 ml 5 % (obj./obj.), suspenzia potom bola inkubovaná s približne 10 pg C2, 24 pg C4 a 1 pg C1 (purifikované ľudské komponenty) po 10 min. pri 37 °C v CFD (R. A. Harrison a P. J. Lachmann, supra). 0,8 ml tejto zmesi potom bolo inkubované po 105 min. s 0,25 ml obsahujúcimi semi - purifikovaný mutant alebo divoký typ C3 a EDTA do koncovej koncentrácie 12,5 mM. Bunky boli potom premývané v CFD a použité v CFD obsahujúcej 0,1 % (hmot./obj.) želatíny (CFD-gel). Rádioligand viazaný s (125|) - značenou kloň 4 monoklonálnou anti-C3 protilátkou bol použitý pre potvrdenie toho, že bolo deponované rovnaké množstvo C3b divokého typu alebo mutantného C3b.
Pre skúšku bolo rozpustených 40 pl 5 % suspenzie buniek v 250 pl CFD-gelu a 50 pl alikvótmi boli inkubované s 50 pl CFD-gelu obsahujúceho rozpustené faktory I a H v konečnej koncentrácii 100, 10, 1 a 0,1 pg/ml každého pri 37 °C po 30 minút. 0,9 CFD potom bolo pridané, bunky boli peletované centrifugáciou a premyté dvakrát viac ako 1 ml CFD zakaždým. Bunky potom boli resuspendované v 100 pl CFD-geli obsahujúceho 100 I pg/ml faktoru B, 100 pg/ml properdínu, 1 pg/ml faktoru D a 0,3 mM NÍCI2· Po 10 minútach pri 37 °C 0,9 ml CFD obsahujúceho 10 mM EDTA 2 % (obj./obj.) normálneho morčacieho séra. Po ďalších 30 minútach pri 37 °C boli nelyzované bunky peletované centrifugáciou a stupeň lýzie bol určený meraním absorbancie supernatantu pri 412 nm. Absorbančný ekvivalent k 100 % lýzie bol určený z alikvóty buniek lyzovaných vo vode, a preto sa kalkulovalo percento lýzie.
Táto skúška meria schopnosť deponovaného C3b formovať funkčný C3bBbP konvertázu. Konverzia C3b bráni formovaniu korivertázy a následnej lýzii v sérum/EDTA.
3. Výsledky
Výsledky ukázané na obrázku indikujú, že viac ako desaťkrát viac faktoru I a faktoru H sa požaduje pre dosiahnutie hemolytickej aktivity arg 1303 > gin mutantu v porovnaní s divokým typom. Táto mutácia je preto výhodná pre vytvorenie derivátu C3, ktorého produkt C3b je rezistentný na inaktiváciu faktormi H a l. Efekt môže byť buď vďaka vyššej rezistencii na štiepenie v polohe 1303 (ak je arg mutovaný na gin) alebo vďaka vyššej rezistencii na štiepenie v polohe 1320, ak je štiepenie najprv umiestnené v polohe 1303.
4. Obrázok
Výsledky sú ukázané na obr. 5. X os indikuje koncentráciu faktorov H a I. Q1 reprezentuje arg1303 > gin mutáciu. % lýzie je merané ako popisuje metóda.
Diskusia
Základné rysy ľudského C3, s ohľadom na modifikované varianty tu popísané, sú:
(i) Molekula má funkčný C3b-podobný derivát, v ktorom môže byť kombinovaný s funkčným aktívnym ľudským faktorom B, ktorý potom môže byť štiepený ľudským faktorom D za vytvárania enzýmu schopného štiepenia ľudského C3.
(ii) Aminokyselinová sekvencia derivátov je viac homológna k ľudskému C3 ako k C3 z iných druhov, pre ktoré je sekvencia teraz známa, alebo akejkoľvek inej v súčasnosti známej proteínovej sekvencii. Štrukturálne rysy C3 prítomné v divokom type, ale nie nevyhnutne v modifikovaných derivátoch, zahrňujú nasledujúce:
a) DNA kódujúce sekvencie a sekvencie translatovaného proteínu pre variant ľudského C3 použitého v príkladoch vynálezu tu popísaných sú dané v obrázkoch 2 a 1, v príslušnom poradí. Táto proteínová sekvencia sa odlišuje od publikovanej sekvencie (2) v práve dvoch aminokyselinách (detaily sú dané v príkladoch). Predpokladalo sa, že viacero variácií je kompatibilných s C3 funkciou, hoci väčšina nie je prítomná v populácii.
b) Primárny translačný produkt je proteolyticky spracovaný do dvoch disulfidicky viazaných reťazcov, alfa (zvyšky 672-1663) a beta (zvyšky 23-667), s odstránením signálnej sekvencie (zvyšky 1-22).
c) Zrelý proteín obsahuje tiolesterovú väzbu medzi zvyškami Cys1010 a Gin 1013.
d) C3 konvertáza štiepi C3 za odstránenia C3a (zvyšky 672-748). Táto reakcia je sprevádzaná rozbitím tiolesterovej väzby,
e) Za prítomnosti faktoru H štiepi faktor I C3b medzi zvyškami Arg1303 a Ser1304 a medzi Arg1320 a Ser1321.
Modifikácie vykonané na natívnej C3 molekule
Nahradenie Arg1303 Gin
Táto modifikácia je v jednom mieste štiepenia C3b faktorom I. Efektom je redukcia rýchlosti štiepenia faktorom I v tejto polohe. Zmena na glutamín bola vybraná kvôli odstráneniu pozitívneho náboja arginínu, ktorý je pravdepodobne dôležitý pre serín proteázovú aktivitu faktoru I, pretože udržiava hydrofilný charakter a podobnú veľkosť bočného reťazca, čo môže minimalizovať akékoľvek disrupcie v terciálnej štruktúre proteínu. Dôkazom podporujúcim tento predpoklad je to, že mutácia nebráni spracovaniu do dvojreťazcovej štruktúry, formovaniu tiolesteru alebo štiepeniu C3 C3 konvertázou. Mutácia Arg1303 na inú aminokyselinu môže dosiahnuť podobný alebo i vyšší efekt ako je demonštrované v príklade 5.
Je tiež možné redukovať toto štiepenie mutovaním Ser1304 (iná strana štiepiaceho miesta) alebo iných zvyškov zahrnutých v interakcii enzým substrát.
Nahradenie Arg1320 Gin
Táto modifikácia je v inom mieste štiepenia C3b faktorom I. Efektom je drastická redukcia (prakticky zrušenie) stupňa štiepenia faktorom I v tejto polohe. Zmena na glutamín bola vykonaná za rovnakých podmienok ako sú popísané vyššie a táto mutácia tiež nebránila spracovaniu do dvojreťazcovej štruktúry, formovaniu tiolesteru alebo štiepeniu C3 C3 konvertázou. Opäť mutácia inej aminokyseliny môže viesť k rovnakému efektu, ako napríklad mutácia Ser1321 alebo iných zvyškov zahrnutých v interakcii enzým - substrát.
Pri kombinácii dvoch mutácií, Arg1303 > Gin a Arg1320 > Gin, sa predchádza C3b inaktiváciou, a preto zachovaniu jeho schopnosti vytvárať časť aktívnej C3bBb konvertázy. Iné mutácie (vrátane kombinácií mutácií), ktoré rušia obidve štiepiace reakcie, môžu sa tiež použiť (napríklad Arg1303 Glu alebo Arg1303 Gly sa môže použiť v kombinácii s Arg1320 Gin).
Príklad 7
Rôzne mutácie, ktoré redukujú interakcie C3b/C3i faktorom H
7.1 Úvod
Iné laboratória produkovali dôkazy založené buď na vplyve syntetických peptidov (Ganu, V. S. a Muller - Eberhard, H. J., 1985, Complement 2, 27, Becherer, J. D. et al., 1992, Biochemistry 31, 1787 - 1794) alebo limitovanej mutagenézy (Taniguchi - Šidle, A. a Isenman, D. E., 1994, J. Immunol. 153, 5285 - 5302), ktoré naznačujú, že zvyšky 752-761 v primárnej sekvencii C3 transkriptu (pozri obr. 1) sa môžu zahrnúť v interakcii s faktorom H. Avšak iní publikovali dôkazy, ktoré naznačujú, že v interakcii s faktorom H sú zahrnuté iba zvyšky 767-776, zatiaľ čo zvyšky 752-761 sú dôležité pre interakciu s faktorom B (Fishelson, 1991, Mol. Immunol. 28, 545 - 552). Predpokladáme, že viac extenzívnej mutagenézy tohto regiónu môžu redukovať afinitu pre faktor
H, a preto byť žiaduce pre objektívne vytváranie C3 derivátu, ktorý je rezistentný na faktor H. Naviae sa domnievame, že významnými zvyškami pre mutáciu môžu byť prominentné kyslé rezíduá (kyselina aspartová a glutamová) a že bude žiaduce zmeniť ich na neutrálne zvyšky, ktoré s menšou pravdepodobnosťou mediujú silné interakcie. V tomto príklade sme zmenili zvyšky 752-754 z Asp - Glu - Asp na Gly - Ser - Gly, v kombinácii so zmenou zvyškov 758-760 z Glu - Glu - Asn na Gl - Ser - Gly. Produkt vykazoval redukované štiepiace charakteristiky konzistentné s redukciou citlivosti na faktor H. Toto poskytuje dôkaz, že C3 môže byť modifikovaný k redukcii väzby faktoru H, a preto citlivosti na faktory H a I. Tieto modifikácie sú žiaduce pre vytvorenie C3 konvertázy, ktorá je stabilná za fyziologických podmienok.
7.2. Metóda
Metódy mutagenézy, expresie a analýzy boli popísané v skorších príkladoch. Mutagénny oligonukleotid, ktorý bol syntetizovaný, mal sekvenciu:
agtaacctgggttcggggcatcattgcaggatcgggcatcgtttcc.
7.3. Výsledky
Výsledky štiepiacich reakcií sú ukázané na obr. 6. Tieto indikujú, že:
I. Adícia CVFBb k divokému typu C3 vedie k eliminácii alfa reťazca (dráha 2), pretože C3b, ktorý je formovaný, je citlivý na nízke koncentrácie faktoru I a H v supernatante kultúry. C3i, ktorý bol vytvorený počas expresie alebo následnej inkubácie, bol rozrušený na iC3i rovnakým spôsobom. Pridanie exogénnych faktorov I a H (dráhy 3 a 4) sa tu neodlišuje od dráh 1 a 2, pretože médium samotné obsahuje dostatok aktivity faktoru H a I k efektu kompletného štiepenia.
2. Oproti tomu ošetrenie mutantu C3 CVFBb (dráha 6) nevedie k vymiznutiu alfa reťazca. Je tu určité generovanie alfa, korešpondujúceho k C3b, ale niektoré z týchto všetkých zostávajú, indikujúc tak, že perzistencia alfa reťazca nie je len výsledkom zlyhania štiepenia CVFBb. Zvyšný neštiepený alfa reťazec v dráhe 2 môže preto reprezentovať C3i, ktorý nebol štiepený endogénnou aktivitou faktorov H a I, hoci je tiež možné, že niektoré z nich reprezentujú natívny C3 perzistujúci vtedy, ak je pre mutant požadovaná parciálna rezistencia na CVFBb. Pridanie vysokých koncentrácií exogénnych faktorov H a I (dráha 7 a 8) produkuje depléciu alfa a alfa' reťazcov, čo indikuje, že (i) mutant nie je kompletne rezistentný na tieto faktory a (ii) alfa reťazec neštiepený CVFBb v dráhe 2 je predominantne odvodený od C3i (ktorý je štiepiteľný faktormi H a I, ale nie CVFBb) ako od natívneho C3 (ktorý je štiepiteľný CVFBb, ale nie faktormi H a I). Stále ešte nie je štiepený všetok alfa reťazec, ako v dráhe 8, pravdepodobne z dôvodu rezistencie na faktory H a I.
Preto môžu mutácie zvyškov 752-754 a zvyškov 758-760 generovať C3 molekulu, ktorá stále ešte môže byť štiepená C3 konvertázou, ale je parciálne rezistentná na účinok faktorov H a I. Vo svetle novo publikovaných dát je toto pravdepodobné z dôvodu mutácií, ktoré modifikovali región, ktorý je zahrnutý v interakcii s faktorom H, a preto vedú k redukovanej afinite k faktoru H.
Príklad 8
Miesto v C3, ktoré môže byť mutované pre modifikáciu interakcie C3i s faktorom B
8.1 Úvod
Predchádzajúce príklady demonštrovali, že mutácie C3 môžu modulovať interakcie s faktormi H a I. Pre objavenie nových miest v C3, ktoré môžu interagovať s faktorom B, sme porovnávali známe sekvencie C3 molekuly od rôznych druhov, rovnako ako dostupné sekvencie pre C3 a iné homológne proteíny. Identifikovali sme región korešpondujúci zvyškom 1427-1433 ľudského C3, ktorý môže byť zahrnutý v C3 a C4 špecifických funkciách. Tieto môžu zahrňovať interakcie s faktorom B (alebo jeho homológom, C2, v prípade C4), ale nie nevyhnutne, pretože iné potenciálne funkcie zahrňujú formovanie tiolesteru, konverziu na C3b (alebo C4b formu), interakciu so substrátom C3 a/alebo C5 v konvertázovej aktivite a interakcii s faktorom I a jeho kofaktormi. Preto boli selektované zvyšky mutované do korešpondujúcich zvyškov (podľa zoradenia sekvencie) nachádzaných v iných homológnych proteínoch, v tomto prípade ľudskom C5. Tak sa zmenil zvyšok 1427 z Arg na Gin, zvyšok 1431 z Lys na Asp, a zvyšok 1433 z Glu na Gin. Výsledný mutant je citlivý na štiepenie C3 konvertázou (CVFBb) a C3b produkt bol štiepiteľný faktormi H a I. Avšak tento mutant nepodporoval konverziu faktoru B na Bb plus Ba, ktorá je závislá od väzby faktoru B na C3i (alebo C3b). Preto máme dôkaz, že tento región má menšiu interakciu s faktorom B. Zatiaľ čo je toto nežiaduce pre generovanie superaktívnej C3 konvertázy, poskytuje to indikáciu, že iné modifikácie tohto regiónu C3 budú tiež alterovať interakciu s faktorom B, a niektoré z nich budú pravdepodobne zvyšovať afinitu. Následok takýchto mutácií môže tiež zvyšovať stabilitu a aktivitu biomolekulárneho konvertázového enzýmu C3bBb (alebo C3iBb).
8.2. Metódy
Prehľad ukázaný v tabuľke 1 ďalej dokladá, prečo sa domnievame, že tento región je kandidátom pre mutagenézu. Predpokladáme, že charakter istých zvyškov bol dobre konzervovaný v C3 a C4, ale mierne sa odlišoval u obidvoch proteínov. Zvyšky 1427 1431 a 1433 boli vybrané, pretože ich prirodzený náboj môže byť ukazovateľom skupiny zahrnutej v proteín - proteín interakciách. Vykonali sa zmeny ku korešpondujúcim zvyškom v ľudskom C5, pretože vykazovali veľmi odlišné elektrostatické vlastnosti, ale v kontexte niektorých iných konzervovaných zvyškov, ktoré môžu indikovať podobnú lokálnu štruktúru.
Tabuľka 1
Pripojenie sekvencií C3 a príbuzných molekúl k regiónu zvyškov 1427-1435 ľudského C3 ZVYŠOK (človek)
Proteín Druh 1427 1428 1429 1430 1431 1432 1433 1434 1435
Q Z Q Q Z Q Z Q LU Q Q CZ h- iZ iZ WOWCZ)_iOW_i > Σ I- I- I-----CZClCZCZCZCiCZCZ
LU LU LU LU LU LULULU LULU LU LULU O O LUGLULULUOLULU >>>>>- U. > LU Lu Lu LU >->- >>íz iz íz íz íz íz íz íz x z z σ z qq ω w w ω ω w ω lu ω w w > w i-ι- :zízíz>zízízízíz >> >--LU _J >>>>>>>>
>>>->->- >>> >> > >> —1 —I FWFFFWFF cz cĺ qĺ cĺ cz z z z oĺ cz cz z íz a a 0.0.0.0.0.0.0.0.
D CO
U r -X Φ > >0Q (η u n C >>t0 ></) U X
O >> O 'CO § Φ w O =F -· >>0 e .x E X o. >0 E E w E >0 E >ó E co
0
j»: jxí >υ φ
Φ ttl CO cu CO L— co
> >w j. >W (Λ > >ίΛ w Jkí ω
0 >> c O £ Z* O z * ><λ £
>0 c >ó E >0 E j«c Ó)
□ o
CD o
•>S c 'T -Q
o 0 X3 2 Q. ·§ 2 2 co
CO t}- Q. CO O m CM N V-
0 O ω O Q. O < O. 2 < < <
Metódy mutagenézy, expresie a analýzy C3 štiepiacich reakcií boli rovnaké, ako sú popísané v predchádzajúcich príkladoch (príklady 1 - 4). Mutagénny oligonukleotid bol syntetizovaný so sekvenciou: tggtgttgaccaatacatctccgactatcagctggacaa.
Skúška pre obrat faktoru B
Exprivovaný produkt bol purifikovaný z média COS buniek afinitnou purifikáciou na kolóne Clone - 3 - Sepharose ako popisuje príklad 9. Táto metóda viedla k značnej konverzií tiolester rozrušenej formy C3i. Divoký typ C3 bol izolovaný rovnakou procedúrou. Diluovaný divoký typ C3 (1/5, 1/25 a 1/125) bol spracovaný na SDS-PAGE geli (redukčné podmienky) spolu s mutantným C3, a farbenie striebrom indikovalo, že mutant bol prítomný v koncentrácii ekvivalentnej k o niečo menej ako 1/25, ale o niečo viac ako 1/125 riedenia divokého typu. Rovnaké riedenia boli použité v skúške na obrat faktoru B. 5 μΙ týchto C3 bolo inkubované s 25 μΙ CFD-G obsahujúceho 5 pg/ml faktora D a približne 1,6 pg/ml 125l-značeného faktoru B (približne 1 000 2 000 dpm/μΙ) po 3 h pri 37 °C. Vzorky potom boli analyzované SDS-PAGE (redukčné podmienky) s autorádiografiou sušeného gélu. Výsledky sú ukázané na obr. 7.
8.3. Výsledky
Ako ukazuje obr. 7, zreteľné štiepenie faktoru BV sa vyskytuje ešte v 1/125 riedenia divokého typu C3 (C3i). Oproti tomu, žiadne signifikantné štiepenie nebolo pozorované v prítomnosti mutantného C3, ani neriedeného, ktorý bol v koncentráciách vyšších ako 1/125 vzorky divokého typu.
U tohto mutantu sa preto javí, že má porušenú schopnosť podporovať štiepenie faktoru B, najpravdepodobnejšie redukciu afinity väzby pre faktor B. Z tohto dôvodu je toto región C3, ktorý môže byť mutovaný pre moduláciu interakcie medzi C3i (alebo C3b) a faktorom B a tiež snáď stabilitu konvertázy (C3iBb alebo C3bBb).
Príklad 9
Purifikácia exprivovaných C3 mutantných molekúl
9.1 Úvod
Tento príklad demonštruje, ako môžu byť mutantné C3 molekuly izolované z expresného média, ako je kultivačné médium transfektovaných eukaryotických buniek. Jednoduchou afinitnou purifikáciou sú C3 molekuly získané v čistote dostatočnej pre funkčné testy a pre konjugáciu s protilátkou metódou popísanou v príklade 10. Hoci eluácia z protilátky je spojená s hydrolýzou značnej časti vnútorných tiolesterov, je C3i produkt stále ešte vhodným prekurzorom pre generáciu aktívnej C3 konvertázy, rovnako ako pre produkciu C3i-protilátkových konjugátov. Tento prístup je tiež pravdepodobne využiteľný ako časť prípravy vyžadovanej pre in vivo použitie.
9.2. Metóda
Afinitná purifikácia na Clone - 3 - Sepharose
Clone - 3 je krysia monoklonálna protilátka, ktorá je špecifická pre C3 a jeho deriváty, vrátane C3b a C3i (Lachmann, P. J. et al., 1980, J. Immunol. 41, 503 5145). Sú dosiahnuteľné iné monoklonálne protilátky proti C3 a v niektorých prípadoch boli úspešne použité v izolovaní C3 z malých množstiev ľudskej plazmy (Dodds, A. W., 1993: Methods Enzymol. 223, 46 - 61) a sú preto tiež pravdepodobne aplikovateľné pre izolovanie molekúl exprivovaných ex vivo. IgG frakcia bola spojená na Sepharosa CL-4B použitím kyanobromid (metodológia môže byť nájdená v Harrison a Lachmann, 1986, Handbook of Experimental Immunology, 4. vyd., vyd. Weir, Herzenberg, Blackwell and Herzenberg, Blackwell, Oxford). Supernatanty kultúr boli buď priamo vložené do kolón tejto živice (re-cirkulovanej) alebo najprv koncentrované precipitáciou s 25 % (hmot./obj.) Na2SO4, a resolubilizáciou a dialýzou do PBS, 5 mM ΝθΝβ. Kolóny potom boli premývané postupne (i) PBS, 5 mM NaN3 a (ii) PBS obsahujúcim 1M NaCI. Väzba C3 sa eluuje s 50 mM boritanu sodného pufrom, pH 10,5 a je okamžite neutralizovaná odohraním 0,9 ml frakciou do 0,1 ml 1M Tris/HCI pH 7. Materiál je potom dialyzovaný do PBS, 5 mM NaN3.
Príprava C3 nesúceho His - Tag
His - Tag je vlákno histidínových zvyškov, ktoré vykazuje afinitu pre kolóny nesúce ióny niklu. Táto metóda bola využitá pre izoláciu exprivovaných proteínov. Domnievali sme sa, že môže byť užitočná pre izoláciu exprivovaných mutantných C3 molekúl, a tak sme použili inzertnú mutagenézu pre vytvorenie plazmidu kódujúceho C3 s pripojenými 6 histidínovými zvyškami na karboxy konci (priamo na karboxy koniec k zvyšku 1663). Toto umiestnenie pre His - Tag bolo vybrané tak, aby minimalizovalo interferenciu so syntézou, skladaním, spracovaním a tvorbou disulfidových väzieb nascentnej C3. Zvyšok 1661 je cysteínový zvyšok, ktorý je zahrnutý v disulfidovej väzbe na zvyšok k sekvencii skoršej (pravdepodobne Cys 1537, Dolmer, K. a Sottrup - Jensen, L., 1993, FEBS-Lett. 315, 85 - 90), a preto sa zdá byť opatrné vykonať inzerciu za týmto štrukturálnym rysom. Mutácie boli zavedené použitím gapped plasmid techniky použitej v príklade 1, použitím syntetizovaného mutagénneho oligonukleotidu so sekvenciou: tgggtgcccaaccatcatcatcatcatcattgaccacacccc.
Inkorporácia korektnej sekvencie bola potvrdená DNA sekvenovaním. Táto DNA sekvencia môže teraz byť transferovaná do expresného vektoru. Po transfekcii eukaryotných buniek by malo byť možné izolovať exprivovaný C3 vďaka afinite pre kolónu nesúcu ióny niklu alebo akúkoľvek inú maticu so špecifickou afinitou pre His - Tag.
9.3 Výsledky
Množstvo mutantného C3 bolo purifikované na Clone - 3 - Sepharose, vrátane tých, ktoré sú popísané v príklade 1 a 2 a sú exprivované v CHO bunkách. Produkty si uchovávajú schopnosť podporovať štiepenie faktoru B faktorom D. Rovnaká metóda bola použitá na izoláciu mutantov popísaných v príklade B2, exprivovaných v COS bunkách. Farbenie striebrom SDS-PAGE gélov indikovalo, že izolované produkty neboli 100 % čisté, ale zvyčajne sa zdali byť viac ako alebo aspoň 50 % čisté. Toto vychádza z počiatočných materiálov obyčajne obsahujúcich menej ako 10 pg/ml C3 v 10 % (obj./obj.) fetálneho teľacieho séra plus iné celulárne proteíny. Naviac neboli C3 degradované v priebehu izolácie a aktivita endogénnych faktorov H a I sa zdala byť odstránená.
Purifikácia pomocou His - Tag vyžaduje miernejšie eluačné podmienky z kolón nesúcich ióny niklu. Napríklad sa použila EDTA. Aplikácia tejto metódy na C3 môže preto dovoliť izoláciu bez porušenia vnútornej tiolesterovej väzby.
Príklad 10
Konjugácia C3i protilátky a použitie k cielenej aktivite C3 konvertázy proti jednotlivým bunkám
10.1 Úvod
Jedným aspektom vynálezu je, že stabilné C3 konvertázy odvodené od mutantných C3 molekúl budú zvyšovať konverziu C3, ktorá, ak je lokalizovaná na určité cieľové miesto, naštartuje od komplementu závislý útok na tento cieľ. Uprednostňovaný prístup pre zacielenie odpovede je spojenie mutantnej C3 molekuly, buď C3i alebo C3b derivátu, s protilátkou špecifickou pre žiaduci cieľ. V tomto príklade demonštrujeme pracovnú metodológiu pre vytváranie takýchto konjugátov, ktorá je aplikovateľná na mutantný C3i alebo C3b molekuly a môže byť použitá na materiáli afinitne purifikovanom z expresného systému, keď bol tiolester C3 porušený pri spracovaní. Spojením C3i s protilátkou, ktorá sa špecificky viaže na ovčie erytrocyty, sme ďalej ukázali, že konjugát fixuje C3i na povrch erytrocytu tak, že môže byť formovaná konvertáza. C3iBbP, ktorá iniciuje lýziu týchto buniek, keď sú iné komponenty poskytnuté vo forme normálneho morčacieho séra (v EDTA kvôli zabráneniu de novo formácie C3 konvertázy). Preto môže byť konjugovaná protilátka použitá k zameraniu C3 molekuly pre iniciáciu komplement dependentného ataku jednotlivých typov buniek. Tento príklad využíva divoké formy C3i z ľudskej plazmy, ktorý formuje C3 konvertázu in vitro. In vivo je divoký typ C3i a C3b porušený faktormi H a I. Preto môže byť v tomto kontexte výhodné použitie mutantného C3, konštruovaného podľa plánu tohto patentu tak, aby bol rezistentný na faktory H a I, a preto vytváral stabilnú C3 konvertázu.
10.2. Metóda (i) Generovanie a purifikácia C3i - protilátka konjugátu
Použitou protilátkou bola IgG frakcia izolovaná od polyklonálneho králičieho anti-ovčí erytrocyt antiséra. 1,1 mg bolo inkubované so 75 nmól SPDP v konjugačnom pufre, pH 7,5 (20 mM KH2PO4, 60 mM Na2HPO4, 0,12 M NaCI) po 2 h. pri izbovej teplote. PDP-gG bol purifikovaný gelovou filtráciou na Superose - 6 kolóne (Pharmacia) (vo fosfátovom pufre, pH 7,4, obsahujúcom 0,5 M NaCI). Redukcia vzorky ditiotreitolom bola použitá na hodnotenie 4 PDP skupín pripojených na molekulu IgG. C3i bol pripravený ošetrením purifikovaného C3 0,1 M metylamínu, pH 7,2 (2 h. pri 37 °C). Prebytočný etylamín bol odstránený gelovou filtráciou nasledovanou dialýzou do konjugačného pufra. 18 nmól C31 bolo zmiešané s 1,7 nmól PDP-lgG v 1,26 ml konjugačného pufra a inkubované 1 deň pri izbovej teplote a potom 1,5 dňa pri 4 °C. Obrázok 8 ukazuje Coomassie Blue farbený SDS-PAGE gel konjugačnej reakčnej zmesi, vykazujúci prítomnosť druhu 0 približne 350 kDa, ktorý nebol prítomný ani v PDP-lgG, ani v C3i. Tento druh bol parciálne purifikovaný gelovou filtráciou na Superose - 6 kolóne vo fosfátovom pufre, pH
7,4, obsahujúcom 0,5 M NaCI, a potom dialyzovaný do PBS. Tento sa eluuje pred C3, v objeme, z ktorého môže byť hodnotená molekulárna hmotnosť 300 400 kDa kalibráciou s globulárnymi štandardami molekulárnej hmotnosti. Koncentrácia konjugátu, voľné protilátky a nenaviazaný C3 boli hodnotené z Coomassie - farbeného SDS-PAGE gélu (neredukujúce podmienky). Dvojdimenzionálny SDS-PAGE (prvá dimenzia neredukovaná, druhá dimenzia redukovaná) odhalil vzorky kompatibilné s 1 : 1 konjugátom medzi IgG a C3i.
(ii) Demonštrácia toho, že C3i - protilátka konjugát môže byť použitý na zameranie aktivity konvertázy proti jednotlivým bunkám.
μΙ rozpusteného konjugátu (0 (bez konjugátu), 1/100, 1/50, 1/10) bolo inkubovaných so 100 pl približne 1 % (obj./obj.) ovčích erytrocytov (vopred premytých v CFD) po 1 h. pri 37 °C. Paralelné inkubácie boli vykonané s ekvivalentným množstvom PDP-lgG (bez C3) a s C3 samotným. Bunky potom boli 4 krát premývané v CFD a resuspendované do 100 pi v CFD-G. 50 pl z nich bolo lyzované so 150 μΙ H2O, po ktorom nasledovalo pridanie 800 μΙ CFD obsahujúceho 10 mM EDTA 2 % (obj./obj.) NGPS. Ďalších 50 μΙ konjugátom potiahnutých buniek bolo inkubované po 15 min. pri 37 °C s 50 μΙ CFD-G obsahujúceho 190 μg/ml faktora B, 2 μg/ml faktora D, 20 μg/ml properdínu a 0,6 mM NÍCI2 a potom nasledovala lýzia 900 μΙ CFD obsahujúceho 10 mM EDTA a 2 % (obj./obj.) NGPS. Po 30 min. pri 37 °C boli bunky peletované centrifugáciou (2 000 x g, asi 3 min.) a merala sa optická absorbancia supernatantu pri 412 nm. Použitím H2O ošetrených vzoriek ako 100 % lýzie a čistého pufra bez buniek bolo kalkulované % lýzie, ako ukazuje obr. 9. Konjugát produkoval lýziu dependentnú od dávky, zatiaľ čo ani PDP-lgG ani C3i sám negeneroval žiadnu lýziu signifikantne vyššiu ako bola pozorovaná za absencie akéhokoľvek ošetrenia.
10.3 Súhrn výsledkov
Použitá metóda sa ukázala ako úspešná pre spojenie C3i s IgG ako je ukázané:
1. Formovaním prúžku vhodnej veľkosti (okolo 350 kDa) pre 1 : 1 C3 : IgG konjugát ukázaný SDS-PAGE na obr. 8.
2. Dvojdimenzionálnym SDS-PAGE (prvá dimenzia neredukovaná, druhá dimenzia redukovaná) indikujúcim, že tento druh obsahoval ako IgG, tak C3i.
3. Eluačná charakteristika tohto druhu na gelovej filtrácii je opäť konzistentná s molekulou okolo 350 kDa.
4. Konjugát vykazuje hemolytickú aktivitu, ktorá nie je vykazovaná ani PDPlgG, ani C3i (obr. 9).
Hemolytická skúška (obr. 9) ďalej demonštrovala, že:
1. Špecifická anti-ovčí erytrocyt protilátka lokalizovala C3i na membránu cieľovej bunky (ovčieho erytrocytu), a tak zabránila jeho odstráneniu premývaním (oproti voľnému C3i).
2. Konjugát udržiaval aktivitu C3i, v ktorej bol stále ešte schopný vytvárať C3 konvertázu reakciou s properdínom a faktormi B a D.
3. Táto konvertáza môže iniciovať komplement - dependentný atak na cieľ, v tomto prípade aktiváciou dráhy lýzie (C5-9) k lýzii erytrocytov.
Ďalšie dáta z iných laboratórií ukazujú, že faktor kobrieho jedu môže byť pripojený na protilátku a že tento konjugát môže namerať aktiváciu komplementu na jednotlivé typy buniek (Vogel, 1988, Targeted, Diagn. Ther.,
I, 191 - 224, Muller, B. a Muller - Ruchholtz, W., 1987, Leuk. Res., 11, 461 468, Parker, C. J., White, V. F. a Falk, R. J., 1986, Complement 3, 223 - 235, Petrella, E. C. et al., 1987, J. Immunol. Methods 104, 159 - 172). Tieto dáta podporujú tvrdenie, že C3 modifikovaný tak, že je schopný vytvárať stabilnú C3 konvertázu, ako faktor kobrieho jedu, môže byť použitý na zacielenie komplementom sprostredkovanej odpovede, ako sa zdôrazňuje v tomto vynáleze.
Príklad 11
Demonštrácia toho, že mutantné molekuly C3 indukujú obrat faktoru B v normálnom ľudskom sére
II. 1 Úvod
Hlavným účelom tu popísaného vynálezu je korizumpčná deplécia aktivity komplementu z biologických tekutín. Vynález popisuje metódy pre výrobu C3 molekúl, ktoré sú rezistentné na down-reguláciu faktormi Hal.lv tomto stave budú viazať faktor B a generovať aktívne C3 konvertázy. Aktivita týchto konvertáz je demonštrovaná hemolytickou skúškou využitou v príklade 6. Takáto konvertáza bude preto konzumovať C3. Ak je konvertáza nestabilná, bude disociovať bez veľkej C3 konverzie. Avšak dovolí väzbu čerstvého faktoru B a jeho konverziu ma Bb a Ba. Tak mutantný C3 začne konzumpciu faktoru B, vedúcu nakoniec k vyradeniu alternatívnej dráhy a znemožneniu amplifikácie stimulácie klasickou dráhou. Ak je vytvorená stabilná C3 konvertáza, bude obraz faktoru B redukovaný, ale konzumpcia C3 bude zvýšená. Obidve situácie môžu byť preto žiaduce. V tomto príklade demonštrujeme, že mutantné C3 molekuly, ktoré sú modifikované k rezistencii na faktor I, ale bez akejkoľvek modifikácie na ovplyvnenie stability konvertázy, začnú akcelerovaný obraz faktoru B v ľudskom sére. Oproti tomu divoký typ C3 nespôsobuje žiaden signifikantný obrat, pravdepodobne vďaka tomu, že divoký typ C3i je rýchlo degradovaný faktormi H a I.
11.2 Metóda
Pripravené mutanty sú nasledujúce:
Q1R2 Arg1303 zamenený za Gin (príklad 2)
Q1Q2 Arg 1303 zamenený za Gin, plus Arg 1320 zamenený za Gin (Príklad 1)
E1Q2 Arg 1303 zamenený za Glu, plus Arg 1320 zamenený za
Gin (príklad 5)
Tieto mutanty boli všetky exprivované v CHO bunkách a potom purifikované precipitáciou s Na2SO4, potom nasledovala afinitná purifikácia na
Clone - 3 - Sepharose, ako popisuje príklad B3. Divoký typ C3 (R1R2) bol izolovaný podobne. Podľa SDS-PAGE s farbením striebrom bola koncentrácia 01 medzi 1/5 a 1/25 divokého typu a koncentrácia Q1Q2 bola 1/5 divokého typu a koncentrácia E1Q2 bola medzi 1/25 a 1/125 divokého typu. Všetky preparáty pravdepodobne obsahovali väčšinu molekúl s rozrušeným tiolesterom (C3i).
pl týchto C3 preparátov bolo inkubované s 10 μΙ roztoku 20 % (obj./obj.) normálneho ľudského séra v PBS obsahujúcom 1 mM MgCl2 a približne 300 ng ”*23l-značeného faktoru B (približne 2 - 300 000 dpm) po 1 hodinu pri 37 °C. 5 μΙ bolo potom analyzované SDS-PAGE (redukčné podmienky). Sušený gel bol exponovaný na autorádiografickom filme kvôli indikácii pozície prúžkov korešpondujúcej s intaktným faktorom B a jeho produktmi štiepenia. Tieto potom boli excidované a starostlivo skúmané kvôli určeniu stupňa štiepenia. Hodnoty získané v pufre samotnom boli odčítané ako pozadie (zahrňujúc nielen pozadie štiepenia, ale tiež degradačné produkty a iné nečistoty prítomné v príprave rádioligandu).
11.3 Výsledky
Výsledné stupne štiepenia faktoru B sú ukázané nižšie:
1/25 Divoký typ 1,49 %
1/5 Divoký typ 2,74 %
Q1R1 6,19%
Q1Q2 7.41 %
E1Q2 6,42%
Podľa toho všetky faktor I rezistentné mutanty produkovali vyššie úrovne štiepenia faktoru B ako ekvivalentné množstvo divokého typu C3 (C3i). Pri vyšších dávkach alebo dlhšej inkubácii môže byť výsledkom kompletná inkapacitácia alternatívnej dráhy.
Skratky použité v predchádzajúcich príkladoch zahrňujú:
CFD - komplement fixačné rozpúšťadlo (definované Harrison a Lachmann, 1986, Handbook of Experimental Immunology, 4 th ed., Ed.s Weir, Herzenberg, Blackwell and Herzenberg, Blackwell, Oxford), CFD-G, CFD obsahujúci 0,1 % (hmot./obj.) želatínu, PBS fosfátový pufrovací salinický roztok, NGPS, normálne morčacie sérum, SDS-PAGE - SDS - polyakrylamid gelová elektroforéza, SPDP N - Succimidyl - 3 - (2-pyridylditio)propionát.
Odkazy:
ί.
.
.
.
.
.
7.
8.
.
Bergmann,M. & Fruton,J.S. (1941) Adv. Enzymol., 1:63-98 .
de Bruijn,M.H. & Fey,G.H. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:708-712
Crawford-MH et al. (1988) Circulation. 78:1449-58 Daha,M.R. & van Es,L.A. (1982) Immunol. 43:33-38. Farries,TC; Lachmann,PJ & Harrison,RA (1988)
Biochem. J. 252:47-54
Farries,TC; Lachmann,PJ & Harrison,RA (1988)
Biochem. J. 253:667-75
Forty,J; Hasan,R; Čary,N; White,DJ & Wallwork,J (1992) Transplant. Proc. 24:488-9
Fritzinger,D.C. et al. (1992) J. Immunol. 149:3554-3562
Harrison,R.A. & Lachmann, P. J. (1980) Mol. Immunol.
17:9-20.
Kalli,K.R., Hsu,P. & Fearon,D.T. (1994) Springer Semin. Immunopathol. 15:417-431.
Kinoshita,T; Takata,Y; Κοζοηο,Η; Takeda,J; Hong,KS & Inoue,K (1988) J. Immunol. 141:3895-901 McNearney,TA; Odeli,C; Holers,VM; Spear,PG; Atkinson,JP (1987) J. Exp. Med. 166:1525-35 Nicol,P.A.E. & Lachmann,P.J. (1973) Immunol.
24:259-275
Pangburn,MK & Muller-Eberhard,HJ (1984) Springer Semin. Immunopathol. 7:163-92
Rother,K. & Till,G.O. (eds) (1988) The complement System (Springer-Verlag Berlín Heidelberg, Germany) Van den Berg,C.W., Aerts,P.C. & Van Dijk,H. (1991) J. Immunol. Methods 136:287-294.
Vogel,CW; Smith,CA & Muller-Eberhard,HJ (1984) J. Immunol. 133:3235-41
18. Weisman,HF et al. (1990) Science 249:146-51.
19. Wu,R. (ed.) (1993) Methods Enzymol. 217: ch.s 12-14 (Academic Press, San Diego, U.S.A.)
20. 3otto,M, Fong,K.Y., So,A.K., Koch,C. & Walport,M.J. (1990) J. Exp. Med. 172:1011-7
21. Sambrook,J., Fritsch,E.F. & Maniatis,T. (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual second edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press)
22. Fishelson,Z.(1991) Mol. Immunol. 28:545-52.
23. Taniguchi-Sidle,A & Isenman,D.E. (1993) Mol. Immunol. 30:54.
24. Lambr i s,J.D. ,Avi 1 a,D. ,B e chere r,J.D. &
Muller,Eberhard,H.J. (1988) J. Biol. Chem.
263:12147-50.
25. Taniguchi-Sidle, A. and Isenmán, D.E. (1992) J. Biol. Chem. 267:635-643.
26. Hofer, B. and Kuhlein, B. (1993) Methods Enzymol. 217:173-189.
27. Morinaga, Y., Franceschini, T., Inouye, S. and Inouye, M. (1984) Bio-technology 2:636-639.
28. Harrison, R.A. and Lachmann, P.J. (1986) Handbook of Experimental Immunology (eds Weir, Herzenberg, Blackwell and Herzenberg;Blackwell, Oxford) 4thed.,
29. Kotwal, G., J., and Moss, B., Náture (1988) 335

Claims (27)

1. Proteín natívnej komplementovej dráhy modifikovaný tak, že tento proteín je schopný vytvárať stabilné C3 konvertázy.
2. Proteín podľa nároku 1, ktorý je modifikovaným ľudským proteínom.
3. Proteín podľa nároku 1 alebo nároku 2, ktorý je viac rezistentný na štiepenie faktorom I ako natívny proteín.
4. Proteín podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, ktorý je modifikovaný C3 proteínom.
5. Proteín podľa nároku 5, kde je proteín modifikovaný nahradením buď Arg1303, Arg-1320 alebo obidvoch, inou aminokyselinou.
6. Proteín podľa nároku 5, kde Arg-1303 alebo Arg-1320 alebo obidva sú nahradené glutamínom, tyrozínom, cystínom, tryptofánom, glutamovou kyselinou alebo glycínom.
7. Proteín podľa nároku 6, kde Arg-1320 je nahradený glutamínom.
8. Proteín podľa nároku 6 alebo 7, kde Arg-1303 je nahradený glutamovou kyselinou, glycínom alebo glutamínom.
9. Proteín podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, ktorý má redukovanú citlivosť na faktor H a/alebo faktor I vzhľadom k natívnej ľudskej C3 konvertáze, kde zmienený proteín má jednu alebo viacero aminokyselinových zmien vzhľadom k natívnej ľudskej C3 konvertáze v regióne korešpondujúcemu aminozvyškom 752 - 754 a/alebo zvyškom 758 - 780 natívnej ľudskej C3 konvertázy.
10. Proteín podľa nároku 9, kde jednou alebo viacerými aminokyselinovými zmenami sú zmeny z kyslých aminokyselinových zvyškov na neutrálne aminokyselinové zvyšky.
11. Proteín podľa nároku 9 alebo nároku 10, kde zmeny aminokyselinových zvyškov sú zmeny z Asp - Glu - Asp na Gly - Ser - Gly.
12. Proteín podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, ktorý má aminokyselinové zmeny vzhľadom k natívnej C3 konvertáze v aminokyselinových zvyškoch, korešpondujúcich zvyškom 1427, 1431 a/alebo 1433 natívnej ľudskej C3 konvertázy.
13. DNA sekvencie kódujúce proteín, ako je nárokovaný ktorýmkoľvek z nárokov 1 až 12.
14. DNA konštrukt (t.j. vektor) obsahujúci DNA sekvenciu ako je definovaná v nároku 13.
15. Proteín ako je definovaný ktorýmkoľvek z nárokov 1 až 12, pre použitie v terapii.
16. Konjugát obsahujúci proteín, ako je definovaný v ktoromkoľvek z nárokov 1 až 12, naviazaný na špecifickú väzobnú skupinu.
17. Konjugát podľa nároku 16, kde špecifickou väzobnou skupinou je špecifický väzobný proteín.
18. Konjugát podľa nároku 17, kde špecifickým väzobným proteínom je protilátka alebo jej antigén väzobný fragment.
19. Použitie proteínu, ako je definovaný ktorýmkoľvek z nárokov 1 až 12 alebo konjugátu, ako je definovaný ktorýmkoľvek z nárokov 16 až 18 na výrobu liekov pre použitie v deplécii hladín proteínov komplementovej dráhy.
20. Použitie podľa nároku 19, kde je liek použitý v prevencii rejekcie cudzorodého materiálu.
21. Použitie podľa nároku 19, kde je liek použitý pre lokalizáciu a/alebo amplifikáciu endogénnej konverzie proteínov komplementu a depozíciu v špecifickom mieste.
22. Farmaceutická formulácia zahrňujúca jeden alebo viacero proteínov, ako sú definované v ktoromkoľvek z nárokov 1 až 12 alebo konjugátov, ako sú definované v ktoromkoľvek z nárokov 16 až 18 dohromady s jedným alebo viacerými farmaceutický prijateľnými nosičmi alebo excipientmi.
23. Farmaceutická formulácia podľa nároku 22, pre použitie v deplécii hladín proteínov komplementovej dráhy.
24. Farmaceutická formulácia podľa nároku 23, pre použitie v prevencii rejekcie cudzorodého materiálu.
25. Farmaceutická formulácia podľa nároku 22, pre použitie v lokalizácii a/alebo amplifikácii endogénnej konverzie proteínov komplementu a depozícii v špecifickom mieste.
26. Spôsob redukcie proteínov komplementovej dráhy u cicavcov, ktorý zahrňuje podanie proteínu definovaného ktorýmkoľvek z nárokov 1 až 12 cicavcom.
27. Spôsob podľa nároku 25, kde proteín je podaný vo forme farmaceutickej formulácie podľa nároku 22.
SK296-97A 1994-09-08 1995-09-08 Modified human c3 proteins SK29697A3 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB9418147A GB9418147D0 (en) 1994-09-08 1994-09-08 Modified proteins
GBGB9509102.1A GB9509102D0 (en) 1995-05-04 1995-05-04 Modified proteins
PCT/GB1995/002121 WO1996007738A2 (en) 1994-09-08 1995-09-08 Modified human c3 proteins

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK29697A3 true SK29697A3 (en) 1998-01-14

Family

ID=26305590

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK296-97A SK29697A3 (en) 1994-09-08 1995-09-08 Modified human c3 proteins

Country Status (21)

Country Link
US (1) US5849297A (sk)
EP (1) EP0779922B1 (sk)
JP (1) JPH10505241A (sk)
CN (1) CN1104501C (sk)
AT (1) ATE273388T1 (sk)
AU (1) AU707004B2 (sk)
BG (1) BG63606B1 (sk)
BR (1) BR9509172A (sk)
CA (1) CA2197888A1 (sk)
CZ (1) CZ290596B6 (sk)
DE (1) DE69533359T2 (sk)
ES (1) ES2224133T3 (sk)
FI (1) FI970979A (sk)
HU (1) HUT77874A (sk)
NO (1) NO971059L (sk)
NZ (2) NZ333949A (sk)
PL (1) PL319040A1 (sk)
RO (1) RO117189B1 (sk)
RU (1) RU2194713C2 (sk)
SK (1) SK29697A3 (sk)
WO (1) WO1996007738A2 (sk)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HUP9900789A3 (en) 1996-03-07 2001-10-29 Imutran Ltd Down-regulation resistant c3 convertase
EP0972200A1 (en) * 1997-03-06 2000-01-19 Bion Diagnostic Sciences, Inc. Screening and treatment using complement regulator or receptor proteins
US6221621B1 (en) 1997-03-06 2001-04-24 Bard Diagnostic Sciences, Inc. Methods of screening for colorectal cancers in which a complement Factor I or related protein is associated
WO2001092295A2 (en) * 2000-05-30 2001-12-06 University Of Toronto Ligands for cd21 and compositions thereof for modulating immune responses
US6756476B2 (en) * 2001-04-30 2004-06-29 Syn X Pharma, Inc. Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 2021 daltons
US6998243B2 (en) * 2001-04-30 2006-02-14 Syn X Pharma, Inc. Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1793 daltons
US7314717B2 (en) * 2001-04-30 2008-01-01 Nanogen Inc. Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1562 daltons
US7294688B2 (en) * 2001-04-30 2007-11-13 Nanogen Inc. Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1348 daltons
US7179610B2 (en) * 2001-11-23 2007-02-20 Nanogen Inc. Complement C3 precursor biopolymer markers indicative of insulin resistance
US7097989B2 (en) * 2001-11-23 2006-08-29 Syn X Pharma, Inc. Complement C3 precursor biopolymer markers predictive of type II diabetes
WO2005107785A2 (en) * 2004-04-30 2005-11-17 University Of Hawaii Human complement c3 derivates with cobra venom factor-like function
US10206998B2 (en) 2005-01-12 2019-02-19 Proteonova, Inc. Modular targeted therapeutic agents and methods of making same
EP3431503A1 (en) * 2005-01-12 2019-01-23 Proteonova, Inc. Method for making targeted therapeutic agents
WO2010056399A1 (en) * 2008-11-17 2010-05-20 Incode Biopharmaceutics, Inc. Method and composition for modulating the immune system and various inflammatory conditions comprising complement depletors
RU2542401C1 (ru) * 2013-11-06 2015-02-20 Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Способ определения функциональной активности компонента с2 комплемента человека
RU2542404C1 (ru) * 2013-11-06 2015-02-20 Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Способ определения функциональной активности компонента с4 комплемента человека
US11903996B2 (en) * 2015-10-07 2024-02-20 David C. Fritzinger Modulators of complement function
CN113214373B (zh) * 2020-02-06 2022-08-30 深圳华大基因股份有限公司 新包虫病抗原Murinoglobulin-2蛋白
US11918624B2 (en) * 2020-06-10 2024-03-05 Kelsius Laboratories LLC Therapeutic composition for use in the treatment of COVID-19 and other cytokine storm associated disorders

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4661347A (en) * 1982-11-12 1987-04-28 Scripps Clinic Cytotoxic compositions

Also Published As

Publication number Publication date
FI970979A0 (fi) 1997-03-07
AU3477295A (en) 1996-03-27
BG101295A (en) 1997-12-30
AU707004B2 (en) 1999-07-01
CN1162335A (zh) 1997-10-15
NO971059L (no) 1997-05-07
FI970979A (fi) 1997-03-07
CN1104501C (zh) 2003-04-02
ATE273388T1 (de) 2004-08-15
WO1996007738A2 (en) 1996-03-14
ES2224133T3 (es) 2005-03-01
DE69533359T2 (de) 2005-07-28
RO117189B1 (ro) 2001-11-30
JPH10505241A (ja) 1998-05-26
BG63606B1 (bg) 2002-06-28
CA2197888A1 (en) 1996-03-14
CZ68597A3 (en) 1997-11-12
NZ333949A (en) 2000-06-23
DE69533359D1 (de) 2004-09-16
EP0779922B1 (en) 2004-08-11
PL319040A1 (en) 1997-07-21
HUT77874A (hu) 1998-09-28
MX9701783A (es) 1997-10-31
US5849297A (en) 1998-12-15
WO1996007738A3 (en) 1996-03-28
CZ290596B6 (cs) 2002-08-14
RU2194713C2 (ru) 2002-12-20
BR9509172A (pt) 1997-11-25
NZ292565A (en) 1999-03-29
NO971059D0 (no) 1997-03-07
EP0779922A2 (en) 1997-06-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5849297A (en) Modified human C3 proteins
JP4344136B2 (ja) アポリポタンパク質類似体
EP0912730B1 (en) Conjugates of soluble peptidic compounds with membrane-binding agents
US9540626B2 (en) Regulator of complement activation and uses thereof
KR20040026686A (ko) 종양 및 세포의 제거 또는 파괴를 필요로 하는 다른질환의 치료에 효과적인 펩티드
CN114099636A (zh) 使用来源于神经丝蛋白的肽治疗需要破坏或移除细胞的病症的方法
US6221657B1 (en) Modified human C3 DNA sequences and vectors
MXPA06012321A (es) Derivados c3 del complemento humano con funcion similar al factor de veneno de cobra.
US7002001B2 (en) Down-regulation resistant C3 convertase
EP2004680B1 (en) N-terminal vdac variants and uses thereof
RU2238322C2 (ru) Протеин, обладающий способностью к образованию с3-конвертазы, днк, вектор, конъюгат и их использование
MXPA97001783A (es) Proteinas c3 humanas modificadas
JP2002523097A (ja) 新規なヒトリゾチーム遺伝子、それによりコードされたポリペプチド、およびそれらの作製方法
JP2001521385A (ja) ヒト腫瘍関連膜タンパク質
JP2002502424A (ja) 亜鉛ｒｉｎｇタンパク質
WO2003080662A1 (en) Protein kinase c modulators, their aminoacid and nucleotide sequences and uses thereof
PT1335938E (pt) Construções de apolipoproteínas
IL194466A (en) Variants of the V-N terminal of VDAC and their use