KR20040026686A - 종양 및 세포의 제거 또는 파괴를 필요로 하는 다른질환의 치료에 효과적인 펩티드 - Google Patents

종양 및 세포의 제거 또는 파괴를 필요로 하는 다른질환의 치료에 효과적인 펩티드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 펩티드, 조성물, 및 단백질 (및 상기 단백질의 아미노산 서열로부터 유도된 펩티드), 신경 스레드 단백질 및 기타 관련 분자들로부터 유도된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 사용하는, 환자에게서 원하지 않거나 해로운 세포, 예를 들어 양성 및 악성 종양의 제거 또는 파괴를 필요로 하는 증상의 치료 방법에 관한 것이다.

Description

종양 및 세포의 제거 또는 파괴를 필요로 하는 다른 질환의 치료에 효과적인 펩티드{PEPTIDES EFFECTIVE IN THE TREATMENT OF TUMORS AND OTHER CONDITIONS REQUIRING THE REMOVAL OR DESTRUCTION OF CELLS}
본 출원은 2001년 7월 19일 출원된 "종양 및 세포의 제거 또는 파괴를 필요로 하는 다른 질환의 치료에 효과적인 단백질 및 펩티드"라는 제목의 미국 가특허 출원 제60/306,161호, 2001년 7월 19일 출원된 "종양 및 세포의 제거 또는 파괴를 필요로 하는 다른 질환의 치료에 효과적인 펩티드"라는 제목의 미국 가특허 출원 제60/306,150호 및 2001년 11월 16일 출원된 "종양 및 세포의 제거 또는 파괴를 필요로 하는 다른 질환의 치료에 효과적인 펩티드"라는 제목의 미국 가특허 출원 제60/331,477호에 대해 우선권을 주장하며, 본 출원에는 이들의 개시 전체가 본원에 인용됨으로써 삽입된다.
기술 분야
본 발명은 신경 스레드 단백질(neural thread protein)의 아미노산 서열의 일부에 해당하거나, 유사하거나 또는 동종성인 아미노산 서열을 함유하는 단백질 및 펩티드를 사용하여 세포 성분의 제거 또는 파괴를 필요로 하는 질환, 예를 들면 사람의 양성 또는 악성 종양을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 근육내, 경구, 정맥내, 경막내, 종양내, 비내, 국소, 경피 등으로 화합물을 단독으로 또는담체와 접합하여 투여하는 것을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 배경기술
많은 의학적 치료 및 과정의 본질은 해롭거나 원치 않는 조직의 제거 또는 파괴를 포함한다. 이러한 중요한 치료의 예는 암성 증식물의 외과적 제거, 화학요법을 통한 전이성 종양의 파괴 및 선 (예를 들면 전립선) 증식의 감소를 포함한다. 다른 예는 원하지 않는 얼굴 털의 제거, 사마귀의 제거, 피하 조직, 림프 조직 또는 지방 조직의 제거를 포함한다.
해롭거나 원하지 않는 세포 및 조직을 파괴하여 이들의 제거를 용이하게 하거나; 또는 이들이 더이상 성장하는 것을 억제하지만, 주로 국소적인 효과를 갖고 독성이 최소이거나 전신적이 아닌 효과적인 약제가 필요하다. 신경 스레드 단백질 및 그와 관련된 분자는 그 개시의 전체가 본원에 인용됨으로써 삽입되는 2002년 3월 8일에 출원된 계류중인 미국 특허 출원 제10/092,934호, "신경 스레드 단백질을 사용하여 종양 및 관련 질환을 치료하는 방법"에 개시된 바와 같이 그러한 약제의 일종이다. 신경 스레드 단백질의 아미노산 서열의 일부에 해당되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, AD7c-NTP 또한 그러한 약제이다. 이러한 펩티드는 그 개시의 전체가 본원에 인용됨으로써 삽입되는 2002년 5월 24일에 출원된 계류중인 미국 특허 출원 제10/153,334호, "종양 및 세포의 제거 또는 파괴를 필요로 하는 다른 질환의 치료에 효과적인 펩티드"에 개시되었다.
암은 조절되지 않는 세포의 성장 및 복제를 일으키는 세포의 내부 조절 기전에 있어서의 비정상적 상태이다. 정상 세포는 조직을 구성하고, 이 세포들이 특화, 조절, 조정된 단위로서 활동하는 능력을 상실할 때(역분화), 결함은 세포 집단 사이에 혼란을 초래한다. 이러한 상태가 발생하면, 종양이 형성된다.
조직의 양성 과다성장은 세포를 유기체로부터 제거하는 것이 바람직한 비정상 상태이다. 양성 종양은 몸 전체에 전이되지 않는 세포 증식이지만, 질환 증상을 일으킨다. 이러한 종양은 뇌와 같은 기관에서 접근할 수 없는 영역에 위치한다면 치명적일 수 있다. 양성 종양은 폐, 뇌, 피부, 뇌하수체, 갑상선, 부신 피질 및 수질, 난소, 자궁, 고환, 연결 조직, 근육, 장, 귀, 코, 인후, 편도, 입, 간, 담낭, 췌장, 전립선, 심장 및 기타 기관을 포함하는 많은 다른 기관에 존재한다.
암의 치료에 있어서는 외과 수술이 첫번째 단계인 경우가 많다. 외과 수술의 목적은 다양하다. 때로는 가능한 한 명백한 종양의 많은 양을 제거하기 위하여, 또는 적어도 종양을 "디벌크(debulk)" (종양의 주요 부피를 제거하여 다른 수단에 의한 치료를 필요로 하는 부분을 줄이는 것) 하기 위하여 사용된다. 암의 유형 및 위치에 따라, 외과 수술은 환자에게 약간의 증상적 완화를 제공할 수도 있다. 예를 들면, 외과의사가 팽창성 뇌 종양의 많은 부분을 제거할 수 있다면, 두개골 내의 압력이 감소하여, 환자의 증상을 개선시킬 수 있다.
모든 종양이 외과 수술될 수 있는 것은 아니다. 어떤 종양은 완전히 제거될 수 없는 신체 부분에 위치할 수도 있다. 이러한 종양의 예는 뇌간 (호흡을 조절하는 뇌의 부분)의 종양 또는 주요 혈관 내부 및 주위에서 성장하는 종양일 것이다. 이러한 경우, 외과수술의 역할은 종양 제거와 관련된 높은 위험으로 인해 제한된다.
어떤 경우에는, 종양을 디벌크하기 위해 외과수술을 사용하지 않는데, 그 이유는 그럴 필요가 없기 때문이다. 호지킨 림프종이 그 예인데, 이는 화학요법 및 방사선 요법의 조합에 매우 잘 반응하는 림프절의 암이다. 호지킨 림프종에서는 치료를 위하여 외과수술이 거의 필요하지 않지만, 진단을 확정하기 위하여 거의 항상 사용된다.
화학요법은 암 치료의 또다른 통상적 형태로서, 몸 전체에서 급속히 분열하는 세포(종양에서 발견되는 것과 같은 세포)를 특이적으로 공격하는 의약(보통 경구 또는 주사로 투여)의 사용을 포함한다. 이는 화학요법이 이미 전이된 암, 및 혈액 및 림프계를 통해 퍼질 가능성이 높지만 일차 종양 이외에는 명확하지 않은 종양을 치료하는데 유용하게 되도록 한다. 화학요법은 또한 국소 종양의 외과수술 및 방사선 요법에 대한 반응성을 증가시키기 위하여 사용될 수도 있다. 이는 예를 들어 머리 및 목의 암에 대한 경우이다.
불행히도, 정상적으로 급속히 분열하는 인간의 몸의 다른 세포(예를 들면 위벽 및 머리카락)는 화학요법에 의해 영향을 받을 수 있다. 이러한 이유로, 다수의 화학요법제는 구역, 구토, 빈혈, 머리카락의 손실 또는 다른 증상을 일으킨다. 이러한 부작용들은 일시적이고, 이러한 부작용의 많은 부분을 완화시키는데 도움을 줄 수 있는 의약들이 존재한다. 우리의 지식이 커짐에 따라, 연구자들은 암세포를 더 잘 죽일 뿐만 아니라 환자에게 부작용이 더 적은 더 새로운 화학요법제를 고안하였다.
화학요법은 여러가지 방법으로 환자에게 투여된다. 어떤 것은 알약이고, 어떤 것은 정맥주사 또는 다른 주입에 의해로 투여된다. 주가사능한 화학요법을 위해서, 환자는 치료를 위해 의사의 사무실 또는 병원을 방문한다. 다른 화학요법제는 혈류 내로 하루에 24 시간 연속 주입을 필요로 한다. 이런 유형의 화학요법제를 위하여, 환자에게 장착되는 작은 펌프를 이식하기 위하여 가벼운 외과적 수술이 수행된다. 그러면 펌프는 천천히 의약을 투여한다. 많은 경우, 환자의 정맥에 영구 포트를 위치시켜서 반복적으로 바늘을 꽂을 필요를 없앤다.
방사선 요법은 암과 싸우는데 있어서 통상적으로 사용되는 또다른 무기이다. 방사선은 종양 세포 내의 DNA를 손상시킴으로써 암세포를 죽인다. 방사선은 다양한 방법으로 투여되는데, 이중 가장 통상적인 방법은 매우 정확한 방법으로 종양에 초점을 맞추어 방사선을 환자에게 조사하는 것을 포함한다. 이를 위하여, 환자는 테이블 위에 눕고 광선이 환자 주위를 움직인다. 이는 단 몇 분밖에 안 걸리지만, 처방된 특정 총 "용량"을 달성하기 위하여 (종양의 유형에 따라) 수주 동안 매일 시행될 수 있다.
때대로 사용되고, 근접 치료라고 불리는 다른 방사선 방법은 방사활성 펠렛 ("시드") 또는 와이어를 사용하여 체내의 종양의 부위에 이식하는 것을 포함한다. 이식은 일시적 또는 영구적일 수 있다. 영구 이식에 있어서는, 시드 중의 방사선은 수 일 또는 수 주의 기간에 걸쳐 붕괴되어 환자가 방사성을 띠지 않게 된다. 일시적 이식에 있어서는, 방사선의 전체 용량은 보통 약 수 일 동안 전달되고, 환자는 그 시간 동안 병원에 있어야 한다. 두 가지 유형의 근접치료 모두에 있어서, 방사선은 일반적으로 매우 표적화된 부위로 전달되고 암에 대해 국소적으로 제어하게 된다 (화학요법에서와 같이 몸 전체에 처치하는 것과는 반대임).
매우 선별적인 환자들은 골수 이식을 받을 수 있다. 이 과정은 보통 환자가 특히 침습적인 암에 걸렸거나 또는 통상적인 치료로 치료된 후 암이 재발한 경우에 수행된다. 골수 이식은 복잡한 과정이다. 여러 종류가 있고, 부작용을 일으키거나 치료될 가능성이 다르다. 대부분의 이식은 특별 기관에서 수행되고 많은 경우 이들의 용도는 연구용으로 생각된다.
추가적 요법들이 있긴 하지만 이들은 대부분 아직 임상 시험에서 연구 중에 있고 아직 표준 치료법으로 되지 않았다. 그 예는 면역요법, 모노클로날 항체, 항-혈관생성 인자 및 유전자 요법의 사용을 포함한다.
면역요법: 방사선 또는 화학요법과 별도로, 다양한 기술이 환자 자신의 면역계가 암과 싸우는 것을 돕기 위하여 고안되었다. 목적을 달성하기 위하여, 연구자들은 환자에게 특별히 유도된 백신을 주사하는 경우가 종종 있다. 모노클로날 항체: 이들은 암세포 및 비-암세포 사이의 세포의 항원 및(또는)다른 성질에서의 차이점을 이용하여 암 세포에 부착되도록 (정상 세포에는 부착되지 않음) 특별히 고안된 항체이다. 항체는 그 단독으로, 또는 암세포를 선택적으로 표적화하여 원하는 세포에 독성 약제 또는 방사성을 전달하도록 다양한 세포독성 화합물 부착시키거나 또는 방사성 형태로서 환자에게 투여될 수 있다.
항-혈관생성 인자: 암세포가 급속하게 분열하고 종양이 성장함에 따라, 이들은 곧 혈관 공급을 능가할 수 있다. 이를 보상하기 위하여, 어떤 종양은 그 근처의 혈관 성장의 유도를 돕는 것으로 여겨지는 물질을 분비함으로써 암세포가 영양분을 공급받을 수 있도록 한다. 암에 대한 혈관 성장을 멈추도록 실험적인 치료가 고안되고 있다.
유전자 치료: 암은 종국적으로 암 세포의 생산 및 그의 과다 증식으로 유도하는 일련의 돌연변이의 생성물이다. 암은 암의 증식을 저지하거나 멈추는 작용을 하거나, 세포의 프로그램된 세포 기전을 작동시켜서 세포를 파괴하거나, 세포의 면역 인식을 증강시키거나, 독성 대사물질 또는 종양 성장을 억제하는 사이토카인으로 전환하는 프로드럭을 발현할 유전자를 암세포에 도입함으로써 치료될 수 있다.
양성 종양 및 기형은 외과수술, 방사선요법, 약물 요법, 열 또는 전기 제거, 한랭요법 등을 포함하는 다양한 방법에 의해 치료할 수 있다. 양성 종양은 전이되지 않으나, 이들은 크게 성장할 수 있고 재발할 수 있다. 양성 종양의 외과적 적출술에는 일반적 외과수술에서의 모든 어려움 및 부작용이 존재하고, 몇몇 양성 종양, 예를 들면, 뇌하수체 선종, 뇌의 수막종, 전립선 증식 등에 대해서는 반복적으로 수행되어야 하는 경우가 많다.
선택적 세포 제거가 바람직한 원하지 않는 세포 성분을 포함하는 다른 질환들이 여전히 존재한다. 예를 들면, 심장 질환 및 졸중을 통상적으로 혈관벽을 변형시키고, 관강을 좁히고, 혈류를 제한하고, 국소 혈병이 생기게 하기 쉽고, 궁극적으로 폐색 및 경색에 이르게 하는 죽상경화증, 즉, 지방섬유 및 변형된 평활근 성분의 증식성 병변에 기인한다. 죽상경화증에 대한 치료는 우회로 이식술; 인공 이식술; 재소통, 소파술, 방사선, 레이저 또는 다른 제거와 함께 혈관성형술; 지질 저하를 통해 죽상경화증을 억제하기 위한 약물요법; 항-응고 요법; 및 음식, 운동및 생활습관의 일반적 조치를 포함한다. 외과적 수술의 위험 및 부작용이 없는 죽상경화 병변을 제거하기 위한 방법이 필요하다.
선택적 세포 제거가 바람직한 원하지 않는 세포 성분의 다른 예는 사마귀와 같은 바이러스에 의해 유도된 성장을 포함한다. 다른 예는 면역 질환에서 발견되는 비후성 염증성 종괴, 및 비후성 반흔 또는 켈로이드이다. 다른 예는 원하지 않는 털, 예를 들면 얼굴 털의 제거와 같은 미용 분야에서 발견되거나, 또는 예를 들면 얼굴 진피 및 연골 조직에서 또는 사지의 진피 및 연결 조직에서와 같이 미용 목적으로 원하지 않는 조직 영역의 축소를 위한 것이다.
또다른 예는 당업자에게 명백할 것이다. 이 예들의 모두 또는 대부분에서, 통상적 요법의 위험 및 부작용 없이 원하지 않는 세포 성분을 제거 또는 파괴하고 더욱 정확하게 원하지 않는 세포 성분을 제거할 필요성이 존재한다.
신경 스레드 단백질 (NPT)은 최근 확인된 뇌 단백질의 일군이다. 이 군에 속하는 한 단백질인 AD7c-NTP는 신경돌기 발아와 관련된 기능을 갖는 ∼41 kD의 막 결합 인단백질이다 (de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100: 3093-3104 (1997); de la Monte et al., Alz.. Rep., 2:327-332 (1999); de la Monte SM and Wands JR, Journal of Alzheimer's Disease, 3:345-353 (2001)). AD7c-NTP를 코딩하는 유전자 및 AD7c-NTP에 대해 예측된 단백질 서열은 문헌 [de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100 : 3093-3104 (1997)]에서 확인되고 기재되어 있다. ∼41 kD 종 이외에, 다른 종의 신경 스레드 단백질 (∼26 kD, ∼21 kD, ∼17 kD, 및 ∼15 kD)이 확인되었고 신경외배엽 종양, 성상세포종, 및 교모세포종과, 또한 저산소증, 허혈 또는 대뇌 경색으로 인한 손상과 관련된다 (Xu et al., Cancer Research, 53:3823-3829 (1993); de la Monte et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55(10): 1038-50 (1996), de la Monte et al., J. Neurol.Sci., 138(1-2): 26-35 (1996); de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 135(2): 118-25 (1996); de la Monte et al., J. Clial. Invest., 100:3093-3104 (1997); and de la Monte et al., Alz.. Rep., 2:327-332 (1999)).
신경 스레드 단백질의 종은 미국 특허 5,948,634호, 5,948,888호 및 5,830,670호에 모두 "신경 스레드 단백질 유전자 발현 및 알츠하이머병의 검출"에 대해, 또한 미국 특허 6,071,705호에 "신경 질환 또는 기능장애를 검출하는 방법"에 대해 청구되고 기재되어 있다. 이 특허의 개시는 그 전체가 본원에 인용됨으로써 삽입된다. 거기에 기재되어 있는 바와 같이, NTP는 세포 사멸 동안 상향조절되고 생산된다. 따라서, 죽었거나 죽어가는 신경 세포는 NTP를 과잉생산하는 것으로 기재되고, 따라서, 그의 존재는 신경 세포의 사멸 및 알츠하이머병 (AD)의 발병을 나타낸다.
신경 스레드 단백질의 다른 종은 AD7c-NTP 유전자의 다른 산물 (예를 들면, NCBI 엔트레즈 (Entrez)-단백질 데이타베이스 수탁 번호 #XP_032307 PID g15928971에 기재된 112 개의 아미노산 단백질)로서 또는 신경 스레드 단백질 (예를 들면, NCBI 엔트레즈-단백질 데이타베이스 수탁 번호 #AAH14951 PID g15928971에 기재된 106 개의 아미노산 단백질, NCBI 엔트레즈-단백질 데이타베이스 수탁 번호 #XP_039102 PID g18599339에 기재된 106 개의 아미노산 단백질 및 NCBI 엔트레즈-단백질 데이타베이스 수탁 번호 #AAH02534 PID g12803421에 기재된 61 개의 아미노산 단백질)과 유사한 것으로서 확인되었다.
신경 스레드 단백질은 AD와 관련이 있고, NTP는 AD에서 세포 사멸과 관계되어 상향조절된다. AD7c-NTP mRNA는 AD 뇌에서 대조군에 비하여 상향조절되고; 뇌 및 CSF에서의 AD7c-NTP 단백질 수준은 대조군에서보다 AD에서 더 높고; AD7c-NTP 면역 반응성은 노인성 반점, 신경섬유 농축제 (NFT), AD 및 다운증후군 뇌의 퇴화 뉴론, 신경망 스레드, 및 이영양성 신경돌기 발아에서 발견된다 (Ozturk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:419-423 (1989); de la Monte et al., J. Clin. Invest., 86(3):1004-13 (1990); de la Monte et al., J.Neurol. Sci., 113(2):152-64 (1992); de la Monte et al., Ann. Neurol., 32(6):733-42 (1992); de la Monte et al., J. Neuropathol. Exp. Neuro., 55(10):1038-50 (1996), de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 138(1-2):26-35 (1996); de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 135(2):118-25 (1996); de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100:3093-3104 (1997); and de la Monte et al., Alz.. Rep., 2:327-332 (1999)). NTP는 세포 내에, 신경망 내의 미세 과정에 위치하거나, 또는 AD 및 다운증후군 뇌에서 세포 밖에 위치한다 (de la Monte et al., Ann. Neurol., 32(6):733-42 (1992)).
AD7c-NTP 단백질의 상승된 수준은 AD 환자의 CSF 및 요에서 발견되었다 (de la Monte and Wands, Front Biosci 7:989-96 (2002); de la Monte and Wands, Journal of Alzheimer's Disease 3:345-353 (2001); Munzar et al, Alzheimer'sReports 4: 61-65 (2001); Kahle et al, Neurology 54:1498-1504 (2000) and Averback Neurology 55:1068 (2000); Munzar et al, Alzheimer Reports 3:155-159 (2000); de la Monte et al, Alzheimer's Reports 2:327-332 (1999); Ghanbari et al, J Clin Lab Anal 12:285-288 (1998); Ghanbari et al, J Clin Lab Anal 12: 223-226 (1998); Ghanbari et al, Journal of Contemporary Neurology 1998;4A: 2-6 (1998); and de la Monte et al, J Clin Invest 100:3093-3104 (1997)).
NTP의 과다 발현은 알츠하이머 병에서 세포 사멸의 과정과 연관되었다 (de la Monte and Wands, J. Neuropatho. and Exp. Neuro. 60:195-207 (2001); de la Monte and Wands, Cell Mol Life Sci 58:844-49 (2001)). AD7c-NTP는 다운증후군 뇌 조직에서도 확인되었다 (Wands et al., 국제 특허 공개 WO 90/06993; de la Monte et al, J Neurol Sci 135:118-25 (1996); de la Monte et al., Alz.. Rep., 2:327-332 (1999)). 어떤 증거는 NTP의 과다 발현이 정상 안압 녹내장과도 관련될 수 있다는 것을 제시한다 (Golubnitschaja-Labudova et al, Curr Eye Res 21:867-76 (2000)).
NTP는 교종 및 신경모세포종 세포 배양에서 시험관내에서 및 정상 설치류 근육 조직, 피하 연결 조직, 및 진피에서, 및 유방암, 피부암 및 유두종, 결장암, 뇌의 교종을 포함하는 다양하고 상이한 인간 및 비-인간 기원 종양, 및 다른 설치류 모델에서 생체내에서 모두 세포 사멸을 유발하기 위하여 효과적인 물질임이 입증되었다. 그 개시의 전체가 본원에 인용됨으로 삽입되는 2002년 3월 8일 출원된 계류중인 미국 특허 출원 제 10/092,934호, "신경 스레드 단백질을 사용하는 종양 및관련 질환의 치료 방법"을 참조하시오.
관련 기술의 상기 기재를 포함하여 이 기재 전체에서, 모든 미국 특허를 포함하여 본원에 기재된 모든 공개적으로 입수가능한 문헌은 본원에 인용됨으로써 그 전체가 삽입된다. 상기 관련 기술은 어떠한 방식으로든 계류 중인 미국 특허 출원을 포함하여 거기에 기재된 문헌의 모두가 본 발명의 선행 기술임을 인정하는 의도로 기재된 것은 아니다.
당업계에는 원하지 않는 세포 요소를 치료하기 위한 신규하고 독성이 적은 치료에 대한 수요가 존재한다. 본 발명은 이러한 수요를 만족시킨다.
발명의 요약
본 발명은 일면에서는 본 발명자들이 해롭거나 원하지 않는 세포의 파괴 또는 제거를 위한 효과적인 약제를 발견한 AD7c-NTP에 포함된 펩티드 서열, 이의 변이체 및 동족체가 인간 및 다른 포유동물을 포함하는 다른 유기체 중의 다른 단백질 중에서도 발견되었다는 발견에 관한 것이다. 펩티드 서열이 발견되었다면, 널리 이용가능한 공공의 및 상업적인 단백질 데이타베이스, 예를 들어, 국립 중앙 생물공학 정보의 단백질 데이타베이스 및 검색 프로그램, 예를 들어, 블라스트(등록상표)(Basic Local Alignment Search Tool)을 이용하여 당업자는 이들 단백질을 찾을 수 있다. 문헌[Altschul, Stephen F. , Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein databasesearch programs", Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402]을 참고하라.
이어서 당업자는 해롭거나 원하지 않는 세포의 파괴 또는 제거를 위한 약제로서의 효과를 측정하게 위해 본원에 기재된 분석 방법을 이용하여 이들 단백질을 스크리닝할 수 있다. 당업자는 하나 이상의 이러한 효과적인 약제를 발견하면, 이어서 이들 약제 중 어떤 부분이 본원에 기술되거나 2002년 5월 24일 출원되어 계류중인 미국 특허 일련번호 제10/153,334호, "종양 및 세포의 제거 또는 파괴를 필요로 하는 다른 질환의 치료에 효과적인 펩티드"에 개시된 AD7c-NTP 펩티드와 동종성이거나 유사한 서열을 포함하는지를 측정하고, 약제의 부분을 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 합성하고, 해롭거나 원치않는 세포의 파괴 또는 제거를 위한 약제로서의 효과에 대해 합성 약제를 테스트할 수 있다. 나아가 당업자는 본원에 기술되거나 2002년 5월 24일 출원되어 계류중인 미국 특허 일련번호 제10/153,334호, "종양 및 세포의 제거 또는 파괴를 필요로 하는 다른 질환의 치료에 효과적인 펩티드"에 개시된 AD7c-NTP 펩티드와 동종성이 아니거나 유사하지 않은 다른 펩티드 서열을 측정하는 것으로 알려진 이러한 임의의 단백질의 아미노산 서열을 이용할 수 있다. 이어서, 이러한 새로운 합성 서열은 해롭거나 원치않는 세포의 파괴 또는 제거를 위한 약제로서의 효과에 대해 테스트될 수 있다.
본 발명은 원치않는 세포다산성, 예를 들어, 양성 및 악성 종양, 선(예를 들면 전립선), 원하지 않는 얼굴 털, 사마귀, 피하 조직을 치료하는 펩티드, 조성물 및 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 세포 사망을 유발하는데 효과적인 약제로 알려진 관련 단백질, 관련 펩티드, NTP 펩티드의 치료유효량을 이를 필요로 하는동물에 투여하는 것을 포함한다. "관련 단백질", "관련 펩티드" 및 "NTP 펩티드"라는 용어는 하기에 정의된다.
본 발명의 펩티드는 일종의 신경 스레드 단백질의 아미노산 서열에 해당하는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 조성물은 펩티드 및 제약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 본 발명의 펩티드 또는 단백질("세포 사망 펩티드")는 단독으로 또는 담체 또는 항체에 컨쥬게이션될 수 있고, 조성물로 제제화될 수 있다. 세포 사망 펩티드는 근육내, 경구, 정맥내, 복강내, 뇌내 (실질내), 뇌실내, 종양내, 병변내, 진피내, 경막내, 비내, 안내, 동맥내, 국소, 경피로, 에어로졸을 통해, 주입, 일시 주사, 이식 장치, 지연 방출 시스템 등을 통해, 단독으로 또는 담체와 컨쥬게이션하여 투여될 수 있다. 별법으로, 세포 사망 펩티드는 유전자 변형 또는 다른 방법으로 인해, 펩티드를 발현하는 유전자를 투여하거나, 이러한 생산을 유도하는 백신을 투여하거나 또는 생체내에서 펩티드를 발현하는 세포, 박테리아 또는 바이러스를 도입함으로써 생체내에서 발현될 수 있다.
또한, 세포 사망 펩티드는 양성 및 악성 종양 및 다른 원하지 않거나 해로운 세포 성장을 치료하기 위한 다른 요법과 결합하여 사용될 수 있다. 상기 일반적 기재 및 하기 상세한 설명 모두는 예시적 및 설명적이고, 청구된 발명을 더 설명하기 위한 것이다. 다른 목적, 이점, 및 신규한 특징은 하기 발명의 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1: AD7c-NTP 유전자 및 그 유전자의 AD7c-NTP 단백질 생성물의 완전한 아미노산 서열 및 핵산서열을 나타낸다 (미국 특허 제5,830,670호, 제5,948,634호 및 제5,948,888호의 서열 120 및 121; de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100:3093-3104 (1997); NCBI 엔트레즈-단백질 수탁 번호 #AAC08737; PID g3002527) [SEQ ID NO.(서열 번호) 1].
도 2: 122 개의 아미노산의 신경 스레드 단백질의 완전한 아미노산 서열을 나타낸다 (미국 특허 제5,830,670호, 제5,948,634호, 및 제5,948,888호의 서열 40; NCBI 엔트레즈-단백질 수탁 번호 #AAE25447 PID g10048540) [SEQ ID NO. 2]("NTP-122").
도 3: 112 개의 아미노산의 신경 스레드 단백질의 완전한 아미노산 서열을 나타낸다 (NCBI 엔트레즈-단백질 수탁 번호 #XP_032307 PID g15928971) [SEQ ID NO. 3]("NTP-112").
도 4: 106 개의 아미노산의 신경 스레드 단백질-유사 단백질의 완전한 아미노산 서열을 나타낸다 (NCBI 엔트레즈-단백질 수탁 번호 #AAH14951 PID g15928971) [SEQ ID NO.4]("NTP-106A").
도 5: 106 개의 아미노산의 신경 스레드 단백질-유사 단백질의 완전한 아미노산 서열을 나타낸다 (NCBI 엔트레즈-단백질 수탁 번호 #XP_039102 PID g18599339) [SEQ ID NO. 5]("NTP-106B").
도 6: 98 개의 아미노산의 신경 스레드 단백질의 완전한 아마노산 서열을 나타낸다 (미국 특허 제5,830,670호, 제5,948,634호, 및 제5,948,888호의 서열 30; NCBI 엔트레즈-단백질 수탁 번호 #AAE25445, PID g10048538) [SEQ ID NO. 6]("NTP-98").
도 7: 75 개의 아미노산의 신경 스레드 단백질의 완전한 아미노산 서열을 나타낸다 (미국 특허 제5,830,670호, 제5,948,634호, 및 제5,948,888호의 서열 48; NCBI 엔트레즈-단백질 수탁 번호 #AAE25448, PID g10048541) [SEQ ID NO. 7]("NTP-75").
도 8: 68 개의 아미노산의 신경 스레드 단백질의 완전한 아미노산 서열을 나타낸다 (미국 특허 제5,830,670호, 제5,948,634호, 및 제5,948,888호의 서열 36; NCBI 엔트레즈-단백질 수탁 번호 #AAE25446, PID g10048539) [SEQ ID NO. 8]("NTP-66").
도 9: 61 개의 아미노산의 신경 스레드 단백질-유사 단백질의 완전한 아미노산 서열을 나타낸다 (NCBI 엔트레즈-단백질 수탁 번호 #AAH02534, PID g12803421) [SEQ ID NO. 9]("NTP-61").
바람직한 실시태양의 상세한 설명
본원에서 사용되는 용어 및 어구는 달리 지시가 없는 한 하기와 같이 정의된다.
"AD7c-NTP"라는 용어는 문헌 [de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100:3093-104 (1997)], 미국 특허 제5,948,634호, 제5,948,888호, 및 제5,830,670호의 서열 120 및 121, 및 진뱅크(GenBank) #AF010144에 기재된 ∼41kD의 단백질 및 그를 코딩하는 유전자 및 핵산 서열을 지칭하고, 그에 대한 핵산 및 아미노산서열은 도 1에 기재된다. "AD7c-NTP"라는 용어는 또한 AD7c-NTP의 생물학적 활성 단편, 변이체, 유도체, 상동체 및 모방체 (mimetic)를 포함한다.
"NTP" 또는 "신경 스레드 단백질"이라는 용어는 신경 스레드 단백질 및 관련 분자 (췌장 스레드 단백질을 포함) 및 상기 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 지칭하고, 하기 단백질 및 이 단백질에 대한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다 (그러나, 이에 한정되지는 않는다):
(a) AD7C-NTP;
(b) 미국 특허 제5,948,634호, 제5,948,888호, 제5,830,670호, 및 제6,071,705호 및 문헌 [de la Monte et al., Neuropathol. Exp. Neurol., 55(10):1038-50 (1996), de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 138(1-2):26-35 (1996); de la Monte et al., J. Neurol.Sci., 135(2):118-25 (1996), de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100:3093-3104 (1997) and de la Monte et al., Alz.. Rep., 2:327-332 (1999)]에 기재된 ∼42, ∼26, ∼21, ∼17, ∼14, 및 ∼8 kD 종의 신경 스레드 단백질;
(c) 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션, 마나사스(Manassas), Va.에 수탁 번호 HB-12546으로 기탁된 모노클로날 항체 #2 또는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션, 마나사스, Va.에 수탁 번호 HB-12545로 기탁되어 있는 모노클로날 항체 #5에 의해 특이적으로 인식되는 단백질;
(d) AD7C-NTP 유전자에 의해 코딩되는 단백질;
(e) 미국 특허 제5,830,670호, 제5,948,634호, 및 제5,948,888호의 서열 40및 NCBI 엔트레즈-단백질 수탁 번호 #AAE25447, PID g10048540에 기재된 122 개의 아미노산 신경 스레드 단백질 (그에 대한 아미노산 서열은 도 2("NTP-122")에 기재되어 있다);
(f) NCBI 엔트레즈-단백질 수탁 번호 #XP_032307, PID g14725132에 기재되어 있는 112 개의 아미노산의 신경 스레드 단백질 (그에 대한 아미노산 서열은 도 3("NTP-112")에 기재되어 있다);
(g) NCBI 엔트레즈-단백질 수탁 번호 #AAH14951 PID g15928971에 기재된 106 개의 아미노산의 신경 스레드 단백질-유사 단백질 (그에 대한 아미노산 서열은 도 4("NTP-106A")에 기재되어 있다);
(h) NCBI 엔트레즈-단백질 수탁 번호 #XP_039102, PID g18599339에 기재되어 있는 106 개의 아미노산의 신경 스레드 단백질 유사 단백질 (그에 대한 아미노산 서열은 도 5("NTP-106B")에 기재되어 있다);
(i) 미국 특허 제5,830,670호, 제5,948,634호, 및 제5,948,888호의 서열 30 및 NCBI 엔트레즈-단백질 수탁 번호 #AAE25445, PID g10048538에 기재되어 있는 98 개의 아미노산의 신경 스레드 단백질 (그에 대한 아미노산 서열은 도 6("NTP-98")에 기재되어 있다);
(j) 미국 특허 제5,830,670호, 제5,948,634호, 및 제5,948,888호의 서열 48 및 NCBI 엔트레즈-단백질 수탁 번호 #AAE25448, PID g10048541에 기재되어 있는 75 개의 아미노산의 신경 스레드 단백질 (그에 대한 아미노산 서열은 도 7("NTP-75")에 기재되어 있다);
(k) 미국 특허 제5,830,670호, 제5,948,634호, 및 제5,948,888호의 서열 36 및 NCBI 엔트레즈-단백질 수탁 번호 #AAE25446, PID g10048539에 기재되어 있는 68개의 아미노산의 신경 스레드 단백질 (그에 대한 아미노산 서열은 도 8("NTP-68")에 기재되어 있다);
(l) NCBI 엔트레즈-단백질 수탁 번호 #AAH02534, PID g12803421에 기재되어 있는 61개의 아미노산의 신경 스레드 단백질-유사 단백질 (그에 대한 아미노산 서열은 도 9("NTP-61")에 기재되어 있다);
(m) 췌장 스레드 단백질;
(n) 미국 특허 제6,071,705호에 기재된 중성 췌장 스레드 단백질 (nPTP); 및
(o) 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection)에 기탁된 HB 9934, HB 9935 및 HB 9936으로 구성된 군으로부터의 하이브리도마에 의해 생성된 항체에 의해 특이적으로 인식되는 단백질.
"NTP 펩티드"라는 표현은 NTP의 아미노산 서열의 일부 이상 또는 NTP의 단편에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 말하며, 본문에서 달리 지시하지 않는 한, 그러한 펩티드의 상동체, 유도체, 변이체, 융합 단백질 및 펩티드 모방체를 포함한다. "NTP 펩티드"라는 표현은 미국 특허출원 일련번호 10/092,934 및 10/153334에 구체적으로 나열된 펩티드를 또한 포함한다 (그러나 이로 한정되는 것은 아님). "NTP 펩티드"라는 용어는 바람직하게는 다음과 같은 NTP의 아미노산 서열을 또한 포함하며 (그러나 이로 한정되는 것은 아님),
(a)NTP 펩티드 #1: [SEQ ID NO. 10], AD7c-NTP p239-243
SSWDY
Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr
b)NTP 펩티드 #2[SEQ ID NO. 11], AD7c-NTP p31-39
PASASPVAG
Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Pro-Val-Ala-Gly
c)NTP 펩티드 #3[SEQ ID NO. 12], AD7c-NTP p14-24
GAISAHRNLRL
Gly-Ala-Ile-Ser-Ala-His-Arg-Asn-Leu-Arg-Leu
d)NTP 펩티드 #4[SEQ ID NO. 13], AD7c-NTP p53-58
FFLVEM
Phe-Phe-Leu-Val-Glu-Met
e)NTP 펩티드 #5[SEQ ID NO. 14], AD7c-NTP p208-216
SVTQAGVQW
Ser-Val-Thr-Gln-Ala-Gly-Val-Gln-Trp
f)NTP 펩티드 #6[SEQ ID NO. 15], NTP-122 p106-122
IDQQVLSRIKLEIKRCL
Ile-Asp-Gln-Gln-Val-Leu-Ser-Arg-Ile-Lys-Leu-Glu-Ile-Lys-
Arg-Cys-Leu
g)NTP 펩티드 #7[SEQ ID NO. 16], NTP-122 p111-119
LSRIKLEIK
Leu-Ser-Arg-Ile-Lys-Leu-Glu-Ile-Lys
이들 구체적으로 열거된 NTP 펩티드의 상동체, 유도체, 변이체, 융합 단백질 및 펩티드 모방체를 포함한다.
"관련 단백질"이라는 문구는 하나 또는 그 이상의 NTP 펩티드와 동일, 밀접하게 유사 또는 상동인 아미노산 하나 또는 그 이상을 함유하는 단백질을 말한다.
"관련 단백질"이라는 표현은 관련 단백질의 아미노산 서열의 일부 이상에 상응하는 아미노산 서열로 구성된 펩티드를 말하며, 그러한 펩티드의 상동체, 변이체, 융합 단백질, 역-D 펩티드 및 펩티드 모방체를 포함한다. "관련 단백질"이라는 표현은 바람직하게는 다음과 같은 관련 단백질의 아미노산 서열을 포함하며 (그러나 이로 한정되는 것은 아님),
(a)관련 단백질 #1[SEQ ID NO. 17] 일시적인 수용체 포텐셜 채널 6,
변이체 델타 (NCBI 접근 CAC01686, PID g9716913), p356-377
GDHGRPNLSRLKLAIKYEVKKM
Gly-Asp-His-Gly-Arg-Pro-Asn-Leu-Ser-Arg-Leu-Lys-Leu-Ala-Ile-
Lys-Tyr-Glu-Val-Lys-Lys-Met
(b)관련 단백질 #2[SEQ ID NO. 18] 추정적인 커패시터티브 칼슘 채널
(NCBI 접근 NP_065122, PID g9966865), p345-360
QQSIAVKFLAVFGVSI
Gln-Gln-Ser-Ile-Ala-Val-Lys-Phe-Leu-Ala-Val-Phe-Gly-Val-Ser-Ile
(c)관련 단백질 #3[SEQ ID NO. 19] trp-관련 단백질 4 절단된
변이체 감마, (NCBI 접근 AF063825_1, PID g6665596), p337-357
GLLFPVFSVCYLIAPKSPLGL
Gly-Leu-Leu-Phe-Pro-Val-Phe-Ser-Val-Cys-Tyr-Leu-Ile-Ala-Pro-
Lys-Ser-Pro-Leu-Gly-Leu
이들 구체적으로 열거된 관련 단백질의 상동체, 유도체, 변이체, 융합 단백질 및 펩티드 모방체를 포함한다.
"세포 사멸 펩티드"라는 문구는, 관련 단백질, 또는 세포 사멸을 야기하는 데 효과적인 제제로서 밝혀진 관련 단백질을 말한다.
"단편"이라는 용어는 NTP 단백질, NTP 펩티드, 관련 단백질 또는 관련 펩티드의 아미노 서열의 연속적인 하부서열(subsequence)로 이루어진 단백질 또는 폴리펩티드를 말하며, 자연적으로 발생하는 생체내 프로테아제 활성으로부터 발생하는 스플라이스 변이체 및 단편과 같은 자연적으로 발생하는 단편을 포함한다. 그러한 단편은 아미노 말단에서, 카르복시 말단에서 및/또는 내부적으로 (자연적인 스플라이싱과 같은) 절단(truncate)될 수 있다. 그러한 단편은 아미노 말단 메티오닌의 존재 또는 부재 하에 제조될 수 있다. "단편"이라는 용어는, 동일하거나 상이한, 동일한 NTP 단백질 또는 NTP 펩티드, 또는 관련 단백질 또는 관련 펩티드로부터, 인접하는 아미노산 서열을 공통으로 가지거나 가지지 않고, 직접 또는 링커를 통하여 함께 연결된, 단편을 포함한다.
"변이체"라는 용어는, NTP 단백질, NTP 펩티드, 관련 단백질 또는 관련 펩티드의 아미노산 서열과 비교하여 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는삽입이 존재하는 단백질 또는 폴리펩티드를 말하며, NTP 단백질, NTP 펩티드, 관련 단백질 또는 관련 펩티드의 자연 발생적인 알렐 변이체 또는 택일적 스플라이스 변이체를 포함한다. "변이체"라는 용어는 펩티드 서열 중에 하나 또는 그 이상의 아미노산의, 유사하거나 상동한 아미노산(들) 또는 유사하지 않은 아미노산(들)로의 치환을 포함한다. 아미노산이 유사 또는 상동하다고 등급을 매길 수 있는 많은 척도가 있다 [Gunnar von Heijne, Sequence Analysis in Molecular Biology, p. 123-39 (Academic Press, New York, NY 1987)]. 바람직한 변이체는 하나 또는 그 이상의 아미노산 위치에 알라닌 치환을 포함한다. 다른 바람직한 치환은 단백질의 전체적인 알짜 전하, 극성 또는 소수성에 영향을 미치지 않거나 거의 미치지 않는 보존적 치환을 포함한다. 보존적 치환은 하기 표 2에 기재되어 있다.
보존적 아미노산 치환
염기성: 아르기닌리신히스티딘
산성: 글루탐산아스파르트산
비전하 극성: 글루타민아스파라진세린쓰레오닌티로신
비극성: 페닐알라닌트립토판시스테인글리신알라닌발린프롤린메티오닌류신이소류신
표 3은 또다른 아미노산 치환 도표를 기재한다.
원래 잔기 치환
AlaArgAsnAspCysGlnGluGlyHisIleLeuLysMetPheSerThrTrpTyrVal gly; serlysgln; hisgluserasnaspala; proasn; glnleu; valile; valarg; gln; gluleu; tyr; ilemet; leu; tyrthrsertyrtrp; pheile; leu
기타 변이체는 (a) 치환 지역의 폴리펩티드 골격의 구조, 예를 들어 시트형 또는 나선형 구조, (b) 표적 자리의 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 크기를 유지하는 데 대한 영향에 있어 더욱 중대하게 상이한 잔기를 선택하는 것과 같은, 덜 보존적인 아미노산 치환으로 구성될 수 있다. 기능에 더욱 중대하게 영향을 미칠 것으로 일반적으로 예상되는 치환은, (a) 글리신 및/또는 프롤린이 다른 아미노산으로 치환되거나 결실되거나 삽입되는 것; (b) 친수성 잔기(예. 세린 또는 쓰레오닌)가 소수성 잔기(예. 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 발린 또는 알라닌)를 치환하거나 치환되는 것; (c) 시스테인 잔기가 다른 잔기를 치환하거나 치환되는 것; (d) 전기양성인 측쇄를 가지는 잔기(예. 라이신, 아르기닌 또는 히스티딘)가 전기음성 전하를 가지는 잔기(예. 글루타민 또는 아르파르트산)을 치환화거나 치환되는 것; 또는 (e) 벌키한 측쇄를 가지는 잔기(예. 페닐알라닌)가 그러한 측쇄를가지지 않는 것(예. 글리신)을 치환하거나 치환되는 것들이다. 다른 변이체는 신규한 글리코실화 및/또는 포스포릴화 자리(들)을 생성하도록 고안된 것 또는 기존의 글리코실화 및/또는 포스포릴화 자리(들)을 제거하도록 고안된 것들을 포함한다. 변이체는 글리코실화 자리, 단백분해 절단 자리 및/또는 시스테인 잔기에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 변이체는 링커 펩티드 상의 NTP 단백질, NTP 펩티드, 관련 단백질 또는 관련 펩티드 아미노산 서열의 전 또는 후에 추가적인 아미노산 잔기를 가지는 NTP 단백질, NTP 펩티드, 관련 단백질 및 관련 펩티드를 또한 포함한다. 예를 들어, 시스테인 잔기를 관ㄹㄴ된 펩티드의 아미노 및 카르복시 말단 양쪽에 추가하여 이황화 결합의 형성에 의해 관련 펩티드의 환화(cyclization)를 허용할 수 있다. "변이체"라는 용어는 관련 단백질 또는 관련 펩티드의 3' 또는 5' 말단과 인접한 하나 이상, 최대 25 또는 그 이상의 추가적인 아미노산을 가지는 관련 단백질 또는 관련 펩티드의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 또한 포괄한다.
"유도체"라는 용어는, 프로세싱 및 기타 번역 후 변형과 같은 천연 과정 또는 예를 들어 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 분자, 당, 포스페이트 및/또는 기타 그러한 분자를 추가하는 것과 같은 화학적 변형에 의해 화학적으로 변형된, 화학적으로 변형된 단백질 또는 폴리펩티드를 말하며, 여기서 분자 또는 분자(들)은 야생형 관련 단백질 또는 관련 펩티드에 자연적으로 부착되지 않는다. 유도체는 염을 포함한다. 그러한 화학적 변형은 기초적인 문헌 및 보다 상세한 논문 및 부피가 큰 연구 문헌에도 잘 기재되어 있으며, 당업자에게 잘 알려져 있다. 동일한 유형의 변형이 주어진 단백질 또는 폴리펩티드의 여러 자리에서 동일한 또는 다양한 정도로 존재할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 또한, 주어진 단백질 또는 폴리펩티드는 많은 유형의 변형을 포함할 수 있다. 변형은, 펩티드 골격, 아미노산 측쇄 및 아미노 또는 카르복시 말단을 포함하여 단백질 또는 폴리펩티드의 어느 곳에서도 일어날 수 있다. 변형은 예를 들어 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 부착, 헴(heme) 부분의 공유 부착, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유 부착, 리피드 또는 리피드 유도체의 공유 부착, 포스포티딜이노시톨의 공유 부착, 가교결합, 환화, 이황화 결합 형성, 탈메틸화, 공유 가교결합의 형성, 시스테인의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마카르복실화, 글리코실화, GPI 앵커 형성, 히드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 단백분해 프로세싱, 포스포릴화, 프레닐화, 라세미화, 글리코실화, 리피드 부착, 황화, 아르기닌화와 같은 트랜스퍼-RNA 매개에 의한 아미노산의 단백질에의 추가 및 유비퀴틴화를 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Proteins--Structure And Molecular Properties, 2nd Ed. , T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993)] 및 [Wold, F., "Posttranslational Protein Modifications: Perspectives 및 Prospects," pgs. 1-12 in Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York (1983)]; [Seifter et al., Meth. Enzymol. 182: 626-646 (1990)] 및 [Rattan et al., "Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging," Ann. N. Y. Acad. Sci. 663: 48-62 (1992)]를 참조할 수 있다. "유도체"라는 용어는, 단백질 또는 폴리펩티드를, 분지가 있거나 없이, 분지화 또는 환화시키는, 화학적 변형을 포함한다. 환형, 분지 및 분지 환형 단백질 또는 폴리펩티드는 번역 후 천연 프로세스로부터 야기될 수 있으며 전적으로 합성 방법에 의해서도 또한 만들 수 있다.
"상동체"라는 용어는, 두 개의 폴리펩티드의 아미노산의 위치의 유사성을 비교하는 데 흔히 사용되는 표준 방법에 의해 측정시, 본 경우에, NTP 단백질, NTP 펩티드, 관련 단백질 또는 관련 펩티드의 아미노산 서열에 있어 60 % 이상 동일한 단백질을 말한다. 두 단백질 사이의 유사성 또는 동일성의 정도는 공지의 방법에 의해 쉽게 계산할 수 있으며, 이러한 방법은 [Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988]; [Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993]; [Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994]; [Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987]; [Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991]; 및 [Carillo H. and Lipman, D., SIAM, J Applied Math., 48: 1073 (1988)]에 기재된 것을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다. 동일성을 결정하는 바람직한 방법은 테스트되는 서열 사이의 최대한의 매치를 산출하도록 고안된다. 동일성 및 유사성을 측정하는 방법은 공개적으로 사용가능한 컴퓨터 프로그램에 정리되어 있다.
두 서열 사이의 동일성 및 유사성을 측정하는 데 유용한 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법은, GCG 프로그램 패키지 ([Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1): 387 (1984)]), BLASTP, BLASTN, 및 FASTA, [Atschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215: 403-410 (1990)]을 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다. BLAST X 프로그램은 NCBI 및 다른 소스 (BLAST 매뉴얼, [Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894]; [Altschul, S., et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990)]으로부터 공적으로 이용가능하다. 예로써, GAP (Genetic Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.)과 같은 컴퓨터 알고리즘을 사용하여, 백분 서열 상동성을 측정하고자 하는 두 단백질 또는 폴리펩티드를 각각의 아미노산의 최적의 매칭을 위해 정렬한다 (알고리즘에 의해 결정되는 "매치 스팬").
갭 개방 페널티 (3 x (곱하기) 평균 대각선으로 계산됨; "평균 대각선"은 사용되는 비교 매트릭스의 대각선의 평균이고; "대각선"은 특정 비교 매트릭스에 의해 각각의 완벽한 아미노산에 배당되는 점수 또는 숫자임) 및 갭 연장 페널티 (대개 갭 개방 페널티의 1/10임) 뿐만 아니라 PAM 250 또는 BLOSUM 62와 같은 비교 매트릭스가 알고리즘과 함께 사용된다. 표준 비교 매트릭스 (PAM250 비교 매트릭스의 경우 [Dayhoff et al. in: Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp. 3 (1978) for the comparison matrix]를, BLOSUM 62 비교 매트릭스의 경우 [Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 10915-10919 [1992]를 참고할 수 있다) 또한 알고리즘에 의해 사용될 수 있다. 백분율 동일성을 알고리즘에 의해 계산한다. 상동체는, 이 경우, 비교 NTP 단백질, NTP 펩티드, 관련 단백질 또는 관련 펩티드와 비교하여, 전형적으로 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환, 결실, 및/또는 삽입을 가질 것이다.
"펩티드 모방체" 또는 "모방체"라는 용어는 펩티드 또는 단백질의 생물학적 활성을 모방하지만 화학적 성질상 펩티드가 아닌, 즉 펩티드 결합 (즉, 아미노산 사이의 아미드 결합)을 함유하지 않는 생물학적 활성 화합물을 지칭한다. 본원에서, 펩티드 모방체라는 용어는 유사-펩티드, 세미-펩티드 및 펩토이드와 같이 성질상 완전히 펩티드성이 아닌 분자를 포함하는 광의로 사용된다. 이 광의의 펩티드 모방체의 예 (펩티드의 일부가 펩티드 결합이 없는 구조에 의해 교체됨)는 하기에 기재한다. 완전한 또는 부분적 비-펩티드이던지 간에, 본 발명에 따른 펩티드 모방체는 펩티드 모방체가 기초로 하는 NTP 펩티드, 관련 단백질 또는 관련 펩티드에서의 활성 기의 3차원적 배열과 매우 유사한 반응성 화학적 부분의 공간적 배열을 제공한다. 이 유사한 활성-부위의 기하학적 배열의 결과 펩티드 모방체는 생물학적 시스템에 NTP 펩티드, 관련 단백질 또는 관련 펩티드의 생물학적 활성과 유사한 효과를 갖는다.
본 발명의 펩티드 모방체는 바람직하게는 본원에 기재된 NTP 펩티드, 관련 단백질 또는 관련 펩티드와 3차원적 형상 및 생물학적 활성 면 모두에서 실질적으로 유사하다. 펩티드 모방체를 만들기 위한 펩티드를 구조적으로 변형시키는 공지의 방법의 예는 특히 N-말단에서, 활성에 미치는 부정적 영향 없이 단백분해적 분해에 대한 안정성을 상승시킬 수 있는 D-아미노산 잔기 구조로 유도하는 골격 키랄중심의 반전을 포함한다. 그 예는 문헌 ["Tritriated D-ala1-Peptide T Binding", Smith C. S. et al., Drug Development Res., 15, pp. 371-379 (1988)]에 기재되어 있다. 두번째 방법은 N에서 C로의 사슬간 이미드 및 락탐과 같이 안정성을 위해 고리 구조를 변경시키는 것이다 (Ede et al. in Smith and Rivier (Eds.) "Peptides: Chemistry and Biology", Escom, Leiden (1991), pp. 268-270). 그 예는, 예를 들면 본원에 인용됨으로써 그 개시의 전체가 삽입되는 골드스타인, 지. (Goldstein, G.) 등의 미국 특허 제4,457,489호 (1985)에 개시되어 있는 것과 같은 입체구조적으로 제한된 티모펜틴-유사 화합물이다. 세번째 방법은 관련 단백질 또는 관련 펩티드에서 펩티드 결합을 단백분해에 저항성을 부여하는 유사펩티드 결합에 의해 치환하는 것을 포함한다.
다수의 유사펩티드 결합은 일반적으로 펩티드 구조 및 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 것으로 기재되었다. 이러한 접근의 한 예는 레트로-인버소 (retro-inverso) 유사펩티드 결합을 치환하는 것이다 (본원에 인용됨으로써 삽입되는 문헌 ["Biologically active retroinverso analogues of thymopentin", Sisto A. et al in Rivier, J. E. and Marshall, G. R. (eds) "Peptides, Chemistry, Structure and Biology", Escom, Leiden (1990), pp.722-773 및 Dalpozzo, et al. (1993), Int. J. Peptide Protein Res., 41:561-566]). 이러한 변형에 따라, 펩티드의 아미노산 서열은 하나 이상의 펩티드 결합이 레트로-인버소 유사펩티드 결합에 의해 교체된다는 것을 제외하고 상기 NTP 펩티드, 관련 단백질 또는 관련 펩티드의 서열과 동일할 수 있다. 바람직하게는, 대부분의 N-말단 펩티드 결합이 치환되는데, 이는 이러한 치환이 N-말단에 작용하는 엑소펩티다제에 의한 단백분해에 대한 저항성을 부여할 것이기 때문이다. 추가적 변형은 또한 유사한 구조의 다른 화학기로 아미노산의 화학기를 교체함으로써 만들어질 수 있다. 생물학적 활성의 손실은 없거나 거의 없으면서 효소적 절단에 대한 안정성을 상승시킨다고 알려진 다른 적절한 유사펩티드 결합은 환원된 등입체성 유사펩티드 결합이다 (Couder, et al. (1993), Int. J. Peptide Protein Res., 41:181-184, 그 전체가 본원에 인용함으로써 삽입됨).
따라서, 이 펩티드들의 아미노산 서열은 하나 이상의 펩티드 결합이 등입체성 유사펩티드 결합에 의해 교체되는 것을 제외하고 NTP 펩티드, 관련 단백질 또는 관련 펩티드의 서열과 동일할 수 있다. "아미노산 서열"이라는 표현은 본원에서 둘 이상, 바람직하게는 넷 이상, 더욱 바람직하게는 다섯 이상의 아미노산 서열을 나타내는 데 바람직하게 사용된다. 바람직하게는 대부분의 N-말단 펩티드 결합이 치환되는데, 이는 이러한 치환이 N-말단에서 작용하는 엑소펩티다제에 의한 단백분해에 대한 저항성을 부여할 것이기 때문이다. 하나 이상의 환원된 등입체성 유사펩티드 결합을 갖는 펩티드의 합성은 당업계에 공지되어 있다 (상기 인용된 문헌 [Couder, et al. (1993)]). 다른 예는 펩티드 결합을 교체하기 위한 케토메틸렌 또는 메틸설파이드 결합의 도입을 포함한다.
NTP 펩티드, 관련 단백질 또는 관련 펩티드의 펩토이드 유도체는 생물학적 활성에 중요한 구조적 결정자를 보유하지만, 펩티드 결합을 제거함으로써 단백분해에 대한 저항성을 부여하는 다른 종류의 펩티드 모방체를 나타낸다 (Simon, et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 9367-9371, 그 전체가 본원에 인용함으로써 삽입됨). 펩토이드는 N-치환된 글리신의 올리고머이다. 각각 천연 아미노산의 측쇄에 해당하는 다수의 N-알킬기가 기재되었다 (상기 인용된 문헌 [Simon, et al. (1992)]). NTP 펩티드, 관련 단백질 또는 관련 펩티드의 아미노산의 일부 또는 전부가, 교체된 아미노산에 해당하는 N-치환된 글리신으로 교체될 수 있다.
"펩티드 모방체" 또는 "모방체"라는 용어는 또한 하기하는 역-D 펩티드 및 에난티오머를 포함한다.
"역-D 펩티드"라는 용어는 NTP 펩티드, 관련 단백질 또는 관련 펩티드의 L-아미노산 서열과 비교하여 역순으로 배열된 D-아미노산으로 이루어진 생물학적 활성 단백질 또는 펩티드를 지칭한다. 따라서, L-아미노산 NTP 펩티드, 관련 단백질 또는 관련 펩티드의 카르복시 말단 잔기는 D-아미노산 펩티드 등에 대한 아미노 말단이 된다. 예를 들면, NTP 펩티드, SSWDY는 YdDdWdSdSd가 되고, 여기서 Dd, Sd, Wd및 Yd는 각각 L-아미노산인 D, S, W 및 Y에 상응하는 D-아미노산이다.
"에난티오머"라는 용어는 NTP 펩티드, 관련 단백질 또는 관련 펩티드의 아미노산 서열에서 하나 이상의 L-아미노산 잔기가 상응하는 D-아미노산 잔기로 교체된 생물학적 활성 단백질 또는 펩티드를 지칭한다.
본원에 기재된 아미노산 및 아미노산 잔기는 하기 표에 제공되는 인정된 1 또는 3-문자 코드에 따라 언급될 수 있다.
아미노산 1-문자 심볼 3-문자 심볼
알라닌 A Ala
아르기닌 R Arg
아스파라긴 N Asn
아스파르트산 D Asp
시스테인 C Cys
글루타민 Q Gln
글루탐산 E Glu
글리신 G Gly
히스티딘 H His
이소류신 I Ile
류신 L Leu
리신 K Lys
메티오닌 M Met
페닐알라닌 F Phe
프롤린 P Pro
세린 S Ser
쓰레오닌 T Thr
트립토판 W Trp
티로신 Y Tyr
발린 V Val
본 발명은 본 발명의 상기 정의된 세포 사멸 펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 바람직한 세포 사멸 펩티드는 NTP 펩티드와 유사하거나 상동적이다. 그러나, 관련 단백질의 부분 또는 단편에 기초한 기타 세포 사멸 펩티드의 사용 또한 본 발명에 포함된다. 예를 들어, AD7c-NTP 펩티드 서열 및 유사한 변이체 및 상동체 역시 광범위한 인간 및 비인간 단백질 ("관련 단백질")에서 발견된다. 특히, AD7c-NTP 유전자는, 인간 및 기타 영장류 게놈 중의 다른 유전자에서 또한 발견되는 것들과 매우 유사한 Alu-형 서열을 함유한다.
따라서, 전부는 아닐지라도 어떤 관련 단백질은 AD7c-NTP 펩티드 ("관련 펩티드")와 상동적이거나 또는 밀접히 유사한 펩티드 서열을 함유하기 때문에 세포 사멸을 야기시키는 효과적인 제제로 판명될 것이라고 예측하는 것이 합리적이다. 유사하게, 당업자는 세포 사멸을 야기시키는 유효한 제제로서 밝혀진 임의의 관련단백질에 대한 아미노산 서열에 근거하여 특정 관련 펩티드를 합성하고, 세포 사멸을 야기하는 제제로서의 효과에 대해 그들을 테스트할 수 있을 것이다.
세포 사멸을 야기하는 효과적인 제제로 밝혀진 관련 단백질로부터 유도된 기타 펩티드 서열 또한 세포 사멸을 야기하는 데 유효한 제제일 수 있다. 당업자는 기타 효과적인 펩티드 서열을 찾기 위해, 그 단백질이 전체 아미노산 서열에 걸치는 효과적인 관련 단백질을 과도한 실험을 하지 않고 합성할 수 있다.
특정 관련 단백질은 NTP 펩티드 서열과 동일하거나 밀접히 유사하거나 또는 상동적인 아미노산을 함유하는 것으로 알려진 다음과 같은 단백질을 포함한다.
본 발명에 포함되는 NTP 펩티드, 관련 단백질, 관련 펩티드, 및 그들의 단편, 변형체, 유도체, 상동체 및 모방체는 당업자에게 공지된 방법, 예를 들면 재조합 DNA 기술, 단백질 합성 및 자연 발생의 NTP 펩티드, 관련 단백질, 관련 펩티드, 및 그들의 단편, 변형체, 유도체 및 상동체의 단리를 사용하여 제조될 수 있다.
NTP 펩티드, 관련 단백질 또는 관련 펩티드는 공지된 재조합 DNA 기술 방법, 예를 들면 문헌[Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. [1989])] 및(또는) 문헌[Ausubel et al., eds.,Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers Inc. and Wiley and Sons, N.Y. [1994]]에 기재된 방법들을 사용하여 제조될 수 있다.
유전자 또는 cDNA를 코딩하는 NTP 펩티드, 관련 단백질 또는 관련 펩티드는 예를 들면, 유전자 또는 cDNA 라이브러리 스크리닝, 또는 PCR 증폭에 의해 얻을 수 있다. 라이브러리를 스크리닝하는 데 유용한 프로브 또는 프라이머(primer)는 유전자 또는 관련된 유전자군, 예를 들면, 다른 관련 단백질에서 발견되는 보존된 모티프(motif)로부터 다른 공지된 유전자 또는 유전자 단편에 대한 서열 정보에 기초하여 생성될 수 있다. 또한, 유전자를 코딩하는 NTP 펩티드, 관련 단백질 또는 관련 펩티드가 한 종으로부터 동정된 경우, 그 유전자의 모두 또는 일부가 다른 종으로부터 동종 유전자를 동정하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다. 프로브 또는 프라이머는 NTP 펩티드, 관련 단백질 또는 관련 펩티드 유전자를 발현하는 것으로 믿어지는 다양한 조직원으로부터 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 데에 사용될 수 있다. 일반적으로, 스크리닝으로부터 얻어진 위양성의 수를 최소화하기 위해, 스크리닝에는 매우 가혹한 조건이 사용될 것이다.
유전자를 코딩하는 NTP 펩티드, 관련 단백질 또는 관련 펩티드를 제조하는 또다른 수단은 당업자에게 공지된 방법, 예를 들면 엔젤스(Engels) 등에 의한 문헌[Angew. Chem. Intl. Ed., 28:716-734 [1989]]에 기재된 것을 사용하여 화학적 합성을 사용하는 것이다. 그 중에서도, 이들 방법은 핵산 합성을 위한 포스포트리에스테르, 포스포라미디트, 및 H-포스포네이트 방법을 포함한다. 이러한 화학적 합성에 대한 바람직한 방법은 표준 포스포라미디트 화학을 사용한 중합체 지지 합성이다. 일반적으로, DNA를 코딩하는 NTP 펩티드, 관련 단백질 또는 관련 펩티드는 길이가 수백 뉴클레오티드가 될 것이다. 약 100 뉴클레오티드를 초과하는 핵산은 이들 방법을 사용하여 수 개의 단편으로서 합성될 수 있다. 그 다음, 단편은 서로 라이게이션(ligation)되어 전 길이의 NTP 펩티드, 관련 단백질 또는 관련 펩티드를 형성할 수 있다. 대개, 단백질의 아미노 말단을 코딩하는 DNA 단편은 ATG를 가질 것이고, 이는 메티오닌 잔기를 코딩한다. 숙주 세포에서 생성된 단백질이 세포로부터 분비될 것인지에 따라, 이 메티오닌은 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드의 성숙한 형태에 존재하거나 또는 존재하지 않을 수 있다.
관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드를 코딩하는 유전자, cDNA, 또는 그들의 단편은 표준 라이게이션 기술을 사용하여 적절한 발현 또는 증폭 벡터에 삽입될 수 있다. 일반적으로, 벡터는 사용되는 특정 숙주 세포에서 기능하도록 선택된다(즉, 유전자 및(또는) 유전자의 발현의 증폭이 일어날 수 있도록, 벡터는 숙주 세포 기구와 상용가능함). 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드를 코딩하는 유전자, cDNA, 또는 그들의 단편은 원핵 생물, 효모, 곤충(바쿨로바이러스계) 및(또는) 진핵 숙주 세포에서 증폭/발현될 수 있다. 숙주 세포의 선택은 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드가 글리코실화 및(또는) 포스포릴화되는 것인지에 따라 부분적으로 좌우된다. 만약 그렇다면, 효모, 곤충, 또는 포유류 숙주 세포가 바람직하다.
일반적으로, 임의의 숙주 세포에서 사용되는 벡터는 5'측 서열(프로모터로도 지칭됨) 및 다른 조절 요소, 예를 들면 인헨서(들), 복제 시발점 요소, 전사 종결 요소, 공여체(donor) 및 수용체(acceptor) 스플라이스(splice) 부위를 포함하는 완전한 인스트론 서열, 신호 펩티드 서열, 리보솜 결합 부위 요소, 폴리아데닐화 서열, 발현될 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 삽입하기 위한 폴리링커 영역, 및 선택가능한 표지 요소를 포함한다. 이들 각각의 요소는 하기에서 논의된다. 임의적으로, 벡터는 테그(tag) 서열, 즉, 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드를 코딩하는 서열의 5' 또는 3' 말단에 위치하는 올리고뉴클레오티드 분자를 포함할 수 있고, 올리고뉴클레오티드 분자는 폴리His(예를 들면, 헥사His), 또는 다른 테그, 예를 들면 FLAG, HA(헤마글루티닌 인플루엔자 바이러스) 또는 상업적으로 입수가능한 항체가 존재하는 myc를 코딩한다. 일반적으로, 이 테그는 폴리펩티드의 발현시 폴리펩티드에 융합되고, 숙주 세포로부터 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드의 친화성 정제에 대한 수단으로서 작용할 수 있다. 친화성 정제는 예를 들면, 친화성 매트릭스로서 테그에 대한 항체를 사용한 칼럼 크로마토그래피에 의하여 달성될 수 있다. 임의적으로, 테그는 추후에, 다양한 수단에 의하여, 예를 들면 일정한 펩티다아제를 사용하여 정제된 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드로부터 제거될 수 있다.
인간 면역글로불린 힌지 및 Fc 영역은 당업자에 의해 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에서 융합될 수 있다. 후속 Fc-융합 단백질은 단백질 A 친화성 칼럼을 사용함으로써 정제될 수 있다. Fc는 생체에서긴 약동학적 반감기를 나타내는 것으로 공지되어 있고, Fc에 융합된 단백질은 비융합된 대응물보다 실질적으로 생체내 반감기가 긴 것으로 발견되었다. 또한, Fc 영역에 대한 융합은 일부 분자의 생활성에 유용할 수 있는 분자가 이량화/다중화되게 한다.
5'측 서열은 동종(즉, 숙주 세포로서 동일 종 및(또는) 세포주로부터), 이종(즉, 숙주 세포 종 또는 세포주이외의 종으로부터), 혼성물(즉, 하나 이상의 원천으로부터 5'측 서열들의 조합), 합성일 수 있고, 또는 고유의 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드 유전자 5'측 서열일 수 있다. 따라서, 5'측 서열의 원천은 임의의 단세포 원핵 또는 진핵 생물, 임의의 척추 또는 무척추 생물, 또는 임의의 식물일 수 있고, 단, 5'측 서열은 숙주 세포 기구에서 기능적이고, 이에 의해 활성화될 수 있다.
본 발명의 벡터에 유용한 5'측 서열은 당업계에 공지된 임의의 몇몇 방법에 의해 얻을 수 있다. 일반적으로, 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드 유전자 측 서열 외에 본 명세서에서 유용한 5'측 서열은 지도화 및(또는) 제한 엔도뉴클레아제(endonuclease) 분해에 의해 이미 동정되었고, 따라서, 적절한 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 적절한 조직원으로부터 단리될 수 있다. 몇 가지 경우, 5'측 서열의 전 뉴클레오티드 서열은 공지될 수 있다. 이 경우, 5'측 서열은 핵산 합성 또는 클로닝에 대한 상기 방법을 사용하여 합성될 수 있다.
모든 또는 단지 일부의 5'측 서열이 공지되어 있는 경우, 이는 PCR을 사용하고(사용하거나) 동일 또는 다른 종으로부터 적절한 올리고뉴클레오티드 및(또는)5'측 서열 단편을 사용하여 유전자 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻을 수 있다.
5'측 서열이 공지되어 있지 않은 경우, 5'측 서열을 포함하는 DNA의 단편은 예를 들면, 코딩 서열 또는 심지어 다른 유전자 또는 유전자들을 포함할 수 있는 큰 단편의 DNA로부터 단리될 수 있다. 단리는 적절한 DNA 단편을 단리하기 위해 하나 이상의 신중하게 선택된 효소를 사용하여 제한 엔도뉴클레아제 분해에 의하여 이루어질 수 있다. 분해 후, 원하는 단편은 아가로오스 겔 정제, 퀴아겐(Qiagen)(등록상표) 칼럼 또는 다른 당업자에게 공지된 방법에 의해 단리될 수 있다. 용이하게도, 이 목적을 달성하는 데 적절한 효소의 선택은 당업자에게 자명할 것이다.
일반적으로, 복제 시발점 요소는 상업적으로 시판되는 원핵 발현 벡터의 부분이고, 숙주 세포 내에서 벡터의 증폭을 돕는다. 일부 경우에서, 일정한 복제수로의 벡터의 증폭은 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드의 최적의 발현에 중요할 수 있다. 선택한 벡터가 복제 시발점 부위를 갖지 않는 경우, 공지된 서열에 기초하여 화학적으로 합성하여 벡터로 라이게이션시킬 수 있다. 일반적으로, 전사 종결 요소는 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드 코딩 서열의 3' 말단에 위치하고, 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드의 전사를 종결시킨다. 대개, 원핵 세포 중의 전사 종결 요소는 G-C 풍부 단편에 뒤이은 폴리 T 서열이다. 요소는 벡터의 일부로서 상업적으로 시판되거나 또는 라이브러리로부터 클로닝될 수 있지만, 또한, 상기와 같은 핵산 합성 방법을 사용하여 용이하게 합성될 수 있다.
선택가능한 표지 유전자 요소는 선택적 배지에서 성장한 숙주 세포의 생존및 성장에 필요한 단백질을 코딩한다. 전형적인 선택 표지 유전자는 (a) 원핵 숙주 세포에게 항생제 또는 다른 독소, 예를 들면, 엠피실린, 테트라시클린, 또는 카나마이신에 대한 내성을 제공하거나, (b) 세포의 영양 결핍을 보충하거나, 또는 (c) 복합 배지로부터 이용가능하지 않은 중요한 영양소를 제공하는 단백질을 코딩한다. 바람직한 선택가능한 표지들은 카나마이신 내성 유전자, 엠피실린 내성 유전자, 및 테트라시클린 내성 유전자이다.
통상 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 서열(원핵 생물) 또는 코자크(Kozak) 서열(진핵 생물)로 불리는 리보솜 결합 요소는 대개 mRNA의 번역 개시에 필요하다. 일반적으로, 요소는 프로모터에 대해 3' 및 합성되는 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드의 코딩 서열에 대해 5'에 위치한다. 샤인-달가노 서열은 변하지만, 일반적으로 폴리푸린(즉, 높은 A-G 함량을 가짐)이다. 많은 샤인-달가노 서열이 동정되었고, 이들 각각은 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 당업자에 의해 용이하게 합성될 수 있으며, 원핵 벡터에서 사용되었다.
관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드가 숙주 세포로부터 분비되는 것이 바람직한 경우, 신호 서열은 합성시 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드를 숙주 세포 밖으로 보내는 데에 사용될 수 있고, 막 고정(anchoring)을 막기 위해, 단백질의 카르복시 말단부가 삭제될 수 있다. 일반적으로, 신호 서열은 관련 단백질/관련 펩티드/NTP 펩티드 유전자 또는 cDNA의 코딩 영역, 또는 관련 단백질/관련 펩티드/NTP 펩티드 유전자 코딩 영역의 5' 말단에 바로 위치한다. 많은 신호 서열이 동정되었고, 선택된 숙주 세포에서 기능적인 임의의 것들을 관련단백질/NTP 펩티드 유전자 또는 cDNA와 함께 사용할 수 있다. 따라서, 신호 서열은 관련 단백질/관련 펩티드/NTP 펩티드 유전자 또는 cDNA에 대해 동종 또는 이종일 수 있고, 관련 단백질/관련 펩티드/NTP 펩티드 유전자 또는 cDNA과 동종 또는 이종일 수 있다. 또한, 신호 서열은 상기 나타낸 방법을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 대부분의 경우, 신호 펩티드의 존재를 통하여 숙주 세포로부터 폴리펩티드가 분비됨으로써 폴리펩티드로부터 아미노 말단 메티오닌이 제거될 것이다.
많은 경우, 관련 단백질/관련 펩티드/NTP 펩티드 유전자 또는 cDNA의 전사는 벡터 내 하나 이상의 인스트론의 존재에 의해 증가될 수 있다. 이는 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드가 진핵 숙주 세포, 특히 포유류 숙주 세포에서 생성되는 경우에 특히 그러하다. 특히 사용되는 유전자가 전 길이의 유전자 서열 또는 그의 단편인 경우, 사용되는 인스트론은 관련 단백질/관련 펩티드/NTP 펩티드 유전자 내에서 자연적으로 발생할 수 있다. 인스트론이 유전자 내에서 자연적으로 발생하지 않는 경우(대부분의 cDNA의 경우), 인스트론은 또다른 원천으로부터 얻을 수 있다. 인스트론이 효율적으로 전사되어야 하기 때문에, 일반적으로, 측 서열 및 관련 단백질/관련 펩티드/NTP 펩티드 유전자에 대한 인스트론의 위치는 중요하다. 따라서, 발현 벡터로 삽입되는 관련 단백질/관련 펩티드/NTP 펩티드 유전자가 cDNA 분자인 경우, 바람직한 인스트론 위치는 전사 시작 부위에 대해 3' 및 폴리 A 전사 종결 서열에 대해 5'이다. 관련 단백질/관련 펩티드/NTP 펩티드 cDNA의 경우 바람직하게는, 이 코딩 서열을 방해하지 못하도록 인스트론 또는 인스트론들은cDNA의 한 쪽 또는 다른 쪽(즉, 5' 또는 3')에 위치할 것이다. 임의의 바이러스, 원핵 및 진핵 (식물 또는 동물) 생물을 포함하는 임의의 원천로부터의 임의의 인스트론을 본 발명을 실시하는 데에 사용할 수 있으며, 단, 이는 이것이 삽입되는 숙주 세포와 상용가능한 것이다. 또한, 합성 인스트론도 본 명세서에 포함된다. 임의적으로, 하나 이상의 인스트론이 벡터에 사용될 수 있다.
상기 나타낸 요소 중 하나 이상이 이미 사용되는 벡터에 존재하는 경우, 이들은 개별적으로 수득되어 벡터로 라이게이션될 수 있다. 각각의 요소를 얻는 데 사용되는 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 상기 나타낸 방법(즉, DNA 합성, 라이브러리 스크리닝 등)과 동등하다.
일반적으로, 본 발명을 실시하는 데에 사용되는 최종 벡터는 출발 벡터, 예를 들면 상업적으로 입수가능한 벡터로부터 제조된다. 이러한 벡터는 완성된 벡터에 포함되는 일부 요소들을 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 출발 벡터에 원하는 요소가 전혀 존재하지 않는 경우, 라이게이션되는 요소의 말단 및 벡터의 말단이 라이게이션에 상용가능하도록, 적절한 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 벡터를 절단함으로써 각 요소를 벡터에 개별적으로 라이게이션시킬 수 있다. 일부 경우에서, 라이게이션을 만족스럽게 하기 위해서는 라이레이션될 말단을 평활하게 할(blunt) 수 있다. 모든 4 개의 뉴클레오티드의 존재 하에서 클레나우(Klenow) DNA 폴리머라아제 또는 T4 DNA 폴리머라아제를 사용하여 먼저 "점착성 말단(sticky end)"을 채움으로써 평활하게 만들 수 있다. 이 과정은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌[Sambrook et al., supra]에 기재되어 있다. 별법으로, 먼저 벡터로 삽입되는 요소 중 두 개 이상을 함께 라이게이션(이들이 서로 인접하여 위치하는 경우)시킨 다음, 벡터로 라이게이션시킬 수 있다.
벡터를 제조하는 추가적인 방법은 하나의 반응 혼합물 중에서 다양한 요소로 된 모든 라이게이션을 동시에 수행하는 것이다. 이 때, 요소의 비적절한 라이게이션 또는 삽입으로 인해, 무의미하거나 또는 비기능적인 벡터가 많이 생성된다. 그러나, 제한 엔도뉴클레아제 분해에 의해 기능적 벡터를 동정하고 선택할 수 있다.
본 발명을 실시하기에 바람직한 벡터는 세균, 곤충, 및 포유류 숙주 세포와 상용가능한 것들이다. 이러한 벡터는 그 중에서도, pCRII, pCR3, 및 pcDNA3.1(캘리포니아주 샌디에고 소재의 인비트로겐 캄파니(Invitrogen Company)), pBSII(캘리포니아주 라 졸라 소재의 스트라타젠 캄파니(Stratagene Company)), pET15b(위스콘신주 마디슨 소재의 노바겐(Novagen)), PGEX(뉴져지주 피스카타웨이 소재의 파마시아 바이오테크(Pharmacia Biotech)), pEGFP-N2(캘리포니아주 팔로 알토 소재의 클론테크(Clontech)), pETL(BlueBacII; 인비트로겐), 및 pFastBacDual(뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재의 기브코(Gibco)/BRL)을 포함한다.
벡터를 제조하고, 핵산 분자를 코딩하는 전 길이 또는 절단된 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드가 벡터의 적절한 부위에 삽입된 후, 완성된 벡터는 증폭 및(또는) 폴리펩티드 발현을 위하여 적절한 숙주 세포에 삽입될 수 있다. 숙주 세포는 원핵 숙주 세포(예를 들면, 대장균) 또는 진핵 숙주 세포(예를 들면, 효모 세포, 곤충 세포, 또는 척추동물 세포)일 수 있다. 적절한 조건하에서 배양된 경우 숙주 세포는 배지로부터 추후 수집될 수 있거나(숙주 세포가 이를 배지로 분비하는 경우) 또는 이를 생성하는 숙주 세포로부터 직접 수집될 수 있는(분비되지 않는 경우) 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드를 합성할 수 있다.
수집 후, 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드는 분자체 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등과 같은 방법을 사용하여 정제할 수 있다. 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드 제조를 위한 숙주 세포의 선택은 부분적으로는 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드가 글리코실화 또는 포스포릴화되는 지 여부(이 경우, 진핵 숙주 세포가 바람직함), 및 생물학적 활성 단백질이 생물학적 활성을 갖는 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드에 의해 제조되도록, 숙주 세포가 그의 고유의 3차 구조로 단백질을 폴딩(folding)할 수 있는 방식(예를 들면, 디술피드 브릿지의 적절한 배향 등)에 따라 좌우될 것이다. 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드는 하기에 논의된 바와 같이 적절한 화학적 조건을 사용하여 합성된 후 폴딩될 수 있다. 본 발명에 유용한 적절한 세포 또는 세포주는 포유류 세포, 예를 들면 중국 햄스터 난소 세포(CHO), 인간 배아 신장(HEK) 293 또는 293T 세포, 또는 3T3 세포를 포함한다. 적절한 포유류 숙주 세포의 선택 및 형질전환, 배양, 증폭, 스크리닝 및 생성물 제조 및 정제 방법은 본 명세서에 제공된 지침을 사용하여 당업자에 의해 달성될 수 있다. 다른 적절한 포유류 세포주는 원숭이 COS-1 및 COS-7 세포주 및 CV-1 세포주를 포함한다. 추가로, 예시적인 포유류 숙주 세포는 형질전환된 세포주를 포함하는 영장류 세포주 및 설치류 세포주를 포함한다. 또한, 정상 배수체 세포, 1차 이식편 뿐만 아니라 1차 조직의 시험관내 배양으로부터 유도된 세포주도 적절하다. 후보 세포는 선택 유전자에서 유일반적으로 결함을 갖거나, 또는 지배적으로 작용하는 선택 유전자를 포함할 수 있다. 다른 적절한 포유류 세포주는 마우스 신경모 세포종 N2A 세포, HeLa, 마우스 L-929 세포, 스위스, Balb-c 또는 NIH 마우스로부터 유도된 3T3주, BHK 또는 HaK 햄스터 세포주를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
유사하게도, 본 발명에 적절한 숙주 세포로서 유용한 것은 세균 세포이다. 예를 들면, 대장균의 다양한 세포주(예를 들면, HB101, DH5.알파, DH10, 및 MC1061)는 생물공학 분야에 숙주 세포로서 공지되어 있다. 또한, 이 방법에 바실러스 서브틸리스(B. subtilis), 수도모나스균(Pseudomonas spp.), 다른 바실러스균(Bacillus spp.), 방선균(Streptomyces spp.) 등의 다양한 세포주를 사용할 수 있다. 또한, 당업자에게 공지된 효모 세포 중 많은 세포주들이 본 발명의 폴리펩티드의 발현을 위한 숙주 세포로서 이용가능하다.
또한, 원하는 경우, 곤충 세포계를 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 이러한 계는 예를 들면, 문헌[Kitts et al. (Biotechiques, 14:810-817 [1993]), Lucklow (Curr. Opin. Biotechnol., 4:564-572 [1993]) and Lucklow et al.(J Virol., 67:4566-4579 [1993])]에 기재되어 있다. 바람직한 곤충 세포는 Sf-9 및 Hi5(캘리포니아주 칼스바드 소재의 인비트로겐)이다.
벡터의 선택된 숙주 세포로의 삽입(형질전환 또는 형질감염으로도 지칭됨)은 염화칼슘, 일렉트로포레이션(electroporation), 미세주입법(microinjection), 리포펙션(lipofection), 또는 DEAE-덱스트란 방법과 같은 방법들을 사용하여 달성될 수 있다. 방법의 선택은 부분적으로는 사용되는 숙주 세포 타입의 기능에 따를 것이다. 이들 방법 및 다른 적절한 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌[Sambrook et al., supra]에 기재되어 있다.
벡터를 포함하는 숙주 세포(즉, 형질전환 또는 형질감염됨)는 당업자에게 공지된 표준 배지를 사용하여 배양될 수 있다. 대개, 배지는 세포의 성장 및 생존에 필요한 모든 영양소를 포함할 것이다. 대장균 세포 배양에 적절한 배지는 예를 들면, 루리아 브로쓰(Luria Broth)(LB) 및(또는) 테리픽 브로쓰(Terrific Broth)(TB)이다. 진핵 세포 배양에 적절한 배지는 RPMI 1640, EM, DMEM이고, 이들 모두에게 배양될 특정 세포주에게 요구되는 성장 인자 및(또는) 혈청이 보충될 수 있다. 곤충 배양에 적절한 배지는 필요에 따라 이스톨레이트, 락트알부민 히드로라이세이트, 및(또는) 우태 혈청이 보충되는 그레이스(Grace)의 배지이다. 일반적으로, 오직 형질전환된 세포의 선택적인 성장에 유용한 항생제 또는 다른 화합물이 배지에 보충물로서 첨가될 수 있다. 사용되는 화합물은 형질전환된 숙주 세포와 플라스미드 상에 존재하는 선택가능한 표지 요소에 의해 지시될 것이다. 예를 들면, 선택가능한 표지 요소가 카나마이신 내성인 경우, 배지에 첨가되는 화합물은 카나마이신이다.
숙주 세포에서 생성된 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드의 양은 당업계에 공지된 표준 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 이러한 방법은 웨스턴 블럿(Western blot) 분석, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 비변성 겔 전기영동, HPLC 분리, 질량 분광법, 면역침전, 및(또는) 활성 분석시험, 예를 들면 DNA 결합 겔 이동(shift) 분석시험을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드가 숙주 세포로부터 분비되는 것인 경우, 대다수의 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드가 세포 배지 중에서 발견될 수 있다. 일반적으로, 이 방법으로 제조된 단백질은 세포로부터 분비되는 동안 제거되기 때문에 아미노 말단 메티오닌을 갖지 않는다. 그러나, 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드가 숙주 세포로부터 분비되지 않는 경우, 세포질 및(또는) 핵(진핵 숙주 세포의 경우) 또는 시토졸(그람 음성 세균 숙주 세포의 경우)에 존재할 수 있고, 아미노 말단 메티오닌을 가질 수 있다.
숙주 세포 세포질 및(또는) 핵에 위치한 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드의 경우, 일반적으로, 숙주 세포는 우선 기계적으로 또는 세제로 분열되어 세포내 물질을 완충 용액으로 방출시킨다. 그 다음, 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드를 이 용액으로부터 단리시킬 수 있다.
다양한 기술을 사용하여 용액으로부터 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드를 정제할 수 있다. 단백질이 그의 카르복실 또는 아미노 말단에 테그, 예를 들면 헥사히스티딘(hexaHistidine)(예를 들면, NTP 펩티드/헥사His) 또는 다른 작은 펩티드, 예를 들면 FLAG(미시간주 세인트 루이스 소재의 시그마 알드리치(Sigma-Aldritch)) 또는 칼모듈린결합 펩티드(캘리포니아 라 졸라 소재의 스트라타젠)를 포함하도록 합성된 경우, 본질적으로, 용액을 칼럼 매트릭스가 테그 또는 직접적으로 단백질에 대한 높은 친화성을 갖는 (즉, 관련 단백질 또는 관련 펩티드를 특이적으로 인지하는 단일클론 항체) 친화성 칼럼에 통과시킴으로써 1단계 공정으로 이를 정제할 수 있다. 예를 들면, 폴리히스티딘은 높은 친화성 및 니켈, 아연 및 코발트에 대한 특이성을 갖고 결합하므로, 니켈 기초의 친화성 수지(퀴아겐의 QIA익스프레스 시스템 또는 인비트로겐의 젝스프레스 시스템(Xpress System)에서 사용됨) 또는 코발트 기초의 친화성 수지(BD 바이오사이언시스(Biosciences)-클론테크(CLONTECH)의 타론 시스템(Talon system)에서 사용됨)을 사용하는 고정화된 금속 이온 친화성 크로마토그래피가 관련 단백질/폴리His의 정제에 사용될 수 있다(예를 들면, 문헌[Ausubel et al., eds.,Current Protocols in Molecular Biology, Section 10.11. 8, John Wiley & Sons, New York [1993]] 참조).
관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드가 부착된 테그없이 제조된 경우, 및 어떠한 항체도 이용가능하지 않은 경우, 다른 공지된 정제 과정이 사용될 수 있다. 이러한 과정은 이온 교환 크로마토그래피, 히드록시아파티트 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 분자체 크로마토그래피, HPLC, 겔 용리와 함께 고유 겔 전기영동, 및 제조 등전 집속(이소프림(Isoprime) 기계/기법, 호에퍼 사이언티픽(Hoefer Scientific))을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 일부 경우에서, 증가된 순도를 얻기 이해, 이들 기술 중 두 개 이상을 병용할 수 있다.
관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드가 주로 세포내 발견될 것으로 예상되는 경우, 세포내 물질(그람 음성 세균 봉입체(inclusion body) 포함)을 당업자에게 공지된 임의의 표준 기법을 사용하여 숙주 세포로부터 추출할 수 있다. 예를 들면, 프렌치 프레스(French press), 균질화, 및(또는) 초음파처리에 이어 원심분리에 의하여 숙주 세포가 용균되어 원형질막공간/세포질 물질을 방출할 수 있다.관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드가 시토졸 중에 봉입체를 형성한 경우, 봉입체는 종종 내부 및(또는) 외부 세포막에 결합될 수 있고 따라서, 원심분리 후 펠렛 물질 중에서 주로 발견될 것이다. 그 다음, 봉입체를 방출, 파괴 및 가용화시키기 위하여, 환원제, 예를 들면 염기성 pH에서 디티오트레이톨 또는 산성 pH에서 트리스 카르복시에틸 포스핀의 존재 하에서, 펠렛 물질을 pH 극단에서 또는 카오트로픽제(chaotropic agent), 예를 들면 세제, 구아니딘, 구아니딘 유도체, 우레아, 또는 우레아 유도체로 처리할 수 있다. 그 다음, 현재 가용성 형태인 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드를 겔 전기영동, 면역침전 등을 사용하여 분석할 수 있다. 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드를 단리시키는 것이 바람직하는 경우, 단리는 표준 방법, 예를 들면 하기에 나타내고 문헌[Marston et al. (Meth. Enz., 182: 264-275 [1990])]에 기재된 것을 사용하여 달성할 수 있다.
일부 경우에서, 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드는 단리 시 생물학적으로 활성이 없을 수 있다. 폴리펩티드의 그의 3차 구조로의 재폴딩 (refolding) 또는 전환 및 디술피드 연결의 생성을 위한 다양한 방법이 생물학적 활성을 복구하는 데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 가용화된 폴리펩티드를 대개 pH 7 초과로 및 카오트로프(chaotrope)의 특정 농도의 존재 하에서 노출시키는 것을 포함한다. 카오트로프의 선택은 봉입체 가용화에 사용되는 선택과 매우 유사하고, 저 농도에서는 대개 유사하고, 가용화에 사용되는 동일 카오트로프에 대해서는 반드시 유사한 것은 아니다. 또한, 대부분의 경우, 단백질의 시스테인 브릿지 형성시 디술피드 셔플링(shuffling)이 발생하도록 하는 특정 산화환원 전위를 생성하기 위하여 재폴딩/산화 용액은 환원제 또는 환원제와 그의 산화된 형태를 특이적인 비율로 포함할 것이다. 통상 사용되는 몇몇 산화환원 커플은 시스테인/시스타민, 글루타티오닌(GSH)/디티오비스 GSH, 염화구리, 디티오트레이톨(DTT)/디티안 DTT, 2-멀캅토에탄올(bME)/디티오-b(ME)를 포함한다. 많은 경우, 재폴딩 효율을 증가시키기 위해 공용매가 필요할 수 있고, 이 목적으로 사용되는 보다 통상적인 시약은 글리세롤, 다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜 및 아르기닌을 포함한다.
숙주 세포 내에서 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드 봉입체가 상당한 양으로 형성되지 않은 경우, 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드는 세포 균질화액의 원심분리 후 상청액 중에서 주로 발견될 수 있고, 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드를 하기에 나타낸 것과 같은 방법을 사용하여 상청액 으로부터 단리시킬 수 있다.
부분적으로 또는 완전하게 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드, 정제를 단리시키는 것이 바람직한 경우, 당업자에게 공지된 표준 방법을 사용하여 단리시킬 수 있다. 이러한 방법은 전기영동에 이어서 전기용리에 의한 분리, 다양한 타입의 크로마토그래피(면역친화성, 분자체, 및(또는) 이온 교환), 및(또는) 고압 액체 크로마토그래피를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 일부 경우에서는, 이러한 완전 정제 방법 중 하나 이상을 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드를 제조하고 정제하는 데에 재조합 DNA 기술을 사용하는 것 외에도, 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드, 및 그들의 단편, 변형체, 상동체 및 유도체는 당업계에 공지된 기술, 예를 들면 문헌[Merrifield et al., (J Am. Chem. Soc., 85:2149 [1963]), Houghten et al. (Proc Natl Acad. Sci.USA, 82: 5132 [1985]), and Stewart and Young (Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, III. [1984]]에 기재된 것을 사용하는 화학적 합성 방법(예를 들면, 고체상 펩티드 합성)에 의하여 제조될 수 있다. 이러한 폴리펩티드는 아미노 말단 상의 메티오닌을 사용하여 또는 메티오닌없이 합성될 수 있다. 화학적으로 합성된 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드는 이들 참조문헌에 개시된 방법을 사용하여 산화시켜 이황화 가교를 형성할 수 있다. 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드는 재조합 생성되거나 또는 천연 공급원으로부터 정제된 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드에 상응하는 생물학적 활성을 가질 것으로 예상되고, 따라서, 재조합 또는 천연 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드와 교환적으로 사용될 수 있다.
관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드가 중합체에 결합된 화학적으로 개질된 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드 조성물은 본원발명의 범위 내에 포함된다. 선택된 중합체는 이들이 결합된 단백질이 생리학적 환경과 같은 수용성 환경 중에서 침전되지 않도록 일반적으로 수용성이다. 중합도가 본원발명의 방법에서 제공된 것과 같이 조절될 수 있도록, 선택된 중합체는 일반적으로 단일 반응기, 예를 들어, 아실화를 위한 활성 에스테르 또는 알킬화를 위한 알데히드를 가지도록 개질된다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있고, 분지되거나 또는 비분지될 수 있다. 관련 단백질/관련 펩티드/NTP 펩티드 중합체의 범위 내에 중합체의 혼합물이 포함된다.
어떤 경우, 천연형 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드의 핵산 및(또는) 아미노산 변이체를 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 핵산 변이체는 위치 특이적 돌연변이, PCT 증폭, 또는 프라이머(들)이 목적한 점 돌연변이를 갖는 기타 적절한 방법을 사용하여 제조될 수 있다 (돌연변이 기술의 기재에 대해서 [Sambrook et al., supra] 및 [Ausubel et al., supra]을 참조). 또한, 문헌 [Engels et al.]에 기술된 방법을 사용한 화학적 합성이 이같은 변이체를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 당업자들에게 공지된 기타 방법이 또한 사용될 수 있다.
바람직한 핵산 변이체는 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드를 생성하기 위해 사용되는 숙주 세포 중의 코돈 선호도의 원인이 되는 뉴클레오티드 치환을 함유하는 것들이다. 이같은 코돈 최적화는 위스콘신 대학 패키지 버젼 9.0, 제네틱스 컴퓨터 그룹 (위스콘신주 매디슨 소재)에 의해 제공되는 발현율이 높은 박테리아 유전자의 코돈 선호도에 대한 Egohigh.Cod와 같은 코돈 빈도표를 도입한 컴퓨터 알고리즘으로 결정될 수 있다. 기타 유용한 코돈 빈도표는 Celegans_high.cod, Celegans_low.cod, Drosophila_high.cod, Human_high.cod, Maize_high.cod, 및 Yeast_high.cod를 포함한다. 기타 바람직한 변이체는 상기에서 기술된 것과 같이 천연형과 비교하여 보존적 아미노산 변화를 코딩하는 것들 (예를 들어, 천연 아미노산 측쇄의 하전 또는 극성이 상이한 아미노산에 의한 치환으로 실질적으로 변화하지 않는 것) 및(또는) 신규한 글리코실화 및(또는) 인산화 부위(들)을 형성하도록 고안되었거나, 또는 존재하는 글리코실화 및(도는) 인산화 부위(들)을 결실시키도록 고안된 것들이다.
관련 단백질, 관련 펩티드, NTP 펩티드, 단편, 상동체, 변이체, 유도체 및 이들의 염이 당업계에서 통상의 기술을 가진 자들에게 공지된 통상의 펩티드 합성 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 이들 기술은 화학적 커플링 방법 (cf. Wunsch, E: "Methods der organischen Chemie", Volume 15, Band 1+2, Synthese von Peptiden, thime Verlag, Stuttgart (1974), and Barrany, G.; Marrifield, R. B.: "The Peptides", eds. E. Gross, J. Meienhofer, Volume 2, Chapter 1, pp. 1-284, Academic Press (1980)), 효소적 커플링 방법 (cf. Windmer, F. Johansen, J. T., Carlsberg Res. Commun, Vol. 44, pp. 37-46 (1979)), and Kullmann, W.: "Enzymatic Peptide Synthesis", CRC Press Inc. Boca Raton, Fla. (1987) and Windmer, F., Johansen, J.T. in "Synthetic Peptides in Biology and Medicines:, eds. Alitalo, K. Partanen, P., Vatieri, A., pp. 79-86, Elsevier, Amsterdam (1985)), 또는 공정 고안 및 경제적인 측면에서 바람직하다면, 화학적 및 효소적 방법의 결합을 포함한다. 본원에서 제시된 가이드라인을 사용하여, 당업계에서 통상의 지식을 가진 자들은 본래의 또는 천연 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드와 동일한 또는 유사한 생물학적 활성 (생활성)을 갖는 상동체를 제조하기 위해 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드의 펩티드 서열을 변화시킬 수 있다.
단백질 자체보다 소정의 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드의 모방체를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 일반적으로, 펩티드 모방체가 보다 생물학적으로 잘 이용될 수 있고, 작용이 보다 길게 지속되며, 단백질 및 펩티드를 생산하는 것보다 저렴할 수 있다.
따라서, 상기에서 기술된 관련 단백질, 관련 펩티드 및 NPT 펩티드는 유사한 생물학적 활성 및 이에 따른 유사한 치료적 유용성을 갖는 이같은 작은 화학적 화합물의 개발에 유용하다. 관련 단백질, 관련 펩티드 및 NTP 펩티드의 펩티드 모방체는 조합 화학 기술 및 당업계에 공지된 기타 기술을 사용하여 개발될 수 있다 (예를 들어, [Proceeding of the 20th European Peptide Symposium, ed. G. Jung, E. Bayer, pp. 289-336 및 위 문헌 중의 참조문헌]을 참조).
펩티드 모방체를 생성하기 위해 당업계에 공지되어 있는 펩티드를 구조적으로 개질하는 방법의 예는 D-아미노산 잔기 구조를 생성하고 (특히, N-말단에서), 활성에 불리한 영향을 주지 않고 단백질 분해에 대해 증가된 안정성을 가져오는 골격 키랄 중심의 역전을 포함한다. 그 예는 논문 ["Tritriated D-ala1-Peptide T Binding", Smith C.S et al., Drug Development Res. 15, pp. 371-379 (1988)]에 기술되어 있다.
두번째 방법은 안정성을 위해 N에서 C로 사슬간 이미드 및 락탐의 변화시키는 것과 같이 시클릭 구조를 변화시키는 것이다 (Ede et al., in Smith and Rivier (Eds.) "Peptides: Chemistry and Biology", Escom, Leiden (1991), pp. 268-270). 이 실시예는 미국 특허 제4,457,489호 (1985) (Goldstein, G. et al., 개시내용 전체가 본원에 참조문헌으로 삽입되었음)에 개시된 것과 같은 구조적으로 제한된 티모펜틴 유사 화합물 중에서 제공된다.
세번째 방법은 관련 단백질, 관련 펩티드 및 NTP 펩티드 중의 펩티드 결합을단백질 분해에 대해 내성을 부여하는 모조 펩티드 결합으로 치환하는 것이다. 일반적으로 펩티드 구조 및 생물학적 활성에 영향을 영향을 주지 않는 다수의 모조펩티드 결합이 기술되어 있다. 이러한 접근법의 한 예는 반-역 (retro-inverso) 모조펩티드 결합을 치환하는 것이다 ("Biologically active retroinverso analogues of thymopentin", Sistro A. et al. in Rivier, J. E. and Marshall, G. R. (eds) "Peptides, Chemistry, Structure and Biology", Escom, Leiden (1990), pp. 722-773) and Dalpozzo, et al. (1993), Int. J. Peptide Protein Res., 41:561-566, 본원에 참조문헌으로 삽입됨). 이 변형에 따라, 펩티드의 아미노산 서열은 하나 이상의 펩티드 결합이 반-역 모조펩티드 결합으로 치환되었다는 것만을 제외하고는 상기에서 기술된 관련 단백질, 관련 펩티드 및 NTP 펩티드의 서열과 동일할 수 있다. 바람직하게는, 대부분 N-말단 펩티드 결합이 치환되는데, 이는 이같은 치환이 N-말단에 작용하는 엑소펩티다제에 의한 단백질분해에 대해 내성을 부여하기 때문이다.
하나 이상의 감소된 반-역 모조펩티드 결합을 가진 펩티드의 합성은 당업계에 공지되어 있다 (Sisto (1990) and Dalpozzo, et al. (1993), 상기에서 언급됨). 따라서, 펩티드 결합은 펩티드 모방체가 유사한 구조를 채용하도록 허용하는, 이에 따라서 본래의 펩티드의 생물학적 활성을 허용하는 비펩티드 결합으로 치환될 수 있다. 또한, 아미노산의 화학적 기를 유사한 구조의 다른 화학적 기로치환하여 추가적인 개질을 만들 수 있다. 생물학적 활성의 감소가 전혀 또는 거의 없이 효소적 절단에 대한 안정성을 향상시키는 것으로 알려진 다른 적합한 모조펩티드 결합은 감소된 이소스테르 모조펩티드 결합이다 (Couder, et al. (1993), Int. J. Peptide Protein Res., 41:181-184, 본원에 그 전체 내용이 참조문헌으로 삽입됨). 따라서, 이들 펩티드의 아미노산 서열은 하나 이상의 펩티드 결합이 이소스테르 모조펩티드 결합으로 치환되었다는 것만을 제외하고는 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드의 서열과 동일할 수 있다. 바람직하게는, 대부분 N-말단 펩티드 결합이 치환되는데, 이는 이같은 치환이 N-말단에 작용하는 엑소펩티다제에 의한 단백질 분해에 대해 내성을 부여하기 때문이다. 하나 이상의 감소된 이소스테르 모조펩티드 결합을 가진 펩티드의 합성이 당업계에 공지되어 있다 (Couder, et al. (1993), 상기에서 언급됨). 기타 예는 펩티드 결합을 치환하기 위한 케토메틸렌 또는 메틸술파이드 결합의 도입을 포함한다.
관련 단백질, 관련 펩티드 및 NTP 펩티드의 펩토이드 유도체는 생물학적 활성을 위한 중요한 구조적 결정인자는 보유하지만, 펩티드 결합을 제거하여, 이로써 단백질 분해에 대한 내성을 부여하는 다른 종류의 펩티드 모방체를 나타낸다 (Simon, et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:9367-9371, 본원에 그 전체내용이 참조문헌으로 삽입되었음). 펩토이드는 N-치환된 글리신의 올리고머이다. 다수의 N-알킬기가 기술되었으며, 각각은 천연 아미노산의 측쇄에 상응한다 (Simon, et al. (1992), 상기에서 언급되었고, 본원에 그 전체내용이 참조문헌으로 삽입되었음). 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드의 일부 또는 전체 아미노산은 치환된 아미노산에 상응하는 N-치환된 글리신으로 치환된다.
펩티드 모방체의 개발은 본래의 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드의 3차 구조를 NMR 분광기, 결정학 및(또는) 컴퓨터 보조된 분자 모델링으로 결정하여 도움을 받을 수 있다. 이들 기술은 본래의 펩티드보다 높은 효능 및(또는) 보다 큰 생체이용도 및(또는) 보다 큰 안정성을 갖는 신규한 조성물 개발을 돕는다 (Dean (1994), BioEssays, 16:683-687; Cohen and Shatzmiller (1993), J. Mol. Graph., 11:166-173; Wiley and Rich (1993), Med. Res. Rev., 13:327-384; Moore (1994), Trends Pharmacol. Sci., 15:124-129; Hurby (1993), Biopolymers, 33:1073-1082; Bugg et al. (1993), Sci. Am., 269:92-98l; 본원에 그 전체 내용이 참조문헌으로 삽입됨).
잠재적인 펩티드 모방체 화합물이 확인되면, 이를 합성하고, 그 활성을 평가하기 위한 하기 실시예에서 기술된 방법을 사용하여 분석할 수 있다. 상기 방법에 의해 획득된, 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드의 생물학적 활성 및 유사한 3차 구조를 갖는 펩티드 모방체 화합물은 본원발명의 범위 내에 포함된다. 상기에서 기술된 하나 이상의 변형을 갖는 임의의 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드로부터 펩티드 모방체를 생성할 수 있다는 것이 당업자들에게 쉽게 이해될 것이다. 또한, 본 발명의 펩티드 모방체가 그 치료적 화합물로서의 용도와 아울러 보다 강력한 비펩티드 화합물 개발에 추가적으로 사용될 수 있다는 것이 명백할 것이다.
본원에서 기술된 관련 단백질, 관련 펩티드 및 NTP 펩티드를 합성할 수 있는 다수의 기관들이 현재 존재한다. 예를 들어, NTP 펩티드의 서열이 주어지면, 해당 기관은 펩티드를 합성하고, 첨부 서류 및 펩티드 동일성의 증거자료와 함께 합성된펩티드를 보내 줄 수 있다.
또한, 본 발명은 포유류 조직 또는 체액 샘플 중 관련 단백질, 관련 펩티드, NTP 펩티드, 관련 단백질/관련 펩티드/NTP 펩티드 DNA 또는 상응하는 RNA의 존재를 정성적으로 또는 정량적으로 시험하기 위한 분석을 위한, 관련 단백질, 관련 펩티드 및 NTP 펩티드 및 이들의 상응하는 핵산의 용도를 포함한다. 관련 단백질, 관련 펩티드, NTP 펩티드 및 이들의 상응하는 핵산 분자는 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드 또는 코딩된 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드가 생물학적 활성을 보이는지 여부와 관계없이, 이같은 분석 중 제조에서의 용도를 갖는다. 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드 핵산 서열은 포유류 조직 또는 체액 샘플 중 관련 단백질, 관련 펩티드, NTP 펩티드, 관련 단백질/관련 펩티드/NTP 펩티드 DNA 또는 상응하는 RNA의 존재를 정성적으로 또는 정량적으로 시험하기 위한 혼성화 프로브의 유용한 공급원이 될 수 있다.
그 자체로는 생물학적으로 활성이 아닌 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드는 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드를 인식 및(또는) 이들에 결합하는 항체를 제조하는 데 유용할 수 있다. 이같은 항체는 표준 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 따라서, 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드와 반응하는 항체와 아울러, 이같은 항체의 단쇄 항체 단편 및 기타 반응성 단편이 또한 본원 발명의 범위 내에서 고안될 수 있다. 항체는 폴리클로날, 모노클로날, 재조합, 키메라, 단쇄 및(또는) 양쪽 특이성일 수 있다. 일반적으로 항체 또는 이들의 단편은 사람 기원이거나, 또는 사람화, 즉, 환자에 투여되었을 때 항체에 대한 면역 반응을 방지하거나 또는 최소화하기 위해 제조될 수 있다. 바람직한 항체는 사람 항체, 폴리클로날 또는 모노클로날 중 하나일 수 있다. 항체 단편은 본원발명의 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드와 반응성인 임의의 단편, 예를 들어, Fab, Fab'등일 수 있다. 또한, 본원발명에 의해 제공되는 것은 선택된 포유동물에 임의의 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드를 제공하고, 포유동물의 세포 (예를 들어, 비장 세포)를 특정 암 세포와 융합하여 공지된 기술로 불사멸화된 세포주를 생성하여 생성되는 하이브리도마이다. 또한, 이같은 세포주 및 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드에 대한 항체를 제조하기 위해 사용된 방법도 본원발명에 포함된다.
항체는 추가적으로 체액 또는 세포 샘플 중의 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드의 존재를 탐지하기 위해 예를 들어, 표지화된 형태로, 생체내 및 시험관내 진단 또는 연구 목적을 위해 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 하나 이상의 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드의 체액 또는 세포 샘플 중의 관련 단백질, 관련 펩티드, NTP 펩티드, 관련 단백질/관련 펩티드/NTP 펩티드 DNA 또는 상응하는 RNA의 존재를 정성적으로 또는 정량적으로 시험하는 분석 중 검정 표준으로 용도를 포함한다.
본원발명은 세포의 제거, 예를 들어, 양성 및 악성 암종, 샘종 (예를 들어, 전립샘) 증식, 바람직하지 못한 안면 털, 사마귀 및 바람직하지 못한 지방 조직의 제거를 요구하는 증상의 신규 치료 방법에 관한 것이다. 이같은 방법은 치료를 필요로 하는 포유동물에게 치료적으로 유효한 양의 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드를 투여하는 것을 포함한다.
증상은 예를 들어, 폐, 가슴, 위, 췌장, 전립샘, 방광, 뼈, 난소, 피부, 신장, 누(瘻), 결장, 창자, 위, 직장, 식도, 혈액, 뇌 및 그 덮개, 척수 및 그 덮개, 근육, 결합 조직, 부신, 부갑상샘, 갑상샘, 자궁, 고환, 뇌하수체, 생식 기관, 간, 담낭, 눈, 귀, 코, 목, 편도, 입, 림프절 및 림프계 및 기타 기관의 종양일 수 있다.
본원에서 사용된 것과 같이, "악성 종양"이란 분화가 잘 일어나지 않았거나, 중간정도로 분화되었거나 잘 분화된 형태에서 일어나는 사람 암종, 육종 및 흑색종의 모든 형태를 포함하도록 의도되었다.
본 발명은 보다 위험이 적고, 수술의 바람직하지 못한 부작용이 보다 적은 양성 종양을 제거할 수 있는 치료법에 대한 당업계의 요구를 만족시킨다. 몸 깊은 곳에 위치한 (예를 들어, 뇌, 심장, 폐 및 기타) 수술하기 위험한 부위의 양성 종약을 제거하는 방법이 특히 요구된다.
세포가 제거되어야 하는 증상의 치료 방법은 이같은 증상을 치료하기 위한 통상의 방법, 예를 들어, 수술적 절제, 화학요법 및 방사선과 결합하여 사용될 수 있다. 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드는 이같은 통상의 치료법 전, 실시 중, 또는 후에 투여될 수 있다.
또한, 치료되어야 할 증상은 폐, 가슴, 위, 십이지장, 전립선, 방광, 뼈, 난소, 피부, 신장, 누, 결장, 창자, 위, 직장, 식도, 혈액, 뇌 및 그 덮개, 척수 및그 덮개, 근육, 결합 조직, 부신, 부갑상샘, 갑상샘, 자궁, 고환, 뇌하수체, 생식 기관, 간, 담낭, 눈, 귀, 코, 목, 편도, 입, 림프절 및 림프계로 이루어지는 군으로부터 선택되는 조직의 증식증, 비대 또는 과도발육일 수 있다.
본 발명의 방법을 사용하여 치료될 수 있는 기타 질환은 폐, 가슴, 위, 십이지장, 전립선, 방광, 뼈, 난소, 피부, 신장, 누, 결장, 창자, 위, 직장, 식도, 혈액, 뇌 및 그 덮개, 척수 및 그 덮개, 근육, 결합 조직, 부신, 부갑상샘, 갑상샘, 자궁, 고환, 뇌하수체, 생식 기관, 간, 담낭, 눈, 귀, 코, 목, 편도, 입, 림프절 및 림프계로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 바이러스, 박테리아 또는 기생충에 의해 변형된 조직일 수 있다.
또한, 치료되어야 하는 증상은 폐, 가슴, 위, 십이지장, 전립선, 방광, 뼈, 난소, 피부, 신장, 누, 결장, 창자, 위, 직장, 식도, 혈액, 뇌 및 그 덮개, 척수 및 그 덮개, 근육, 결합 조직, 부신, 부갑상샘, 갑상샘, 자궁, 고환, 뇌하수체, 생식 기관, 간, 담낭, 눈, 귀, 코, 목, 편도, 입, 림프절 및 림프계로 이루어지는 군으로부터 선택되는 조직의 기형 또는 장애일 수 있다.
특히, 치료되어야 하는 질환은 편도 비대, 전립성 증식증, 건선, 습진, 피부염 또는 치질일 수 있다. 치료되어야 하는 질환은 죽상경화증 또는 동맥경화증과 같은 맥관 질환 또는 정맥류와 같은 맥관 질환이다. 또한, 치료되어야 하는 질환은 피부, 눈, 귀, 코, 목, 입, 근육, 결합 조직, 모발 또는 가슴 조직에 대한 미용적 변형이다.
관련 단백질, 관련 펩티드 및(또는) NTP 펩티드의 치료적 조성물은 본 발명의 범위 내에 있다. 이같은 조성물은 제약학적으로 허용가능한 담체와 혼합된 치료적 유효량의 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드를 포함할 수 있다. 담체 물질은 주사용 물, 바람직하게는 포유동물에게 투여하기 위한 용액에서 흔히 사용되는 기타 물질로 보충된 것일 수 있다. 일반적으로, 치료적 용도의 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드는 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제와 함께 정제된 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드를 포함하는 조성물 형태로 투여될 것이다. 중성 완충용액 염수 또는 혈청 알부민과 혼합된 염수가 대표적인 적절한 담체이다. 바람직하게는, 제품은 적절한 부형제 (예를 들어, 자당)을 사용하여 동결건조물로 제제화된다. 기타 표준적인 담체, 희석제 및 부형제가 목적한 대로 포함될 수 있다. 약 7.0-8.5의 pH를 갖는 트리스 (Tris) 완충용액, 또는 약 4.0-5.5의 pH를 갖는 아세테이트 완충용액을 포함하는, 적절한 범위의 pH 값을 가진, 당업자들에게 공지된 완충용액을 포함하는 조성물은 추가로 소르비톨 또는 이들에 대한 적합한 치환물을 포함할 수 있다.
바람직하지 않은 세포내 성분을 표적화하는, 항체, 항체 단편, 항체 유사 분자, 또는 세포내 수용체, 시그날 펩티드 또는 과발현된 효소와 같이 특정 암 마커에 대해 높은 친화도를 가진 분자에 콘쥬게이트되거나, 연결되거나 또는 결합된 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드의 용도가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 항체, 항체 단편, 항체 유사 분자, 또는 특정 암 마커에 대해 높은 치환도를 가진 분자가 특정 세포내 또는 조직 표적물에 대해 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드를 표적화하기 위해 사용된다. 예를 들어, 특이한 표면 항원 또는 발현된항원을 갖는 종양이 항체, 항체 단편, 또는 항체 유사 결합 분자로 표적화될 수 있고, 종양 세포들은 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드로 죽일 수 있다. 항체 표적화를 사용하는 이같은 접근법은 투여량을 감소시키고, 표적세포로의 결합 가능성 및 표적세포에 의한 흡수 가능성을 높이고, 전이 종양 및 미세한 크기의 종양을 표적화하고 치료하는 유용성을 증가시키는 장점을 기대할 수 있다.
또한, 본 발명은 종양 또는 기타 바람직하지 못한 세포들을 표적화하는 암 또는 위치 특이적 효소 또는 프로테아제에 의해 또는 항체 콘쥬게이트에 의해 암 또는 기타 바람직하지 않은 세포 위치(들) 또는 그 근방에서 절단되어, 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드를 암 또는 기타 바람직하지 않은 세포 위치(들) 또는 그 근방에서 방출하는 조성물을 형성하는, 단백질 또는 기타 분자에 콘쥬게이트되거나 또는 연결되거나 또는 결합된 관련 단백질, 관련 펩티드 및 NTP 펩티드의 용도를 포함한다.
또한, 본 발명은 치료되어야 하는 조직을 빛 (레이저 치료법 또는 기타 광-역학 또는 광-활성 치료법에서와 같이), 다른 형태의 전-자기 방사선, 예를 들어, 적외선, 자외선, x-선 또는 감마선 방사선, 국부적 열, 알파 또는 베타 방사선, 초음파 방출 또는 기타 공급원의 국부적 에너지에 노출시켰을 때, 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드 또는 기타 생물학적으로 활성인 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드의 단편을 방출하는 조성물을 형성하기 위한, 단백질 또는 기타 분자에 콘쥬게이트되거나, 연결되거나 또는 결합된 관련 단백질, 관련 펩티드 및 NTP 펩티드의 용도를 포함한다.
관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드는 단독으로, 함께, 또는 치료되는 증상에 적절하다면, 다른 제약학적 조성물, 예를 들어, 사이토킨, 성장 인자, 항생제, 세포자멸사-유도제, 소염제 및(또는) 화학치료제와 함께 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드 및(또는) 그의 상응하는 DNA 분자가 그 자체로 또는 종양 특이적 마커와 같은 다른 분자 물질과 함께 중합체 또는 고분자에 콘쥬게이트되거나, 결합되거나 또는 포함되는, 덴드리머, 플러렌 및 기타 합성 분자를 사용하는 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드의 치료적 조성물을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 제5,714,166호 "Bioactive and/or Targeted Dendrimer Conjugates"는 표적 지시기(들)을 갖는 하나 이상의 덴드리머 및 여기에 콘쥬게이트된 하나 이상의 생활성 물질로 구성된 수지상 중합체 콘쥬게이트의 제조 및 사용 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드 및(또는) 유전자 및 약물 전달 비히클, 예를 들어, 액상 에멀젼, 미셀 중합체, 중합체 마이크로스피어, 전기활성 중합체, 수화겔 및 리포좀의 치료적 조성물을 포함한다.
또한, 바람직하지 않은 세포에 전달되는 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드 또는 동족 유전자 또는 유전자 등가물의 용도가 본 발명에 포함된다. 암 내에서 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드의 과발현이 암 중의 세포가 사멸하도록 유도하고, 이에 따라 암 세포 개체수를 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 바람직하지 않은 세포 성분을 치료하기 위한 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드의 유전자 또는 유전자 등가물의 전달은 보다 적은 양의 투여량을 요구하고,표적 세포내 성분의 세포내 자손에 전달되므로, 보다 적은 수의 치료 및 보다 적은 전체 치료를 요구한다는 이점을 가진다. 또한, 본 발명은 유전자 발현 및 융합 단백질의 생성 및(또는) 분비 후, 융합 단백질이 천연 효소 또는 프로테아제, 또는 전구약물에 의해 절단되어 바람직하지 않은 세포 위치 또는 그 근방에서 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드를 방출하는, 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드를 함유하는 융합 단백질을 코딩하는 유전자의 바람직하지 않은 세포 또는 이웃한 세포로의 전달을 포함한다.
또한, 클로닝된 재조합 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드 항체 콘쥬게이트; 클로닝된 재조합 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드 항체 단편 콘쥬게이트; 및 클로닝된 재조합 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드 항체 유사 단백질 콘쥬게이트도 본 발명에 포함된다. 표적 콘쥬게이트 (예를 들어, 항체, 항체 단편, 항체 유사 분자, 또는 암 특이적 수용체 또는 기타 종양 마커에 대해 높은 친화도를 갖는 분자)와 결합된 클로닝된 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드의 이점은 이같은 분자가 클로닝된 컨쥬게이트 분자의 제조 및 표준화된 생성에 대한 이점 외에 상기에서 기술된 표적화 장점을 결합한다는 데 있다.
경구 투여용 고형 투여 형태는 캡슐, 정제, 환약, 분말 및 과립을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 이같은 고형 투여 형태에서, 활성 화합물은 바람직하게는 하나 이상의 다음 성분들과 혼합된다: (a) 하나 이상의 비활성 부형제 (또는 담체), 예를 들어, 시트르산나트륨 또는 인산이칼슘, (b) 충진제 또는 증량제, 예를 들어, 전분, 유당, 자당, 포도당, 만니톨 및 규산; (c) 결합제, 예를 들어,카르복시메틸셀룰로오스, 알지네이트, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈, 자당 및 아카시아; (d) 습윤제, 예를 들어, 글리세롤; (e) 붕해제, 예를 들어, 아가-아가, 탄산칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정 복합 실리케이트, 및 탄산나트륨; (f)용액 지연제, 예를 들어, 파라핀; (g) 흡수 가속화제, 예를 들어, 4차 암모늄 화합물; (h) 습윤제, 예를 들어, 아세틸 알콜 및 글리세롤 모노스테아레이트; (i) 흡수제, 예를 들어, 카올린 및 벤토나이트; 및 (j) 윤활유, 예를 들어, 활석, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고형 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 라우릴 술페이트, 또는 이들의 혼합물. 캡슐, 정제, 및 환약의 경우, 투여 형태는 완충제도 포함할 수 있다.
경구 투여용 액상 투여 형태는 제약학적으로 허용되는 에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르를 포함한다. 활성 화합물과 아울러, 액상 투여 형태는 당업계에서 흔히 사용되는 비활성 희석제, 예를 들어, 물 또는 기타 용매, 가용화제 및 에멀젼화제를 포함할 수 있다. 예시적인 에멀젼화제는 에틸 알콜, 이소프로필 알콜, 에틸 카르보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 디메틸포름아미드, 오일, 예를 들어, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수배 오일, 올리브 오일, 피마자유, 및 참깨 오일, 글리세롤, 테트라히드로푸르푸릴 알콜, 폴리에틸렌글리콜, 소르비탄의 지방산 에스테르, 또는 이들 물질의 혼합물 등을 포함할 수 있다.
이같은 비활성 희석제 외에, 조성물은 또한 애주번트, 예를 들어, 습윤화제, 에멀젼화제 및 현탁제, 감미제, 향료 및 방향제를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물 중 활성 성분의 실제 투여 수준은 특정 조성물 및 투여 방법에 대한 목적한 치료적 효과를 얻도록 효과적인 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드의 양을 얻도록 변화될 수 있다. 따라서, 선택된 투여량 수준은 목적한 치료적 효과, 투여 경로, 목적한 치료 지속기간 및 기타 요소에 따라 달라질 것이다.
사람을 포함한 포유동물에서, 유효량은 몸 표면적 기준으로 투여될 수 있다. 다양한 크기, 종의 동물 및 사람에 대한 투여량의 상호 관계 (mg/M2몸 표면 기준)는 문헌 [E. J. Freireich et al., Cancer Chemother. Res., 50(4):219(1966)]에 기술되어 있다. 몸 표면적은 개체의 키 및 체중으로부터 대략적으로 결정될 수 있다 (Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardsley, N.Y.pp. 537-538 (1970) 참조).
숙주에게 투여되는 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드의 총 일일 투여량은 단일 또는 분할된 투여량일 수 있다. 투여량 단위 조성물은 일일 투여량으로 제조되도록 사용되도록 이들 서브멀티플의 이같은 양을 포함할 수 있다. 그러나, 임의의 특정 환자에 대한 특정 투여량 수준은 체중, 일반적 건강, 성, 음식, 시간 및 투여 경로, 투여되는 약의 효능, 흡수 및 분비율, 다른 약물과의 배합 및 치료되는 특정 질환의 심도를 포함하는 다수의 인자에 따라 달라질 것이다.
본 발명에 따른 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드 조성물을 투여하는 방법은 화합물을 근육내로, 구강으로, 정맥내로, 복강내로, 뇌내로 (유조직내로), 뇌내심실내로, 종양내로, 병변내로, 피내로, 경막내로, 비강내로, 눈속으로, 동맥내로, 국부적으로, 경피내로, 에어로졸로, 주입으로, 일시 주사로, 이식 기구로, 지속성 약물 방출 시스템 등으로 투여하는 것을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드의 다른 투여 방법은 경피적 경로에 의한 것이다. 이같은 실시태양의 한 예는 패치의 사용이다. 특히, 패치는 예를 들어, 디메틸술폭사이드 (DMSO) 또는 목화씨 오일과 DMSO의 혼합물 중의 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드의 미세 현탁액을 사용하여 제조될 수 있고, 이를 종양이 있는 포유동물의 피부를 종양 부위로부터 떨어진 피부 낭 중에서 접촉시킬 수 있다. 기타 매질 또는 이들과 다른 용매의 혼합물 및 고형 지지물이 동일하게 우수하게 작용한다. 패치는 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드 화합물을 용액 또는 현탁액 형태로 포함할 수 있다. 이어서, 예를 들어 바늘, 클립 또는 다른 지지 기구에 의해 피부를 접고 지지하여 형성된 환자의 피부 주머니 안에 패치를 삽입하여 패치를 환자의 피부에 도포할 수 있다. 이 피부 주머니는 포유 동물의 간섭 없이 계속하여 피부와 접촉되도록 사용하여야 한다. 피부 주머니를 사용하는 것 외에, 패치가 피부와 단단히 접촉되도록 하는 어떠한 기구도 사용할 수 있다. 예를 들면, 접착 밴드를 사용하여 패치가 피부 위에 지지되도록 할 수 있을 것이다.
관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드를 지속 방출 조성물 또는 제제로 투여할 수 있다. 지속 방출 제제의 적절한 예에는 형태를 갖춘 제품, 예컨대 필름또는 마이크로캡슐의 형태로 된 반투과형 중합체 매트릭스가 포함된다. 지속 방출 매트릭스에는 폴리에스테르, 하이드로겔, 폴리악티드[US 3,773,919, EP 58,481], L-글루탐산과 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체[시드만(Sidman) 등, Biopolymers, 22: 547-556 (1983)], 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트)[랑어 (Langer), Chem. Tech., 12: 98-105 (1982)], 에틸렌 비닐 아세테이트[랑어 등, 상기 문헌] 또는 폴리-D(-)-3-히드록시부티르산[EP 133,988]이 포함된다. 지속 방출 조성물에는 리포좀도 포함될 수 있는데, 리포좀은 당업계에 알려진 여러가지 방법들 중 하나로 제조할 수 있다[예컨대, 엡스타인(Eppstein) 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-3692 (1985); EP 36,676; EP 88,046; 및 EP 143,949].
본 발명의 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드를 투여하는 또다른 방법은 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드를 치료할 종양 또는 다른 조직 안에 직접 또는 간접 주입하는 것이다. 그런 구체예의 한 예는 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드를 치료할 종양 또는 다른 조직 안에 직접 주사하는 것이다. 치료는 1회 주사, 한번에 수회 주사, 또는 생체 검사, 이미징 또는 조직 성장을 모니터하는 다른 방법에 의해 치료하는 종양 또는 다른 조직의 퇴화 또는 파괴를 모니터하면서 여러 시간, 날 또는 달에 걸쳐 일련의 주사를 할 수 있다. 코, 입, 귀, 자궁, 직장 또는 요도와 같은 구멍 안으로 또는 절개를 통해 생체내 종양 또는 조직에 도달하도록 삽입된 기구에 의해, 또는 초음파 또는 파이버 옵틱 스코프(fiber optic scope)와 같은 이미징 또는 광학 시스템을 함께 사용하여 적절한 주사 지점을 찾아 치료할 종양 또는 다른 조직 안에 주사할 수 있다. 그런 구체예의 또다른 예는 시간 경과에 따라 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드를 지속적으로 주입할 수 있는 기구를 이용하는 것이다.
본 발명의 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드를 투여하는 또다른 방법은 제거하거나 파괴할 필요가 있거나 원하는 종양 또는 다른 조직 또는 세포 성분을 물리적으로 절개하거나 제거하거나 다른 방법으로 없애거나 파괴하는 데 사용하는 수술 또는 그와 유사한 방법을 함께 사용하는 것으로서, 종양 또는 다른 조직이 제거된 영역 바로 주위에 본 발명의 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드를 투여하여 상기 방법에 의해 제거되거나 파괴되지 않은 임의의 종양 세포 또는 다른 세포 성분을 파괴하거나 그 성장을 저해한다.
본 발명의 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드를 투여하는 또다른 방법은 치료할 종양 또는 다른 조직 안에 기구를 이식하는 것이다. 그런 구체예의 한 예는 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드를 함유하는 웨이퍼를 치료할 종양 또는 다른 조직 안에 이식하는 것이다. 웨이퍼는 치료양의 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드를 시간이 지남에 따라 조직 안에 방출한다. 추가로 다른 방법으로서, 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드가 흡수된 멤브레인, 스폰지, 또는 다른 적절한 물질을 감염된 영역 안에 이식하여 조성물을 투여할 수 있다. 이식 기구를 사용하는 경우, 임의의 적합한 조직 또는 기관 안에 기구를 이식할 수 있고, 환약을 통해, 또는 연속 투여를 통해, 또는 연속 주입을 이용한 카테터를 통해, 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드를 장치를 통해 직접 송달할 수 있다.
다른 투여 방법으로서, 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드를 코딩하는 유전자의 복제물을 1 이상 표적 세포 안에 도입하고, 필요하다면, 상기 유전자의 복제물이 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드를 세포내에서 생성을 시작하도록 유발하는 것이다. 유전자 치료를 적용할 수 있는 한가지 방법은 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드를 코딩하는 유전자(관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드를 코딩하는 게놈 DNA, cDNA, 및/또는 합성 DNA, 또는 그의 단편, 변이체, 상동체 또는 유도체)를 이용하는 것으로서, 상기 유전자는 수술에 의해 구성적 또는 유발성 프로모터에 연결되어 유전자 치료 DNA 구성체를 형성할 수 있다. 상기 프로모터는 상기 구성체가 삽입될 세포 또는 조직 형태에서 활성을 갖는다면 내생적 관련 단백질-, 관련 펩티드- 또는 NTP 펩티드-코딩 유전자에 상동 또는 이종일 수 있다. 상기 유전자 치료 DNA 구성체의 다른 성분들에는, 위치 특이적 통합을 위해 설계된 DNA 분자(예컨대, 상동성 재조합에 유용한 내생적 측면 서열), 조직 특이적 프로모터, 증강제 또는 억제제, 모세포에 대한 선택적 잇점을 제공할 수 있는 DNA 분자, 형질전환된 세포를 확인하는 라벨로서 유용한 DNA 분자, 음성 선택 시스템, 세포 특이적 결합제(예컨대, 세포 표적을 위한 것), 세포 특이적 내면화 인자, 및 벡터에 의한 발현을 촉진하는 전사 인자, 및 벡터 생산을 할 수 있게 하는 인자가 임의적으로 필요한 대로 포함될 수 있다.
유전자를 생체내 또는 생체외 세포 또는 조직에 송달하는 수단에는 날 DNA의 직접 주사, 발리스틱(ballistic) 방법, 리포좀 매개 전달, 수용체 매개 전달(리간드-DNA 컴플렉스), 일렉트로포레이션(electroporation), 및 인산칼슘 침전이 포함되며(하지만 여기에 한정되는 것은 아니다), 이들은 예를 들어 US 4,970,154, WO 96/40958, US 5,679,559, US 5,676,954, 및 US 5,593,875에 개시되어 있다. 이들 문헌의 개시 내용은 본원에 그대로 참고로 인용한다. 상기 수단에는 또한 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 수두 바이러스, 렌티바이러스, 유두종 바이러스 또는 단순 헤르페스 바이러스와 같은 바이러스 벡터의 이용, DNA-단백질 콘쥬게이트의 이용, 및 리포좀의 이용이 포함된다. 유전자 치료 벡터의 이용은 예컨대 US 5,672,344, US 5,399,346, US 5,631,236, 및 US 5,635,399에 기재되어 있으며, 이들 문헌의 개시 내용은 본원에 그대로 참고로 인용한다.
관련 단백질-, 관련 펩티드- 또는 NTP 펩티드-코딩 유전자는, 본 명세서에 설명된 것과 같은 방법을 이용하여 관련 단백질, 관련 펩티드 또는 NTP 펩티드, 또는 그의 단편, 변이체, 상동체 또는 유도체를 발현 또는 분비하도록 생체외에서 유전학적으로 설계된 일정한 세포를 환자에게 이식함으로써 송달될 수 있다. 그러한 세포는 동물 또는 인간 세포일 수 있고, 환자 자신의 조직으로부터 또는 인간 또는 비인간의 또다른 제공원으로부터 유도될 수 있다. 임의적으로, 세포는 불멸하게 한 것이거나 줄기 세포(stem cell)일 수 있다. 하지만, 면역학적 반응의 가능성을 줄이기 위해, 세포를 캡슐화하여 주위 조직의 침투를 피하는 것이 바람직하다. 캡슐화 물질은 단백질 생성물은 방출되도록 하지만 환자의 면역계에 의한 또는 주위 조직으로부터의 다른 유해 인자에 의한 세포의 파괴는 방지할 수 있는 생체적합성의 반투과성 중합체 봉합물 또는 멤브레인이 통상적이다. 세포의 멤브레인 캡슐화에 사용되는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있고, 캡슐화된 세포의 제조 및 환자에의 이식은 과도한 실험 없이 달성할 수 있다. 예를 들면, US 4,892,538; US 5,011,472; 및 5,106,627을 참조하며, 그 개시 내용은 본원에 그대로 참고로 인용한다. 생존 세포의 캡슐화 시스템은 PCT WO 91/10425에 기재되어 있으며, 그 개시 내용은 본원에 그대로 참고로 인용한다. 리포좀 담체, 생-침식가능한 입자 또는 비드와 같은 여러 가지 다른 지속 또는 제어 송달 수단의 제조 기술도 당업자에게 알려져 있다. 예컨대, US 5,653,975에 기재되어 있으며, 그 개시 내용은 본원에 그대로 참고로 인용한다. 캡슐화되거나 되지 않은 세포는 환자의 적합한 신체 조직 또는 기관 내에 이식될 수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이지만, 본 발명이 이 실시예에 기재된 구체적인 조건이나 상세 내용에 한정되는 것은 아니다. 명세서 전반에 걸쳐, 미국 특허를 비롯한 공중이 입수가능한 문헌에 대한 임의의 모든 참고는 구체적으로 참고로 인용한다.
특히, 본 발명은 계속 중인 미국 특허 출원 제10/092,934호, "신경사 단백질을 이용한 종양 및 관련 질환의 치료 방법"에 포함된 실시예들을 명시적으로 참고로 인용한다. 위 문헌은 전체 AD7c-NTP 단백질이 신경교종 및 뉴로블라스토마 세포 배양물에서의 생체외 세포사 및 보통의 설치류 근육 조직, 피하 결합 조직, 및 피부에서의 생체내 세포사, 및 설치류 모델에서의 유방 암종, 피부 암종 및 유두종, 결장 암종, 뇌 신경교종 등을 비롯한 여러 가지 상이한 인간 및 비인간 기원의 종양에서의 세포사를 일으키는 데 효과적인 약제임을 보여준다. 본 발명은 또한미국 특허 출원 제10/153334호에 포함된 실시예들을 명시적으로 참고로 인용한다. 위 문헌은 NTP 펩티드가 보통의 설치류 근육 조직, 피하 결합 조직, 피부 및 다른 조직에서의 생체내 세포사를 일으키는 데 효과적인 약제임을 보여준다.
실시예 1
이 실시예의 목적은 주사 지점에서 NTP 펩티드 #6의 조직에 대한 영향을 측정하는 것이다.
스프라그-돌리 수컷 래트(체중 300 그램 범위)를 에테르로 마취시키고 전립선을 개방 수술 시각화한 후 NTP 펩티드 #6을 전립선 내 주입하였다. 주사는 PBS pH 7.4 중 1 mg/ml의 NTP 펩티드 #6 300 ㎕(1.0 mg/kg)(n=8), PBS 단독의 대조군 주사(n=6), 및 주사하지 않는 대조군(n=2)으로 구성되었다. 72 시간 후 래트를 고통없이 죽였다. 전립선 분비선을 절개하고, 24 시간 동안 10% 완충 포르말린에 두고, 파라핀에 파묻고, 자르고, H & E로 염색하였다. 각 개체에 대해, 전체 전립선 분비선을 파묻고 잘랐다. 각 전립선에 대해, 4개 이상의 조직학적 섹션을 검사하였고, 각 조직학적 섹션에 대해, 2개의 단면 직경(D)을 서로로부터 90˚에서 측정하였다(전립선 당 총 ≥8 측정). 각 전립선에 대한 이들 측정값으로부터 얻은 평균 직경을 사용하여 V = (4/3)(D/2)3에 따른 부피를 추정하였다.
결과: NTP 펩티드 #6가 주사된 래트의 전립선 부피 감소는 대조군에 비해 평균 45%로 추정되었다(대조군 PBS 주사 단독과 주사하지 않은 대조군 사이에 눈에 띨 만한 차이는 없었다). 처리된 래트 전립선은 분비선 상피의 광범위한 손실, 평활화 및 위축을 보였다. PBS pH 7.4 중의 NTP 펩티드 #6를 래트 전립선 안에 1.0 mg/kg 개방 주입하면 처리되지 않은 또는 PBS 처리된 대조군에 비해 72 시간 후 대략 >40%의 전립선 부피 감소를 일으켰다.
실시예 2
이 실시예의 목적은 주사 지점에서 NTP 펩티드 #7의 조직에 대한 영향을 측정하는 것이다.
4 마리의 보통 래트에 대해, 피부 및 피하의 각각 4개의 상이한 병소에, 및 극도로 골격같은 근육에, 각각 2개의 상이한 병소에, 식염수 중의 NTP 펩티드 #7을 0.1-1 mg/mL의 농도로 100 내지 400 mL의 양으로 플라스틱 주사기로부터 스테인레스 스틸 26 게이지 바늘을 통해 송달하였다.
개체들을 24 시간 동안 관찰하고 24 시간 경과 시점에 고통없이 죽였다. 개별 침입 병소를 절개하고, 10% 포르말린에 두고, 파라핀에 파묻고, 염색한 후, 표준 조직병리학적 방법에 의하여 검사하였다.
대조군은 식염수만 투여받았다.
결과: NTP 펩티드 #7을 주사하자 주사 지점에서 조직의 급성 괴저가 발생하였다. NTP 펩티드 #7가 주사된 지점에서 근육 조직, 피하 결합 조직 및 피부의 괴저가 명백하였다. 괴저는 주사 부위와 관련되었고, 주사 지점에서 멀리까지 퍼지지는 않는 것으로 보였다.
가벼운 염증 부위는 차치하고, 대조군은 괴저나 세포 손실의 증거를 보이지 않았다. 대조군은 극미한 근육 변화만 보이거나 아예 없었다. 대조군 주사액은주사 지점에서 경증 내지 극미한 급성 염증 및 바늘에 의한 병소 미세출혈을 보였다.
실시예 3
이 실시예의 목적은 주사 지점에서 관련 펩티드 #1의 조직에 대한 영향을 측정하는 것이다.
상기 실시예 2에서와 같이 래트의 피부 및 피하에 관련 펩티드 #1을 주사하였다.
개체들을 24 시간 동안 관찰하고 24 시간 경과 시점에 고통없이 죽였다. 조직을 절개하고, 10% 포르말린에 두고, 파라핀에 파묻고, 염색한 후, 표준 조직병리학적 방법에 의하여 검사하였다.
대조군은 실시예 2와 같았다.
결과: 관련 펩티드 #1을 주사하자 주사 지점에서 세포사 및 조직 괴저가 발생하였다. 상기 실시예 2와 유사하게, 관련 펩티드 #1을 주사한 지점에서 근육 조직, 피하 결합 조직, 및 피부에 세포사가 존재하였다.
가벼운 염증 부위는 차치하고, 대조군은 괴저나 세포 손실에 관한 극미한 증거를 보였다. 대조군 주사액은 주사 지점에서 극미한 급성 염증을 보였고 바늘에 의한 병소 미세출혈을 가끔 보였다.
실시예 4
이 실시예의 목적은 주사 지점에서 관련 펩티드 #2의 조직에 대한 영향을 측정하는 것이다.
스프라그-돌리 수컷 래트(체중 300 그램 범위)를 에테르로 마취시키고 전립선을 개방 수술 시각화한 후 관련 펩티드 #2를 전립선 내 주입하였다. 주사는 PBS pH 7.4 중 1 mg/ml의 관련 펩티드 #2 300 ㎕(1.0 mg/kg)(n=8), PBS 단독의 대조군 주사(n=6), 및 주사하지 않는 대조군(n=2)으로 구성되었다. 72 시간 후 래트를 고통없이 죽였다. 전립선 분비선을 절개하고, 24 시간 동안 10% 완충 포르말린에 두고, 파라핀에 파묻고, 자르고, H & E로 염색하였다. 각 개체에 대해, 전체 전립선 분비선을 파묻고 잘랐다. 각 전립선에 대해, 4개 이상의 조직학적 섹션을 검사하였고, 각 조직학적 섹션에 대해, 2개의 단면 직경(D)을 서로로부터 90˚에서 측정하였다(전립선 당 총 ≥8 측정). 각 전립선에 대한 이들 측정값으로부터 얻은 평균 직경을 사용하여 V = (4/3)(D/2)3에 따른 부피를 추정하였다.
대조군은 실시예 1과 같았다.
결과: 상기 실시예 1에서와 같이, 관련 펩티드 #2를 주사하면 72 시간 후 전립선에 상당한 세포 손실 및 위축을 일으켰다. 대조군은 극미한 변화를 보이거나 변화가 없었으며, 변화는 바늘에 의한 경증 병소 염증으로 이루어졌다.
실시예 5
이 실시예의 목적은 주사 지점에서 관련 펩티드 #3의 조직에 대한 영향을 측정하는 것이다.
상기 실시예 1 및 4에서와 같이 보통의 래트의 전립선에 관련 펩티드 #3을 주사하였다. 72 시간 후 래트를 고통없이 죽이고 그 전립선 분비선을 상기 실시예1 및 4에서와 같이 검사하였다.
결과:72 시간 후 전립선의 상당한 세포 손실 및 위축이 나타났지만, 대조군에서는 극미한 변화만 있었다.
* * * *
본 발명을 특히 바람직한 구체예 및 실시예를 참고로 하여 설명하였지만, 당업자는 본 발명의 사상과 범위를 벗어나지 않고 여러 가지 변형을 가할 수 있다는 점을 이해할 것이다.

Claims (46)

  1. SEQ ID 10번 내지 124번으로 이루어진 군의 1 이상으로부터 선택된 펩티드.
  2. 제1항에 따른 펩티드 1 이상 및 그의 담체를 포함하는 조성물.
  3. 제1항에 따른 펩티드의 상동체, 유도체, 단편 또는 변이체를 포함하는 단백질.
  4. 제1항에 따른 펩티드의 아미노산 서열을 기준으로 역-D 순의 아미노산을 포함하는 단백질.
  5. 펩티드의 3' 또는 5' 말단의 측면에 위치하는 1 내지 25 개의 추가 아미노산으로 변형된, 제1항에 따른 펩티드를 포함하는 단백질.
  6. 제1항에 따른 펩티드를 2 이상 포함하는 단백질.
  7. 제1항에 따른 펩티드를 2 반복 이상 포함하는 단백질.
  8. 제1항에 따른 펩티드의 모방체.
  9. 항체, 항체의 단편 또는 유사 항체 분자에 융합된 제1항에 따른 펩티드를 포함하는 단백질.
  10. 제1항에 따른 펩티드, 및 그의 상동체, 단편 및 변이체에 상응하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산.
  11. 제10항에 따른 핵산 1 이상 및 그의 제약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
  12. 제1항에 따른 펩티드의 아미노산 서열의 일부분에 상응하는 아미노산 서열을 1 이상 포함하는 펩티드.
  13. 제12항에 따른 펩티드 1 이상 및 그의 담체를 포함하는 조성물.
  14. 제12항에 따른 펩티드의 상동체, 유도체, 단편 또는 변이체를 포함하는 펩티드.
  15. 제12항에 따른 펩티드의 아미노산 서열을 기준으로 역-D 순의 아미노산을 포함하는 펩티드.
  16. 펩티드의 3' 또는 5' 말단의 측면에 위치하는 1 내지 25 개의 추가 아미노산으로 변형된, 제12항에 따른 펩티드를 포함하는 펩티드.
  17. 제12항에 따른 펩티드를 2 이상 포함하는 펩티드.
  18. 제12항에 따른 펩티드를 2 반복 이상 포함하는 펩티드.
  19. 제12항에 따른 펩티드의 모방체.
  20. 항체, 항체의 단편 또는 유사 항체 분자에 융합된 제12항에 따른 펩티드를 포함하는 펩티드.
  21. 제12항에 따른 펩티드에 상응하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산.
  22. 제21항에 따른 핵산 1 이상 및 그의 제약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
  23. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 펩티드, 모방체, 핵산, 또는 조성물을 필요한 포유류에게 치료 유효량 투여하는 것을 포함하는, 세포의 제거 또는파괴를 필요로 하는 환자의 질병을 치료하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 투여가 경구, 피하, 피내, 비강내, 정맥내, 근육내, 척수강내, 비강내, 종양내, 국부, 및 경피 투여로 이루어진 군으로부터 선택된 방법을 포함하는 것인 방법.
  25. 제23항에 있어서, 외과 절제, 이식, 그라프팅, 화학요법, 면역요법, 백신 접종, 열 또는 전기 절제, 냉동 요법, 레이저 요법, 광요법, 유전자 요법, 및 방사요법으로 이루어진 군으로부터 선택된 치료법으로 환자를 치료하기 전에, 치료하는 중에, 또는 치료한 후에 치료제를 투여하는 방법.
  26. 제23항에 있어서, 질병이, 폐, 가슴, 위, 췌장, 전립선, 방광, 뼈, 난소, 피부, 신장, 공동, 결장, 장, 위, 직장, 식도, 심장, 비장, 침샘, 혈액, 뇌 및 그의 외피, 척수 및 그의 외피, 근육, 결합 조직, 부신, 부갑상선, 갑상선, 자궁, 고환, 뇌하수체, 생식 기관, 간장, 쓸개, 눈, 귀, 코, 목, 편도선, 입, 임파절, 및 임파 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된 조직의 양성 또는 악성 종양인 방법.
  27. 제23항에 있어서, 질병이, 폐, 가슴, 위, 췌장, 전립선, 방광, 뼈, 난소, 피부, 신장, 공동, 결장, 장, 위, 직장, 식도, 심장, 비장, 침샘, 혈액, 뇌 및 그의 외피, 척수 및 그의 외피, 근육, 결합 조직, 부신, 부갑상선, 갑상선, 자궁, 고환,뇌하수체, 생식 기관, 간장, 쓸개, 눈, 귀, 코, 목, 편도선, 입, 임파절, 및 임파 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된 조직의 이상증식, 이상비대, 또는 과성장인 방법.
  28. 제23항에 있어서, 질병이, 폐, 가슴, 위, 췌장, 전립선, 방광, 뼈, 난소, 피부, 신장, 공동, 결장, 장, 위, 직장, 식도, 심장, 비장, 침샘, 혈액, 뇌 및 그의 외피, 척수 및 그의 외피, 근육, 결합 조직, 부신, 부갑상선, 갑상선, 자궁, 고환, 뇌하수체, 생식 기관, 간장, 쓸개, 눈, 귀, 코, 목, 편도선, 입, 임파절, 및 임파 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된 조직이 바이러스, 박테리아, 또는 기생충에 의해 변질된 것인 방법.
  29. 제23항에 있어서, 질병이, 폐, 가슴, 위, 췌장, 전립선, 방광, 뼈, 난소, 피부, 신장, 공동, 결장, 장, 위, 직장, 식도, 심장, 비장, 침샘, 혈액, 뇌 및 그의 외피, 척수 및 그의 외피, 근육, 결합 조직, 부신, 부갑상선, 갑상선, 자궁, 고환, 뇌하수체, 생식 기관, 간장, 쓸개, 눈, 귀, 코, 목, 편도선, 입, 임파절, 및 임파 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된 조직의 기형인 방법.
  30. 제26항에 있어서, 조직이 임파 조직인 방법.
  31. 제23항에 있어서, 질병이 편도선의 이상비대인 방법.
  32. 제23항에 있어서, 질병이 전립선의 이상증식인 방법.
  33. 제23항에 있어서, 질병이 건선인 방법.
  34. 제23항에 있어서, 습진인 방법.
  35. 제23항에 있어서, 질병이 피부병인 방법.
  36. 제23항에 있어서, 질병이 조직에 대한 미용 변형인 방법.
  37. 제26항에 있어서, 조직이 피부, 눈, 귀, 목, 입, 근육, 신경 연계, 두발, 및 가슴인 방법.
  38. 제23항에 있어서, 질병이 혈관 질병인 방법.
  39. 제23항에 있어서, 질병이 치질인 방법.
  40. 제23항에 있어서, 질병이 정맥류성 정맥인 방법.
  41. 제38항에 있어서, 혈관 질병이 아테롬성 동맥 경화증 또는 동맥 경화증인 방법.
  42. 제23항에 있어서, 질병이, 염증성 질병, 자가면역 질병, 대사성 질병, 유전성 질병, 외상성 질병 또는 물리적 손상, 영양 결핍 질병, 감염성 질병, 아밀로이드 질병, 섬유증 질병, 저장병, 선천성 기형, 효소 결핍 질병, 중독(poisoning), 중독(intoxication), 환경 질병, 방사성 질병, 내분비 질병, 퇴행성 질병 및 기계적 질병으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  43. 제23항에 있어서, 펩티드가 췌장 스레드 단백질의 아미노산 서열로부터 유도된 것인 방법.
  44. 제23항에 있어서, 펩티드가 항체, 항체 단편, 및 유사 항체 결합 분자로 이루어진 군으로부터 선택된 분자에 접합, 연결, 또는 결합된 것이고, 상기 분자는 다른 세포에의 결합보다 종양 또는 다른 표적에의 결합에 더 높은 친화성을 갖는 것인 방법.
  45. 제23항에 있어서, 펩티드가 상기 펩티드로 이루어진 단일의 새로 클론된 재조합 분자, 및 항체, 항체 단편, 및 유사 항체 결합 분자로 이루어진 군으로부터 선택된 분자의 일부이고, 상기 분자는 다른 세포에의 결합보다 종양 또는 다른 표적에의 결합에 더 높은 친화성을 갖는 것인 방법.
  46. (i) SEQ ID 15번(Ile-Asp-Gln-Gln-Val-Leu-Ser-Arg-Ile-Lys-Leu-Glu-Ile-Lys-Arg-Cys-Leu)으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드; 또는
    (ii) SEQ ID 18번(Gln-Gln-Ser-Ile-Ala-Val-Lys-Phe-Leu-Ala-Val-Phe-Gly-Val-Ser-Ile)으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드
    로부터 선택된 펩티드를 1 이상 포함하는 펩티드.
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