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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung ist auf die Verwendung von Peptiden, die aus
SEQ ID Nos.: 10, 19 und 22-28 bestehen, für die Behandlung von Zuständen gerichtet,
welche die Entfernung oder Zerstörung
von zellulären
Elementen, wie gutartigen oder malignen Tumoren bei Menschen, erfordern.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Die
Essenz von vielen medizinischen Behandlungen und Verfahren beinhaltet
die Entfernung oder Zerstörung
von schädlichem
oder unerwünschtem
Gewebe. Beispiele für
derartige wichtige Behandlungen umfassen die chirurgische Entfernung
von kanzerösen
Gewächsen,
die Zerstörung
von metastasischen Tumoren durch Chemotherapie und die Reduktion
von Drüsen-(zum
Beispiele Prostata-)Hyperplasie. Andere Beispiele schließen die
Entfernung von unerwünschtem
Gesichtshaar, Warzen, subkutanem Gewebe, Lymphgewebe oder Fettgewebe
ein.
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Es
gibt einen Bedarf an einem wirksamen Mittel, welches das weitere
Wachstum von schädlichen
oder unerwünschten
Zellen und schädlichem
oder unerwünschtem
Gewebe zerstört
und daher dessen weiteres Wachstum hemmt, welches aber hauptsächlich lokale
Auswirkungen und eine minimale oder fehlende systemische Toxizität aufweist.
Neuronal-thread-Proteine und deren verwandte Moleküle sind
eine Klasse derartiger Mittel, wie in der US 2003/0054990 mit dem
Titel: Methods of Treating Tumors and Related Conditions Using Neural
Thread Proteins, eingereicht am 8. März 2002, offenbart. Peptide,
die Aminosäuresequenzen
enthalten, welche einem Teil der Aminosäuresequenz von Neuronal-thread-Protein, AD7c-NTP,
entsprechen, sind ebenfalls derartige Mittel. Diese Peptide sind
in der US 2003/0096350 mit dem Titel: Peptides Effective in the Treatment
of Tumors and Other Conditions Requiring the Removal or Destruction
of Cells, eingereicht am 24. Mai 2002, offenbart.
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Hierin
sind gewisse andere Fragmente von Neuronal-thread-Proteinen offenbart,
die ebenfalls bei der Behandlung von Tumoren und anderen Zuständen, welche
die Entfernung oder Zerstörung
von Zellen erfordern, nützlich
sind.
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Krebs
ist eine Abnormalität
im internen regulatorischen Mechanismus einer Zelle, welche ein
unkontrolliertes Wachstum und einen unkontrollierte Reproduktion
der Zelle zur Folge hat. Normale Zellen bilden Gewebe und wenn diese
Zellen ihre Fähigkeit
verlieren, sich als spezifische, kontrollierte und koordinierte
Einheit zu verhalten (Entdifferenzierung), führt der Defekt zu einer Fehlordnung
unter der Zellpopulation. Wenn diese stattfindet, wird ein Tumor
gebildet.
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Benignes Überwachstum
von Gewebe ist eine Abnormalität,
bei der es wünschenswert
ist, Zellen aus einem Organismus zu entfernen. Benigne Tumoren sind
zelluläre
Proliferationen, die nicht im ganzen Körper metastasieren, jedoch
Krankheitssymptome verursachen. Derartige Tumoren können letal
sein, wenn sie in unzugänglichen
Bereichen in Organen, wie dem Gehirn, vorliegen. Es gibt benigne
Tumoren von Organen, die Lunge, Gehirn, Haut, Hypophyse, Schilddrüse, Nebennierenrinde
und Medulla, Eierstock, Uterus, Testikel, Bindegewebe, Muskel, Eingeweide,
Ohr, Nase, Hals, Mandeln, Mund, Leber, Gallenblase, Pankreas, Prostata, Herz
und andere Organe einschließen.
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Eine
Operation ist häufig
der erste Schritt bei der Behandlung von Krebs. Das Ziel der Operation
variiert. Manchmal wird sie verwendet, um so viel des offensichtlichen
Tumors wie möglich
zu entfernen oder zumindest seine Masse zu verringern (die Hauptmasse(n)
des Tumors zu entfernen, so dass weniger vorliegt, was durch andere
Mittel behandelt werden muss). Abhängig vom Krebstyp und -ort
kann eine Operation auch für
eine gewisse symptomatische Linderung beim Patienten sorgen. Wenn
zum Beispiel ein Chirurg einen großen Teil eines expandierenden
Gehirntumors entfernen kann, nimmt der Druck im Schädel ab,
was zu einer Verbesserung der Symptome des Patienten führt.
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Nicht
alle Tumoren sind einer Operation zugänglich. Einige liegen in Teilen
des Körpers
vor, welche es unmöglich
machen, sie vollständig
zu entfernen. Beispiele dafür
wären Tumoren
im Hirnstamm (einem Teil des Gehirns, welcher die Atmung steuert)
oder ein Tumor, der in einem Hauptblutgefäß und darum herum wächst. In
diesen Fällen
ist die Rolle einer Operation aufgrund des hohen Risikos, das mit
der Tumorentfernung verbunden ist, begrenzt.
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In
einigen Fällen
wird keine Operation verwendet, um die Masse des Tumors zu verringern,
da es nicht erforderlich ist. Ein Beispiel ist Hodgkin-Lymphom,
ein Krebs der Lymphknoten, der sehr gut auf Kombinationen von Chemotherapie
und Strahlentherapie anspricht. Beim Hodgkin-Lymphom wird eine Operation
kaum benötigt,
um eine Heilung zu erzielen, aber nahezu immer verwendet, um eine
Diagnose zu erstellen.
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Chemotherapie
ist eine übliche
Form der Krebsbehandlung, welche die Verwendung von Medikamenten
(gewöhnliche über den
Mund oder durch Injektion verabreicht) beinhaltet, die spezifisch
sich schnell teilende Zellen (wie jene, die in einem Tumor gefunden
werden) im ganzen Körper
angreifen. Dies macht die Chemotherapie bei der Behandlung von Krebsen,
die bereits metastasiert sind, sowie von Tumoren nützlich,
die eine große
Wahrscheinlichkeit aufweisen, sich durch das Blut- und Lymphsystem
zu verbreiten, aber jenseits des primären Tumors nicht offenkundig
sind,. Die Chemotherapie kann auch verwendet werden, um die Reaktion
von lokalisierten Tumoren auf Operation und Strahlentherapie zu
verbessern. Dies ist zum Beispiel bei einigen Krebsen des Kopfs
und des Nackens der Fall.
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Leider
werden andere Zellen im menschlichen Körper, die sich normalerweise
ebenfalls rasch teilen (wie die Auskleidung des Magens und das Haar)
ebenfalls durch eine Chemotherapie beeinflusst. Aus diesem Grund
schließen
viele Chemotherapien unerwünschte
Nebenwirkungen ein, wie Übelkeit,
Erbrechen, Anämie, Haarverlust
oder andere Symptome. Diese Nebenwirkungen sind vorübergehend
und es gibt Medikamente, die dazu beitragen können, viele dieser Nebenwirkungen
zu mildem. Da unser Wissen fortwährend
zunimmt, haben Forscher neuere chemotherapeutische Mittel ersonnen,
die nicht nur beim Abtöten
von Krebszellen besser sind, sondern auch für den Patienten weniger Nebenwirkungen
aufweisen.
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Chemotherapie
wird Patienten auf einer Anzahl von Wegen verabreicht. Einige sind
Pillen und andere werden durch intravenöse oder andere Injektion verabreicht.
Bei der injizierbaren Chemotherapie besucht ein Patient die Praxis
eines Arztes oder ein Krankenhaus zur Behandlung. Andere chemotherapeutische
Mittel erfordern eine kontinuierliche Infusion in den Blutstrom,
24 Stunden täglich.
Bei diesen Chemotherapie-Typen kann ein kleineres chirurgisches
Verfahren durchgeführt
werden, um eine kleine Pumpe zu implantieren, die von dem Patienten
getragen wird. Die Pumpe verabreicht dann langsam das Medikament.
In vielen Fällen
wird eine permanenter Zugang zur Vene des Patienten gekegt, um das
Erfordernis für
wiederholte Nadelstiche zu beseitigen.
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Strahlentherapie
ist eine weitere üblicherweise
verwendete Waffe im Kampf gegen Krebs. Strahlung töten Krebs
durch Beschädigen
der DNA innerhalb der Tumorzellen. Die Strahlung wird auf verschiedenen
Wegen zugeführt.
Der üblichste
beinhaltet das Richten eines Strahls von Strahlung auf den Patienten
auf hoch präzise
Weise, indem man ihn auf den Tumor fokussiert. Um dies vorzunehmen,
liegt ein(e) Patient(in) auf einem Tisch und der Strahl bewegt sich
um ihn/sie herum. Das Verfahren dauert Minuten, kann aber über mehrere
Wochen täglich
vorgenommen werden (abhängig
von der Tumorart), um eine spezielle verordnete Gesamtdosis zu erzielen.
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Ein
weiteres Bestrahlungsverfahren, das manchmal verwendet wird und
als Brachytherapie bezeichnet wird, beinhaltet die Hernahme von
radioaktiven Pellets (Seeds) oder Drähten und die Implantation derselben
in den Körper
im Bereich des Tumors. Die Implantate können vorübergehend oder dauerhaft sein.
Bei dauerhaften Implantaten zerfällt
die Strahlung in den Seeds über
eine Zeitspanne von Tagen oder Wochen, so dass der Patient nicht
radioaktiv ist. Bei vorübergehenden
Implantaten wird die gesamte Strahlungsdosis gewöhnlich in wenigen Tagen zugeführt und
der Patient muss während
dieser Zeit im Krankenhaus bleiben. Bei beiden Brachytherapiearten
wird die Strahlung im Allgemeinen einem sehr gezielten Bereich zugeführt, um eine
lokale Kontrolle über
einen Krebs zu erzielen (im Gegensatz zur Behandlung des ganzen
Körpers,
wie es bei der Chemotherapie der Fall ist).
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Einige
sehr ausgewählte
Patienten können
für Knochenmarktransplantationen
vorgesehen sein. Dieses Verfahren wird gewöhnlich entweder durchgeführt, weil
ein Patient einen Krebs hat, der besonders aggressiv ist, oder weil
sie einen Krebs haben, der nach einer Behandlung mit herkömmlicher
Therapie rezidiviert. Die Knochenmarktransplantation ist ein kompliziertes
Verfahren. Es gibt viele Arten und sie können in ihrem Potential zur
Verursachung von Nebenwirkungen und Heilung variieren. Die meisten
Transplantationen werden in speziellen Zentren durchgeführt und
in vielen Fällen
wird ihre Verwendung als zur Forschung gehörig angesehen.
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Es
gibt eine Anzahl weiterer Therapien, obwohl die meisten derselben
noch in klinischen Versuchen untersucht werden und noch nicht ein
Standardheilverfahren sind. Beispiele umfassen die Verwendung von Immuntherapie,
monoklonalen Antikörpern,
Antiangiogenese-Faktoren und Gentherapie.
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Immuntherapie:
Es gibt verschiedene Techniken, die ausgelegt sind, um das eigene
Immunsystem des Patienten zu unterstützen, den Krebs ziemlich getrennt
von Bestrahlung oder Chemotherapie zu bekämpfen. Häufig injizieren Forscher dem
Patienten eine speziell abgeleitete Vakzine, um das Ziel zu erreichen.
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Monoklonale
Antikörper:
Dabei handelt es sich um Antikörper,
die so konstruiert sind, dass sie sich an Krebszellen (und nicht
normale Zellen) anheften, indem sie einen Vorteil aus Unterschieden
zwischen Krebs- und Nicht-Krebszellen mit Bezug auf deren antigene
und/oder andere Merkmale ziehen. Die Antikörper können dem Patienten allein oder
an vielfältige
zytotoxische Verbindungen konjugiert oder in radioaktiver Form verabreicht
werden, derart, dass der Antikörper
vorzugsweise auf die Krebszellen abzielt, wodurch das toxische Mittel
oder die Radioaktivität
den gewünschten
Zellen zugeführt
wird.
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Antiangiogenese-Faktoren:
Da sich Krebszellen rasch teilen und Tumoren schnell wachsen, können sie
bald über
ihre Blutzufuhr hinauswachsen. Um dies zu kompensieren, sondern
einige Tumoren eine Substanz ab, von der man annimmt, dass sie dazu
beiträgt,
das Wachstum von Blutgefäßen in ihrer
Nachbarschaft zu induzieren, wodurch die Krebszellen mit einer vaskulären Nährstoffquelle
versorgt werden. Es sind experimentelle Therapien entwickelt worden,
um das Wachstum von Blutgefäßen zu Tumoren
hin zu stoppen.
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Gentherapie:
Krebs ist das Produkt einer Reihe von Mutationen, die letztendlich
zur Produktion einer Krebszelle und ihrer übermäßigen Proliferation führen. Krebse
können
behandelt werden, indem man Gene in die Krebszellen einführt, die
entweder so wirken, dass sie die Proliferation des Krebses überwachen
oder stoppen, den programmierten Zellmechanismus der Zelle zur Zerstörung anschalten,
die Immunerkennung der Zelle erhöhen
oder ein Prodrug exprimieren, das sich in einen toxischen Metaboliten
oder ein Zytokin umwandelt, welcher bzw. welches das Tumorwachstum
hemmt.
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Benigne
Tumoren und Missbildungen können
ebenfalls durch eine Vielfalt von Verfahren behandelt werden, einschließlich Operation,
Radiotherapie, Arzneistofftherapie, thermischer oder elektrischer
Ablation, Kryotherapie und dergleichen. Obwohl benigne Tumoren nicht
metastasieren, können
sie groß werden
und sie können
rezidivieren. Die chirurgische Exstirpation von benignen Tumoren
weist all die Schwierigkeiten und Nebenwirkungen von Operationen
im Allgemeinen auf und muss häufig
bei einigen benignen Tumoren, wie bei Hypophysenadenomen, Meningeoma
des Gehirns, Prostatahyperplasie und anderen, wiederholt durchgeführt werden.
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Es
gibt noch weitere Zustände,
an denen unerwünschte
zelluläre
Elemente beteiligt sind und bei denen eine selektive Zellenentfernung
wünschenswert
ist. Zum Beispiel werden Herzkrankheit und Schlaganfälle üblicherweise
durch Atherosklerose verursacht, welche eine proliferative Läsion von
fibrösfettigen
und modifizierten glatten Muskelelementen ist, welche die Blutgefäßwand verformen,
das Lumen verengen, den Blutstrom einschränken, für fokale Blutgerinnsel prädisponieren
und letztendlich zur Blockade und zum Infarkt führen. Verschiedene Behandlungen
für Atherosklerose
umfassen Bypass-Transplantate;
künstliche
Transplantate, Angioplastie mit Rekanalisierung, Kürettage,
Strahlung, Laser oder eine andere Entfernung; Pharmakotherapie,
um die Atherosklerose durch Lipidreduktion zu inhibieren; und gerinnungshemmende
Therapien; und allgemeine Maßnahmen
mit Bezug auf Nahrung, Sport und Lebensführung. Ein Verfahren zur Entfernung
von atherosklerotischen Läsionen
ohne das Risiko und die Nebenwirkungen von chirurgischen Verfahren
wird benötigt.
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Andere
Beispiele für
unerwünschte
zelluläre
Elemente, bei denen eine selektive Zellenentfernung wünschenswert
ist, umfassen viral induzierte Gewächse, wie Warzen. Ein weiteres
Beispiel sind hypertrophe entzündliche
Massen, die bei entzündlichen
Zuständen
gefunden werden, und hypertrophe Narben oder Keloide. Noch weitere
Beispiele werden in kosmetischen Kontexten gefunden, wie die Entfernung
von unerwünschtem
Haar, zum Beispiel Gesichtshaar, oder bei der Schrumpfung von unerwünschten
Gewebebereiche für
kosmetische Zwecke, wie in der Gesichtsdermis und Bindegeweben oder
in den Dermen und im Bindegewebe der Extremitäten.
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Noch
weitere Beispiele werden dem Fachmann beim Lesen der Offenbarung
hierin offensichtlich. Bei allen oder den meisten dieser Beispiele
gibt es einen Bedarf an Behandlungen, welche die unerwünschten
zellulären
Elemente ohne die Risiken und Nebenwirkungen von herkömmlichen
Therapien entfernen oder zerstören
können
oder die unerwünschten
zellulären
Elemente mit höherer
Präzision
entfernen können.
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Neuronal-thread-Proteine
(NTP) sind eine Familie von kürzlich
charakterisierten Gehirnproteinen. Ein Mitglied dieser Familie,
AD7c-NTP, ist eine ~41 kD Membran, die mit Phosphoprotein mit Funktionen
assoziiert ist, die mit neuritischer Entwicklung verbunden sind
(de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100: 3093-3104 (1997); de
la Monte et al., Alz. Rep., 2: 327-332 (1999); de la Monte SM and
Wands JR, Journal of Alzheimer's
Disease, 3: 345-353 (2001)). Das Gen, das AD7c-NTP codiert, und
die vorhergesagte Proteinsequenz für Ad7c-NTP sind identifiziert
und beschrieben worden. (de la Monte et al., J. Clin. Invest, 100:
3093-3104 (1997)). Zusätzlich
zu der ~41 kD Spezies sind andere Spezies von Neuronal-thread-Protein
(~26 kD, ~21 kD, ~17 kD und ~15 kD) identifiziert und mit neuroektodennalen
Tumoren, Astrozytomen und Glioblastomen und mit Verletzung aufgrund
von Hypoxie, Ischämie
oder zerebralem Infarkt verbunden worden (Xu et al., Cancer Research,
53: 3823-3829 (1993); de la Monte et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol.,
55(10): 1038-50 (1996), de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 138(1-2):
26-35 (1996); de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 135(2): 118-25
(1996); de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100: 3093-3104 (1997);
und de la Monte et al., Alz. Rep., 2: 327-332 (1999)).
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Spezies
von Neuronal-thread-Protein sind in den U.S. Patenten Nr. 5,948,624;
5,948,888 und 5,830,670, alle für "Neural Thread Protein
Gene Expression and Detection of Alzheimer's Disease", und im U.S. Patent Nr. 6,071,705 für "Method of Detecting
Neurological Disease or Dysfunction" beschrieben und beansprucht worden.
Wie dort beschrieben, wird NTP während
des Zelltods hinaufreguliert und produziert. So wird beschrieben,
dass tote und sterbende Nervenzellen NTP überproduzieren und dass demgemäß dessen Anwesenheit
den Tod von Nervenzellen und den Beginn der Alzheimer-Krankheit
(AD) anzeigt.
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Andere
Spezies von Neuronal-thread-Protein sind als weitere Produkte des
AD7c-NTP-Gens (zum Beispiel ein 112 Aminosäuren-Protein, das in der NCBI
Entrez-Protein-Datenbank, Zugangsnummer Nr. XP_032307 PID g15928971
beschrieben ist) oder als ähnlich
mit Neuronal-thread-Proteinen identifiziert worden (zum Beispiel
106 Aminosäuren-Protein,
das in der NCBI Entrez-Protein-Datenbank, Zugangsnummer AAH14951
PID g15928971 beschrieben ist, ein weiteres 106 Aminosäuren-Protein,
das in der NCBI Entrez-Protein-Datenbank, Zugangsnummer XP_039102
PID g18599339 beschrieben ist, und ein 61 Aminosäuren-Protein, das in der NCBI
Entrez-Protein-Datenbank, Zugangsnummer AAH02534 PID g12803421 beschrieben
ist).
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Neuronal-thread-Protein
ist mit AD assoziiert und NTP wird in Verbindung mit dem Zelltod
in AD hinaufreguliert. AD7c-NTP-mRNA wird im AD-Gehirn im Vergleich
zu Kontrollen hinaufreguliert; AD7c-NTP-Proteinkonzentrationen im Gehirn
und im ZSF sind bei AD höher
als bei Kontrollen; und eine AD7G NTP wird in senilen Plaques, in
neurofibrillären
Knäueln
(NFT), in degenerierenden Neuronen, in Neuropil-Threads und dystrophischen
Nervensprossen in Gehirnen von AD und Down-Syndrom gefunden (Ozturk
et al., Proc. Natl. Acd. Sci. USA, 86: 419-423 (1989); de la Monte
et al., J. Clin. Invest., 86(3): 1004-13 (1990); de la Monte et al.,
J. Neurol. Sci., 113(2): 152-64 (1992); de la Monte et al., Ann.
Neurol, 32(6): 733-42 (1992); de la Monte et al., J. Neuropathol.
Exp. Neurol., 55(10): 1038-50 (1996), de la Monte et al., J. Neurol.
Sci., 138(1-2): 26-35 (1996); de la Monte et al., J. Neurol. Sci.,
135(2): 118-25 (1996); de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100: 3093-3104
(1997); und de la Monte et al., Alz. Rep., 2: 327-332 (1999)). NTP
ist innerhalb von Zellen innerhalb feiner Fortsätze innerhalb des Neuropils
lokalisiert oder liegt in Gehirnen von sowohl AD als auch Down-Syndrom
extrazellulär
vor; de la Monte et al., Ann. Neurol., 32(6): 733-42 (1992).
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Erhöhte Konzentrationen
von AD7c-NTP-Protein sind sowohl in ZSF als auch im Urin von AD-Patienten gefunden
worden (de la Monte and Wands, Front Biosci, 7: 989-96 (2002); de
la Monte und Wands, Journal of Alzheimer's Disease, 3: 345-353 (2001); Munzar
et al., Alzheimer's
Reports, 4: 61-65 (2001); Kahle et al., Neurology, 54: 1498-1504
(2000); Munzar et al., Alzheimer Reports, 3: 155-159 (2000); de
la Monte et al., Alzheimer's
Reports, 2: 327-332 (1999); und de la Monte et al., J. Clin. Invest.,
100: 3093-3104 (1997)).
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Die Überexpression
von NTP ist auch mit dem Prozess des Zelltods bei der Alzheimer-Krankheit
verbunden worden (de la Monte und Wands, J. Neuropathol. Exp. Neurol.,
60: 195-207 (2001); de la Monte und Wands, Cell Mol Life Sci, 58:
844-49 (2001)). AD7c-NTP ist auch im Hirngewebe von Down-Syndrom identifiziert
worden (Wands et al., internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 90/06993;
de la Monte et al., J Neurol Sci, 135: 118-25 (1996); de la Monte
et al., Alz. Rep., 2: 327-332 (1999)). Es gibt einige Hinweise,
dass die Überexpression
von NTP auch mit Normaldruck-Glaukom verbunden sein kann (Golubnitschaja-Labudova
et al., Curr Eye Res, 21: 867-76 (2000)).
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Es
hat sich erwiesen, daß NTP
ein wirksames Mittel für
die Bewirkung des Zelltods sowohl in vitro in Gliom- und Neuroblastom-Zellkulturen
als auch in vivo in normalem Nager-Muskelgewebe, subkutanem Bindegewebe
und in der Dermis und in einer Vielfalt von verschiedenen Tumoren
menschlichen und nicht menschlichen Ursprungs, einschließlich Mammakarzinom,
Hautkarzinom und Papillom, Kolonkarzinom, Gliom des Gehirns und
anderer in Nagermodellen, ist. Siehe die US 2003/0054990, Methods
of Treting Tumors and Related Conditions Using Neural Thread Proteins,
eingereicht am 8. März
2002.
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Gewisse
Peptidsequenzen von AD7c-NTP ("AD7c-NTP-Peptide") erwiesen sich ebenfalls
als wirksame Mittel zur Verursachung von Zelltod sowohl in vitro
in Gliom- und Neuroplastom-Zellkulturen als auch/oder in vivo in
normalem Nager-Muskelgewebe, subkutanem Bindegewebe, Dermis und
anderem Gewebe. Siehe die US 2003/0096350 mit dem Titel: Peptides
Effective in the Treatment of Tumors and Other Conditions Requiring
the Removal or Destruction of Cells,
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Die
WO 00/58295 offenbart ein 47-mer Polypeptid, das die Sequenz GAISAHRNLRL
umfaßt,
und dessen potentielle Verwendung zur Behandlung eines großen Bereichs
von Krankheiten.
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Die
WO 02/097030 ist auf von NTP abgeleitete Peptide und deren Verwendung
zur Behandlung von Krankheiten gerichtet, welche die Entfernung
oder Zerstörung
von Zellen erfordern, wie Krebs.
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Es
bleibt ein Bedarf in der Medizin an neuen, weniger toxischen Behandlungen
für die
Behandlung von unerwünschten
zellulären
Elementen. Die vorliegende Erfindung erfüllt diesen Bedarf.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung ist auf NTP-Peptide, Zusammensetzungen und
deren Verwendung für
die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung eines Zustandes
gerichtet, der die Entfernung oder Zerstörung von Zellen erfordert und
ausgewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus einem benignen oder malignen Tumor
eines Gewebes; einer Hyperplasie, Hypertrophie oder Überwachstum
eines Gewebes; eines viral, bakteriell oder parasitisch veränderten
Gewebes; einer Missbildung eines Gewebes; einer tonsillären Hypertrophie;
Prostata-Hyperplasie; Psoriasis; Ekzem; Dennatose; einer kosmetischen
Veränderung
eines Gewebes; einer vaskulären
Krankheit; Hämorrhoiden,
varikösen
Venen, Atherosklerose; entzündlicher
Krankheit; Autoimmunkrankheit; metabolischer Krankheit; vererbter/genetischer
Krankheit; traumatischer Krankheit oder physischer Verletzung; Nahrungsmangel-Krankheit; infektiöser Krankheit;
Amyloid-Krankheit; Fibrose-Krankheit; Speicher-Krankheit; angeborener
Missbildung; Enzymmangel-Krankheit; Vergiftung; Intoxikation; umweltbedingter
Krankheit; Strahlenkrankheit; endokriner Krankheit und degenerativer
Krankheit. Das Expressions-NTP-Peptid ist nachstehend definiert.
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Die
Peptide der vorliegenden Erfindung weisen mindestens eine Aminosäuresequenz
auf, welche einem Teil der Aminosäuresequenz einer Spezies von
Neuronal-thread-Protein entspricht. Die Zusammensetzungen der Erfindung
umfassen die Peptide und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder
die Peptide an einen Träger
oder dergleichen konjugiert oder die Peptide in einer Polymermatrix
eingekapselt usw..
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Die
vorliegende Erfindung beinhaltet teilweise die Entdeckung, daß Peptidsequenzen,
die in AD7c-NTP enthalten sind und von welchen die Erfinder gefunden
haben, daß sie
wirksame Mittel für
die Zerstörung
oder Entfernung von schädlichen
oder unerwünschten
Zellen sind, und Varianten und Homologe davon auch in anderen Proteinen
in anderen Organismen gefunden werden, einschließlich Menschen und anderer
Säugetiere.
Wenn die Peptidsequenzen entdeckt werden, können diese Proteine vom gewöhnlichen
Fachmann durch die Verwendung von überall verfügbaren öffentlichen und kommerziellen
Protein-Datenbanken, wie der National Center Biotechnology Information's Protein-Datenbank und Suchprogrammen,
wie BLAST® (Basic
Local Alignment Search Tool), gefunden werden. Siehe Altschul, Stephen
F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schäffer, Jinghui Zhang, Zheng
Zhang, Webb Miller und David J. Lipmann (1997), "Gapped BLAST und PSI-BLAST: a new generation
of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402.
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Ein
Fachmann kann diese Proteine unter Verwendung der hierin beschriebenen
Assay-Verfahren durchmustern, um deren Wirksamkeit als Mittel für die Zerstörung oder
Entfernung von unerwünschten
oder schädlichen
Zellen zu bestimmen. Ein gewöhnlicher
Fachmann, der ein oder mehrere derartige wirksame Mittel gefunden
hat, kann dann bestimmen, welche Abschnitte dieser Mittel Sequenzen
enthalten, die zu AD7c-NTP-Peptidsequenzen, die hierin oder in der
US 2003/0096350 mit dem Titel: Peptides Effective in the Treatment
of Tumors and Other Conditions Requiring the Removal or Destruction
of Cells, eingereicht am 24. Mai 2002, beschriebenen werden, homolog
oder ähnlich
sind, diese Abschnitte dieser Mittel unter Verwendung von dem Fachmann
bekannten Verfahren synthetisieren lassen und die synthetisierten
Mittel bezüglich
ihrer Wirksamkeit als Mittel für
die Zerstörung
oder Entfernung von unerwünschten
oder schädlichen
Zellen testen. Weiter könnte
ein Fachmann auch die Aminosäuresequenzen
aller derartiger gefundener Proteine verwenden, um andere Peptidsequenzen
zu bestimmen, die nicht homolog oder ähnlich sind zu hierin und in
der US 2003/0096360 mit dem Titel: Peptides Effective in the Treatment
of Tumors and Other Conditions Requiring the Removal or Destruction
of Cells, eingereicht am 24. Mai 2002, beschriebenen Peptidesequenzen,
die zu AD7c-NTP-Peptidsequenzen
homolog oder ähnlich
sind.
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Die
erfindungsgemäßen Peptide
oder Proteine ("Zelltod-Peptid") können allein
oder an einen Träger konjugiert
verabreicht werden. Das Zelltod-Peptid kann intramuskulär, oral,
intravenös,
intraperitoneal, intrazerebral (intraparenchymal), intrazerebroventrikulär, intratumoral,
intraläsional, intradermal,
intrathekal, intranasal, intraokular, intraarteriell, topisch, transdermal,
mittels eines Aerosols, Infusion, Bolus-Injektion, Implantationsvorrichtung,
Systems mit verzögerter
Freisetzung usw. entweder allein oder an einen Träger konjugiert
verabreicht werden.
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Zusätzlich kann
das Zelltod-Peptid in Verbindung mit anderen Therapien zur Behandlung
benigner und maligner Tumoren und anderen unerwünschten oder schädlichen
Zellwachstums verwendet werden.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER FIGUREN
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1:
zeigt die vollständige
Aminosäuresequenz
und Nukleinsäuresequenz
des AD7c-NTP-Gens und
des AD7c-NTP-Proteinprodukts dieses Gens (Sequenzen 120 und 121
aus dem U.S. Patenten Nr. 5,830,670, 5,948,634 und 5,948,888; de
la Monte et al., J. Clin. Invest., 100: 3093-3104 (1997); NCBI Entrez-Protein
Zugangsnummer AAC08737; PID g3002527) [SEQ ID NO. 1].
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2:
zeigt die vollständigen
Aminosäuresequenzen
des 122 Aminosäuren-Neuronal-thread-Proteins (Sequenz
40 aus den U.S. Patenten Nr. 5,830,670, 5,948,634 und 5,948,888;
NCBI Entrez-Protein Zugangsnummer AAE25447 PID g10048540) [SEQ ID
NO. 2].
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3:
zeigt die vollständigen
Aminosäuresequenzen
des 112 Aminosäuren-Neuronal-thread-Proteins (NCBI
Entrez-Protein Zugangsnummer XP_032307 PID g15928971) [SEQ ID NO.
3].
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4:
zeigt die vollständigen
Aminosäuresequenzen
eines Neuronal-thread-Protein-artigen
106 Aminosäuren-Proteins
(NCBI Entrez-Protein Zugangsnummer AAH14951 PID g15928971) [SEQ
ID NO. 4].
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5:
zeigt die vollständigen
Aminosäuresequenzen
eines Neuronal-thread-Protein-artigen
106 Aminosäuren-Proteins
(NCBI Entrez-Protein Zugangsnummer XP_039102 PID g18599339) [SEQ
ID NO. 5].
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6:
zeigt die vollständigen
Aminosäuresequenzen
des 98 Aminosäuren-Neuronal-thread-Proteins [Sequenz
30 aus den U.S. Patenten Nr. 5,830,670, 5,948,634 und 5,948,888;
NCBI Entrez-Protein Zugangsnummer AAE25445, PID g10048538) [SEQ
ID NO. 6].
-
7:
zeigt die vollständigen
Aminosäuresequenzen
des 75 Aminosäuren-Neuronal-thread-Proteins (Sequenz
48 aus den U.S. Patenten Nr. 5,830,670, 5,948,634 und 5,948,888;
NCBI Entrez-Protein Zugangsnummer AAE25448, PID g10048541) [SEQ
ID NO. 7].
-
8:
zeigt die vollständigen
Aminosäuresequenzen
des 68 Aminosäuren-Neuronal-thread-Proteins (Sequenz
36 aus den U.S. Patenten Nr. 5,830,670, 5,948,634 und 5,948,888;
NCBI Entrez-Protein Zugangsnummer AAE25446, PID g10048539) [SEQ
ID NO. 8].
-
9:
zeigt die vollständigen
Aminosäuresequenzen
des 61 Aminosäuren-Neuronal-thread-Protein-artigen
Proteins (NCBI Entrez-Protein Zugangsnummer AAH02534, PID g12803421)
[SEQ ID NO. 9].
-
DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
-
Die
hierin verwendeten Ausdrücke
und Satzteile werden wie nachstehend definiert, falls nicht anders angegeben.
-
Der
Ausdruck "AD7c-NTP" bezeichnet das ~41
kD Protein und das Gen und die Nukleinsäuresequenzen, die dafür codieren,
welche in de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100: 3093-104 (1997),
in den Sequenzen 120 und 121 der U.S. Patente Nr. 5,948,634, 5,948,888
und 5,830,670 und in GenBank Nr. AF010144 beschrieben sind, dessen
Nukleinsäure-
und Aminosäuresequenz
in 1 veranschaulicht sind. Der Ausdruck "AD7c-NTP" umfasst auch biologisch
aktive Fragmente, Varianten, Derivate, Homologe und Mimetika von AD7c-NTP.
-
Der
Ausdruck "NTP" oder "Neuronal-thread-Protein" bezeichnet Neuronal-thread-Proteine
und verwandte Moleküle
(einschließlich
Pankreas-thread-Protein) und die Nukleinsäuren, welche diese Proteine
codieren, und schließt
(ohne jedoch darauf beschränkt
zu sein) die folgenden Proteine und die Nukleinsäuresequenzen, welche die Aminosäuresequenzen
dieser Proteine codieren, ein:
- (a) AD7c-NTP;
- (b) die ~42, ~26, ~21, ~17, ~14 und ~8 kD Spezies von Neuronal-thread-Protein,
wie in den U.S. Patenten Nr. 5,948,634, 5,948,888, 5,830,670 und
6,071,705 und in de la Monte et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55(10):
1038-50 (1996), de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 138(1-2): 26-35
(1996); de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 135(2): 118-25 (1996),
de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100: 3093-3104 (1997) und
de la Monte et al., Alz. Rep., 2: 327-332 (1999) beschrieben;
- (c) Proteine, die spezifisch vom monoklonalen Antikörper Nr.
3, hinterlegt bei der American Type Culture Collection, Manassas,
Va., unter der Zugangsnummer HB-12546 oder vom monoklonalen Antikörper Nr.
5, hinterlegt bei der American Type Culture Collection, Manassas,
Va., unter der Zugangsnummer HB-12545, erkannt werden;
- (d) Proteine, die vom AD7c-NTP-Gen codiert werden;
- (e) das 122 Aminosäuren-Neuronal-thread-Protein,
das in Sequenz 40 aus den U.S. Patenten Nr. 5,830,670, 5,948,634
und 5,948,888 beschrieben ist und in NCBI Entrez-Protein Zugangsnummer AAE25447,
PID g10048540 aufgeführt
wird, dessen Aminosäuresequenzen
in 2 veranschaulicht sind;
- (f) das 122 Aminosäuren-Neuronal-thread-Protein,
das in NCBI Entrez-Protein Zugangsnummer XP_032307, PID g14725132
aufgeführt
ist, dessen Aminosäuresequenzen
in 3 veranschaulicht sind;
- (g) Neuronal-thread-Protein-artiges 106 Aminosäuren-Protein,
das in NCBI Entrez-Protein Zugangsnummer AAH14951 PID g15928971
aufgeführt
ist, dessen Aminosäuresequenzen
in 4 veranschaulicht sind;
- (h) Neuronal-thread-Protein-artiges 106 Aminosäuren-Protein,
das in NCBI Entrez-Protein Zugangsnummer XP_039102, PID g18599339
aufgeführt
ist, dessen Aminosäuresequenz
in 5 veranschaulicht ist;
- (i) das 98 Aminosäuren-Neuronal-thread-Protein,
das in Sequenz 30 aus den U.S. Patenten Nr. 5,830,670, 5,948,634
und 5,948,888 beschrieben ist und in NCBI Entrez-Protein Zugangsnummer
AAE25445, PID g10048538 aufgeführt
ist, dessen Aminosäuresequenzen
in 6 veranschaulicht sind;
- (j) das 75 Aminosäuren-Neuronal-thread-Protein,
das in Sequenz 48 aus den U.S. Patenten Nr. 5,830,670, 5,948,634
und 5,948,888 beschrieben ist und in NCBI Entrez-Protein Zugangsnummer
AAE25448, PID g10048541 aufgeführt
ist, dessen Aminosäuresequenzen
in 7 veranschaulicht sind;
- (k) das 68 Aminosäuren-Neuronal-thread-Protein,
das in Sequenz 36 aus den U.S. Patenten Nr. 5,830,670, 5,948,634
und 5,948,888 beschrieben ist und im NCBI Entrez-Protein Zugangsnummer
AAE25446, PID g10048539 aufgeführt
ist, dessen Aminosäuresequenzen
in 8 veranschaulicht sind;
- (l) das 61 Aminosäuren-Neuronal-thread-Protein-artige
Protein, das in NCBI Entrez-Protein Zugangsnummer AAH02534, PID
g12803421 aufgeführt
ist, dessen Aminosäuresequenzen
in 9 veranschaulicht sind;
- (m) Pankreas-thread-Protein;
- (n) das neuronale Pankreas-thread-Protein (nPTP), das im U.S.
Patent Nr. 6,071,705 beschrieben ist; und
- (o) Proteine, die spezifisch von den Antikörpern erkannt werden, welche
von einem Hybridom aus der Gruppe bestehend aus HB 9934, HB 9935
und HB 9936, hinterlegt bei der American Type Culture Collection, produziert
werden.
-
Der
Ausdruck "NTP-Peptid" bezeichnet die folgenden
Aminosäuresequenzen
von NTP:
- a) NTP-Peptid Nr. 1 [SEQ ID NO. 10], ähnlich AD7c-NTP
p227-245, mit der Insertion eines zusätzlichen Phenylalanin-Restes
nach p228.
PGFFKLFSCPSLLSSWDYRR
Pro-Gly-Phe-Phe-Lys-Leu-Phe-Ser-Cys-Pro-Ser-Leu-Leu-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg
- b) NTP-Peptid Nr. 10 [SEQ ID NO. 19], AD7c-NTP p239-245 mit
der Addition von Leucin- und
Prolinresten am N-Terminus.
LPSSWDYRR
Leu-Pro-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg-
- c) NTP-Peptid Nr. 13 [SEQ ID NO. 22], AD7c-NTP p239-245 + AD7c-NTP
p139-144
SSWDYRRFILFFL
Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg-Phe-Ile-Leu-Phe-Phe-Leu
- d) NTP-Peptid Nr. 14 [SEQ ID NO. 23], AD7c-NTP p241-245 + AD7c-NTP
p197-202
WDYRRFIFNFL
Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg-Phe-Ile-Phe-Asn-Phe-Leu
- e) NTP-Peptid Nr. 15 [SEQ ID NO. 24], AD7c-NTP p297-302
FNFCLF
Phe-Asn-Phe-Cys-Leu-Phe
- f) NTP-Peptid Nr. 16 [SEQ ID NO. 25], AD7c-NTP p197-202
FIFNFL
Phe-Ile-Phe-Asn-Phe-Leu
- g) NTP-Peptid Nr. 17 [SEQ ID NO. 26], AD7c-NTP p31-43
PASASPVAGITGM
Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Pro-Val-Ala-Gly-Ile-Thr-Gly-Met
- h) NTP-Peptid Nr. 18 [SEQ ID NO. 27], AD7c-NTP p175-187
PASASQVAGTKDM
Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Gln-Val-Ala-Gly-Thr-Lys-Asp-Met
- i) NTP-Peptid Nr. 19 [SEQ ID NO. 28], AD7c-NTP p277-289
PASASQSAGITGV
Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Gln-Ser-Ala-Gly-Ile-Thr-GIy-Val
-
Hierin
beschriebene Aminosäuren
und Aminosäurereste
können
gemäß dem akzeptierten
Ein- oder Drei-Buchstabencode
bezeichnet werden, der in der nachstehenden Tabelle geliefert wird.
-
-
Die
vorliegende Erfindung ist auf eine Zusammensetzung gerichtet, die
NTP-Peptide umfasst, wie vorstehend in dieser Erfindung definiert.
-
NTP-Peptide
dieser Erfindung können
unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren, wie rekombinante
DNA-Technik, Proteinsynthese und Isolierung von natürlich vorkommenden
NTP-Peptiden, hergestellt werden.
-
Ein
NTP-Peptid kann unter Verwendung wohlbekannter DNA-Technik-Verfahren
hergestellt werden, wie jenen, die in Sambrook et al. (Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, N.Y. [1989]) und/oder Ausubel et al., Hsg.,
Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers Inc. und
Wiley and Sons, N.Y. [1994] aufgeführt sind.
-
Ein
Gen oder eine cDNA, die ein NTP-Peptid codiert, kann zum Beispiel
anhand einer Durchmusterung einer genomischen oder cDNA-Bibliothek
oder durch PCR-Amplifikation erhalten werden. Sonden oder Primer,
die für
die Durchmusterung der Bibliothek nützlich sind, können auf
der Grundlage der Sequenzinformation von anderen bekannten Genen
oder Gen-Fragmenten aus derselben oder einer verwandten Genfamilie
erzeugt werden, wie zum Beispiel konservierten Motiven, die in anderen
NTP-Peptiden oder NTP-Proteinen gefunden werden. Zusätzlich kann,
wenn ein Gen, das ein NTP-Peptid oder NTP-Protein codiert, aus einer Spezies
identifiziert worden ist, alles oder ein Teil jenes Gens als Sonde
verwendet werden, um homologe Gene aus anderen Spezies zu identifizieren.
Die Sonden oder Primer können
verwendet werden, um cDNA-Bibliotheken aus verschiedenen Gewebequellen
zu durchmustern, von denen man annimmt, dass sie ein NTP-Peptid-
oder NTP-Protein-Gen
exprimieren. Typisch werden Bedingungen hoher Stringenz für die Durchmusterung
verwendet, um die Zahl von falsch Positiven zu minimieren, die aus
der Durchmusterung erhalten werden.
-
Ein
weiteres Mittel, um ein Gen herzustellen, das ein NTP-Peptid codiert,
ist die Verwendung von chemischer Synthese unter Verwendung von
dem Fachmann bekannten Verfahren, wie jenen, die von Engels et al.
(Angew. Chem. Intl. Ed., 28: 716-734 [1989]) beschrieben sind. Diese
Verfahren schließen
unter anderem das Phosphotriester-, Phosphoramidit- und H-Phosphonat-Verfahren
für die
Nukleinsäuresynthese
ein. Ein bevorzugtes Verfahren für
eine derartige chemische Synthese ist die Polymer-getragene Synthese
unter Verwendung von Standard-Phosphoramidit-Chemie. Typisch weist
die DNA, die ein NTP-Peptid codiert, eine Länge von mehreren 100 Nukleotiden
auf. Nukleinsäuren,
die größer als
etwa 100 Nukleotide sind, können
als mehrere Fragmente unter Verwendung dieser Verfahren synthetisiert
werden. Die Fragmente können
dann zusammenligiert werden, um das NTP-Peptid voller Länge zu bilden.
Gewöhnlich
weist das DNA-Fragment, das den Aminoterminus des Proteins codiert,
ein ATG auf, das einen Methioninrest codiert. Dieses Methionin kann
auf der reifen Form des NTP-Peptids anwesend sein oder nicht, abhängig davon,
ob das in der Wirtszelle produzierte Protein ausgelegt ist, um aus
dieser Zelle sekretiert zu werden.
-
Das
Gen, die cDNA oder ein Fragment derselben, welche(s) das NTP-Peptid
codiert, kann in einen geeigneten Expressions- oder Amplifikationsvektor
unter Verwendung von Standard-Ligierungstechniken
inseriert werden. Der Vektor wird typisch so ausgewählt, dass
er in der speziellen verwendeten Wirtszelle funktional ist (d.h.
der Vektor ist mit der Wirtszellen-Maschinerie kompatibel, so dass
die Amplifikation des Gens und/oder die Expression des Gens stattfinden
kann). Das Gen, die cDNA oder das Fragment davon, welche(s) das
NTP-Peptid codiert, kann in prokaryotischen, Hefe-, Insekten-(Baculovirus-Systemen)
und/oder eukaryotischen Wirtszellen amplifiziert/exprimiert werden.
Die Wahl der Wirtszelle hängt
teilweise davon ab, ob das NTP-Peptid glycosyliert und/oder phosphoryliert
werden soll. Falls dies der Fall ist, sind Hefe-, Insekten- oder Säuger-Wirtszellen
vorzuziehen.
-
Typisch
enthalten die Vektoren, die in irgendeiner der Wirtszellen verwendet
werden, eine 5'-flankierende Sequenz
(auch als Promotor bezeichnet) und andere Regulationselemente, wie
(einen) Enhancer, ein Replikationsstartelement, ein Transkriptionsterminationselement,
eine vollständige
Intronsequenz, die eine Donor- und Akzeptor-Spleißstelle
enthält,
eine Signalpeptidsequenz, ein Ribosomen-Bindungsstellen-Element,
eine Polyadenylierungssequenz, eine Polylinker-Region für die Insertion
der Nukleinsäure,
welche für das
zu exprimierende Polypeptid codiert, und ein selektierbares Markerelement.
Jedes dieser Elemente wird nachstehend erörtert. Gegebenenfalls kann
der Vektor eine Markierungs-Sequenz enthalten, das heißt ein Oligonukleotid-Molekül, das am
5'- oder 3'-Ende der das NTP-Peptid
codierenden Sequenz angeordnet ist; das Oligonukleotid-Molekül codiert
polyHis (wie hexaHis) oder eine andere Markierung, wie FLAG, HA
(Hämaglutinin-Influenzavirus)
oder myc, für
welches kommerziell erhältliche
Antikörper
existieren. Diese Markierung wird typisch bei der Expression des
Polypeptids mit dem Polypeptid fusioniert und kann als Mittel für die Affinitätsreinigung
des NTP-Peptids
aus der Wirtszelle dienen. Die Affinitätsreinigung kann zum Beispiel
durch Säulenchromatographie
unter Verwendung von Antikörpern
gegen die Markierung als Affinitätsmatrix
bewerkstelligt werden. Gegebenenfalls kann die Markierung anschließend aus
dem gereinigten NTP-Peptid durch verschiedene Mittel, wie unter
Verwendung gewisser Peptidasen, entfernt werden.
-
Die
Human-Immunglobulin-Scharnier- und Fc-Region könnte entweder am N-Terminus
oder C-Terminus
des NTP-Peptids vom Fachmann fusioniert werden. Das anschließende Fc-Fusionsprotein
könnte
unter Verwendung einer Protein A-Affinitätssäule gereinigt werden. Es ist
bekannt, dass Fc eine lange pharmakokinetische Halbwertszeit in
vivo zeigt, und es wurde gefunden, dass Proteine, die mit Fc fusioniert
sind, eine wesentlich größere Halbwertszeit
in vivo zeigen als das nicht fusionierte Gegenstück. Auch ermöglicht die
Fusion der Fc-Region eine Dimerisierung/Multimerisierung des Moleküls, welche
für die
Bioaktivität
einiger Moleküle nützlich sein
kann.
-
Die
5'-flankierende
Sequenz kann homolog (d.h. aus derselben Spezies und/oder demselben
Stamm wie die Wirtszelle), heterolog, d.h. von einer von der Wirtszellenspezies
oder dem Wirtszellenstamm verschiedenen Spezies), hybrid (d.h. eine
Kombination von 5'-flankierenden
Sequenzen aus mehr als einer Quelle), synthetisch sein oder sie
kann die native, das NTP-Peptid-Gen 5'-flankierende Sequenz sein. Als solche
kann die Quelle der 5'-flankierenden
Sequenz irgendein einzelliger prokaryotischer oder eukaryotischer
Organismus, jeder vertebrale oder nicht vertebrale Organismus oder
jede Pflanze sein, vorausgesetzt, dass die 5'-flankierende Sequenz in der Wirtszellen-Maschinerie
funktional ist und durch sie aktiviert werden kann.
-
Die
5'-flankierenden
Sequenzen, die in den Vektoren nützlich
sind, können
durch mehrere in der Technik wohlbekannte Verfahren erhalten werden.
Typisch sind hierin nützliche
5'-flankierende
Sequenzen außer der
die das NTP-Peptid-Gen flankierenden Sequenz früher durch Kartieren und/oder
durch Restriktionsendonuklease-Verdau identifiziert worden und können so
unter Verwendung der geeigneten Restriktionsendonukleasen aus der
geeigneten Gewebequelle isoliert werden. In einigen Fällen kann
die volle Nukleotidsequenz der 5'-flankierenden
Sequenz bekannt sein. Hier kann die 5'-flankierende
Sequenz unter Verwendung der oben für die Nukleinsäuresynthese
beschriebenen Verfahren synthetisiert oder kloniert werden.
-
Wenn
das ganze oder nur ein Teil der 5'-flankierenden Sequenz bekannt ist,
kann sie unter Verwendung von PCR und/oder anhand einer Durchmusterung
einer genomischen Bibliothek mit einem geeigneten Oligonukleotid
und/oder geeigneten 5'-flankierenden
Sequenzfragmenten aus derselben oder einer anderen Spezies erhalten
werden.
-
Wenn
die 5'-flankierende
Sequenz nicht bekannt ist, kann ein DNA-Fragment, das eine 5'-flankierende Sequenz enthält, aus
einem größeren DNA-Stück isoliert
werden, welches zum Beispiel eine codierende Sequenz oder selbst
ein weiteres Gen oder weitere Gene enthalten kann. Die Isolierung
kann mittels Restriktionsendonuklease-Verdau unter Verwendung eines
oder mehrerer sorgfältig
ausgewählter
Enzyme bewerkstelligt werden, um das geeignete DNA-Fragment zu isolieren.
Nach dem Verdau kann das gewünschte
Fragment durch Agarosegel-Reinigung, Qiagen®-Säule oder
andere dem Fachmann bekannte Verfahren isoliert werden. Die Auswahl
geeigneter Enzyme, um diesen Zweck zu bewerkstelligen, ist für den Fachmann
ohne weiteres ersichtlich.
-
Das
Replikationsstartelement ist typisch ein Teil von prokaryotischen
Expressionsvektoren, die im Handel erworben werden, und unterstützt die
Amplifikation des Vektors in einer Wirtszelle. Die Amplifikation des
Vektors auf eine gewisse Kopienzahl kann in einigen Fällen für eine optimale
Expression des NTP-Peptids wichtig sein. Wenn der Vektor der Wahl
keine Replikationsstartstelle enthält, kann eine auf der Grundlage
einer bekannten Sequenz chemisch synthetisiert und in den Vektor
ligiert werden. Das Transkriptionsterminationselement ist typisch
3' vom Ende der
das NTP-Peptid codierenden Sequenz angeordnet und dient dazu, die
Transkription des NTP-Peptids zu terminieren. Gewöhnlich ist
das Transkriptionsterminationselement in prokaryotischen Zellen
ein G-C-reiches Fragment, gefolgt von einer PolyT-Sequenz. Obwohl
das Element aus einer Bibliothek kloniert oder im Handel als Teil
eines Vektors erworben werden kann, kann es auch leicht unter Verwendung
von Verfahren für
die Nukleinsäuresynthese,
wie den oben beschriebenen, synthetisiert werden.
-
Ein
selektierbares Markergenelement codiert ein Protein, das für das Überleben
und das Wachstum einer Wirtszelle erforderlich ist, die in einem
selektiven Kulturmedium gezüchtet
wird. Typische Selektionsmarkergene codieren Proteine, die (a) eine
Resistenz gegen Antibiotika oder andere Toxine, z.B. Ampicillin,
Tetracyclin oder Kanamycin bei prokaryotischen Wirtszellen, verleihen,
(b) auxothrophe Defekte der Zelle komplementieren; oder (c) kritische
Nährstoffe
zuführen,
die aus komplexen Medien nicht erhältlich sind. Bevorzugte selektierbare
Marker sind das Kanamycin-Resistenzgen, das Ampicillin-Resistenzgen und
das Tetracyclin-Resistenzgen.
-
Das
Ribosomen-Bindungselement, üblicherweise
als Shine-Dalgarno-Sequenz (Prokaryoten) oder Kozak-Sequenz (Eurokaryoten)
bezeichnet, ist gewöhnlich
für die
Translationsinitiierung von mRNA erforderlich. Das Element ist typisch
3' zum Promotor
und 5' zur codierenden
Sequenz des zu synthetisierenden NTP-Peptids angeordnet. Die Shine-Dalgarno-Sequenz
ist unterschiedlich, aber sie ist typisch ein Polypurin (d.h. mit
einem hohen A-G-Gehalt). Viele Shine-Dalgarno-Sequenzen sind identifiziert
worden, von denen jede leicht vom Fachmann unter Verwendung von
oben angegebenen Verfahren synthetisiert und in einem prokaryotischen
Vektor verwendet werden kann.
-
In
den Fällen,
in denen es wünschenswert
ist, dass das NTP-Peptid aus der Wirtszelle sekretiert wird, kann
eine Signalsequenz verwendet werden, um das NTP-Peptid aus der Wirtszelle
zu lenken, wenn es synthetisiert ist, und der Carboxy-terminale
Teil des Proteins kann deletiert werden, um eine Membranverankerung zu
verhindern. Typisch ist die Signalsequenz in der codierenden Region
des NTP-Peptid-Gens
oder der cDNA oder direkt am 5'-Ende
der codierenden NTP-Peptid-Genregion angeordnet. Viele Signalsequenzen
sind identifiziert worden, und jede davon, die in der gewählten Wirtszelle
funktional ist, kann in Verbindung mit dem NTP-Peptid-Gen oder der
cDNA verwendet werden. Deshalb kann die Signalsequenz homolog oder
heterolog zum NTP-Peptid-Gen oder der cDNA sein und kann homolog
oder heterolog zum NTP-Peptid-Gen oder zur cDNA sein. Zusätzlich kann
die Signalsequenz unter Verwendung der angegebenen Verfahren chemisch
synthetisiert werden. In den meisten Fällen hat die Sekretion des
Polypeptids aus der Wirtszelle über
die Anwesenheit eines Signalpeptids die Entfernung des Amino-terminalen
Methionins aus dem Polypeptid zur Folge.
-
In
vielen Fällen
wird die Transkription des NTP-Peptid-Gens oder der NTP-Peptid-cDNA
durch das Vorhandensein von einem oder mehreren Introns in dem Vektor
erhöht;
dies trifft insbesondere zu, wenn das NTP-Peptid in eukaryotischen
Wirtszellen, insbesondere Säugetier-Wirtszellen
produziert wird. Die verwendeten Introns können von Natur aus innerhalb
des NTP-Peptid-Gens vorkommen, insbesondere, wenn das verwendete
Gen eine genomische Volllängen-Sequenz
oder ein Fragment davon ist. Wenn das Intron nicht von Natur aus
in dem Gen vorkommt (wie bei den meisten cDNAs), kann bzw. können das
bzw. die Intron(s) von einer andere Quelle erhalten werden. Die
Position des Introns in Bezug auf die flankierende Sequenz und das NTP-Peptid-Gen
ist im Allgemeinen wichtig, da das Intron transkribiert werden muss,
um wirksam zu sein. Dementsprechend ist, wenn das NTP-Peptid-Gen,
das in den Expressionsvektor inseriert ist, ein cDNA-Molekül ist, die
bevorzugte Position für
das Intron 3' zu
der Transkriptionsstartstelle und 5' von der polyA-Transkriptionsterminationssequenz.
Für die
NTP-Peptid-cDNA
wird das Intron oder werden die Introns bevorzugt auf einer Seite
oder der anderen (d.h. 5' oder
3') der cDNA lokalisiert
sein, so dass es diese kodierende Sequenz nicht unterbricht. Es
kann ein jegliches Intron aus einer jeglichen Quelle, einschließlich jeglicher
viraler, prokaryotischer und eukaryotischer (pflanzlicher oder tierischer)
Organismen, verwendet werden, um diese Erfindung in der Praxis auszuführen, vorausgesetzt,
dass es mit der oder den Wirtszelle(n), in welche es inseriert wird,
verträglich
ist. Auch umfasst werden hier synthetische Introns. Gegebenenfalls
kann mehr als ein Intron in dem Vektor verwendet werden.
-
Wenn
ein oder mehrere der Elemente, die oben erläutert worden sind, nicht bereits
in dem zu verwendenden Vektor vorhanden sind, können sie individuell erhalten
und in den Vektor ligiert werden. Verfahren, die verwendet werden,
um jedes der Elemente zu erhalten, sind dem Fachmann auf diesem
Gebiet wohlbekannt und sind vergleichbar mit den Verfahren, die
oben erläutert
worden sind (d.h. Synthese der DNA, Bibliotheks-Screening und dergleichen).
-
Die
endgültigen
Vektoren, die verwendet werden, um diese Erfindung in der Praxis
auszuführen,
werden typischerweise ausgehend von Ausgangsvektoren, wie einem
kommerziell erhältlichen
Vektor, konstruiert. Solche Vektoren können einige der Elemente, die
in dem komplettierten Vektor enthalten sein sollen, enthalten oder
nicht. Wenn keines der gewünschten
Elemente in dem Ausgangsvektor vorhanden ist, kann jedes Element
individuell in den Vektor ligiert werden, indem der Vektor mit der
bzw. den geeigneten Restriktionsendonuklease(n) derart geschnitten
wird, dass die Enden des hinein zu ligierenden Elements und die
Enden des Vektors für
eine Ligation verträglich
(kompatibel) sind. In einigen Fällen
kann es erforderlich sein, die Enden in stumpfe Enden zu überführen, damit
sie miteinander ligiert werden können,
um eine zufriedenstellende Ligation zu erhalten. Das Überführen in
stumpfe Enden wird bewerkstelligt, indem zuerst „kohäsive Enden" unter Verwendung von Klenow-DNA-Polymerase
oder T4-DNA-Polymerase
in Gegenwart von allen vier Nukleotiden aufgefüllt werden. Diese Vorgehensweise
ist in diesem Fachgebiet wohlbekannt und wird beispielsweise in Sambrook
et al., a.a.O., beschrieben. Alternativ können zwei oder mehrere der
Elemente, die in den Vektor inseriert werden sollen, zuerst zusammen
ligiert werden (wenn sie aneinander angrenzend positioniert sein sollen)
und dann in den Vektor ligiert werden.
-
Ein
zusätzliches
Verfahren zum Konstruieren des Vektors besteht darin, alle Ligationen
der verschiedenen Elemente gleichzeitig in einer Reaktionsmischung
auszuführen.
Hier werden viele Nonsense- oder nicht-funktionale Vektoren aufgrund
einer unkorrekten Ligation oder Insertion der Elemente erzeugt werden. Der
funktionale Vektor kann jedoch durch Restriktionsendonukleaseverdau
identifiziert und ausgewählt
werden.
-
Bevorzugte
Vektoren für
das praktische Ausführen
dieser Erfindung sind jene, die mit bakteriellen, Insekten- und
Säugetier-Wirtszellen
verträglich
sind. Solche Vektoren umfassen unter anderem pCRII, pCR3 und pcDNA3.1
(Invitrogen Company, San Diego, Kalif.), pBSII (Stratagene Company,
La Jolla, Kalif.), pET15b (Novagen, Madison, Wis.), PGEX (Pharmacia
Biotech, Piscataway, N.J.), pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, Kalif.),
pETL (BlueBacII; Invitrogen) und pFastBacDuaI (Gibco/BRL, Grand
Island, N.Y.).
-
Nachdem
der Vektor konstruiert worden ist und ein NTP-Peptid kodierendes
Nukleinsäuremolekül in die
korrekte Stelle des Vektors inseriert worden ist, kann der vervollständigte Vektor
in eine geeignete Wirtszelle für
eine Amplifizierung und/oder Polypeptidexpression inseriert werden.
Wirtszellen können
prokaryotische Wirtszellen (wie E. coli) oder eukaryotische Wirtszellen
(wie eine Hefezelle, eine Insektenzelle oder eine Vertebratenzelle)
sein. Die Wirtszelle kann, wenn sie unter geeigneten Bedingungen
kultiviert wird, NTP-Peptid synthetisieren, das nachfolgend gewonnen
werden kann aus dem Kulturmedium (wenn die Wirtszelle es in das Medium
sekretiert) oder direkt aus der Wirtszelle, die dieses produziert
(wenn es nicht sekretiert wird).
-
Nach
der Gewinnung kann das NTP-Peptid unter Verwendung von Verfahren,
wie Molekularsieb-Chromatographie,
Affinitätschromatographie
und dergleichen, gereinigt werden. Die Auswahl der Wirtszelle für die NTP-Peptid-Produktion
wird teilweise davon abhängen,
ob das NTP-Peptid glycosyliert oder phosphoryliert werden soll (in
welchem Falle eukaryotische Wirtszellen bevorzugt sind) und von
der Art und Weise, in welcher die Wirtszelle in der Lage ist, das
Protein in seine native Tertiärstruktur
zu falten (z.B. korrekte Orientierung von Disulfidbrücken u.s.w.),
so dass das biologische Protein hergestellt wird durch das NTP-Peptid, das
biologische Aktivität
aufweist. Das NTP-Peptid kann nach der Synthese unter Verwendung
von geeigneten chemischen Bedingungen, wie nachfolgend diskutiert,
gefaltet werden. Geeignete Zellen oder Zelllinien, die im Rahmen
der Erfindung nützlich
sind, umfassen Säugetierzellen,
wie Eierstockzellen des chinesischen Hamsters (CHO), humane embryonale
Nieren (HEK)-293- oder 293T-Zellen oder 3T3-Zellen. Die Auswahl
von geeigneten Säugetier-Wirtszellen
und Verfahren zur Transformation, Kultur, Amplifizierung, zum Screenen
und zur Produktproduktion und -reinigung können bewerkstelligt werden
durch die Fachleute auf diesem Gebiet unter Verwendung der hier
bereitgestellten Richtlinien. Andere geeignete Säugetier-Zelllinien umfassen
die Affen-COS-1- und -COS-7-Zelllinien und die CV-1-Zelllinie. Weitere
exemplarische Säugetier-Wirtszellen
umfassen Primaten-Zelllinien und Nagetier-Zelllinien, einschließlich transformierter
Zelllinien. Normale diploide Zellen, Zellstämme, die aus einer in vitro-Kultur
von primärem
Gewebe abgeleitet worden sind, wie auch primäre Explantate sind ebenfalls
geeignet. Kandidatenzellen können
hinsichtlich des Selektionsgens genotypisch defizient sein oder
können
ein dominant wirkendes Selektionsgen enthalten. Andere geeignete
Säugetier-Zelllinien
umfassen, sind aber nicht beschränkt
auf die Maus-Neuroblastom-N2A-Zellen, HeLa, Maus-L-929-Zellen, 3T3-Linien,
abgeleitet von Swiss-, Balb-c- oder NIH-Mäusen, BHK- oder HaK-Hamster-Zelllinien.
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In ähnlicher
Weise nützlich
als Wirtszellen, die für
die Erfindung geeignet sind, sind Bakterienzellen. Beispielsweise
sind die verschiedenen Stämme
von E. coli (z.B. HB101, DH5.alpha, DH10 und MC1061) als Wirtszellen
auf dem Gebiet der Biotechnologie wohlbekannt. Verschiedene Stämme von
B, subtilis, Pseudomonas sp., andere Bacillus spp., Streptomyces
spp. und dergleichen können
in diesem Verfahren ebenfalls eingesetzt werden. Es stehen auch
viele Stämme
von Hefezellen, die den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind,
als Wirtszellen für
eine Expression der Polypeptide der Erfindung zur Verfügung.
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Zusätzlich können, wo
gewünscht,
Insektenzellsysteme in den Verfahren der Erfindung eingesetzt werden.
Solche Systeme werden beispielsweise in Kitts et al. (Biotechniques,
14: 810-817 [1993]), Lucklow (Curr. Opin. Biotechnol., 4: 564-572
[1993]) und Lucklow et al. (J. Virol., 67: 4566-4579 [1993]) beschrieben. Bevorzugte
Insektenzellen sind SF-9 und Hi5 (Invitrogen, Carlsbad, Kalif.).
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Eine
Insertion (auch bezeichnet als Transformation oder Transfektion)
des Vektors in die ausgewählte Wirtszelle
kann bewerkstelligt werden unter Verwendung von solchen Verfahren,
wie der Calciumchlorid-, Elektroporations-, Mikroinjektions-, Lipofektions-
oder der DEAE-Dextran-Methode. Das ausgewählte Verfahren wird teilweise
von der Art von Wirtszelle, die verwendet werden soll, abhängen. Diese
Verfahren und andere geeignete Verfahren sind den Fachleuten auf
diesem Gebiet wohlbekannt und werden beispielsweise in Sambrook
et al., a.a.O., erläutert.
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Die
den Vektor enthaltenden (d.h. transformierten oder transfizierten)
Wirtszellen können
kultiviert werden unter Verwendung von Standardmedien, die den Fachleuten
auf diesem Gebiet bekannt sind. Die Medien werden üblicherweise
alle Nährstoffe
enthalten, die für
die Vermehrung und das Überleben
der Zellen erforderlich sind. Geeignete Medien für das Kultivieren von E. coli-Zellen
sind beispielsweise Luria Broth (LB) und/oder Terrific Broth (TB).
Geeignete Medien für
das Kultivieren von eukaryotischen Zellen sind RPMI 1640, MEM, DMEM,
die alle mit Serum und/oder Wachstumsfaktoren ergänzt werden
können,
sofern diese von der jeweiligen Zelllinie, die kultiviert wird,
benötigt
werden. Ein geeignetes Medium für
Insektenkulturen ist Graces-Medium, ergänzt mit Yeastolate, Lactalbumin-Hydrolysat
und/oder fötalem
Kälberserum,
sofern nötig.
Typischerweise wird ein Antibiotikum oder eine andere Verbindung,
die für
eine selektive Vermehrung nur der transformierten Zellen nützlich ist,
als eine Ergänzung
zu dem Medium hinzugesetzt. Die zu verwendende Verbindung wird durch
das auf dem Plasmid, mit dem die Wirtszelle transformiert worden
ist, vorhandene selektierbare Markerelement diktiert werden. Wenn
das selektierbare Markerelement beispielsweise Kanamycinresistenz
ist, wird die zu dem Kulturmedium hinzugesetzte Verbindung Kanamycin
sein.
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Die
Menge von in der Wirtszelle produziertem NTP-Peptid kann ausgewertet
werden unter Verwendung von Standardmethoden, die in diesem Fachgebiet
bekannt sind. Solche Methoden umfassen, ohne Einschränkukng,
Western-Blot-Analyse, SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese, nicht-denaturierende Gelelektrophorese,
HPLC-Trennung, Massenspektroskopie, Immunpräzipitation und/oder Aktivitätsassays,
wie DNA-Bindungs-Gel-Shift-Assays (DNA-Bindungs-Gel-Verschiebungs-Assays).
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Wenn
das NTP-Peptid so gestaltet worden ist, dass es aus den Wirtszellen
sekretiert wird, kann die Hauptmenge des NTP-Peptids in dem Zellkulturmedium
gefunden werden. Auf diese Weise hergestellte Proteine werden typischerweise
kein aminoterminales Methionin aufweisen, da dieses während der
Sekretion aus der Zelle entfernt wird. Wenn das NTP-Peptid jedoch
aus den Wirtszellen nicht sekretiert wird, wird es im Zytoplasma
und/oder im Zellkern (bei eukaryotischen Wirtszellen) oder im Zytosol
(bei gramnegativen Bakterien als Wirtszellen) vorhanden sein und
es kann ein aminoterminales Methionin aufweisen.
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Für ein im
Zytoplasma und/oder in dem Zellkern der Wirtszellen befindliches
NTP-Peptid werden die Wirtszellen typischerweise zuerst mechanisch
oder mittels Detergens aufgebrochen, so dass sie den intrazellulären Inhalt
in eine gepufferte Lösung
freisetzen. NTP-Peptid kann dann aus dieser Lösung isoliert werden.
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Die
Reinigung von NTP-Peptid aus einer Lösung kann unter Verwendung
von verschiedenen Techniken bewerkstelligt werden. Wenn das Protein
derart synthetisiert worden ist, dass es eine Markierung, wie hexaHistidin
(z.B. NTP-Peptid/hexaHis) oder ein anderes kleines Peptid, wie FLAG
(Sigma-Aldrich, St. Louis, MI) oder das Calmodulin-bindende Peptid
(Stratagene, La Jolla, CA), an entweder dessen Carboxyl- oder Aminoterminus
enthält,
kann es im Wesentlichen in einem einstufigen Verfahren gereinigt
werden durch Hindurchleiten der Lösung durch eine Affinitätssäule, wo
die Säulenmatrix
eine hohe Affinität
für die
Markierung oder für das
Protein direkt (d.h. ein monoklonaler Antikörper, der spezifisch das NTP-Peptid
erkennt) hat. Beispielsweise bindet Polyhistidin mit hoher Affinität und Spezifität an Nickel,
Zink und Cobalt; dementsprechend kann eine an immobilisierten Metallionen
erfolgende Affinitätschromatographie,
die ein auf Nickel basierendes Affinitätsharz (wie es in Qiagens QIAexpress
system oder Invitrogens Xpress System verwendet wird) oder ein auf
Cobalt basierendes Affinitätsharz
(wie es in dem Talon-System von BD Biosciences-CLONTECH verwendet
wird) einsetzt, zur Reinigung von NTP-Peptid/polyHis verwendet werden.
(Siehe beispielsweise Ausubel et al., Hrsg., Current Protocols in
Molecular Biology, Abschnitt 10.11.8, John Wiley & Sons, New York
[1993]).
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Wenn
das NTP-Peptid ohne eine angeheftete Markierung hergestellt wird
und keine Antikörper
zur Verfügung
stehen, können
andere wohlbekannte Vorgehensweisen zur Reinigung verwendet werden.
Solche Vorgehensweisen umfassen, ohne Einschränkung, Ionenaustauschchromatographie,
Hydroxylapatit-Chromatographie, hydrophobe Wechselwirkungschromatographie,
Molekularsieb-Chromatographie,
HPLC, native Gelelektrophorese in Kombination mit Gelelution und
präparative
isoelektrische Fokussierung (Isoprime-Gerät/Technik, Hoefer Scientific).
In einigen Fällen
können
zwei oder mehrere von diesen Techniken kombiniert werden, um erhöhte Reinheit
zu erzielen.
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Wenn
antizipiert wird, dass das NTP-Peptid primär intrazellulär gefunden
werden wird, kann das intrazelluläre Material (einschließlich Einschlusskörpern bei
gramnegativen Bakterien) aus der Wirtszelle extrahiert werden unter
Verwendung einer jeglichen Standardtechnik, die dem Fachmann auf
diesem Gebiet bekannt ist. Beispielsweise können die Wirtszellen durch
French press, Homogenisierung und/oder Beschallung, gefolgt von
Zentrifugation, lysiert werden, um den Inhalt des Periplasmas/Zytoplasmas
freizusetzen. Wenn das NTP-Peptid Einschlusskörper im Zytosol gebildet hat,
können
die Einschlusskörper
oftmals an die inneren und/oder äußeren Zellmembranen
binden und werden dementsprechend primär im Pelletmaterial nach einer Zentrifugation
gefunden werden. Das Pelletmaterial kann dann bei pH-Extremen oder
mit einem chaotropen Mittel, wie einem Detergens, Guanidin, Guanidin-Derivaten, Harnstoff
oder Harnstoff-Derivaten, in Gegenwart eines Reduktionsmittels,
wie Dithiothreitol bei alkalischem pH oder Triscarboxyethylphosphin
bei saurem pH, behandelt werden, um die Einschlusskörper freizusetzen,
auseinanderzubrechen und zu solubilisieren. Das NTP-Peptid in seiner jetzt
löslichen
Form kann dann analysiert werden unter Verwendung von Gelelektrophorese,
Immunpräzipitation
oder dergleichen. Wenn gewünscht
wird, das NTP-Peptid zu isolieren, kann die Isolierung bewerkstelligt
werden unter Verwendung von Standardmethoden wie jenen, die nachfolgend
und in Marston et al. (Meth. Enz., 182: 264-275 [1990]) erläutert werden.
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In
einigen Fällen
ist das NTP-Peptid möglicherweise
nach einer Isolierung nicht biologisch aktiv. Verschiedene Methoden
zum Umfalten oder Umwandeln des Polypeptids in seine Tertiärstruktur
und zum Erzeugen von Disulfidbrücken
können
verwendet werden, um biologische Aktivität wieder herzustellen. Solche
Methoden umfassen das Exponieren des solubilisierten Polypeptids
gegenüber
einem pH üblicherweise über 7 und
in Gegenwart einer bestimmten Konzentration eines chaotropen Mittels.
Die Auswahl des chaotropen Mittels erfolgt sehr ähnlich zu den Wahlen, die für die Solubilisierung
von Einschlusskörpern
getroffen werden, aber üblicherweise
bei geringerer Konzentration, und es ist nicht notwendigerweise
das gleiche chaotrope Mittel, wie es für die Solubilisierung verwendet
wird. In den meisten Fällen
wird die Umfaltungs/Oxidationslösung auch
ein Reduktionsmittel oder ein Reduktionsmittel plus dessen oxidierte
Form in einem speziellen Verhältnis enthalten,
um ein bestimmtes Redoxpotential zu erzeugen, welches ermöglicht,
dass bei der Bildung der Cystein-Brücke(n) des Proteins Disulfidverschiebungen
auftreten. Einige der üblicherweise
verwendeten Redox-Paare umfassen Cystein/Cystamin, Glutathion (GSH)/Dithiobis-GSH,
Kupfer(II)-chlorid, Dithiothreitol (DTT)/Dithian-DTT, 2-Mercaptoethanol (bME)/Dithio-b(ME).
In vielen Fällen
kann ein Colösungsmittel
erforderlich sein, um die Effizienz der Umfaltung zu erhöhen, und
die üblicheren
Reagenzien, die für
diesen Zweck verwendet werden, umfassen Glycerol, Polyethylenglycol
mit verschiedenen Molekulargewichten und Arginin.
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Wenn
in der Wirtszelle keine NTP-Peptid-Einschlusskörper in einem signifikanten
Ausmaß gebildet werden,
kann das NTP-Peptid primär
in dem Überstand
nach der Zentrifugation des Zellhomogenisats gefunden werden und
das NTP-Peptid kann aus dem Überstand
unter Verwendung von Methoden wie jenen, die nachfolgend erläutert werden,
isoliert werden.
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In
jenen Situationen, wo es bevorzugt ist, das NTP-Peptid teilweise
oder vollständig
zu isolieren, kann eine Reinigung bewerkstelligt werden unter Verwendung
von Standardmethoden, die dem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannt
sind. Solche Methoden umfassen, ohne Einschränkung, eine Trennung durch
Elektrophorese, gefolgt von einer Elektroelution, verschiedene Arten
von Chromatographie (Immunaffinität, Molekularsieb und/oder Ionenaustausch)
und/oder Hochdruckflüssigkeitschromatographie.
In einigen Fällen
kann es bevorzugt sein, mehr als eine dieser Methoden für eine vollständige Reinigung
zu verwenden.
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Zusätzlich zum
Herstellen und Reinigen von NTP-Proteinen oder NTP-Peptiden unter
Verwendung der Techniken der in vitro-DNA-Rekombination können NTP-Peptide
durch Methoden chemischer Synthese (wie Festphasen-Peptidsynthese)
hergestellt werden unter Verwendung von Techniken, die in diesem
Fachgebiet bekannt sind, wie jene, die von Merrifield et al. (J.
Am. Chem. Soc., 85: 2149 [1963]), Houghten et al. (Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 82: 5132 [1985]) und Stewart und Young (Solid Phase Peptide
Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, III. [1984]) erläutert worden
sind. Solche Polypeptide können
mit oder ohne ein Methionin am Aminoterminus synthetisiert werden.
Chemisch synthetisierte NTP-Proteine oder NTP-Peptide können unter
Verwendung von Verfahren, die in diesen Referenzen erläutert werden,
oxidiert werden, um Disulfidbrücken zu
bilden. Es wird erwartet, dass die NTP-Proteine oder NTP-Peptide
biologische Aktivität,
die mit NTP-Proteinen oder NTP-Peptiden, die rekombinant hergestellt
oder aus natürlichen
Quellen gereinigt worden sind, vergleichbar ist, aufweisen und dementsprechend
austauschbar mit einem rekombinanten oder natürlichen NTP-Protein oder NTP-Peptid verwendet
werden können.
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Heutzutage
existiert eine Anzahl von Organisationen, die in der Lage sind,
die Related Proteins (Verwandte Proteine), Related Peptides (Verwandte
Peptide) und NTP-Peptide, die hier beschrieben werden, zu synthetisieren.
Beispielsweise kann, ist die Sequenz eines NTP-Peptids gegeben,
die Organisation das Peptid synthetisieren und das synthetisierte
Peptid mit einer begleitenden Dokumentation und einem Nachweis der Identität des Peptids
zuschicken.
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Die
Erfindung ist auf die Verwendung von NTP-Peptiden für das Behandeln
von Zuständen,
welche die Entfernung von Zellen erfordern, wie gutartige und maligne
Tumore, glanduläre
(z.B. Prostata-)Hyperplasie, unerwünschte Gesichtsbehaarung, Warzen
und unerwünschtes
Fettgewebe, gerichtet. Ein solches Verfahren umfasst, einem Säugetier,
welches dies benötigt,
eine therapeutisch wirksame Menge von NTP-Peptid zu verabreichen.
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Der
Zustand können
beispielsweise Tumore von Lunge, Brust, Magen, Pankreas, Prostata,
Blase, Knochen, Ovar, Haut, Niere, Sinus, Kolon, Darm, Magen, Rektum, Ösophagus,
Blut, Hirn und dessen Umhüllungen,
Rückenmark
und dessen Umhüllungen,
Muskel, Bindegewebe, Nebenniere, Nebenschilddrüse, Schilddrüse, Uterus,
Testes, Hypophyse, Reproduktionsorganen, Leber, Gallenblase, Auge,
Ohr, Nase, Rachen, Mandeln, Mund, Lymphknoten und Lymphsystem (z.B.
lymphatisches Gewebe) und anderen Organen sein.
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Wie
hier verwendet, soll der Begriff „maligner Tumor" alle Formen von
humanen Karzinomen, Sarkomen und Melanomen, die in den schlecht
differenzierten, moderat differenzierten und gut differenzierten
Formen vorkommen, umfassen.
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Diese
Erfindung befriedigt einen Bedarf in diesem Fachgebiet an Behandlungen,
die gutartige Tumore mit weniger Risiko und weniger der unerwünschten
Nebenwirkungen eines chirurgischen Eingriffs entfernen können. Eine
Entfernung von gutartigen Tumoren in chirurgisch gefährlichen
Bereichen, wie in tief gelegenen Bereichen des Körpers (z.B. Gehirn, Herz, Lungen
und andere) wird besonders benötigt.
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Die
Verwendung von NTP-Peptiden für
das Behandeln von Zuständen,
wo Zellen entfernt werden müssen,
kann in Verbindung mit herkömmlichen
Methoden zum Behandeln von solchen Zuständen, wie chirurgischer Entfernung,
Chemotherapie und Bestrahlung, verwendet werden. NTP-Peptid kann
vor, während oder
nach solchen herkömmlichen
Behandlungen verabreicht werden.
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Der
zu behandelnde Zustand kann auch eine Hyperplasie, Hypertrophie
oder eine Wucherung eines Gewebes, ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus Lunge, Brust, Magen, Pankreas, Prostata, Blase, Knochen, Ovar,
Haut, Niere, Sinus, Kolon, Darm, Magen, Rektum, Ösophagus, Blut, Hirn und dessen
Umhüllungen,
Rückenmark
und dessen Umhüllungen,
Muskel, Bindegewebe, Nebenniere, Nebenschilddrüse, Schilddrüse, Uterus,
Testes, Hypophyse, Reproduktionsorganen, Leber, Gallenblase, Auge,
Ohr, Nase, Rachen, Mandeln, Mund und Lymphknoten und Lymphsystem,
sein.
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Andere
Zustände,
die unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung behandelt werden
können,
umfassen, sind aber nicht beschränkt
auf viral, bakteriell oder aufgrund von Parasiten verändertes
Gewebe, ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus Lunge, Brust, Magen, Pankreas, Prostata,
Blase, Knochen, Ovar, Haut, Niere, Sinus, Kolon, Darm, Magen, Rektum, Ösophagus,
Blut, Hirn und dessen Umhüllungen,
Rückenmark
und dessen Umhüllungen,
Muskel, Bindegewebe, Nebenniere, Nebenschilddrüse, Schilddrüse, Uterus, Testes,
Hypophyse, Reproduktionsorganen, Leber, Gallenblase, Auge, Ohr,
Nase, Rachen, Mandeln, Mund und Lymphknoten und Lymphsystem.
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Der
zu behandelnde Zustand kann auch eine Fehlbildung oder Erkrankung/Störung eines
Gewebes, ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus Lunge, Brust, Magen, Pankreas, Prostata,
Blase, Knochen, Ovar, Haut, Niere, Sinus, Kolon, Darm, Magen, Rektum, Ösophagus,
Blut, Hirn und dessen Umhüllungen,
Rückenmark
und dessen Umhüllungen,
Muskel, Bindegewebe, Nebenniere, Nebenschilddrüse, Schilddrüse, Uterus, Testes,
Hypophyse, Reproduktionsorganen, Leber, Gallenblase, Auge, Ohr,
Nase, Rachen, Mandeln, Mund und Lymphknoten und Lymphsystem, sein.
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Insbesondere
kann der zu behandelnde Zustand Mandelhypertrophie, Prostatavergrößerung,
Psoriasis, Ekzeme, Dermatosen oder Hämorrhoiden sein. Der zu behandelnde
Zustand kann eine vaskuläre
Erkrankung, wie Atherosklerose oder Arteriosklerose, oder eine vaskuläre Erkrankung,
wie Krampfadern, sein. Der zu behandelnde Zustand kann auch eine
kosmetische Modifikation an einem Gewebe, wie Haut, Auge, Ohr, Nase,
Rachen, Mund, Muskel, Bindegewebe, Haar oder Brustgewebe, sein.
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Therapeutische
Zusammensetzungen von NTP-Peptiden liegen innerhalb des Umfangs
der Erfindung. Solche Zusammensetzungen können eine therapeutisch wirksame
Menge eines NTP-Peptids in einer Mischung mit einem pharmazeutisch
annehmbaren Träger
umfassen. Das Trägermaterial
kann Wasser für
die Injektion, vorzugsweise ergänzt
mit anderen Materialien, die in Lösungen für eine Verabreichung an Säugetiere üblich sind,
sein. Typischerweise wird ein NTP-Peptid für eine therapeutische Verwendung
in Form einer Zusammensetzung verabreicht werden, welche gereinigtes
NTP-Peptid in Verbindung mit einem oder mehreren physiologisch annehmbaren
Trägern,
Hilfsstoffen oder Verdünnungsmitteln
umfasst. Neutrale gepufferte Kochsalzlösung oder Kochsalzlösung gemischt
mit Serumalbumin sind exemplarische geeignete Träger. Das Produkt wird vorzugsweise
unter Verwendung von geeigneten Hilfsstoffen (z.B. Sucrose) als
ein Lyophilisat formuliert. Andere Standardträger, -verdünnungsmittel und -hilfsstoffe
können
aufgenommen werden, sofern gewünscht.
Zusammensetzungen, welche Puffer umfassen, die den Fachleuten auf
diesem Gebiet bekannt sind, mit einem geeigneten Bereich von pH-Werten,
einschließlich
Tris-Puffer mit einem pH von etwa 7,0 bis 8,5 oder Acetatpuffer
mit einem pH von etwa 4,0 bis 5,5, die des Weiteren Sorbitol oder
einen geeigneten Ersatz dafür
umfassen können.
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Die
NTP-Peptide können
allein, gemeinsam oder in Kombination mit anderen pharmazeutischen
Zusammensetzungen, wie Zytokinen, Wachstumsfaktoren, Antibiotika,
Apoptose-induzierenden Mitteln, antiinflammatorisch wirkenden Mitteln
und/oder chemotherapeutischen Mitteln, verwendet werden, sofern
dies für die
behandelte Indikation geeignet ist.
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Diese
Erfindung umfasst auch therapeutische Zusammensetzungen von NTP-Peptiden,
die Dendrimere, Fullerene und andere synthetische Moleküle, Polymere
und Makromoleküle,
wo das NTP-Peptid
in das Molekül,
Polymer oder Makromolekül,
entweder selbst oder in Verbindung mit anderen Molekülspezies,
wie einem tumorspezifischen Marker, eingeschlossen ist, einsetzen.
Beispielsweise gibt das U.S.-Patent Nr. 5,714,166, Bioactive and/or
Targeted Dendrimer Conjugates, ein Verfahren zur Herstellung und
Verwendung von unter anderem dendritischen Polymer-Konjugaten, welche
aus wenigstens einem Dendrimer mit einer oder mehreren ein Ziel
ansteuernden Komponente(n) und wenigstens einem bioaktiven Mittel,
welches damit konjugiert ist, gebildet werden, an.
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Diese
Erfindung umfasst auch therapeutische Zusammensetzungen von NTP-Peptiden
und Arzneimittelabgabevehikel, wie Lipidemulsionen, Micellenpolymere,
Polymer-Mikrosphären,
elektroaktive Polymere, Hydrogele und Liposome.
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Feste
Dosierungsformen für
eine orale Verabreichung umfassen, sind aber nicht beschränkt auf
Kapseln, Tabletten, Pillen, Pulver und Körnchen. In solchen festen Dosierungsformen
ist die aktive Verbindung vorzugsweise mit mindestens einem der
folgenden gemischt: (a) einem oder mehreren inerten Hilfsstoffen
(oder Träger),
wie Natriumcitrat oder Dicalciumphosphat; (b) Füllstoffen oder Streckmitteln,
wie Stärken,
Lactose, Sucrose, Glucose, Mannitol und Kieselsäure; (c) Bindemitteln, wie
Carboxymethylcellulose, Alginaten, Gelatine, Polyvinylpyrrolidon,
Sucrose und Gummiarabicum; (d) Feuchthaltemitteln, wie Glycerol;
(d) Abbaumitteln, wie Agar-Agar, Calciumcarbonat, Kartoffel- oder
Tapioca-Stärke,
Alginsäure,
bestimmten komplexen Silicaten und Natriumcarbonat; (f) Auflösungsverzögerern,
wie Paraffin; (g) Absorptionsbeschleunigern, wie quartären Ammoniumverbindungen;
(h) Benetzungsmitteln, wie Acetylalkohol und Glycerolmonostearat;
(i) Adsorptionsmitteln, wie Kaolin und Bentonit; und (j) Gleitmitteln,
wie Talk, Calciumstearat, Magnesiumstearat, festen Polyethylenglycolen,
Natriumlaurylsulfat oder Mischungen davon. Bei Kapseln, Tabletten
und Pillen können
die Dosierungsformen auch puffernd wirkende Mittel umfassen.
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Flüssige Dosierungsformen
für eine
orale Verabreichung umfassen pharmazeutisch annehmbare Emulsionen,
Lösungen,
Suspensionen, Sirupe und Elixire. Zusätzlich zu den wirksamen Verbindungen
können die
flüssigen
Dosierungsformen inerte Verdünnungsmittel,
die in diesem Fachgebiet üblicherweise
verwendet werden, wie Wasser oder andere Lösungsmittel, Solubilisierungsmittel
und Emulgatoren umfassen. Exemplarische Emulgatoren sind Ethylalkohol,
Isopropylalkohol, Ethylcarbonat, Ethylacetat, Benzylalkohol, Benzylbenzoat,
Propylenglycol, 1,3-Butylenglycol, Dimethylformamid, Öle, wie
Baumwollsamenöl,
Erdnussöl,
Maiskeimöl,
Olivenöl,
Rizinusöl
und Sesamöl,
Glycerol, Tetrahydrofurfurylalkohol, Polyethylenglycole, Fettsäureester von
Sorbitan oder Mischungen von diesen Substanzen und dergleichen umfassen.
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Neben
solchen inerten Verdünnungsmitteln
kann die Zusammensetzung auch Adjuvantien oder Hilfssubstanzen,
wie Benetzungsmittel, emulgierend und suspendierend wirkende Mittel,
Süßungsmittel,
Geschmack verleihende und parfümierende
Mittel, umfassen.
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Aktuelle
Dosierungshöhen
von Wirkstoffen in den Zusammensetzungen der Erfindung können variiert werden,
um eine Menge von NTP-Peptid zu erhalten, die wirksam ist, um eine
gewünschte
therapeutische Reaktion für
eine bestimmte Zusammensetzung und ein bestimmtes Verabreichungsverfahren
zu erhalten. Die ausgewählte
Dosierungshöhe
hängt dementsprechend
von der gewünschten
therapeutischen Wirkung, der Verabreichungsroute, der gewünschten
Behandlungsdauer und anderen Faktoren ab.
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Bei
Säugetieren,
einschließlich
des Menschen, können
die wirksamen Mengen auf der Grundlage der Körperoberfläche verabreicht werden. Die
wechselseitige Beziehung von Dosierungen für Tiere von verschiedenen Größen, Spezies
und Menschen (basierend auf mg/M2 Körperoberfläche) wird
von E.J. Freireich et al., Cancer Chemother. Rep., 50(4): 219 (1966)
beschrieben. Die Körperoberfläche kann
näherungsweise
bestimmt werden aus der Größe und dem
Gewicht eines Individuums (siehe z.B. Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals,
Ardsley, N.Y., S. 537-538 (1970).
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Die
gesamte tägliche
Dosis des an einen Wirt verabreichten NTP-Peptids kann in einer
einzelnen Dosis oder aufgeteilten Dosen verabreicht werden. Dosierungseinheit-Zusammensetzungen
können
solche Mengen von solchen Untervielfachen („submultiples") davon enthalten,
wie sie verwendet werden können,
um die tägliche
Dosis auszumachen. Es versteht sich jedoch, dass die spezielle Dosishöhe für einen
jeglichen bestimmten Patienten von verschiedenen Faktoren abhängen wird,
einschließlich
des Körpergewichts,
der allgemeinen Gesundheit, des Geschlechts, der Diät, des Zeitpunkts
und der Route der Verabreichung, der Wirkkraft des verabreichten
Arzneimittels, Raten von Absorption und Exkretion, Kombination mit
anderen Arzneimitteln und der Schwere der jeweiligen Erkrankung,
die behandelt wird.
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Die
NTP-Peptid-Zusammensetzung gemäß der Erfindung
kann intramuskulär,
oral, intravenös,
intraperitoneal, intrazerebral (intraparenchymal), intrazerebroventrikulär, intratumoral,
intraläsional,
intradermal, intrathekal, intranasal, intraokular, intraarteriell,
topisch, transdermal, über
ein Aerosol, Infusion, Bolus-Injektion, über eine Implantationsvorrichtung,
ein Depot-Freisetzungssystem u.s.w. verabreicht werden.
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Das
NTP-Peptid der Erfindung kann auch verabreicht werden durch eine
transdermale oder transkutane Route. Ein Beispiel für eine solche
Ausführungsform
ist die Verwendung eines Pflasters. Insbesondere kann ein Pflaster
hergestellt werden mit einer feinen Suspension von NTP-Peptid in
beispielsweise Dimethylsulfoxid (DMSO) oder einer Mischung von DMSO
mit Baumwollsamenöl
und in Kontakt mit der Haut der einen Tumor tragenden Säugetiere
entfernt von der Stelle des Tumororts innerhalb einer Hauttasche
gebracht werden. Andere Medien oder Mischungen davon mit anderen
Lösungsmitteln
und festen Trägern
würden
ebenso in gleicher Weise funktionieren. Das Pflaster kann die NTP-Peptid-Verbindung
in Form einer Lösung
oder einer Suspension enthalten. Das Pflaster kann dann auf die
Haut des Patienten aufgebracht werden beispielsweise mittels des
Einführens
von diesem in eine Hauttasche des Patienten, die durch Falten und
Zusammenhalten der Haut mittels Stichen, Klammern oder anderen Haltevorrichtungen
gebildet wird. Diese Tasche sollte auf eine solche Weise eingesetzt
werden, dass ein kontinuierlicher Kontakt mit der Haut ohne Behinderung
des Säugetiers
sichergestellt wird. Neben einer Verwendung einer Hauttasche kann
eine jegliche Vorrichtung verwendet werden, die die feste Platzierung
des Pflasters in Kontakt mit der Haut sicherstellt. Es könnte beispielsweise
eine klebende Bandage verwendet werden, um das Pflaster auf der
Haut an Ort und Stelle zu haften.
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NTP-Peptid
kann in einer Depot-Formulierung oder -zubereitung verabreicht werden.
Geeignete Beispiele für
Depot-Zubereitungen umfassen semipermeable Polymermatrices in Form
von geformten Gegenständen,
z.B. Filmen, oder Mikrokapseln. Depot-Matrices umfassen Polyester,
Hydrogele, Polylactide (
U.S. 3,773,919 ,
EP 58,481 ), Copolymere von
L-Glutaminsäure
und gamma-Ethyl-L-glutamat (Sidman et al., Biopolymers, 22: 547-556
[1983]), Poly-(2-hydroxyethylmethacrylat) (Langer et al., J. Biomed.
Mater. Res., 15: 167-277 [1981] und Langer, Chem. Tech., 12: 98-105
[1982], Ethylenvinylacetat (Langer et al., a.a.O.) oder Poly-D(–)-3-hydroxybuttersäure (
EP 133,988 ). Depot-Zusammensetzungen
können
auch Liposome umfassen, die durch jegliche von mehreren Methoden,
die in diesem Fachgebiet bekannt sind, hergestellt werden können (z.B.
Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-3692 [1985];
EP 36,676 ;
EP 88,046 ; und
EP 143,949 ).
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Eine
andere Verabreichungsroute für
ein NTP-Peptid der Erfindung wird realisiert durch direkte oder indirekte
Infusion von NTP-Peptid in den Tumor oder ein anderes Gewebe, welches
behandelt werden soll. Ein Beispiel für eine solche Ausführungsform
ist die direkte Injektion von NTP-Peptid in den Tumor oder ein anderes
Gewebe, welches behandelt werden soll. Die Behandlung kann aus einer
einzelnen Injektion, einer Mehrzahl von Injektionen zu einer Gelegenheit
oder einer Reihe von Injektionen über einen Zeitraum von Stunden, Tagen
oder Monaten bestehen, wobei die Regression oder Zerstörung des
Tumors oder des anderen Gewebes, welches behandelt werden soll,
mittels Biopsie, Bildgebung oder anderen Methoden zur Überwachung von
Gewebewachstum überwacht
wird. Die Injektion in den Tumor oder ein anderes Gewebe, welches
behandelt werden soll, kann durch eine Vorrichtung erfolgen, die
in eine Öffnung,
wie die Nase, den Mund, das Ohr, die Vagina, das Rektum oder die
Urethra, oder durch einen Einschnitt eingeführt wird, um den Tumor oder
das Gewebe in vivo zu erreichen, und kann in Verbindung mit einem
bildgebenden oder optischen System, wie einem Ultraschall- oder
Fiberendoskop, ausgeführt
werden, um die geeignete Stelle für die Injektion(en) zu identifizieren.
Ein anderes Beispiel einer solchen Ausführungsform ist die Verwendung
einer Vorrichtung, die eine konstante Infusion von NTP-Peptid zu
dem Gewebe über
die Zeit gewährleisten
kann.
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Eine
andere Verabreichungsroute für
ein NTP-Peptid der Erfindung wird realisiert in Verbindung mit einem
chirurgischen oder ähnlichen
Eingriff, welcher eingesetzt wird, um Tumor- oder anderes Gewebe
oder zelluläre
Elemente, die entfernt oder zerstört werden müssen oder von denen gewünscht wird,
dass sie entfernt oder zerstört
werden, physisch herauszuschneiden, zu entfernen oder auf andere
Weise abzutöten
oder zu zerstören,
wobei ein NTP-Peptid der Erfindung verabreicht wird an den bzw.
die unmittelbaren Bereich(e), welche(r) die Fläche(n), wo der Tumor oder das
andere Gewebe entfernt worden ist, umgibt bzw. umgeben, um jegliche
Tumorzellen oder andere zelluläre
Elemente, die durch den Eingriff nicht entfernt oder zerstört worden
sind, zu zerstören
oder deren Vermehrung zu behindern.
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Eine
andere Verabreichungsroute für
ein NTP-Peptid der Erfindung wird realisiert durch Implantierung einer
Vorrichtung in den Tumor oder ein anderes Gewebe, das behandelt
werden soll. Ein Beispiel einer solchen Ausführungsform ist die Implantierung
eines NTP-Peptid enthaltenden Plättchens
(„wafer") in den Tumor oder
das andere Gewebe, das behandelt werden soll. Das Plättchen setzt
eine therapeutische Dosis von NTP-Peptid in das Gewebe über die
Zeit frei. Alternativ oder zusätzlich
kann die Zusammensetzung lokal über eine
Implantierung einer Membran, eines Schwamms oder eines anderen geeigneten
Materials, auf welches das NTP-Peptid absorbiert worden ist, in
den befallenen Bereich verabreicht werden. Wenn eine Implantationsvorrichtung
verwendet wird, kann die Vorrichtung in ein jegliches geeignetes
Gewebe oder Organ implantiert werden und die Abgabe des NTP-Peptids
kann direkt durch die Vorrichtung als Bolus oder über eine
kontinuierliche Verabreichung oder über einen Katheter unter Verwendung
einer kontinuierlichen Infusion erfolgen.
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Beispiel 1: (nur zum Vergleich)
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Der
Zweck dieses Beispiels war, die Wirkung von NTP-Peptid Nr. 7 auf
Gewebe an Injektionsorten zu bestimmen.
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Vier
normalen Ratten wurde NTP-Peptid Nr. 7 in Kochsalzlösung in
Mengen von 100 bis 400 ml in Konzentrationen von 0,1-1 mg/ml, abgegeben
aus Kunststoffspritzen durch 26 Gauge-Edelstahlnadeln, in die Haut und
subkutan, jeweils in vier unterschiedliche Foci, und in Skelettmuskel
einer Extremität,
jeweils in zwei unterschiedliche Foci, injiziert.
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Die
Tiere wurden 24 h beobachtet und nach 24 h schmerzlos getötet. Die
individuellen Infiltrationsfoci wurden herausgeschnitten, in 10%
Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet und durch histopathologische
Standardmethoden gefärbt
und untersucht.
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Die
Kontrollen erhielten allein Kochsalzlösung.
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Ergebnisse:
Die Injektion von NTP-Peptid Nr. 7 erzeugte eine Nekrose von Gewebe
an den Injektionsorten. Die Nekrose war evident in Muskelgewebe,
subkutanem Bindegewebe und Dermis an den Orten, wo NTP-Peptid Nr.
7 injiziert worden war. Die Nekrose korrelierte mit den Injektionsbereichen
und schien sich nicht weit über
den Injektionsort hinaus zu verbreiten.
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Abgesehen
von den Bereichen mit milder Entzündung zeigten die Kontrollen
keinen Hinweis auf Nekrose oder Zellverlust. Die Kontrollen zeigten
minimale oder fehlende Muskelveränderungen.
Kontrollinjektionen erzeugten milde bis minimale akute Entzündungen
an den Injektionsstellen und fokale Mikrohämorrhagien von den Nadeln.
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Beispiel 2 (nur zum Vergleich)
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Der
Zweck dieses Beispiels war, die Wirkung von NTP-Peptid Nr. 7 auf
Gewebe an Injektionsorten zu bestimmen.
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Vier
Ratten wurden mit Ether anästhesiert
und erhielten NTP-Peptid Nr. 7 durch intraprostatische Injektion.
Die Injektionen bestanden aus 300 μl NTP-Peptid Nr. 7, 1 mg/ml
in PBS, pH 7,4 (1,0 mg/kg). Kontrollen erhielten Injektionen von
PBS allein oder keine Injektion. Ratten wurden nach 72 h schmerzfrei
getötet.
Prostatadrüsen
wurden präpariert,
in 10% gepuffertem Formalin 24 h fixiert, in Paraffin eingebettet,
davon Schnitte erstellt und mit H & E gefärbt. Für jedes Tier wurde die gesamte
Prostatadrüse
eingebettet und davon Schnitte erstellt. Alle gefärbten Schnitte
wurden histologisch untersucht.
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Ergebnisse:
Mit NTP-Peptid Nr. 7 behandelte Ratten-Prostata zeigte Nekrose von
Gewebe an den Injektionsorten mit einem Verlust von glandulärem Epithel,
Abflachung und Atrophie. Es gab keinen erkennbaren Unterschied zwischen
Kontrollinjektionen von PBS allein oder Kontrollen ohne Injektionen.
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Beispiel 3
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Der
Zweck dieses Beispiels war, die Wirkung von NTP-Peptid Nr. 14 auf
Gewebe an Injektionsorten zu bestimmen.
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Ratten
erhielten Injektionen in die Haut und subkutan wie in Beispiel 1
oben mit der Ausnahme, dass ihnen NTP-Peptid Nr. 14 injiziert wurde.
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Die
Tiere wurden 24 h beobachtet und nach 24 h schmerzlos getötet. Gewebe
wurden herausgeschnitten, in 10% Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet
und durch histopathologische Standardmethoden gefärbt und
untersucht.
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Die
Kontrollen waren die gleichen wie in Beispiel 1.
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Ergebnisse:
Eine Injektion von NTP-Peptid Nr. 14 erzeugte Zelltod und Nekrose
von Gewebe an den Injektionsorten. Ähnlich zu Beispiel 1 oben war
der Zelltod in Muskelgewebe, subkutanem Bindegewebe und Dermis an
den Orten, wo NTP-Peptid Nr. 14 injiziert worden war, vorhanden.
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Abgesehen
von den Bereichen mit milder Entzündung zeigten die Kontrollen
minimale Hinweise auf Nekrose oder Zellverlust. Kontrollinjektionen
erzeugten milde bis minimale akute Entzündungen an den Injektionsorten
und gelegentliche fokale Mikrohämorrhagien
von den Nadeln.
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Beispiel 4
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Der
Zweck dieses Beispiels war, die Wirkung von NTP-Peptid Nr. 17 auf
Gewebe an Injektionsorten zu bestimmen.
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Normale
Ratten erhielten Injektionen in die Prostata wie in dem obigen Beispiel
2 mit der Ausnahme, dass ihnen NTP-Peptid Nr. 17 injiziert wurde.
Ratten wurden nach 72 h schmerzlos getötet und ihre Prostatadrüsen wurden
wie in Beispiel 2 untersucht.
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Ergebnisse:
Wie in dem obigen Beispiel 2 erzeugte eine Injektion von NTP-Peptid
Nr. 17 in der Prostata nach 72 h signifikanten Zellverlust und Atrophie.
Kontrollen zeigten minimale oder fehlende Veränderungen, welche aus einer
milden fokalen Entzündung
aufgrund der Nadeln bestanden.
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