DE60217507T2

DE60217507T2 - Peptide für die behandlung von tumoren und anderen zuständen, die das entfernen oder zerstören von zellen erfordern

Info

Publication number: DE60217507T2
Application number: DE60217507T
Authority: DE
Inventors: A. Paul Beaconsfield AVERBACK
Original assignee: Nymox Corp Canada; Nymox Corp
Current assignee: Nymox Corp Canada; Nymox Corp
Priority date: 2001-07-19
Filing date: 2002-07-19
Publication date: 2007-11-15
Anticipated expiration: 2022-07-20
Also published as: KR20040018481A; NO20040222L; DE60218179T2; EA200400205A1; CY1108009T1; DK1417228T3; JP2011152133A; IL159903A0; JP2005507647A; MXPA04000561A; IL159903A; CA2453967A1; JP2005506061A; WO2003008443A2; DE60218179D1; WO2003008443A3; US7192929B2; EA006603B1; ATE353914T1; EP1417228A2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist auf die Verwendung von Peptiden, die aus SEQ ID Nos.: 10, 19 und 22-28 bestehen, für die Behandlung von Zuständen gerichtet, welche die Entfernung oder Zerstörung von zellulären Elementen, wie gutartigen oder malignen Tumoren bei Menschen, erfordern.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Essenz von vielen medizinischen Behandlungen und Verfahren beinhaltet die Entfernung oder Zerstörung von schädlichem oder unerwünschtem Gewebe. Beispiele für derartige wichtige Behandlungen umfassen die chirurgische Entfernung von kanzerösen Gewächsen, die Zerstörung von metastasischen Tumoren durch Chemotherapie und die Reduktion von Drüsen-(zum Beispiele Prostata-)Hyperplasie. Andere Beispiele schließen die Entfernung von unerwünschtem Gesichtshaar, Warzen, subkutanem Gewebe, Lymphgewebe oder Fettgewebe ein.
Es gibt einen Bedarf an einem wirksamen Mittel, welches das weitere Wachstum von schädlichen oder unerwünschten Zellen und schädlichem oder unerwünschtem Gewebe zerstört und daher dessen weiteres Wachstum hemmt, welches aber hauptsächlich lokale Auswirkungen und eine minimale oder fehlende systemische Toxizität aufweist. Neuronal-thread-Proteine und deren verwandte Moleküle sind eine Klasse derartiger Mittel, wie in der US 2003/0054990 mit dem Titel: Methods of Treating Tumors and Related Conditions Using Neural Thread Proteins, eingereicht am 8. März 2002, offenbart. Peptide, die Aminosäuresequenzen enthalten, welche einem Teil der Aminosäuresequenz von Neuronal-thread-Protein, AD7c-NTP, entsprechen, sind ebenfalls derartige Mittel. Diese Peptide sind in der US 2003/0096350 mit dem Titel: Peptides Effective in the Treatment of Tumors and Other Conditions Requiring the Removal or Destruction of Cells, eingereicht am 24. Mai 2002, offenbart.
Hierin sind gewisse andere Fragmente von Neuronal-thread-Proteinen offenbart, die ebenfalls bei der Behandlung von Tumoren und anderen Zuständen, welche die Entfernung oder Zerstörung von Zellen erfordern, nützlich sind.
Krebs ist eine Abnormalität im internen regulatorischen Mechanismus einer Zelle, welche ein unkontrolliertes Wachstum und einen unkontrollierte Reproduktion der Zelle zur Folge hat. Normale Zellen bilden Gewebe und wenn diese Zellen ihre Fähigkeit verlieren, sich als spezifische, kontrollierte und koordinierte Einheit zu verhalten (Entdifferenzierung), führt der Defekt zu einer Fehlordnung unter der Zellpopulation. Wenn diese stattfindet, wird ein Tumor gebildet.
Benignes Überwachstum von Gewebe ist eine Abnormalität, bei der es wünschenswert ist, Zellen aus einem Organismus zu entfernen. Benigne Tumoren sind zelluläre Proliferationen, die nicht im ganzen Körper metastasieren, jedoch Krankheitssymptome verursachen. Derartige Tumoren können letal sein, wenn sie in unzugänglichen Bereichen in Organen, wie dem Gehirn, vorliegen. Es gibt benigne Tumoren von Organen, die Lunge, Gehirn, Haut, Hypophyse, Schilddrüse, Nebennierenrinde und Medulla, Eierstock, Uterus, Testikel, Bindegewebe, Muskel, Eingeweide, Ohr, Nase, Hals, Mandeln, Mund, Leber, Gallenblase, Pankreas, Prostata, Herz und andere Organe einschließen.
Eine Operation ist häufig der erste Schritt bei der Behandlung von Krebs. Das Ziel der Operation variiert. Manchmal wird sie verwendet, um so viel des offensichtlichen Tumors wie möglich zu entfernen oder zumindest seine Masse zu verringern (die Hauptmasse(n) des Tumors zu entfernen, so dass weniger vorliegt, was durch andere Mittel behandelt werden muss). Abhängig vom Krebstyp und -ort kann eine Operation auch für eine gewisse symptomatische Linderung beim Patienten sorgen. Wenn zum Beispiel ein Chirurg einen großen Teil eines expandierenden Gehirntumors entfernen kann, nimmt der Druck im Schädel ab, was zu einer Verbesserung der Symptome des Patienten führt.
Nicht alle Tumoren sind einer Operation zugänglich. Einige liegen in Teilen des Körpers vor, welche es unmöglich machen, sie vollständig zu entfernen. Beispiele dafür wären Tumoren im Hirnstamm (einem Teil des Gehirns, welcher die Atmung steuert) oder ein Tumor, der in einem Hauptblutgefäß und darum herum wächst. In diesen Fällen ist die Rolle einer Operation aufgrund des hohen Risikos, das mit der Tumorentfernung verbunden ist, begrenzt.
In einigen Fällen wird keine Operation verwendet, um die Masse des Tumors zu verringern, da es nicht erforderlich ist. Ein Beispiel ist Hodgkin-Lymphom, ein Krebs der Lymphknoten, der sehr gut auf Kombinationen von Chemotherapie und Strahlentherapie anspricht. Beim Hodgkin-Lymphom wird eine Operation kaum benötigt, um eine Heilung zu erzielen, aber nahezu immer verwendet, um eine Diagnose zu erstellen.
Chemotherapie ist eine übliche Form der Krebsbehandlung, welche die Verwendung von Medikamenten (gewöhnliche über den Mund oder durch Injektion verabreicht) beinhaltet, die spezifisch sich schnell teilende Zellen (wie jene, die in einem Tumor gefunden werden) im ganzen Körper angreifen. Dies macht die Chemotherapie bei der Behandlung von Krebsen, die bereits metastasiert sind, sowie von Tumoren nützlich, die eine große Wahrscheinlichkeit aufweisen, sich durch das Blut- und Lymphsystem zu verbreiten, aber jenseits des primären Tumors nicht offenkundig sind,. Die Chemotherapie kann auch verwendet werden, um die Reaktion von lokalisierten Tumoren auf Operation und Strahlentherapie zu verbessern. Dies ist zum Beispiel bei einigen Krebsen des Kopfs und des Nackens der Fall.
Leider werden andere Zellen im menschlichen Körper, die sich normalerweise ebenfalls rasch teilen (wie die Auskleidung des Magens und das Haar) ebenfalls durch eine Chemotherapie beeinflusst. Aus diesem Grund schließen viele Chemotherapien unerwünschte Nebenwirkungen ein, wie Übelkeit, Erbrechen, Anämie, Haarverlust oder andere Symptome. Diese Nebenwirkungen sind vorübergehend und es gibt Medikamente, die dazu beitragen können, viele dieser Nebenwirkungen zu mildem. Da unser Wissen fortwährend zunimmt, haben Forscher neuere chemotherapeutische Mittel ersonnen, die nicht nur beim Abtöten von Krebszellen besser sind, sondern auch für den Patienten weniger Nebenwirkungen aufweisen.
Chemotherapie wird Patienten auf einer Anzahl von Wegen verabreicht. Einige sind Pillen und andere werden durch intravenöse oder andere Injektion verabreicht. Bei der injizierbaren Chemotherapie besucht ein Patient die Praxis eines Arztes oder ein Krankenhaus zur Behandlung. Andere chemotherapeutische Mittel erfordern eine kontinuierliche Infusion in den Blutstrom, 24 Stunden täglich. Bei diesen Chemotherapie-Typen kann ein kleineres chirurgisches Verfahren durchgeführt werden, um eine kleine Pumpe zu implantieren, die von dem Patienten getragen wird. Die Pumpe verabreicht dann langsam das Medikament. In vielen Fällen wird eine permanenter Zugang zur Vene des Patienten gekegt, um das Erfordernis für wiederholte Nadelstiche zu beseitigen.
Strahlentherapie ist eine weitere üblicherweise verwendete Waffe im Kampf gegen Krebs. Strahlung töten Krebs durch Beschädigen der DNA innerhalb der Tumorzellen. Die Strahlung wird auf verschiedenen Wegen zugeführt. Der üblichste beinhaltet das Richten eines Strahls von Strahlung auf den Patienten auf hoch präzise Weise, indem man ihn auf den Tumor fokussiert. Um dies vorzunehmen, liegt ein(e) Patient(in) auf einem Tisch und der Strahl bewegt sich um ihn/sie herum. Das Verfahren dauert Minuten, kann aber über mehrere Wochen täglich vorgenommen werden (abhängig von der Tumorart), um eine spezielle verordnete Gesamtdosis zu erzielen.
Ein weiteres Bestrahlungsverfahren, das manchmal verwendet wird und als Brachytherapie bezeichnet wird, beinhaltet die Hernahme von radioaktiven Pellets (Seeds) oder Drähten und die Implantation derselben in den Körper im Bereich des Tumors. Die Implantate können vorübergehend oder dauerhaft sein. Bei dauerhaften Implantaten zerfällt die Strahlung in den Seeds über eine Zeitspanne von Tagen oder Wochen, so dass der Patient nicht radioaktiv ist. Bei vorübergehenden Implantaten wird die gesamte Strahlungsdosis gewöhnlich in wenigen Tagen zugeführt und der Patient muss während dieser Zeit im Krankenhaus bleiben. Bei beiden Brachytherapiearten wird die Strahlung im Allgemeinen einem sehr gezielten Bereich zugeführt, um eine lokale Kontrolle über einen Krebs zu erzielen (im Gegensatz zur Behandlung des ganzen Körpers, wie es bei der Chemotherapie der Fall ist).
Einige sehr ausgewählte Patienten können für Knochenmarktransplantationen vorgesehen sein. Dieses Verfahren wird gewöhnlich entweder durchgeführt, weil ein Patient einen Krebs hat, der besonders aggressiv ist, oder weil sie einen Krebs haben, der nach einer Behandlung mit herkömmlicher Therapie rezidiviert. Die Knochenmarktransplantation ist ein kompliziertes Verfahren. Es gibt viele Arten und sie können in ihrem Potential zur Verursachung von Nebenwirkungen und Heilung variieren. Die meisten Transplantationen werden in speziellen Zentren durchgeführt und in vielen Fällen wird ihre Verwendung als zur Forschung gehörig angesehen.
Es gibt eine Anzahl weiterer Therapien, obwohl die meisten derselben noch in klinischen Versuchen untersucht werden und noch nicht ein Standardheilverfahren sind. Beispiele umfassen die Verwendung von Immuntherapie, monoklonalen Antikörpern, Antiangiogenese-Faktoren und Gentherapie.
Immuntherapie: Es gibt verschiedene Techniken, die ausgelegt sind, um das eigene Immunsystem des Patienten zu unterstützen, den Krebs ziemlich getrennt von Bestrahlung oder Chemotherapie zu bekämpfen. Häufig injizieren Forscher dem Patienten eine speziell abgeleitete Vakzine, um das Ziel zu erreichen.
Monoklonale Antikörper: Dabei handelt es sich um Antikörper, die so konstruiert sind, dass sie sich an Krebszellen (und nicht normale Zellen) anheften, indem sie einen Vorteil aus Unterschieden zwischen Krebs- und Nicht-Krebszellen mit Bezug auf deren antigene und/oder andere Merkmale ziehen. Die Antikörper können dem Patienten allein oder an vielfältige zytotoxische Verbindungen konjugiert oder in radioaktiver Form verabreicht werden, derart, dass der Antikörper vorzugsweise auf die Krebszellen abzielt, wodurch das toxische Mittel oder die Radioaktivität den gewünschten Zellen zugeführt wird.
Antiangiogenese-Faktoren: Da sich Krebszellen rasch teilen und Tumoren schnell wachsen, können sie bald über ihre Blutzufuhr hinauswachsen. Um dies zu kompensieren, sondern einige Tumoren eine Substanz ab, von der man annimmt, dass sie dazu beiträgt, das Wachstum von Blutgefäßen in ihrer Nachbarschaft zu induzieren, wodurch die Krebszellen mit einer vaskulären Nährstoffquelle versorgt werden. Es sind experimentelle Therapien entwickelt worden, um das Wachstum von Blutgefäßen zu Tumoren hin zu stoppen.
Gentherapie: Krebs ist das Produkt einer Reihe von Mutationen, die letztendlich zur Produktion einer Krebszelle und ihrer übermäßigen Proliferation führen. Krebse können behandelt werden, indem man Gene in die Krebszellen einführt, die entweder so wirken, dass sie die Proliferation des Krebses überwachen oder stoppen, den programmierten Zellmechanismus der Zelle zur Zerstörung anschalten, die Immunerkennung der Zelle erhöhen oder ein Prodrug exprimieren, das sich in einen toxischen Metaboliten oder ein Zytokin umwandelt, welcher bzw. welches das Tumorwachstum hemmt.
Benigne Tumoren und Missbildungen können ebenfalls durch eine Vielfalt von Verfahren behandelt werden, einschließlich Operation, Radiotherapie, Arzneistofftherapie, thermischer oder elektrischer Ablation, Kryotherapie und dergleichen. Obwohl benigne Tumoren nicht metastasieren, können sie groß werden und sie können rezidivieren. Die chirurgische Exstirpation von benignen Tumoren weist all die Schwierigkeiten und Nebenwirkungen von Operationen im Allgemeinen auf und muss häufig bei einigen benignen Tumoren, wie bei Hypophysenadenomen, Meningeoma des Gehirns, Prostatahyperplasie und anderen, wiederholt durchgeführt werden.
Es gibt noch weitere Zustände, an denen unerwünschte zelluläre Elemente beteiligt sind und bei denen eine selektive Zellenentfernung wünschenswert ist. Zum Beispiel werden Herzkrankheit und Schlaganfälle üblicherweise durch Atherosklerose verursacht, welche eine proliferative Läsion von fibrösfettigen und modifizierten glatten Muskelelementen ist, welche die Blutgefäßwand verformen, das Lumen verengen, den Blutstrom einschränken, für fokale Blutgerinnsel prädisponieren und letztendlich zur Blockade und zum Infarkt führen. Verschiedene Behandlungen für Atherosklerose umfassen Bypass-Transplantate; künstliche Transplantate, Angioplastie mit Rekanalisierung, Kürettage, Strahlung, Laser oder eine andere Entfernung; Pharmakotherapie, um die Atherosklerose durch Lipidreduktion zu inhibieren; und gerinnungshemmende Therapien; und allgemeine Maßnahmen mit Bezug auf Nahrung, Sport und Lebensführung. Ein Verfahren zur Entfernung von atherosklerotischen Läsionen ohne das Risiko und die Nebenwirkungen von chirurgischen Verfahren wird benötigt.
Andere Beispiele für unerwünschte zelluläre Elemente, bei denen eine selektive Zellenentfernung wünschenswert ist, umfassen viral induzierte Gewächse, wie Warzen. Ein weiteres Beispiel sind hypertrophe entzündliche Massen, die bei entzündlichen Zuständen gefunden werden, und hypertrophe Narben oder Keloide. Noch weitere Beispiele werden in kosmetischen Kontexten gefunden, wie die Entfernung von unerwünschtem Haar, zum Beispiel Gesichtshaar, oder bei der Schrumpfung von unerwünschten Gewebebereiche für kosmetische Zwecke, wie in der Gesichtsdermis und Bindegeweben oder in den Dermen und im Bindegewebe der Extremitäten.
Noch weitere Beispiele werden dem Fachmann beim Lesen der Offenbarung hierin offensichtlich. Bei allen oder den meisten dieser Beispiele gibt es einen Bedarf an Behandlungen, welche die unerwünschten zellulären Elemente ohne die Risiken und Nebenwirkungen von herkömmlichen Therapien entfernen oder zerstören können oder die unerwünschten zellulären Elemente mit höherer Präzision entfernen können.
Neuronal-thread-Proteine (NTP) sind eine Familie von kürzlich charakterisierten Gehirnproteinen. Ein Mitglied dieser Familie, AD7c-NTP, ist eine ~41 kD Membran, die mit Phosphoprotein mit Funktionen assoziiert ist, die mit neuritischer Entwicklung verbunden sind (de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100: 3093-3104 (1997); de la Monte et al., Alz. Rep., 2: 327-332 (1999); de la Monte SM and Wands JR, Journal of Alzheimer's Disease, 3: 345-353 (2001)). Das Gen, das AD7c-NTP codiert, und die vorhergesagte Proteinsequenz für Ad7c-NTP sind identifiziert und beschrieben worden. (de la Monte et al., J. Clin. Invest, 100: 3093-3104 (1997)). Zusätzlich zu der ~41 kD Spezies sind andere Spezies von Neuronal-thread-Protein (~26 kD, ~21 kD, ~17 kD und ~15 kD) identifiziert und mit neuroektodennalen Tumoren, Astrozytomen und Glioblastomen und mit Verletzung aufgrund von Hypoxie, Ischämie oder zerebralem Infarkt verbunden worden (Xu et al., Cancer Research, 53: 3823-3829 (1993); de la Monte et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55(10): 1038-50 (1996), de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 138(1-2): 26-35 (1996); de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 135(2): 118-25 (1996); de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100: 3093-3104 (1997); und de la Monte et al., Alz. Rep., 2: 327-332 (1999)).
Spezies von Neuronal-thread-Protein sind in den U.S. Patenten Nr. 5,948,624; 5,948,888 und 5,830,670, alle für "Neural Thread Protein Gene Expression and Detection of Alzheimer's Disease", und im U.S. Patent Nr. 6,071,705 für "Method of Detecting Neurological Disease or Dysfunction" beschrieben und beansprucht worden. Wie dort beschrieben, wird NTP während des Zelltods hinaufreguliert und produziert. So wird beschrieben, dass tote und sterbende Nervenzellen NTP überproduzieren und dass demgemäß dessen Anwesenheit den Tod von Nervenzellen und den Beginn der Alzheimer-Krankheit (AD) anzeigt.
Andere Spezies von Neuronal-thread-Protein sind als weitere Produkte des AD7c-NTP-Gens (zum Beispiel ein 112 Aminosäuren-Protein, das in der NCBI Entrez-Protein-Datenbank, Zugangsnummer Nr. XP_032307 PID g15928971 beschrieben ist) oder als ähnlich mit Neuronal-thread-Proteinen identifiziert worden (zum Beispiel 106 Aminosäuren-Protein, das in der NCBI Entrez-Protein-Datenbank, Zugangsnummer AAH14951 PID g15928971 beschrieben ist, ein weiteres 106 Aminosäuren-Protein, das in der NCBI Entrez-Protein-Datenbank, Zugangsnummer XP_039102 PID g18599339 beschrieben ist, und ein 61 Aminosäuren-Protein, das in der NCBI Entrez-Protein-Datenbank, Zugangsnummer AAH02534 PID g12803421 beschrieben ist).
Neuronal-thread-Protein ist mit AD assoziiert und NTP wird in Verbindung mit dem Zelltod in AD hinaufreguliert. AD7c-NTP-mRNA wird im AD-Gehirn im Vergleich zu Kontrollen hinaufreguliert; AD7c-NTP-Proteinkonzentrationen im Gehirn und im ZSF sind bei AD höher als bei Kontrollen; und eine AD7G NTP wird in senilen Plaques, in neurofibrillären Knäueln (NFT), in degenerierenden Neuronen, in Neuropil-Threads und dystrophischen Nervensprossen in Gehirnen von AD und Down-Syndrom gefunden (Ozturk et al., Proc. Natl. Acd. Sci. USA, 86: 419-423 (1989); de la Monte et al., J. Clin. Invest., 86(3): 1004-13 (1990); de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 113(2): 152-64 (1992); de la Monte et al., Ann. Neurol, 32(6): 733-42 (1992); de la Monte et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55(10): 1038-50 (1996), de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 138(1-2): 26-35 (1996); de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 135(2): 118-25 (1996); de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100: 3093-3104 (1997); und de la Monte et al., Alz. Rep., 2: 327-332 (1999)). NTP ist innerhalb von Zellen innerhalb feiner Fortsätze innerhalb des Neuropils lokalisiert oder liegt in Gehirnen von sowohl AD als auch Down-Syndrom extrazellulär vor; de la Monte et al., Ann. Neurol., 32(6): 733-42 (1992).
Erhöhte Konzentrationen von AD7c-NTP-Protein sind sowohl in ZSF als auch im Urin von AD-Patienten gefunden worden (de la Monte and Wands, Front Biosci, 7: 989-96 (2002); de la Monte und Wands, Journal of Alzheimer's Disease, 3: 345-353 (2001); Munzar et al., Alzheimer's Reports, 4: 61-65 (2001); Kahle et al., Neurology, 54: 1498-1504 (2000); Munzar et al., Alzheimer Reports, 3: 155-159 (2000); de la Monte et al., Alzheimer's Reports, 2: 327-332 (1999); und de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100: 3093-3104 (1997)).
Die Überexpression von NTP ist auch mit dem Prozess des Zelltods bei der Alzheimer-Krankheit verbunden worden (de la Monte und Wands, J. Neuropathol. Exp. Neurol., 60: 195-207 (2001); de la Monte und Wands, Cell Mol Life Sci, 58: 844-49 (2001)). AD7c-NTP ist auch im Hirngewebe von Down-Syndrom identifiziert worden (Wands et al., internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 90/06993; de la Monte et al., J Neurol Sci, 135: 118-25 (1996); de la Monte et al., Alz. Rep., 2: 327-332 (1999)). Es gibt einige Hinweise, dass die Überexpression von NTP auch mit Normaldruck-Glaukom verbunden sein kann (Golubnitschaja-Labudova et al., Curr Eye Res, 21: 867-76 (2000)).
Es hat sich erwiesen, daß NTP ein wirksames Mittel für die Bewirkung des Zelltods sowohl in vitro in Gliom- und Neuroblastom-Zellkulturen als auch in vivo in normalem Nager-Muskelgewebe, subkutanem Bindegewebe und in der Dermis und in einer Vielfalt von verschiedenen Tumoren menschlichen und nicht menschlichen Ursprungs, einschließlich Mammakarzinom, Hautkarzinom und Papillom, Kolonkarzinom, Gliom des Gehirns und anderer in Nagermodellen, ist. Siehe die US 2003/0054990, Methods of Treting Tumors and Related Conditions Using Neural Thread Proteins, eingereicht am 8. März 2002.
Gewisse Peptidsequenzen von AD7c-NTP ("AD7c-NTP-Peptide") erwiesen sich ebenfalls als wirksame Mittel zur Verursachung von Zelltod sowohl in vitro in Gliom- und Neuroplastom-Zellkulturen als auch/oder in vivo in normalem Nager-Muskelgewebe, subkutanem Bindegewebe, Dermis und anderem Gewebe. Siehe die US 2003/0096350 mit dem Titel: Peptides Effective in the Treatment of Tumors and Other Conditions Requiring the Removal or Destruction of Cells,
Die WO 00/58295 offenbart ein 47-mer Polypeptid, das die Sequenz GAISAHRNLRL umfaßt, und dessen potentielle Verwendung zur Behandlung eines großen Bereichs von Krankheiten.
Die WO 02/097030 ist auf von NTP abgeleitete Peptide und deren Verwendung zur Behandlung von Krankheiten gerichtet, welche die Entfernung oder Zerstörung von Zellen erfordern, wie Krebs.
Es bleibt ein Bedarf in der Medizin an neuen, weniger toxischen Behandlungen für die Behandlung von unerwünschten zellulären Elementen. Die vorliegende Erfindung erfüllt diesen Bedarf.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist auf NTP-Peptide, Zusammensetzungen und deren Verwendung für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung eines Zustandes gerichtet, der die Entfernung oder Zerstörung von Zellen erfordert und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem benignen oder malignen Tumor eines Gewebes; einer Hyperplasie, Hypertrophie oder Überwachstum eines Gewebes; eines viral, bakteriell oder parasitisch veränderten Gewebes; einer Missbildung eines Gewebes; einer tonsillären Hypertrophie; Prostata-Hyperplasie; Psoriasis; Ekzem; Dennatose; einer kosmetischen Veränderung eines Gewebes; einer vaskulären Krankheit; Hämorrhoiden, varikösen Venen, Atherosklerose; entzündlicher Krankheit; Autoimmunkrankheit; metabolischer Krankheit; vererbter/genetischer Krankheit; traumatischer Krankheit oder physischer Verletzung; Nahrungsmangel-Krankheit; infektiöser Krankheit; Amyloid-Krankheit; Fibrose-Krankheit; Speicher-Krankheit; angeborener Missbildung; Enzymmangel-Krankheit; Vergiftung; Intoxikation; umweltbedingter Krankheit; Strahlenkrankheit; endokriner Krankheit und degenerativer Krankheit. Das Expressions-NTP-Peptid ist nachstehend definiert.
Die Peptide der vorliegenden Erfindung weisen mindestens eine Aminosäuresequenz auf, welche einem Teil der Aminosäuresequenz einer Spezies von Neuronal-thread-Protein entspricht. Die Zusammensetzungen der Erfindung umfassen die Peptide und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder die Peptide an einen Träger oder dergleichen konjugiert oder die Peptide in einer Polymermatrix eingekapselt usw..
Die vorliegende Erfindung beinhaltet teilweise die Entdeckung, daß Peptidsequenzen, die in AD7c-NTP enthalten sind und von welchen die Erfinder gefunden haben, daß sie wirksame Mittel für die Zerstörung oder Entfernung von schädlichen oder unerwünschten Zellen sind, und Varianten und Homologe davon auch in anderen Proteinen in anderen Organismen gefunden werden, einschließlich Menschen und anderer Säugetiere. Wenn die Peptidsequenzen entdeckt werden, können diese Proteine vom gewöhnlichen Fachmann durch die Verwendung von überall verfügbaren öffentlichen und kommerziellen Protein-Datenbanken, wie der National Center Biotechnology Information's Protein-Datenbank und Suchprogrammen, wie BLAST^® (Basic Local Alignment Search Tool), gefunden werden. Siehe Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schäffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller und David J. Lipmann (1997), "Gapped BLAST und PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402.
Ein Fachmann kann diese Proteine unter Verwendung der hierin beschriebenen Assay-Verfahren durchmustern, um deren Wirksamkeit als Mittel für die Zerstörung oder Entfernung von unerwünschten oder schädlichen Zellen zu bestimmen. Ein gewöhnlicher Fachmann, der ein oder mehrere derartige wirksame Mittel gefunden hat, kann dann bestimmen, welche Abschnitte dieser Mittel Sequenzen enthalten, die zu AD7c-NTP-Peptidsequenzen, die hierin oder in der US 2003/0096350 mit dem Titel: Peptides Effective in the Treatment of Tumors and Other Conditions Requiring the Removal or Destruction of Cells, eingereicht am 24. Mai 2002, beschriebenen werden, homolog oder ähnlich sind, diese Abschnitte dieser Mittel unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren synthetisieren lassen und die synthetisierten Mittel bezüglich ihrer Wirksamkeit als Mittel für die Zerstörung oder Entfernung von unerwünschten oder schädlichen Zellen testen. Weiter könnte ein Fachmann auch die Aminosäuresequenzen aller derartiger gefundener Proteine verwenden, um andere Peptidsequenzen zu bestimmen, die nicht homolog oder ähnlich sind zu hierin und in der US 2003/0096360 mit dem Titel: Peptides Effective in the Treatment of Tumors and Other Conditions Requiring the Removal or Destruction of Cells, eingereicht am 24. Mai 2002, beschriebenen Peptidesequenzen, die zu AD7c-NTP-Peptidsequenzen homolog oder ähnlich sind.
Die erfindungsgemäßen Peptide oder Proteine ("Zelltod-Peptid") können allein oder an einen Träger konjugiert verabreicht werden. Das Zelltod-Peptid kann intramuskulär, oral, intravenös, intraperitoneal, intrazerebral (intraparenchymal), intrazerebroventrikulär, intratumoral, intraläsional, intradermal, intrathekal, intranasal, intraokular, intraarteriell, topisch, transdermal, mittels eines Aerosols, Infusion, Bolus-Injektion, Implantationsvorrichtung, Systems mit verzögerter Freisetzung usw. entweder allein oder an einen Träger konjugiert verabreicht werden.
Zusätzlich kann das Zelltod-Peptid in Verbindung mit anderen Therapien zur Behandlung benigner und maligner Tumoren und anderen unerwünschten oder schädlichen Zellwachstums verwendet werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1: zeigt die vollständige Aminosäuresequenz und Nukleinsäuresequenz des AD7c-NTP-Gens und des AD7c-NTP-Proteinprodukts dieses Gens (Sequenzen 120 und 121 aus dem U.S. Patenten Nr. 5,830,670, 5,948,634 und 5,948,888; de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100: 3093-3104 (1997); NCBI Entrez-Protein Zugangsnummer AAC08737; PID g3002527) [SEQ ID NO. 1].
2: zeigt die vollständigen Aminosäuresequenzen des 122 Aminosäuren-Neuronal-thread-Proteins (Sequenz 40 aus den U.S. Patenten Nr. 5,830,670, 5,948,634 und 5,948,888; NCBI Entrez-Protein Zugangsnummer AAE25447 PID g10048540) [SEQ ID NO. 2].
3: zeigt die vollständigen Aminosäuresequenzen des 112 Aminosäuren-Neuronal-thread-Proteins (NCBI Entrez-Protein Zugangsnummer XP_032307 PID g15928971) [SEQ ID NO. 3].
4: zeigt die vollständigen Aminosäuresequenzen eines Neuronal-thread-Protein-artigen 106 Aminosäuren-Proteins (NCBI Entrez-Protein Zugangsnummer AAH14951 PID g15928971) [SEQ ID NO. 4].
5: zeigt die vollständigen Aminosäuresequenzen eines Neuronal-thread-Protein-artigen 106 Aminosäuren-Proteins (NCBI Entrez-Protein Zugangsnummer XP_039102 PID g18599339) [SEQ ID NO. 5].
6: zeigt die vollständigen Aminosäuresequenzen des 98 Aminosäuren-Neuronal-thread-Proteins [Sequenz 30 aus den U.S. Patenten Nr. 5,830,670, 5,948,634 und 5,948,888; NCBI Entrez-Protein Zugangsnummer AAE25445, PID g10048538) [SEQ ID NO. 6].
7: zeigt die vollständigen Aminosäuresequenzen des 75 Aminosäuren-Neuronal-thread-Proteins (Sequenz 48 aus den U.S. Patenten Nr. 5,830,670, 5,948,634 und 5,948,888; NCBI Entrez-Protein Zugangsnummer AAE25448, PID g10048541) [SEQ ID NO. 7].
8: zeigt die vollständigen Aminosäuresequenzen des 68 Aminosäuren-Neuronal-thread-Proteins (Sequenz 36 aus den U.S. Patenten Nr. 5,830,670, 5,948,634 und 5,948,888; NCBI Entrez-Protein Zugangsnummer AAE25446, PID g10048539) [SEQ ID NO. 8].
9: zeigt die vollständigen Aminosäuresequenzen des 61 Aminosäuren-Neuronal-thread-Protein-artigen Proteins (NCBI Entrez-Protein Zugangsnummer AAH02534, PID g12803421) [SEQ ID NO. 9].
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die hierin verwendeten Ausdrücke und Satzteile werden wie nachstehend definiert, falls nicht anders angegeben.
Der Ausdruck "AD7c-NTP" bezeichnet das ~41 kD Protein und das Gen und die Nukleinsäuresequenzen, die dafür codieren, welche in de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100: 3093-104 (1997), in den Sequenzen 120 und 121 der U.S. Patente Nr. 5,948,634, 5,948,888 und 5,830,670 und in GenBank Nr. AF010144 beschrieben sind, dessen Nukleinsäure- und Aminosäuresequenz in 1 veranschaulicht sind. Der Ausdruck "AD7c-NTP" umfasst auch biologisch aktive Fragmente, Varianten, Derivate, Homologe und Mimetika von AD7c-NTP.
Der Ausdruck "NTP" oder "Neuronal-thread-Protein" bezeichnet Neuronal-thread-Proteine und verwandte Moleküle (einschließlich Pankreas-thread-Protein) und die Nukleinsäuren, welche diese Proteine codieren, und schließt (ohne jedoch darauf beschränkt zu sein) die folgenden Proteine und die Nukleinsäuresequenzen, welche die Aminosäuresequenzen dieser Proteine codieren, ein:

(a) AD7c-NTP;
(b) die ~42, ~26, ~21, ~17, ~14 und ~8 kD Spezies von Neuronal-thread-Protein, wie in den U.S. Patenten Nr. 5,948,634, 5,948,888, 5,830,670 und 6,071,705 und in de la Monte et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55(10): 1038-50 (1996), de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 138(1-2): 26-35 (1996); de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 135(2): 118-25 (1996), de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100: 3093-3104 (1997) und de la Monte et al., Alz. Rep., 2: 327-332 (1999) beschrieben;
(c) Proteine, die spezifisch vom monoklonalen Antikörper Nr. 3, hinterlegt bei der American Type Culture Collection, Manassas, Va., unter der Zugangsnummer HB-12546 oder vom monoklonalen Antikörper Nr. 5, hinterlegt bei der American Type Culture Collection, Manassas, Va., unter der Zugangsnummer HB-12545, erkannt werden;
(d) Proteine, die vom AD7c-NTP-Gen codiert werden;
(e) das 122 Aminosäuren-Neuronal-thread-Protein, das in Sequenz 40 aus den U.S. Patenten Nr. 5,830,670, 5,948,634 und 5,948,888 beschrieben ist und in NCBI Entrez-Protein Zugangsnummer AAE25447, PID g10048540 aufgeführt wird, dessen Aminosäuresequenzen in 2 veranschaulicht sind;
(f) das 122 Aminosäuren-Neuronal-thread-Protein, das in NCBI Entrez-Protein Zugangsnummer XP_032307, PID g14725132 aufgeführt ist, dessen Aminosäuresequenzen in 3 veranschaulicht sind;
(g) Neuronal-thread-Protein-artiges 106 Aminosäuren-Protein, das in NCBI Entrez-Protein Zugangsnummer AAH14951 PID g15928971 aufgeführt ist, dessen Aminosäuresequenzen in 4 veranschaulicht sind;
(h) Neuronal-thread-Protein-artiges 106 Aminosäuren-Protein, das in NCBI Entrez-Protein Zugangsnummer XP_039102, PID g18599339 aufgeführt ist, dessen Aminosäuresequenz in 5 veranschaulicht ist;
(i) das 98 Aminosäuren-Neuronal-thread-Protein, das in Sequenz 30 aus den U.S. Patenten Nr. 5,830,670, 5,948,634 und 5,948,888 beschrieben ist und in NCBI Entrez-Protein Zugangsnummer AAE25445, PID g10048538 aufgeführt ist, dessen Aminosäuresequenzen in 6 veranschaulicht sind;
(j) das 75 Aminosäuren-Neuronal-thread-Protein, das in Sequenz 48 aus den U.S. Patenten Nr. 5,830,670, 5,948,634 und 5,948,888 beschrieben ist und in NCBI Entrez-Protein Zugangsnummer AAE25448, PID g10048541 aufgeführt ist, dessen Aminosäuresequenzen in 7 veranschaulicht sind;
(k) das 68 Aminosäuren-Neuronal-thread-Protein, das in Sequenz 36 aus den U.S. Patenten Nr. 5,830,670, 5,948,634 und 5,948,888 beschrieben ist und im NCBI Entrez-Protein Zugangsnummer AAE25446, PID g10048539 aufgeführt ist, dessen Aminosäuresequenzen in 8 veranschaulicht sind;
(l) das 61 Aminosäuren-Neuronal-thread-Protein-artige Protein, das in NCBI Entrez-Protein Zugangsnummer AAH02534, PID g12803421 aufgeführt ist, dessen Aminosäuresequenzen in 9 veranschaulicht sind;
(m) Pankreas-thread-Protein;
(n) das neuronale Pankreas-thread-Protein (nPTP), das im U.S. Patent Nr. 6,071,705 beschrieben ist; und
(o) Proteine, die spezifisch von den Antikörpern erkannt werden, welche von einem Hybridom aus der Gruppe bestehend aus HB 9934, HB 9935 und HB 9936, hinterlegt bei der American Type Culture Collection, produziert werden.

Der Ausdruck "NTP-Peptid" bezeichnet die folgenden Aminosäuresequenzen von NTP:

a) NTP-Peptid Nr. 1 [SEQ ID NO. 10], ähnlich AD7c-NTP p227-245, mit der Insertion eines zusätzlichen Phenylalanin-Restes nach p228. PGFFKLFSCPSLLSSWDYRR Pro-Gly-Phe-Phe-Lys-Leu-Phe-Ser-Cys-Pro-Ser-Leu-Leu-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg
b) NTP-Peptid Nr. 10 [SEQ ID NO. 19], AD7c-NTP p239-245 mit der Addition von Leucin- und Prolinresten am N-Terminus. LPSSWDYRR Leu-Pro-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg-
c) NTP-Peptid Nr. 13 [SEQ ID NO. 22], AD7c-NTP p239-245 + AD7c-NTP p139-144 SSWDYRRFILFFL Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg-Phe-Ile-Leu-Phe-Phe-Leu
d) NTP-Peptid Nr. 14 [SEQ ID NO. 23], AD7c-NTP p241-245 + AD7c-NTP p197-202 WDYRRFIFNFL Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg-Phe-Ile-Phe-Asn-Phe-Leu
e) NTP-Peptid Nr. 15 [SEQ ID NO. 24], AD7c-NTP p297-302 FNFCLF Phe-Asn-Phe-Cys-Leu-Phe
f) NTP-Peptid Nr. 16 [SEQ ID NO. 25], AD7c-NTP p197-202 FIFNFL Phe-Ile-Phe-Asn-Phe-Leu
g) NTP-Peptid Nr. 17 [SEQ ID NO. 26], AD7c-NTP p31-43 PASASPVAGITGM Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Pro-Val-Ala-Gly-Ile-Thr-Gly-Met
h) NTP-Peptid Nr. 18 [SEQ ID NO. 27], AD7c-NTP p175-187 PASASQVAGTKDM Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Gln-Val-Ala-Gly-Thr-Lys-Asp-Met
i) NTP-Peptid Nr. 19 [SEQ ID NO. 28], AD7c-NTP p277-289 PASASQSAGITGV Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Gln-Ser-Ala-Gly-Ile-Thr-GIy-Val

Hierin beschriebene Aminosäuren und Aminosäurereste können gemäß dem akzeptierten Ein- oder Drei-Buchstabencode bezeichnet werden, der in der nachstehenden Tabelle geliefert wird.
Tabelle 1
Die vorliegende Erfindung ist auf eine Zusammensetzung gerichtet, die NTP-Peptide umfasst, wie vorstehend in dieser Erfindung definiert.
NTP-Peptide dieser Erfindung können unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren, wie rekombinante DNA-Technik, Proteinsynthese und Isolierung von natürlich vorkommenden NTP-Peptiden, hergestellt werden.
Ein NTP-Peptid kann unter Verwendung wohlbekannter DNA-Technik-Verfahren hergestellt werden, wie jenen, die in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. [1989]) und/oder Ausubel et al., Hsg., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers Inc. und Wiley and Sons, N.Y. [1994] aufgeführt sind.
Ein Gen oder eine cDNA, die ein NTP-Peptid codiert, kann zum Beispiel anhand einer Durchmusterung einer genomischen oder cDNA-Bibliothek oder durch PCR-Amplifikation erhalten werden. Sonden oder Primer, die für die Durchmusterung der Bibliothek nützlich sind, können auf der Grundlage der Sequenzinformation von anderen bekannten Genen oder Gen-Fragmenten aus derselben oder einer verwandten Genfamilie erzeugt werden, wie zum Beispiel konservierten Motiven, die in anderen NTP-Peptiden oder NTP-Proteinen gefunden werden. Zusätzlich kann, wenn ein Gen, das ein NTP-Peptid oder NTP-Protein codiert, aus einer Spezies identifiziert worden ist, alles oder ein Teil jenes Gens als Sonde verwendet werden, um homologe Gene aus anderen Spezies zu identifizieren. Die Sonden oder Primer können verwendet werden, um cDNA-Bibliotheken aus verschiedenen Gewebequellen zu durchmustern, von denen man annimmt, dass sie ein NTP-Peptid- oder NTP-Protein-Gen exprimieren. Typisch werden Bedingungen hoher Stringenz für die Durchmusterung verwendet, um die Zahl von falsch Positiven zu minimieren, die aus der Durchmusterung erhalten werden.
Ein weiteres Mittel, um ein Gen herzustellen, das ein NTP-Peptid codiert, ist die Verwendung von chemischer Synthese unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren, wie jenen, die von Engels et al. (Angew. Chem. Intl. Ed., 28: 716-734 [1989]) beschrieben sind. Diese Verfahren schließen unter anderem das Phosphotriester-, Phosphoramidit- und H-Phosphonat-Verfahren für die Nukleinsäuresynthese ein. Ein bevorzugtes Verfahren für eine derartige chemische Synthese ist die Polymer-getragene Synthese unter Verwendung von Standard-Phosphoramidit-Chemie. Typisch weist die DNA, die ein NTP-Peptid codiert, eine Länge von mehreren 100 Nukleotiden auf. Nukleinsäuren, die größer als etwa 100 Nukleotide sind, können als mehrere Fragmente unter Verwendung dieser Verfahren synthetisiert werden. Die Fragmente können dann zusammenligiert werden, um das NTP-Peptid voller Länge zu bilden. Gewöhnlich weist das DNA-Fragment, das den Aminoterminus des Proteins codiert, ein ATG auf, das einen Methioninrest codiert. Dieses Methionin kann auf der reifen Form des NTP-Peptids anwesend sein oder nicht, abhängig davon, ob das in der Wirtszelle produzierte Protein ausgelegt ist, um aus dieser Zelle sekretiert zu werden.
Das Gen, die cDNA oder ein Fragment derselben, welche(s) das NTP-Peptid codiert, kann in einen geeigneten Expressions- oder Amplifikationsvektor unter Verwendung von Standard-Ligierungstechniken inseriert werden. Der Vektor wird typisch so ausgewählt, dass er in der speziellen verwendeten Wirtszelle funktional ist (d.h. der Vektor ist mit der Wirtszellen-Maschinerie kompatibel, so dass die Amplifikation des Gens und/oder die Expression des Gens stattfinden kann). Das Gen, die cDNA oder das Fragment davon, welche(s) das NTP-Peptid codiert, kann in prokaryotischen, Hefe-, Insekten-(Baculovirus-Systemen) und/oder eukaryotischen Wirtszellen amplifiziert/exprimiert werden. Die Wahl der Wirtszelle hängt teilweise davon ab, ob das NTP-Peptid glycosyliert und/oder phosphoryliert werden soll. Falls dies der Fall ist, sind Hefe-, Insekten- oder Säuger-Wirtszellen vorzuziehen.
Typisch enthalten die Vektoren, die in irgendeiner der Wirtszellen verwendet werden, eine 5'-flankierende Sequenz (auch als Promotor bezeichnet) und andere Regulationselemente, wie (einen) Enhancer, ein Replikationsstartelement, ein Transkriptionsterminationselement, eine vollständige Intronsequenz, die eine Donor- und Akzeptor-Spleißstelle enthält, eine Signalpeptidsequenz, ein Ribosomen-Bindungsstellen-Element, eine Polyadenylierungssequenz, eine Polylinker-Region für die Insertion der Nukleinsäure, welche für das zu exprimierende Polypeptid codiert, und ein selektierbares Markerelement. Jedes dieser Elemente wird nachstehend erörtert. Gegebenenfalls kann der Vektor eine Markierungs-Sequenz enthalten, das heißt ein Oligonukleotid-Molekül, das am 5'- oder 3'-Ende der das NTP-Peptid codierenden Sequenz angeordnet ist; das Oligonukleotid-Molekül codiert polyHis (wie hexaHis) oder eine andere Markierung, wie FLAG, HA (Hämaglutinin-Influenzavirus) oder myc, für welches kommerziell erhältliche Antikörper existieren. Diese Markierung wird typisch bei der Expression des Polypeptids mit dem Polypeptid fusioniert und kann als Mittel für die Affinitätsreinigung des NTP-Peptids aus der Wirtszelle dienen. Die Affinitätsreinigung kann zum Beispiel durch Säulenchromatographie unter Verwendung von Antikörpern gegen die Markierung als Affinitätsmatrix bewerkstelligt werden. Gegebenenfalls kann die Markierung anschließend aus dem gereinigten NTP-Peptid durch verschiedene Mittel, wie unter Verwendung gewisser Peptidasen, entfernt werden.
Die Human-Immunglobulin-Scharnier- und Fc-Region könnte entweder am N-Terminus oder C-Terminus des NTP-Peptids vom Fachmann fusioniert werden. Das anschließende Fc-Fusionsprotein könnte unter Verwendung einer Protein A-Affinitätssäule gereinigt werden. Es ist bekannt, dass Fc eine lange pharmakokinetische Halbwertszeit in vivo zeigt, und es wurde gefunden, dass Proteine, die mit Fc fusioniert sind, eine wesentlich größere Halbwertszeit in vivo zeigen als das nicht fusionierte Gegenstück. Auch ermöglicht die Fusion der Fc-Region eine Dimerisierung/Multimerisierung des Moleküls, welche für die Bioaktivität einiger Moleküle nützlich sein kann.
Die 5'-flankierende Sequenz kann homolog (d.h. aus derselben Spezies und/oder demselben Stamm wie die Wirtszelle), heterolog, d.h. von einer von der Wirtszellenspezies oder dem Wirtszellenstamm verschiedenen Spezies), hybrid (d.h. eine Kombination von 5'-flankierenden Sequenzen aus mehr als einer Quelle), synthetisch sein oder sie kann die native, das NTP-Peptid-Gen 5'-flankierende Sequenz sein. Als solche kann die Quelle der 5'-flankierenden Sequenz irgendein einzelliger prokaryotischer oder eukaryotischer Organismus, jeder vertebrale oder nicht vertebrale Organismus oder jede Pflanze sein, vorausgesetzt, dass die 5'-flankierende Sequenz in der Wirtszellen-Maschinerie funktional ist und durch sie aktiviert werden kann.
Die 5'-flankierenden Sequenzen, die in den Vektoren nützlich sind, können durch mehrere in der Technik wohlbekannte Verfahren erhalten werden. Typisch sind hierin nützliche 5'-flankierende Sequenzen außer der die das NTP-Peptid-Gen flankierenden Sequenz früher durch Kartieren und/oder durch Restriktionsendonuklease-Verdau identifiziert worden und können so unter Verwendung der geeigneten Restriktionsendonukleasen aus der geeigneten Gewebequelle isoliert werden. In einigen Fällen kann die volle Nukleotidsequenz der 5'-flankierenden Sequenz bekannt sein. Hier kann die 5'-flankierende Sequenz unter Verwendung der oben für die Nukleinsäuresynthese beschriebenen Verfahren synthetisiert oder kloniert werden.
Wenn das ganze oder nur ein Teil der 5'-flankierenden Sequenz bekannt ist, kann sie unter Verwendung von PCR und/oder anhand einer Durchmusterung einer genomischen Bibliothek mit einem geeigneten Oligonukleotid und/oder geeigneten 5'-flankierenden Sequenzfragmenten aus derselben oder einer anderen Spezies erhalten werden.
Wenn die 5'-flankierende Sequenz nicht bekannt ist, kann ein DNA-Fragment, das eine 5'-flankierende Sequenz enthält, aus einem größeren DNA-Stück isoliert werden, welches zum Beispiel eine codierende Sequenz oder selbst ein weiteres Gen oder weitere Gene enthalten kann. Die Isolierung kann mittels Restriktionsendonuklease-Verdau unter Verwendung eines oder mehrerer sorgfältig ausgewählter Enzyme bewerkstelligt werden, um das geeignete DNA-Fragment zu isolieren. Nach dem Verdau kann das gewünschte Fragment durch Agarosegel-Reinigung, Qiagen^®-Säule oder andere dem Fachmann bekannte Verfahren isoliert werden. Die Auswahl geeigneter Enzyme, um diesen Zweck zu bewerkstelligen, ist für den Fachmann ohne weiteres ersichtlich.
Das Replikationsstartelement ist typisch ein Teil von prokaryotischen Expressionsvektoren, die im Handel erworben werden, und unterstützt die Amplifikation des Vektors in einer Wirtszelle. Die Amplifikation des Vektors auf eine gewisse Kopienzahl kann in einigen Fällen für eine optimale Expression des NTP-Peptids wichtig sein. Wenn der Vektor der Wahl keine Replikationsstartstelle enthält, kann eine auf der Grundlage einer bekannten Sequenz chemisch synthetisiert und in den Vektor ligiert werden. Das Transkriptionsterminationselement ist typisch 3' vom Ende der das NTP-Peptid codierenden Sequenz angeordnet und dient dazu, die Transkription des NTP-Peptids zu terminieren. Gewöhnlich ist das Transkriptionsterminationselement in prokaryotischen Zellen ein G-C-reiches Fragment, gefolgt von einer PolyT-Sequenz. Obwohl das Element aus einer Bibliothek kloniert oder im Handel als Teil eines Vektors erworben werden kann, kann es auch leicht unter Verwendung von Verfahren für die Nukleinsäuresynthese, wie den oben beschriebenen, synthetisiert werden.
Ein selektierbares Markergenelement codiert ein Protein, das für das Überleben und das Wachstum einer Wirtszelle erforderlich ist, die in einem selektiven Kulturmedium gezüchtet wird. Typische Selektionsmarkergene codieren Proteine, die (a) eine Resistenz gegen Antibiotika oder andere Toxine, z.B. Ampicillin, Tetracyclin oder Kanamycin bei prokaryotischen Wirtszellen, verleihen, (b) auxothrophe Defekte der Zelle komplementieren; oder (c) kritische Nährstoffe zuführen, die aus komplexen Medien nicht erhältlich sind. Bevorzugte selektierbare Marker sind das Kanamycin-Resistenzgen, das Ampicillin-Resistenzgen und das Tetracyclin-Resistenzgen.
Das Ribosomen-Bindungselement, üblicherweise als Shine-Dalgarno-Sequenz (Prokaryoten) oder Kozak-Sequenz (Eurokaryoten) bezeichnet, ist gewöhnlich für die Translationsinitiierung von mRNA erforderlich. Das Element ist typisch 3' zum Promotor und 5' zur codierenden Sequenz des zu synthetisierenden NTP-Peptids angeordnet. Die Shine-Dalgarno-Sequenz ist unterschiedlich, aber sie ist typisch ein Polypurin (d.h. mit einem hohen A-G-Gehalt). Viele Shine-Dalgarno-Sequenzen sind identifiziert worden, von denen jede leicht vom Fachmann unter Verwendung von oben angegebenen Verfahren synthetisiert und in einem prokaryotischen Vektor verwendet werden kann.
In den Fällen, in denen es wünschenswert ist, dass das NTP-Peptid aus der Wirtszelle sekretiert wird, kann eine Signalsequenz verwendet werden, um das NTP-Peptid aus der Wirtszelle zu lenken, wenn es synthetisiert ist, und der Carboxy-terminale Teil des Proteins kann deletiert werden, um eine Membranverankerung zu verhindern. Typisch ist die Signalsequenz in der codierenden Region des NTP-Peptid-Gens oder der cDNA oder direkt am 5'-Ende der codierenden NTP-Peptid-Genregion angeordnet. Viele Signalsequenzen sind identifiziert worden, und jede davon, die in der gewählten Wirtszelle funktional ist, kann in Verbindung mit dem NTP-Peptid-Gen oder der cDNA verwendet werden. Deshalb kann die Signalsequenz homolog oder heterolog zum NTP-Peptid-Gen oder der cDNA sein und kann homolog oder heterolog zum NTP-Peptid-Gen oder zur cDNA sein. Zusätzlich kann die Signalsequenz unter Verwendung der angegebenen Verfahren chemisch synthetisiert werden. In den meisten Fällen hat die Sekretion des Polypeptids aus der Wirtszelle über die Anwesenheit eines Signalpeptids die Entfernung des Amino-terminalen Methionins aus dem Polypeptid zur Folge.
In vielen Fällen wird die Transkription des NTP-Peptid-Gens oder der NTP-Peptid-cDNA durch das Vorhandensein von einem oder mehreren Introns in dem Vektor erhöht; dies trifft insbesondere zu, wenn das NTP-Peptid in eukaryotischen Wirtszellen, insbesondere Säugetier-Wirtszellen produziert wird. Die verwendeten Introns können von Natur aus innerhalb des NTP-Peptid-Gens vorkommen, insbesondere, wenn das verwendete Gen eine genomische Volllängen-Sequenz oder ein Fragment davon ist. Wenn das Intron nicht von Natur aus in dem Gen vorkommt (wie bei den meisten cDNAs), kann bzw. können das bzw. die Intron(s) von einer andere Quelle erhalten werden. Die Position des Introns in Bezug auf die flankierende Sequenz und das NTP-Peptid-Gen ist im Allgemeinen wichtig, da das Intron transkribiert werden muss, um wirksam zu sein. Dementsprechend ist, wenn das NTP-Peptid-Gen, das in den Expressionsvektor inseriert ist, ein cDNA-Molekül ist, die bevorzugte Position für das Intron 3' zu der Transkriptionsstartstelle und 5' von der polyA-Transkriptionsterminationssequenz. Für die NTP-Peptid-cDNA wird das Intron oder werden die Introns bevorzugt auf einer Seite oder der anderen (d.h. 5' oder 3') der cDNA lokalisiert sein, so dass es diese kodierende Sequenz nicht unterbricht. Es kann ein jegliches Intron aus einer jeglichen Quelle, einschließlich jeglicher viraler, prokaryotischer und eukaryotischer (pflanzlicher oder tierischer) Organismen, verwendet werden, um diese Erfindung in der Praxis auszuführen, vorausgesetzt, dass es mit der oder den Wirtszelle(n), in welche es inseriert wird, verträglich ist. Auch umfasst werden hier synthetische Introns. Gegebenenfalls kann mehr als ein Intron in dem Vektor verwendet werden.
Wenn ein oder mehrere der Elemente, die oben erläutert worden sind, nicht bereits in dem zu verwendenden Vektor vorhanden sind, können sie individuell erhalten und in den Vektor ligiert werden. Verfahren, die verwendet werden, um jedes der Elemente zu erhalten, sind dem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannt und sind vergleichbar mit den Verfahren, die oben erläutert worden sind (d.h. Synthese der DNA, Bibliotheks-Screening und dergleichen).
Die endgültigen Vektoren, die verwendet werden, um diese Erfindung in der Praxis auszuführen, werden typischerweise ausgehend von Ausgangsvektoren, wie einem kommerziell erhältlichen Vektor, konstruiert. Solche Vektoren können einige der Elemente, die in dem komplettierten Vektor enthalten sein sollen, enthalten oder nicht. Wenn keines der gewünschten Elemente in dem Ausgangsvektor vorhanden ist, kann jedes Element individuell in den Vektor ligiert werden, indem der Vektor mit der bzw. den geeigneten Restriktionsendonuklease(n) derart geschnitten wird, dass die Enden des hinein zu ligierenden Elements und die Enden des Vektors für eine Ligation verträglich (kompatibel) sind. In einigen Fällen kann es erforderlich sein, die Enden in stumpfe Enden zu überführen, damit sie miteinander ligiert werden können, um eine zufriedenstellende Ligation zu erhalten. Das Überführen in stumpfe Enden wird bewerkstelligt, indem zuerst „kohäsive Enden" unter Verwendung von Klenow-DNA-Polymerase oder T4-DNA-Polymerase in Gegenwart von allen vier Nukleotiden aufgefüllt werden. Diese Vorgehensweise ist in diesem Fachgebiet wohlbekannt und wird beispielsweise in Sambrook et al., a.a.O., beschrieben. Alternativ können zwei oder mehrere der Elemente, die in den Vektor inseriert werden sollen, zuerst zusammen ligiert werden (wenn sie aneinander angrenzend positioniert sein sollen) und dann in den Vektor ligiert werden.
Ein zusätzliches Verfahren zum Konstruieren des Vektors besteht darin, alle Ligationen der verschiedenen Elemente gleichzeitig in einer Reaktionsmischung auszuführen. Hier werden viele Nonsense- oder nicht-funktionale Vektoren aufgrund einer unkorrekten Ligation oder Insertion der Elemente erzeugt werden. Der funktionale Vektor kann jedoch durch Restriktionsendonukleaseverdau identifiziert und ausgewählt werden.
Bevorzugte Vektoren für das praktische Ausführen dieser Erfindung sind jene, die mit bakteriellen, Insekten- und Säugetier-Wirtszellen verträglich sind. Solche Vektoren umfassen unter anderem pCRII, pCR3 und pcDNA3.1 (Invitrogen Company, San Diego, Kalif.), pBSII (Stratagene Company, La Jolla, Kalif.), pET15b (Novagen, Madison, Wis.), PGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J.), pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, Kalif.), pETL (BlueBacII; Invitrogen) und pFastBacDuaI (Gibco/BRL, Grand Island, N.Y.).
Nachdem der Vektor konstruiert worden ist und ein NTP-Peptid kodierendes Nukleinsäuremolekül in die korrekte Stelle des Vektors inseriert worden ist, kann der vervollständigte Vektor in eine geeignete Wirtszelle für eine Amplifizierung und/oder Polypeptidexpression inseriert werden. Wirtszellen können prokaryotische Wirtszellen (wie E. coli) oder eukaryotische Wirtszellen (wie eine Hefezelle, eine Insektenzelle oder eine Vertebratenzelle) sein. Die Wirtszelle kann, wenn sie unter geeigneten Bedingungen kultiviert wird, NTP-Peptid synthetisieren, das nachfolgend gewonnen werden kann aus dem Kulturmedium (wenn die Wirtszelle es in das Medium sekretiert) oder direkt aus der Wirtszelle, die dieses produziert (wenn es nicht sekretiert wird).
Nach der Gewinnung kann das NTP-Peptid unter Verwendung von Verfahren, wie Molekularsieb-Chromatographie, Affinitätschromatographie und dergleichen, gereinigt werden. Die Auswahl der Wirtszelle für die NTP-Peptid-Produktion wird teilweise davon abhängen, ob das NTP-Peptid glycosyliert oder phosphoryliert werden soll (in welchem Falle eukaryotische Wirtszellen bevorzugt sind) und von der Art und Weise, in welcher die Wirtszelle in der Lage ist, das Protein in seine native Tertiärstruktur zu falten (z.B. korrekte Orientierung von Disulfidbrücken u.s.w.), so dass das biologische Protein hergestellt wird durch das NTP-Peptid, das biologische Aktivität aufweist. Das NTP-Peptid kann nach der Synthese unter Verwendung von geeigneten chemischen Bedingungen, wie nachfolgend diskutiert, gefaltet werden. Geeignete Zellen oder Zelllinien, die im Rahmen der Erfindung nützlich sind, umfassen Säugetierzellen, wie Eierstockzellen des chinesischen Hamsters (CHO), humane embryonale Nieren (HEK)-293- oder 293T-Zellen oder 3T3-Zellen. Die Auswahl von geeigneten Säugetier-Wirtszellen und Verfahren zur Transformation, Kultur, Amplifizierung, zum Screenen und zur Produktproduktion und -reinigung können bewerkstelligt werden durch die Fachleute auf diesem Gebiet unter Verwendung der hier bereitgestellten Richtlinien. Andere geeignete Säugetier-Zelllinien umfassen die Affen-COS-1- und -COS-7-Zelllinien und die CV-1-Zelllinie. Weitere exemplarische Säugetier-Wirtszellen umfassen Primaten-Zelllinien und Nagetier-Zelllinien, einschließlich transformierter Zelllinien. Normale diploide Zellen, Zellstämme, die aus einer in vitro-Kultur von primärem Gewebe abgeleitet worden sind, wie auch primäre Explantate sind ebenfalls geeignet. Kandidatenzellen können hinsichtlich des Selektionsgens genotypisch defizient sein oder können ein dominant wirkendes Selektionsgen enthalten. Andere geeignete Säugetier-Zelllinien umfassen, sind aber nicht beschränkt auf die Maus-Neuroblastom-N2A-Zellen, HeLa, Maus-L-929-Zellen, 3T3-Linien, abgeleitet von Swiss-, Balb-c- oder NIH-Mäusen, BHK- oder HaK-Hamster-Zelllinien.
In ähnlicher Weise nützlich als Wirtszellen, die für die Erfindung geeignet sind, sind Bakterienzellen. Beispielsweise sind die verschiedenen Stämme von E. coli (z.B. HB101, DH5.alpha, DH10 und MC1061) als Wirtszellen auf dem Gebiet der Biotechnologie wohlbekannt. Verschiedene Stämme von B, subtilis, Pseudomonas sp., andere Bacillus spp., Streptomyces spp. und dergleichen können in diesem Verfahren ebenfalls eingesetzt werden. Es stehen auch viele Stämme von Hefezellen, die den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind, als Wirtszellen für eine Expression der Polypeptide der Erfindung zur Verfügung.
Zusätzlich können, wo gewünscht, Insektenzellsysteme in den Verfahren der Erfindung eingesetzt werden. Solche Systeme werden beispielsweise in Kitts et al. (Biotechniques, 14: 810-817 [1993]), Lucklow (Curr. Opin. Biotechnol., 4: 564-572 [1993]) und Lucklow et al. (J. Virol., 67: 4566-4579 [1993]) beschrieben. Bevorzugte Insektenzellen sind SF-9 und Hi5 (Invitrogen, Carlsbad, Kalif.).
Eine Insertion (auch bezeichnet als Transformation oder Transfektion) des Vektors in die ausgewählte Wirtszelle kann bewerkstelligt werden unter Verwendung von solchen Verfahren, wie der Calciumchlorid-, Elektroporations-, Mikroinjektions-, Lipofektions- oder der DEAE-Dextran-Methode. Das ausgewählte Verfahren wird teilweise von der Art von Wirtszelle, die verwendet werden soll, abhängen. Diese Verfahren und andere geeignete Verfahren sind den Fachleuten auf diesem Gebiet wohlbekannt und werden beispielsweise in Sambrook et al., a.a.O., erläutert.
Die den Vektor enthaltenden (d.h. transformierten oder transfizierten) Wirtszellen können kultiviert werden unter Verwendung von Standardmedien, die den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind. Die Medien werden üblicherweise alle Nährstoffe enthalten, die für die Vermehrung und das Überleben der Zellen erforderlich sind. Geeignete Medien für das Kultivieren von E. coli-Zellen sind beispielsweise Luria Broth (LB) und/oder Terrific Broth (TB). Geeignete Medien für das Kultivieren von eukaryotischen Zellen sind RPMI 1640, MEM, DMEM, die alle mit Serum und/oder Wachstumsfaktoren ergänzt werden können, sofern diese von der jeweiligen Zelllinie, die kultiviert wird, benötigt werden. Ein geeignetes Medium für Insektenkulturen ist Graces-Medium, ergänzt mit Yeastolate, Lactalbumin-Hydrolysat und/oder fötalem Kälberserum, sofern nötig. Typischerweise wird ein Antibiotikum oder eine andere Verbindung, die für eine selektive Vermehrung nur der transformierten Zellen nützlich ist, als eine Ergänzung zu dem Medium hinzugesetzt. Die zu verwendende Verbindung wird durch das auf dem Plasmid, mit dem die Wirtszelle transformiert worden ist, vorhandene selektierbare Markerelement diktiert werden. Wenn das selektierbare Markerelement beispielsweise Kanamycinresistenz ist, wird die zu dem Kulturmedium hinzugesetzte Verbindung Kanamycin sein.
Die Menge von in der Wirtszelle produziertem NTP-Peptid kann ausgewertet werden unter Verwendung von Standardmethoden, die in diesem Fachgebiet bekannt sind. Solche Methoden umfassen, ohne Einschränkukng, Western-Blot-Analyse, SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese, nicht-denaturierende Gelelektrophorese, HPLC-Trennung, Massenspektroskopie, Immunpräzipitation und/oder Aktivitätsassays, wie DNA-Bindungs-Gel-Shift-Assays (DNA-Bindungs-Gel-Verschiebungs-Assays).
Wenn das NTP-Peptid so gestaltet worden ist, dass es aus den Wirtszellen sekretiert wird, kann die Hauptmenge des NTP-Peptids in dem Zellkulturmedium gefunden werden. Auf diese Weise hergestellte Proteine werden typischerweise kein aminoterminales Methionin aufweisen, da dieses während der Sekretion aus der Zelle entfernt wird. Wenn das NTP-Peptid jedoch aus den Wirtszellen nicht sekretiert wird, wird es im Zytoplasma und/oder im Zellkern (bei eukaryotischen Wirtszellen) oder im Zytosol (bei gramnegativen Bakterien als Wirtszellen) vorhanden sein und es kann ein aminoterminales Methionin aufweisen.
Für ein im Zytoplasma und/oder in dem Zellkern der Wirtszellen befindliches NTP-Peptid werden die Wirtszellen typischerweise zuerst mechanisch oder mittels Detergens aufgebrochen, so dass sie den intrazellulären Inhalt in eine gepufferte Lösung freisetzen. NTP-Peptid kann dann aus dieser Lösung isoliert werden.
Die Reinigung von NTP-Peptid aus einer Lösung kann unter Verwendung von verschiedenen Techniken bewerkstelligt werden. Wenn das Protein derart synthetisiert worden ist, dass es eine Markierung, wie hexaHistidin (z.B. NTP-Peptid/hexaHis) oder ein anderes kleines Peptid, wie FLAG (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI) oder das Calmodulin-bindende Peptid (Stratagene, La Jolla, CA), an entweder dessen Carboxyl- oder Aminoterminus enthält, kann es im Wesentlichen in einem einstufigen Verfahren gereinigt werden durch Hindurchleiten der Lösung durch eine Affinitätssäule, wo die Säulenmatrix eine hohe Affinität für die Markierung oder für das Protein direkt (d.h. ein monoklonaler Antikörper, der spezifisch das NTP-Peptid erkennt) hat. Beispielsweise bindet Polyhistidin mit hoher Affinität und Spezifität an Nickel, Zink und Cobalt; dementsprechend kann eine an immobilisierten Metallionen erfolgende Affinitätschromatographie, die ein auf Nickel basierendes Affinitätsharz (wie es in Qiagens QIAexpress system oder Invitrogens Xpress System verwendet wird) oder ein auf Cobalt basierendes Affinitätsharz (wie es in dem Talon-System von BD Biosciences-CLONTECH verwendet wird) einsetzt, zur Reinigung von NTP-Peptid/polyHis verwendet werden. (Siehe beispielsweise Ausubel et al., Hrsg., Current Protocols in Molecular Biology, Abschnitt 10.11.8, John Wiley & Sons, New York [1993]).
Wenn das NTP-Peptid ohne eine angeheftete Markierung hergestellt wird und keine Antikörper zur Verfügung stehen, können andere wohlbekannte Vorgehensweisen zur Reinigung verwendet werden. Solche Vorgehensweisen umfassen, ohne Einschränkung, Ionenaustauschchromatographie, Hydroxylapatit-Chromatographie, hydrophobe Wechselwirkungschromatographie, Molekularsieb-Chromatographie, HPLC, native Gelelektrophorese in Kombination mit Gelelution und präparative isoelektrische Fokussierung (Isoprime-Gerät/Technik, Hoefer Scientific). In einigen Fällen können zwei oder mehrere von diesen Techniken kombiniert werden, um erhöhte Reinheit zu erzielen.
Wenn antizipiert wird, dass das NTP-Peptid primär intrazellulär gefunden werden wird, kann das intrazelluläre Material (einschließlich Einschlusskörpern bei gramnegativen Bakterien) aus der Wirtszelle extrahiert werden unter Verwendung einer jeglichen Standardtechnik, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt ist. Beispielsweise können die Wirtszellen durch French press, Homogenisierung und/oder Beschallung, gefolgt von Zentrifugation, lysiert werden, um den Inhalt des Periplasmas/Zytoplasmas freizusetzen. Wenn das NTP-Peptid Einschlusskörper im Zytosol gebildet hat, können die Einschlusskörper oftmals an die inneren und/oder äußeren Zellmembranen binden und werden dementsprechend primär im Pelletmaterial nach einer Zentrifugation gefunden werden. Das Pelletmaterial kann dann bei pH-Extremen oder mit einem chaotropen Mittel, wie einem Detergens, Guanidin, Guanidin-Derivaten, Harnstoff oder Harnstoff-Derivaten, in Gegenwart eines Reduktionsmittels, wie Dithiothreitol bei alkalischem pH oder Triscarboxyethylphosphin bei saurem pH, behandelt werden, um die Einschlusskörper freizusetzen, auseinanderzubrechen und zu solubilisieren. Das NTP-Peptid in seiner jetzt löslichen Form kann dann analysiert werden unter Verwendung von Gelelektrophorese, Immunpräzipitation oder dergleichen. Wenn gewünscht wird, das NTP-Peptid zu isolieren, kann die Isolierung bewerkstelligt werden unter Verwendung von Standardmethoden wie jenen, die nachfolgend und in Marston et al. (Meth. Enz., 182: 264-275 [1990]) erläutert werden.
In einigen Fällen ist das NTP-Peptid möglicherweise nach einer Isolierung nicht biologisch aktiv. Verschiedene Methoden zum Umfalten oder Umwandeln des Polypeptids in seine Tertiärstruktur und zum Erzeugen von Disulfidbrücken können verwendet werden, um biologische Aktivität wieder herzustellen. Solche Methoden umfassen das Exponieren des solubilisierten Polypeptids gegenüber einem pH üblicherweise über 7 und in Gegenwart einer bestimmten Konzentration eines chaotropen Mittels. Die Auswahl des chaotropen Mittels erfolgt sehr ähnlich zu den Wahlen, die für die Solubilisierung von Einschlusskörpern getroffen werden, aber üblicherweise bei geringerer Konzentration, und es ist nicht notwendigerweise das gleiche chaotrope Mittel, wie es für die Solubilisierung verwendet wird. In den meisten Fällen wird die Umfaltungs/Oxidationslösung auch ein Reduktionsmittel oder ein Reduktionsmittel plus dessen oxidierte Form in einem speziellen Verhältnis enthalten, um ein bestimmtes Redoxpotential zu erzeugen, welches ermöglicht, dass bei der Bildung der Cystein-Brücke(n) des Proteins Disulfidverschiebungen auftreten. Einige der üblicherweise verwendeten Redox-Paare umfassen Cystein/Cystamin, Glutathion (GSH)/Dithiobis-GSH, Kupfer(II)-chlorid, Dithiothreitol (DTT)/Dithian-DTT, 2-Mercaptoethanol (bME)/Dithio-b(ME). In vielen Fällen kann ein Colösungsmittel erforderlich sein, um die Effizienz der Umfaltung zu erhöhen, und die üblicheren Reagenzien, die für diesen Zweck verwendet werden, umfassen Glycerol, Polyethylenglycol mit verschiedenen Molekulargewichten und Arginin.
Wenn in der Wirtszelle keine NTP-Peptid-Einschlusskörper in einem signifikanten Ausmaß gebildet werden, kann das NTP-Peptid primär in dem Überstand nach der Zentrifugation des Zellhomogenisats gefunden werden und das NTP-Peptid kann aus dem Überstand unter Verwendung von Methoden wie jenen, die nachfolgend erläutert werden, isoliert werden.
In jenen Situationen, wo es bevorzugt ist, das NTP-Peptid teilweise oder vollständig zu isolieren, kann eine Reinigung bewerkstelligt werden unter Verwendung von Standardmethoden, die dem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannt sind. Solche Methoden umfassen, ohne Einschränkung, eine Trennung durch Elektrophorese, gefolgt von einer Elektroelution, verschiedene Arten von Chromatographie (Immunaffinität, Molekularsieb und/oder Ionenaustausch) und/oder Hochdruckflüssigkeitschromatographie. In einigen Fällen kann es bevorzugt sein, mehr als eine dieser Methoden für eine vollständige Reinigung zu verwenden.
Zusätzlich zum Herstellen und Reinigen von NTP-Proteinen oder NTP-Peptiden unter Verwendung der Techniken der in vitro-DNA-Rekombination können NTP-Peptide durch Methoden chemischer Synthese (wie Festphasen-Peptidsynthese) hergestellt werden unter Verwendung von Techniken, die in diesem Fachgebiet bekannt sind, wie jene, die von Merrifield et al. (J. Am. Chem. Soc., 85: 2149 [1963]), Houghten et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 5132 [1985]) und Stewart und Young (Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, III. [1984]) erläutert worden sind. Solche Polypeptide können mit oder ohne ein Methionin am Aminoterminus synthetisiert werden. Chemisch synthetisierte NTP-Proteine oder NTP-Peptide können unter Verwendung von Verfahren, die in diesen Referenzen erläutert werden, oxidiert werden, um Disulfidbrücken zu bilden. Es wird erwartet, dass die NTP-Proteine oder NTP-Peptide biologische Aktivität, die mit NTP-Proteinen oder NTP-Peptiden, die rekombinant hergestellt oder aus natürlichen Quellen gereinigt worden sind, vergleichbar ist, aufweisen und dementsprechend austauschbar mit einem rekombinanten oder natürlichen NTP-Protein oder NTP-Peptid verwendet werden können.
Heutzutage existiert eine Anzahl von Organisationen, die in der Lage sind, die Related Proteins (Verwandte Proteine), Related Peptides (Verwandte Peptide) und NTP-Peptide, die hier beschrieben werden, zu synthetisieren. Beispielsweise kann, ist die Sequenz eines NTP-Peptids gegeben, die Organisation das Peptid synthetisieren und das synthetisierte Peptid mit einer begleitenden Dokumentation und einem Nachweis der Identität des Peptids zuschicken.
Die Erfindung ist auf die Verwendung von NTP-Peptiden für das Behandeln von Zuständen, welche die Entfernung von Zellen erfordern, wie gutartige und maligne Tumore, glanduläre (z.B. Prostata-)Hyperplasie, unerwünschte Gesichtsbehaarung, Warzen und unerwünschtes Fettgewebe, gerichtet. Ein solches Verfahren umfasst, einem Säugetier, welches dies benötigt, eine therapeutisch wirksame Menge von NTP-Peptid zu verabreichen.
Der Zustand können beispielsweise Tumore von Lunge, Brust, Magen, Pankreas, Prostata, Blase, Knochen, Ovar, Haut, Niere, Sinus, Kolon, Darm, Magen, Rektum, Ösophagus, Blut, Hirn und dessen Umhüllungen, Rückenmark und dessen Umhüllungen, Muskel, Bindegewebe, Nebenniere, Nebenschilddrüse, Schilddrüse, Uterus, Testes, Hypophyse, Reproduktionsorganen, Leber, Gallenblase, Auge, Ohr, Nase, Rachen, Mandeln, Mund, Lymphknoten und Lymphsystem (z.B. lymphatisches Gewebe) und anderen Organen sein.
Wie hier verwendet, soll der Begriff „maligner Tumor" alle Formen von humanen Karzinomen, Sarkomen und Melanomen, die in den schlecht differenzierten, moderat differenzierten und gut differenzierten Formen vorkommen, umfassen.
Diese Erfindung befriedigt einen Bedarf in diesem Fachgebiet an Behandlungen, die gutartige Tumore mit weniger Risiko und weniger der unerwünschten Nebenwirkungen eines chirurgischen Eingriffs entfernen können. Eine Entfernung von gutartigen Tumoren in chirurgisch gefährlichen Bereichen, wie in tief gelegenen Bereichen des Körpers (z.B. Gehirn, Herz, Lungen und andere) wird besonders benötigt.
Die Verwendung von NTP-Peptiden für das Behandeln von Zuständen, wo Zellen entfernt werden müssen, kann in Verbindung mit herkömmlichen Methoden zum Behandeln von solchen Zuständen, wie chirurgischer Entfernung, Chemotherapie und Bestrahlung, verwendet werden. NTP-Peptid kann vor, während oder nach solchen herkömmlichen Behandlungen verabreicht werden.
Der zu behandelnde Zustand kann auch eine Hyperplasie, Hypertrophie oder eine Wucherung eines Gewebes, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lunge, Brust, Magen, Pankreas, Prostata, Blase, Knochen, Ovar, Haut, Niere, Sinus, Kolon, Darm, Magen, Rektum, Ösophagus, Blut, Hirn und dessen Umhüllungen, Rückenmark und dessen Umhüllungen, Muskel, Bindegewebe, Nebenniere, Nebenschilddrüse, Schilddrüse, Uterus, Testes, Hypophyse, Reproduktionsorganen, Leber, Gallenblase, Auge, Ohr, Nase, Rachen, Mandeln, Mund und Lymphknoten und Lymphsystem, sein.
Andere Zustände, die unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung behandelt werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf viral, bakteriell oder aufgrund von Parasiten verändertes Gewebe, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lunge, Brust, Magen, Pankreas, Prostata, Blase, Knochen, Ovar, Haut, Niere, Sinus, Kolon, Darm, Magen, Rektum, Ösophagus, Blut, Hirn und dessen Umhüllungen, Rückenmark und dessen Umhüllungen, Muskel, Bindegewebe, Nebenniere, Nebenschilddrüse, Schilddrüse, Uterus, Testes, Hypophyse, Reproduktionsorganen, Leber, Gallenblase, Auge, Ohr, Nase, Rachen, Mandeln, Mund und Lymphknoten und Lymphsystem.
Der zu behandelnde Zustand kann auch eine Fehlbildung oder Erkrankung/Störung eines Gewebes, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lunge, Brust, Magen, Pankreas, Prostata, Blase, Knochen, Ovar, Haut, Niere, Sinus, Kolon, Darm, Magen, Rektum, Ösophagus, Blut, Hirn und dessen Umhüllungen, Rückenmark und dessen Umhüllungen, Muskel, Bindegewebe, Nebenniere, Nebenschilddrüse, Schilddrüse, Uterus, Testes, Hypophyse, Reproduktionsorganen, Leber, Gallenblase, Auge, Ohr, Nase, Rachen, Mandeln, Mund und Lymphknoten und Lymphsystem, sein.
Insbesondere kann der zu behandelnde Zustand Mandelhypertrophie, Prostatavergrößerung, Psoriasis, Ekzeme, Dermatosen oder Hämorrhoiden sein. Der zu behandelnde Zustand kann eine vaskuläre Erkrankung, wie Atherosklerose oder Arteriosklerose, oder eine vaskuläre Erkrankung, wie Krampfadern, sein. Der zu behandelnde Zustand kann auch eine kosmetische Modifikation an einem Gewebe, wie Haut, Auge, Ohr, Nase, Rachen, Mund, Muskel, Bindegewebe, Haar oder Brustgewebe, sein.
Therapeutische Zusammensetzungen von NTP-Peptiden liegen innerhalb des Umfangs der Erfindung. Solche Zusammensetzungen können eine therapeutisch wirksame Menge eines NTP-Peptids in einer Mischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfassen. Das Trägermaterial kann Wasser für die Injektion, vorzugsweise ergänzt mit anderen Materialien, die in Lösungen für eine Verabreichung an Säugetiere üblich sind, sein. Typischerweise wird ein NTP-Peptid für eine therapeutische Verwendung in Form einer Zusammensetzung verabreicht werden, welche gereinigtes NTP-Peptid in Verbindung mit einem oder mehreren physiologisch annehmbaren Trägern, Hilfsstoffen oder Verdünnungsmitteln umfasst. Neutrale gepufferte Kochsalzlösung oder Kochsalzlösung gemischt mit Serumalbumin sind exemplarische geeignete Träger. Das Produkt wird vorzugsweise unter Verwendung von geeigneten Hilfsstoffen (z.B. Sucrose) als ein Lyophilisat formuliert. Andere Standardträger, -verdünnungsmittel und -hilfsstoffe können aufgenommen werden, sofern gewünscht. Zusammensetzungen, welche Puffer umfassen, die den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind, mit einem geeigneten Bereich von pH-Werten, einschließlich Tris-Puffer mit einem pH von etwa 7,0 bis 8,5 oder Acetatpuffer mit einem pH von etwa 4,0 bis 5,5, die des Weiteren Sorbitol oder einen geeigneten Ersatz dafür umfassen können.
Die NTP-Peptide können allein, gemeinsam oder in Kombination mit anderen pharmazeutischen Zusammensetzungen, wie Zytokinen, Wachstumsfaktoren, Antibiotika, Apoptose-induzierenden Mitteln, antiinflammatorisch wirkenden Mitteln und/oder chemotherapeutischen Mitteln, verwendet werden, sofern dies für die behandelte Indikation geeignet ist.
Diese Erfindung umfasst auch therapeutische Zusammensetzungen von NTP-Peptiden, die Dendrimere, Fullerene und andere synthetische Moleküle, Polymere und Makromoleküle, wo das NTP-Peptid in das Molekül, Polymer oder Makromolekül, entweder selbst oder in Verbindung mit anderen Molekülspezies, wie einem tumorspezifischen Marker, eingeschlossen ist, einsetzen. Beispielsweise gibt das U.S.-Patent Nr. 5,714,166, Bioactive and/or Targeted Dendrimer Conjugates, ein Verfahren zur Herstellung und Verwendung von unter anderem dendritischen Polymer-Konjugaten, welche aus wenigstens einem Dendrimer mit einer oder mehreren ein Ziel ansteuernden Komponente(n) und wenigstens einem bioaktiven Mittel, welches damit konjugiert ist, gebildet werden, an.
Diese Erfindung umfasst auch therapeutische Zusammensetzungen von NTP-Peptiden und Arzneimittelabgabevehikel, wie Lipidemulsionen, Micellenpolymere, Polymer-Mikrosphären, elektroaktive Polymere, Hydrogele und Liposome.
Feste Dosierungsformen für eine orale Verabreichung umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Kapseln, Tabletten, Pillen, Pulver und Körnchen. In solchen festen Dosierungsformen ist die aktive Verbindung vorzugsweise mit mindestens einem der folgenden gemischt: (a) einem oder mehreren inerten Hilfsstoffen (oder Träger), wie Natriumcitrat oder Dicalciumphosphat; (b) Füllstoffen oder Streckmitteln, wie Stärken, Lactose, Sucrose, Glucose, Mannitol und Kieselsäure; (c) Bindemitteln, wie Carboxymethylcellulose, Alginaten, Gelatine, Polyvinylpyrrolidon, Sucrose und Gummiarabicum; (d) Feuchthaltemitteln, wie Glycerol; (d) Abbaumitteln, wie Agar-Agar, Calciumcarbonat, Kartoffel- oder Tapioca-Stärke, Alginsäure, bestimmten komplexen Silicaten und Natriumcarbonat; (f) Auflösungsverzögerern, wie Paraffin; (g) Absorptionsbeschleunigern, wie quartären Ammoniumverbindungen; (h) Benetzungsmitteln, wie Acetylalkohol und Glycerolmonostearat; (i) Adsorptionsmitteln, wie Kaolin und Bentonit; und (j) Gleitmitteln, wie Talk, Calciumstearat, Magnesiumstearat, festen Polyethylenglycolen, Natriumlaurylsulfat oder Mischungen davon. Bei Kapseln, Tabletten und Pillen können die Dosierungsformen auch puffernd wirkende Mittel umfassen.
Flüssige Dosierungsformen für eine orale Verabreichung umfassen pharmazeutisch annehmbare Emulsionen, Lösungen, Suspensionen, Sirupe und Elixire. Zusätzlich zu den wirksamen Verbindungen können die flüssigen Dosierungsformen inerte Verdünnungsmittel, die in diesem Fachgebiet üblicherweise verwendet werden, wie Wasser oder andere Lösungsmittel, Solubilisierungsmittel und Emulgatoren umfassen. Exemplarische Emulgatoren sind Ethylalkohol, Isopropylalkohol, Ethylcarbonat, Ethylacetat, Benzylalkohol, Benzylbenzoat, Propylenglycol, 1,3-Butylenglycol, Dimethylformamid, Öle, wie Baumwollsamenöl, Erdnussöl, Maiskeimöl, Olivenöl, Rizinusöl und Sesamöl, Glycerol, Tetrahydrofurfurylalkohol, Polyethylenglycole, Fettsäureester von Sorbitan oder Mischungen von diesen Substanzen und dergleichen umfassen.
Neben solchen inerten Verdünnungsmitteln kann die Zusammensetzung auch Adjuvantien oder Hilfssubstanzen, wie Benetzungsmittel, emulgierend und suspendierend wirkende Mittel, Süßungsmittel, Geschmack verleihende und parfümierende Mittel, umfassen.
Aktuelle Dosierungshöhen von Wirkstoffen in den Zusammensetzungen der Erfindung können variiert werden, um eine Menge von NTP-Peptid zu erhalten, die wirksam ist, um eine gewünschte therapeutische Reaktion für eine bestimmte Zusammensetzung und ein bestimmtes Verabreichungsverfahren zu erhalten. Die ausgewählte Dosierungshöhe hängt dementsprechend von der gewünschten therapeutischen Wirkung, der Verabreichungsroute, der gewünschten Behandlungsdauer und anderen Faktoren ab.
Bei Säugetieren, einschließlich des Menschen, können die wirksamen Mengen auf der Grundlage der Körperoberfläche verabreicht werden. Die wechselseitige Beziehung von Dosierungen für Tiere von verschiedenen Größen, Spezies und Menschen (basierend auf mg/M² Körperoberfläche) wird von E.J. Freireich et al., Cancer Chemother. Rep., 50(4): 219 (1966) beschrieben. Die Körperoberfläche kann näherungsweise bestimmt werden aus der Größe und dem Gewicht eines Individuums (siehe z.B. Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardsley, N.Y., S. 537-538 (1970).
Die gesamte tägliche Dosis des an einen Wirt verabreichten NTP-Peptids kann in einer einzelnen Dosis oder aufgeteilten Dosen verabreicht werden. Dosierungseinheit-Zusammensetzungen können solche Mengen von solchen Untervielfachen („submultiples") davon enthalten, wie sie verwendet werden können, um die tägliche Dosis auszumachen. Es versteht sich jedoch, dass die spezielle Dosishöhe für einen jeglichen bestimmten Patienten von verschiedenen Faktoren abhängen wird, einschließlich des Körpergewichts, der allgemeinen Gesundheit, des Geschlechts, der Diät, des Zeitpunkts und der Route der Verabreichung, der Wirkkraft des verabreichten Arzneimittels, Raten von Absorption und Exkretion, Kombination mit anderen Arzneimitteln und der Schwere der jeweiligen Erkrankung, die behandelt wird.
Die NTP-Peptid-Zusammensetzung gemäß der Erfindung kann intramuskulär, oral, intravenös, intraperitoneal, intrazerebral (intraparenchymal), intrazerebroventrikulär, intratumoral, intraläsional, intradermal, intrathekal, intranasal, intraokular, intraarteriell, topisch, transdermal, über ein Aerosol, Infusion, Bolus-Injektion, über eine Implantationsvorrichtung, ein Depot-Freisetzungssystem u.s.w. verabreicht werden.
Das NTP-Peptid der Erfindung kann auch verabreicht werden durch eine transdermale oder transkutane Route. Ein Beispiel für eine solche Ausführungsform ist die Verwendung eines Pflasters. Insbesondere kann ein Pflaster hergestellt werden mit einer feinen Suspension von NTP-Peptid in beispielsweise Dimethylsulfoxid (DMSO) oder einer Mischung von DMSO mit Baumwollsamenöl und in Kontakt mit der Haut der einen Tumor tragenden Säugetiere entfernt von der Stelle des Tumororts innerhalb einer Hauttasche gebracht werden. Andere Medien oder Mischungen davon mit anderen Lösungsmitteln und festen Trägern würden ebenso in gleicher Weise funktionieren. Das Pflaster kann die NTP-Peptid-Verbindung in Form einer Lösung oder einer Suspension enthalten. Das Pflaster kann dann auf die Haut des Patienten aufgebracht werden beispielsweise mittels des Einführens von diesem in eine Hauttasche des Patienten, die durch Falten und Zusammenhalten der Haut mittels Stichen, Klammern oder anderen Haltevorrichtungen gebildet wird. Diese Tasche sollte auf eine solche Weise eingesetzt werden, dass ein kontinuierlicher Kontakt mit der Haut ohne Behinderung des Säugetiers sichergestellt wird. Neben einer Verwendung einer Hauttasche kann eine jegliche Vorrichtung verwendet werden, die die feste Platzierung des Pflasters in Kontakt mit der Haut sicherstellt. Es könnte beispielsweise eine klebende Bandage verwendet werden, um das Pflaster auf der Haut an Ort und Stelle zu haften.
NTP-Peptid kann in einer Depot-Formulierung oder -zubereitung verabreicht werden. Geeignete Beispiele für Depot-Zubereitungen umfassen semipermeable Polymermatrices in Form von geformten Gegenständen, z.B. Filmen, oder Mikrokapseln. Depot-Matrices umfassen Polyester, Hydrogele, Polylactide ( U.S. 3,773,919 , EP 58,481 ), Copolymere von L-Glutaminsäure und gamma-Ethyl-L-glutamat (Sidman et al., Biopolymers, 22: 547-556 [1983]), Poly-(2-hydroxyethylmethacrylat) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 [1981] und Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 [1982], Ethylenvinylacetat (Langer et al., a.a.O.) oder Poly-D(–)-3-hydroxybuttersäure ( EP 133,988 ). Depot-Zusammensetzungen können auch Liposome umfassen, die durch jegliche von mehreren Methoden, die in diesem Fachgebiet bekannt sind, hergestellt werden können (z.B. Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-3692 [1985]; EP 36,676 ; EP 88,046 ; und EP 143,949 ).
Eine andere Verabreichungsroute für ein NTP-Peptid der Erfindung wird realisiert durch direkte oder indirekte Infusion von NTP-Peptid in den Tumor oder ein anderes Gewebe, welches behandelt werden soll. Ein Beispiel für eine solche Ausführungsform ist die direkte Injektion von NTP-Peptid in den Tumor oder ein anderes Gewebe, welches behandelt werden soll. Die Behandlung kann aus einer einzelnen Injektion, einer Mehrzahl von Injektionen zu einer Gelegenheit oder einer Reihe von Injektionen über einen Zeitraum von Stunden, Tagen oder Monaten bestehen, wobei die Regression oder Zerstörung des Tumors oder des anderen Gewebes, welches behandelt werden soll, mittels Biopsie, Bildgebung oder anderen Methoden zur Überwachung von Gewebewachstum überwacht wird. Die Injektion in den Tumor oder ein anderes Gewebe, welches behandelt werden soll, kann durch eine Vorrichtung erfolgen, die in eine Öffnung, wie die Nase, den Mund, das Ohr, die Vagina, das Rektum oder die Urethra, oder durch einen Einschnitt eingeführt wird, um den Tumor oder das Gewebe in vivo zu erreichen, und kann in Verbindung mit einem bildgebenden oder optischen System, wie einem Ultraschall- oder Fiberendoskop, ausgeführt werden, um die geeignete Stelle für die Injektion(en) zu identifizieren. Ein anderes Beispiel einer solchen Ausführungsform ist die Verwendung einer Vorrichtung, die eine konstante Infusion von NTP-Peptid zu dem Gewebe über die Zeit gewährleisten kann.
Eine andere Verabreichungsroute für ein NTP-Peptid der Erfindung wird realisiert in Verbindung mit einem chirurgischen oder ähnlichen Eingriff, welcher eingesetzt wird, um Tumor- oder anderes Gewebe oder zelluläre Elemente, die entfernt oder zerstört werden müssen oder von denen gewünscht wird, dass sie entfernt oder zerstört werden, physisch herauszuschneiden, zu entfernen oder auf andere Weise abzutöten oder zu zerstören, wobei ein NTP-Peptid der Erfindung verabreicht wird an den bzw. die unmittelbaren Bereich(e), welche(r) die Fläche(n), wo der Tumor oder das andere Gewebe entfernt worden ist, umgibt bzw. umgeben, um jegliche Tumorzellen oder andere zelluläre Elemente, die durch den Eingriff nicht entfernt oder zerstört worden sind, zu zerstören oder deren Vermehrung zu behindern.
Eine andere Verabreichungsroute für ein NTP-Peptid der Erfindung wird realisiert durch Implantierung einer Vorrichtung in den Tumor oder ein anderes Gewebe, das behandelt werden soll. Ein Beispiel einer solchen Ausführungsform ist die Implantierung eines NTP-Peptid enthaltenden Plättchens („wafer") in den Tumor oder das andere Gewebe, das behandelt werden soll. Das Plättchen setzt eine therapeutische Dosis von NTP-Peptid in das Gewebe über die Zeit frei. Alternativ oder zusätzlich kann die Zusammensetzung lokal über eine Implantierung einer Membran, eines Schwamms oder eines anderen geeigneten Materials, auf welches das NTP-Peptid absorbiert worden ist, in den befallenen Bereich verabreicht werden. Wenn eine Implantationsvorrichtung verwendet wird, kann die Vorrichtung in ein jegliches geeignetes Gewebe oder Organ implantiert werden und die Abgabe des NTP-Peptids kann direkt durch die Vorrichtung als Bolus oder über eine kontinuierliche Verabreichung oder über einen Katheter unter Verwendung einer kontinuierlichen Infusion erfolgen.
Beispiel 1: (nur zum Vergleich)
Der Zweck dieses Beispiels war, die Wirkung von NTP-Peptid Nr. 7 auf Gewebe an Injektionsorten zu bestimmen.
Vier normalen Ratten wurde NTP-Peptid Nr. 7 in Kochsalzlösung in Mengen von 100 bis 400 ml in Konzentrationen von 0,1-1 mg/ml, abgegeben aus Kunststoffspritzen durch 26 Gauge-Edelstahlnadeln, in die Haut und subkutan, jeweils in vier unterschiedliche Foci, und in Skelettmuskel einer Extremität, jeweils in zwei unterschiedliche Foci, injiziert.
Die Tiere wurden 24 h beobachtet und nach 24 h schmerzlos getötet. Die individuellen Infiltrationsfoci wurden herausgeschnitten, in 10% Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet und durch histopathologische Standardmethoden gefärbt und untersucht.
Die Kontrollen erhielten allein Kochsalzlösung.
Ergebnisse: Die Injektion von NTP-Peptid Nr. 7 erzeugte eine Nekrose von Gewebe an den Injektionsorten. Die Nekrose war evident in Muskelgewebe, subkutanem Bindegewebe und Dermis an den Orten, wo NTP-Peptid Nr. 7 injiziert worden war. Die Nekrose korrelierte mit den Injektionsbereichen und schien sich nicht weit über den Injektionsort hinaus zu verbreiten.
Abgesehen von den Bereichen mit milder Entzündung zeigten die Kontrollen keinen Hinweis auf Nekrose oder Zellverlust. Die Kontrollen zeigten minimale oder fehlende Muskelveränderungen. Kontrollinjektionen erzeugten milde bis minimale akute Entzündungen an den Injektionsstellen und fokale Mikrohämorrhagien von den Nadeln.
Beispiel 2 (nur zum Vergleich)
Der Zweck dieses Beispiels war, die Wirkung von NTP-Peptid Nr. 7 auf Gewebe an Injektionsorten zu bestimmen.
Vier Ratten wurden mit Ether anästhesiert und erhielten NTP-Peptid Nr. 7 durch intraprostatische Injektion. Die Injektionen bestanden aus 300 μl NTP-Peptid Nr. 7, 1 mg/ml in PBS, pH 7,4 (1,0 mg/kg). Kontrollen erhielten Injektionen von PBS allein oder keine Injektion. Ratten wurden nach 72 h schmerzfrei getötet. Prostatadrüsen wurden präpariert, in 10% gepuffertem Formalin 24 h fixiert, in Paraffin eingebettet, davon Schnitte erstellt und mit H & E gefärbt. Für jedes Tier wurde die gesamte Prostatadrüse eingebettet und davon Schnitte erstellt. Alle gefärbten Schnitte wurden histologisch untersucht.
Ergebnisse: Mit NTP-Peptid Nr. 7 behandelte Ratten-Prostata zeigte Nekrose von Gewebe an den Injektionsorten mit einem Verlust von glandulärem Epithel, Abflachung und Atrophie. Es gab keinen erkennbaren Unterschied zwischen Kontrollinjektionen von PBS allein oder Kontrollen ohne Injektionen.
Beispiel 3
Der Zweck dieses Beispiels war, die Wirkung von NTP-Peptid Nr. 14 auf Gewebe an Injektionsorten zu bestimmen.
Ratten erhielten Injektionen in die Haut und subkutan wie in Beispiel 1 oben mit der Ausnahme, dass ihnen NTP-Peptid Nr. 14 injiziert wurde.
Die Tiere wurden 24 h beobachtet und nach 24 h schmerzlos getötet. Gewebe wurden herausgeschnitten, in 10% Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet und durch histopathologische Standardmethoden gefärbt und untersucht.
Die Kontrollen waren die gleichen wie in Beispiel 1.
Ergebnisse: Eine Injektion von NTP-Peptid Nr. 14 erzeugte Zelltod und Nekrose von Gewebe an den Injektionsorten. Ähnlich zu Beispiel 1 oben war der Zelltod in Muskelgewebe, subkutanem Bindegewebe und Dermis an den Orten, wo NTP-Peptid Nr. 14 injiziert worden war, vorhanden.
Abgesehen von den Bereichen mit milder Entzündung zeigten die Kontrollen minimale Hinweise auf Nekrose oder Zellverlust. Kontrollinjektionen erzeugten milde bis minimale akute Entzündungen an den Injektionsorten und gelegentliche fokale Mikrohämorrhagien von den Nadeln.
Beispiel 4
Der Zweck dieses Beispiels war, die Wirkung von NTP-Peptid Nr. 17 auf Gewebe an Injektionsorten zu bestimmen.
Normale Ratten erhielten Injektionen in die Prostata wie in dem obigen Beispiel 2 mit der Ausnahme, dass ihnen NTP-Peptid Nr. 17 injiziert wurde. Ratten wurden nach 72 h schmerzlos getötet und ihre Prostatadrüsen wurden wie in Beispiel 2 untersucht.
Ergebnisse: Wie in dem obigen Beispiel 2 erzeugte eine Injektion von NTP-Peptid Nr. 17 in der Prostata nach 72 h signifikanten Zellverlust und Atrophie. Kontrollen zeigten minimale oder fehlende Veränderungen, welche aus einer milden fokalen Entzündung aufgrund der Nadeln bestanden.
Sequenzprotokoll

Claims

NTP-Peptid bestehend aus einer Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: SEQ ID NR. 10 (Pro-Gly-Phe-Phe-Iys-Leu-Phe-Ser-Cys-Pro-Ser-Leu-Leu-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg); SEQ ID NR. 19 (Leu-Pro-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg); SEQ ID NR. 22 (Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg-Phe-Ile-Leu-Phe-Phe-Leu); SEQ ID NR. 23 (Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg-Phe-Ile-Phe-Asn-Phe-Leu); SEQ ID NR. 24 (Phe-Asn-Phe-Cys-Leu-Phe); SEQ ID NR. 25 (Phe-Ile-Phe-Asn-Phe-Leu); SEQ ID NR. 26 (Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Pro-Val-Ala-Gly-Ile-Thr-Gly-Met); SEQ ID NR. 27 (Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Gln-Val-Ala-Gly-Thr-Lys-Asp-Met) und SEQ ID NR. 28 (Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Gln-Ser-Ala-Gly-Ile-Thr-Gly-Val).
NTP-Peptid nach Anspruch 1 zur Anwendung als ein Arzneimittel.
Zusammensetzung, die ein NTP-Peptid nach Anspruch 1 und ein Träger dafür umfasst.
Anwendung eines NTP-Peptids nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Zustands, der die Entfernung oder Zerstörung von Zellen erfordert, welche Zellen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus einem gutartigen oder bösartigen Tumor in einem Gewebe; einer Hyperplasia, Hypertrophia oder übermäßigem Wachstum eines Gewebes; einem viral, bakteriell oder parasitartig veränderten Gewebe; einer Missbildung eines Gewebes; Hypertrophie in den Mandeln; prostatischer Hyperplasia; Psorasis; Ekzem; Dermatose; einer kosmetischen Modifizierung eines Gewebes; einer Gefäßkrankheit; Hämorrhoiden; Krampfadern; Atherosklerose; Entzündungskrankheit; autoimmuner Krankheit; Stoffwechselkrankheit; vererblicher/genetischer Krankheit; traumatischer Krankheit oder Körperschaden; ernährungsbedingter Mangelkrankheit; Infektionkrankheit; Amyloidablagerung; Fibrosekrankheit; Stoffwechselerkrankung; kongenitaler Missbildung; Enzymdefektkrankheit; Vergiftung; Berauschung; umweltbedingter Krankheit; Strahlungskrankheit; endokriner Krankheit und degenerativer Krankheit.