ES2281528T3 - Peptidos eficaces en el tratamiento de tumores y otros estados que requieren la eliminacion o destruccion de celulas. - Google Patents

Peptidos eficaces en el tratamiento de tumores y otros estados que requieren la eliminacion o destruccion de celulas. Download PDF

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Abstract

Un péptido de NTP constituido por una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por: SEQ ID NO. 10 (Pro-Gly-Phe-Phe-Lys-Leu-Phe-Ser-Cys-Pro-Ser-Leu-Leu-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg); SEQ ID NO. 19 (Leu-Pro-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg); SEQ ID NO. 22 (Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg-Phe-Ile-Leu-Phe-Phe-Leu); SEQ ID NO. 23 (Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg-Phe-Ile-Phe-Asn-Phe-Leu); SEQ ID NO. 24 (Phe-Asn-Phe-Cys-Leu-Phe): SEQ ID NO. 25 (Phe-Ile-Phe-Asn-Phe-Leu); SEQ ID NO. 26 (Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Pro-Val-Ala-Gly-Ile-Thr-Gly-Met); SEQ ID NO. 27 (Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Gln-Val-Ala-Gly-Thr-Lys-ASp-Met) y SEQ ID NO. 28 (Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Gln-Ser-Ala-Gly-Ile-Thr-Gly-Val).

Description

Péptidos eficaces en el tratamiento de tumores y otros estados que requieren la eliminación o destrucción de células.
Campo de la invención
La presente invención se refiere al uso de péptidos constituidos por SEQ ID NOS: 10, 19 y 22-28 para procedimientos para tratar estados que requieren la eliminación o destrucción de elementos celulares, tales como tumores benignos o malignos en seres humanos.
Antecedentes de la invención
La esencia de muchos procedimientos y tratamientos médicos implica la eliminación o destrucción de tejido dañino o no deseado. Ejemplos de tales tratamientos importantes incluyen la eliminación quirúrgica de crecimientos cancerosos, la destrucción de tumores metastásicos a través de quimioterapia, y la reducción de hiperplasia glandular (por ejemplo próstata). Otros ejemplos incluyen la eliminación de vello facial no deseado, verrugas, tejido subcutáneo, tejido linfático o tejido graso.
Existe una necesidad de un agente eficaz que destruirá y por tanto facilitará la eliminación de o inhibición de crecimiento adicional de células y tejido dañino o no deseados, pero que tendrá principalmente efectos locales y toxicidad sistémica mínima o ausente. Proteínas de cadena neural y sus moléculas relacionadas son una clase de tales agentes tal como se describe en el documento US 2003/054990, titulado: Methods of Treating Tumors and Related Conditions Using Neural Thread proteins, presentado el 8 de marzo de 2002, péptidos que contienen secuencias de aminoácidos que corresponden a parte de la secuencia de aminoácidos de una proteína de cadena neural, AD7c-NTP son también tales agentes. Estos péptidos se describen en el documento US 2003/0096 350, titulado: Peptides Effective in the Treatment of Tumors and Other Conditions Requiring the Removal or Destruction of Cells, presentado el 24 de mayo de 2002.
Descritos en el presente documento están otros ciertos fragmentos de proteínas de cadena neural que también son útiles para tratar tumores y otros estados que requieren la eliminación o destrucción de células.
El cáncer es una anomalía en los mecanismos reguladores internos de una célula que da como resultado un crecimiento incontrolado y la reproducción de la célula. Las células normales componen tejidos, y cuando estas células pierden su capacidad para comportarse como una unidad controlada, coordinada y especificada (desdiferenciación), el defecto de deriva en una desorganización entre la población celular. Cuando esto ocurre, se forma un tumor.
Los crecimientos excesivos benignos de tejidos son anomalías en las que es deseable eliminar las células de un organismo. Los tumores benignos son proliferaciones celulares que no experimentan metástasis por todo el cuerpo pero podrían, sin embargo, provocar síntomas de enfermedad. Tales tumores pueden ser letales si están localizados en áreas inaccesibles en órganos tales como el cerebro. Existen tumores benignos de órganos incluyendo pulmón, cerebro, piel, pituitaria, tiroide, cortex adrenal y médula, ovario, útero, testículos, tejido conjuntivo, músculo, intestinos, oído, nariz, garganta, amígdalas, boca, hígado, vesícula biliar, páncreas, próstata, corazón, y otros órganos.
La cirugía a menudo es la primera etapa en el tratamiento del cáncer. El objetivo de la cirugía varía. A veces se usa para eliminar tanta parte del tumor evidente como sea posible, o al menos para reducir su volumen (eliminar la(s)
mayor(es) parte(s) del tumor de manera que exista menor necesidad de tratarlo por otros medios). Dependiendo del tipo de cáncer y de la ubicación, la cirugía también puede proporcionar cierto alivio sintomático al paciente. Por ejemplo, si un cirujano puede eliminar una gran parte de un tumor cerebral en expansión, la presión dentro del cráneo disminuirá, llevando a una mejora de los síntomas del paciente.
No todos los tumores pueden someterse a cirugía. Algunos pueden estar ubicados en partes del cuerpo que los hace totalmente imposibles de eliminar. Ejemplos de éstos serían tumores en el tronco encefálico (una parte del cerebro que controla la respiración) o un tumor que ha crecido dentro y alrededor de un vaso sanguíneo principal. En estos casos, el papel de la cirugía está limitado debido al alto riesgo asociado con la eliminación del tumor.
En algunos casos, la cirugía no se usa para reducir el volumen de un tumor porque no es necesario. Un ejemplo es el linfoma de Hodgkin, un cáncer de los nódulos linfáticos que responde muy bien a las combinaciones de quimioterapia y radioterapia. En el linfoma de Hodgkin, pocas veces se necesita cirugía para lograr la curación, pero casi siempre se usa para establecer un diagnóstico.
La quimioterapia es una forma común de tratamiento contra el cáncer que implica el uso de medicamentos (normalmente administrados por vía oral o inyección) que específicamente ataca a las células que se dividen rápidamente (tales como las encontradas en un tumor) por todo el cuerpo. Esto convierte la quimioterapia en útil para el tratamiento de cánceres que ya han experimentado metástasis, así como tumores que tienen una alta probabilidad de extenderse a través de la sangre y los sistemas linfáticos pero no son evidentes más allá del tumor primario. También puede usarse la quimioterapia para aumentar la respuesta de tumores localizados para cirugía y radioterapia. Este es el caso, por ejemplo, de algunos cánceres de cabeza y cuello.
Desafortunadamente, otras células en el cuerpo humano que también normalmente se dividen rápidamente (tal como el revestimiento interno del estómago y del pelo) también se ven afectadas por la quimioterapia. Por esa razón, muchos agentes de quimioterapia inducen efectos secundarios indeseados tales como náuseas, vómitos, anemia, pérdida de cabello u otros síntomas. Estos efectos secundarios son temporales, y existen medicamentos que pueden ayudar a aliviar muchos de estos efectos secundarios. Dado que nuestro conocimiento continúa creciendo, los investigadores han logrado agentes quimioterapéuticos más nuevos que no sólo son mejores matando células cancerosas, sino que también tienen menos efectos secundarios para el paciente.
La quimioterapia se administra a los pacientes en una variedad de maneras. Algunas son píldoras y algunas se administran mediante inyección intravenosa u otra. Para la quimioterapia inyectable, un paciente va a la consulta del doctor u hospital para el tratamiento. Otros agentes quimioterapéuticos requieren infusión continua en el torrente circulatorio, 24 horas al día. Para estos tipos de quimioterapia puede realizarse un procedimiento quirúrgico menor para implantar una bomba pequeña que lleva el paciente. Entonces, la bomba administra lentamente el medicamento. En muchos casos, se coloca un orificio permanente en la vena de un paciente para eliminar el requerimiento de pinchazos de aguja repetidos.
La radioterapia es otra herramienta comúnmente usada en la lucha contra el cáncer. La radiación mata el cáncer dañando el ADN dentro de las células tumorales. La radiación se administra de diferentes maneras. La más común implica dirigir un haz de radiación hacia el paciente de una manera altamente precisa, enfocando el tumor. Para hacer esto, el paciente se tumba en una camilla y el haz se mueve alrededor de él/ella. El procedimiento dura minutos, pero puede realizarse diariamente durante varias semanas (dependiendo del tipo de tumor), para lograr una dosis prescrita total particular.
Otro procedimiento de radiación empleado algunas veces, llamado braquiterapia, implica tomar grageas radiactivas (semillas) o hilos e implantarlos en el cuerpo en el área del tumor. Los implantes pueden ser temporales o permanentes. Para implantes permanentes, la radiación en las semillas decae durante un periodo de días o semanas de manera que el paciente no sea radiactivo. Para implantes temporales, la dosis entera de radiación normalmente se administra en unos pocos días, y el paciente debe permanecer en el hospital durante ese tiempo. Para ambos tipos de braquiterapia, la radiación normalmente se envía a un área muy concreta para ganar control local sobre un cáncer (al contrario que al tratar todo el cuerpo, tal como hace la quimioterapia).
Algunos pacientes muy seleccionados pueden derivarse para transplantes de médula ósea. Este procedimiento normalmente se realiza o bien porque un paciente tiene un cáncer que es particularmente agresivo o bien porque tienen un cáncer que ha recidivado tras tratarse con terapia convencional. El transplante de médula ósea es un procedimiento complicado. Existen muchos tipos, y pueden variar en su potencial para provocar efectos secundarios y curación. La mayoría de los transplantes se realizan en centros especiales, y en muchos casos su uso se considera como investigación.
Existen varias terapias distintas, aunque la mayoría de ellas todavía se están explorando en ensayos clínicos y aún no se han convertido en cuidados convencionales. Ejemplos incluyen inmunoterapia, anticuerpos monoclonales, factores de antiangiogénesis, y terapia génica.
Inmunoterapia: existen varias técnicas diseñadas para ayudar al propio sistema inmunitario del paciente para luchar contra el cáncer, bastante alejado de la radioterapia o quimioterapia. A menudo, para lograr el objetivo los investigadores inyectan al paciente una vacuna obtenida de manera especial.
Anticuerpos monoclonales: éstos son anticuerpos diseñados para unirse a células cancerosas (y células no normales) aprovechándose de las diferencias entre células cancerosas y no cancerosas en sus características antigénicas y/u otras. Los anticuerpos pueden administrarse al paciente por separado o conjugados con varios compuestos citotóxicos o en su forma radiactiva, tal que el anticuerpo seleccione como diana preferentemente las células cancerosas, administrando así el agente tóxico o radiactividad a las células deseadas.
Factores antiangiogénesis: debido a que las células cancerosas se dividen rápidamente y los tumores crecen, se le puede quedar pequeño su suministro de sangre. Para compensar esto, algunos tumores segregan una sustancia que se cree que ayuda a inducir el crecimiento de los vasos sanguíneos en sus proximidades, dotando así a las células cancerosas con una fuente vascular de nutrientes. Se han diseñado terapias experimentales para detener el crecimiento de vasos sanguíneos para tumores.
Terapia génica: el cáncer es el producto de una serie de mutaciones que en último lugar dan lugar a la producción de una célula cancerosa y su proliferación excesiva. Los cánceres pueden tratarse mediante la introducción de genes en las células cancerosa que actuarán o bien para comprobar o bien para parar la proliferación del cáncer, activando los mecanismos celulares programados de la célula para destruir la célula, aumentando el reconocimiento inmunitario de la célula o expresando un profármaco que se convierte en un metabolito tóxico o citocina que inhibe el crecimiento del tumor.
Los tumores benignos y las malformaciones también pueden tratarse mediante una variedad de procedimientos que incluyen cirugía, radioterapia, terapia con fármacos, ablación térmica o eléctrica, crioterapia, y otros. Aunque los tumores benignos no experimenten metástasis, pueden hacerse grandes y pueden volver a aparecer. La extirpación quirúrgica de tumores benignos tiene todas las dificultades y efectos secundarios de la cirugía en general y a menudo debe repetirse para algunos tumores benignos, tal como para adenomas de la pituitaria, meningeomas del cerebro, hiperplasia prostática, y otros.
Aún existen otros estados que implican elementos celulares no deseados, en los que es deseable la eliminación celular. Por ejemplo, las enfermedades cardíacas y los accidentes cerebrovasculares están comúnmente causados por aterosclerosis, que es una lesión proliferativa de elementos fibrograsos y de músculo liso modificado que deforman la pared de los vasos sanguíneos, estrechan la luz, dificultan el flujo sanguíneo, predisponen los coágulos sanguíneos focales y en última instancia dan lugar a un bloqueo e infarto. Varios tratamientos para la aterosclerosis incluyen injertos de derivación; injertos artificiales; angioplastia con recanalización, legrado, radiación u otras eliminaciones; farmacoterapia para inhibir la aterosclerosis a través de reducción lipídica; terapias de anticoagulación; y medidas generales de dieta, ejercicio y estilo de vida. Se necesita un procedimiento para eliminar lesiones ateroscleróticas sin el riesgo y los efectos secundarios de los procedimientos quirúrgicos.
Otros ejemplos de elementos celulares no deseados en los que es deseable la eliminación celular selectiva incluyen crecimientos inducidos virales, tales como verrugas. Otro ejemplo son las masas inflamatorias hipertróficas encontradas en estados inflamatorios, y queloides o cicatrices hipertróficas. Aún otros ejemplos se encuentran en contextos cosméticos tales como la eliminación de vello no deseado, por ejemplo, vello facial, o para la reducción de áreas tisulares no deseadas con fines cosméticos, tal como en la dermis facial y tejidos conjuntivos o en la dermis y el tejido conjuntivo de las extremidades.
Aún otros ejemplos resultarán evidentes para los expertos en la técnica leyendo la descripción del presente documento. En todos o la mayoría de estos ejemplos, existe la necesidad de tratamientos que puedan eliminar o destruir los elementos celulares no deseados sin los riesgos y efectos secundarios de terapias convencionales, o para eliminar los elementos celulares no deseados con mayor precisión.
Las proteínas de cadena neural (NTP, neural thread proteins) son una familia de proteínas del cerebro caracterizadas recientemente. Un miembro de esta familia, AD7c-NTP, es una fosfoproteína asociada a membrana de \sim41 kD con funciones asociadas con la extensión neurítica (de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100:3093-3104 (1997); de la Monte et al., Alz.. Rep., 2:327-332 (1999); de la Monte SM y Wands JR, Journal of Alzheimer's Disease, 3:345-353 (2001)). Se han identificado y descrito el gen que codifica para AD7c-NTP y la secuencia de proteína predicha para AD7c-NTP (de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100:3093-3104 (1997)). Además de las especies de \sim41 kD, se han identificado otras especies de proteína de cadena neural (\sim26 kD, \sim21 kD, \sim17 kD, y \sim15 kD) y se han asociado con tumores neuroectodérmicos, astrocitomas, y glioblastomas y con lesión debida a hipoxia, isquemia, o infarto cerebral (Xu et al., Cancer Research, 53:3823-3829 (1993); de la Monte et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55(10):1038-50 (1996), de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 138 (1-2):26-35 (1996); de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 135(2):118-25 (1996); de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100:3093-3104 (1997); y de la Monte et al., Alz. Rep., 2:327-332 (1999)).
Se han descrito y reivindicado especies de proteína de cadena neural en las patentes de los EE.UU. números 5.948.634; 5.948.888; y 5.830.670, todas para "Neural Thread Proteína Gene Expression and Detection of Alzheimer's Disease" y en la patente de los EE.UU número 6.071.705 para "Method of Detecting Neurological Disease or Dysfunction". Tal como se describe en el presente documento, NTP se regula por incremento y se produce durante la muerte celular. Por tanto, las células nerviosas muertas o muriendo se describen como sobreproduciendo NTP, y consecuentemente, su presencia indica la muerte de células nerviosas y la aparición de la enfermedad de Alzheimer (EA).
Se han identificado otras especies de proteína de cadena neural como otros productos del gen de AD7c-NTP (por ejemplo, una proteína de 112 aminoácidos descrita en la base de datos NCBI Entrez-Protein número de acceso XP_032307 PID g15928971) o como que es similar a proteínas de cadena neural (por ejemplo una proteína de 106 aminoácidos descritas en la base de datos NCBI Entrez-Protein número de acceso AAH14951 PID g15928971, otra proteína de 106 aminoácidos descrita en la base de datos NCBI Entrez-Protein número de acceso XP_039102 PID g18599339 y una proteína de 61 aminoácidos descrita en la base de datos NCBI Entrez-Protein número de acceso AAH02534 PID g12803421).
La proteína de cadena neural está asociada con EA y la NTP se regula pro incremento en asociación con la muerte celular en EA. El ARNm de AD7c-NTP se regula por incremento en un cerebro con EA comparado con controles; los niveles de proteína AD7c-NTP en el cerebro y en el LCR son superiores en EA que en los controles; y se encuentra inmunorreactividad a AD7c-NTP en placas seniles, en ovillos neurofibrilares (ONF), en neuronas que se degeneran, en hebras de neuropilo, y brotes neuróticos distróficos en cerebros con EA y síndrome de Down (Ozturk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 419-423 (1989); de la Monte et al., J. Clin. Invest., 86(3):1004-13 (1990); de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 113(2):152-64 (1992); de la Monte et al., Ann. Neurol., 32(6):733-42 (1992); de la Monte et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55(10):1038-50 (1996), de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 138(1-2):26-35 (1996); de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 135 (2): 118-25 (1996); de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100:3093-3104 (1997); y de la Monte et al., Alz.. Rep., 2:327-332 (1999)). La NTP se localiza dentro de las células, en procesos finos dentro del neuropilo, o es extracelular tanto en cerebros con EA como con síndrome de Down. de la Monte et al., Ann. Neurol., 32(6):733-42 (1992).
\newpage
Se han encontrado niveles elevados de proteína AD7c-NTP tanto en el LCR como en la orina de pacientes con EA (de la Monte y Wands, Front Biosci 7: 989-96 (2002); de la Monte y Wands, Journal of Alzheimer's Disease 3: 345-353 (2001); Munzar et al, Alzheimer's Reports 4: 61-65 (2001); Kahle et al, Neurology 54: 1498-1504 (2000); Munzar et al, Alzheimer Reports 3: 155-159 (2000); de la Monte et al, Alzheimer's Reports 2: 327-332 (1999); y de la Monte et al, J Clin Invest 100: 3093-3104 (1997).
También se ha relacionado la sobreexpresión de NTP con el proceso de muerte celular en la enfermedad de Alzheimer (de la Monte y Wands, J. Neuropathol. Exp. Neurol., 60:195-207 (2001); de la Monte y Wands, Cell Mol Life Sci 58: 844-49 (2001). También se ha identificado AD7c-NTP en tejido cerebral con síndrome de Down (Wands et al., número de publicación de patente internacional WO 90/06993; de la Monte et al, J Neurol Sci 135: 118-25 (1996); de la Monte et al., Alz. Rep., 2:327-332 (1999)). Existe cierta evidencia de que la sobreexpresión de NTP también puede estar asociada con glaucoma de tensión normal (Golubnitschaja-Labudova et al, Curr Eye Res 21: 867-76
(2000)).
La NTP ha demostrado ser un agente eficaz para provocar la muerte celular tanto en cultivos celulares de glioma y neuroblastoma in vitro como en tejido muscular, tejido conjuntivo subcutáneo, y dermis de roedor in vivo, y en una variedad de tumores diferentes de origen humano y no humano, incluyendo carcinoma mamario, carcinoma de piel, y papiloma, carcinoma de colon, glioma cerebral, y otros en modelos de roedores. Véase el documento US 2003/0054990 Methods of Treating Tumors and Related Conditions Using Neural Thread Proteins, presentado el 8 de marzo de 2002.
Ciertas secuencias peptídicas de AD7c-NTP ("péptidos de AD7c-NTP") también han demostrados ser agentes eficaces para provocar la muerte celular tanto en cultivos celulares de glioma como de neuroblastomas in vitro y/o tejido muscular normal, tejido conjuntivo subcutáneo, dermis y otros tejidos in vivo de roedor. Véase el documento US 2003/0096350, titulado: Peptides Effective in the Treatment of Tumors and Other Conditions Requiring the Removal o Destruction of Cells, presentado el 24 de mayo de 2002.
El documento WO 00/58295 describe un polipéptido de 47-meros que comprende la secuencia GAISAHRNLRL y su uso potencial para el tratamiento de una amplia gama de enfermedades.
El documento WO 02/097030 se refiere a péptidos derivados de NTP y a su uso para tratar enfermedades que requieren la eliminación o destrucción de células, tal como cáncer.
Sigue existiendo una necesidad en la técnica para tratamientos nuevos, menos tóxicos para tratar elementos celulares no deseados. La presente invención satisface estas necesidades.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a péptidos de NTP, a composiciones, y a su uso para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un estado que requiere la eliminación o destrucción de células seleccionadas del grupo constituido por un tumor benigno o maligno de un tejido; una hiperplasia, hipertrofia, o crecimiento excesivo de un tejido; un tejido alterado viral, bacteria o parasitariamente; una malformación de un tejido; hipertrofia de las amígdalas; hiperplasia prostática; psorasis; eccema; dermatosis; una modificación cosmética de un tejido; una enfermedad vascular; hemorroides, venas varicosas, aterosclerosis; enfermedad inflamatoria; enfermedad autoinmunitaria; enfermedad metabólica; enfermedad hereditaria/genética; enfermedad traumática o lesión física; enfermedad de deficiencia nutricional; enfermedad infecciosa; enfermedad amiloide; enfermedad de fibrosis; tesaurismosis; malformación congénita; enfermedad de deficiencia enzimática; envenenamiento; intoxicación; enfermedad ambiental, enfermedad por radiación; enfermedad endocrina; y enfermedad degenerativa. El péptido de NTP de expresión se define a
continuación.
Los péptidos de la presente invención tienen al menos una secuencia de aminoácidos que corresponde a parte de la secuencia de aminoácidos de una especie de proteína de cadena neural. Las composiciones de la invención incluyen los péptidos y un vehículo farmacéuticamente aceptable, o los péptidos conjugados con un vehículo, o similares, o los péptidos encapsulados en una matriz polimérica, etc.
La presente invención implica en parte el descubrimiento de que las secuencias peptídicas contenidas en AD7c-NTP que los inventores han descubierto que son agentes eficaces para la destrucción o eliminación de células dañinas o no deseadas, y variantes y homólogos de las mismas, también se encuentran en otras proteínas en otros organismos, incluyendo seres humanos y otros mamíferos. Una vez se han descubierto las secuencias peptídicas, un experto en la técnica puede encontrar estas proteínas a través del uso de bases de datos de proteínas comerciales y públicas ampliamente disponibles tales como la base de datos National Center Biotechnology Information's Protein y programas de búsqueda tales como BLAST® (Basic Local Alignment Search Tool). Véase Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schäffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, y David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-
3402.
Una persona con experiencia en la técnica puede entonces seleccionar estas proteínas usando el procedimiento de ensayo descrito en el presente documento para determinar su eficacia como agentes para la destrucción o eliminación de células no deseadas o dañinas. Una persona experta en la técnica, habiendo encontrado uno o más de tales agentes eficaces, puede entonces determinar que partes de esos agentes contienen secuencias homólogas con o similares a las secuencias peptídicas de AD7c-NTP descritas en el presente documento, o descritas en el documento US 2003/0096350, titulado: Peptides Effective in the Treatment of Tumors and Other Conditions Requiring the Elimination or destruction of Cells, presentado el 24 de mayo de 2002, tienen esas partes de esos agentes sintetizados usando procedimientos conocidos por los expertos en la técnica, y someten a prueba los agentes sintetizados para determinar su eficacia como agentes para la destrucción o eliminación de células no deseadas o dañinas. Además, una persona experta en la técnica también podría usar las secuencias de aminoácidos de tales proteínas encontradas para determinar otras secuencias peptídicas no similares a u homólogas con homólogos con o similares a las secuencias peptídicas de AD7c-NTP descritas en el presente documento, y descritas en el documento US 2003/0096360 titulado: Peptides Effective in the Treatment of Tumors and Other Conditions Requiring the Elimination or destruction of Cells, presentado el 24 de mayo de 2002. Pueden someterse a prueba estas nuevas secuencias sintetizadas para determinar su eficacia como agentes para la destrucción o eliminación de células no deseadas o
dañinas.
Los péptidos o proteínas inventivos ("péptido de muerte celular") pueden administrarse solos o conjugados con un vehículo. El péptido de muerte celular puede administrarse por vía intramuscular, vía oral, vía intravenosa, vía intraperitoneal, vía intracerebral (vía intraparenquimal), vía intracerebroventricular, vía intratumoral, vía intralesional, vía intradérmica, vía intratecal, vía intranasal, vía intraocular, vía intraarterial, vía tópica, vía transdérmica, por medio de un aerosol, infusión, inyección en bolo, dispositivo de implantación, sistema de liberación sostenida, etc., o bien solos o bien conjugados con un vehículo.
Además, el péptido de muerte celular puede usarse junto con otras terapias para tratar tumores benignos y malignos y otros crecimientos celulares no deseados o dañinos.
Breve descripción de las figuras
La figura 1: muestra la secuencia de aminoácidos completa y la secuencia de ácido nucleico del gen AD7c-NTP y del producto proteico AD7c-NTP de ese gen (secuencias 120 y 121 de las patentes de los EE.UU. números 5.830.670, 5.948.634, y 5.948.888; de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100: 3093-3104 (1997); NCBI Entrez-Proteína número de acceso AAC08737; PID g3002527) [SEQ ID NO. 1].
La figura 2: muestra las secuencias de aminoácidos completas de la proteína de cadena neural de 122 aminoácidos (secuencia 40 de las patentes de los EE.UU. números 5.830.670, 5.948.634, y 5.948.888; NCBI Entrez-Protein número de acceso AAE25447 PID g10048540) [SEQ ID NO. 2].
La figura 3: muestra las secuencias de aminoácidos completas de la proteína de cadena neural de 112 aminoácidos (NCBI Entrez- Protein número de acceso XP_032307 PID g15928971) [SEQ ID NO. 3].
La figura 4: muestra las secuencias de aminoácidos completas de una proteína tipo proteína de cadena neural de 106 aminoácidos (NCBI Entrez-Protein número de acceso AAH14951 PID g15928971) [SEQ ID NO. 4].
La figura 5: muestra las secuencias de aminoácidos completas de una proteína tipo proteína de cadena neural de 106 aminoácidos (NCBI Entrez-Protein número de acceso XP_039102 PID g18599339) [SEQ ID NO. 5].
La figura 6: muestra las secuencias de aminoácidos completas de la proteína de cadena neural de 98 aminoácidos (secuencia 30 de las patentes de los EE.UU. números 5.830.670, 5.948.634, y 5.948.888; NCBI Entrez-Protein número de acceso AAE25445, PID g10048538) [SEQ ID NO. 6].
La figura 7: muestra las secuencias de aminoácidos completas de la proteína de cadena neural de 75 aminoácidos (secuencia 48 de las patentes de los EE.UU. números 5.830.670, 5.948.634, y 5.948.888; NCBI Entrez-Protein número de acceso AAE25448, PID g10048541) [SEQ ID NO. 7].
La figura 8: muestra las secuencias de aminoácidos completas de la proteína de cadena neural de 68 aminoácidos (secuencia 36 de las patentes de los EE.UU. números 5.830.670, 5.948.634, y 5.948.888; NCBI Entrez-Protein número de acceso AAE25446, PID g10048539) [SEQ ID NO. 8].
La figura 9: muestra las secuencias de aminoácidos completas de la proteína tipo proteína de cadena neural de 61 aminoácidos (NCBI Entrez-Protein número de acceso AAH02534, PID g12803421) [SEQ ID NO. 9].
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
Los términos y frases usadas en el presente documento se definen tal como se expone a continuación a no ser que se especifique lo contrario.
La expresión "AD7c-NTP" se refiere a la proteína de \sim41 kD y al gen y a las secuencias de ácido nucleico que codifican para ella descritas en de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100:3093-104 (1997), en las secuencias 120 y 121 de las patentes de los EE.UU. números 5.948.634, 5.948.888, y 5.830.670 y en GenBank número AF010144, cuyas secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos se ilustran en la figura 1. El término "AD7c-NTP" también incluye fragmentos biológicamente activos, variantes, derivados, homólogos y miméticos de AD7c-NTP.
El término "NTP" o "proteína de cadena neural" se refiere a proteínas de cadena neural y moléculas relacionadas (incluyendo proteína de cadena pancreática) y las secuencias de ácido nucleico que codifican para esas proteínas, e incluye (pero no se limita a) las siguientes proteínas y las secuencias de ácido nucleico que codifican para los aminoácidos para estas proteínas:
(a) AD7c-NTP;
(b) las especies de proteína de cadena neural de \sim42, \sim26, \sim21, \sim17, \sim14, y \sim8 kD tal como se describen en las patentes de los EE.UU. números 5.948.634, 5.948.888, 5.830.670, y 6.071.705 y en de la Monte et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55(10): 1038-50 (1996), de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 138(1-2):26-35 (1996); de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 135 (2):118-25 (1996), de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100:3093-3104 (1997) y de la Monte et al., Alz.. Rep., 2: 327-332 (1999);
(c) proteínas reconocidas específicamente por anticuerpo monoclonal nº 2 en depósito con la American Type Culture Collection (Colección Americana de Cultivos Tipo), Manassas, Va., con el número de acceso HB-12546 o anticuerpo monoclonal nº 5 en depósito con la American Type Culture Collection, Manassas, Va., con el número de acceso HB-12545;
(d) proteínas codificadas por el gen de AD7c-NTP;
(e) la proteína de cadena neural de 122 aminoácidos descrita en la secuencia 40 de las patentes de los EE.UU. números 5.830.670, 5.948.634, y 5.948.888 y enumeradas en NCBI Entrez-Protein número de acceso AAE25447, PID g10048540, cuyas secuencias de aminoácidos se ilustran en la figura 2;
(f) la proteína de cadena neural de 112 aminoácidos enumerada en NCBI Entrez-Protein número de acceso XP_032307, PID g14725132, cuyas secuencias de aminoácidos se ilustran en la figura 3;
(g) una proteína tipo proteína de cadena neural de 106 aminoácidos enumerada en NCBI Entrez-Protein número de acceso AAH14951 PID g15928971, cuyas secuencias de aminoácidos se ilustran en la figura 4;
(h) una proteína tipo proteína de cadena neural de 106 aminoácidos enumerada en NCBI Entrez-Protein número de acceso XP_039102, PID g18599339, cuyas secuencias de aminoácidos se ilustran en la figura 5;
(i) la proteína de cadena neural de 98 aminoácidos descrita en la secuencia 30 de las patentes de los EE.UU. números 5.830.670, 5.948.634, y 5.948.888 y enumeradas en NCBI Entrez-Protein número de acceso AAE25445, PID g10048538, cuyas secuencias de aminoácidos se ilustran en la figura 6;
(j) la proteína de cadena neural de 75 aminoácidos descrita en la secuencia 48 de las patentes de los EE.UU. números 5.830.670, 5.948.634, y 5.948.888 y enumeradas en NCBI Entrez-Protein número de acceso AAE25448, PID g10048541, cuyas secuencias de aminoácidos se ilustran en la figura 7;
(k) la proteína de cadena neural de 68 aminoácidos descrita en la secuencia 36 de las patentes de los EE.UU. números 5.830.670, 5.948.634, y 5.948.888 y enumeradas en NCBI Entrez-Protein número de registro AAE25446, PID g10048539, cuyas secuencias de aminoácidos se ilustran en la figura 8;
(l) la proteína tipo proteína de cadena neural de 61 aminoácidos enumerada en NCBI Entrez-Protein número de registro AAH02534, PID g12803421, cuyas secuencias de aminoácidos se ilustran en la figura 9;
(m) proteína de cadena pancreática;
(n) la proteína de cadena pancreática neural (nPTP) descrita en la patente de los EE.UU. número 6.071.705; y
(o) proteínas reconocidas específicamente por los anticuerpos producidos mediante un hibridoma del grupo constituido por HB 9934, HB 9935, y HB 9936 depositados en la American Type Culture Collection.
\vskip1.000000\baselineskip
La expresión "péptido NTP" se refiere a la siguiente secuencia de aminoácidos de NTP:
a) péptido de NTP nº 1 [SEQ ID NO. 10], similar a p227-245 de AD7c-NTP con la inserción de un residuo de fenilalanina adicional tras p228.
\quad
PGFFKLFSCPSLLSSWDYRR
\quad
Pro-Gly-Phe-Phe-Lys-Leu-Phe-Ser-Cys-Pro-Ser-Leu-Leu-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg
\newpage
b) péptido de NTP nº 10 [SEQ ID NO. 19], p239-245 de AD7c-NTP con la adición de residuos de leucina y prolina en el extremo N-terminal.
\quad
LPSSWDYRR
\quad
Leu-Pro-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg
\vskip1.000000\baselineskip
c) péptido de NTP nº 13 [SEQ ID NO. 22], p239-245 de AD7c-NTP + p139-144 de AD7c-NTP
\quad
SSWDYRRFILFFL
\quad
Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg-Phe-Ile-Leu-Phe-Phe-Leu
\vskip1.000000\baselineskip
d) péptido de NTP nº 14 [SEQ ID NO. 23], p241-245 de AD7c-NTP + p197-202 de AD7c-NTP
\quad
WDYRRFIFNFL
\quad
Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg-Phe-Ile-Phe-Asn-Phe-Leu
\vskip1.000000\baselineskip
e) péptido de NTP nº 15 [SEQ ID NO. 24], p297-302 de AD7c-NTP
\quad
FNFCLF
\quad
Phe-Asn-Phe-Cys-Leu-Phe
\vskip1.000000\baselineskip
f) péptido de NTP nº 16 [SEQ ID NO. 25], p197-202 de AD7c-NTP
\quad
FIFNFL
\quad
Phe-Ile-Phe-Asn-Phe-Leu
\vskip1.000000\baselineskip
g) péptido de NTP nº 17 [SEQ ID NO. 26], p31-43 de AD7c-NTP
\quad
PASASPVAGITGM
\quad
Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Pro-Val-Ala-Gly-Ile-Thr-Gly-Met
\vskip1.000000\baselineskip
h) péptido de NTP nº 18 [SEQ ID NO. 27], p175-187 de AD7c-NTP
\quad
PASASQVAGTKDM
\quad
Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Gln-Val-Ala-Gly-Thr-Lys-Asp-Met
\vskip1.000000\baselineskip
i) péptido de NTP nº 19 [SEQ ID NO. 28], p277-289 de AD7c-NTP
\quad
PASASQSAGITGV
\quad
Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Gln-Ser-Ala-Gly-Ile-Thr-Gly-Val
\newpage
Los aminoácidos y residuos de aminoácidos descritos en el presente documento pueden denominarse según el código aceptado de una o tres letras proporcionado en la tabla a continuación.
TABLA 1
1
La presente invención se refiere a una composición que comprende péptidos de NTP tal como se definió anteriormente en esta invención.
Pueden prepararse péptidos de NTP de esta invención usando procedimientos conocidos por los expertos en la técnica, tales como tecnología de ADN recombinante, síntesis de proteínas y aislamiento de péptidos de NTP que se producen de manera natural.
Puede prepararse un péptido de NTP usando procedimientos bien conocidos de tecnología de ADN recombinante tal como los expuestos en Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. [1989]) y/o Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers Inc. y Wiley and Sons, N.Y. [1994].
Puede obtenerse un gen o un ADNc que codifica para un péptido de NTP por ejemplo seleccionando una biblioteca genómica o de ADNc o mediante amplificación por PCR. Pueden generarse sondas o cebadores útiles para la selección de la biblioteca basándose en la información de secuencia para otros genes o fragmentos génicos conocidos de la misma familia génica o de una relacionada, tales como, por ejemplo, motivos conservados encontrados en otros péptidos de NTP o proteínas NTP. Además, cuando se identifica a partir de una especie un gen que codifica para un péptido de NTP o proteína NTP, puede usarse toda o una parte del gen como sonda para identificar genes homólogos de otras especies. Pueden usarse las sondas o cebadores para seleccionar bibliotecas de ADNc de varias fuentes de tejido que se cree que expresan un péptido de NTP o gen de proteína NTP. Normalmente, se emplearán condiciones muy rigurosas para la selección para minimizar el número de falsos positivos obtenidos a partir de la selección.
Otros medios para preparar un gen que codifica para un péptido de NTP es emplear síntesis química usando procedimientos bien conocidos por el experto en la técnica, tales como los descritos por Engels et al.(Angew. Chem. Intl. Ed., 28:716-734 [1989]). Estos procedimientos incluyen, entre otros, los procedimientos fosfodiéster, fosforamidita y H-fosfanato para la síntesis de ácido nucleico. Un procedimiento preferido para tal síntesis química es la síntesis apoyada en polímero usando la química de la fosforamidita convencional. Normalmente, el ADN que codifica péptido para un péptido de NTP será de varios cientos de nucleótidos de longitud. Los ácidos nucleicos más largos de aproximadamente 100 nucleótidos pueden sintetizarse como varios fragmentos usando estos procedimientos. Pueden entonces ligarse entre sí los fragmentos para formar un péptido de NTP de longitud completa. Habitualmente, el fragmento de ADN que codifica para el extremo aminoterminal de la proteína tendrá un ATG, que codifica para un residuo de metionina. Esta metionina puede o no estar presente en la forma madura del péptido de NTP, dependiendo de si la proteína producida en la célula huésped está diseñada para secretarse de esa célula.
Puede insertarse el gen, ADNc, o fragmento del mismo que codifica para el péptido de NTP en un vector de expresión o amplificación apropiado usando técnicas convencionales de ligamiento. Normalmente el vector se selecciona para que sea funcional en la célula huésped particular (es decir, el vector es compatible con la maquinaria de la célula huésped de manera que puede producirse la amplificación del gen y/o la expresión del gen). Puede amplificarse/expresarse el gen, ADNc o fragmento del mismo que codifica para el péptido de NTP en células huésped procariotas, de levadura, de insecto (sistemas de baculovirus) y/o eucariotas. La selección de la célula huésped dependerá en parte de si el péptido de NTP va a ser glucosilado y/o fosforilado. Si es así se prefieren células huésped de mamífero, de insecto o levadura.
Normalmente, los vectores usados en cualquiera de las células huésped contendrá una secuencia flanqueante en 5' (también denominada como promotora) y otros elementos reguladores, tales como potenciador(es), un elemento de origen de replicación, un elemento de terminación transcripcional, una secuencia de intrón completa que contiene un sitio de corte y empalme de donante y aceptor, una secuencia de péptido señal, un elemento de sitio de unión a ribosoma, una secuencia de poliadenilación, una región poliligadora para insertar el ácido nucleico que codifica para el polipéptido que va a expresarse, y un elemento marcador seleccionable. Cada uno de estos elementos se trata a continuación. Opcionalmente, el vector puede contener una secuencia de etiqueta, es decir, una molécula de oligonucleótido ubicada en el extremo 5' ó 3' de la secuencia codificante del péptido de NTP; la molécula de oligonucleótido codifica para poliHis (tal como hexaHis), u otra etiqueta tales como FLAG, HA (virus de influenza hemaglutinina) o myc para los que existen anticuerpos disponibles comercialmente. Esta etiqueta normalmente se fusiona al polipéptido ante la expresión del polipéptido y puede servir como un medio para la purificación por afinidad del péptido de NTP a partir de la célula huésped. La purificación por afinidad puede lograrse, por ejemplo, mediante cromatografía en columna usando anticuerpos contra la etiqueta como una matriz de afinidad. Opcionalmente, la etiqueta puede eliminarse posteriormente del péptido de NTP purificado mediante varios medios tales como usando ciertas peptidasas.
La región Fc y la visagra de inmunoglobulina humana podrían fusionarse en cualquiera de los extremos N-terminal o C-terminal del péptido de NTP por un experto en la técnica. Podría purificarse la posterior proteína de fusión Fc usando una columna de afinidad por proteína A. Se sabe que Fc muestra una semivida farmacocinética larga in vivo y se ha encontrado que las proteínas fusionadas a Fc muestran una semivida in vivo sustancialmente superior que el homólogo no fusionado. Además, la fusión a la región Fc permite la dimerización/multimerización de la molécula que puede ser útil para la bioactividad de algunas moléculas.
La secuencia flanqueante en 5' puede ser homóloga (es decir, de la misma especie y/o cepa que la célula huésped), heteróloga (es decir, de una especie distinta a la especie de la célula huésped o cepa), híbrida (es decir, una combinación de secuencias flanqueantes en 5' de más de una fuente), sintética, o puede ser la secuencia flanqueante en 5' del gen del péptido de NTP nativo. Como tal, la fuente de la secuencia flanqueante en 5' puede ser cualquier organismo procariota unicelular o eucariota, cualquier organismo vertebrado o invertebrado o cualquier planta, siempre que la secuencia flanqueante en 5' sea funcional en, y pueda activarse por, la maquinaria de la célula huésped.
Pueden obtenerse las secuencias flanqueantes en 5' útiles en los vectores mediante cualquiera de diversos procedimientos bien conocidos en la técnica. Normalmente, las secuencias flanqueantes en 5' útiles en el presente documento distintas de la secuencia flanqueante del gen del péptido de NTP se habrán identificado previamente mediante mapeo y/o mediante digestión de endonucleasa de restricción y así poder aislarse a partir de la fuente de tejido adecuadas usando las endonucleasas de restricción apropiadas. En algunos casos, puede conocerse la secuencia de nucleótidos completa de la secuencia flanqueante en 5'. En este caso, la secuencia flanqueante en 5' puede sintetizarse usando los procedimientos descritos anteriormente para síntesis o clonación de ácido nucleico.
Cuando se conoce toda o sólo una parte de la secuencia flanqueante en 5', puede obtenerse usando PCR y/o mediante selección de una biblioteca genómica con oligonucleótidos adecuados y/o fragmentos de secuencia flanqueante en 5' a partir de la misma u otra especie.
Cuando no se conoce la secuencia flanqueante en 5', puede aislarse un fragmento de ADN que contiene una secuencia flanqueante en 5' a partir de una pieza de ADN mayor que puede contener, por ejemplo, una secuencia codificante o incluso otro gen o genes. Puede lograrse el aislamiento mediante digestión de endonucleasa de restricción usando una o más enzimas seleccionadas cuidadosamente para aislar el fragmento de ADN adecuado. Tras la digestión, puede aislarse el fragmento deseado mediante purificación en gel de agarosa, columna Qiagen® u otros procedimientos conocidos por el experto en la técnica. La selección de enzimas adecuadas para lograr este propósito resultará evidente para el experto en la técnica.
El elemento de origen de replicación normalmente es una parte de vectores de expresión procariotas adquiridos comercialmente, y ayuda en la amplificación del vector en una célula huésped. La amplificación del vector hasta cierto número de copias puede, en algunos casos, ser importante para la expresión óptima del péptido de NTP. Si el vector de elección no contiene un origen de sitio de replicación, puede sintetizarse uno químicamente basándose en una secuencia conocida y ligarse en el vector. El elemento de terminación de transcripción normalmente está ubicado en 3' del extremo de la secuencia codificante del péptido de NTP y sirve para terminar la transcripción del péptido de NTP. Habitualmente, el elemento de terminación de transcripción en células procariotas es un fragmento rico en G-C seguido por una secuencia poli T. Aunque el elemento puede clonarse a partir de una biblioteca o adquirirse comercialmente como parte de un vector, también puede sintetizarse fácilmente usando procedimientos para la síntesis de ácido nucleico tales como las descritas anteriormente.
Un elemento génico de marcador seleccionable que codifica para una proteína necesaria para la supervivencia de una célula huésped crecida en un medio de cultivo selectivo. Los genes marcadores de selección típicos codifican para proteínas que (a) confieren resistencia frente a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, tetraciclina, o kanamicina para células huésped procariotas, (b) complementan las deficiencias auxotróficas de la célula; o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles a partir de los medios complejos. Marcadores seleccionables preferidos son el gen resistente a kanamicina, gen resistente a ampicilina y el gen resistente a tetraciclina.
El elemento de unión a ribosoma, comúnmente denominado secuencia Shine-Dalgarno (procariotas) o la secuencia Kozak (eucariotas), normalmente es necesario para el inicio de la traducción de ARNm. El elemento normalmente se ubica en 3' hacia el promotor y en 5' hacia la secuencia codificante del péptido de NTP que va a sintetizarse. Se varía la secuencia Shine-Dalgarno pero normalmente es una polipurina (es decir, que tiene una alto contenido en A-G). Se han identificado muchas secuencias Shine-Dalgamo, cada una de las cuales puede sintetizarse fácilmente mediante un experto en la técnica usando procedimientos expuestos anteriormente y usados en un vector procariota.
En los casos en los que es deseable segregar el péptido de NTP de la célula huésped, puede usarse una secuencia señal para dirigir el péptido de NTP fuera de la célula huésped en la que se sintetiza, y puede delecionarse la parte carboxiterminal de la proteína con el fin de evitar el anclaje de la membrana. Normalmente, la secuencia señal se posiciona en la región codificante del gen del péptido de NTP o ADNc, o directamente en el extremo 5' de la región codificante del gen de péptido de NTP. Se han identificado muchas secuencias señal, y cualquiera de ellas que sea funcional en la célula huésped seleccionada puede usarse junto con el gen de péptido de NTP o ADNc. Por tanto, la secuencia señal puede ser homóloga o heteróloga al gen de péptido de NTP o ADNc, y puede ser homóloga o heteróloga al gen de péptido de NTP o ADNc. Adicionalmente, la secuencia señal puede sintetizarse químicamente usando procedimientos expuestos anteriormente. En la mayoría de los casos, la secreción del polipéptido de la célula huésped por medio de la presencia de un péptido señal dará como resultado la eliminación de la metionina aminoterminal del polipéptido.
En muchos casos, la transcripción del gen de péptido de NTP o ADNc aumenta por la presencia de uno o más intrones en el vector; esto es particularmente cierto cuando el péptido de NTP se produce en células huésped eucariotas, especialmente en células huésped de mamíferos. Los intrones usados pueden producirse de manera natural dentro del gen de péptido de NTP, especialmente cuando el gen usado es una secuencia genómica de longitud completa o un fragmento de la misma. Cuando el intrón no se produce de manera natural dentro del gen (como para la mayoría de los ADNc), puede(n) obtenerse el/los intrón/intrones a partir de otra fuente. La posición del intrón con respecto a la secuencia flanqueante y el gen de péptido de NTP generalmente es importante, dado que el intrón tiene que transcribirse para que sea eficaz. Por tanto, cuando el gen de péptido de NTP insertado en el vector de expresión es una molécula de ADNc, la posición preferida para el intrón es 3' para el sitio de inicio de la transcripción, y 5' para la secuencia de terminación de transcripción poliA. Preferiblemente para el ADNc del péptido de NTP, el intrón o intrones estarán ubicados en un lado o el otro (es decir 5' ó 3') del ADNc de manera que no interrumpa esta secuencia codificante. Puede usarse para poner en práctica esta invención cualquier intrón de cualquier fuente, incluyendo cualquier organismo viral, procariota, eucariota, (planta o animal), siempre que sea compatible con la(s) célula(s) huésped(es) en la(s) que se inserta. También se incluyen en el presente documento intrones sintéticos. Opcionalmente puede usarse más de un intrón en el vector.
Cuando uno o más de los elementos expuestos anteriormente no están ya presentes en el vector que va a usarse, pueden obtenerse individualmente y ligarse con el vector. Los procedimientos usados para obtener cada uno de los elementos son bien conocidos por el experto en la técnica y son comparables con los procedimientos expuestos anteriormente (es decir, síntesis del ADN, selección de biblioteca y similares).
Los vectores finales usados para poner en práctica esta invención normalmente están construidos a partir de vectores de partida tales como un vector disponible comercialmente. Tales vectores pueden o no contener algunos de los elementos que deben incluirse en el vector completado. Si ninguno de los elementos deseados está presente en el vector de partida, cada elemento puede ligarse individualmente en el vector cortando el vector con la(s) endonucleasa(s) de restricción apropiada(s) de manera que los extremos del elemento que va a ligarse y los extremos del vector son compatibles para el ligamiento. En algunos casos, puede ser necesario convertir en romos los extremos que van a ligarse entre sí con el fin de obtener un ligamiento satisfactorio. La conversión en romos se logra llenando en primer lugar en los "extremos pegajosos" usando Klenow de ADN polimerasa o T4 de ADN polimerasa en presencia de los cuatro nucleótidos. Este procedimiento es bien conocido en la técnica y se describe por ejemplo en Sambrook et al., anteriormente. Alternativamente, dos o más de los elementos que van a insertarse en el vector pueden ligarse entre sí en primer lugar (si han de posicionarse adyacentes el uno al otro) y luego ligarse en el vector.
Un procedimiento adicional para construir el vector es realizar todos los ligamientos de los distintos elementos simultáneamente en una mezcla de reacción. En este caso, se generarán muchos vectores sin sentido o no funcionales, debido al ligamiento o inserción de los elementos inadecuados. Sin embargo, puede identificarse y seleccionarse el vector funcional mediante digestión de endonucleasa de restricción.
Vectores preferidos para poner en práctica esta invención son los que son compatibles con células huésped bacterianas, de insectos y de mamíferos. Tales vectores incluyen, entre otros, pCRII, pCR3, y pcDNA3.1 (Invitrogen Company, San Diego, Calif.), pBSII (Stratagene Company, La Jolla, Calif.), pET15b (Novagen, Madison, Wis.), PGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J.), pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, Calif.), pETL (BlueBacII; Invitrogen), y pFastBacDual (Gibco/BRL, Grand Island, N.Y.).
Una vez se ha construido el vector y se ha insertado una molécula de ácido nucleico que codifica para el péptido de NTP en el sitio adecuado del vector, puede insertarse el vector completado en una célula huésped adecuada para la amplificación y/o expresión del polipéptido. Las células huésped pueden ser células huésped procariotas (tales como E. coli) o células huésped eucariotas (tales como una célula de levadura, una célula de insecto, o una célula de vertebrado). La célula huésped, cuando se cultiva en condiciones apropiadas, puede sintetizar el péptido de NTP que puede recogerse posteriormente del medio de cultivo (si la célula huésped lo secreta al medio) o directamente a partir de la célula huésped que lo produce (si no se secreta).
Tras la recogida, puede purificarse el péptido de NTP usando procedimientos tales como cromatografía de tamiz molecular, cromatografía de afinidad, y similares. La selección de la célula huésped para la producción del péptido de NTP dependerá en parte de si el péptido de NTP va a glucosilarse o fosforilarse (en cuyo caso se prefieren células huésped eucariotas), y la forma en que la célula huésped puede plegar la proteína en su estructura terciaria nativa (por ejemplo, orientación apropiada de puentes disulfuro, etc.) de manera que la proteína biológicamente activa se prepara por el péptido de NTP que tiene actividad biológica. Puede plegarse el péptido de NTP tras la síntesis usando condiciones químicas apropiadas tal como se trató anteriormente. Células o líneas celulares adecuadas, útiles en la invención incluyen células de mamífero tales como células de ovario de hámster chino (CHO, chinese hamster ovary), de riñón embrionario humano (HEK, human embryonic kidney) 293 o 293T, o células 3T3. La selección de células huésped de mamíferos adecuadas y procedimientos para la transformación, cultivo, amplificación, selección y producción de producto y purificación pueden lograrse por los expertos en la técnica usando las pautas proporcionadas en el presente documento. Otras líneas celulares de mamíferos adecuadas, incluyen las líneas celulares COS-1 y COS-7 de mono, y la línea celular CV-1. Ejemplos adicionales de células huésped de mamífero incluyen líneas celulares de primates y roedores, incluyendo líneas celulares transformadas. También son adecuadas las células diploides normales, cepas de célula derivadas de un cultivo in vitro de tejido primario, así como explantes primarios. Las células candidatas pueden ser deficientes genotípicamente en el gen de selección, o pueden contener un gen de selección que actúa de manera dominante. Otras líneas celulares de mamíferos adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células N2A de neuroblastoma de ratón, HeLa, células L-929 de ratón, líneas 3T3 derivadas de ratones NIH, Balb-c o Swiss o líneas celulares BHK o HaK de hámster.
Útiles de manera similar que las células huésped adecuadas para la presente invención son las células bacterianas. Por ejemplo, las distintas cepas de E. coli (por ejemplo, HB101, DH5.alfa., DH10, y MC1061) son bien conocidas como células huésped en el campo de la biotecnología. Varias cepas de B. subtilis, Pseudomonas spp., otras Bacillus spp., Streptomyces spp., y similares también pueden emplearse en este procedimiento. Muchas cepas de células de levadura conocidas por los expertos en la técnica también están disponibles como células huésped para la expresión de los polipéptidos de la presente invención.
Adicionalmente, cuando se desee, pueden utilizarse sistemas de células de insecto en los procedimientos de la presente invención. Tales sistemas se describen por ejemplo en Kitts et al. (Biotechniques, 14:810-817 [1993]), Lucklow (Curr. Opin. Biotechnol., 4:564-572 [1993]) y Lucklow et al. (J. Virol., 67:4566-4579 [1993]). Células de insectos preferidas son Sf-9 y Hi5 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.).
La inserción (también denominada como transformación o transfección) del vector en la célula huésped seleccionada puede realizarse usando procedimientos tales como cloruro de calcio, electroporación, microinyección, lipofección o el procedimiento DEAE-dextrano. El procedimiento seleccionado será en parte una función del tipo de célula huésped que va a usarse. Estos procedimientos y otros procedimientos adecuados son bien conocidos por el experto en la técnica, y se exponen, por ejemplo, in Sambrook et al., anteriormente.
Pueden cultivarse las células huésped que contienen el vector (es decir, transformado o transfectado) usando medios convencionales bien conocidos por el experto en la técnica. Los medios habitualmente contendrán todos los nutrientes necesarios para el crecimiento y la supervivencia de las células. Medios adecuados para cultivar células E. coli, son por ejemplo, Caldo Luria (LB, Luria Broth) y/o Caldo Terrific (TB, Terrific Broth). Medios adecuados para cultivar células eucariotas son RPMI 1640, MEM, DMEM, todos los cuales pueden complementarse con suero y/o factores de crecimiento tal como requiera la línea celular particular que se está cultivando. Un medio adecuado para cultivos de insectos es el medio de Grace complementado con yeastolate, hidrolizado de lactoalbúmina, y/o suero de ternero fetal según se necesite. Normalmente, un antibiótico u otro compuesto útil para el crecimiento selectivo de las células transformadas se añade sólo como complemento a los medios. El compuesto que va a usarse estará dictado por el elemento marcador seleccionable presente en el plásmido con el que se transformó la célula huésped. Por ejemplo, cuando el elemento marcador seleccionable es resistente a kanamicina, el compuesto añadido al medio de cultivo será kanamicina.
Puede evaluarse la cantidad de péptido de NTP producido en la célula huésped usando procedimientos convencionales conocidos en la técnica. Tales procedimientos incluyen, sin limitación, ensayos de inmunotransferencia tipo Western, electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS, electroforesis en gel no desnaturalizante, separación por HPLC, espectroscopia de masas, inmunoprecipitación, y/o ensayos de actividad tales como ensayos de desplazamiento en gel de unión a ADN.
Si se ha diseñado el péptido de NTP para que se secrete a partir de las células huésped, pueden encontrarse la mayoría de los péptidos de NTP en el medio de cultivo celular. Las proteínas preparadas de esta manera no tienen normalmente una metionina aminoterminal, ya que se ha eliminado durante la secreción de la célula. Sin embargo, si no se secreta el péptido de NTP de las células huésped, estará presente en el citoplasma y/o el núcleo (para células huésped eucariotas) o en el citosol, (para células huésped bacterianas gram negativas), y puede tener una metionina aminoterminal.
Para el péptido de NTP situado en el citoplasma y/o núcleo de la célula huésped, normalmente las células huésped se interrumpen mecánicamente o con detergente para liberar los contenidos intracelulares en una disolución tamponada. Entonces puede aislarse el péptido de NTP a partir de esta disolución.
La purificación del péptido de NTP a partir de una disolución puede lograrse usando una variedad de técnicas. Si la proteína se ha sintetizado de manera que contiene una etiqueta tal como hexaHistidina (por ejemplo péptido de NTP/hexaHis) u otro péptido pequeño tal como FLAG (Sigma-Aldritch, St. Louis, MI) o péptido de unión a calmodulina (Stratagene, La Jolla, CA) en cualquiera de sus extremos carboxi o aminoterminal, puede esencialmente purificarse en un proceso de una etapa haciendo pasar la disolución a través de una columna de afinidad en la que la matriz de la columna tiene una alta afinidad por la etiqueta o por la proteína directamente (es decir, un anticuerpo monoclonal que reconoce específicamente el péptido de NTP). Por ejemplo, la polihistidina se une con gran afinidad y especificidad a níquel, zinc y cobalto; por tanto puede usarse cromatografía de afinidad por ión metálico que emplea una resina de afinidad basada en níquel (tal como se usa en el sistema QIAexpress de Qiagen o sistema Xpress de Invitrogen) o una resina de afinidad basada en cobalto (tal como se usa en el sistema Talon de BD Biosciences de CLONTECH) para la purificación del péptido de NTP/poliHis. (Véase por ejemplo, Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Section 10,11,8, John Wiley & Sons, Nueva York [1993]).
Cuando se prepara el péptido de NTP sin una etiqueta unida, y no hay anticuerpos disponibles, pueden usarse otros procedimientos para purificación bien conocidos. Tales procedimientos incluyen, sin limitación, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de hidroxiapatita, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de tamiz molecular, HPLC, electroforesis en gel nativa en combinación con elución de gel y centrado isoeléctrico preparativo (máquina/técnica Isoprime, Hoefer Scientific). En algunos casos, pueden combinarse dos o más de estas técnicas para lograr pureza aumentada.
Si se prevé que el péptido de NTP se encontrará fundamentalmente dentro de la célula, puede extraerse el material intracelular (incluyendo los cuerpos de inclusión para bacterias gram negativas) de la célula huésped usando cualquier técnica convencional conocida por el experto en la técnica. Por ejemplo, pueden lisarse las células huésped para liberar los contenidos del periplasma/citoplasma mediante prensa francesa, homogeneización, y/o sonicación seguida de centrifugación. Si el péptido de NTP ha formado cuerpos de inclusión en el citosol, a menudo los cuerpos de inclusión pueden unirse con frecuencia a las membranas celulares internas y/o externas y por tanto se encontrarán principalmente en el material sedimentado tras la centrifugación. El material sedimentado puede entonces tratarse a pH extremos o con agentes caotrópicos tales como detergente, guanidina, derivados de guanidina, urea, o derivados de urea en presencia de un agente reductor tal como ditiotreitol a pH alcalino o tris carboxietilfosfina a pH ácido para liberar, romper y solubilizar los cuerpos de inclusión. El péptido de NTP en esta forma ahora soluble puede entonces analizarse usando electroforesis en gel, inmunoprecipitación o similares. Si se desea aislar el péptido de NTP, puede lograrse el aislamiento usando procedimientos convencionales tales como los expuestos a continuación y en Marston et al. (Meth. Enz., 182:264-275 [1990]).
En algunos casos, el péptido de NTP puede no ser biológicamente activo ante el aislamiento. Varios procedimientos para replegar o convertir el polipéptido en su estructura terciaria y generar uniones disulfuro, pueden usares para reestablecer la actividad biológica. Tales procedimientos incluyen exponer el polipéptido solubilizado a un pH habitualmente superior a 7 y en presencia de una concentración particular de un caótropo. La selección de caótropo es muy similar a las elecciones usadas para la solubilización del cuerpo de inclusión pero habitualmente a una concentración inferior y no es necesariamente el mismo caótropo que el usado para la solubilización. En la mayoría de los casos la disolución de replegamiento/oxidación también contendrá un agente reductor o el agente reductor junto con su forma oxidada en una razón específica para generar una potencial redox particular que permite que el intercambio de disulfuro se produzca en la formación de puente(s) de cisteína de la proteína. Algunos de los pares redox comúnmente usados incluyen cisteína/cistamina, glutatión (GSH)/ditiobis GSH, cloruro de cobre (II), ditiotreitol (DTT)/ditiano DTT, 2-mercaptoetanol (bME)/ditio-b(ME). En muchos casos un codisolvente puede ser necesario para aumentar la eficacia del replegamiento y los reactivos más comúnmente usados con este propósito incluyen glicerol, polietilenglicol de varios pesos moleculares, y arginina.
Si no se forman cuerpos de inclusión de péptido de NTP en un grado significativo en la célula huésped, el péptido de NTP puede encontrarse principalmente en el sobrenadante tras la centrifugación del homogeneizado celular, y puede aislarse el péptido de NTP a partir del sobrenadante usando procedimientos tales como los expuestos a continuación.
En las situaciones en las que es preferible aislar parcial o completamente el péptido de NTP, puede lograrse la purificación usando procedimientos convencionales bien conocidos por el experto en la técnica. Tales métodos incluyen, sin limitación, separación por electroforesis seguida de electroelución, varios tipos de cromatografía (inmunoafinidad, tamiz molecular, y/o intercambio iónico), y/o cromatografía líquida a alta presión. En algunos casos, puede ser preferible usar más de uno de estos procedimientos para la purificación completa.
Además de preparar y purificar proteínas NTP o péptidos de NTP usando técnicas de ADN recombinante, los péptidos de NTP pueden prepararse mediante procedimientos de síntesis química (tal como síntesis de péptidos en fase sólida) usando técnicas conocidas en la técnica tales como las expuestas por Merrifield et al., (J. Am. Chem. Soc., 85:2149 [1963]), Houghten et al. (Proc Natl Acad. Sci. USA, 82:5132 [1985]), y Stewart y Young (Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, Ill. [1984]). Tales polipéptidos pueden sintetizarse con o sin una metionina en el extremo aminoterminal. Las proteínas NTP o péptidos de NTP sintetizados químicamente pueden oxidarse usando procedimientos expuestos en estas referencias para formar puentes disulfuro. Se espera que las proteínas NTP o péptidos de NTP tengan actividad biológica comparable con las proteínas NTP o péptidos de NTP producidos de manera recombinante o purificados a partir de fuentes naturales, y por tanto pueden intercambiarse con proteína NTP o péptido de NTP recombinante o natural.
Existen varias organizaciones en la actualidad que pueden sintetizar las proteínas relacionadas, péptidos relacionados, y péptidos de NTP descritos en el presente documento. Por ejemplo, dada la secuencia de un péptido de NTP, la organización puede sintetizar el péptido y enviar el péptido sintetizado con documentación adjunta y prueba de la identidad del péptido.
La presente invención se refiere al uso de péptidos de NTP para tratar estados que requieren la eliminación de células, tales como tumores benignos y malignos, hiperplasia glandular (por ejemplo, próstata), vello facial indeseado, verrugas y tejido graso indeseado. Un procedimiento de este tipo comprende la administración a un mamífero que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de péptido de NTP.
El estado puede ser, por ejemplo, tumores de pulmón, pecho, estómago, páncreas, próstata, vejiga, hueso, ovario, piel, riñón, seno, colon, intestino, estómago, recto, esófago, sangre, cerebro y sus recubrimientos, médula espinal y sus recubrimientos, músculo, tejido conjuntivo, adrenal, paratiroide, tiroide, útero, testículos, pituitaria, órganos reproductores, hígado, vesícula biliar, ojo, oído, nariz, garganta, amígdalas, boca, nódulos linfáticos y sistema linfático (por ejemplo, tejido linfático), y otros órganos.
Tal como se usa en el presente documento, el término "tumor maligno" pretende englobar todas las formas de carcinomas, sarcomas y melanomas humanos que se producen en las formas mal diferenciadas, moderadamente diferenciadas y bien diferenciadas.
Esta invención satisface una necesidad en la técnica para tratamientos que pueden eliminar tumores benignos con menor riesgo y menos de los efectos secundarios de la cirugía. La eliminación de tumores benignos en áreas peligrosas quirúrgicamente tales como en ubicaciones profundas en el cuerpo (por ejemplo, cerebro, corazón, pulmones, y otras) se necesita particularmente.
El uso de péptidos de NTP para tratar estados en los que deben eliminarse células puede usarse junto con procedimientos convencionales para tratar tales estados, tales como escisión quirúrgica, quimioterapia y radiación. El péptido de NTP puede administrarse antes, durante o después de tales tratamientos convencionales.
El estado que va a tratarse también puede ser una hiperplasia, hipertrofia, o crecimiento excesivo de un tejido seleccionado del grupo constituido por pulmón, pecho, estómago, páncreas, próstata, vejiga, hueso, ovario, piel, riñón, seno, colon, intestino, estómago, recto, esófago, sangre, cerebro y sus recubrimientos, médula espinal y sus recubrimientos, músculo, tejido conjuntivo, adrenal, paratiroide, tiroide, útero, testículos, pituitaria, órganos reproductores, hígado, vesícula biliar, ojo, oído, nariz, garganta, amígdalas, boca, y nódulos linfáticos y sistema linfático.
Otros estados que pueden tratarse usando el procedimiento de la invención incluyen, pero no se limitan a, tejido alterado vírica, bacteriana o parasitariamente seleccionado del grupo constituido por pulmón, pecho, estómago, páncreas, próstata, vejiga, hueso, ovario, piel, riñón, seno, colon, intestino, estómago, recto, esófago, sangre, cerebro y sus recubrimientos, médula espinal y sus recubrimientos, músculo, tejido conjuntivo, adrenal, paratiroide, tiroide, útero, testículos, pituitaria, órganos reproductores, hígado, vesícula biliar, ojo, oído, nariz, garganta, amígdalas, boca, y nódulos linfáticos y sistema linfático.
El estado que va a tratarse también puede ser una malformación o un trastorno de un tejido seleccionado del grupo constituido por pulmón, pecho, estómago, páncreas, próstata, vejiga, hueso, ovario, piel, riñón, seno, colon, intestino, estómago, recto, esófago, sangre, cerebro y sus recubrimientos, médula espinal y sus recubrimientos, músculo, tejido conjuntivo, adrenal, paratiroide, tiroide, útero, testículos, pituitaria, órganos reproductores, hígado, vesícula biliar, ojo, oído, nariz, garganta, amígdalas, boca, y nódulos linfáticos y sistema linfático.
En particular, el estado que va a tratarse puede ser hipertrofia de las amígdalas, hiperplasia prostática, psoriasis, eccema, dermatosis o hemorroides. El estado que va a tratarse puede ser una enfermedad vascular, tal como aterosclerosis o arteriosclerosis, o una enfermedad vascular, tal como venas varicosas. El estado que va a tratarse también puede ser una modificación cosmética de un tejido, tal como tejido de piel, ojo, oído, nariz, garganta, boca, músculo, tejido conjuntivo, pelo, o pecho.
Las composiciones terapéuticas de péptidos de NTP están dentro del alcance de la presente invención. Tales composiciones pueden comprender una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido de NTP en mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable. El material de vehículo puede ser agua para inyección, preferiblemente complementado con otros materiales comunes en disoluciones para administración a mamíferos. Normalmente, un péptido de NTP para uso terapéutico se administrará en forma de una composición que comprende péptido de NTP purificado junto con uno o más vehículos, excipientes o diluyentes fisiológicamente aceptables. Solución salina tamponada neutra o solución salina mezclada con albúmina en suero son vehículos apropiados a modo de ejemplo. Preferiblemente, se formula el producto como un liofilizado usando excipientes apropiados (por ejemplo, sacarosa). Pueden incluirse según se desee otros vehículos, diluyentes y excipientes convencionales. Composiciones que incluyen tampones conocidos para los expertos en la técnica con un intervalo apropiado de valores de pH, incluyendo tampón Tris que tiene un pH de aproximadamente 7,0-8,5, o tampón acetato que tiene un pH de aproximadamente 4,0-5,5, que adicionalmente puede incluir sorbitol o un sustituto adecuado del mismo.
Los péptidos de NTP pueden usarse solos, juntos, o en combinación con otras composiciones farmacéuticas, tales como citocinas, factores de crecimiento, antibióticos, agentes inductores de apoptotis, antiinflamatorios, y/o agentes quimioterapéuticos tal como es apropiado para la indicación que se está tratando.
Esta invención también abarca composiciones terapéuticas de péptidos de NTP que emplean dendrímeros, fulerenos y otras moléculas sintéticas, polímeros y macromoléculas en las que el péptido de NTP está incluido en la molécula, polímero o macromolécula, o bien por sí mismo o bien junto con otras especies de molécula tales como marcador específico de tumor. Por ejemplo, la patente de los EE.UU. número 5.714.166, Bioactive and/or Targeted Dendimer Conjugates, proporciona un procedimiento para prepara y usar, entre otros, conjugados de polímero dendrítico compuestos de al menos un dendrímero con un(os) director(es) de diana y al menos un agente bioactivo conjugado a él.
Esta invención también abarca composiciones terapéuticas de péptidos de NTP y vehículos de administración de fármaco tales como emulsiones lipídicas, polímeros micelares, microesferas poliméricas, polímeros electroactivos, hidrogeles y liposomas.
Formas de dosificación sólidas para administración oral incluyen, pero no se limitan a, cápsulas, comprimidos, píldoras, polvos y gránulos. En tales formas de dosificación sólidas, el principio activo preferiblemente está mezclado con al menos uno de los siguientes: (a) uno o más excipientes inertes (o vehículo), tal como citrato de sodio o fosfato de dicalcio; (b) productos de relleno o extensores, tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y ácido silícico; (c) aglutinantes, tales como carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y goma arábiga; (d) humectantes, tales como glicerol; (e) agentes desintegrantes, tales como agar-agar, carbonato de calcio, almidón de patata o de tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos complejos, y carbonato de sodio; (f) retardadores de disolución, tales como parafina; (g) acelerantes de absorción, tales como compuestos de amonio cuaternario; (h) agentes de mojado, tales como alcohol acetílico y monoestearato de glicerol; (i) adsorbentes, tales como caolín y bentonita; y (j) lubricantes, tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, laurilsulfato de sodio, o mezclas de los mismos. Para cápsulas, comprimidos y píldoras, las formas de dosificación también pueden comprender agentes tamponantes.
Las formas de dosificación líquidas para administración oral incluyen emulsiones, disoluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Además de los principios activos, las formas de dosificación líquidas pueden incluir diluyentes inertes comúnmente usados en la técnica, tales como agua u otros disolventes, agentes solubilizantes, y emulsionantes. Ejemplos de emulsionantes son alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites, tales como aceite de semilla de algodón, aceite de cacahuete, aceite de germen de maíz, aceite de oliva, aceite de ricino, y aceite de sésamo, glicerol, alcohol tetrahidrofurfurílico, polietilenglicoles, ésteres de ácidos grasos de sorbitano, o mezclas de estas sustancias y similares.
Además de tales diluyentes inertes, la composición también puede incluir adyuvantes, tales como agentes de mojado, emulsionantes y agentes de suspensión, edulcorantes, condimentos o aromatizantes.
Pueden variarse los niveles de dosificación actuales de principios activos en las composiciones de la invención para obtener una cantidad de péptido de NTP que es eficaz para obtener una respuesta terapéutica deseada para una composición particular y un procedimiento de administración. Por tanto, el nivel de dosificación seleccionado depende del efecto terapéutico deseado, la ruta de administración, la duración deseada del tratamiento y otros factores.
Con mamíferos, incluyendo seres humanos, las cantidades eficaces pueden administrarse basándose en el área de superficie corporal. La interrelación de dosificaciones para animales de varios tamaños, especies y seres humanos (basándose en mg/m^{2} de superficie corporal) se describe por E. J. Freireich et al., Cancer Chemother. Rep., 50(4):219 (1966). Puede determinarse aproximadamente el área de superficie corporal a partir de la altura y peso de un individuo (véase por ejemplo, Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardsley, N.Y. págs. 537-538 (1970)).
La dosis diaria total del péptido de NTP administrada a un huésped puede ser en dosis únicas o divididas. Las composiciones de unidad de dosis pueden contener tales cantidades de tales submúltiplos de las mismas que puedan usarse para crear la dosis diaria. Sin embargo, se entenderá, que el nivel de dosis específica para cualquier paciente particular dependerá de una variedad de factores incluyendo el peso corporal, salud general, sexo, dieta, tiempo y ruta de administración, potencia del fármaco administrado, tasas de absorción y excreción, combinación con otros fármacos, y la gravedad de la enfermedad particular que se está tratando.
La composición del péptido de NTP según la invención puede administrarse por vía intramuscular, vía oral, vía intravenosa, vía intraperitoneal, vía intracerebral (vía intraparenquimal), vía intracerebroventricular, vía intratumoral, vía intralesional, vía intradérmica, vía intratecal, vía intranasal, vía intraocular, vía intraarterial, vía tópica, vía transdérmica, por medio de un aerosol, infusión, inyección en bolo, dispositivo de implantación, sistema de liberación sostenida, etc.
También puede administrarse el péptido de NTP de la invención mediante una ruta transdérmica o transcutánea. Un ejemplo de una realización de este tipo es el uso de un parche. En particular, puede prepararse un parche con una suspensión final de péptido de NTP en, por ejemplo, dimetilsulfóxido (DMSO), o una mezcla de DMSO con aceite de semilla de algodón y ponerse en contacto con la piel de los mamíferos que tienen tumor lejos del sitio de ubicación del tumor dentro de una bolsa de piel. Otros medios o mezclas de los mismos con otros disolventes y soportes sólidos funcionarán igual de bien. El parche puede contener el compuesto de péptido de NTP en forma de una disolución o una suspensión. El parche puede entonces aplicarse sobre la piel del paciente, por ejemplo, insertándolo en una bolsa de piel del paciente formada doblando y sujetando junta la piel mediante puntos, grapas u otros dispositivos de sujeción. Esta bolsa debería emplearse de tal manera que se asegure un contacto continuo con la piel sin la interferencia del mamífero. Además de usar la bolsa de piel, puede usarse cualquier dispositivo que asegure la colocación firme del parche en contacto con la piel. Por ejemplo, podría usarse una venda adhesiva para sujetar el parche en el lugar sobre la piel.
Puede administrarse el péptido de NTP en una formulación o preparación de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices poliméricas semipermeables en la forma de artículos con forma, por ejemplo, películas o microcápsulas. Matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles, polilactidas (documentos U.S. 3.773.919, EP 58.481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato (Sidman et al, Biopolymers, 22: 547-556 [1983]), poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 [1981] y Langer, Chem. Tech., 12:98-105 [1982]), acetato de etilenvinilo (Langer et al., anteriormente) o ácido poli-D(-)-3-hidroxibutírico (documento EP 133.988). Las composiciones de liberación sostenida también pueden incluir liposomas, que pueden preparase mediante cualquiera de los procedimientos conocidos en la técnica (por ejemplo, Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-3692 [1985]; documentos EP 36.676; EP 88.046; y EP 143.949).
Otra ruta de administración para un péptido de NTP de la invención es mediante infusión directa o indirecta del péptido de NTP en el tumor u otro tejido que va a tratarse. Un ejemplo de tal realización es la inyección directa de un péptido de NTP en el tumor u otro tejido que va a tratarse. El tratamiento puede estar constituido por una inyección única, inyecciones múltiples en una ocasión o una serie de inyecciones durante un periodo de horas, días o meses monitorizándose la regresión o destrucción del tumor u otro tejido que va a tratarse por medio de una biopsia, obtención de imágenes u otros procedimientos de monitorización de crecimiento tisular. La inyección en el tumor u otro tejido que va a tratarse puede ser mediante un dispositivo insertado en un orificio tal como la nariz, boca, oído, vagina, recto o uretra o a través de una incisión con el fin de alcanzar el tumor o tejido in vivo y puede ejecutarse junto con un sistema de obtención de imágenes u óptico tal como alcance de ultrasonidos o fibra óptica con el fin de identificar el sitio apropiado para la(s) inyección/inyecciones. Otro ejemplo de una realización de este tipo es el uso de un dispositivo que puede proporcionar una infusión constante de péptido de NTP al tejido a lo largo del
tiempo.
Otra ruta de administración para un péptido de NTP de la invención es junto con un procedimiento quirúrgico o similar empleado para escindir, extirpar o de otra manera matar o destruir el tumor u otro tejido o elementos celulares requeridos o deseados que van a eliminarse o destruirse en el que un péptido de NTP de la invención se administra al/a las área(s) intermedia(s) en las que el tumor u otro tejido se eliminó con el fin de destruir o impedir el crecimiento de cualquier célula tumoral u otros elementos celulares no eliminados o destruidos mediante el procedimiento.
Otra ruta de administración para un péptido de NTP según la invención es mediante la implantación de un dispositivo dentro del tumor o tejido que va a tratarse. Un ejemplo de tal realización es la implantación de una oblea que contiene péptido de NTP en el tumor u otro tejido que va a tratarse. La oblea libera una dosis terapéutica de péptido de NTP en el tejido a lo largo del tiempo. Alternativa o adicionalmente, puede administrarse la composición localmente por medio de la implantación en el área afectada de una membrana, esponja u otro material apropiado sobre el que se ha absorbido el péptido. Cuando se usa un dispositivo de implantación, el dispositivo puede implantarse en cualquier tejido u órgano adecuado y la administración del péptido de NTP puede ser directamente a través del dispositivo por medio de un bolo o por medio de administración continua, o a través de un catéter usando infusión
continua.
Ejemplo 1
(Sólo para comparación)
El propósito de este ejemplo era determinar el efecto del péptido de NTP nº 7 sobre tejidos en los sitios de inyección.
Se inyectaron cuatro ratas normales en la piel y por vía subcutánea, cada uno en cuatro focos diferentes, y en extremo el músculo esquelético, cada uno en dos focos diferentes, con péptido de NTP nº 7 en solución salina en cantidades de 100 a 400 ml a concentraciones de 0,1-1 mg/ml administrados a partir de jeringas de plástico a través de agujas de calibre 26 de acero inoxidable.
Se observaron los animales durante 24 horas y se sacrificaron sin dolor a las 24 horas. Se extirparon los focos individuales de infiltración, se fijaron en formalina al 10%, se incrustaron en parafina, y se tiñeron y se examinaron mediante procedimientos histopatológicos convencionales.
Los controles recibieron solución salina sola.
Resultados: la inyección de péptido de NTP nº 7 produjo necrosis de tejido en los sitios de inyección. La necrosis era evidente en el tejido muscular, tejido conjuntivo subcutáneo, y dermis en los sitios en los que se inyectó péptido de NTP nº 7. Se correlacionó la necrosis con las áreas de inyección y pareció no extenderse más allá del sitio de inyección.
Aparte de las áreas de inflamación ligera, los controles no mostraron evidencia de necrosis o pérdida celular. Los controles mostraron cambios musculares mínimos o ausentes. Las inyecciones de control tenían inflamación aguda de suave a mínima en los sitios de inyección y microhemorragias locales de las agujas.
Ejemplo 2
(Sólo para comparación)
El propósito de este ejemplo era determinar el efecto del péptido de NTP nº 7 sobre el tejido en los sitios de inyección.
Se anestesiaron cuatro ratas con éter y se les administró péptido de NTP nº 7 mediante infusión intraprostática. Las inyecciones estaban constituidas por 300 \mul de péptido de NTP nº 7 1 mg/ml en PBS pH 7,4. (1,0 mg/kg). Los controles recibieron inyecciones de PBS solo o no recibieron inyección. Se sacrificaron las ratas sin dolor tras 72 horas. Se diseccionaron las glándulas prostáticas, se fijaron en formalina tamponada al 10% durante 24 horas, se incrustaron en parafina, se seccionaron y se tiñeron con H y E. Para cada animal se incrustó y seccionó la glándula prostática entera. Se examinaron histológicamente todas las secciones teñidas.
Resultados: la próstata de rata tratada con péptido de NTP nº 7 mostraba necrosis del tejido en los sitios de inyección con pérdida de epitelio glandular, allanamiento y atrofia. No existía diferencia discernible entre los controles con inyección de PBS solo y controles sin inyección.
Ejemplo 3
El propósito de este ejemplo era determinar el efecto del péptido de NTP nº 14 sobre el tejido en los sitios de inyección.
Se inyectaron ratas en la piel y por vía subcutánea tal como en el ejemplo 1 anterior, excepto que se inyectaron con péptido de NTP nº 14.
Se observaron los animales durante 24 horas y se sacrificaron sin dolor a las 24 horas. Se extirparon los tejidos se fijaron en formalina al 10%, se incrustaron en parafina y se tiñeron y se examinaron mediante procedimientos histopatológicos convencionales.
Los controles fueron los mismos que en el ejemplo 1.
Resultados: la inyección de péptido de NTP nº 14 produjo muerte celular y necrosis del tejido en los sitios de inyección. De manera similar que en el ejemplo 1 anterior, la muerte celular estaba presente en tejido muscular, tejido conjuntivo subcutáneo y dermis en los sitios en los que se había inyectado péptido de NTP nº 14.
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Aparte de las áreas de inflamación ligera, los controles mostraron evidencia mínima de necrosis o pérdida celular. Las inyecciones de control tenían inflamación aguda de suave a mínima en los sitios de inyección y microhemorragias locales ocasionales de las agujas.
Ejemplo 4
El propósito de este ejemplo era determinar el efecto del péptido de NTP nº 17 sobre el tejido en los sitios de inyección.
Se inyectaron ratas normales en la próstata tal como en el ejemplo 2 anterior, excepto que se inyectaron con péptido de NTP nº 17. Se sacrificaron sin dolor las ratas tras 72 horas y se examinaron sus glándulas prostáticas tal como en el ejemplo 2.
Resultados: tal como en el ejemplo 2, la inyección de péptido de NTP nº 17 produjo pérdida celular significativa y atrofia en la próstata a las 72 horas. Los controles mostraron cambios mínimos o ausentes, constituidos por inflamación local suave de las agujas.
<110> NYMOX CORPORATION
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AVERBACK, PAUL 
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<120> PÉPTIDOS EFICACES EN EL TRATAMIENTO DE TUMORES Y OTROS ESTADOS QUE REQUIEREN LA ELIMINACIÓN O DESTRUCCIÓN DE CÉLULAS
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<130> 10107-45
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<141> 19-07-2002
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<150> documento US 60/306.150
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<151> 19-07-2001
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<150> US 60/331.477
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<151> 16-11-2001
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Pro Ser Ser Trp Asp Tyr Arg Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Ser Trp Asp Tyr Arg Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Ser Trp Asp Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Ser Trp Asp Tyr Arg Arg Phe Ile Leu Phe Phe Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Trp Asp Tyr Arg Arg Phe Ile Phe Asn Phe Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Asn Phe Cys Leu Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Ile Phe Asn Phe Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Ala Ser Ala Ser Pro Val Ala Gly Ile Thr Gly Met}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Ala Ser Ala Ser Gln Val Ala Gly Thr Lys Asp Met}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Ala Ser Ala Ser Gln Ser Ala Gly Ile Thr Gly Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial: Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cccgggccct tcaagctacc ctcctgcccc agcctcccga gtagctgga ctacaggcgc 
\hfill
60 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial: Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cctgagctca agcagtccac ctgcctcagc ctcccaaagc gctgggatta caggcgt 
\hfill
57 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial: Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cctcccgggc tcaagcgatt ctcctgtctc agcctcccaa gcagctggga ttacggg 
\hfill
57 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial: Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttctcctgtc tcagcctccc aagcagctgg gattacgggc ac 
\hfill
42 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial: Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,1cm
tcc4cctqcc tcagcctccc aaagtgctgg gattacaggc gt 
\hskip8,4cm
42 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial: Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttctcctgcc ccagcctcet gagtagctgg gactacaggc gc 
\hfill
42 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial: Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ettagcctcc caagcagctg ggattac 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial: Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctcagcctcc caaagtgctg ggattacagg cgt 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial: Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agcctcctga gtagctggga ctacaggcgc 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial: Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctcccagagt agctgggact acaggcgc 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia artificial: Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gagtagctgg gactacaggc gc 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia artificial: Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agcagctggg attac 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia artificial: Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gagtagctgg gactacacaggc gctttattt atttttttta 
\hfill
40 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia artificial: Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgggactaca ggcgctttat ttttaatttt ttg 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia artificial: Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tttaattttt gtttgttt 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia artificial: Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tttattttta attttttg 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia artificial: Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cctgcctcag cctccccagt agctgggatt acaggcatg 
\hfill
39 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia artificial: Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cctgcctcag cctcccaagt agctgggacc aaagacacg 
\hfill
39 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia artificial: Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cctgcctcgg cctcccaaag tgctgggatt acaggcgtg 
\hfill
39 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1442
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)..(1139)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
13
14 
\vskip1.000000\baselineskip

Claims (4)

1. Un péptido de NTP constituido por una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 SEQ ID NO. 10 \+
(Pro-Gly-Phe-Phe-Lys-Leu-Phe-Ser-Cys-Pro-Ser-Leu-Leu-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg);\cr
 SEQ ID NO. 19 \+
(Leu-Pro-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg);\cr
 SEQ ID NO. 22 \+
(Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg-Phe-Ile-Leu-Phe-Phe-Leu);\cr
 SEQ ID NO. 23 \+
(Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg-Phe-Ile-Phe-Asn-Phe-Leu);\cr
 SEQ ID NO. 24 \+
(Phe-Asn-Phe-Cys-Leu-Phe):\cr
 SEQ ID NO. 25 \+
(Phe-Ile-Phe-Asn-Phe-Leu);\cr
 SEQ ID NO. 26 \+
(Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Pro-Val-Ala-Gly-Ile-Thr-Gly-Met);\cr
 SEQ ID NO. 27 \+
(Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Gln-Val-Ala-Gly-Thr-Lys-Asp-Met)
y\cr  SEQ ID NO. 28 \+
(Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Gln-Ser-Ala-Gly-Ile-Thr-Gly-Val).\cr}
2. Péptido de NTP según la reivindicación 1, para su uso como un medicamento.
3. Una composición que comprende un péptido de NTP según la reivindicación 1 y un vehículo para el mismo.
4. Un uso de un péptido de NTP según la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un estado que requiere la eliminación o destrucción de células seleccionadas del grupo constituido por un tumor benigno o maligno de un tejido; una hiperplasia, hipertrofia, o crecimiento excesivo de un tejido; tejido alterado vírica, bacteriana o parasitariamente; una malformación de un tejido; hipertrofia de amígdalas; hiperplasia prostática; psorasis; eccema; dermatosis; una modificación cosmética de un tejido; una enfermedad vascular; hemorroides, venas varicosas, aterosclerosis; enfermedad inflamatoria; enfermedad autoinmunitaria; enfermedad metabólica; enfermedad hereditaria/genética; enfermedad traumática o daño físico; enfermedad de deficiencia nutricional; enfermedad infecciosa; enfermedad amiloide; enfermedad de fibrosis; enfermedad de las plaquetas de la sangre; malformación congénita; enfermedad de deficiencia enzimática; envenenamiento, intoxicación; enfermedad ambiental; enfermedad por radiación; enfermedad endocrina; y enfermedad degenerativa.
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