DE60222745T2 - Verwendung von neurofilamentproteinen zur behandlung von tumoren - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung bzw. Anwendung einer therapeutisch effektiven Menge eines Neurofilamentproteins zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung von Tumoren. Die Zusammensetzung kann intramuskulär, oral, intravenös, intrathekal, intratumoral, intranasal, topisch, transdermal usw., entweder alleine oder konjugiert an einen Träger, verabreicht werden.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Der Grundsatz vieler medizinischer Behandlungen und Vorgehensweisen involviert die Entfernung oder Zerstörung von schädlichem oder unerwünschtem Gewebe. Beispiele derartiger wichtiger Behandlungen umfassen die chirurgische Entfernung von krebsartigen Wucherungen, die Zerstörung von metastatischen Tumoren durch Chemotherapie und die Reduktion von glandulärer (z. B. Prostata-)Hyperplasie. Andere Beispiele umfassen die Entfernung von unerwünschtem Gesichtshaar, die Entfernung von Warzen und die Entfernung von unerwünschtem Fettgewebe.
  • Es besteht daher ein offensichtlicher Bedarf an einem effektiven Mittel, das schädliche oder unerwünschte Tumorzellen zerstören wird und folglich entweder deren Entfernung erleichtert oder deren weiteres Wachstum inhibiert, jedoch hauptsächlich lokale Wirkungen und minimale oder fehlende systemische Toxizität haben wird.
  • Neurofilamentproteine („neural thread Proteins") und deren verwandte Moleküle sind derartige Mittel.
  • Krebs und gutartige Überwucherungen
  • Krebs ist eine Abnormalität im inneren Regulationsmechanismus einer Zelle, die in unkontrolliertem Wachstum und unkontrollierter Reproduktion der Zelle resultiert. Normale Zellen bilden Gewebe und wenn diese Zellen ihre Fähigkeit, sich als eine spezifizierte, kontrollierte und koordinierte Einheit zu verhalten, verlieren (Dedifferenzierung), führt der Defekt zu einer Unordnung in der Zellpopulation. Wenn dies auftritt, wird ein Tumor gebildet.
  • Gutartige Überwucherungen von Gewebe sind Abnormalitäten, bei denen es wünschenswert ist, Zellen aus dem Organismus zu entfernen. Gutartige Tumore sind Zellproliferationen, die nicht über den Körper hinweg metastasieren, jedoch Krankheitssymptome verursachen. Derartige Tumore können letal sein, falls sie in unzugänglichen Bereichen in Organen, wie dem Gehirn, lokalisiert sind. Es gibt gutartige Tumore von Organen, einschließlich Lunge, Gehirn, Haut, Hypophyse, Schilddrüse, Nebennierenrinde und Medulla, Eierstock, Uterus, Hoden, Bindegewebe, Muskel, Gedärme, Ohr, Nase, Hals, Tonsillen, Mund, Leber, Gallenblase, Pankreas bzw. Bauchspeicheldrüse, Prostata, Herz und andere Organe.
  • Krebsbehandlungen
  • Ein chirurgischer Eingriff ist oft der erste Schritt bei der Behandlung von Krebs. Das Ziel des chirurgischen Eingriffs variiert. Manchmal dient er der Entfernung von soviel offensichtlichem Tumor wie möglich oder wenigstens zur „Mengenverringerung" („debulk") (Entfernen des/der Hauptmenge/n an Tumor, so dass weniger Bedarf an einer Behandlung durch andere Mittel besteht). Abhängig vom Krebstyp und der Lokalisierung kann ein chirurgischer Eingriff auch eine gewisse symptomatische Erleichterung für den Patienten ermöglichen. Zum Beispiel wird, falls ein Chirurg einen großen Teil eines expandierenden Gehirntumors entfernen kann, der Druck im Inneren des Schädels abnehmen, was zu einer Verbesserung der Symptome des Patienten führt.
  • Nicht alle Tumore sind einem chirurgischen Eingriff zugänglich. Einige können in Teilen des Körpers lokalisiert sein, die eine vollständige Entfernung unmöglich machen. Beispiele dafür waren Tumore im Hirnstamm (einem Teil des Gehirns, der die Atmung kontrolliert) oder ein Tumor, der in und um ein Hauptblutgefäß gewachsen ist. In diesen Fällen ist die Rolle der Chirurgie aufgrund des mit einer Tumorentfernung assoziierten hohen Risikos beschränkt.
  • In manchen Fällen wird ein chirurgischer Eingriff nicht angewendet, um die Tumormenge zu verringern, da dies einfach nicht nötig ist. Ein Beispiel ist das Hodgkin-Lymphom, ein Krebs der Lymphknoten, der sehr gut auf Kombinationen von Chemotherapie und Strahlentherapie reagiert. Beim Hodgkin-Lymphom ist ein chirurgischer Eingriff selten notwendig, um eine Heilung zu erzielen, wird jedoch stets angewendet, um eine Diagnose zu erstellen.
  • Die Chemotherapie ist eine weitere verbreitete Form der Krebsbehandlung. Im Wesentlichen umfasst sie die Verwendung von Medikationen (üblicherweise oral („by mouth") oder über eine Injektion verabreicht), die spezifisch schnell sich teilende Zellen (wie jene, die in einem Tumor gefunden werden) über den Körper hinweg angreifen. Dies macht die Chemotherapie nützlich bei der Behandlung von Krebsarten, die bereits metastasiert haben, sowie (bei) Tumoren, die eine große Chance der Ausbreitung durch bzw. über die Blut- und Lymphsysteme haben, jedoch über den Primärtumor hinaus nicht evident sind. Eine Chemotherapie kann auch verwendet werden, um die Reaktion von lokalisierten Tumoren auf ein chirurgischen Eingriff und Strahlentherapie zu erhöhen. Dies ist z. B. der Fall bei einigen Krebsarten des Kopfes und des Halses bzw. Nackens.
  • Unglücklicherweise werden andere Zellen im menschlichen Körper, die sich ebenfalls normalerweise rasch teilen (wie die Auskleidung des Magens und Haar) ebenfalls durch eine Chemotherapie beeinträchtigt. Aus diesem Grund können einige (obgleich nicht alle) Chemotherapiemittel Übelkeit oder Haarverlust induzieren. Diese Nebenwirkungen sind temporär und Ärzte verfügen über Medikationen, die bei der Linderung vieler dieser Nebenwirkungen Unter stützung bereitstellen können. Somit werden Chemotherapiebehandlungen im Allgemeinen von Patienten gut toleriert.
  • Mit der kontinuierlichen Vergrößerung unseres Wissens haben Forscher auf neuere chemotherapeutische Mittel abgezielt, die nicht nur bei der Abtötung von Krebszellen besser sind, sondern auch weniger Nebenwirkungen für den Patienten haben.
  • Eine Chemotherapie wird auf eine Vielfalt von Wegen an Patienten verabreicht. Einige sind Pillen, die täglich oder einmal pro Woche oder nach einem anderen Zeitplan genommen werden und einige werden über eine intravenöse Injektion verabreicht. Für eine injizierbare Chemotherapie geht ein Patient zur Behandlung in die Arztpraxis oder in das Krankenhaus. Andere chemotherapeutische Mittel erfordern eine kontinuierliche Infusion in den Blutstrom, 24 Stunden pro Tag. Für diese Typen von Chemotherapie wird eine kleine chirurgische Verfahrensweise durchgeführt, um eine vom Patienten getragene kleine Pumpe zu implantieren. Die Pumpe verabreicht die Medikation anschließend langsam. In vielen Fällen wird ein Dauerzugang in einer Vene eines Patienten platziert, um das Erfordernis wiederholter Nadelstiche zu eliminieren.
  • Die Strahlentherapie ist eine weitere verbreitet verwendete Waffe im Kampf gegen Krebs. Strahlung kann Krebszellen durch Schädigung der DNA innerhalb der Tumorzellen abtöten. Die Strahlung wird auf zwei möglichen Wegen „angewendet". Der erste und üblichste umfasst das Richten eines Strahlungsstrahles auf den Patienten auf eine hoch präzise Weise unter Fokussierung auf den Tumor. Dazu liegt ein Patient auf einem Tisch und die Strahlung bewegt sich über ihm/ihr. Dies erfordert nur einige Minuten, erfolgt jedoch an fünf Tagen pro Woche für 3–6 Wochen (in Abhängigkeit vom Tumortyp), um eine spezielle verschriebene Gesamt-„Dosis" zu erzielen.
  • Ein weiteres Bestrahlungsverfahren, das manchmal angewendet wird, bezeichnet als Brachytherapie, umfasst die Verwendung radioaktiver Pellets („Seeds” oder „Samen") oder Drähte und deren Implantation in den Körper im Bereich des Tumors. Die Implantate können temporär oder permanent sein. Bei permanenten Implantaten erfolgt ein „Abklingen" oder Verschwinden der Strahlung in den Seeds über einen Zeitraum von Tagen oder Wochen hinweg, so dass der Patient nicht mehr radioaktiv ist. Bei temporären Implantaten wird die gesamte Strahlendosis üblicherweise in etwa zwei Tagen abgegeben und der Patient muss während dieser Zeit im Krankenhaus bleiben. Bei beiden Typen der Brachytherapie wird Strahlung üblicherweise an ein sehr begrenztes targetiertes Gebiet abgegeben, um eine lokale Kontrolle über einen Krebs zu erreichen (im Gegensatz zur Behandlung des ganzen Körpers, wie bei der Chemotherapie).
  • Bei einigen in hohem Maße ausgewählten Patienten kann auf Knochenmarktransplantate Bezug genommen bzw. zurückgegriffen werden. Diese Verfahrensweise wird üblicherweise durchgeführt, entweder weil ein Patient einen Krebs hat, der besonders aggressiv ist, oder weil sie einen Krebs haben, der nach Behandlung mit einer herkömmlichen Therapie rezidiviert hat. Die Knochenmarktransplantation ist eine komplizierte Verfahrensweise. Es gibt viele Typen und sie können hinsichtlich ihres Potentials zur Verursachung von Nebenwirkungen und (zur) Heilung variieren. Die meisten Transplantate werden in Spezialzentren eingesetzt und in vielen Fällen wird ihre Verwendung als Forschung angesehen.
  • Es gibt eine Zahl weiterer Therapien, obgleich die meisten von ihnen noch in klinischen Versuchen untersucht werden und noch nicht Standardbehandlung („standard care") geworden sind. Beispiele umfassen die Anwendung von Immuntherapie, monoklonalen Antikörpern, Antiangiogenesefaktoren und Gentherapie.
  • Immuntherapie: Es gibt zahlreiche Techniken, die dazu konzipiert sind, das eigene Immunsystem des Patienten bei der Bekämpfung des Krebses zu unterstützen, und sind von Strahlen- oder Chemotherapie recht verschieden. Zur Erreichung des Ziels injizieren Forscher dem Patienten häufig ein speziell erstelltes Vakzin. Die meiste Forschung in diesem Gebiet ist am Melanom durchgeführt worden, obgleich andere Krebsarten nun ebenfalls als Ziel genommen werden.
  • Monoklonale Antikörper: Diese sind kleine Proteine, die speziell zur Anheftung an krebsartige Zellen (und nicht normale Zellen) konzipiert sind, wobei Vorteile aus Unterschieden zwischen krebsartigen und nicht-krebsartigen Zellen hinsichtlich deren Zellmembranen gezogen werden. Vor einer Verabreichung der Antikörper an den Patienten werden sie oft an zahlreiche cytotoxische Verbindungen „getagged" (angeheftet) oder radioaktiv gemacht, so dass der Antikörper vorzugsweise die krebsartigen Zellen targetiert, wodurch das toxische Mittel an die gewünschten Zellen abgegeben wird.
  • Anti-Angiogenesefaktoren: Da sich Krebszellen rasch teilen und Tumore wachsen, können sie über ihre Blutversorgung schnell hinauswachsen. Um dies zu kompensieren, sekretieren bzw. sezernieren manche Tumore eine Verbindung, bei der gezeigt worden ist, dass sie die Induktion des Wachstums von Blutgefäßen in deren Nachbarschaft unterstützt, wodurch für die Krebszellen eine kontinuierliche Zufuhr von Nährstoffen sichergestellt wird. Vor kurzem haben Forscher Wege, um diesen Vorgang abzustellen (Stoppen des Wachstums von Blutgefäßen), untersucht.
  • Gentherapie: Krebs ist das Produkt einer Reihe von Mutationen, die schlussendlich zur Produktion einer Krebszelle und deren exzessiver Proliferation führen. Krebsarten können durch Einführung von Genen in die Krebszellen, die entweder zur Kontrolle oder zum Stoppen der Krebsproliferation wirken, die programmierten Mechanismen zur Zerstörung der Zelle aktivieren, eine Immunerkennung der Zelle verstärken oder ein Prodrug exprimieren, das sich in einen toxischen Metaboliten oder ein Cytokin, der/das das Tumorwachstum inhibiert, umwandelt, behandelt werden.
  • Behandlung gutartiger Tumore
  • Gutartige Tumore können ebenso mittels einer Vielfalt von Verfahren, einschließlich chirurgischer Eingriff, Strahlentherapie, Arzneimitteltherapie, thermische oder elektrische Ablation, Kryotherapie und andere, behandelt werden. Obgleich gutartige Tumore nicht metastasie ren, können sie durch Wachstum groß werden und sie können wiederkehren. Eine chirurgische Extirpation von gutartigen Tumoren weist alle Schwierigkeiten und Nebenwirkungen von chirurgischen Eingriffen im Allgemeinen auf und muss bei manchen gutartigen Tumoren, wie bei Hypophysenadenomen, Meningiomen des Gehirns, Prostatahyperplasie und anderen, wiederholt durchgeführt werden.
  • Neurofilamentproteine
  • Neurofilamentproteine (NTP) sind eine neue Familie von vor kurzem charakterisierten Gehirnproteinen. Ein Mitglied dieser Familie, AD7C-NTP, ist ein ~41 kD großes Membranassoziiertes Phosphoprotein mit Funktionen, die die Neuritensprossung und den Zelltod betreffen (de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100: 3093–3104 (1997); de la Monte et al., Alz. Rep., 2: 327–332 (1999); de la Monte SM und Wands JR, Journal of Alzheimer Disease, 3: 345–353 (2001)). Das Gen und die vorhergesagte Proteinsequenz für AD7C-NTP sind identifiziert und beschrieben worden (de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100: 3093–3104 (1997)). Zusätzlich zu der ~41 kD-Spezies sind andere Spezies des Neurofilamentproteins (~26 kD, ~21 kD, ~17 kD und ~15 kD) identifiziert worden und mit neuroektodermalen Tumoren, Astrocytomen und Glioblastomen und mit Schädigung aufgrund von Hypoxie, Ischämie oder Hirninfarkt in Zusammenhang gebracht worden (Xu et al., Cancer Research, 53: 3823–3829; de la Monte et al., J. Neuropath. Exp. Neurol., 55(10): 1038–50 (1996); de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 138(1–2): 26–35 (1996); de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 135(2): 118–25 (1996); de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100: 3093–3104 (1997); und de la Monte et al., Alz. Rep., 2: 327–332 (1999)).
  • Neurofilamentprotein ist beschrieben und beansprucht worden in den U.S. Patenten Nrn. 5,948,634 , 5,948,888 und 5,830,670 , alle für „Neural Thread Protein Gene Expression and Detection of Alzheimer's Disease" und im U.S. Patent Nr. 6,071,705 für „Method of Detecting Neurological Disease or Dysfunction".
  • Es gibt zwingende Beweise, die AD7C-NTP mit der Alzheimer-Krankheit (AD) in Zusammenhang bringen. AD7C-NTP-mRNA ist im AD-Gehirn, verglichen mit Kontrollen, hochreguliert; AD7C-NTP-Proteinlevel im Gehirn und in CSF sind bei AD höher als (bei) Kontrollen und eine AD7C-NTP-Immunreaktivität wird bei senilen Plaques, bei „neurofibrillary tangles" (NFT), bei degenerierenden Neuronen, Neuropilfäden und dystrophen neurotischen („neurotic") Sprossungen in AD- und Down-Syndrom-Gehirnen festgestellt (Ozturk et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 86: 419–423 (1989); de la Monte et al., J. Clin. Invest., 86(3): 1004–13 (1990); de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 113(2): 152–64 (1992); de la Monte et al., Ann. Neurol., 32(6): 733–42 (1992); de la Monte et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55(10): 1038–50 (1996), de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 138(1–2): 26–35 (1996); de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 135(2): 118–25 (1996); de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100: 3093–3104 (1997); und de la Monte et al., Alz. Rep., 2: 327–332 (1999)). AD7C-NTP ist auch in Down-Syndrom-Gehirngewebe identifiziert worden (Wands et al., Internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 90/06993 ; de la Monte et al., Alz. Rep., 2: 327–332 (1999)). AD7C-NTP ist auch mit dem Vor gang des Zelltodes bei Alzheimer-Krankheit in Zusammenhang gebracht worden (de la Monte und Wands, J. Neuropatho. and Exp. Neuro., 60: 195–207 (2001)).
  • Im Fachgebiet verbleibt ein Bedarf an neuen, weniger toxischen Behandlungen zur Behandlung von Tumoren. Die vorliegende Erfindung befriedigt diesen Bedarf.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Anwendung einer therapeutisch effektiven Menge eines Neurofilamentproteins zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung von Tumoren. Die Zusammensetzung kann verabreicht werden an einen Säuger mit einem Bedarf an einer therapeutisch effektiven Menge an Neurofilamentprotein (NTP).
  • NTP kann alleine oder konjugiert an einen Träger oder einen Antikörper verabreicht werden. Zusätzlich kann NTP in Verbindung mit anderen Therapien zur Behandlung gutartiger und bösartiger Tumore angewendet werden.
  • Sowohl die vorstehende allgemeine Beschreibung als auch die folgende detaillierte Beschreibung sind beispielhaft und erklärend und sollen eine weitere Erklärung der Erfindung, wie beansprucht, bereitstellen. Andere Aufgaben, Vorteile und neue Merkmale werden Fachleuten auf dem Gebiet, ausgehend von der folgenden detaillierten Beschreibung der Erfindung, leicht zugänglich sein.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1: Zeigt die vollständige Aminosäuresequenz und Nucleinsäuresequenz des AD7c-NTP-Gens und des AD7c-NTP-Proteinprodukts dieses Gens (Sequenzen 120 und 121 aus den U.S. Patenten Nm. 5,830,670 , 5,948,634 und 5,948,888 ; de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100: 3093–3104 (1997); NCBI Entrez-Protein-Eingangsnummer AAC08737; PID g3002527) [SEQ ID NO: 1].
  • 2: Zeigt die vollständige Aminosäuresequenz des 122 Aminosäuren langen Neurofilamentproteins (Sequenz 40 aus den U.S. Patenten Nm. 5,830,670 , 5,948,634 und 5,948,888 ; NCBI Entrez-Protein-Eingangsnummer AAE25447 PID g10048540) [SEQ ID NO: 2].
  • 3: Zeigt die vollständige Aminosäuresequenz des 112 Aminosäuren langen Neurofilamentproteins (NCBI Entrez-Proteineingangsnummer XP_032307 PID g15928971) [SEQ ID NO: 3].
  • 4: Zeigt die vollständige Aminosäuresequenz eines 106 Aminosäuren langen Neurofilamentprotein-ähnlichen Proteins (NCBI Entrez-Protein-Eingangsnummer AAH14951 PID g15928971) [SEQ ID NO: 4].
  • 5: Zeigt die vollständige Aminosäuresequenz eines 106 Aminosäuren langen Neurofilamentprotein-ähnlichen Proteins (NCBI Entrez-Protein-Eingangsnummer XP_039102 PID g18599339) [SEQ ID NO: 5].
  • 6: Zeigt die vollständige Aminosäuresequenz des 98 Aminosäuren langen Neurofilamentproteins (Sequenz 30 aus den U.S. Patenten Nrn. 5,830,670 , 5,948,634 und 5,948,888 ; NCBI Entrez-Protein-Eingangsnummer AAE25445, PID g10048538) [SEQ ID NO: 6].
  • 7: Zeigt die vollständige Aminosäuresequenz des 75 Aminosäuren langen Neurofilamentproteins (Sequenz 48 aus den U.S. Patenten Nrn. 5,830,670 , 5,948,634 und 5,948,888 ; NCBI Entrez-Protein-Eingangsnummer AAE25448, PID g10048541) [SEQ ID NO: 7].
  • 8: Zeigt die vollständige Aminosäuresequenz des 68 Aminosäuren langen Neurofilamentproteins (Sequenz 36 aus den U.S. Patenten Nrn. 5,830,670 , 5,948,634 und 5,948,888 ; NCBI Entrez-Protein-Eingangsnummer AAE25446, PID g10048539) [SEQ ID NO: 8].
  • 9: Zeigt die vollständige Aminosäuresequenz des 61 Aminosäuren langen Neurofilamentprotein-ähnlichen Proteins (NCBI Entrez-Protein-Eingangsnummer AAH02534, PID g12803421) [SEQ ID NO: 9].
  • 10: Zeigt subkutane Gewebe- und Muskelnekrose an einer AD7C-NTP-Injektionsstelle, 24 Stunden nach Injektion. Optische Mikroskopie, Hämatoxylin- und Eosinfärbung, ×400;
  • 11: Zeigt subkutane Gewebe- und Muskelnekrose an einer AD7C-NTP-Injektionsstelle, 24 Stunden nach Injektion. Optische Mikroskopie, Hämatoxylin- und Eosinfärbung, ×400;
  • 12: Zeigt subkutane Gewebe- und Muskelnekrose an einer AD7C-NTP-Injektionsstelle, 24 Stunden nach Injektion. Optische Mikroskopie, Hämatoxylin- und Eosinfärbung, ×400;
  • 13: Zeigt subkutane Gewebe- und Muskelnekrose an einer AD7C-NTP-Injektionsstelle, 24 Stunden nach Injektion. Optische Mikroskopie, Hämatoxylin- und Eosinfärbung, ×1000;
  • 14: Zeigt subkutane Gewebe- und Muskelnekrose an einer AD7C-NTP-Injektionsstelle, 24 Stunden nach Injektion. Optische Mikroskopie, Hämatoxylin- und Eosinfärbung, ×1000;
  • 15: Zeigt Tumornekrose 24 Stunden nach AD7C-NTP-Injektion. Optische Mikroskopie, Hämatoxylin- und Eosinfärbung, ×200;
  • 16: Zeigt Tumornekrose 24 Stunden nach AD7C-NTP-Injektion. Optische Mikroskopie, Hämatoxylin- und Eosinfärbung, ×400;
  • 17: Zeigt Tumornekrose 24 Stunden nach AD7C-NTP-Injektion. Optische Mikroskopie, Hämatoxylin- und Eosinfärbung, ×1000;
  • 18: Zeigt Tumornekrose 2 Wochen nach AD7C-NTP-Injektion. Optische Mikroskopie, Hämatoxylin- und Eosinfärbung, ×40; und
  • 19: Zeigt Tumornekrose 2 Wochen nach AD7C-NTP-Injektion. Optische Mikroskopie, Hämatoxylin- und Eosinfärbung, ×200;
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Definitionen
  • Begriffe und Ausdrücke, die hierin verwendet werden, sind wie untenstehend definiert, sofern nicht anders angegeben.
  • Der Begriff „AD7c-NTP" bezieht sich auf das ~41 kD große Protein und das Gen und die Nucleinsäuresequenzen, die dafür codieren, beschrieben in de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100: 3093–104 (1997), in den Sequenzen 120 und 121 der U.S. Patente Nrn. 5,948,634 , 5,948,888 und 5,830,670 und in GenBank #AF010144, wobei die Nucleinsäure- und Aminosäuresequenzen dafür in 1 dargestellt sind. Der Begriff „AD7c-NTP" umfasst auch biologisch aktive Fragmente, Varianten und Derivate, Homologe, Peptidmimetika, reverse D-Peptide und Enantiomere von AD7c-NTP.
  • Der Begriff „NTP" oder „Neurofilamentprotein" bezieht sich auf Neurofilamentproteine und damit verwandte Moleküle (einschließlich Pankreasfilamentprotein) und die Nucleinsäuresequenzen, die für jene Proteine codieren, und umfasst (ohne Beschränkung darauf) die folgenden Proteine und die Nucleinsäuresequenzen, die für die Aminosäuresequenzen für diese Proteine codieren:
    • (a) AD7c-NTP;
    • (b) die ~42, ~26, ~21, ~17, ~14 und ~8 kD-Spezies von Neurofilamentprotein, wie in den U.S. Patenten Nrn. 5,948,634 , 5,948,888 , 5,830,670 und 6,071,705 und in de la Monte et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55(10): 1038–50 (1996), de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 138(1–2): 26–35 (1996); de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 135(2): 118–25 (1996), de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100: 3093–3104 (1997) und de la Monte et al., Alz. Rep., 2: 327–332 (1999), beschrieben;
    • (c) Proteine, die spezifisch erkannt werden durch den monoklonalen Antikörper #2, hinterlegt bei der American Type Culture Collection, Manassas, VA, unter der Eingangsnummer HB-12546, oder (durch) den monoklonalen Antikörper #5, hinterlegt bei der American Type Culture Collection, Manassas, VA, unter der Eingangsnummer HB-12545;
    • (d) Proteine, die durch das AD7c-NTP-Gen codiert werden;
    • (e) das 122 Aminosäuren lange Neurofilamentprotein, beschrieben in Sequenz 40 aus den U.S. Patenten Nrn. 5,830,670 , 5,948,634 und 5,948,888 , und gelistet unter der NCBI Entrez-Proteineingangsnummer AAE25447, PID g10048540, dessen Aminosäuresequenz in 2 dargestellt ist;
    • (f) das 112 Aminosäuren lange Neurofilamentprotein, gelistet unter der NCBI Entrez-Protein-Eingangsnummer XP_032307, PID g14725132, dessen Aminosäuresequenz in Figur dargestellt ist;
    • (g) ein 106 Aminosäuren langes Neurofilamentprotein-ähnliches Protein, gelistet unter der NCBI Entrez-Protein-Eingangsnummer AAH14951 PID g15928971, dessen Aminosäuresequenz in 4 dargestellt ist;
    • (h) ein 106 Aminosäuren langes Neurofilamentprotein-ähnliches Protein, gelistet unter der NCBI Entrez-Protein-Eingangsnummer XP_039102, PID g18599339, dessen Aminosäuresequenz in 5 dargestellt ist;
    • (i) das 98 Aminosäuren lange Neurofilamentprotein, beschrieben in Sequenz 30 aus den U.S. Patenten Nrn. 5,830,670 , 5,948,634 und 5,948,888 , unter der NCBI Entrez-Protein-Eingangsnummer AAE25445, PID g10048538, dessen Aminosäuresequenz in 6 dargestellt ist;
    • (j) das 75 Aminosäuren lange Neurofilamentprotein, beschrieben in Sequenz 48 aus U.S. Patenten Nrn. 5,830,670 , 5,948,634 und 5,948,888 und gelistet unter der NCBI Entrez-Protein-Eingangsnummer AAE25448, PID g10048541, dessen Aminosäuresequenz in 7 dargestellt ist;
    • (k) das 68 Aminosäuren lange Neurofilamentprotein, beschrieben in Sequenz 36 aus den U.S. Patenten Nrn. 5,830,670 , 5,948,634 und 5,948,888 und gelistet unter der NCBI Entrez-Protein-Eingangsnummer AAE25446, PID g10048539, dessen Aminosäuresequenz in 8 dargestellt ist;
    • (l) das 61 Aminosäuren lange Neurofilamentprotein-ähnliche Protein, gelistet unter der NCBI Entrez-Protein-Eingangsnummer AAH02534, PID g12803421, dessen Aminosäuresequenz in 9 dargestellt ist;
    • (m) Pankreasfilamentprotein („pancreatic thread Protein");
    • (n) das neurale Pankreasfilamentprotein (neural pancreatic thread Protein") (nPTP), beschrieben im U.S. Patent Nr. 6,071,705 ; und
    • (o) Proteine, die spezifisch von den Antikörpern, produziert durch ein Hybridom aus der Gruppe, bestehend aus HB9934, HB9935 und HB9936, hinterlegt bei der American Type Culture Collection, erkannt werden.
  • Der Begriff „NTP" umfasst auch biologisch aktive Fragmente, Varianten und Derivate, Homologe, Peptidmimetika, reverse D-Peptide und Enantiomere von NTP.
  • Der Begriff „biologisch aktiv" bezieht sich auf ein Protein, ein Polypeptidfragment, eine Variante, ein Derivat, ein Homologes, ein reverses D-Peptid, ein Peptidmimetikum oder ein E-natiomer, welche(s) die Fähigkeit zur Zerstörung und folglich entweder zur Erleichterung der Entfernung von schädlichen oder unerwünschten Zellen oder schädlichem oder unerwünschtem Gewebe oder zur Inhibierung des weiteren Wachstums davon hat, jedoch hauptsächlich lokale Wirkungen und minimale oder fehlende systemische Toxizität aufweist und umfasst (ohne Beschränkung darauf): die Fähigkeit zum Abtöten oder Verringern der Lebensfähigkeit von Zellen im Zellkulturcytotoxizitätsassay von Beispiel 1 hierin, die Fähigkeit zur Bewirkung von Zellverlust und/oder Gewebsnekrose in dem in vivo-Gewebeassay von Beispiel 2 hierin, oder die Fä higkeit zur Bewirkung von Zellverlust, Gewebenekrose oder Tumorschrumpfung im Tumorassay von Beispiel 3 hierin.
  • Der Begriff „Fragment" bezieht sich auf ein biologisch aktives Protein oder Polypeptid, das aus einer kontinuierlichen Subsequenz der Aminosäuresequenz eines NTP-Proteins oder einer Variante, eines Derivates, eines Homologen, eines reverses D-Peptids oder Enantiomers davon besteht, und umfasst natürlich vorkommende Fragmente, wie Spleißvarianten, und Fragmente, resultierend aus natürlich auftretender in vivo-Proteaseaktivität. Ein derartiges Fragment kann am Aminoterminus, am Carboxyterminus und/oder intern (wie durch natürliches Spleißen) trunkiert bzw. verkürzt sein und kann eine Variante oder ein Derivat eines NTP-Proteins sein. Derartige Fragmente können mit oder ohne ein aminoterminales Methionin hergestellt werden. Der Begriff „Fragment" umfasst Fragmente, ob identisch oder unterschiedlich, aus dem gleichen NTP-Protein oder mit einer zusammenhängenden Aminosäuresequenz, die gemeinsam ist oder nicht, die entweder direkt oder über einen Linker miteinander verbunden sind.
  • Der Begriff „Variante" bezieht sich auf ein biologisch aktives Protein oder Polypeptid, in dem eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, -delektionen und/oder -insertionen vorhanden sind, im Vergleich zur Aminosäuresequenz eines NTP-Proteins, und umfasst natürlich vorkommende allelische Varianten oder alternative Spleißvarianten eines NTP-Proteins. Der Begriff „Variante" umfasst die Ersetzung von einer oder mehreren Aminosäuren in einer Peptidsequenz durch eine ähnliche oder homologe Aminosäure(n) oder eine unähnliche Aminosäure(n). Es gibt viele Skalen, auf denen Aminosäuren als ähnlich oder homolog eingeordnet werden können (Gunnar von Heijne, Sequence Analysis in Molecular Biology, S. 123–39 (Academic Press, New York, NY 1987). Bevorzugte Varianten umfassen Alaninsubstitutionen an einer oder mehreren der Aminosäurepositionen. Andere bevorzugte Substitutionen umfassen konservative Substitutionen, die geringe oder keine Auswirkung auf die gesamte Nettoladung, Polarität oder Hydrophobizität des Proteins haben. Konservative Substitutionen sind in der untenstehenden Tabelle I angegeben. TABELLE I Konservative Aminosäure-Substitutionen
    Basisch: Arginin
    Lysin
    Histidin
    Sauer: Glutaminsäure
    Asparaginsäure
    Ungeladen, polar: Glutamin
    Asparagin
    Serin
    Threonin
    Thyrosin
    Unpolar: Phenylalanin
    Tryptophan
    Cystein
    Glycin
    Alanin
    Valin
    Prolin
    Methionin
    Leucin
    Isoleucin
  • Tabelle II gibt ein weiteres Schema der Aminosäure-Substitution an: TABELLE II
    Ursprünglicher Rest Substitutionen
    Ala Gly; Ser
    Arg Lys
    Asn Gln; His
    Asp Glu
    Cys Ser
    Gln Asn
    Glu Asp
    Gly Ala; Pro
    His Asn; Gln
    Ile Leu; Val
    Leu Ile; Val
    Lys Arg; Gln; Glu
    Met Leu; Tyr; Ile
    Phe Met; Leu; Tyr
    Ser Thr
    Thr Ser
    Trp Tyr
    Tyr Trp; Phe
    Val Ile; Leu
  • Andere Varianten können aus weniger konservativen Aminosäuresubstitutionen bestehen, wie das Auswählen von Resten, die sich bedeutender hinsichtlich ihrer Wirkung auf die Erhaltung (a) der Struktur des Polypeptidrückgrats im Bereich der Substitution, zum Beispiel als (Falt-)Blatt- der Helixkonformation, (b) der Ladung oder Hydrophobizität des Moleküls an der Zielstelle oder (c) der sterischen Wirkung („bulk") der Seitenkette unterscheiden. Substitutionen, bei denen allgemein eine bedeutendere Wirkung auf die Funktion erwartet wird, sind jene, bei denen (a) Glycin und/oder Prolin durch eine andere Aminosäure ersetzt wird oder deletiert oder inseriert wird; (b) ein hydrophiler Rest, z. B. Seryl oder Threonyl, mit einem (oder durch einen) („for (or by)") hydrophoben Rest substituiert bzw. ersetzt wird, z. B. Leucin, Isoleucyl, Phenylalanyl, Valyl oder Alanyl; (c) ein Cysteinrest mit einem (oder durch einen) beliebigen anderen Rest substituiert wird; (d) ein Rest mit einer elektropositiven Seitenkette, z. B. Lysyl, Arginyl oder Histidyl, mit einem (oder durch einen) Rest mit einer elektronegativen Ladung, z. B. Glutamyl oder Aspartyl, substituiert wird; oder (e) ein Rest mit einer raumgreifenden Seitenkette, z. B. Phenylalanin, mit einem (oder durch einen), der keine derartige Seitenkette hat, z. B. Glycin, substituiert wird. Andere Varianten umfassen jene, die so konzipiert sind, dass sie entweder eine neue Glycosylierungs- und/oder Phosphorylierungsstelle(n) erzeugen, oder jene, die so konzipiert sind, dass sie eine bestehende Glycosylierungs- und/oder Phosphorylierungsstelle(n) deletieren. Varianten umfassen wenigstens eine Aminosäuresubstitution an einer Glycosylierungsstelle, einer proteolytischen Spaltstelle und/oder einem Cysteinrest. Varianten umfassen auch NTP-Proteine, Fragmente, Derivate, Homologe, reverse D-Peptide und Antimere mit zusätzlichen Aminosäureresten vor oder nach der NTP-Aminosäuresequenz an bzw. auf Linkerpeptiden. Zum Beispiel kann ein Cysteinrest sowohl am Amino- als auch am Carboxyterminus eines NTP-Fragments hinzugefügt werden, um die Cyclisierung des NTP-Fragments durch die Bildung einer Disulfidbindung zu ermöglichen. Der Begriff „Variante" umfasst Varianten von Fragmenten, Derivaten, Homologen, reverse D-Peptiden und Enantiomeren von NTP oder AD7c-NTP.
  • Der Begriff „Derivat” bezieht sich auf ein biologisch aktives, chemisch modifiziertes Protein oder Polypeptid, das chemisch modifiziert wurde, entweder durch natürliche Vorgänge, wie Prozessierung und andere post-translationale Modifikationen, jedoch auch durch chemische Modifikationstechniken, wie z. B. Addition von einem oder mehreren Polyethylenglykolmolekülen, Zuckern, Phosphaten und/oder anderen derartigen Molekülen, wobei das Molekül oder die Moleküle natürlicher Weise nicht an die Wildtyp-NTP-Proteine angeheftet sind. Derivate umfassen Salze. Derartige chemische Modifikationen sind in grundlegenden Texten und in detaillierteren Monographien, sowie in einer umfänglichen Forschungsliteratur gut beschrieben und sie sind Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt. Es wird verstanden werden, dass der gleiche Typ an Modifikation mit gleichem oder mit variierendem Grad an mehreren Stellen in einem gegebenen Protein oder Polypeptid vorliegen kann. Auch kann ein gegebenes Protein oder Polypeptid viele Typen von Modifikationen enthalten. Modifikationen können an beliebiger Stelle in einem Protein oder Polypeptid auftreten, einschließlich des Peptidrückgrats, der Aminosäure-Seitenketten und der Amino- oder Carboxytermini. Modifikationen umfassen z. B. Acetylierung, Acylierung, ADP-Ribosylierung, Amidierung, kovalente Anheftung von Flavin, kovalente An heftung einer Häm-Gruppierung, kovalente Anheftung eines Nucleotids oder Nucleotidderivats, kovalente Anheftung eines Lipids oder Lipidderivats, kovalente Anheftung von Phosphatidylinositol, Vernetzung, Cyclisierung, Disulfidbindungsbildung, Desmethylierung, Bildung kovalenter Vernetzungen, Bildung von Cystein, Bildung von Pyroglutamat, Formylierung, gamma-Carboxylierung, Glycosylierung, GPI-Anker-Bildung, Hydroxylierung, Iodierung, Methylierung, Myristoylierung, Oxidation, proteolytische Prozessierung, Phosphorylierung, Prenylierung, Racemisierung, Glycosylierung, Lipidanheftung, Sulfatierung, gamma-Carboxylierung von Glutaminsäureresten, Hydroxylierung und ADP-Ribosylierung, Selenoylierung, Sulfatierung, Transfer-RNA-vermittelte Addition von Aminosäuren an Proteine, wie Arginylierung, und Ubiquitinierung. Siehe zum Beispiel Proteins-Structure And Molecular Properties, 2. Ausg., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993) und Wold, F., "Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects", S. 1–12 in Posttranslational Kovalent Modification Of Proteins, B. C. Johnson, Hrsg., Academic Press, New York (1983); Seifter et al., Meth. Enzymol. 182: 626–646 (1990) und Rattan et al., „Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging", Ann. N. Y. Acad. Sci. 663: 48–62 (1992). Der Begriff "Derivate" umfasst chemische Modifikationen, die in Verzweigung oder Cyclisierung des Proteins oder Polypeptids, mit oder ohne Verzweigung resultieren. Cyclische, verzweigte und verzweigte zirkuläre Proteine oder Polypeptide können aus post-translationalen natürlichen Vorgängen resultieren und können auch durch vollständig synthetische Verfahren hergestellt werden. Der Begriff „Derivat" umfasst auch Derivate von Fragmenten, Varianten, Homologen, reverse D-Peptiden, Peptidmimetika und Enatiomeren.
  • Der Begriff „Homologes" bezieht auf ein biologisch aktives Protein, das in seiner Aminosäuresequenz mit einem NTP-Protein oder einem AD7c-NTP zu wenigstens 75 Prozent identisch ist, wie durch Standardverfahren bestimmt, die üblicherweise zum Vergleichen der Ähnlichkeit in der Position von Aminosäuren von zwei Polypeptiden verwendet werden. Der Grad der Ähnlichkeit oder Identität zwischen zwei Proteinen kann leicht mittels bekannter Verfahren berechnet werden, einschließlich, aber ohne Beschränkung darauf, jener, die beschrieben sind in Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., Hrsg., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., Hrsg., Academic Press, New York; 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Teil I, Griffin, A. M. und Griffin, H. G., Hrsg., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. und Devereux, J., Hrsg., M Stockton Press, New York, 1991; und Carillo H. und Lipman, D.., SIAM, J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Bevorzugte Verfahren zum Bestimmen der Identität sind so konzipiert, dass sie die größte Übereinstimmung zwischen den getesteten Sequenzen ergeben. Verfahren zur Bestimmung der Identität und Ähnlichkeit werden in öffentlich zugänglichen Computerprogrammen niedergelegt. Bevorzugte Computerprogrammverfahren zur Bestimmung von Identität und Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen umfassen, ohne Beschränkung darauf, das GCG- Programmpaket (Devereux, J. et al., Nucleic Acids Research, 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN und FASIA, Atschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215: 403–410 (1990). Das BLAST X-Programm ist über NCBI und andere Quellen öffentlich zugänglich (BLAST-Handbuch, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol., 215: 403–410 (1990)). Beispielsweise werden unter Verwendung eines Computeralgorithmus, wie GAP (Genetic Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.) die zwei Proteine oder Polypeptide, für die die prozentuale Sequenzidentität zu bestimmen ist, bezüglich einer optimalen Übereinstimmung („matching") ihrer jeweiligen Aminosäuren aligned bzw. angeglichen (die „matched span", wie durch den Algorithmus bestimmt). Eine Gap Opening Penalty (die als 3 mal die durchschnittliche Diagonale („average diagonal") berechnet wird; die „durchschnittliche Diagonale" ist der Durchschnitt der Diagonale der Vergleichsmatrix, die verwendet wird; die „Diagonale” ist der Wert oder die Zahl, der/die jeder perfekten Aminosäure durch die spezielle Vergleichsmatrix zugewiesen wird) und eine Gap Extension Penalty (die üblicherweise 1/10 mal die Gap Opening Penalty ist), sowie eine Vergleichsmatrix, wie PAM 250 oder BLOSUM 62, werden in Verbindung mit dem Algorithmus verwendet. Eine Standard-Vergleichsmatrix (siehe Dayhoff et al., in: Atlas of Protein Sequence and Structure, Bd. 5, Erg. 3 [1978] für die PAM250-Vergleichsmatrix; siehe Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915–10919 [1992] für die BLOSUM 62-Vergleichsmatrix) wird ebenfalls durch den Algorithmus verwendet. Die prozentuale Identität wird dann durch den Algorithmus berechnet. Homologe werden typischerweise eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, -deletionen und/oder -insertionen, verglichen mit NTP oder AD7c-NTP, aufweisen.
  • Der Begriff „Proteinmimetikum" bezieht sich auf biologisch aktive Verbindungen, die die biologische Aktivität eines Peptids oder Proteins nachahmen, aber nicht mehr peptidischer chemischer Natur sind (das heißt, sie enthalten keine Peptidbindungen (das heißt Amidbindungen zwischen Aminosäuren) mehr. Hier wird der Begriff Peptidmimetikum in einem breiteren Sinne verwendet, so dass Moleküle, die nicht mehr vollständig peptidischer Natur sind, wie Pseudopeptide, Semipeptide und Peptoide, eingeschlossen sind. Beispiele für Peptidmimetika in diesem breiteren Sinne (wobei ein Teil eines Peptids durch eine Struktur, der Peptidbindungen fehlen, ersetzt ist) sind untenstehend beschrieben. Ob vollständig oder teilweise Nicht-Peptid, Peptidmimetika gemäß dieser Erfindung stellen eine räumliche Anordnung reaktiver chemischer Gruppierungen bereit, die der dreidimensionalen Anordnung der aktiven Gruppen in dem NTP-Protein, auf dem das Peptidmimetikum basiert, stark ähnelt. Als Ergebnis dieser ähnlichen Geometrie aktiver Zentren („aktive-site geometry") besitzt das Peptidmimetikum Wirkungen auf biologische Systeme, die zu der biologischen Aktivität des Peptids ähnlich sind. Die Peptidmimetika dieser Erfindung sind vorzugsweise zu den oben angegebenen NTP-Peptiden sowohl in der dreidimensionalen Form als auch der biologischen Aktivität im Wesentlichen ähnlich. Beispiele für Verfahren des strukturellen Modifizierens eines Peptids, bekannt im Stand der Technik, zum Erzeugen eines Peptidmimetikums, umfassen die Inversion chiraler Zentren des Rück grats, was zu D-Aminosäurerest-Strukturen führt, die, insbesondere am N-Terminus, zu einer erhöhten Stabilität hinsichtlich proteolytischem Abbau ohne nachteilige Beeinträchtigung der Aktivität führen können. Ein Beispiel wird in der Veröffentlichung „Tritriated D-ala.sup.1-Peptide T. Bindung", Smith C. S. et al., Drug Development Res., 15, S. 371–379 (1988) gegeben. Ein zweites Verfahren ist das Abändern einer cyclischen Struktur bezüglich Stabilität, wie N-zu-C-Imide und -Lactame zwischen Ketten (Ede et al., Smith and River (Hrsg.) „Peptides: Chemistry and Biology", Escom, Leiden (1991), S. 268–270). Ein Beispiel dafür sind Konformations-beschränkte Thymopentin-ähnliche Verbindungen, wie jene, die im U.S. Patent Nr. 4,457,489 (1985); Goldstein, G., et al., offenbart sind, dessen Offenbarung hierin durch Bezugnahme in seiner Gänze aufgenommen ist. Ein drittes Verfahren ist das Substituieren von Peptidbindungen im NTP-Peptid durch Pseudopeptidbindungen, die Beständigkeit gegenüber Proteolyse verleihen. Eine Reihe von Pseudopeptidbindungen ist beschrieben worden, die im Allgemeinen die Peptidstruktur und die biologische Aktivität nicht beeinflussen. Ein Beispiel für diese Herangehensweise ist es, retro-inverso-Pseudopeptidbindungen („retro-inverso pseudopeptide bond") zu substituierten („Biologically active retroinverso analogues of thymopentin", Sisto A. et al. in Rivier, J. E. und Marshall, G. R. (Hrsg.) „Peptides, Chemistry, Structure and Biology", Escom, Leiden (1990), S. 722–773) und Dalpozzo, et al. (1993), Int. J. Peptide Protein Res., 41: 561–566). Gemäß dieser Modifikation können die Aminosäuresequenzen der Peptide zu den oben beschriebenen Sequenzen der NTP-Peptide identisch sein, abgesehen davon, dass eine oder mehrere Peptidbindungen durch eine retro-inverso-Pseudopeptidbindung ersetzt sind. Vorzugsweise ist die am meisten N-terminale Peptidbindung substituiert, da eine derartige Substitution Beständigkeit gegenüber Proteolyse durch Exopeptidasen, die auf den N-Terminus einwirken, verleihen wird. Weitere Modifikationen können auch hergestellt werden, indem chemische Gruppen der Aminosäuren durch chemische Gruppen mit ähnlicher Struktur ersetzt werden. Eine weitere geeignete Pseudopeptidbindung, die für Erhöhung der Stabilität gegen enzymatische Spaltung bei keinem oder geringem Verlust an biologischer Aktivität bekannt ist, ist die reduzierte bzw. verringerte isostere Pseudopeptidbindung (Couder, et al. (1993), Int. J. Peptide Protein Res., 41: 181–184). Somit können die Aminosäuresequenzen dieser Peptide zu den Sequenzen eines NTP-Proteins identisch sein, abgesehen davon, dass eine oder mehrere Peptidbindung(en) durch eine isostere Pseudopeptidbindung ersetzt ist bzw. sind. Vorzugsweise ist die am meisten N-terminale Peptidbindung substituiert, da eine derartige Substitution Beständigkeit gegenüber Proteolyse durch Exopeptidasen, die auf den N-Terminus einwirken, verleihen würde. Die Synthese von Peptiden mit einer oder mehreren reduzierten bzw. verringerten isosteren Pseudopeptidbindungen ist auf dem Fachgebiet bekannt (Couder et al., (1993), oben zitiert). Weitere Beispiele umfassen die Einführung von Ketomethylen- oder Methylsulfidbindungen zum Ersetzen von Peptidbindungen.
  • Peptoidderivate von NTP-Peptiden stellen eine weitere Klasse von Peptidmimetika dar, die die wichtigen strukturellen Determinanten für biologische Aktivität beibehalten, jedoch die Peptidbindungen eliminieren, wodurch Beständigkeit gegenüber Proteolyse verliehen wird (Simon, et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 9367–9371). Peptoide sind Oligomere von N-substituierten Glycinen. Eine Anzahl von N-Alkylgruppen ist beschrieben worden, wobei jede der Seitenkette einer natürlichen Aminosäure entspricht (Simon, et al. (1992), oben zitiert). Einige oder alle der Aminosäuren des NTP werden durch das N-substituierte Glycin, das der ersetzten Aminosäure entspricht, ersetzt.
  • Der Begriff „reverses D-Peptid" („reverse D-peptide") bezieht sich auf ein biologisch aktives Protein oder Peptid, bestehend aus D-Aminosäuren, die in einer umgekehrten Reihenfolge, verglichen mit der L-Aminosäuresequenz eines NTP-Proteins, -Fragments, einer NTP-Variante oder eines NTP-Homologen, angeordnet sind. Somit wird der carboxyterminale Rest eines/einer L-Aminosäure-NTP-Proteins, -Fragments, -Variante oder -Homologen der Aminoterminus für das D-Aminosäurepeptid usw. Zum Beispiel wird das AD7c-NTP-Fragment, HVGQAG, GdAdQdGdVdHd, wobei Ad, Gd, Hd, Qd und Vd die D-Aminosäuren sind, die den L-Aminosäuren, A, G, H, Q bzw. V entsprechen.
  • Der Begriff „Enantiomer" bezieht sich auf ein biologisch aktives Protein oder Peptid, worin ein oder mehrere der L-Aminosäurereste in der Aminosäuresequenz eines/einer NTP-Proteins, -Fragments, -Variante oder -Homologen durch den/die entsprechenden D-Aminosäurerest(e) ersetzt ist/sind.
  • Hierin beschriebene Aminosäuren und Aminosäurereste können gemäß dem anerkannten Ein- oder Drei-Buchstaben-Code, der in der nachstehenden Tabelle angegeben ist, bezeichnet werden. Sofern nicht anders angegeben, sind diese Aminosäuren oder Reste von der natürlich vorkommenden L-Stereoisomerform. TABELLE III
    Aminosäure Ein-Buchstaben- Drei-Buchstaben-
    Symbol Symbol
    Alanin A Ala
    Arginin R Arg
    Asparagin N Asn
    Asparaginsäure D Asp
    Cystein C Cys
    Glutamin Q Gln
    Glutaminsäure E Glu
    Glycin G Gly
    Histidin H His
    Isoleucin I Ile
    Leucin L Leu
    Lysin K Lys
    Methionin M Met
    Phenylalanin F Phe
    Prolin P Pro
    Serin S Ser
    Threonin T Thr
    Tryptophan W Trp
    Tyrosin Y Tyr
    Valin V Val
  • Herstellung von NTP-Proteinen und -Fragmenten
  • NTP-Proteine (einschließlich AD7c-NTP, Fragmente, Varianten, Derivate und Homologe), die von dieser Erfindung umfasst sind, können unter Verwendung von Verfahren, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, wie DNA-Rekombinationstechnologie, Proteinsynthese und Isolierung von natürlich vorkommendem NTP und AD7c-NTP und Fragmenten und Varianten davon, hergestellt werden.
  • Ein NTP-Protein kann unter Verwendung gut bekannter Verfahren der DNA-Rekombinationstechnologie, wie jene, die in Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. [1989] und/oder Ausubel et al., Hrsg., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers Inc. and Wiley and Sons, N. Y. [1994]) angegeben sind, hergestellt werden.
  • Ein Gen oder eine cDNA, codierend für ein NTP-Protein, kann zum Beispiel durch Durchmusterung bzw. Screening einer genomischen oder cDNA-Bibliothek oder mittels PCR-Amplifikation erhalten werden. Sonden oder Primer, die zum Durchmustern der Bibliothek verwendbar sind, können, basierend auf Sequenzinformationen für andere bekannte Gene oder Genfragmente aus der gleichen oder einer verwandten Familie von Genen, wie z. B. konservierte Motive, die in anderen NTP-Proteinen gefunden werden, erzeugt werden. Zusätzlich kann, wenn ein Gen, das für ein NTP-Protein codiert, ausgehend von einer Spezies identifiziert worden ist, das gesamte Gen oder ein Teil davon als Sonde zum Identifizieren von homologen Genen aus anderen Arten verwendet werden. Die Sonden oder Primer können zum Durchmustern von cDNA-Bibliotheken aus zahlreichen Gewebequellen, bei denen angenommen wird, dass sie ein NTP-Gen exprimieren, verwendet werden. Typischerweise werden Bedingungen hoher Stringenz zum Durchmustern eingesetzt werden, um die Zahl von Falschpositiven, die aus der Durchmusterung erhalten werden, zu minimieren.
  • Ein weiteres Mittel zum Herstellen eines Gens, das für ein NTP-Protein codiert, ist die Verwendung von chemischer Synthese unter Verwendung von Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind, wie jene, die von Engels et al. (Angew. Chemie Intl. Ausg., 28: 716–734 [1989]) beschrieben werden. Diese Verfahren umfassen unter anderem Phosphotriester-, Phosphoramidit- und H-Phosphonat-Verfahren zur Nucleinsäuresynthese. Ein bevorzugtes Verfahren für eine derartige chemische Synthese ist eine Polymer-gestützte Synthese unter Verwendung von Standard-Phosphoramidit-Chemie. Typischerweise wird die DNA, die für ein NTP-Protein codiert, mehrere 100 Nucleotide lang sein. Nucleinsäuren, die größer als etwa 100 Nucleotide sind, können unter Verwendung dieser Verfahren als mehrere Fragmente synthetisiert werden. Die Fragmente können anschließend miteinander unter Bildung des Volllängen-NTP-Proteins ligiert werden. Üblicherweise wird das DNA-Fragment, das für den Aminoterminus des Proteins codiert, ein ATG besitzen, welches für einen Methioninrest codiert. Dieses Methionin kann, muss aber nicht in der reifen Form des NTP-Proteins vorhanden sein, abhängig davon, ob das Protein, das in der Wirtszelle produziert wird, für eine Sekretion bzw. Sezernierung aus dieser Zelle gedacht ist.
  • Das Gen, die cDNA oder ein Fragment davon, codierend für das NTP-Protein, kann unter Verwendung von Standard-Ligationstechniken in einem geeigneten Expressions- oder Amplifikationsvektor inseriert werden. Der Vektor wird typischerweise so ausgewählt, dass er in der speziellen eingesetzten Wirtszelle funktionell ist (d. h. der Vektor ist kompatibel mit der Wirtszellmaschinerie, so dass eine Amplifikation des Gens und/oder eine Expression des Gens auftreten kann). Das Gen, die cDNA oder ein Fragment davon, codierend für das NTP-Protein, kann in prokaryotischen, Hefe-, Insekten-(Baculovirussysteme) und/oder eukaryotischen Wirtszellen amplifiziert/exprimiert werden. Die Auswahl der Wirtszelle wird teilweise davon abhängen, ob das NTP-Protein glycosyliert und/oder phosphoryliert werden soll. Falls ja, sind Hefe-, Insekten- oder Säugerwirtszellen bevorzugt.
  • Typischerweise werden die in einer beliebigen Wirtszelle verwendeten Vektoren eine 5'-flankierende Sequenz (auch als ein „Promotor" bezeichnet) und andere Regulationselemente, sowie einen oder mehrere Enhancer, ein Replikationsstartpunkt-Element, ein Transkriptionsterminations-Element, eine vollständige Intronsequenz, enthaltend eine Donor- und Akzeptor-Spleißstelle, eine Signalpeptidsequenz, ein Ribosomenbindungsstellenelement, eine Polyadenylierungssequenz, eine Polylinker-Region zum Inserieren der Nucleinsäure, die für das zu exprimierende Polypeptid codiert, und ein selektierbares Markerelement enthalten. Jedes dieser Elemente wird nachstehend diskutiert. Gegebenenfalls kann der Vektor eine „tag"- bzw. „Markierungs"-Sequenz enthalten, d. h. ein Oligonucleotidmolekül, lokalisiert am 5'- oder 3'-Ende der NTP-Protein-codierenden Sequenz; das Oligonucleotidmolekül codiert für polyHis (wie hexa-His) oder ein anderes „tag" bzw. eine andere „Markierung", wie FLAG, HA (Hämaglutinin, Influenzavirus) oder myc, wofür im Handel erhältliche Antikörper existieren. Dieses tag ist bei Expression des Polypeptids typischerweise mit dem Polypeptid fusioniert und kann als Mittel zur Affinitätsreinigung des NTP-Proteins aus der Wirtszelle dienen. Eine Affinitätsreinigung kann z. B. mittels Säulenchromatographie unter Verwendung von Antikörpern gegen tag als eine Affinitätsmatrix bewerkstelligt werden. Gegebenenfalls kann das tag nachfolgend durch zahlrei ehe Mittel, wie z. B. unter Verwendung bestimmter Peptidasen, aus dem gereinigten NTP-Protein entfernt werden.
  • Die humane Immunglobulin-Gelenk- und Fc-Region könnten durch einen Fachmann mit entweder dem N-Terminus oder dem C-Terminus des NTP-Proteins fusioniert werden. Das so erhältliche („subsequent") Fc-Fusionsprotein könnte mittels Verwendung einer Protein A-Affinitätssäule gereinigt werden. Fc ist dafür bekannt, eine lange pharmakologische Halbwertszeit in vivo aufzuweisen und es ist festgestellt worden, dass an Fc-fusionierte Proteine eine wesentlich größere Halbwertszeit in vivo aufweisen als das nicht-fusionierte Gegenstück. Ebenso ermöglicht eine Fusion an die Fc-Region eine Dimerisierung/Multimerisierung des Moleküls, die für die Bioaktivität mancher Moleküle nützlich sein kann.
  • Die 5'-flankierende Sequenz kann homolog (d. h. aus der gleichen Art und/oder dem gleichen Stamm wie die Wirtszelle), heterolog (d. h. aus einer anderen Art bzw. Spezies als die Wirtszellspezies oder der Wirtszellstamm), hybrid (d. h. eine Kombination von 5'-flankierenden Sequenzen aus mehr als einer Quelle) oder synthetisch sein oder sie kann die native 5'-flankierende Sequenz des NTP-Proteingens sein. Somit kann die Quelle der 5'-flankierenden Sequenz ein beliebiger einzelliger prokaryotischer oder eukaryotischer Organismus, ein beliebiges Wirbeltier oder ein beliebiger wirbelloser Organismus oder eine beliebige Pflanze sein, vorausgesetzt, dass die 5'-flankierende Sequenz in der Wirtszellmaschinerie funktionell ist und durch sie aktiviert werden kann.
  • Die in den Vektoren dieser Erfindung verwendbaren 5'-flankierenden Sequenzen können durch ein beliebiges von mehreren Verfahren, die gut im Fachgebiet bekannt sind, erhalten werden. Typischerweise werden 5'-flankierende Sequenzen, die hierin außer der NTP-flankierenden Sequenz verwendbar sind, zuvor durch Kartierung und/oder durch Restriktionsendonukleaseverdau identifiziert worden sein und können somit aus der geeigneten Gewebequelle unter Verwendung geeigneter Restriktionsendonukleasen isoliert werden. In einigen Fällen kann die vollständige Nucleotidsequenz der 5'-flankierenden Sequenz bekannt sein. Hier kann die 5'-flankierende Sequenz unter Verwendung der Verfahren, die oben für die Nucleinsäuresynthese oder -klonierung beschrieben wurden, synthetisiert werden.
  • Wenn die gesamte oder ein Teil der 5'-flankierenden Sequenz bekannt ist, kann sie unter Verwendung von PCR und/oder mittels Durchmusterung einer genomischen Bibliothek mit (einem) Oligonucleotid und/oder 5'-flankierende Sequenz-Fragmenten aus der gleichen oder einer anderen Art erhalten werden.
  • Wenn die 5'-flankierende Sequenz nicht bekannt ist, kann ein Fragment einer DNA, enthaltend eine 5'-flankierende Sequenz, aus einem größeren Stück von DNA, das z. B. eine codierende Sequenz oder sogar ein anderes Gen oder andere Gene enthalten kann, isoliert werden. Die Isolation kann durch Restriktionsendonukleaseverdau unter Verwendung von einem oder mehr sorgfältig ausgewählten Enzymen zum Isolieren des geeigneten DNA-Fragments durchgeführt werden. Nach dem Verdau kann das gewünschte Fragment durch Aufreinigung an Agarosegel, eine Quiagen.RTM.-Säule oder andere Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, isoliert werden. Die Auswahl von geeigneten Enzymen zur Erreichung dieses Zweckes wird für Durchschnittsfachleute auf dem Gebiet leicht ersichtlich sein.
  • Das Replikationsstartpunkt-Element („origin of replication element”) ist typischerweise ein Teil von prokaryotischen Expressionsvektoren, die kommerziell erworben werden, und unterstützt die Amplifikation des Vektors in einer Wirtszelle. Eine Amplifikation des Vektors auf eine bestimmte Kopienzahl kann in manchen Fällen für eine optimale Expression des NTP-Proteins wichtig sein. Fall der Vektor der Wahl keine Replikationsstartstelle enthält, kann eine (solche) chemisch auf Basis einer bekannten Sequenz synthetisiert und in den Vektor ligiert werden. Das Transkriptionsterminationselement ist typischerweise 3' des Endes der NTP-Protein-codierenden Sequenz lokalisiert und dient zur Beendigung bzw. zum Terminieren der Transkription des NTP-Proteins. Üblicherweise ist das Transkriptionsterminationselement in prokaryotischen Zellen ein G-C-reiches Fragment, gefolgt von einer poly T-Sequenz. Obgleich das Element, ausgehend von einer Bibliothek, leicht kloniert werden kann oder sogar kommerziell als Teil eines Vektors erworben werden kann, kann es auch in einfacher Weise unter Verwendung von Verfahren zur Nucleinsäuresynthese, wie jene, die oben beschrieben sind, synthetisiert werden.
  • Ein geeignetes Markergen-Element codiert für ein Protein, das für das Überleben und das Wachstum einer Wirtszelle, die in einem selektiven Kulturmedium gezüchtet wird, notwendig ist. Typische Selektionsmarkergene codieren für Proteine, die (a) Resistenz gegenüber Antibiotika oder anderen Toxinen, z. B. Ampicillin, Tetracyclin oder Kanamycin für prokaryotische Wirtszellen verleihen, (b) auxotrophe Defizienzen der Zelle („complement auxotrophic deficiencies of the cell") komplementieren; oder (c) mit kritischen Nährstoffen, die nicht ausgehend von komplexen Medien verfügbar sind, versorgen. Bevorzugte selektierbare Marker sind das Kanamycrinresistenzgen, das Ampicillinresistenzgen und das Tetracyclinresistenzgen.
  • Das Ribosomenbindungselement, üblicherweise als die Shine-Dalgarno-Sequenz (Prokaryoten) oder die Kozak-Sequenz (Eukaryoten) bezeichnet, ist üblicherweise für die Initiation der Translation von mRNA nötig. Das Element ist typischerweise 3' zum Promotor und 5' zur codierenden Sequenz des zu synthetisierenden NTP-Proteins lokalisiert. Die Shine-Dalgarno-Sequenz variiert, ist jedoch typischerweise ein Polypurin (d. h. einen hohen A-G-Gehalt aufweisend). Viele Shine-Dalgarno-Sequenzen sind identifiziert worden, wobei jede davon leicht unter Verwendung von Verfahren, die oben angegeben sind, synthetisiert und in einem prokaryotischen Vektor verwendet werden kann.
  • In den Fällen, in denen es wünschenswert ist, dass das NTP-Protein aus der Wirtszelle sekretiert bzw. sezerniert wird, kann eine Signalsequenz verwendet werden, um das NTP-Protein aus der Wirtszelle, in der es synthetisiert wird, herauszuführen, und der carboxyterminale Teil des Proteins kann deletiert werden, um eine Verankerung an der Membran zu verhindern. Typischerweise wird die Signalsequenz in der codierenden Region des NTP-Gens oder der cDNA oder direkt am 5'-Ende der NTP-Gen-codierenden Region positioniert. Es sind viele Signalsequenzen identifiziert worden und eine beliebige von diesen, die in der ausgewählten Wirtszelle funktionell ist bzw. sind, kann in Verbindung mit dem NTP-Gen oder der NTP-cDNA verwendet werden. Daher kann die Signalsequenz homolog oder heterolog zum NTP-Gen oder der NTP-cDNA sein und kann homolog oder heterolog zum NTP-Gen oder zur NTP-cDNA sein. Zusätzlich kann die Signalsequenz unter Verwendung der oben angegeben Verfahren synthetisiert werden. In den meisten Fällen wird eine Sekretion bzw. Sezernierung des Polypeptids aus der Wirtszelle über das Vorhandensein eines Signalpeptids in der Entfernung des aminoterminalen Methionins aus dem Peptid resultieren.
  • In vielen Fällen wird die Transkription des NTP-Gens oder der NTP-cDNA durch das Vorhandensein von einem oder mehreren Introns im Vektor verstärkt; dies gilt insbesondere, wenn das NTP-Protein in eukaryotischen Wirtszellen, insbesondere in Säugerwirtszellen, produziert wird. Die verwendeten Introns können natürlich innerhalb des NTP-Gens auftreten, insbesondere wenn das verwendete Gen eine genomische Volllängensequenz oder ein Fragment davon ist. Wenn das Intron nicht natürlicherweise innerhalb des Gens vorkommt (wie für die meisten cDNAs), kann/können das/die Intron(s) aus einer anderen Quelle erhalten werden. Die Position des Introns hinsichtlich der flankierenden Sequenz und des NTP-Gens ist allgemein wichtig, da das Intron transkribiert werden muss, um wirksam zu sein. Somit ist, wenn das NTP-Gen, das in den Expressionsvektor inseriert ist, ein cDNA-Molekül ist, die bevorzugte Position für das Intron 3' zur Transkriptionsstartstelle und 5' zur polyA-Transkriptionsterminationssequenz. Vorzugsweise wird für NTP-cDNA das Intron oder werden die Introns auf einer Seite der cDNA oder auf der anderen (d. h. 5' oder 3') lokalisiert sein, so dass diese codierende Sequenz nicht unterbrochen wird. Ein beliebiges Intron aus einer beliebigen Quelle, einschließlich beliebiger viraler, prokaryotischer und eukaryotischer (Pflanze oder Tier) Organismen, kann in der Ausführungsform dieser Erfindung verwendet werden, vorausgesetzt, dass es mit der/den Wirtszelle(n), in die es inseriert wird, kompatibel ist. Hierin eingeschlossen sind auch synthetische Introns. Gegebenenfalls kann mehr als ein Intron im Vektor verwendet werden.
  • Wenn eines oder mehrere der oben angegebenen Elemente nicht bereits in dem zu verwendenden Vektor vorhanden ist/sind, kann es/können sie individuell erhalten und in den Vektor ligiert werden. Verfahren zum Erhalten von jedem der Elemente sind Fachleuten gut bekannt und sind mit den oben angegebenen Verfahren vergleichbar (d. h. Synthese der DNA, Bibliotheksdurchmusterung und dergleichen).
  • Die zur Ausführung dieser Erfindung verwendeten endgültigen Vektoren werden typischerweise ausgehend von Ausgangsvektoren, wie einem im Handel erhältlichen Vektor, konstruiert. Derartige Vektoren können, müssen aber nicht, einige der in dem vervollständigten Vektor eingeschlossenem Elemente enthalten. Falls keines der gewünschten Elemente im Ausgangsvektor vorhanden ist, kann jedes Element individuell in den Vektor ligiert werden, indem der Vektor mit der/den geeignete(n) Restriktionsendonuklease(n) geschnitten wird, so dass die Enden des einzuligierenden Elements und die Enden des Vektors zur Ligation kompatibel sind. In einigen Fällen kann es nötig sein, die miteinander zu ligierenden Enden „glatt" bzw. „stumpf" („blunt") zu machen, um eine zufrieden stellende Ligation zu erhalten. Das Stumpf- bzw. Glattmachen wird bewerkstelligt, indem zunächst in „kohäsiven Enden" bzw. „sticky ends” unter Verwendung von Klenow-DNA-Polymerase oder T4-DNA-Polymerase in Gegenwart aller vier Nucleotide aufgefüllt wird. Diese Verfahrensweise ist auf dem Fachgebiet gut bekannt und wird z. B. in Sambrook et al., supra, beschrieben. Alternativ können zwei oder mehr der in den Vektor zu inserierenden Elemente zunächst miteinander ligiert werden (falls sie zueinander benachbart zu positionieren sind) und dann in den Vektor ligiert werden.
  • Ein weiteres Verfahren zum Konstruieren des Vektors (ist es), alle Ligationen der verschiedenen Elemente gleichzeitig in einem Reaktionsgemisch durchzuführen. Hierbei werden viele Nonsense- oder nicht-funktionelle Vektoren aufgrund ungeeigneter Ligation oder Insertion der Elemente erzeugt werden, jedoch kann der funktionelle Vektor mittels Restriktionsendonukleaseverdau identifiziert und ausgewählt werden.
  • Bevorzugte Vektoren zur Durchführung der Erfindung sind jene, die mit Bakterien-, Insekten- und Säugerwirtszellen kompatibel sind. Derartige Vektoren umfassen unter anderem pCRII, pCR3 und pcDNA3.1 (Invitrogen Company, San Diego, Kalif.), pBSII (Stratagene Company, La Jolla Kalif.), pET15b (Novagen, Madison, Wis.), PGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, N. J.), pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, Kalif.), pETL, (BlueBacII; Invitrogen) und pFastBacDual (Gibco/BRL, Grand Island, N. Y.).
  • Nachdem der Vektor konstruiert wurde und ein Nucleinsäuremolekül, codierend für ein Volllängen- oder trunkiertes NTP-Protein, in die geeignete Stelle des Vektors inseriert worden ist, kann der vervollständigte Vektor in eine geeignete Wirtszelle zur Amplifikation und/oder Polypeptidexpression inseriert bzw. eingeführt werden. Wirtszellen können prokaryotische Wirtszellen (wie E. coli) oder eukaryotische Wirtszellen (wie eine Hefezelle, eine Insektenzelle oder eine Wirbeltierzelle) sein. Die Wirtszelle kann, bei Kultur unter geeigneten Bedingungen, NTP-Protein synthetisieren, welches nachfolgend aus dem Kulturmedium (falls es die Wirtszelle direkt in das Medium sekretiert) oder direkt aus der es produzierenden Zelle (falls es nicht sekretiert wird) gewonnen werden kann.
  • Nach Gewinnung kann das NTP-Protein unter Verwendung von Verfahren, wie Chromatographie an Molekularsieben, Affinitätschromatographie und dergleichen, gereinigt werden. Die Auswahl der Wirtszelle zur NTP-Proteinproduktion wird teilweise davon abhängen, ob das NTP-Protein glycosyliert oder phosphoryliert werden soll (in welchem Falle eukaryotische Wirtszellen bevorzugt sind) und von der Weise, auf die die Wirtszelle dazu befähigt ist, das Protein zu seiner nativen Tertiärstruktur zu „falten" (z. B. geeignete Orientierung von Disulfidbrücken usw.), so dass biologisch aktives Protein durch das NTP-Protein, das biologische Aktivität besitzt, hergestellt wird. Das NTP-Protein kann nach Synthese unter Verwendung geeigneter chemischer Bedingungen „gefaltet" werden, wie untenstehend diskuktiert. Geeignete Zellen oder Zelllinien können Säugerzellen, wie chinesischer Hamster-Quarzellen (CHO), humane embryonale Nieren-(HEK)293- oder -293T-Zellen oder 3T3-Zellen, sein. Die Auswahl geeigneter Säugerwirtszellen und geeigneter Verfahren für Transformation, Kultur, Amplifikation, Durchmusterung und Produktproduktion und Aufreinigung sind auf dem Fachgebiet bekannt. Weitere geeignete Säugerzelllinien sind die Affen-COS-1- und -COS-7-Zelllinien und die CV-1-Zelllinie. Weitere beispielhafte Säugerwirtszellen umfassen Primatenzelllinien und Nagerzelllinien, einschließlich transformierter Zelllinien. Normale diploide Zellen, Zellstämme, die aus der in vitro-Kultur von primärem Gewebe stammen, sowie primäre Explantate sind ebenso geeignet. Kandidatenzellen können hinsichtlich des Selektionsgens gentypisch defizient sein oder können ein dominant wirkendes Selektionsgen enthalten. Geeignete Säugerzelllinien umfassen, ohne Beschränkung darauf, Maus-Neuroblastom-N2A-Zellen, HeLa-, Maus-L-929-Zellen, 3T3-Linien, abgeleitet von Swiss-, Balb-c- oder NIH-Mäusen, BHK- oder HaK-Hamsterzelllinien.
  • Bakterienzellen sind als Wirtszellen für die vorliegende Erfindung gleichermaßen geeignet. Zum Beispiel sind verschiedene Stämme von E. coli (z. B. HB101, DH5.alpha., DH10 und MC1061) als Wirtszellen auf dem Gebiet der Biotechnologie gut bekannt. Verschiedene Stämme von B. subtilis, Pseudomonas spp., andere Bacillus spp., Streptomyces spp. und dergleichen, können ebenso in diesem Verfahren eingesetzt werden. Viele Stämme von Hefezellen, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, sind ebenso als Wirtszellen zur Expression der Polypeptide der vorliegenden Erfindung verfügbar.
  • Zusätzlich können, wenn gewünscht, Insektenzellsysteme in den Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Derartige Systeme sind z. B. beschrieben in Kitts et al. (Biotechniques, 14: 810–817 [1993]), Lucklow (Curr. Opin. Biotechnol., 4: 564–572 [1993]) und Lucklow et al. (J. Virol., 67: 4566–4579 [1993]). Bevorzugte Insektenzellen sind Sf-9 und Hi5 (Invitrogen, Carlsbad. Kalif.).
  • Insertion bzw. Einführung (auch bezeichnet als „Transformation" oder „Transfektion") des Vektors in die ausgewählte Wirtszelle kann unter Verwendung von derartigen Verfahren, wie das Calciumchlorid-, Elektroporations-, Mikroinjektions-, Lipofectin- oder das DEAE-Dextran-Verfahren, bewerkstelligt werden. Das ausgewählte Verfahren wird zum Teil eine Funktion des Typs der zu verwendenden Wirtszelle sein. Diese Verfahren und andere geeignete Verfahren sind Fachleuten gut bekannt und sind z. B. in Sambrook et al., supra, angegeben.
  • Die den Vektor enthaltenden Wirtszellen (d. h. transformiert oder transfiziert) können unter Verwendung von Standardmedien, die dem Fachmann gut bekannt sind, kultiviert werden. Die Medien werden üblicherweise alle Nährstoffe, die für das Wachstum und Überleben der Zellen notwendig sind, enthalten. Geeignete Medien zum Kultivieren von E. coli-Zellen sind z. B. Luria-Bouillon (LB) und/oder „Terrific Broth" (TB). Geeignete Medien zum Kultivieren eukaryotischer Zellen sind RPMI 1640, MEM, DMEM, wobei alle davon mit Serum und/oder Wachstumsfaktoren, wie von der speziellen Zelllinie, die kultiviert wird, benötigt, supplementiert werden können. Ein geeignetes Medium für Insektenkulturen ist Grace-Medium, supple mentiert mit Yeastolate, Lactalbuminhydrolysat und/oder fötalem Kälberserum, nach Bedarf. Typischerweise wird ein Antibiotikum oder eine andere Verbindung, die für selektives Wachstum der transformierten Zellen alleine nützlich ist, als ein Supplement bzw. eine Ergänzung zum Medium gegeben. Die zu verwendende Verbindung wird durch das selektierbare Markerelement, das auf dem Plasmid, mit dem die Wirtszelle transformiert wurde, vorhanden ist, vorgegeben. Zum Beispiel wird die zu dem Kulturmedium gegebene Verbindung Kanamycin sein, wenn das selektierbare Markerelement Kanamycinresistenz ist.
  • Die Menge an in der Wirtszelle produziertem NTP-Protein kann unter Verwendung von Standardverfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, bewertet bzw. evaluiert werden. Derartige Verfahren umfassen, ohne Beschränkung darauf, Western Blot-Analyse, SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese, nicht-denaturierende Gelelektrophorese, HPLC-Abtrennung, Immunpräzipitation und/oder Aktivitätsassays, wie DNA-Bindungs-Gelshift-Assays.
  • Falls das NTP-Protein zur Sekretion aus den Wirtszellen konzipiert worden ist, kann der Hauptteil des NTP-Proteins im Zellkulturmedium gefunden werden. Auf diese Weise hergestellte Proteine werden typischerweise kein aminoterminales Methionin besitzen, da es während der Sekretion aus der Zelle entfernt wird. Falls das NTP-Protein jedoch nicht aus der Wirtszelle sekretiert wird, wird es im Cytoplasma und/oder dem Kern (bei eukaryotischen Wirtszellen) oder im Cytosol (bei Gram-negativen bakteriellen Wirtszellen) vorliegen und kann ein aminoterminales Methionin aufweisen.
  • Bei NTP-Protein, das im Wirtszellcytoplasma und/oder Nucleus sitzt bzw. lokalisiert ist, werden die Wirtszellen typischerweise zunächst mechanisch oder mit Detergens aufgebrochen, um die intracellulären Inhalte in eine gepufferte Lösung freizusetzen. NTP-Protein kann anschließend aus dieser Lösung isoliert werden.
  • Die Aufreinigung von NTP-Protein aus einer Lösung kann unter Verwendung einer Vielfalt von Techniken bewerkstelligt werden. Falls das Protein so synthetisiert worden ist, dass es ein tag, wie hexaHistidin (NTP-Protein/hexaHis) oder ein anderes kleines Peptid, wie FLAG (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI) oder Calmodulin-Bindungspeptid (Stratagene, La Jolla, CA), entweder am Carboxy- oder Aminoterminus, enthält, kann es im Wesentlichen in einem einstufigen Verfahren gereinigt werden, indem die Lösung durch eine Affinitätssäule geführt wird, wobei die Säulenmatrix eine hohe Affinität für das tag oder für das Protein direkt hat (d. h. ein monoklonaler Antikörper, der das NTP-Protein spezifisch erkennt). Zum Beispiel bindet Polyhistidin mit großer Aktivität und Spezifität an Nickel, Zinn und Kobalt, so dass eine Affinitätschromatographie unter Verwendung immobilisierter Metallionen, wobei ein Nickel-basiertes Affinitätsharz (wie im QIA-Expresssystem von Qiagen oder im Xpress-System von Invitrogen verwendet) oder ein Kobalt-basiertes Affinitätsharz (wie im Talon-System von BD Biosciences-CLONTECH verwendet) zur Aufreinigung von NTP-Protein/polyHis verwendet werden kann. (Siehe z. B. Ausubel et al., Hrsg., Current Protocols in Molecular Biology, Abschnitt 10.11.8, John Wiley & Sons, New York [1993]).
  • Wenn das NTP-Protein ohne ein angeheftetes tag hergestellt wird, und keine Antikörper verfügbar sind, können andere Verfahrensweisen der Reinigung verwendet werden. Derartige Verfahrensweisen umfassen, ohne Beschränkung darauf, Ionenaustauschchromatographie, Hydroxyapatitchromatographie, hydrophobe Interaktionschromatographie, Molekualrsiebchromatographie, HPLC, native Gelelektrophorese in Kombination mit Gelelution und präparative isoelektrische Fokussierung („Isoprime"-Gerät/Technik, Hoefer Scientific). Gegebenfalls können zwei oder mehr dieser Techniken kombiniert werden, um eine erhöhte Reinheit zu erreichen.
  • Es wird vorweggenommen, dass das NTP-Protein hauptsächlich intrazellulär gefunden wird, das intrazelluläre Material (einschließlich Einschlusskörpem bei Gram-negativen Bakterien) kann aus der Wirtszelle unter Verwendung einer beliebigen Standardtechnik, die dem Fachmann bekannt ist, extrahiert werden. Zum Beispiel können die Wirtszellen lysiert werden, um die Inhalte des Periplasmas/Cytoplasmas mittels French-Presse, Homogenisierung und/oder (Ultra)Schallbehandlung, gefolgt von Zentrifugation, freizusetzen. Falls das NTP-Protein Einschlusskörper im Cytosol gebildet hat, können die Einschlusskörper häufig an die inneren und/oder äußeren Zellmembranen binden und werden somit hauptsächlich im Pelletmaterial nach Zentrifugation gefunden werden. Das Pelletmaterial kann dann bei extremen pH-Werten oder mit einem chaotropen Mittel, wie einem Detergens, Guanidin, Guanidinderivaten, Harnstoff oder Harnstoffderivaten, in Gegenwart eines Reduktionsmittels wie Dithiothreitol bei alkalischem pH oder Tris-Carboxyethylphosphin bei saurem pH behandelt werden, um die Einschlusskörper freizusetzen, abzulösen („break apart”) und zu solubilisieren. Das NTP-Protein ist nun in löslicher Form und kann anschließend unter Verwendung von Gelelektrophorese, Immunpräzipitation oder dergleichen analysiert werden. Falls es gewünscht ist, das NTP-Protein zu isolieren, kann eine Isolation unter Verwendung von Standardverfahren, wie jene, die untenstehend und in Marston et al. (Meth. Enz., 182: 264–275 [1990]) angegeben sind, bewerkstelligt werden. In manchen Fällen kann das NTP-Protein bei bzw. nach Isolation nicht biologisch aktiv sein. Zahlreiche Verfahren zur „Rückfaltung" oder Umwandlung des Polypeptids in dessen Tertiärstruktur und Erzeugung von Disulfidbrücken können verwendet werden, um die biologische Aktivität wiederherzustellen. Derartige Verfahren umfassen das Aussetzen des solubilisierten Polypeptids gegenüber einem pH üblicherweise oberhalb von 7 und in Gegenwart einer bestimmten Konzentration eines chaotropen Mittels. Die Auswahl des chaotropen Mittels ist sehr ähnlich zu den Wahlen, die für ein die Solubilisierung von Einschlusskörpern getroffen werden, jedoch üblicherweise bei einer geringeren Konzentration und es ist nicht notwendigerweise das gleiche chaotrope Mittel, wie das, das zur Solubilisierung verwendet wurde. In den meisten Fällen wird die Rückfaltungs/Oxidationslösung auch ein Reduktionsmittel oder das Reduktionsmittel plus dessen oxidierte Form in einem spezifischen Verhältnis zum Erzeugen eines bestimmten Redoxpotentials enthalten, um das Auftreten von Disulfid-Shuffling bei der Bildung des/der Cysteinbrücke(n) des Proteins zu ermöglichen. Einige der üblicherweise verwendeten Redox paare umfassen Cystein/Cystamin, Glutathion(GSH)/Dithiobis-GSH, Kupfer(II)-chlorid, Dithiotreitol(DTT)/Dithian-DTT, 2-Mercaptoethanol(bME)/Dithio-b(ME). In vielen Fällen ist ein Cosolvens nötig, um die Wirksamkeit der Rückfaltung zu erhöhen, und die üblicheren Reagenzien, die zu diesem Zwecke verwendet werden, umfassen Glycerin, Polyethylenglycol verschiedener Molekulargewichte und Arginin.
  • Falls NTP-Proteineinschlusskörper nicht zu einem bedeutenden Grad in der Wirtszelle gebildet werden, wird das NTP-Protein hauptsächlich im Überstand nach Zentrifugation des Zellhomogenats gefunden werden und das NTP-Protein kann aus dem Überstand isoliert werden, wobei Verfahren, wie jene, die oben angegeben sind, verwendet werden.
  • In jenen Situationen, in denen es bevorzugt ist, das NTP-Protein teilweise oder vollständig zu isolieren, kann eine Reinigung unter Verwendung von Standardverfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind, bewerkstelligt werden. Derartige Verfahren umfassen, ohne Beschränkung, Trennung mittels Elektrophorese, gefolgt von Elektroelution, verschiedene Typen von Chromatographie (Immunoaffinität, Molekularsieb und/oder Ionenaustausch) und/oder Hochdruckflüssigkeitschromatographie. In einigen Fällen kann es bevorzugt sein, mehr als eines dieser Verfahren für eine vollständige Reinigung zu verwenden.
  • Zusätzlich zur Herstellung und Reinigung von NTP-Protein unter Verwendung von DNA-Rekombinationstechniken können NTP-Proteine und deren Derivate mittels chemischer Syntheseverfahren (wie zum Beispiel Festphasen-Peptidsynthese) hergestellt werden, wobei Techniken verwendet werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, wie jene, die von Merrifield et al. (J. Am. Chem. Soc., 85: 2149 [1963]), Houghten et al. (Proc Natl Acad. Sci. USA, 82: 5132 [1985]) und Stewart und Young (Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, III. [1984]) angegeben werden. Derartige Polypeptide können mit einem Methionin oder ohne ein Methionin am Aminoterminus synthetisiert werden. Chemisch synthetisierte NTP-Proteine können oxidiert werden, wobei Verfahren, die in diesen Referenzen zur Bildung von Disulfidbrücken angegeben sind, verwendet werden. Es wird erwartet, dass die NTP-Proteine eine biologische Aktivität haben, die mit NTP-Proteinen, die rekombinant produziert oder aus natürlichen Quellen gereinigt wurden, vergleichbar ist, und somit austauschbar mit rekombinantem oder natürlichem NTP-Protein verwendet werden können.
  • Chemisch modifizierte NTP-Proteinzusammensetzungen, in denen das NTP-Protein mit einem Polymer verknüpft ist, sind in den Rahmen der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Das ausgewählte Polymer ist typischerweise wasserlöslich, so dass das Protein, an das es angeheftet ist, in einer wässrigen Umgebung, wie einer physiologischen Umgebung, nicht präzipitiert. Das ausgewählte Polymer ist üblicherweise so modifiziert, dass es eine einzelne reaktive Gruppe, wie einen aktiven Ester zur Acylierung oder ein Aldehyd zur Alkylierung, aufweist, so dass der Grad der Polymerisierung kontrolliert werden kann, wie in den vorliegenden Verfahren berücksichtigt. Das Polymer kann von beliebigem Molekulargewicht sein und kann verzweigt oder unverzweigt sein. In den Rahmen von NTP-Proteinpolymeren ist ein Gemisch von Polymeren eingeschlossen.
  • In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, Nucleinsäure- und/oder Aminosäurevarianten der natürlich vorkommenden NTP-Proteine herzustellen. Nucleinsäurevarianten können hergestellt werden unter Verwendung von ortsspezifischer bzw. ortsgerichteter Mutagenese, PCR-Amplifikation oder anderen geeigneten Verfahren, wobei der/die Primer die gewünschten Punktmutationen aufweist/aufweisen (siehe Sambrook et al., supra, und Ausubel et al., supra, für Beschreibungen von Mutagenesetechniken). Eine chemische Synthese unter Verwendung von Methoden, die von Engels et al., supra, beschrieben werden, kann auch zum Herstellen derartiger Varianten verwendet werden. Andere Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, können ebenso verwendet werden.
  • Bevorzugte Nucleinsäurevarianten sind jene, die Nucleotidsubstitutionen, die der Codonpräferenz in der Wirtszelle, die zum Produzieren des NTP-Proteins verwendet werden soll, Rechnung tragen, enthalten. Eine derartige „Codonoptimierung" kann über Computeralgorithmen („computer algorithers"), die Codonhäufigkeitstabellen, wie „Ecohigh.Cod" für die Codonpräferenz von hochexprimierten bakteriellen Genen enthalten, wie durch das „University of Wisconon”-Paket Version 9.0, Genetics Computer Group, Madison, Wis., bereitgestellt, bestimmt werden. Andere verwendbare Codonhäufigkeitstabellen umfassen „Celegans_high.cod", „Celegans_low.cod", „Drosophila_high.cod", „Human_high.cod", „Maize_high.cod" und „Yeast_high.cod". Andere bevorzugte Varianten sind jene, die für konservative Aminosäureänderungen, wie oben beschrieben (z. B. worin die Ladung oder Polarität der natürlich vorkommenden Aminosäureseitenkette nicht wesentlich durch Substitution mit einer verschiedenen Aminosäure verändert wird), im Vergleich zum Wildtyp codieren und/oder jene, die dazu konzipiert sind, entweder (eine) neue Glycosylierungs- und/oder Phosphorylierungsstelle(n) zu erzeugen, oder jene, die dazu konzipiert sind, (eine) bestehende Glycosylierungs- und/oder Phosphorylierungsstelle(n) zu deletieren.
  • NTP-Fragmente, -Homologe, -Varianten, -Derivate und Salze davon können unter Verwendung von herkömmlichen Peptidsynthesetechniken, die einem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet bekannt sind, hergestellt werden. Diese Techniken umfassen chemische Kupplungsverfahren (vgl. Wunsch, E.: „Methoden der organischen Chemie", Bd. 15, Band 1 + 2, Synthese von Peptiden, Thieme Verlag, Stuttgart (1974), und Barrang, G.; Marrifield, R. B.: „The Peptides", Hrsg. E. Gross, J. Meienhofer, Bd. 2, Kapitel 1, S. 1–284, Academic Press (1980)), enzymatische Kupplungsverfahren (vgl. Widmer, F., Johansen, J. T., Carlsberg Res. Commun., Bd. 44, S. 37–46 (1979) und Kullmann, W.: „Enzymatic Peptide Synthesis", CRC Press Inc. Boca Raton, Fla. (1987) und Widmer F., Johansen, J. T. in „Synthetic Peptides in Biology and Medicines; Hrsg. Alitalo, K., Partanen, P., Vatieri, A., S. 79–86, Elsevier, Amsterdam (1985)) oder eine Kombination von chemischen und enzymatischen Verfahren, falls dies für die Prozessgestaltung und -ökonomie vorteilhaft ist. Fachleute auf dem Gebiet sind dazu fähig, die Peptidse quenz des NTP-Proteins unter Herstellung eines Homologen mit der gleichen oder ähnlichen biologischen Aktivität (Bioaktivität) wie das ursprüngliche oder natürliche NTP-Protein zu variieren.
  • Es bestehen deutliche Vorteile für die bzw. bei der Verwendung eines Mimetikums eines gegebenen NTP-Proteins anstelle des Proteins selbst, da Proteine üblicherweise zwei unerwünschte Eigenschaften aufweisen: (1) schlechte Bioverfügbarkeit und (2) kurze Wirkungsdauer. Peptidmimetika bieten einen Weg zur Umgehung dieser zwei Haupthindernisse, da die betreffenden Moleküle klein genug sind, um sowohl in weiterem Umfang verfügbar zu sein, als auch um eine lange Wirkungsdauer zu haben. Ferner sind Peptidmimetika viel günstiger zu produzieren als Proteine und Peptide. Schließlich gibt es Schwierigkeiten, die mit der Stabilität, Lagerung und Immunreaktivität bei Proteinen und Peptiden zusammenhängen, die bei Peptidmimetika nicht angetroffen werden.
  • Somit finden die oben beschriebenen NTP-Proteine Verwendung in der Entwicklung derartiger kleiner chemischer Verbindungen mit ähnlichen biologischen Aktivitäten und daher mit ähnlicher therapeutischer Verwendbarkeit. Peptidmimetika von NTP-Proteinen können unter Verwendung von Techniken der kombinatorischen Chemie und anderer Techniken, die auf dem Fachgebiet bekannt sind (siehe z. B. Proceedings of the 20th European Paptide Symposium, Hrsg. G. Jung, E. Bayer, S. 289–336, und Referenzen darin), entwickelt werden.
  • Beispiele für Verfahren zum strukturellen Modifizieren eines Peptids, bekannt auf dem Fachgebiet zum Erzeugen eines Peptidmimetikums umfassen, die Inversion von chiralen Zentren des Rückgrats, was zu D-Aminosäurerest-Strukturen führt, die insbesondere am Endterminus zu erhöhter Stabilität hinsichtlich eines proteolytischen Abbaus führen können, ohne die Aktivität nachteilig zu beeinflussen. Ein Beispiel wird in der Veröffentlichung „Tritriated D-ala.sup.1-Peptide T Binding", Smith C. S. et al., Drug Development Res. 15, S. 371–379 (1988), gegeben.
  • Ein zweites Verfahren ist die Änderung einer cyclischen Struktur hinsichtlich Stabilität, wie N-zu-C-Imid- und -Lactam-Zwischenketten (Ede et al. in Smith und Rivier (Hrsg.) „Peptides: Chemistry and Biology", Escom, Leiden (1991), S. 268–270). Ein Beispiel dafür sind konformationell beschränkte Thymopentin-ähnliche Verbindungen, wie jene, die im US-Patent Nr. 4,457,489 (1985), Goldstein, G. et al., offenbart sind.
  • Ein drittes Verfahren besteht darin, Peptidbindungen im NTP-Peptid durch Pseudopeptidbindungen, die Beständigkeit gegenüber Proteolyse verleihen, zu substituieren bzw. zu ersetzen. Eine Reihe von Pseudopeptidbindungen, die die Peptidstruktur und die biologische Aktivität allgemein nicht beeinflussen, ist beschrieben worden. Ein Beispiel für die Herangehensweise ist es, retro-inverso-Pseudopeptidbindungen zu substituieren („Biologically active retroinverso analogues of thymopentin", Sisto A. et al. in Rivier, J. E. und Marshall, G. R. (Hrsg.) „Peptides, Chemistry, Structure and Biology", Escom, Leiden (1990), S. 722–773) und Dalpozzo, et al. (1993), Int. J. Peptide Protein Res., 41: 561–566). Gemäß dieser Modifikation können die Ami nosäuresequenzen der Peptide identisch zu den Sequenzen der oben beschriebenen NTP-Peptide sein, abgesehen davon, dass eine oder mehrere der Peptidbindungen durch eine retro-inverso-Pseudopeptidbindung ersetzt sind. Vorzugsweise wird die am meisten N-terminale Peptidbindung substituiert, da eine derartige Substitution Beständigkeit gegenüber Proteolyse durch Exopeptidasen, die auf den N-Terminus einwirken, verleihen wird.
  • Die Synthese von Peptiden mit einer oder mehreren reduzierten retro-inverso-Pseudopeptidbindungen ist auf dem Fachgebiet bekannt (Sisto (1990) und Dalpozzo, et al. (1993), oben zitiert). Somit können Peptidbindungen durch Nicht-Peptidbindungen ersetzt werden, die es dem Peptidmimetikum ermöglichen, eine zum ursprünglichen Peptid ähnliche Struktur und daher biologische Aktivität einzunehmen. Weitere Modifikationen können auch durch Ersetzung chemischer Gruppen der Aminosäuren durch andere chemische Gruppen in ähnlicher Struktur hergestellt werden. Eine weitere geeignete Pseudopeptidbindung, die dafür bekannt ist, die Stabilität gegenüber enzymatischer Spaltung bei keinem oder geringem Verlust an biologischer Aktivität zu erhöhen, ist die reduzierte bzw. verringerte isostere Pseudopeptidbindung (Couder, et al. (1993), Int. J. Peptide Protein Res., 41: 181–184). Daher können die Aminosäuresequenzen dieser Peptide zu den Sequenzen eines NTP-Peptids identisch sein, abgesehen davon, dass eine oder mehrere der Peptidbindungen durch eine isostere Pseudopeptidbindung ersetzt ist/sind. Vorzugsweise wird die am meisten endterminale Peptidbindung substituiert, da eine derartige Substitution Beständigkeit gegenüber Proteolyse durch Exopeptidasen, die auf den Endterminus einwirken, verleihen würde. Die Synthese von Peptiden mit einer oder mehreren reduzierten isosteren Pseudopeptidbindungen ist auf dem Fachgebiet bekannt (Couder et al. (1993), oben zitiert). Andere Beispiele umfassen die Einführung von Ketomethylen- oder Methylsulfidbindungen zum Ersetzen von Peptidbindungen.
  • Peptoidderivate von NTP-Peptiden stellen eine weitere Klasse von Peptidmimetika dar, die die wichtigen strukturellen Determinanten für biologische Aktivität beibehalten, jedoch die Peptidbindungen eliminieren, wodurch Beständigkeit gegenüber Proteolyse verliehen wird (Simon et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 9367–9371). Peptoide sind Oligomere von N-substituierten Glycinen. Eine Anzahl von N-Alkylgruppen ist beschrieben worden, wobei jede der Seitenkette einer natürlichen Aminosäure entspricht (Simon, et al. (1992), oben zitiert). Einige oder alle der Aminosäuren des NTPs werden durch das N-subsitutierte Glycin, das der ersetzten Aminosäure entspricht, ersetzt.
  • Die Entwicklung von Peptidmimetika kann durch Bestimmung der Tertiärstruktur des ursprünglichen NTP-Peptids mittels NMR-Spektroskopie, Kristallographie und/oder computerunterstützter Molekülmodellierung unterstützt werden. Diese Techniken unterstützen die Entwicklung von neuen Zusammensetzungen höherer Wirksamkeit bzw. Potenz und/oder größerer Bioverfügbarkeit und/oder größerer Stabilität als das ursprüngliche Peptid (Denn (1994), BioEssays, 16: 683–687; Cohen und Shatzmiller (1993), J. Mol. Graph., 11: 166–173; Wiley und Rich (1993), Med. Res. Rev., 13: 327–384; Moore (1994), Trends Pharmacol. Sci., 15: 124–129; Hruby (1993), Biopolymers, 33: 1073–1082; Bugg et al., (1993), Sci. Am., 269: 92–98).
  • Sobald eine potentielle peptidmimetische Verbindung identifiziert ist, kann sie synthetisiert und getestet werden, wobei die Verfahren, die in den untenstehenden Beispielen dargelegt sind, zur Beurteilung ihrer Aktivität verwendet werden. Die mittels der obigen Verfahrens erhaltenen peptidmimetischen Verbindungen mit der biologischen Aktivität der NTP-Peptide und (dazu) ähnlicher dreidimensionaler Struktur, sind von dieser Erfindung umfasst. Es wird für Fachleute auf dem Gebiet leicht ersichtlich sein, dass ein Peptidmimetikum ausgehend von einem beliebigen der NTP-Peptide, das eine oder mehrere der oben beschriebenen Modifikationen trägt, erzeugt werden kann. Es wird darüber hinaus ersichtlich sein, dass die Peptidmimetika dieser Erfindung ferner zur Entwicklung von sogar noch wirksameren nicht-peptidischen Verbindungen verwendet werden können, zusätzlich zu ihrer Brauchbarkeit als therapeutische Verbindungen.
  • Zu behandelnde Zustände
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Anwendung einer therapeutisch effektiven Menge eines Neurofilamentproteins zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung von Tumoren. Die zu behandelnden Tumore können gutartige oder bösartige Tumore sein, z. B. Tumore von Lunge, Brust, Magen, Pancreas, Prostata, Blase, Knochen, Ovarium bzw. Eierstock, Haut, Niere, Sinus, Dickdarm, Darm, Magen, Rektum, Speiseröhre, Blut, des Gehirns und von dessen Abdeckungen, des Rückenmarks und von dessen Abdeckungen, von Muskel, Bindegewebe, Parathyroid bzw. Nebenschilddrüse, Thyroid bzw. Schilddrüse, Gebärmutter, Hoden, Hypophyse, Fortpflanzungsorganen, Leber, Blase, Auge, Ohr, Nase, Hals, Mund, Lymphknoten und Lymphsystem und anderen Organen.
  • Wie hierin verwendet soll der Begriff „bösartiger Tumor" alle Formen von humanen Karzinomen, Sarkomen und Melanomen umfassen, die in schlecht bzw. schwach differenzierten, mäßig differenzierten und gut differenzierten Formen auftreten.
  • Diese Erfindung stillt ein Bedürfnis im Fachgebiet an Zusammensetzungen, die gutartige Tumore bei geringerem Risiko und weniger der unerwünschten Nebenwirkungen eines chirurgischen Eingriffs entfernen können. Eine Zusammensetzung zur Entfernung gutartiger Tumore in chirurgisch gefährlichen Bereichen, wie in Positionen tief im Körper (z. B. Hirn, Herz, Lunge und andere) wird besonders benötigt.
  • Die Zusammensetzung zur Behandlung von Tumoren kann in Verbindung mit herkömmlichen Verfahren zur Behandlung derartiger Zustände, wie chirurgischer Entfernung, Chemotherapie und Bestrahlung, verwendet werden. NTP kann vor, während oder nach derartigen herkömmlichen Behandlungen verabreicht werden.
  • NTP-Zusammensetzungen
  • Die Verwendung von NTP-Proteinen zur Herstellung einer Zusammensetzung ist innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung. Derartige Zusammensetzungen können eine the rapeutisch effektive Menge des NTP-Proteins im Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen. Das Trägermaterial kann Wasser für Injektionszwecke, vorzugsweise supplementiert mit anderen Materialien, die in Lösungen zur Verabreichung an Säuger üblich sind, sein. Typischerweise wird ein NTP-Protein zur therapeutischen Verwendung in Form einer Zusammensetzung, umfassend gereinigtes NTP-Protein in Verbindung mit einem oder mehreren physiologisch verträglichen Trägern, Exzipientien oder Verdünnungsmitteln, verabreicht werden. Neutral gepufferte Salzlösung oder Salzlösung, gemischt mit Serumalbumin, sind beispielhafte geeignete Träger. Vorzugsweise wird das Produkt als ein Lyophilisat formuliert, wobei geeignete Exzipientien (z. B. Saccharose) verwendet werden. Andere Standardträger, -verdünnungsmittel und -exzipientien können nach Wunsch eingeschlossen werden. Andere beispielhafte Zusammensetzungen umfassen Trispuffer mit etwa pH 7,0–8,5 oder Acetatpuffer mit etwa pH 4,0–5,5, die ferner Sorbit oder einen geeigneten Ersatz dafür einschließen können.
  • Die Anwendung von NTP-Proteinen, konjugiert oder verbunden bzw. verknüpft oder gebunden an einen Antikörper, ein Antikörperfragment oder ein antikörperähnliches Molekül oder ein Molekül mit einer hohen Affinität gegenüber einem spezifischen Tumormarker, wie ein Zellrezeptor, ein Signalpeptid oder überexprimiertes Enzym, zum Targetieren des Tumors ist ebenfalls vom Rahmen der Erfindung umfasst. Der Antikörper, das Antikörperfragment, das antikörperähnliche Molekül oder das Molekül mit hoher Affinität gegenüber einem spezifischen Tumormarker wird verwendet, um das NTP-Proteinkonjugat zu einem spezifischen zellulären oder Gewebeziel zu targetieren. Zum Beispiel kann ein Tumor mit einem unterscheidungskräftigen bzw. charakteristischen Oberflächenantigen oder exprimierten Antigen durch den Antikörper, das Antikörperfragment oder das antikörperähnliche bindende Molekül targetiert werden und die Tumorzellen können durch das NTP-Protein abgetötet werden. Eine derartige Herangehensweise unter Anwendung von Antikörper-Targetierung hat die erwarteten Vorteile der Verringerung der Dosierung, der Erhöhung der Wahrscheinlichkeit der Bindung an die und der Aufnahme durch die Zielzellen und der erhöhten Anwendbarkeit zum Targetieren und Behandeln von metastatischen bzw. metastasierenden Tumoren und von Tumoren mikroskopischer Größe.
  • Diese Erfindung umfasst auch die Anwendung von NTP-Proteinen, konjugiert oder verbunden bzw. verknüpft oder gebunden an ein Protein oder anderes Molekül zur Bildung einer Zusammensetzung, die bei Spaltung an oder nahe der/den Stelle(n) der Tumor- oder anderer unerwünschter Zellen durch ein tumor- oder ortsspezifisches Enzym oder eine Protease oder durch ein Antikörperkonjugat, das einen Tumor targetiert, das NTP-Protein an oder nahe der/den Stelle(n) der Tumor- oder anderer unerwünschter Zellen freisetzt.
  • Diese Erfindung umfasst die Anwendung von NTP-Proteinen, konjugiert oder verbunden oder gebunden an ein Protein oder anderes Molekül zur Bildung einer Zusammensetzung, die das NTP-Protein oder ein biologisch aktives Fragment des NTP-Proteins bei Exposition des zu behandelnden Gewebes gegenüber Licht (wie bei Lasertherapien oder anderer photodynamischer oder photoaktivierter Therapie), anderen Formen von elektromagnetischer Strahlung, wie infra roter Strahlung, ultravioletter Strahlung, Röntgen- oder Gamma-Strahlung, lokaler Wärme, Alpha- oder Beta-Strahlung, Ultraschallemissionen oder anderen Quellen von lokaler Energie freisetzt bzw. freigibt.
  • Die NTP-Proteine können alleine, zusammen oder in Kombination mit anderen pharmazeutischen Zusammensetzungen, wie Cytokinen, Wachstumsfaktoren, Antibiotika, Apoptoseinduzierenden Mitteln, entzündungshemmenden Mitteln und/oder chemotherapeutischen Mitteln, wie es für die Indikation, die behandelt wird, angemessen ist, verwendet werden.
  • Diese Erfindung umfasst auch die Verwendung von NTP zur Herstellung von therapeutischen Zusammensetzungen von NTP unter Einsatz von Dendrimeren, Fullerenen und/oder anderen synthetischen Molekülen, Polymeren und Makromolekülen, wo(bei) das NTP-Protein und/oder sein entsprechendes DNA-Molekül mit dem Molekül, Polymer oder Makromolekül konjugiert, daran angeheftet oder darin eingeschlossen ist, und zwar entweder alleine bzw. durch sich selbst oder in Verbindung mit anderen Molekülarten, wie einem tumorspezifischen Marker. Beispielsweise stellt das US-Patent Nr. 5,714,166 , Bioactive and/or Targeted Dendimer Conjugates, ein Verfahren zur Herstellung und Verwendung unter anderem von dendritischen Polymerkonjugaten, bestehend aus wenigstens einem Dendrimer mit (einem) Element(en) zur Targetierung („a target director(s)") und wenigstens einem damit konjugierten bioaktiven Mittel, bereit.
  • Die Anwendung einer therapeutisch effektiven Menge eines NTP-Gens zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung von Tumoren ist ebenfalls vom Rahmen der Erfindung umfasst. Eine Überexpression von NTP innerhalb des Tumors kann eingesetzt werden, um die Zellen im Tumor zum Absterben anzuregen und somit die Tumorzellpopulation zu verringern. Es wird erwartet, dass der Gen- oder Genäquivalent-Transfer von NTP zum Behandeln des Tumors den Vorteil eines geringeren Dosierungsbedarfs und der Übertragung bzw. Passage auf die Zellnachkommenschaft der targetierten Zellelemente aufweist, wodurch eine weniger häufige Therapie und insgesamt weniger Therapie benötigt wird.
  • Die Anwendung von klonierten rekombinanten NTP-Antikörper-Konjugaten; klonierten rekombinanten NTP-Antikörperfragment-Konjugaten und klonierten rekombinanten NTP-antikörperähnliches Protein-Konjugaten ist ebenfalls vom Rahmen der Erfindung umfasst. Die Vorteile eines klonierten NTP, kombiniert mit einem targetierenden Konjugat (wie ein Antikörper, ein Antikörperfragment, ein antikörperähnliches Molekül oder ein Molekül mit hoher Affinität gegenüber einem krebsspezifischen Rezeptor oder anderen Tumormarker), sind, dass ein derartiges Molekül die oben beschriebenen Targetierungsvorteile kombiniert, zusätzlich zu Vorteilen hinsichtlich Herstellung und standardisierter Produktion des klonierten konjugierten Moleküls.
  • Dosierungsformen
  • Feste Dosierungsformen zur oralen Verabreichung umfassen, ohne Beschränkung darauf, Kapseln, Tabletten, Pillen, Pulver und Granulate. In derartigen festen Dosierungsformen ist die aktive Verbindung mit wenigstens einem der Folgenden gemischt: (a) ein oder mehrere inerte Exzipientien (oder Träger), wie Natriumcitrat oder Dicalciumphosphat; (b) Füll- oder Streckmittel, wie Stärken, Lactose, Saccharose, Glucose, Mannit und Kieselsäure; (c) Bindemittel, wie Carboxymethylcellulose, Alginate, Gelatine, Polyvinylpyrrolidon, Saccharose und Gummi arabicum; (d) Feuchthaltemittel, wie Glycerin; (e) Zerfalls- bzw. Sprengmittel, wie Agar-Agar, Calciumcarbonat, Kartoffel- oder Tapiokastärke, Alginsäure, bestimmte komplexe Silikate und Natriumcarbonat; (f) Lösungsverzögerer, wie Paraffin; (g) Absorptionsbeschleuniger, wie quaternäre Ammoniumverbindungen; (h) Benetzungsmittel, wie Acetylalkohol („acetyl alcohol") und Glycerinmonostearat; (i) Adsorbentien, wie Kaolin und Bentonit; und (j) Schmiermittel, wie Talk, Calciumstearat, Magnesiumstearat, feste Polyethylenglycole, Natriumlaurylsulfat oder Gemische davon. Bei Kapseln, Tabletten und Pillen können die Dosierungsformen auch puffernde Mittel umfassen.
  • Flüssige Dosierungsformen für orale Verabreichung umfassen pharmazeutisch verträgliche Emulsionen, Lösungen, Suspensionen, Sirupe und Elixiere. Zusätzlich zu den aktiven Verbindungen können die flüssigen Dosierungsformen inerte Verdünnungsmittel, die üblicherweise im Fachgebiet verwendet werden, wie Wasser oder andere Lösungsmittel, Solubilisierungsmittel und Emulgatoren umfassen. Beispielhafte Emulgatoren sind Ethylalkohol, Isopropylalkohol, Ethylcarbonat, Ethylacetat, Benzylalkohol, Benzylbenzoat, Propylenglycol, 1,3-Butylenglycol, Dimethylformamid, Öle, wie Baumwollsamenöl, Erdnussöl, Mais- bzw. Getreidekeimöl, Olivenöl, Rizinusöl und Sesamöl, Glycerin, Tetrahydrofurfurylalkohol, Polyethylenglykole, Sorbitanfettsäureester oder Gemische dieser Substanzen und dergleichen.
  • Neben derartigen inerten Verdünnungsmitteln kann die Zusammensetzung auch Adjuvantien bzw. Hilfsstoffe, wie Benetzungsmittel, Emulgatoren und Suspendiermittel, Süßungsmittel, Aromamittel und Duftstoffe einschließen.
  • Die tatsächlichen Dosierungslevel von aktiven Inhaltsstoffen in den Zusammensetzungen der Erfindung können variiert werden, um eine Menge an NTP zu erhalten, die effektiv ist, um eine gewünschte therapeutische Reaktion einer bestimmten Zusammensetzung und Verabreichungsweise zu erhalten. Die ausgewählten Dosierungslevel hängen daher von der gewünschten therapeutischen Wirkung, dem Verabreichungsweg, der gewünschten Wirkdauer und von anderen Faktoren ab.
  • Bei Säugern, einschließlich Menschen, können die effektiven Mengen auf Basis der Körperoberfläche verabreicht werden. Der Zusammenhang von Dosierungen bei Tieren verschiedener Größen, Arten und bei Menschen (basierend auf mg/M2 Körperoberfläche) wird von E. J. Freireich et al., Cancer Chemother. Rep., 50(4): 219 (1966) beschrieben. Die Körperoberfläche kann näherungsweise aus der Größe und dem Gewicht eines Individuums bestimmt werden (siehe z. B. Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardsley, N. Y., S. 537–538 (1970)).
  • Die Gesamttagesdosis an NTP, die einem Wirt verabreicht wird, kann in einzelnen oder unterteilten Dosen sein. Dosierungseinheit-Zusammensetzungen („dosage unit compositions") können solche Mengen von Teileinheiten („submultiples") davon enthalten, wie verwendet werden, um die Tagesdosis zu ergeben. Es wird jedoch verstanden werden, dass der spezifische Dosislevel für jeden speziellen Patienten von einer Vielfalt von Faktoren abhängen wird, einschließlich des Körpergewichts, der allgemeinen Gesundheit, des Geschlechts, der Ernährung, der Zeit und des Weges der Verabreichung, der Potenz bzw. Wirksamkeit des verabreichten Wirkstoffs, der Raten der Absorption und Ausscheidung, der Kombination mit anderen Wirkstoffen und der Schwere der speziellen Erkrankung, die behandelt wird.
  • Verfahren der Verabreichung
  • Die NTP-Zusammensetzung kann intramuskulär, oral, intravenös, intraperitoneal, intracerebral (intraparenchymal), intracerebroventrikulär, intratumoral, intraläsional, intradermal, intrathekal, intranasal, intraokular, intraarteriell, topisch, transdermal, über ein Aerosol, eine Infusion, eine Bolusinjektion, eine Implantationsvorrichtung, ein System für anhaltende Freisetzung („sustained release system") usw. verabreicht werden.
  • Eine weitere Verabreichung des NTP erfolgt auf einem transdermalen oder transkutanen Weg. Ein Beispiel für eine derartige Ausführungsform ist die Verwendung eines Pflasters. Insbesondere kann ein Pflaster mit einer feinen Suspension von NTP zum Beispiel in Dimethylsulfoxid (DMSO) oder einem Gemisch von DMSO mit Baumwollsamenöl hergestellt und mit der Haut des tumortragenden Säugers, entfernt von der Stelle des Tumors, in einer Hautfalte bzw. -tasche („skin pouch") in Kontakt gebracht werden. Andere Medien oder Gemische davon mit anderen Lösungsmitteln und festem/festen Träger(n) würden gleichermaßen funktionieren. Das Pilaster kann die NTP-Verbindung in Form einer Lösung oder einer Suspension enthalten. Das Pilaster kann dann auf die Haut des Patienten angewendet werden, zum Beispiel mittels Einführung in eine Hautfalte des Patienten, gebildet durch Falten und Zusammenhalten der Haut mittels Stichen, Klammern oder anderen Haltevorrichtungen. Diese Falte sollte in einer derartigen Weise eingesetzt werden, dass ein kontinuierlicher Kontakt mit der Haut ohne Störung des Säugers sichergestellt wird. Neben der Verwendung einer Hautfalte kann eine beliebige Vorrichtung verwendet werden, die die feste Anordnung des Pflasters in Kontakt mit der Haut sicherstellt. Zum Beispiel könnte ein Klebeband verwendet werden, um das Pflaster auf der Haut festzuhalten.
  • NTP kann in Form einer Formulierung oder Zubereitung zur anhaltenden Freisetzung verabreicht werden. Geeignete Beispiele für Zubereitungen zur anhaltenden Freisetzung umfassen semipermeable Polymermatrizes in Form geformter Gegenstände, z. B. Filme, oder Mikrokapseln. Matrizes für anhaltende Freisetzung umfassen Polyester, Hydrogele, Polylactide ( US 3,773,919 , EP 58 481 ), Copolymere von L-Glutaminsäure und gamma-Ethyl-L-glutamat (Sidman et al., Biopolymers, 22: 547–556 [1983]), Poly(2-hydroethylmethacrylat) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167–277 [1981] und Langer, Chem. Tech., 12: 98–105 [1982]), Ethylenvinylacetat (Langer et al., supra) oder Poly-D(–)-3-Hydroxybuttersäure ( EP 133 988 ). Zusammensetzungen mit anhaltender Freisetzung können auch Liposome einschließen, die durch ein beliebiges von mehreren Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, hergestellt werden können (z. B. Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688–3692 [1985]; EP 36 676 ; EP 88 046 und EP 143 949 ).
  • Ein weiteres Verfahren zur Verabreichung des NTPs ist mittels direkter oder indirekter Infusion von NTP in den Tumor. Ein Beispiel für eine derartige Ausführungsform ist die direkte Injektion von NTP in den Tumor. Die Behandlung kann aus einer einzelnen Injektion, mehrfachen Injektionen bei einer Gelegenheit oder einer Reihe von Injektionen über einen Zeitraum von Stunden, Tagen oder Monaten bestehen, wobei die Regression oder Zerstörung des Tumors mittels Biopsie, Bildgebung oder anderen Verfahren der Überwachung von Gewebewachstum überwacht wird. Die Injektion in den Tumor kann mittels einer Vorrichtung erfolgen, die in eine Öffnung, wie die Nase, den Mund, das Ohr, die Vagina, das Rektum oder die Urethra, oder durch einen Inzision eingeführt wird, um den Tumor in vivo zu erreichen und kann in Verbindung mit einem bildgebenden oder optischen System, wie Ultraschall oder ein optisches Faserendoskop („fibre optic scope") durchgeführt werden, um die geeignete Stelle für die Injektion(en) zu identifizieren. Ein weiteres Beispiel einer derartigen Ausführungsform ist die Verwendung einer Vorrichtung, die eine konstante NTP-Infusion an das Gewebe über die Zeit bereitstellen kann.
  • Ein weiteres Verfahren der Verabreichung des NTPs ist in Verbindung mit einer chirurgischen oder ähnlichen Vorgehensweise, eingesetzt zum physischen Exzidieren, Ablatieren bzw. Entfernen oder sonstigen Abtötens oder Zerstörens des Tumors, wobei das erfindungsgemäße NTP an den/die unmittelbaren Bereich(e) verabreicht wird, der/die den/die Bereich(e) umgibt/umgeben, wo der Tumor entfernt wurde, um jegliche Tumorzellen, die nicht durch die Verfahrensweise entfernt oder zerstört wurden, zu zerstören oder deren Wachstum zu behindern.
  • Ein weiteres Verfahren der Verabreichung des NTPs ist mittels Implantation einer Vorrichtung in den Tumor. Ein Beispiel für eine derartige Ausführungsform ist die Implantation eines NTP enthaltenden Wafers in den Tumor. Der Wafer setzt über die Zeit eine therapeutische Dosis an NTP in das Gewebe frei. Alternativ oder zusätzlich kann die Zusammensetzung lokal in dem betroffenen Bereich über Implantation einer Membran, eines Schwammes oder anderen geeigneten Materials auf der/dem das erfindungsgemäße NTP absorbiert worden ist, verabreicht werden. Wenn eine Implantationsvorrichtung verwendet wird, kann die Vorrichtung in ein beliebiges geeignetes Gewebe oder Organ implantiert werden und die Abgabe des erfindungsgemäßen NTPs kann direkt durch die Vorrichtung über einen Bolus oder über eine kontinuierliche Verabreichung oder über einen Katheter unter Anwendung kontinuierlicher Infusion erfolgen.
  • Ein alternatives Verfahren der Verabreichung ist das Einführen von einer oder mehreren Kopien des NTP-Gens in die Zelle, die targetiert wird, und, sofern nötig, das Induzieren der Kopie(n) des Gens, um die intrazelluläre Produktion von NTP zu starten. Eine Weise, auf die eine Gentherapie angewendet werden kann, ist die Anwendung des NTP-Gens (entweder genomische DNA, cDNA und/oder systemische DNA, codierend für das erfindungsgemäße NTP oder ein Fragment, eine Variante oder ein Derivat davon), das funktionell mit einem konstitutiven oder induzierbaren Promotor verknüpft sein kann, um ein „Gentherapie-DNA-Konstrukt" zu bilden. Der Promotor kann bezüglich des endogenen NTP-Gens homolog oder heterolog sein, vorausgesetzt, dass er in dem Zell- oder Gewebetyp, in den das Konstrukt eingeführt werden wird, aktiv ist. Andere Komponenten des Gentherapie-DNA-Konstrukts können gegebenenfalls, wie erforderlich, einschließen: DNA-Moleküle, die zur ortsspezifischen Integration konzipiert sind (z. B. endogene flankierende Sequenzen, die für eine homologe Rekombination verwendbar sind), einen gewebespezifischen Promotor, einen oder mehrere Enhancer oder Silencer, DNA-Moleküle, die dazu fähig sind, einen Selektionsvorteil gegenüber der Elternzelle bereitzustellen, DNA-Moleküle, die als Markierungen zum Identifizieren transformierter Zellen verwendbar sind, negative Selektionssysteme, zellspezifische bindende Mittel (wie zum Beispiel zur Zelltargetierung), zellspezifische Internalisierungsfaktoren und Transkriptionsfaktoren zum Verstärken der Expression durch einen Vektor, sowie Faktoren zum Ermöglichen der Vektorherstellung. Mittel bzw. Wege der Genabgabe an eine Zelle oder ein Gewebe in vivo oder ex vivo umfassen (ohne Beschränkung darauf) direkte Injektion nackter DNA, ballistische Verfahren, liposomenvermittelten Transfer, rezeptorvermittelten Transfer (Ligand-DNA-Komplex), Elektroporation und Caliciumphosphatpräzipitation. Siehe US-Patent Nr. 4,970,154 , WO 96/40958 , US-Patent Nr. 5,679,599 , US-Patent Nr. 5,676,954 und US-Patent Nr. 5,593,875 . Sie umfassen auch die Verwendung eines viralen Vektors, wie eines Retrovirus, Adenvirus, adenassoziierten Virus, Pockenvirus, Lentivirus, Papillomavirus oder Herpes simplex-Virus, die Verwendung eines DNA-Protein-Konjugats und die Verwendung eines Liposoms. Die Verwendung von Gentherapievektoren ist zum Beispiel im US-Patent Nr. 5,672,344 , US-Patent Nr. 5,399,346 , US-Patent Nr. 5,631,236 und US-Patent Nr. 5,635,399 beschrieben.
  • Das NTP-Gen kann durch Implantieren bestimmter Zellen, die ex vivo genetisch verändert wurden, in Patienten abgegeben werden, wobei Verfahren, wie jene, die hierin beschrieben sind, verwendet werden, um das erfindungsgemäße NTP oder Fragmente, Varianten oder Derivate davon zu exprimieren und zu sekretieren bzw. sezernieren. Derartige Zellen können tierische oder menschliche Zellen sein und können aus dem eigenen Gewebe des Patienten oder aus einer anderen Quelle, menschlich oder nicht-menschlich, stammen. Gegebenenfalls können die Zellen immortalisiert sein oder sie können Stammzellen sein. Um jedoch die Wahrscheinlichkeit einer Immunreaktion zu verringern, ist es bevorzugt, dass die Zellen eingekapselt sind, um eine Infiltration von umgebenden Geweben zu vermeiden. Die Einkapselungsmaterialien sind typischerweise biokompatible, semipermeable polymere Umschließungen oder Membranen, die eine Freisetzung des/der Proteinprodukts/-produkte erlauben, jedoch eine Zerstörung der Zellen durch das Immunsystem des Patienten oder andere schädliche Faktoren aus den umgebenden Geweben verhindern. Verfahren, die zur Membraneinkapselung von Zellen verwendet werden, sind dem Fachmann vertraut und die Herstellung von eingekapselten Zellen und deren Implantation in Patienten kann ohne unzumutbare Versuche bewerkstelligt werden. Siehe zum Beispiele US-Patente Nrn. 4,892,538 ; 5,011,472 und 5,106,627 . Ein System zum Einkapseln lebender Zellen ist in PCT WO 91/10425 beschrieben. Techniken zum Formulieren einer Vielfalt anderer Mittel zur anhaltenden oder kontrollierten Abgabe, wie Liposomenträger, bioerudierbare Partikel oder Kügelchen, sind ebenfalls auf dem Fachgebiet bekannt und sind zum Beispiel im US-Patent Nr. 5,653,975 beschrieben. Die Zellen können, mit oder ohne Einkapselung, in geeignete Körpergewebe oder Organe des Patienten implantiert werden.
  • Die folgenden Beispiele werden zur Erläuterung der Erfindung gegeben. Es sollte jedoch verstanden werden, dass die Erfindung nicht auf die spezifischen Bedingungen oder Details, die in diesen Beispielen beschrieben werden, beschränkt ist.
  • Beispiel 1
  • Der Zweck dieses Beispiels war es, die cytotoxische Wirkung von NTP auf Gliom- und Neuroplastomzellen zu testen.
  • Ein Neuroplastom ist ein Krebs, der hauptsächlich Kinder befällt. Er beginnt im Nervengewebe im Nacken, Brustkorb, Abdomen oder Becken. Üblicherweise entspringt er im Abdomen in den Geweben der Nebenniere. Zum Zeitpunkt seiner Diagnose hat sich der Krebs häufig ausgebreitet, am üblichsten auf die Lymphknoten, die Leber, die Lungen, die Knochen und/oder das Knochenmark.
  • Gliome sind Hirntumore. Ein Gliomtumor ist besonders schädigend, da er dazu neigt, rasch zu wachsen und sich im Gehirn auszubreiten. Jährlich stellen etwa 20.000 Amerikaner fest, dass sie ein Gliom haben. Mehr als die Hälfte stirbt innerhalb von 18 Monaten.
  • Zellkultur:
  • Cryokonservierte Gliom- und Neuroplastomzellen wurden von der American Type Culture Collection (ATCC), Virginia, erworben. Die Zellen wurden aufgetaut und in Suspensionsmedien verdünnt und bei 700 UpM für 7 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Die Zellpellets wurden dann in CACO-2-Medien resuspendiert und in Standardkolben zu 75 oder 175 cm2 bei 37°C, 5% CO2 kultiviert bis sie annähernd konfluent waren. Die Zellen wurden dann trypsinisiert und in CACO-2-Medien verdünnt, um eine Endzelldichte von 1,5 × 105 Zellen/ml zu erreichen. Dann wurden 50 μl-Aliquots pro Probe pro Well in 96-Well-Platten gegeben.
  • Dosierung:
  • Für Experiment I wurden zu jeder Probenkultur 50 μl von entweder PBS (phosphatgepufferte Lösung) (Negativkontrolle), 100 μM Tamoxifen in phosphatgepufferter Salzlösung PBS (Positivkontrolle) oder Testgegenstand gegeben.
  • Für Experiment II wurde 1 mM Tamoxifen in DMSO (Dimethylsulfoxid) auf eine Konzentration von 100 μM in CACO-2-Medien verdünnt, und 100 μl pro Well wurden zu Positivkontroll-Wells gegeben. Eine Vehikelkontrolle, bestehend aus 1% DMSO in CACO-2-Medien, wurde diesem Experiment ebenso hinzugefügt. Andere Negativkontrollen bestanden aus humanem und bovinem Serumalbumin und anderen nichttoxischen Polypeptiden.
  • MTT-Assays:
  • Ein MTT-Assay ist ein empfindlicher Assay zur Messung der Zellproliferation, basierend auf der Reduktion des Tetrazoliumsalzes 3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT).
  • Nach Inkubationen mit Kontroll- oder Testsubstanzen wurden die Medien abgesaugt und 100 μl MTT wurden in jedes Well gegeben. Die Platten wurden dann für 3 Stunden bei 37°C, 5% CO2 inkubiert. MTT wurde durch angesäuertes Isopropanol (0,4 N HCl) ersetzt und die Platten wurden abgedeckt bei 4°C über Nacht verwahrt. Die Platten wurden dann auf einem Rotationsschüttler sanft für 1 Minute bewegt und die Differenz zwischen Emission-Extinktion bei 570 nm und Hintergrund-Extinktion bei 650 nm wurde spektralphotometrisch auf einem automatisierten Plattenlesegerät gemessen.
  • Ergebnisse:
  • Experiment I:
  • Nach Behandlung mit Testmaterialien oder Kontrolllösungen wurden Neuroplastom- und Gliomzellen für 24 Stunden inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wurde MTT zu allen Kulturen gegeben. Die Ergebnisse sind als mittlere Extinktionsdifferenzen ausgedrückt und wiedergegeben als Prozent der Negativkontrolle und sind in Tabelle 1 (Cytotoxizität bei Gliomzellen) und Tabelle 2 (Cytotoxizität bei Neuroplastomzellen) gezeigt. Tabelle 1: Cytotoxizität bei Gliomzellen: 24 Std.
    Identifikation des Testgegenstands Konzentration ABS 570–650 Prozent lebensfähige Zellen
    Probe Mittelwert SA
    NC (PBS) 0,064 0,061 0,005 100
    NC (PBS) 0,057
    VC (DMSO) 0,051 0,054 0,004 100
    VC (DMSO) 0,056
    PC (Tamoxifen) 100 μM 0,017 0,015 0,004 28
    PC (Tamoxifen) 100 μM 0,012
    AD7C-NTP 100–1000 ng/ml 0,022 0,025 0,004 41
    AD7C-NTP 100–1000 ng/ml 0,028
    • Abkürzungen: ABS, Extinktion; NC, Negativkontrolle; PC, Positivkontrolle; SA, Standardabweichung; VC, Vehikelkontrolle
    Tabelle 2: Neuroplastomzellen: 24-stündige Inkubation
    Identifikation des Testgegenstands Konzentration Prozent lebensfähige Zellen
    Probe Mittelwert SA
    0,089 0,096 0,009 100
    NC (PBS) 0,102
    VC (DMSO) 0,073 0,070 0,004 100
    VC (DMSO) 0,067
    PC (Tamoxifen) 100 μM 0,010 0,010 0,001 14
    PC (Tamoxifen) 100 μM 0,009
    AD7C-NTP 100–1000 ng/ml 0,012 0,013 0,001 14
    AD7C-NTP 100–1000 ng/ml 0,014
    • Abkürzungen: ABS, Extinktion; NC, Negativkontrolle; PC, Positivkontrolle; SA, Standardabweichung; VC, Vehikelkontrolle
  • Experiment 2:
  • Zu diesem Experiment wurden Gliomzellen und Neuroblastomzellen verwendet. Nach einer 24-stündigen Inkubation mit Kontroll- oder Testlösungen wurde MTT zu den Platten gegeben. Bei 24 Stunden wurden andere Platten mit frischen Medien, Kontroll- oder Testlösung aufgefrischt bzw. wieder ergänzt und dann 3 Tage später ausgelesen. Die Ergebnisse sind als mittlere Extinktionsdifferenzen und als Prozent der Negativkontrolle angeben und sind in Tabelle 3 (Gliomzellen) und Tabelle 4 (Neuroblastomzellen) gezeigt. Tabelle 3: Cytotoxizität bei Gliomzellen: 4 Tage
    Identifikation des Testgegenstands Konzentration ABS 570–650 Prozent lebensfähige Zellen
    Probe Mittelwert SA
    NC (PBS) 0,107 0,093 0,016 100
    NC (PBS) 0,790
    VC (DMSO) 0,076 0,079 0,004 100
    VC (DMSO) 0,081
    PC (Tamoxifen) 100 μM 0,018 0,015 0,003 19
    PC (Tamoxifen) 100 μM 0,012
    AD7C-NTP 100–1000 ng/ml 0,012 0,012 0,001 11
    AD7C-NTP 100–1000 ng/ml 0,011
    • Abkürzungen: ABS, Extinktion; NC, Negativkontrolle; PC, Positivkontrolle; SA, Standardabweichung; VC, Vehikelkontrolle
    Tabelle 4: Cytotoxizitätswirkungen von Testgegenständen auf Neuroblastomzellen: 4-tägige Inkubation
    Identifikation des Testgegenstands Konzentration Prozent lebensfähige Zellen
    Probe Mittelwert SA
    NC (PBS) 0,088 0,022 0,022 100
    NC (PBS) 0,082
    VC (DMSO) 0,076 0,076 0,001 100
    VC (DMSO) 0,077
    PC (Tamoxifen) 100 μM 0,016 0,019 0,003 25
    AD7C-NTP 100–1000 ng/ml 0,007 0,010 0,004 11
    AD7C-NTP 100–1000 ng/ml 0,012
    • Abkürzungen: ABS, Extinktion; NC, Negativkontrolle; PC, Positivkontrolle; SA, Standardabweichung; VC, Vehikelkontrolle
  • Schlussfolgerung:
  • Bei 24 Stunden und bei 96 Stunden sind bedeutende bzw. signifikante cytotoxische Wirkungen auf Gliom- und Neuroplastomzellen mit AD7C-NTP offensichtlich.
  • Beispiel 2
  • Der Zweck dieses Beispiels war es, die Wirkung von NTP auf Gewebe an Injektionsstellen festzustellen.
  • Acht normalen Ratten wurde an drei unterschiedlichen Fokussen gereinigtes rekombinantes AD7C-NTP in Salzlösung in Konzentrationen von 1–10 μg/ml in die Haut und subkutan injiziert, wobei eine Abgabe aus Kunststoffspritzen durch Edelstahlnadeln der Größe 26 Gauge erfolgte.
  • Die Tiere wurden 24 Stunden lang beobachtet und bei 24 Stunden schmerzlos getötet. Die 24 individuellen Fokusse der Infiltration wurden exzidiert, in 10%igem Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet und mittels histopathologischer Standardverfahren gefärbt und untersucht.
  • Ähnliche Gruppen von Kontrollratten erhielten Injektionen von (1) Rinderserumalbumin, 0,1% in Salzlösung, (2) normalem humanem Serum, (3) physiologischer Salzlösung, (4) E. coli-Proteinen aus Vektoren ohne AD7C-NTP, gereinigt unter Verwendung von Verfahrensweisen, die zur AD7C-NTP-Reinigung ähnlich waren; (5) rekombinantes Nicht-NTP-Protein, exprimiert in E. coli und gereinigt. Die Tiere wurden dann untersucht und wie oben getötet, wobei die exzibierten Fokusse der Injektion wie oben behandelt wurden.
  • Ergebnisse
  • Die Injektion von AD7C-NTP erzeugte in allen Beispielen eine abundante akute Nekrose von Gewebe an den Injektionsstellen (1–5). Die Nekrose ist in Muskelgewebe, subkutanem Bindegewebe und der Dermis an den Stellen, an denen das AD7C-NTP injiziert wurde, evident. Nach 24 Stunden erscheinen Zellen blass bzw. hell, geschrumpft und nekrotisch und es gibt eine Infiltration mit inflammatorischen Zellen. Die Nekrose korreliert mit den Bereichen der Injektion und scheint sich nicht weit über die Injektionsstelle hinaus auszubreiten.
  • Abgesehen von den milden bzw. leichten Bereichen der Entzündung zeigten Kontrollen keine Anzeichen für Nekrose oder Zellverlust. Im Gegensatz zu den AD7C-NTP-Injektionen, wo ganze Felder bzw. Gebiete von Muskelfaserschichten nekrotisch waren, zeigten die Kontrollen minimale oder fehlende Muskelveränderungen. Kontrollinjektionen hatten milde bis minimale akute Entzündung an den Injektionsstellen und fokale Mikrohämorrhagien durch die Nadeln.
  • Beispiel 3
  • Der Zweck dieses Beispiels war es, die Wirkung von NTP auf verschiedene Tumore humanem und nicht-humanem Ursprungs festzustellen.
  • Eine AD7C-NTP-Infiltration wurde an einer Vielfalt von verschiedenen Tumoren humanen und nicht-humanen Ursprungs, einschließlich Mammakarzinom, Hautkarzinom und Papillom, Kolonkarzinom, Gliom des Gehirns und andere, in Nagermodellen getestet. Die Tumore wurden direkt mit AD7C-NTP infiltriert, wie in Beispiel 2 beschrieben, und die Versuchstiere wurden beobachtet und nach Intervallen von 24 Stunden bis 2 Wochen schmerzlos getötet. Nach der Tötung wurde eine histopathologische Untersuchung des Tumors wie oben durchgeführt.
  • Kontrolltumore wurden getestet mit: (1) keiner Behandlung, (2) Infiltration mit normalem humanem Serum, (3) Infiltration mit Rinderserumalbumin und (4) Infiltration mit Salzlösung.
  • Ergebnisse
  • Bei allen untersuchten Fällen gab es eine signifikante Nekrose von Tumorzellen nach AD7C-NTP-Infiltration (6–10). Bei Beispielen, bei denen zwei Injektionen 24 Stunden beabstandet waren, gab es eine größere Tumorzerstörung als nach einer einzelnen Injektion. Bei einigen Beispielen bildete sich der Tumor fast vollständig zurück. Bei anderen Beispielen vergrößerten sich nach einer einzelnen Injektion Tumore 1–2 Wochen später, wenn es keine weitere Injektion von AD7C-NTP gab. Bei Tumoren, die mit einer Injektion von AD7C-NTP behandelt wurden und 2 Wochen später histologisch untersucht wurden, gab es große leere Kavitäten bzw. Höhlen, wo der Tumor zuvor gewesen ist, umgeben von Tumorrändern, was darauf hinweist, dass sich der infiltrierte Tumor nach Nekrose ausgehöhlt hat und verschwand. Bei anderen Tumoren, die mit einer Injektion behandelt und zwei Wochen später untersucht wurden, gab es eine ausgedehnte Fibrosierung („extensive fibrous") innerhalb des Tumors, die bei Kontrollen nicht festgestellt wurde; dies wird einer Tumorzerstörung und nachfolgenden Fibrose zugeschrieben. Kontrollfälle zeigten nur fokale Mikrohämorrhagien und Entzündung und gelegentlich Verformung, jedoch unbedeutende Nekrose und keine Anzeichen für die massive Nekrose, die bei den Ad7C-NTP-Infusionen gezeigt wurde.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00430001
  • Figure 00440001
  • Figure 00450001
  • Figure 00460001
  • Figure 00470001
  • Figure 00480001
  • Figure 00490001
  • Figure 00500001

Claims (20)

  1. Anwendung einer therapeutisch effektiven Menge eines Neurofilamentproteins (NPT) zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung von Tumoren.
  2. Anwendung nach Anspruch 1, worin das NTP durch ein Verfahren verabreicht wird, das aus der Gruppe bestehend aus oral, subkutan, intradermal, intravenös, intramuskulär, intrathekal, intranasal, intratumoral, topisch und transdermal ausgewählt ist.
  3. Anwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 oder 2, worin die Behandlung dem Patienten vor, während oder nach der Behandlung des Patienten verabreicht wird, ausgewählt aus der Gruppe von Behandlungen bestehend aus chirurgischer Exzision, Transplantation, "Grafting", Chemotherapie, Immuntherapie, Beimpfung, thermischer oder elektrischer Ablation, Kryotherapie, Lasertherapie, Phototherapie, Gentherapie und Strahlung.
  4. Anwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, worin der Tumor aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einem gutartigen oder bösartigen Tumor eines Gewebes aus der Gruppe bestehend aus Lunge, Brust, Magen, Pankreas, Prostata, Blase, Knochen, Ovarium, Haut, Niere, Sinus, Dickdarm, Darm, Magen, Rektum, Speiseröhre, Herz, Milz, Speicheldrüse, Blut, Gehirn und dessen Abdeckungen, Rückenmark und dessen Abdeckungen, Muskel, Bindegewebe, Nebenniere, Parathyroid, Thyroid, Gebärmutter, Hoden, Hypophyse, Fortpflanzungsorganen, Leber, Gallenblase, Auge, Ohr, Nase, Hals, Mund und Lymphknoten und Lympfsystem ausgewählt ist.
  5. Anwendung nach Anspruch 4, worin das Gewebe aus der Gruppe bestehend aus Haut, Auge, Ohr, Nase, Hals, Mund, Muskel, Bindegewebe, Haar und Brust ausgewählt ist.
  6. Anwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, worin das NTP an ein Molekül konjugiert, verbunden oder gebunden ist, das aus der Gruppe bestehend aus Antikörper, Antikörperfragment und einem antikörperähnlichen bindenden Molekül ausgewählt ist, wo das Molekül eine höhere Affinität zur Bindung an einen Tumor als Bindung an andere Zellen hat.
  7. Anwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, worin das NTP Teil eines einzelnen neuen geklonten rekombinanten Moleküls ist, bestehend aus NTP und einem Molekül, das aus der Gruppe bestehend aus Antikörper, Antikörperfragment und einem antikörperähnlichen bindenden Molekül ausgewählt ist, wo das Molekül eine höhere Affinität zur Bindung an einen Tumor als Bindung an andere Zellen hat.
  8. Anwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, worin das NTP aus der Gruppe bestehend aus AD7c-NTP (SEQ ID NO. 1), den Proteinen, die durch SEQ ID NO. 2 bis 9 identifiziert sind, neuralem Bauchspeicheldrüse-Filamentprotein und Bauchspeicheldrüse-Filamentprotein ausgewählt ist.
  9. Anwendung nach Anspruch 8, worin das NTP durch ein Verfahren verabreicht wird, das aus der Gruppe bestehend aus oral, subkutan, intradermal, intravenös, intramuskulär, intrathekal, intraperitoneal, intracerebral (intraparenchymal), intracerebroventrikulär, intraokular, intraarteriell, intranasal, intratumoral, intraläsional, topisch und transdermal ausgewählt ist.
  10. Anwendung nach Anspruch 8, worin die Behandlung dem Patienten vor, während oder nach der Behandlung des Patienten verabreicht wird, ausgewählt aus der Gruppe von Behandlungen bestehend aus chirurgischer Exzision, Transplantation, "Grafting", Chemotherapie, Immuntherapie, Beimpfung, thermischer oder elektrischer Ablation, Kryotherapie, Lasertherapie, Phototherapie, Gentherapie und Strahlung.
  11. Anwendung nach Anspruch 8, worin der Tumor ein gutartiger oder bösartiger Tumor eines Gewebes ist, das aus der Gruppe bestehend aus Lunge, Brust, Magen, Pankreas, Prostata, Blase, Knochen, Ovarium, Haut, Niere, Sinus, Dickdarm, Darm, Magen, Rektum, Speiseröhre, Herz, Milz, Speicheldrüse, Blut, Gehirn und dessen Abdeckungen, Rückenmark und dessen Abdeckungen, Muskel, Bindegewebe, Nebennlere, Parathyroid, Thyroid, Gebärmutter, Hoden, Hypophyse, Fortpflanzungsorganen, Leber, Gallenblase, Auge, Ohr, Nase, Hals, Mandeln, Mund und Lymphknoten und Lympfsystem ausgewählt ist.
  12. Anwendung nach Anspruch 11, worin das Gewebe aus der Gruppe bestehend aus 1 Haut, Auge, Ohr, Nase, Hals, Mund, Muskel, Bindegewebe, Fettgewebe, Haar und Brust ausgewählt ist.
  13. Anwendung nach Anspruch 8, worin das NTP an ein Molekül konjugiert, verbunden oder gebunden ist, das aus der Gruppe bestehend aus Antikörper, Antikörperfragment und einem antikörperähnlichen bindenden Molekül ausgewählt ist, wo das Molekül eine höhere Affinität zur Bindung an einen Tumor als Bindung an andere Zellen hat.
  14. Anwendung nach Anspruch 8, worin das NTP Teil eines einzelnen neuen geklonten rekombinanten Moleküls ist, bestehend aus NTP und einem Molekül, das aus der Gruppe bestehend aus Antikörper, Antikörperfragment und einem antikörperähnlichen bindenden Molekül ausgewählt ist, wo das Molekül eine höhere Affinität zur Bindung an einen Tumor als Bindung an andere Zellen hat.
  15. Anwendung nach Anspruch 8, worin das NTP an ein Protein oder ein anderes Molekül konjugiert oder verbunden oder gebunden ist, wo die Zusammensetzung an der Stelle/den Stellen oder in der Nähe der Stelle(n) des Tumors oder anderer unerwünschter Zellen durch ein tumor- oder stellenspezifisches Enzym oder eine tumor- oder stellenspezifische Protease oder durch ein Antikörperkonjugat, das Tumor abzielt, gespalten wird und so das NTP freigibt.
  16. Anwendung nach Anspruch 8, worin das NTP an ein Protein oder ein anderes Molekül konjugiert oder verbunden oder gebunden ist, wo die Zusammensetzung das NTP nach Belichtung des zu behandelnden Gewebes mit Licht (wie bei Lasertherapien oder anderer photodynamischer oder photoaktivierter Therapie), anderen Formen von elektromagnetischer Strahlung, wie z. B. infraroter Strahlung, ultravioletter Strahlung, Röntgen- oder Gammastrahlung, lokaler Wärme, Alpha- oder Betastrahlung, Ultraschallemissionen oder anderen Quellen von lokaler Energie freigibt.
  17. Anwendung nach Anspruch 8, worin das NTP in Kombination mit anderen pharmazeutischen Zusammensetzungen, wie z. B. Cytokinen, Wachstumsfaktoren, Antibiotika, apoptoseinduzierenden Mitteln, entzündungshemmenden Mitteln und/oder chemotherapeutischen Mitteln verwendet wird, die für die Indikation, die behandelt wird, angemessen sind.
  18. Anwendung nach Anspruch 8, worin das NTP in Kombination mit Dendrimeren, Fullerene und anderen synthetischen Molekülen, Polymeren und Makromolekülen verwendet wird, wo das NTP mit dem Molekül, Polymer oder Makromolekül konjugiert ist, daran gebunden ist oder darin eingeschlossen ist, entweder alleine oder zusammen mit einem Molekül mit höherer Affinität zur Bindung an einen Tumor als Bindung an andere Zellen.
  19. Anwendung nach Anspruch 8, worin das NTP Teil eines einzelnen neuen geklonten rekombinanten Moleküls ist, bestehend aus NTP und einem Molekül, das aus der Gruppe bestehend aus Antikörper, Antikörperfragment und einem antikörperähnlichen bindenden Molekül ausgewählt ist, wo das Molekül eine höhere Affinität zur Bindung an einen Tumor als Bindung an andere Zellen hat.
  20. Anwendung einer therapeutisch effektiven Menge eines NPT-Gens zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung von Tumoren.
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