KR20040000403A - 신경 사 단백질을 사용하여 종양 및 세포의 제거 또는파괴를 필요로 하는 다른 증상을 치료하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신경 사 (thread) 단백질 및 관련 분자를 사용하여 해롭거나 원치않는 세포의 제거 또는 파괴를 필요로 하는 환자의 증상, 예를 들어 양성 및 악성 종양을 치료하기 위한 방법에 관한 것이다.

Description

신경 사 단백질을 사용하여 종양 및 세포의 제거 또는 파괴를 필요로 하는 다른 증상을 치료하는 방법 {Methods of Using Neural Thread Proteins to Treat Tumors and Other Conditions Requiring the Removal or Destruction of Cells}

많은 의학적 처치 및 절차는 해롭거나 원치않는 조직의 제거 또는 파괴를 필수적으로 포함한다. 이러한 중요한 처치의 예로는 암 증식의 외과적 제거, 화학요법을 통한 전이성 종양의 파괴, 및 샘 (예, 전립선) 과형성증의 감소가 포함된다. 다른 예로는 원치않는 얼굴 털의 제거, 사마귀 (wart)의 제거 및 원치않는 지방 조직의 제거를 들 수 있다.

유해하거나 원치않는 세포 및 조직을 파괴하여 이들의 제거를 촉진시키거나 이들의 추가 성장을 억제하는 한편, 주로 국소적인 효과를 나타내고 전신에서의 독성이 최소이거나 전혀 없는 효과적인 작용제 (agent)가 분명히 요구되고 있다.

이러한 작용제로서 신경 사 단백질들 및 이들의 관련 분자들이 있다.

암 및 양성 과성장

암은 조절되지 않는 세포 성장 및 재생을 일으키는, 세포의 내부 조절 메카니즘에서의 이상을 의미한다. 정상 세포들은 조직을 구성하며, 이들 세포가 지정되고 조절되고 조화된 단위로서 작용하는 (탈분화) 능력을 상실하는 경우, 이러한 결함은 세포 집단 사이에서 혼란을 일으킨다. 이와 같은 현상이 일어났을 때, 종양이 형성된다.

조직의 양성 과성장이란 유기체로부터 세포를 제거하는 것이 바람직한 이상증을 말한다. 양성 종양은 신체를 통해 전이되지는 않지만 질병 증상을 일으키는 세포 증식을 의미한다. 이러한 종양은 뇌와 같은 기관에서 접근할 수 없는 부위내에 위치하게 되면 치명적일 수 있다. 양성 종양에는 폐, 뇌, 피부, 뇌하수체, 갑상선, 부신 피질 및 수질, 난소, 자궁, 고환, 결합 조직, 근육, 소장, 귀, 코, 인후부, 편도, 입, 간, 담낭, 췌장, 전립선, 심장 및 기타 기관을 비롯한 기관의 양성 종양이 있다.

암 치료

수술은 흔히 암 치료에서의 첫번재 단계이다. 수술의 목적은 다양하다. 수술은 종종 명백한 종양을 가능한 많이 제거하거나, 적어도 종양의 "용적을 축소시키는" (종양의 대부분을 제거하여 다른 수단에 의해 처치할 필요가 거의 없도록 함)데 이용된다. 암의 유형 및 위치에 따라, 수술로서 환자의 증상을 어느 정도 완화시킬 수 있다. 예를 들어, 외과의사가 확장성 뇌종양의 대부분을 제거하는 경우, 두개골 내압이 감소되어 환자의 증상이 호전된다.

모든 종양을 수술할 수 있는 것은 아니다. 어떤 종양은 신체의 여러 부위들에 위치할 수 있어서 이들을 완전히 제거하기란 불가능하다. 이들의 예로는 뇌간 (호흡을 조절하는 뇌의 부분)의 종양 또는 주요 혈관의 내부 및 주변에서 증식하는 종양이 있다. 이러한 경우, 수술의 역할은 종양 제거와 관련된 높은 위험으로 인해 제한적이다.

어떤 경우, 수술이 종양의 용적을 축소시키는데 이용되지 않는 이유는 수술이 단순히 필요하지 않기 때문이다. 그러한 예로는 화학요법 및 방사선요법의 조합에 대해 매우 잘 반응하는 림프절 암인 호지킨 (Hodgkin's) 림프종이 있다. 호지킨 림프종에서, 수술은 치료를 수행하는데 있어서 드물게 요구되지만, 진단을 확정하기 위해서는 거의 항상 이용된다.

화학요법은 다른 형태의 통상적인 암 치료법이다. 본질적으로, 화학요법은 전신에서 빠르게 분열하는 세포 (종양에서 발견되는 세포 등)를 특이적으로 공격하는 약물 (일반적으로 경구 또는 주사로 투여함)의 이용을 포함한다. 이는 화학요법이, 이미 전이된 암, 및 혈액 및 림프계를 통해 확산될 가능성이 높으며 원발성 종양 이외의 분명하지 않은 종양을 치료하는데 있어서 유용해지도록 한다. 또한, 화학요법을 이용하여 수술 및 방사선요법에 대한 종양의 국소적 반응을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 두부 및 경부의 몇몇 암의 경우가 그러하다.

불행하게도, 정상적으로 빠르게 분열하는 (위 및 모발의 라이닝 (lining)과 같은) 인체의 다른 세포들도 화학요법에 의해 영향을 받는다. 이러한 이유로 인해, 어떤 (전부가 아니기는 해도) 화학요법제는 오심 또는 모발 손상을 유발한다. 이러한 부작용은 일시적이며, 의사들은 이러한 부작용들 중 많은 것들을 완화시키는데 도움을 줄 수 있는 약물들을 처방한다. 그래서, 일반적으로 환자들은 화학요법 처치에 충분히 견뎌낸다. 이 분야의 지식이 계속 축적하게 됨에 따라, 연구자들은 암세포를 사멸시키는데 있어서 보다 우수할 뿐 아니라, 환자에 대한 부작용이 보다 적은 새로운 화학요법제를 개발하게 될 것이다.

화학요법제는 다양한 방식으로 환자에게 투여된다. 일부는 매일 또는 주 1회 투여되는 환제이거나, 몇몇 다른 스케쥴 및 일부는 정맥 주사에 의해 투여된다. 주사가능한 화학요법의 경우, 환자는 치료를 위해 의사 사무실이나 병원에 내원한다. 다른 화학요법제는 하루 24시간 동안 혈류내로 지속적으로 주입하는 것이 필요하다. 이러한 유형의 화학요법의 경우, 소수술 (minor surgery) 처치를 수행하여 작은 펌프를 환자에게 이식한다. 이후, 펌프는 약물을 서서히 투여하게 된다. 많은 경우에서, 영구적인 포트 (port)를 환자의 정맥내에 위치시켜 주사 바늘을 반복적으로 삽입해야 하는 필요성을 배제한다.

방사선요법은 암을 치료하는데 있어서 통상적으로 이용되는 또 다른 수단이다. 방사선은 종양 세포내의 DNA를 손상시켜 암을 사멸시킨다. 방사선은 2가지 가능한 방식으로 "적용"된다. 가장 통상적인 첫번째 방식은 방사선 빔을 환자에게 매우 정밀한 방식으로 종양에 집중하여 조사하는 것을 포함한다. 이를 위해, 환자를 테이블 위에 놓고, 빔을 남성/여성의 신체 둘레를 따라 이동시킨다. 이는 몇분에 걸쳐서만 수행하는 것이지만, 3 내지 6주 동안 주당 5일 (종양의 유형에 따라)수행하여 특정 처방된 총 "투여량"을 달성한다.

근접방사선치료법이라 불리우며 종종 이용되는 또 다른 방사선 방법은 방사활성 펠릿 ("시드 (seed)") 또는 와이어 (wire)를 취하여 이들을 체내의 종양 부위에 이식하는 것을 포함한다. 이식은 일시적 또는 영구적인 것일 수 있다. 영구적 이식의 경우, 시드 중 방사선은 수일 또는 수주의 기간에 걸쳐 "붕괴"하거나 소멸하여 환자는 방사성을 띠지 않는다. 일시적 이식의 경우, 방사선의 총 투여량은 일반적으로 약 2일 동안 전달되며, 환자는 이 기간 동안 병원에 입원해 있어야 한다. 상기 2가지 유형의 근접방사선치료법에서, 방사선은 일반적으로 매우 표적화된 부위로 전달되어 (화학요법이 전신을 치료하는 것과는 달리) 암에 대한 국소적인 조절을 달성한다.

잘 선별된 어떤 환자들은 골수 이식에서 언급될 수 있다. 이 방법은 일반적으로 환자가 특히 공격성인 암 또는 통상의 요법에 의한 치료 후 재발하는 암을 보유하기 때문에 수행한다. 골수 이식은 복잡한 방법이다. 골수 이식에는 많은 유형이 있으며, 부작용 및 치료를 유발하는데 있어서 이들의 잠재력에 따라 달라진다. 많은 이식법은 특정의 중심에서 수행되며, 많은 경우에서 이들의 용도는 조사를 위한 것으로 고려된다.

다른 많은 요법들이 있지만, 이들의 대부분은 임상 실험에서 여전히 연구 중에 있으며 아직까지 표준 치료법이 되지는 못하였다. 그러한 예로는 면역요법, 모노클로날 항체, 항-혈관형성 (angiogenesis) 인자 및 유전자요법의 이용이 포함된다.

면역요법: 방사선 또는 화학요법과는 상당히 다르게 환자 자신의 면역계가 암에 저항하는 것을 돕도록 고안된 다양한 기법들이 있다. 흔히, 목적을 달성하기 위해 연구자들은 특별히 유도된 백신을 환자에게 주사한다. 이 분야 연구의 대부분은 흑색종에서 수행되어 왔지만, 본 발명에 이르러서는 다른 암도 치료된다.

모노클로날 항체: 세포막에서 암세포 및 비-암세포 사이의 차이를 이용하여 암세포에 부착되도록 (정상 세포에는 부착되지 않음) 특별히 설계한 작은 단백질이 있다. 항체를 환자에게 투여하기 전에, 항체는 종종 다양한 세포독성 화합물로 "태그 (tagged)" (부착)되거나, 방사활성으로 되어, 그 결과 항체가 암세포를 차별적으로 표적화함으로써 세포독성제를 목적하는 세포로 전달하게 된다.

항-혈관형성 인자: 암세포가 빠르게 분열하여 종양이 증식하기 때문에, 이들은 곧 자신들에 공급되는 혈액량보다 더 커질 수 있게 된다. 이에 대한 보충으로, 일부 종양은 이들 근처 혈관의 성장을 유도하는 것을 돕는 것으로 알려진 화합물을 분비하며, 따라서 종양 세포에 영양분의 지속적인 공급을 보장한다. 최근, 연구자들은 이러한 과정을 종결시키는 (혈관의 성장을 정지시키는) 방법을 연구하였다.

유전자요법: 암은 일련의 돌연변이의 생성물로서 결국에는 암세포의 생산 및 그의 과도한 증식을 초래한다. 암은 그의 증식을 억제 또는 정지시키는 작용을 하거나, 세포의 프로그래밍된 세포 메카니즘을 작동시켜 세포를 파괴하거나, 세포에 대한 면역 인식을 증대시키거나, 또는 독성 대사산물을 전환시키는 전구약물 또는 종양 성장을 억제하는 사이토카인을 발현시키는 유전자를 암세포에 도입하여 치료할 수 있다.

양성 종양 및 기형의 치료

양성 종양 및 기형은 또한 수술, 방사선요법, 약물요법, 열 또는 전기에 의한 절제 및 냉동요법 등을 비롯한 다양한 방법에 의해 치료할 수 있다. 양성 종양들이 전이되지는 않지만, 이들은 크게 증식하며 재발할 수 있다. 양성 종양의 적출 수술은 일반적으로 수술에 있어서의 모든 어려움 및 부작용을 가지며, 흔히 뇌하수체 선종, 뇌수막종 및 전립선 과형성증과 같은 일부 양성 종양의 경우에는 수술을 반복적으로 수행해야 한다.

원치않는 세포 구성원을 포함하는 또 다른 증상들이 있으며, 이 경우 세포를 선별적으로 제거하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 심장 질환 및 발작은 혈관벽을 변형시키고, 관강을 협소하게 만들고, 혈류량을 감소시키고, 병소에서 혈병이 형성되기 쉽게 만들어, 결국에는 차단 및 경색을 초래하는, 섬유지방 및 변형된 평활근 구성원들의 증식성 병소인 아테롬성경화증에 의해 일반적으로 유발된다. 아테롬성경화증에 대하여는 우회로조성술; 인공 이식술; 재소통술, 소파술, 방사선, 레이저 또는 다른 제거술을 이용한 혈관성형술; 지질 감소를 통해 아테롬성경화증을 억제하는 약물요법; 항-응고요법; 및 식이요법, 운동 및 생활양식의 일반적인 측정과 같은 다양한 치료법이 있다. 수술적 방법에 따른 위험성 및 부작용이 없는, 아테롬성경화증 병소의 제거 방법이 필요하다.

선별적으로 제거되는 것이 바람직한, 원치않는 세포 구성원의 다른 예로는 바이러스의 유도에 의한 증식, 예를 들어 사마귀가 포함된다. 또 다른 예로는 염증성 증상에 존재하는 비대성 염증 덩어리 및 비대성 반흔 또는 켈로이드가 있다.또 다른 예는 원치않는 모발, 예를 들어 얼굴 털을 제거하는 것과 같은 화장 상황, 또는 화장 목적을 위해 예를 들어 얼굴 피부 및 결합 조직, 또는 사지의 피부 및 결합 조직에서와 같이 원치않는 조직 부위를 축소하는 경우에서 나타난다.

또 다른 예들은 당업계의 통상의 기술을 가진 자에게는 분명할 것이다. 이러한 예들의 전부 또는 대부분에서, 원치않는 세포 구성원을 종래 요법의 위험 및 부작용 없이 제거 또는 파괴하거나, 원치않는 세포 구성원을 보다 정밀하게 제거할 수 있는 치료법이 요구되고 있다.

신경 사 단백질

신경 사 단백질 (NTP)은 최근에 특성화된 뇌 단백질의 새로운 군이다. 이 군의 구성원 중 하나인 AD7C-NTP는 신경염 발생 및 세포 사멸에 관련된 기능을 갖는 41 kD 막결합 인단백질이다 (de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100:3093-3104 (1997); de la Monte et al., Alz. Rep., 2:327-332 (1999); de la Monte SM and Wands JR, Journal of Alzheimer's Disease, 3:345-353 (2001)). AD7C-NTP에 대한 유전자 및 예상 단백질 서열이 확인 및 기술되었다 (de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100:3093-3104 (1997)). 상기 41 kD 단백질 종 이외에도, 다른 종류의 신경 사 단백질들 (약 26 kD, 약 21 kD, 약 17 kD 및 약 15 kD)이 확인되었으며, 신경외배엽 종양, 성상세포종 및 교모세포종, 및 저산소증, 허혈증 또는 뇌경색으로 인한 손상과 관련이 있었다 (Xu et al., Cancer Research, 53:3823-3829; de la Monte et al., J. Neuropathol. Exp. Neuron, 55 (10):1038-50 (1996), de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 138 (1-2):26-35 (1996); de la Monte et al.,J. Neurol. Sci., 135 (2):118-25 (1996); de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100:3093-3104 (1997); and de la Monte et al., Alz. Rep., 2:327-332 (1999)).

신경 사 단백질은 "알츠하이머 병에서 신경 사 단백질 유전자의 발현 및 검출 (Neural Thread Protein Gene Expression and Detection of Alzheimer's Disease)"이라는 제목으로 미국 특허 제5,948,634호, 동 제5,948,888호 및 동 제5,830,670호에 기재 및 청구되어 있으며, "신경계 질환 및 기능장애의 검출 방법 (Method of Detecting Neurological Disease or Dysfunction)"이라는 제목으로 미국 특허 제6,071,705호에 기재 및 청구되어 있다. 이들 특허문헌의 방법 및 세부사항은 본원에 특별히 참고로 포함된다.

AD7C-NTP가 알츠하이머 병 (AD)과 관련이 있음을 입증하는 결정적인 증거가 있다. AD7C-NTP mRNA는 대조군에 비해 AD 뇌에서 상향조절되고; 뇌 및 CSF에서 AD7C-NTP 단백질 수준은 대조군보다 AD에서 높고; AD7C-NTP 면역반응성은 노인성 반점, 신경섬유얽힘 (NFT), 퇴행성 뉴런, 신경망 사, 및 AD 및 다운증후군 뇌의 이영양성 신경염의 발생에서 나타난다 (Ozturk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:419-423 (1989); de la Monte et al., J. Clin. Invest., 86 (3):1004-13 (1990); de la Monte et al., J. Neural. Sci., 113 (2):152-64 (1992); de la Monte et al., Ann. Neurol., 32 (6):733-42 (1992); de la Monte et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55 (10):1038-50 (1996), de la Monte et al., J; Neurol. Sci., 138 (1-2):26-35 (1996); de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 135 (2):118-25 (1996); de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100:3093-3104(1997); and de la Monte et al., Alz. Rep., 2:327-332 (1999)). AD7C-NTP는 또한 다운증후군의 뇌 조직에서 확인되었다 (Wands et al., 국제 특허 공개 제WO 90/06993호; de la Monte et al., Alz. Rep., 2:327-332 (1999)). 또한 AD7C-NTP는 알츠하이머 병에서 세포 사멸 과정과 관련된다 (de la Monte and Wands, J. Neuropatho. and Exp. Neuro., 60:195-207 (2001)).

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원치않는 세포 구성원을 치료하기 위한, 신규 저독성 치료법에 대한 당업계의 요구가 있다. 본 발명은 이러한 요구를 만족시킨다.

<발명의 개요>

본 발명은 원치않는 세포의 증식, 예를 들어 양성 및 악성 종양, 샘 (예, 전립선)의 과형성증, 원치않는 얼굴 털, 사마귀 및 원치않는 지방 조직을 치료하는 신규한 방법에 관한 것이다. 이 방법은 필요로 하는 포유동물에게 치료 유효량의 신경 사 단백질 (NTP)을 투여하는 것을 포함한다.

NTP는 단독으로 또는 담체 또는 항체와 함께 투여될 수 있다. 또한, NTP는 양성 및 악성 종양 및 원치않거나 해로운 다른 세포 증식증을 치료하기 위한 다른 요법과 함께 이용할 수 있다.

상기 일반적인 설명 및 하기 상세한 설명은 모두 예시 및 설명을 위한 것이며, 청구된 바와 같은 본 발명에 대한 추가 설명을 제공하기 위한 것이다. 당업자라면 하기 본 발명의 상세한 설명으로부터 다른 목적, 이점 및 새로운 특징을 쉽게 알 것이다.

본 발명은 신경 사 (thread) 단백질 (NTP) 및 관련 분자를 사용하여 세포 구성원의 제거 또는 파괴를 필요로 하는 증상, 예를 들어 인간의 양성 또는 악성 종양을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 상기 화합물을 단독으로 또는 담체와 조합하여 근육내, 경구, 정맥내, 경막내, 종양내, 비내, 국소, 경피 등으로 투여하는 것을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

도 1은 AD7c-NTP 유전자의 핵산 서열 및 이 유전자의 AD7c-NTP 단백질 생성물의 완전한 아미노산 서열을 나타낸다 (미국 특허 제5,830,670호, 동 제5,948,634호 및 동 제5,948,888호; de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100:3093-3104 (1997); NCBI Entrez-단백질 기입 번호 AAC08737; PID g3002527로부터의 서열 120 및 서열 121) [서열 1].

도 2는 아미노산 122개의 신경 사 단백질의 완전한 아미노산 서열을 나타낸다 (미국 특허 제5,830,670호, 동 제5,948,634호 및 동 제5,948,888호; NCBI Entrez-단백질 기입 번호 AAE25447 PID gl0048540으로부터의 서열 40) [서열 2].

도 3은 아미노산 112개의 신경 사 단백질의 완전한 아미노산 서열을 나타낸다 (NCBI Entrez-단백질 기입 번호 XP_032307 PID gl5928971) [서열 3].

도 4는 아미노산 106개의 신경 사 단백질-유사 단백질의 완전한 아미노산 서열을 나타낸다 (NCBI Entrez-단백질 기입 번호 AAH14951 PID gl5928971) [서열 4].

도 5는 아미노산 106개의 신경 사 단백질-유사 단백질의 완전한 아미노산 서열을 나타낸다 (NCBI Entrez-단백질 기입 번호 XP_039102 PID gl8599339) [서열 5].

도 6은 아미노산 98개의 신경 사 단백질의 완전한 아미노산 서열을 나타낸다 (미국 특허 제5,830,670호, 동 제5,948,634호 및 동 제5,948,888호; NCBI Entrez-단백질 기입 번호 AAE25445, PID gl0048538의 서열 30) [서열 6].

도 7은 아미노산 75개의 신경 사 단백질의 완전한 아미노산 서열을 나타낸다(미국 특허 제5,830,670호, 동 제5,948,634호 및 동 제5,948,888호; NCBI Entrez-단백질 기입 번호 AAE25448, PID gl0048541으로부터의 서열 48) [서열 7].

도 8은 아미노산 68개의 신경 사 단백질의 완전한 아미노산 서열을 나타낸다 (미국 특허 제5,830,670호, 동 제5,948,634호 및 동 제5,948,888호; NCBI Entrez-단백질 기입 번호 AAE25446, PID glu048539로부터의 서열 36) [서열 8].

도 9는 아미노산 61개의 신경 사 단백질-유사 단백질의 완전한 아미노산 서열을 나타낸다 (NCBI Entrez-단백질 기입 번호 AAH02534, PID gl2803421) [서열 9].

도 10은 AD7C-NTP 주사 부위에서 주사 24시간 후 자발적인 피하 조직 및 근육 괴사를 나타낸다. 광학 현미경, 헤마톡실린 및 에오신 염색, ×400.

도 11은 AD7C-NTP 주사 부위에서 주사 24시간 후 자발적인 피하 조직 및 근육 괴사를 나타낸다. 광학 현미경, 헤마톡실린 및 에오신 염색, ×400.

도 12는 AD7C-NTP 주사 부위에서 주사 24시간 후 자발적인 피하 조직 및 근육 괴사를 나타낸다. 광학 현미경, 헤마톡실린 및 에오신 염색, ×400.

도 13은 AD7C-NTP 주사 부위에서 주사 24시간 후 자발적인 피하 조직 및 근육 괴사를 나타낸다. 광학 현미경, 헤마톡실린 및 에오신 염색, ×1000.

도 14는 AD7C-NTP 주사 부위에서 주사 24시간 후 자발적인 피하 조직 및 근육 괴사를 나타낸다. 광학 현미경, 헤마톡실린 및 에오신 염색, ×1000.

도 15는 AD7C-NTP 주사 24시간 후 종양 괴사를 나타낸다. 광학 현미경, 헤마톡실린 및 에오신 염색, ×200.

도 16은 AD7C-NTP 주사 24시간 후 종양 괴사를 나타낸다. 광학 현미경, 헤마톡실린 및 에오신 염색, ×400.

도 17은 AD7C-NTP 주사 24시간 후 종양 괴사를 나타낸다. 광학 현미경, 헤마톡실린 및 에오신 염색, ×1000.

도 18은 AD7C-NTP 주사 2주 후 종양 괴사를 나타낸다. 광학 현미경, 헤마톡실린 및 에오신 염색, ×40.

도 19는 AD7C-NTP 주사 2주 후 종양 괴사를 나타낸다. 광학 현미경, 헤마톡실린 및 에오신 염색, ×200.

<바람직한 실시양태의 상세한 설명>

정의

본원에 사용된 용어 및 어구는 달리 지시되지 않는다면 하기 나타낸 바와 같이 정의된다.

용어 "AD7c-NTP"는 41 kD 크기의 단백질을 의미하며, 이를 코딩하는 유전자 및 핵산 서열은 문헌 (de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100:3093-104 (1997)), 미국 특허 제5,948,634호, 동 제5,948,888호 및 동 제5,830,670호의 서열 120 및 서열 121, 및 및 젠뱅크 번호 AF010144에 기재되어 있고, 이에 대한 핵산 및 아미노산 서열은 도 1에 제시되어 있다. 용어 "AD7c-NTP"는 또한 AD7c-NTP의 생물학적 활성 단편, 변이체 및 유도체, 동족체, 펩티드 모방체, 리버스 (reverse)-D 펩티드 및 에난티오머를 포함한다.

용어 "NTP" 또는 "신경 사 단백질"은 신경 사 단백질 및 관련 분자 (췌장 사단백질 포함) 및 이러한 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 의미하며, 하기 단백질, 및 이러한 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다:

(a) AD7c-NTP;

(b) 약 42, 약 26, 약 21, 약 17, 약 14 및 약 8 kD 크기의 신경 사 단백질 종류 (미국 특허 제5,948,634호, 동 제5,948,888호, 동 제5,830,670호 및 동 제6,071,705호, 및 문헌 (de la Monte et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55 (10):1038-50 (1996), de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 138 (1-2):26-35 (1996); de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 135 (2):118-25 (1996), de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100:3093-3104 (1997) and de la Monte et al., Alz. Rep., 2:327-332 (1999))에 기재된 바와 같음);

(c) 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection, Manassas, VA)에 기탁 번호 HB-12546로 기탁된 모노클로날 항체 #2 또는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁 번호 HB-12545로 기탁된 모노클로날 항체 #5에 의해 특이적으로 인식되는 단백질;

(d) AD7c-NTP 유전자에 의해 코딩되는 단백질;

(e) 미국 특허 제5,830,670호 동 제5,948,634호 및 동 제5,948,888호로부터의 서열 40에 기재되어 있고 NCBI Entrez 단백질 기입 번호 AAE25447, PID gl0048540에 나열된 아미노산 122개의 신경 사 단백질 (이에 대한 아미노산 서열은 도 2에 제시되어 있음);

(f) NCBI Entrez 단백질 기입 번호 XP_032307, PID gl4725132에 나열된 아미노산 112개의 신경 사 단백질 (이에 대한 아미노산 서열은 도 3에 제시되어 있음);

(g) NCBI Entrez 단백질 기입 번호 AAH14951 PID gl5928971에 나열된 아미노산 106개의 신경 사 단백질-유사 단백질 (이에 대한 아미노산 서열은 도 4에 제시되어 있음);

(h) NCBI Entrez 단백질 기입 번호 XP_039102, PID gl8599339에 나열된 아미노산 106개의 신경 사 단백질-유사 단백질 (이에 대한 아미노산 서열은 도 5에 제시되어 있음);

(i) 미국 특허 제5,830,670호, 동 제5,948,634호 및 동 제5,948,888호로부터의 서열 30에 기재되어 있고 NCBI Entrez 단백질 기입 번호 AAE25445, PID gl0048538에 나열되어 있는 아미노산 98개의 신경 사 단백질 (이에 대한 아미노산 서열은 도 6에 제시되어 있음);

(j) 미국 특허 제5,830,670호, 동 제5,948,634호 및 동 제5,948,888호로부터의 서열 48에 기재되어 있고 NCBI Entrez 단백질 기입 번호 AAE25448, PID gl0048541에 나열된 아미노산 75개의 신경 사 단백질 (이에 대한 아미노산 서열은 도 7에 제시되어 있음);

(k) 미국 특허 제5,830,670호, 동 제5,948,634호 및 동 제5,948,888호로부터의 서열 36에 기재되어 있고 NCBI Entrez 단백질 기입 번호 AAE25446, PID gl0048539에 나열된 아미노산 68개의 신경 사 단백질 (이에 대한 아미노산 서열은 도 8에 제시되어 있음);

(l) NCBI Entrez 단백질 기입 번호, PID gl2803421에 나열된 아미노산 61개의 신경 사 단백질-유사 단백질 (이에 대한 아미노산 서열은 도 9에 제시되어 있음);

(m) 췌장 사 단백질;

(n) 미국 특허 제6,071,705호에 기재된 신경 췌장 사 단백질 (nPTP); 및

(o) 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁된 HB 9934, HB 9935 및 HB 9936로 이루어진 군으로부터의 하이브리도마에 의해 생산되는 항체에 의해 특이적으로 인식되는 단백질.

용어 "NTP"는 또한 NTP의 생물학적으로 활성인 단편, 변이체 및 유도체, 동족체, 펩티드 모방체, 리버스-D 펩티드 및 에난티오머를 포함한다.

용어 "생물학적으로 활성인"은 해롭거나 원치않는 세포 및 조직을 파괴하여 이들의 제거를 촉진시키거나 이들의 추가 증식을 억제하는 능력을 가지며, 주로 국소적인 효과를 나타내고 전신에서의 독성이 최소이거나 전혀 없는 단백질, 폴리펩티드 단편, 변이체, 유도체, 동족체, 리버스-D 펩티드, 펩티드 모방체 또는 에난티오머를 의미하며, 본원의 실시예 1의 세포 배양 세포독성 분석에서 세포의 생존성을 제거하거나 감소시키는 능력, 본원의 실시예 2의 생체내 조직 분석에서 세포 손상 및(또는) 조직 괴사를 유발하는 능력, 또는 본원의 실시예 3의 종양 분석에서 세포 손상, 조직 괴사 또는 종양 축소를 유발하는 능력을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

용어 "단편"은 NTP 단백질 또는 변이체, 유도체, 동족체, 리버스-D 펩티드또는 그의 에난티오머의 연속적인 아미노산 서열로 이루어진, 생물학적으로 활성인 단백질 또는 폴리펩티드를 의미하며, 스플라이스 변이체와 같은 자연 발생적인 단편 및 자연 발생적인 생체내 프로테아제 활성으로부터 생성되는 단편을 포함한다. 이러한 단편은 아미노 말단, 카르복시 말단 및(또는) 내부에서 (예를 들어, 자연적인 스플라이싱에 의해) 절단될 수 있으며, NTP 단백질의 변이체 또는 유도체일 수 있다. 상기 단편은 아미노 말단의 메티오닌이 있거나 없이 제조될 수 있다. 용어 "단편"은, 동일하든지 상이하든지 간에, 동일한 NTP 단백질로부터 유래하는 단편, 또는 직접 연결되거나 링커를 통해 함께 연결되며 공통적이거나 그렇지 않은 연속적인 아미노산 서열을 갖는 단편을 포함한다.

용어 "변이체"는 NTP 단백질의 아미노산 서열에 비해 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및(또는) 삽입이 존재하는 생물학적으로 활성인 단백질 또는 폴리펩티드를 의미하며, NTP 단백질의 자연 발생적인 대립유전자 변이체 또는 다른 스플라이스 변이체를 포함한다. 용어 "변이체"는 펩티드 서열에서 하나 이상의 아미노산이 유사하거나 상동성인 아미노산(들) 또는 유사하지 않은 아미노산(들)로 치환된 것을 포함한다. 아미노산을 유사하거나 상동성인 것으로 등급화할 수 있는 많은 기준들이 있다 (Gunnar von Heijne, Sequence Analysis in Molecular Biology, p. 123-39 (Academic Press, New York, NY 1987)). 바람직한 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 알라닌 치환을 포함한다. 다른 바람직한 치환은 단백질의 전체 순 전하, 극성 또는 소수성에 거의 또는 전혀 영향을 주지 않는 보존적 치환을 포함한다. 보존적 치환은 하기 표 1에 기재되어 있다.

보존적 아미노산 치환
염기성	아르기닌, 라이신, 히스티딘
산성	글루탐산, 아스파르트산
하전되지 않은 극성	글루타민, 아스파라긴, 세린, 쓰레오닌, 티로신
비극성	페닐알라닌, 트립토판, 시스테인, 글리신, 알라닌, 발린, 프롤린, 메티오닌, 루이신, 이소루이신

아미노산 치환의 다른 분류
본래 잔기	치환체
Ala	gly; ser
Arg	lys
Asn	gln; his
Asp	glu
Cys	ser
Gln	asn
Glu	asp
Gly	ala; pro
His	asn; gln
Ile	leu; val
Leu	ile; val
Lys	arg; gln; glu
Met	leu; tyr; ile
Phe	met; leu; tyr
Ser	thr
Thr	ser
Trp	tyr
Tyr	trp; phe
Val	ile; leu

다른 변이체들은 (a) 치환 부위에서 폴리펩티드 골격의 구조를 예를 들어 시트 또는 나선 형태로 유지하거나, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성을 유지하거나, 또는 (c) 측쇄의 크기를 유지하는 효과에서 상당한 차이가 있는 잔기들을 선택하는 것과 같이 덜 보존적인 아미노산 치환들로 이루어질 수 있다. 일반적으로 기능에 대하여 보다 큰 효과를 나타낼 것으로 예상되는 치환은 (a) 글리신및(또는) 프롤린이 다른 아미노산에 의해 치환되거나 결실 또는 삽입되는 것; (b) 친수성 잔기, 예를 들어 세릴 또는 쓰레오닐이 소수성 잔기, 예를 들어 루이실, 이소루이실, 페닐알라닐, 발릴 또는 알라닐로(또는 이들에 의해) 치환되는 것; (c) 시스테인 잔기가 임의의 다른 잔기로(또는 다른 잔기에 의해) 치환되는 것; (d) 양전기성 측쇄, 예를 들어 라이실, 아르기닐 또는 히스티딜을 갖는 잔기가 음전기성 전하를 갖는 잔기, 예를 들어 글루타밀 또는 아스파르틸로(또는 그에 의해) 치환되는 것; 또는 (e) 큰 측쇄를 갖는 잔기, 예를 들어 페닐알라닌이 이러한 측쇄를 갖지 않는 것, 예를 들어 글리신으로(또는 그에 의해) 치환되는 것이 있다. 다른 변이체로는 새로운 글리코실화 및(또는) 인산화 부위(들)을 생성시키도록 계획된 것들, 또는 기존의 글리코실화 및(또는) 인산화 부위(들)을 결실시키도록 계획된 것들이 포함된다. 변이체는 글리코실화 부위, 단백질분해 절단 부위 및(또는) 시스테인 잔기에서 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함한다. 변이체는 또한 링커 펩티드 상의 NTP 아미노산 서열의 앞 또는 뒤에서 추가의 아미노산 잔기를 갖는 NTP 단백질, 단편, 유도체, 동족체, 리버스-D 펩티드 및 안티머 (anitmer)를 포함한다. 예를 들어, 시스테인 잔기를 NTP 단편의 아미노 및 카르복시 말단의 모두에 부가하여 디-술피드 결합을 형성시킴으로써 NTP 단편을 고리화할 수 있다. 또한, 용어 "변이체"는 NTP 또는 AD7c-NTP의 단편, 유도체, 동족체, 리버스-D 펩티드 및 에난티오머의 변이체를 포함한다.

용어 "변이체"는 자연적인 과정, 예를 들어 프로세싱 및 다른 번역후 변형뿐 아니라, 예를 들어 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 분자, 당, 포스페이트 및(또는)다른 분자의 부가에 의한 것과 같은 화학적 변형 기술에 의해 화학적으로 변형된, 생물학적으로 활성인 단백질 또는 폴리펩티드를 의미하며, 여기서 상기 분자 또는 분자들은 본래 야생형 NTP 단백질에는 부착되어 있지 않다. 유도체는 염을 포함한다. 이와 같은 화학적 변형은 기초 문헌 및 보다 상세한 논문뿐 아니라, 방대한 연구 문헌에 충분히 기술되어 있으며, 당업자에게 잘 알려져 있다. 당업자라면 동일한 유형의 변형이 주어진 단백질 또는 폴리펩티드의 여러 부위들에 동일한 정도 또는 다양한 정도로 존재할 수 있음을 알 것이다. 또한, 주어진 단백질 또는 폴리펩티드는 많은 유형의 변형을 포함할 수 있다. 변형은 펩티드 골격, 아미노산 측쇄, 및 아미노 또는 카르복실 말단을 비롯하여 단백질 또는 폴리펩티드의 어느 곳에서나 일어날 수 있다. 변형은 예를 들어 아세틸화, 아실화, ADP 리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유결합 부착, 헴 잔기의 공유결합 부착, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유결합 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유결합 부착, 포스포티딜이노시톨의 공유결합 부착, 가교결합, 고리화, 디술피드 결합 형성, 탈메틸화, 공유 가교결합의 형성, 시스테인의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마-카르복실화, 글리코실화, GPI 앵커 형성, 히드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 단백질분해 과정, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 글리코실화, 지질 부착, 술페이션 (sulfation), 글루탐산 잔기의 감마-카르복실화, 히드록실화 및 ADP-리보실화, 세레노일화, 술페이션, 트랜스퍼-RNA의 매개에 의한 아미노산의 단백질로의 부가, 예로서 아르기닐화 및 유비퀴틴화를 포함한다. 예를 들어, 문헌 (Proteins-Structure And Molecular Properties, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H.Freeman and Company, New York (1993) and Wold, F.,"Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects," pgs. 1-12 in Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York (1983); Seifter et al., Meth. Enzymol. 182:626-646 (1990) and Rattan et al.,"Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging," Ann. N. Y. Acad. Sci. 663: 48-62 (1992))을 참조한다. 용어 "유도체"는 분지되거나 분지화 있거나 없이 고리화되는 단백질 또는 폴리펩티드를 형성시키는 화학적 변형을 포함한다. 고리형, 분지형 및 분지된 원형 단백질 또는 폴리펩티드는 번역 이후의 자연적인 과정으로부터 생성될 수 있으며, 또한 합성 방법만으로도 제조할 수 있다. 용어 "유도체"는 또한 단편, 변이체, 동족체, 리버스-D 펩티드, 펩티드 모방체 및 에난티오머의 유도체를 포함한다.

용어 "동족체"는, 이 경우 두 폴리펩티드의 아미노산 위치에서의 유사성을 비교하는데 통상적으로 이용되는 표준 방법에 의해 결정한 바로는, NTP 단백질 또는 AD7c-NTP의 아미노산 서열에서 75％ 이상이 동일한, 생물학적으로 활성인 단백질을 의미한다. 두 단백질 사이의 유사성 또는 동일성 정도는 문헌 (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing : Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987;Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; and Carillo H. and Lipman, D., SIAM, J : Applied Math., 48: 1073 (1988))에 기재된 것들을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 공지된 방법에 의해 쉽게 계산할 수 있다. 동일성을 결정하는 바람직한 방법은 시험되는 서열들 사이에서 가장 큰 대응을 제공하도록 계획된다. 동일성 및 유사성을 결정하는 방법은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램으로 분류된다. 두 서열들 사이의 동일성 및 유사성을 결정하는 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법으로는 GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12 (1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN, 및 FASTA (Atschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215: 403-410 (1990))가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. BLAST X 프로그램은 NCBI 및 다른 공급원 (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990))으로부터 공개적으로 이용할 수 있다. 예를 들어, GAP (Genetic Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.)와 같은 컴퓨터 알고리즘을 이용하여, 서열 동일성 (％)이 결정될 두 단백질 또는 폴리펩티드를 이들의 각 아미노산들이 최적으로 매치되도록 정렬시킨다 (알고리즘에 의해 결정된 바와 같은 "매치된 스팬 (span)"). 갭 개방 패널티 (3 ×평균 대각선으로 계산됨; "평균 대각선"이란 사용되는 비교 매트릭스의 대각선의 평균임; "대각선"은 특정의 비교 매트릭스에 의해 각각의 완전한 아미노산에 배정된 점수 또는 숫자임) 및 갭 연장 패널티 (일반적으로 갭 개방 패널티의 1/10배임), 및 PAM 250 또는 BLOSUM 62와 같은 비교 매트릭스를 알고리즘과 함께 사용함. 표준 비교 매트릭스 (PAM250 비교 매트릭스에 대하여는 문헌 (Dayhoff et al. in : Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp. 3 [1978])을 참조; BLOSUM 62 비교 매트릭스에 대하여는 문헌 (Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:10915-10919 [1992])을 참조)가 또한 알고리즘에 의해 사용된다. 이어서, 동일성 (％)을 알고리즘에 의해 계산한다. 동족체는 NTP 또는 AD7c-NTP에 비해 통상적으로 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및(또는) 삽입을 가질 것이다.

용어 "펩티드 모방체"는 펩티드 또는 단백질의 생물학적 활성을 모방하지만 화학적 구조에 있어서 펩티드는 아닌, 즉 어떤 펩티드 결합 (즉, 아미노산 사이의 아미드 결합)을 포함하지 않는 생물학적으로 활성인 화합물을 의미한다. 본원에서 용어 펩티드 모방체는 본래 완전하게 펩티드는 아닌 분자, 예를 들어 슈도-펩티드, 세미-펩티드 및 펩토이드를 포함하는 넓은 의미로 사용된다. 이러한 넓은 의미의 펩티드 모방체 (펩티드의 일부는 펩티드 결합이 결여된 구조에 의해 대체됨)의 예는 하기 기재되어 있다. 완전하게 펩티드가 아니든지 부분적으로 펩티드가 아니든지 간에 본 발명에 따른 펩티드 모방체는 이 펩티드 모방체가 기초로 형성된 NTP 단백질내의 활성기의 3차원 배열과 매우 유사한 반응성 화학 잔기의 공간적인 배열을 제공한다. 이와 같은 활성-부위 기하구조의 유사성으로 인해, 펩티드 모방체는 펩티드의 생물학적 활성과 유사한 생물학적 시스템에 영향을 준다. 본 발명의 펩티드 모방체는 바람직하게는 상기 기재된 NTP 펩티드와 3차원 형태 및 생물학적 활성 모두에 있어서 실질적으로 유사하다. 펩티드 모방체를 형성시키는, 당업계에공지된 펩티드 구조 변형 방법의 예로는 특히 N-말단에서 활성에 불리한 영향을 주지 않으면서 단백질분해에 대한 증가된 안정성을 나타낼 수 있는 D-아미노산 잔기 구조를 초래하는 골격 키랄 중심의 역위를 포함한다. 한가지 예가 논문 ("Tritriated D-ala. sup. l-Peptide T Binding", Smith C. S. et al., Drug Development Res., 15, pp. 371-379 (1988))에 제공되어 있다. 제2의 방법은 안정성을 위해 고리형 구조, 예를 들어 N에서 C로의 쇄내 이미드 및 락탐을 변형시키는 방법이다 (Ede et al. in Smith and Rivier (Eds.) "Peptides : Chemistry and Biology", Escom, Leiden (1991), pp. 268-270). 이 방법의 예는 형태적으로 제한된 티모펜틴-유사 화합물, 예를 들어 본원에 전체 개시내용이 참고로 포함되는 미국 특허 제4,457,489호 ((1985), Goldstein, G. et al.)에 개시된 것들에서 제공된다. 제3의 방법은 NTP 펩티드내의 펩티드 결합을, 단백질분해에 대한 내성을 부여하는 슈도펩티드로 치환하는 것이다. 일반적으로 펩티드 구조 및 생물학적 활성에 영향을 주지 않는 다수의 슈도펩티드 결합이 기술되었다. 이러한 방법의 한가지 예는 레트로-인버소 (retro-inverso) 슈도펩티드 결합을 치환하는 것이다 ("Biologically active retroinverso analogues of thymopentin", Sisto A. et al in Rivier, J. E. and Marshall, G. R. (eds) "Peptides, Chemistry, Structure and Biology", Escom, Leiden (1990), pp. 722-773) and Dalpozzo, et al. (1993), Int. J. Peptide Protein Res., 41:561-566, 본원에 참고로 포함됨). 이러한 변형에 따라, 펩티드의 아미노산 서열은 하나 이상의 펩티드 결합이 레트로-인버소 슈도펩티드 결합에 의해 대체되는 것을 제외하면 상기 기재된 NTP 펩티드의 서열과동일할 수 있다. 바람직하게는, 대부분의 N-말단의 펩티드 결합이 치환되는 이유는, 이러한 치환이 N-말단에 작용하는 엑소펩티다제에 의한 단백질분해에 대해 내성을 부여하기 때문이다. 또한, 아미노산의 화학기들을 유사한 구조의 다른 화학기들로 대체하여 추가의 변형을 수행할 수 있다. 생물학적 활성이 전혀 또는 거의 손상되지 않는 효소적 절단에 대해 안정성을 증가시키는 것으로 알려진 다른 적합한 슈도펩티드 결합은 환원된 동배체 (isostere) 슈도펩티드 결합이다 (Couder, et al. (1993), Int. J. Peptide Protein Res., 41: 181-184, 본원에 그의 전체 개시내용이 참고로 포함됨). 따라서, 이러한 펩티드의 아미노산 서열은 하나 이상의 펩티드 결합이 동배체 슈도펩티드 결합에 의해 대체되는 것을 제외하고는 NTP 단백질의 서열과 동일할 수 있다. 바람직하게는, 대부분의 N-말단의 펩티드 결합이 치환되는 이유는, 이러한 치환이 N-말단에 작용하는 엑소펩티다제에 의한 단백질분해에 대한 내성을 부여하기 때문이다. 하나 이상의 환원된 동배체 슈도펩티드 결합을 갖는 펩티드의 합성은 당업계에 공지되어 있다 (Couder, et al. (1993), 상기에서 인용). 다른 예로는 케토메틸렌 또는 메틸술피드 결합을 도입하여 펩티드 결합을 대체하는 것이 포함된다.

NTP 펩티드의 펩토이드 유도체는 생물학적 활성에 대한 중요한 구조적 결정자를 보유하는 다른 종류의 펩티드 모방체를 나타내며, 펩티드 결합을 제거함으로써 단백질분해에 대한 내성을 부여한다 (Simon, et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:9367-9371, 그의 전체 개시내용이 본원에 참고로 포함됨). 펩토이드는 N-치환된 글리신의 올리고머이다. 다수의 N-알킬기가 기재되어 있으며, 각각은천연 아미노산의 측쇄에 상응한다 (Simon, et al. (1992), 상기 인용되어 있으며, 그의 전체 개시내용은 본원에 참고로 포함됨). NTP 아미노산의 전부 또는 일부는 대체되는 아미노산에 상응하는 N-치환된 글리신으로 대체된다.

용어 "리버스-D 펩티드"는 NTP 단백질, 단편, 변이체 또는 동족체의 L-아미노산 서열에 비해 반대 순서로 정렬된 D-아미노산으로 이루어진, 생물학적으로 활성인 단백질 또는 펩티드를 의미한다. 따라서, L-아미노산 NTP 단백질, 단편, 변이체 또는 동족체의 카르복시 말단 잔기는 D-아미노산 펩티드 등에 대한 아미노 말단이 된다. 예를 들어, AD7c-NTP 단편인 HVGQAG는 G_dA_dQ_dG_dV_dH_d가 되며, 여기서 A_d, G_d, H_d, Q_d및 V_d는 각각 L-아미노산인 A, G, H, Q 및 V에 상응하는 D-아미노산이다.

용어 "에난티오머"는 NTP 단백질, 단편, 변이체 또는 동족체의 아미노산 서열에서 하나 이상의 L-아미노산 잔기가 상응하는 D-아미노산 잔기(들)로 대체된, 생물학적으로 활성인 단백질 또는 펩티드를 의미한다.

본원에 기재된 아미노산 및 아미노산 잔기는 하기 표에 제공된 허용되는 1-문자 또는 3-문자 코드에 따라 언급될 수 있다. 달리 지시되지 않는다면, 이러한 아미노산 또는 잔기는 자연 발생적인 L 입체이성질체 형태이다.

아미노산	1-문자 기호	3-문자 기호
알라닌	A	Ala
아르기닌	R	Arg
아스파라긴	N	Asn
아스파르트산	D	Asp
시스테인	C	Cys
글루타민	Q	Gln
글루탐산	E	Glu
글리신	G	Gly
히스티딘	H	His
이소루이신	I	Ile
루이신	L	Leu
라이신	K	Lys
메티오닌	M	Met
페닐알라닌	F	Phe
프롤린	P	Pro
세린	S	Ser
쓰레오닌	T	Thr
트립토판	W	Trp
티로신	Y	Tyr
발린	V	Val

NTP 단백질 및 단편의 제조

본 발명에 의해 포함되는 NTP 단백질 (AD7c-NTP, 단편, 변이체, 유도체 및 동족체 포함)은 재조합 DNA 기술, 단백질 합성법, 및 자연 발생적인 NTP 및 AD7c-NTP 및 그의 단편 및 변이체의 단리와 같이 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 제조할 수 있다.

NTP 단백질은 문헌 (Sambrook et al. (Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. [1989])) 및(또는) 문헌(Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers Inc. and Wiley and Sons, N. Y. [1994])에 기재된 것과 같은 잘 알려진 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조할 수 있다.

NTP 단백질을 코딩하는 유전자 또는 cDNA는 예를 들어 게놈 또는 cDNA 라이브러리의 스크리닝 또는 PCR 증폭에 의해 얻을 수 있다. 라이브러리를 스크리닝하는데 유용한 프로브 또는 프라이머는 예를 들어 다른 NTP 단백질에 존재하는 보존된 모티프와 같은 동일하거나 관련된 유전자 군들로부터의 공지된 다른 유전자 또는 유전자 단편에 대한 서열 정보를 기초로 발생시킬 수 있다. 또한, NTP 단백질을 코딩하는 유전자를 하나의 종으로부터 동정하는 경우, 이 유전자의 전부 또는 일부를 프로브로 사용하여 다른 종으로부터의 상동 유전자를 동정할 수 있다. 이 프로브 또는 프라이머를 사용하여 NTP 유전자를 발현시키는 것으로 생각되는 다양한 조직 공급원으로부터 cDNA 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. 통상적으로, 스크린으로부터 얻어지는 가 (false) 양성의 수를 최소화하는 스크리닝의 경우 고 염격 조건이 이용될 것이다.

NTP 단백질을 코딩하는 유전자를 제조하는 다른 수단은 문헌 (Engels et al. (Angew. Chem. Intl. Ed., 28: 716-734 [1989]))에 기재된 것과 같은, 당업자에게 잘 알려진 방법을 이용한 화학적 합성법을 이용하는 것이다. 이러한 방법으로는 특히 핵산 합성을 위한 포스포트리에스테르, 포스포르아미디트 및 H-포스포네이트 방법을 들 수 있다. 이러한 화학적 합성을 위한 바람직한 방법은 표준 포스포르아미디트 화학을 이용하는 중합체-지지된 합성법이다. 통상적으로, NTP 단백질을 코딩하는 DNA는 뉴클레오티드 수백개의 길이이다. 상기 방법을 이용하여 뉴클레오티드 약 100개 초과의 핵산을 여러 단편들로 합성할 수 있다. 이어서, 단편들을 함께 라이게이션하여 전장 NTP 단백질을 형성시킬 수 있다. 일반적으로, 단백질의 아미노 말단을 코딩하는 DNA 단편은 메티오닌 잔기를 코딩하는 ATG를 가질 것이다.이러한 메티오닌은 숙주 세포에서 생성되는 단백질이 해당 세포로부터 분비되도록 계획되었는지에 따라 성숙한 형태의 NTP 단백질에 존재하거나 그렇지 않을 수 있다.

NTP 단백질을 코딩하는 유전자, cDNA 또는 그의 단편은 표준 라이게이션 기술을 이용하여 적절한 발현 또는 증폭 벡터내에 삽입할 수 있다. 통상적으로, 이러한 벡터는 이용되는 특정 숙주 세포에서 기능적이도록 선택된다 (즉, 벡터는 유전자의 증폭 및(또는) 발현이 일어날 수 있도록 숙주 세포 기구에 적합함). NTP 단백질을 코딩하는 유전자, cDNA 또는 그의 단편은 진핵생물, 효모, 곤충 (바쿨로바이러스 시스템) 및(또는) 진핵 숙주 세포에서 증폭/발현될 수 있다. 숙주 세포의 선택은 NTP 단백질이 글리코실화되고(되거나) 인산화될 것인지에 따라 부분적으로 달라질 것이다. 만약 그렇다면, 효모, 곤충 또는 포유동물 숙주 세포가 바람직하다.

통상적으로, 임의의 숙주 세포에서 사용되는 벡터는 5' 플랭킹 서열 ("프로모터"라고도 부름) 및 다른 조절 요소, 예를 들어 인핸서(들), 복제 기점 요소, 전사 종결 요소, 공여 및 수용 스플라이스 부위를 포함하는 완전한 인트론 서열, 신호 펩티드 서열, 리보좀 결합 부위 요소, 폴리아데닐화 서열, 발현될 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 삽입을 위한 폴리링커 영역, 및 선별가능한 마커 요소를 포함할 것이다. 경우에 따라, 벡터는 "태그" 서열, 즉 NTP 단백질 코딩 서열의 5' 또는 3' 말단에 위치하는 올리고뉴클레오티드 분자를 포함할 것이며, 이 올리고뉴클레오티드 분자는 polyHis (예, hexaHis), 또는 다른 "태그", 예를 들어 FLAG, HA (헤마글루티닌 인플루엔자 바이러스), 또는 상업적으로 이용가능한 항체가 존재하는 myc를 코딩한다. 이러한 태그는 통상적으로 폴리펩티드의 발현시 폴리펩티드에 융합되며, 숙주 세포로부터 NTP 단백질의 친화성 정제를 위한 수단으로 작용할 수 있다. 친화성 정제는 예를 들어 태그에 대한 항체를 친화성 매트릭스로서 사용하는 컬럼 크로마토그래피에 의해 수행할 수 있다. 경우에 따라, 태그는 이후에 특정 펩티다제를 사용하는 것과 같은 여러 방법에 의해 정제된 NTP 단백질로부터 제거할 수 있다.

당업자라면 인간 이뮤노글로불린 힌지 및 Fc 영역을 NTP 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 융합시킬 수 있을 것이다. 이후, Fc 융합 단백질은 단백질 A 친화성 컬럼을 사용하여 정제할 수 있다. Fc는 약동학적으로 긴 생체내 반감기를 나타내는 것으로 알려져 있으며, Fc에 융합된 단백질은 융합되지 않은 대응물보다 실질적으로 더 큰 생체내 반감기를 나타내는 것으로 알려져 있다. 또한, Fc 영역으로의 융합은 분자의 이합체화/다합체화를 허용하여, 어떤 분자의 생활성에 대하여 유용할 수 있다.

5' 플랭킹 서열은 상동성 (즉, 숙주 세포와 동일한 종 및(또는) 균주로부터 유래함), 이종성 (즉, 숙주 세포 종 또는 균주 이외의 종으로부터 유래함), 하이브리드 (즉, 하나 이상의 공급원으로부터의 5' 플랭킹 서열들의 조합), 합성 서열이거나, 천연 NTP 단백질 유전자의 5' 플랭킹 서열일 수 있다. 그러한 것으로, 5' 플랭킹 서열의 공급원은 5' 플랭킹 서열이 숙주 세포 기구내에서 기능적이며 이 기구에 의해 활성화될 수 있다면 임의의 단세포 원핵생물 또는 진핵생물 유기체, 임의의 척추동물 또는 무척추동물 유기체, 또는 임의의 식물일 수 있다.

본 발명의 벡터에 유용한 5' 플랭킹 서열은 당업계에 잘 알려진 여러 방법들 중 어떤 것에 의해 얻을 수 있다. 통상적으로, NTP 유전자 플랭킹 서열 이외에 본원에서 유용한 5' 플랭킹 서열은 맵핑 및(또는) 제한 엔도누클레아제 절단에 의해 미리 확인될 것이며, 따라서 적절한 제한 엔도누클레아제를 사용하여 적절한 조직 공급원으로부터 단리할 수 있다. 어떤 경우, 5' 플랭킹 서열의 전체 뉴클레오티드 서열은 공지된 것일 수 있다. 본원에서, 5' 플랭킹 서열은 핵산 합성 또는 클로닝에 대하여 상기 기술된 방법을 이용하여 합성할 수 있다.

5' 플랭킹 서열의 전부 또는 단지 일부만이 알려져 있는 경우, 5' 플랭킹 서열은 PCR을 이용하고(하거나) 동일하거나 다른 종으로부터의 적합한 올리고뉴클레오티드 및(또는) 5' 플랭킹 서열 단편으로 게놈 라이브러리를 스크리닝하여 얻을 수 있다.

5' 플랭킹 서열이 알려져 있지 않은 경우, 5' 플랭킹 서열을 포함하는 DNA 단편은, 예를 들어 코딩 서열 또는 심지어 다른 유전자 또는 유전자들을 포함할 수 있는 큰 DNA 단편으로부터 단리할 수 있다. 단리는 주의 깊게 선택된 하나 이상의 효소들을 사용하는 제한 엔도누클레아제 절단에 의해 적절한 DNA 단편을 단리하여 수행할 수 있다. 절단 후, 목적하는 단편을 아가로스 겔 정제 (Qiagen.RTM. 컬럼) 또는 당업자에게 공지된 다른 방법에 의해 단리할 수 있다. 이러한 목적을 달성하기 위한 적합한 효소를 선택하는 것은 당업자에게는 지극히 자명할 것이다.

통상적으로 복제 기점 요소는 상업적으로 구입한 원핵생물 발현 벡터의 일부이며, 숙주 세포에서 벡터의 증폭을 보조한다. 어떤 경우, 벡터를 특정 카피수로 증폭시키는 것은 NTP 단백질을 최적으로 발현시키는데 있어서 중요할 수 있다. 선택된 벡터가 복제 기점 부위를 포함하지 않는다면, 공지된 서열을 기초로 화학적으로 합성하여 벡터에 라이게이션시킬 수 있다. 전사 종결 요소는 통상적으로 NTP 단백질 코딩 서열의 3' 말단에 위치하며, NTP 단백질의 전사를 종결시키는 역할을 한다. 일반적으로, 원핵세포에서 전사 종결 요소는 폴리 T 서열의 앞쪽에 존재하는 G-C가 풍부한 단편이다. 이 요소는 라이브러리로부터 쉽게 클로닝하거나 벡터의 일부로서 상업적으로 입수하는 것이지만, 예를 들어 상기 기술된 것들과 같은, 핵산 합성을 위한 방법을 이용하여 쉽게 합성할 수도 있다.

선별가능한 마커 유전자 요소는 선택적 배양 배지에서 배양되는 숙주 세포의 생존 및 성장에 필요한 단백질을 코딩한다. 전형적인 선택 마커 유전자는 (a) 원핵 숙주 세포에게 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 테트라사이클린 또는 카나마이신에 대한 내성을 부여하거나, (b) 세포의 영양요구성 결핍을 보완하거나, 또는 (c) 복합 배지로부터 얻을 수 없는 중요한 영양분을 공급하는 단백질을 코딩한다. 바람직한 선별가능한 마커는 카나마이신 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자 및 테트라사이클린 내성 유전자이다.

통상적으로 샤인-달가노 (Shine-Dalgarno) 서열 (원핵생물) 또는 코작 (Kozak) 서열 (진핵생물)이라 불리는 리보좀 결합 요소는 일반적으로 mRNA의 번역 개시를 위해 필요하다. 이 요소는 통상적으로 프로모터에 대하여 3'에 위치하고, 합성될 NTP 단백질의 코딩 서열에 대하여 5'에 위치한다. 샤인-달가노 서열은 다양하지만, 통상적으로는 폴리퓨린이다 (즉, 높은 A-G 함량을 가짐). 많은 샤인-달가노 서열들이 확인되었으며, 이들 각각은 원핵생물 벡터에서 사용되는 상기 기술된 방법을 이용하여 쉽게 합성할 수 있다.

NTP 단백질이 숙주 세포로부터 분비되는 것이 바람직한 경우, 신호 서열을 사용하여 NTP 단백질이 그가 합성되는 숙주 세포로부터 배출되도록 지시할 수 있으며, 이 단백질의 카르복시-말단 부분을 결실시켜 막 앵커링 (anchoring)을 방지할 수 있다. 통상적으로, 신호 서열은 NTP 유전자 또는 cDNA의 코딩 영역, 또는 NTP 유전자 코딩 영역의 5' 말단에 직접 위치한다. 많은 신호 서열들이 확인되었으며, 선택된 숙주 세포에서 기능적인 이들 중 어떤 것을 NTP 유전자 또는 cDNA와 함께 사용할 수 있다. 따라서, 신호 서열은 NTP 유전자 또는 cDNA에 대하여 상동성이거나 이종성일 수 있으며, NTP 유전자 또는 cDNA에 대하여 상동성이거나 이종성일 수 있다. 또한, 신호 서열은 상기 기술된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 대부분의 경우, 폴리펩티드가 신호 펩티드의 존재에 의해 숙주 세포로부터 분비되면 이 폴리펩티드의 아미노 말단에서 메티오닌이 제거될 것이다.

많은 경우에서, NTP 유전자 또는 cDNA의 전사는 벡터내의 하나 이상의 인트론의 존재에 의해 증가되며, 이는 NTP 단백질이 진핵 숙주 세포, 특히 포유동물 숙주 세포에서 생산되는 경우에 특히 사실이다. 사용되는 인트론은 NTP 유전자내에서 자연 발생적일 수 있으며, 특히 사용되는 유전자는 전장 게놈 서열 또는 그의 단편이다. 인트론이 유전자내에서 자연 발생적이 아닐 경우 (대부분의 cDNA의 경우), 인트론(들)은 다른 공급원으로부터 얻을 수 있다. 인트론이 효과적이도록 전사되어야 하기 때문에, 플랭킹 서열 및 NTP 유전자에 대한 인트론의 위치는 일반적으로 중요하다. 그러한 것으로, 발현 벡터에 삽입된 NTP 유전자가 cDNA 분자인 경우, 인트론의 바람직한 위치는 전사 개시 부위에 대하여 3'이며, polyA 전사 종결 서열에 대하여 5'이다. 바람직하게는, NTP cDNA의 경우, 인트론 또는 인트론들은 상기 코딩 서열을 방해하지 않도록 cDNA의 한쪽 또는 다른 쪽 (즉, 5' 또는 3')에 위치할 것이다. 임의의 바이러스, 원핵생물 및 진핵생물 (식물 또는 동물) 유기체를 포함하는 임의의 공급원으로부터의 임의의 인트론을 사용하여 본 발명을 실시할 수 있으며 단, 인트론은 그가 삽입되는 숙주 세포(들)에 적합한 것이어야 한다. 또한, 본 발명에는 합성 인트론이 포함된다. 경우에 따라, 하나 이상의 인트론을 벡터에 사용할 수 있다.

상기 기재된 요소들 중 하나 이상이 사용될 벡터내에 이미 존재하지 않는 경우, 이 요소들을 개별적으로 입수하여 벡터에 라이게이션시킬 수 있다. 이러한 요소들의 각각을 얻기 위해 이용되는 방법들은 당업자에게 잘 알려진 것이며, 상기 기재된 방법들 (즉, DNA 합성 및 라이브러리 스크리닝 등)에 필적하는 것들이다.

본 발명을 실시하는데 사용되는 최종 벡터들은 상업적으로 이용가능한 벡터와 같은 출발 벡터로부터 구성하는 것이 통상적이다. 이러한 벡터는 완전한 벡터에 포함되는 요소들 중 일부를 포함할 수도 있고, 포함하지 않을 수도 있다. 바람직한 요소들 중 어느 것도 출발 벡터에 존재하지 않을 경우, 라이게이션될 요소의 말단과 벡터의 말단이 라이게이션에 대해 적합하도록 적합한 제한 엔도누클레아제(들)로 벡터를 절단하여 상기 각 요소를 벡터에 개별적으로 라이게이션할 수 있다.어떤 경우, 만족스러운 라이게이션을 달성하기 위해 라이게이션될 말단들을 함께 "블런팅 (blunting)"하는 것이 필요할 수 있다. 블런팅은 먼저, 4가지 모든 뉴클레오티드의 존재하에 클리나우 (Klenow) DNA 폴리머라제 또는 T4 DNA 폴리머라제를 사용하여 "접착성 말단"을 채워넣는 방식으로 수행한다. 이러한 과정은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌 (Sambrook et al., supra)에 기재되어 있다. 또는, 벡터에 삽입될 요소들 중 2개 이상을 먼저 함께 라이게이션하고 (이들이 서로 인접하여 위치하는 경우), 이어서 이를 벡터에 라이게이션할 수 있다.

벡터를 구성하는 다른 한가지 방법은 다양한 요소들의 모든 라이게이션을 하나의 반응 혼합물에서 동시에 수행하는 방법이다. 이 경우, 상기 요소들의 부적절한 라이게이션 또는 삽입으로 인해 많은 넌센스 (nonsense) 또는 비기능적 벡터들이 생성될 것이지만, 기능적 벡터는 제한 엔도누클레아제 절단에 의해 확인 및 선택될 수 있다.

본 발명을 실시하기 위한 바람직한 벡터는 박테리아, 곤충 및 포유동물 숙주 세포에 적합한 것들이다. 이러한 벡터로는 특히 pCRII, pCR3, 및 pcDNA3.1 (Invitrogen Company, San Diego, Calif.), pBSII (Stratagene Company, La Jolla, Calif.), pET15b (Novagen, Madison, Wis.), PGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, N. J.), pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, Calif.), pETL (BlueBacII; Invitrogen), 및 pFastBacDual (Gibco/BRL, Grand Island, N. Y.)을 들 수 있다.

벡터를 구성하고, 전장 또는 말단절단 NTP 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 이 벡터의 적절한 위치에 삽입한 후, 완전한 벡터를 증폭 및(또는) 폴리펩티드 발현을 위해 적합한 숙주 세포내에 삽입할 수 있다. 숙주 세포는 원핵생물 숙주 세포 (예, 이. 콜라이 (E. coli)) 또는 진핵생물 숙주 세포 (예, 효모 세포, 곤충 세포 또는 척추동물 세포)일 수 있다. 숙주 세포는 적절한 조건하에 배양하는 경우 NTP 단백질을 합성할 수 있으며, 이후 NTP 단백질은 배양 배지로부터 (숙주 세포가 이 단백질을 배지로 분비하는 경우) 또는 이 단백질을 생산하는 숙주 세포로부터 직접 (이 단백질이 분비되지 않는 경우) 회수할 수 있다.

회수 후, NTP 단백질은 분자 체 (sieve) 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피 등과 같은 방법을 이용하여 정제할 수 있다. NTP 단백질의 생산을 위한 숙주 세포의 선택은 NTP 단백질이 글리코실화될 것인지 또는 인산화될 것인지의 여부 (이 경우 진핵 숙주 세포가 바람직함), 및 숙주 세포가 단백질을 그의 천연 3차 구조 (예, 디술피드 브리지의 적절한 배향 등)로 "폴딩 (folding)시켜 생물학적으로 활성인 단백질이 생물학적 활성을 갖는 NTP 단백질에 의해 제조되도록 하는 방식에 따라 부분적으로 달라질 것이며, NTP 단백질은 합성 이후에 하기 논의된 바와 같은 적절한 화학적 조건에 의해 "폴딩될" 수 있다. 적합한 세포 또는 세포주는 차이니스 (Chinese) 햄스터 난소 세포 (CHO), 인간 배 신장 (HEK) 293 또는 293T 세포, 또는 3T3 세포와 같은 포유동물 세포일 수 있다. 적합한 포유동물 숙주 세포의 선택, 및 형질전환, 배양, 증폭, 스크리닝 및 생성물 제조 및 정제를 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 다른 적합한 포유동물 세포주는 원숭이 COS1 및 COS-7 세포주, 및 CV-1 세포주이다. 다른 예시적인 포유동물 숙주 세포로는 형질전환된 세포주를 비롯하여 영장류 세포주 및 설치류 세포주를 들 수 있다. 정상의 이배체세포, 1차 조직의 시험관내 배양으로부터 유도된 세포 종, 및 1차 외식편 (explant)이 또한 적합하다. 후보 세포는 선택 유전자의 유전자형에 있어서 결함이 있거나, 우성으로 작용하는 선택 유전자를 포함할 수 있다. 다른 적합한 포유동물 세포주로는 마우스 신경모세포종 N2A 세포, HeLa, 마우스 L-929 세포, 스위스 유래의 3T3 라인, Balb-c 또는 NIH 마우스, BHK 또는 HaK 햄스터 세포주가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.

유사하게, 본 발명에 적합한 숙주 세포로는 박테리아 세포가 유용하다. 예를 들어, 다양한 이. 콜라이 종 (예, HB101, DH5.알파, DH10 및 MC1061)이 생물공학 분야에서 숙주 세포로 잘 알려져 있다. 비. 서브틸리스 (B. subtilis), 슈도모나스 (Pseudomonas)종, 다른 바실러스 (Bacillus) 종 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 종 등의 다양한 종을 본 발명의 방법에서 사용할 수도 있다. 또한, 당업자에게 공지된 다수의 효모 세포 종들이 본 발명의 폴리펩티드의 발현을 위한 숙주 세포로서 이용될 수 있다.

또한, 원한다면, 곤충 세포 시스템을 본 발명의 방법에 이용할 수 있다. 이러한 시스템은 예를 들어 문헌 (Kitts et al. (Biotechniques, 14: 810-817 [1993]), Lucklow (Curr. Opin. Biotechnol., 4: 564-572 [1993]) and Lucklow et al. (J. Virol., 67:4566-4579 [1993]))에 기재되어 있다. 바람직한 곤충 세포는 Sf-9 및 Hi5 (Livitrogen, Carlsbad, Calif.)이다.

벡터를 선택된 숙주 세포로 삽입하는 것 ("형질전환 (transformation)" 또는 "형질감염 (transfection)"이라고 부르기도 함)은 염화칼슘법, 전기천공, 미세주입, 리포펙션, 또는 DEAE-덱스트란 방법 등의 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 선택된 방법은 사용되는 숙주 세포의 유형에 따라 부분적으로 기능적일 것이다. 이러한 방법 및 다른 적합한 방법들은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌 (Sambrook et al., supra)에 기재되어 있다.

벡터를 포함하는 숙주 세포 (즉, 형질전환되거나 형질감염됨)는 당업자에게 잘 알려진 표준 배지를 사용하여 배양할 수 있다. 이 배지는 일반적으로 세포의 성장 및 생존에 필요한 모든 영양분을 포함할 것이다. 이. 콜라이 세포를 배양하는 적합한 배지로는 예를 들어 루리아 브로쓰 (Luria Broth)(LB) 및(또는) 테리픽 브로쓰 (Terrific Broth)(TB)가 있다. 진핵 세포를 배양하기 위한 적합한 배지로는 RPMI 1640, MEM, DMEM이 있으며, 이들 모두에는 배양되는 특정 세포주에 의해 요구되는 바와 같은 혈청 및(또는) 성장 인자를 보충할 수 있다. 곤충 배양을 위한 적합한 배지로는 필요에 따라 효모단리물, 락트알부민 가수분해물 및(또는) 송아지 태아 혈청을 보충한 그레이스 (Grace's) 배지가 있다. 통상적으로는, 형질전환된 세포의 선택적 성장을 위해 유용한 항생제 또는 다른 화합물만을 보충물로서 배지에 첨가한다. 사용될 화합물은 숙주 세포를 형질전환시킨 플라스미드 상에 존재하는 선별가능한 마커 요소에 의해 지시될 것이다. 예를 들어, 선별가능한 마커 요소가 카나마이신 내성인 경우, 배양 배지에 첨가되는 화합물은 카나마이신일 것이다.

숙주 세포에서 생산되는 NTP 단백질의 양은 당업계에 공지된 표준 방법을 이용하여 평가할 수 있다. 이러한 방법으로는 웨스턴 블롯 분석, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 비-변성 겔 전기영동, HPLC 분리, 면역침전, 및(또는) 활성 분석, 예를 들어 DNA 결합 겔 이동 분석을 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.

NTP 단백질이 숙주 세포로부터 분비되도록 계획된 경우, NTP 단백질의 대부분은 세포 배양 배지내에 존재할 수 있다. 이러한 방식으로 제조된 단백질은 통상적으로 아미노 말단의 메티오닌을 보유하지 않는데, 그 이유는 단백질이 세포로부터 분비되는 동안 아미노 말단의 메티오닌이 제거되기 때문이다. 그러나, NTP 단백질이 숙주 세포로부터 분비되지 않는 경우, 이 단백질은 세포질 및(또는) 핵 (진핵 숙주 세포의 경우) 또는 사이토졸 (cytosol)(그람 (Gram) 음성 박테리아 숙주 세포의 경우)에 존재할 것이며, 아미노 말단의 메티오닌을 가질 수 있다.

숙주 세포의 세포질 및(또는) 핵에 위치하는 NTP 단백질의 경우, 먼저 숙주 세포를 기계적으로 또는 디터전트 (detergent)를 사용하여 파열시켜 세포내 함유물을 완충 용액으로 방출시키는 것이 통상적이다. 이어서, NTP 단백질을 상기 용액으로부터 단리할 수 있다.

용액으로부터 NTP 단백질을 정제하는 것은 다양한 기술을 이용하여 수행할 수 있다. 단백질이 그의 카르복실 또는 아미노 말단에서 태그, 예를 들어 헥사-히스티딘 (NTP 단백질/hexaHis) 또는 다른 작은 펩티드, 예를 들어 FLAG (Sigma-Aldritch, St. Louis, MI) 또는 칼모둘린 (calmodulin)-결합 펩티드 (Stratagene, La Jolla, CA)를 포함하도록 합성된 경우, 단백질은 본질적으로는, 태그 또는 단백질에 대하여 직접적으로 높은 친화성을 나타내는 컬럼 매트릭스 (즉, NTP 단백질을 특이적으로 인식하는 모노클로날 항체)를 갖는 친화성 컬럼을 통해 용액을 통과시켜 1-단계 과정으로 정제할 수 있다. 예를 들어, 폴리히스티딘은 니켈, 아연 및 코발트에 큰 친화성 및 특이성으로 결합하며, 따라서 니켈-기재 친화성 수지 (퀴아젠 (Qiagen's) QIAexpress 시스템 또는 인비트로젠 (Invitrogen's) Xpress 시스템에서 사용됨) 또는 코발트-기재 친화성 수지 (BD Biosciences-CLONTECH's Talon 시스템에서 사용됨)를 이용하는 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피를 사용하여 NTP 단백질/polyHis을 정제할 수 있다 (예를 들어, 문헌 (Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Section 10.11.8, John Wiley & Sons, New York [1993]) 참조).

부착된 태그 없이 NTP 단백질을 제조하고 어떤 항체도 이용할 수 없는 경우, 정제를 위해 잘 알려진 다른 방법을 이용할 수 있다. 이러한 방법으로는 이온 교환 크로마토그래피, 히드록시아파티트 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 분자 체 크로마토그래피, HPLC, 겔 용출과 병용되는 천연 겔 전기영동, 및 예비 등전점 포커싱 ("Isoprime" 기기/기술, Hoefer Scientific)을 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 어떤 경우, 이러한 기술들 중 2가지 이상을 병용하여 순도를 증가시킬 수 있다.

NTP 단백질이 주로 세포내에 존재할 것으로 예상되는 경우, 세포내 물질 (그람 음성 박테리아의 경우 봉입체 (inclusion body) 포함)은 당업자에게 공지된 임의의 표준 기술을 이용하여 숙주 세포로부터 추출할 수 있다. 예를 들어, 프렌치 (French) 압력, 균질화, 및(또는) 원심분리 이후의 초음파분해에 의해 숙주 세포를 용해시켜 원형질막주변공간/세포질의 함유물을 방출시킬 수 있다. NTP 단백질이사이토졸에서 봉입체를 형성시킨 경우, 봉입체는 종종 내부 및(또는) 외부 세포막에 결합할 수 있으며, 따라서 주로 원심분리 이후에 펠릿 물질내에서 발견될 것이다. 이어서, 펠릿 물질을 pH 극값에서 처리하거나, 또는 알칼리 pH에서 디티오쓰레이톨 또는 산성 pH에서 트리스 카르복시에틸 포스핀과 같은 환원제의 존재하에 디터전트, 구아니딘, 구아니딘 유도체, 우레아 또는 우레아 유도체와 같은 카오트로픽제 (chaotropic agent)로 처리하여 봉입체를 방출, 파괴 및 용해시킬 수 있다. 이후, 겔 전기영동 또는 면역침전 등을 이용하여 가용성 형태인 NTP 단백질을 분석할 수 있다. NTP 단백질을 단리하는 것이 요구되는 경우, 단리는 하기 내용 및 문헌 (Marston et al. (Meth. Enz., 182:264-275 [1990]))에 기술된 것들과 같은 표준 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 어떤 경우, NTP 단백질은 단리할 경우 생물학적으로 활성을 나타내지 않을 수 있다. 폴리펩티드를 그의 3차 구조로 "리폴딩 (refolding)" 또는 전환시키고 디술피드 결합을 형성시키기 위한 다양한 방법을 이용하여 생물학적 활성을 복구할 수 있다. 이러한 방법은 용해된 폴리펩티드를 특정 농도의 카오트로프 (chaotrope)의 존재하에 일반적으로 7을 초과하는 pH에 노출시키는 것을 포함한다. 카오트로프의 선택은 봉입체 용해에서 이용되는 선택과 매우 유사하지만, 일반적으로 농도가 더 낮으며, 용해에서 사용되는 것과 본질적으로 동일한 카오트로프가 아니다. 대부분의 경우에서, 리폴딩/산화 용액은 또한 환원제 또는 환원제에 더하여 그의 산화된 형태를 특정 비율로 포함하여, 단백질의 시스테인 가교(들)의 형성시 디술피드 셔플링 (shuffling)이 일어날 수 있도록 허용하는 특정의 산화환원 전위를 발생시킬 것이다. 통상적으로 사용되는 몇몇 산화환원 쌍으로는 시스테인/시스타민, 글루타티온 (GSH)/디티오비스 GSH, 염화구리, 디티오쓰레이톨 (DTT)/디티안 DTT, 2-메르캅토에탄올 (bME)/디티오-b(ME)가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 많은 예에서, 공용매 (cosolvent)는 리폴딩 효율을 증가시키기 위해 필요하며, 이러한 목적에 사용되는 보다 일반적인 시약으로는 글리세롤, 다양한 분자량의 폴리에틸렌글리콜, 및 아르기닌이 포함된다.

NTP 단백질 봉입체가 숙주 세포에서 상당한 정도로 형성되지 않는 경우, NTP 단백질은 세포 균질물의 원심분리 이후에 상등액에서 주로 발견될 것이며, NTP 단백질은 하기 기재된 것들과 같은 방법을 이용하여 상등액으로부터 단리할 수 있다.

NTP 단백질을 부분적으로 또는 완전히 단리하는 것이 바람직한 상황에서, 정제는 당업자에게 잘 알려진 표준 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 이러한 방법으로는 전기용출 이후 원심분리에 의한 분리, 다양한 유형의 크로마토그래피 (면역친화성, 분자 체, 및(또는) 이온 교환), 및(또는) 고압 액체 크로마토그래피가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 어떤 경우, 완전한 정제를 위해 이러한 방법들 중 하나 이상을 이용하는 것이 바람직할 수 있다.

NTP 단백질 및 그의 유도체는 재조합 DNA 기술을 이용하여 NTP 단백질을 제조 및 정제할 수 있을 뿐 아니라, 문헌 (Merrifield et al., (R Am. Chem. Soc., 85:2149 [1963]), Houghten et al. (Proc Natl Acad. Sci. USA, 82:5132 [1985]), and Stewart and Young (Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, 111. [1984]))에 기재된 것들과 같이 당업계에 공지된 기술을 이용하는 화학적 합성 방법 (예, 고상 펩티드 합성법)에 의해 제조할 수도 있다. 이러한 폴리펩티드는 아미노 말단에 메티오닌이 있거나 없이 합성할 수 있다. 화학적으로 합성된 NTP 단백질을 상기 참고문헌에 기재된 방법에 의해 산화시켜 디술피드 가교를 형성시킬 수 있다. NTP 단백질은 재조합적으로 생산되거나 천연 공급원으로부터 정제된 NTP 단백질에 필적하는 생물학적 활성을 가질 것으로 예상되며, 따라서 재조합 또는 천연 NTP 단백질과 바꿔 사용할 수 있다.

NTP 단백질이 중합체에 연결된, 화학적으로 변형된 NTP 단백질 조성물은 본 발명의 범위내에 포함된다. 선택된 중합체는 통상적으로 수용성이어서 그가 부착되는 단백질은 수성 환경, 예를 들어 생리학적 환경에서 침전되지 않는다. 선택된 중합체는 아실화의 경우 활성 에스테르 또는 알킬화의 경우 알데히드와 같은 단일한 반응성기를 갖도록 변형되는 것이 일반적이어서, 중합도는 본 발명의 방법에서 제공되는 바와 같이 조절될 수 있다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있으며, 분지되거나 분지되지 않을 수 있다. 중합체 혼합물은 NTP 단백질 중합체의 범위내에 포함된다.

어떤 경우, 자연 발생적인 NTP 단백질의 핵산 및(또는) 아미노산 변이체를 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 핵산 변이체는 부위 지시적 돌연변이유발, PCR 증폭, 또는 적절한 다른 방법을 이용하여 제조할 수 있으며, 여기서 프라이머(들)은 목적하는 점 돌연변이를 갖는다 (돌연변이유발 기술의 설명에 대하여는 문헌 (Sambrook et al., supra, and Ausubel et al., supra)을 참조). 이러한 변이체는 또한 문헌 (Engels et al., supra)에 기재된 방법을 이용한 화학적 합성을 이용하여 제조할 수도 있다. 또한, 당업자에게 공지된 다른 방법을 이용할 수 있다.

바람직한 핵산 변이체는 NTP 단백질의 제조에 사용될 숙주 세포에서 코돈 우선성 (preference)을 설명하는 뉴클레오티드 치환을 포함하는 것들이다. 이러한 "코돈 최적화"는 유니버시티 오브 위스콘신 패키지 (University of Wisconsin Package) 버전 9.0 (Genetics Computer Group, Madison, Wis.)에 의해 제공되는 바와 같은, 고도로 발현되는 박테리아 유전자의 코돈 우선성에 대하여 "Ecohigh. Cod"와 같은 코돈 빈도 (frequency) 표를 포함하는 컴퓨터 알고리더 (algorither)를 통해 결정할 수 있다. 유용한 다른 코돈 빈도 표로는 "Celegans_high. cod," "Celegans_low. cod," "Drosophila_high. cod," "Human_high. cod," "Maize high. cod," 및 "Yeasthigh. cod"를 들 수 있다. 바람직한 다른 변이체는 야생형에 비해 상기 기술된 바와 같은 보존적 아미노산 변화를 코딩하는 것들 (예를 들어, 자연 발생적인 아미노산 측쇄의 전하 또는 극성은 다른 아미노산으로의 치환에 의해 실질적으로 변화되지 않음), 및(또는) 신규 글리코실화 및(또는) 인산화 부위(들)을 생성시키도록 설계된 것들, 또는 기존의 글리코실화 및(또는) 인산화 부위(들)을 제거하도록 설계된 것들이 있다.

NTP 단편, 동족체, 변이체, 유도체 및 그의 염은 당업자에게 공지된 통상의 펩티드 합성 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 이러한 기술에는 화학적 커플링 방법 (문헌 (Wunsch, E:"Methoden der organischen Chemie", Volume 15, Band 1+2, Synthese von Peptiden, thime Verlag, Stuttgart (1974), and Barrany, G.; Marrifield, R. B.:"The Peptides", eds. E. Gross, J. Meienhofer, Volume 2, Chapter 1, pp. 1-284, Academic Press (1980)) 참조), 효소적 커플링 방법 (문헌(Widmer, F. Johansen, J. T., Carlsberg Res. Commun., Vol. 44, pp. 37-46 (1979), and Kullmann, W.: "Enzymatic Peptide Synthesis", CRC Press Inc. Boca Raton, Fla. (1987), and Widmer, F., Johansen, J. T. in "Synthetic Peptides in Biology and Medicines:, eds. Alitalo, K., Partanen, P., Vatieri, A., pp. 79-86, Elsevier, Amsterdam (1985)) 참조), 또는 과정 설계 및 경제적 측면에서 유리하다면 화학적 방법과 효소적 방법의 조합이 포함된다. 당업자라면 NTP 단백질의 펩티드 서열을 변화시켜 원형 또는 천연 NTP 단백질과 동일하거나 유사한 생물학적 활성 (생활성)을 갖는 동족체를 제조할 수 있을 것이다.

주어진 NTP 단백질 그 자체보다 이 단백질의 모방체를 사용하는 것이 분명히 유리한데, 이는 상기 단백질이 통상적으로 2가지 바람직하지 않은 특성, 즉 (1) 불량한 생체이용성, 및 (2) 짧은 작용 기간을 나타내기 때문이다. 펩티드 모방체는 이러한 두가지 장애에 대한 해법을 제공하는데, 그 이유는 관련 분자가 충분히 작아서 보다 널리 이용가능하며 오랜 작용 기간을 갖기 때문이다. 또한, 펩티드 모방체는 단백질 및 펩티드보다 제조 비용이 훨씬 저렴하다. 마지막으로, 펩티드 모방체에서는 경험하지 못하는, 단백질 및 펩티드의 안정성, 보관성 및 면역반응성과 관련된 문제들이 있다.

따라서, 상기 기재된 NTP 펩티드는 유사한 생물학적 활성을 나타내며 따라서 유사한 치료 유용성을 갖는, 상기와 같은 작은 화학 화합물의 개발에서 유용성을 갖는다. NTP 펩티드의 펩티드 모방체는 결합 화학 기술 및 당업계에 공지된 다른 기술을 이용하여 개발할 수 있다 (예를 들어, 문헌 (Proceedings of the 20thEuropean Peptide Symposium, ed. G. Jung, E. Bayer, pp. 289-336), 및 이 문헌에 인용된 참고문헌) 참조).

펩티드 모방체를 생성시키기 위해 폴리펩티드를 구조적으로 변형시키는, 당업계에 공지된 방법의 예에는 활성에 불리한 영향을 주지 않으면서 특히 N-말단에서 단백질분해에 대한 증가된 안정성을 나타낼 수 있는, D-아미노산 잔기 구조를 초래하는 골격 키랄 중심의 역위를 포함한다. 한가지 예가 논문 ("Tritriated D-ala. sup. 1-Peptide T Binding", Smith C. S. et al., Drug Development Res. 15, pp. 371-379 (1988))에 제시되어 있다.

제2의 방법은 안정성을 위해 고리형 구조, 예를 들어 N에서 C로의 쇄간 이미드 및 락탐을 변화시키는 것이다 (Ede et al. in Smith and Rivier (Eds.) "Peptides: Chemistry and Biology", Escom, Leiden (1991), pp. 268-270). 이 방법의 한가지 예는 형태적으로 제한된 티모펜틴-유사 화합물, 예를 들어 미국 특허 제4,457,489호 ((1985), Goldstein, G. et al., 이 문헌의 전체 개시내용은 본원에 참고로 포함됨)에 개시된 것들에서 제공된다.

제3의 방법은 NTP 펩티드에서 펩티드 결합을 슈도펩티드로 치환하여 단백질분해에 대하여 내성을 부여하는 것이다. 다수의 슈도펩티드 결합은 일반적으로 펩티드 구조 및 생물학적 활성에 영향을 주지 않는 것으로 기술되었다. 이러한 방법의 한가지 예는 레트로-인버소 슈도펩티드 결합을 치환하는 것이다 ("Biologically active retroinverso analogues of thymopentin", Sisto A. et al in Rivier, J. E. and Marshall, G. R. (eds) "Peptides, Chemistry, Structure and Biology",Escom, Leiden (1990), pp. 722-773) and Dalpozzo, et al. (1993), Int. J. Peptide Protein Res., 41: 561-566. 본원에 참고로 포함됨). 이러한 변형에 따라, 펩티드의 아미노산 서열은 하나 이상의 펩티드 결합이 레트로-인버소 슈도펩티드 결합에 의해 대체되는 것을 제외하고는 상기 기재된 NTP 펩티드의 서열과 동일할 수 있다. 바람직하게, 가장 끝쪽의 N-말단의 펩티드 결합이 치환되는데, 그 이유는 이러한 치환이 N-말단에 작용하는 엑소펩티다제에 의해 단백질분해에 대하여 내성을 부여할 것이기 때문이다.

하나 이상의 환원된 레트로-인버소 슈도펩티드 결합을 갖는 펩티드의 합성은 당업계에 공지되어 있다 (Sisto (1990) and Dalpozzo, et al. (1993), 상기 인용됨). 따라서, 펩티드 결합은 펩티드 모방체가 본래의 펩티드에 유사한 구조, 따라서 생물학적 활성을 채택하도록 허용하는 비-펩티드 결합에 의해 대체될 수 있다. 또한, 아미노산의 화학기를 유사한 구조의 다른 화학기로 대체하여 추가의 변형을 수행할 수도 있다. 생물학적 활성이 전혀 또는 거의 손상되지 않는 효소적 절단에 대한 안정성을 증가시키는 것으로 알려져 있는 적합한 다른 슈도펩티드는 환원된 동배체 슈도펩티드 결합이다 (Couder, et al. (1993), Int. J. Peptide Protein Res., 41:181-184. 전체 개시내용이 본원에 참고로 포함됨). 따라서, 이러한 펩티드의 아미노산 서열은 하나 이상의 펩티드 결합이 동배체 슈도펩티드 결합에 의해 대체되는 것을 제외하고는 NTP 펩티드의 서열과 동일할 수 있다. 바람직하게는, 가장 끝쪽의 N-말단 펩티드가 치환되는데, 그 이유는 이러한 치환이 N-말단에 작용하는 엑소펩티다제에 의한 단백질분해에 대하여 내성을 부여하기 때문이다.하나 이상의 환원된 동배체 슈도펩티드 결합을 갖는 펩티드의 합성법은 당업계에 공지되어 있다 (Couder, et al. (1993), 상기 인용됨). 다른 예로는 케토메틸렌 또는 메틸술피드 결합을 도입하여 펩티드 결합을 대체하는 것이 포함된다.

NTP 펩티드의 펩토이드 유도체는 생물학적 활성을 위한 중요한 구조적 결정자를 보유하는 다른 종류의 펩티드 모방체를 의미하는데, 펩티드 결합을 제거함으로써 단백질분해에 대한 내성을 부여한다 (Simon, et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:9367-9371, 전체 개시내용이 본원에 참고로 포함됨). 펩토이드는 N-치환된 글리신의 올리고머이다. 다수의 N-알킬기가 기재되었으며, 이들 각각은 천연 아미노산의 측쇄에 상응한다 (Simon, et al. (1992). 상기 인용되었으며, 그의 전체 개시내용은 본원에 참고로 포함됨). NTP의 아미노산의 전부 또는 일부를 대체된 아미노산에 상응하는 N-치환된 글리신으로 대체한다.

본래의 NTP 펩티드의 3차 구조를 NMR 분광법, 결정학 및(또는) 컴퓨터-보조 분자 모델링에 의해 결정하여 펩티드 모방체의 개발을 보조할 수 있다. 이러한 기술은 본래의 펩티드보다 높은 효능 및(또는) 높은 생체이용성 및(또는) 높은 안정성을 갖는 신규 조성물의 개발을 돕는다 (Dean (1994), BioEssays, 16:683-687; Cohen and Shatzmiller (1993), J. Mol. Graph., 11:166-173; Wiley and Rich (1993), Med. Res. Rev., 13:327-384; Moore (1994), Trends Pharmacol Sci., 15:124-129; Hruby (1993), Biopolymers, 33:1073-1082; Bugg et al. (1993), Sci. Am., 269: 92-98. 이들 모두는 전체 개시내용이 본원에 참고로 포함됨).

일단 잠재적인 펩티드 모방체 화합물이 확인되면, 이를 합성하고, 그의 활성을 평가하기 위해 하기 실시예에 약술한 방법을 이용하여 분석할 수 있다. NTP 펩티드 및 유사한 3차원 구조의 생물학적 활성을 가지며, 상기 방법에 의해 얻어지는 펩티드 모방체 화합물은 본 발명에 포함된다. 당업자라면 상기 기재된 하나 이상의 변형을 포함하는 임의의 NTP 폴리펩티드로부터 펩티드 모방체를 생성시킬 수 있음을 분명히 알 것이다. 또한, 당업자라면 본 발명의 펩티드 모방체를 사용하여, 치료 화합물로서 그의 유용성 이외에도, 훨씬 더 효능있는 비-펩티드 화합물을 개발할 수 있음을 알 것이다.

NTP 단백질에 대한 분석

본 발명은 또한 포유동물 조직 또는 체액 샘플에서 NTP 단백질, NTP DNA 또는 상응하는 RNA의 존재에 대하여 정성적 또는 정량적으로 시험하기 위한 분석에 있어서 NTP 단백질 및 그의 상응하는 핵산 분자의 용도를 포함한다. NTP 단백질 및 그의 상응하는 핵산 분자는 NTP 단백질 또는 코딩된 NTP 단백질이 생물학적 활성을 나타내든지 그렇지 않든지 간에 상기 분석에서 시료 중의 용도를 가질 수 있다. NTP 핵산 서열은 포유동물 조직 또는 체액 샘플에서 NTP DNA 또는 상응하는 RNA의 존재에 대하여 정성적 또는 정량적으로 시험하기 위한 혼성화 프로브의 유용한 공급원일 수 있다. 단독으로는 생물학적으로 활성이 아닌 NTP 단백질은 NTP 단백질을 인식하고(하거나) 그와 결합하는 항체를 제조하는데 있어서 유용할 수 있다. 이러한 항체는 표준 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 따라서, NTP 단백질과 반응하는 항체뿐만 아니라, 이러한 항체의 단쇄 항체 단편 및 다른 반응성 단편이 또한 본 발명의 범위내인 것으로 고려된다. 항체는 폴리클로날, 모노클로날, 재조합, 키메라, 단쇄 및(또는) 이중특이적일 수 있다. 통상적으로, 항체 또는 그의 단편은 인간 기원의 것이거나, 또는 "인간화", 즉 환자에게 투여되었을 때 항체에 대한 면역 반응을 방지 또는 최소화하도록 제조될 것이다. 바람직한 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날인 인간 항체이다. 항체 단편은 본 발명의 NTP 단백질과 반응성인 임의의 단편, 예를 들어 Fab, Fab' 등일 수 있다. 또한, 선택된 포유동물에게 임의의 NTP 단백질을 항원으로 제시한 다음, 공지된 방법에 의해 포유동물의 세포 (예, 비장 세포)를 특정 암세포와 융합하여 불멸화된 세포주를 형성시킴으로써 생성되는 하이브리도마도 본 발명에 의해 제공된다. 또한, 이러한 세포주를 생성시키는데 이용되는 방법 및 NTP 단백질의 전체 또는 일부에 대해 지시되는 항체도 본 발명에 포함된다.

또한, 항체를 생체내 및 시험관내 진단 또는 연구 목적을 위해, 예를 들어 표지된 형태로 사용하여 체액 또는 세포 샘플 중의 NTP 단백질의 존재를 검출할 수 있다.

치료될 증상

본 발명은 세포의 제거를 필요로 하는 증상, 예를 들어 양성 및 악성 종양, 샘 (예, 전립선)의 과형성증, 원치않는 얼굴 털, 사마귀 및 원치않는 지방 조직을 치료하기 위한 신규한 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 필요로 하는 포유동물에게 치료 유효량의 NTP를 투여하는 것을 포함한다.

증상은 예를 들어 폐, 흉부, 위, 췌장, 전립선, 방광, 골, 난소, 피부, 신장, 누 (sinus), 결장, 소장, 위, 직장, 식도, 심장, 비장, 침샘, 혈액, 뇌 및 그의 골격계 (covering), 척수 및 그의 골격계, 근육, 결합 조직, 부신, 부갑상선, 갑상선, 자궁, 고환, 뇌하수체, 생식기관, 간, 담낭, 눈, 귀, 코, 인후부, 편도, 입, 및 림프절 및 림프계, 및 다른 기관의 종양일 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "악성 종양"은 적게 분화된 형태, 중간 정도로 분화된 형태 및 잘 분화된 형태로 발생하는 모든 형태의 인간 암종, 육종 및 흑색종을 포함하는 의미이다.

본 발명은 위험이 적고 수술에 따른 바람직하지 않은 부작용이 적은 양성 종양을 제거할 수 있는 치료에 있어서의 당업계의 요구를 충족시킨다. 수술이 위험한 부위, 예를 들어 체내 깊숙한 위치 (예, 뇌, 심장, 폐 및 기타)에서 양성 종양을 제거하는 방법이 특히 요구된다.

세포가 제거되어야 하는 증상을 치료하는 방법은 이러한 증상을 치료하는 통상의 방법, 예를 들어 수술적 절개, 화학요법 및 방사선과 함께 이용할 수 있다. NTP는 이러한 통상의 처치 이전, 처치 동안 또는 처치 이후에 투여할 수 있다.

치료될 증상은 또한 폐, 흉부, 위, 췌장, 전립선, 방광, 골, 난소, 피부, 신장, 누, 결장, 소장, 위, 직장, 식도, 심장, 비장, 침샘, 혈액, 뇌 및 그의 골격계, 척수 및 그의 골격계, 근육, 결합 조직, 부신, 부갑상선, 갑상선, 자궁, 고환, 뇌하수체, 생식기관, 간, 담낭, 눈, 귀, 코, 인후부, 편도, 입, 및 림프절 및 림프계로 이루어진 군으로부터 선택되는 조직의 과형성증, 비대증 또는 과성장증일 수 있다.

본 발명의 방법을 이용하여 치료될 수 있는 또 다른 증상으로는 폐, 흉부,위, 췌장, 전립선, 방광, 골, 난소, 피부, 신장, 누, 결장, 소장, 위, 직장, 식도, 심장, 비장, 침샘, 혈액, 뇌 및 그의 골격계, 척수 및 그의 골격계, 근육, 결합 조직, 부신, 부갑상선, 갑상선, 자궁, 고환, 뇌하수체, 생식기관, 간, 담낭, 눈, 귀, 코, 인후부, 편도, 입, 및 림프절 및 림프계로 이루어진 군으로부터 선택되는 조직이 바이러스, 박테리아 또는 기생충에 의해 변형된 증상이 있다.

또한, 치료될 증상은 폐, 흉부, 위, 췌장, 전립선, 방광, 골, 난소, 피부, 신장, 누, 결장, 소장, 위, 직장, 식도, 심장, 비장, 침샘, 혈액, 뇌 및 그의 골격계, 척수 및 그의 골격계, 근육, 결합 조직, 부신, 부갑상선, 갑상선, 자궁, 고환, 뇌하수체, 생식기관, 간, 담낭, 눈, 귀, 코, 인후부, 편도, 입, 및 림프절 및 림프계로 이루어진 군으로부터 선택되는 조직의 기형일 수도 있다.

특히, 치료될 증상은 편도 비대증, 전립선 과형성증 또는 치질일 수 있다. 치료될 증상은 아테롬성경화증 또는 동맥경화증과 같은 혈관 질환 또는 정맥류와 같은 혈관 질환일 수 있다. 또한, 치료될 증상은 화장품 사용으로 인한 조직, 예를 들어 피부, 눈, 귀, 코, 인후부, 입, 근육, 결합 조직, 모발 또는 흉부 조직의 변형일 수 있다.

NTP 조성물

NTP 단백질의 치료 조성물은 본 발명의 범위내이다. 이러한 조성물은 치료 유효량의 NTP 단백질 및 제약상 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 담체 물질은 바람직하게는 포유동물에게 투여하기 위해 용액 중에 다른 물질을 보충한 주사용수일 수 있다. 통상적으로, 치료 용도를 위한 NTP 단백질은 정제된 NTP 단백질을 1종이상의 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제와 함께 포함하는 조성물의 형태로 투여될 것이다. 중성 완충 염수 또는 혈청 알부민과 혼합된 염수가 대표적으로 적절한 담체이다. 바람직하게, 생성물은 적절한 부형제 (예, 수크로스)를 사용하여 동결건조물로 제제화한다. 필요에 따라 다른 표준 담체, 희석제 및 부형제를 포함시킬 수 있다. 대표적인 다른 조성물은 pH 약 7.0 내지 8.5의 Tris 완충액 또는 pH 약 4.0 내지 5.5의 아세테이트 완충액을 포함하며, 소르비톨 또는 그의 적합한 대용물을 추가로 포함할 수 있다.

항체, 항체 단편, 항체-유사 분자, 또는 특정 종양 마커, 예를 들어 세포 수용체, 신호 펩티드 또는 과발현된 효소에 대해 높은 친화성을 갖는 분자에 접합되거나, 연결되거나 또는 결합된 NTP 단백질의, 원치않는 세포 요소에 대한 표적화에서의 용도는 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 항체, 항체 단편, 항체-유사 분자, 또는 특정 종양 마커에 대해 높은 친화성을 갖는 분자를 사용하여 NTP 단백질 결합체를 특정 세포 또는 조직 표적으로 표적화한다. 예를 들어, 특이적 표면 항원 또는 발현된 항원을 갖는 종양은 항체, 항체 단편 또는 항체-유사 결합 분자에 의해 표적화될 수 있으며, 종양 세포는 NTP 단백질로 사멸시킬 수 있다. 항체 표적화를 이용하는 이러한 방법은 투여량을 감소시키고 표적 세포로의 결합 및 표적 세포에 의한 수용 가능성을 증가시키는 이점을 가질 것으로 예상되며, 전이성 종양 및 극히 작은 크기의 종양을 표적화하고 치료하는데 있어서 증가된 유용성을 갖는다.

또한, 본 발명은 종양- 또는 부위-특이적 효소 또는 프로테아제에 의해, 또는 종양 또는 다른 원치않는 세포를 표적화하는 항체 접합체에 의해 종양 또는 다른 원치않는 세포 부위(들) 또는 그 근처에서 절단되는 경우, 종양 또는 다른 원치않는 세포 부위(들) 또는 그 근처에서 NTP 단백질을 방출시키는 조성물을 제조하는데 있어서 단백질 또는 다른 분자에 접합되거나, 연결되거나 또는 결합된 NTP 단백질의 용도를 포함한다.

또한, 본 발명은 치료될 조직을 광 (레이저요법 또는 다른 광-작용성 또는 광-활성화 치료법에서), 다른 형태의 전자기 방사선, 예를 들어 적외선 조사, 자외선 조사, 엑스선 또는 감마선 조사, 국소적 가열, 알파 또는 베타 방사선, 초음파 방출, 또는 다른 국소화 에너지 공급원에 노출시키는 경우, NTP 단백질 또는 그의 여러 생물학적 단편을 방출시키는 조성물을 제조하는데 있어서 단백질 또는 다른 분자에 접합되거나, 연결되거나 또는 결합된 NTP 단백질의 용도를 포함한다.

NTP 단백질은 단독으로, 다른 제약 조성물, 예를 들어 치료될 증상에 대해 적절한 사이토카인, 성장 인자, 항생제, 아폽토시스 (apoptosis) 유도제, 항염제 및(또는) 화학요법제와 함께 또는 이들과 조합하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 덴드리머 (dendrimer), 풀러렌 (fullerene) 및 다른 합성 분자, 중합체 및 거대분자를 이용한 NTP의 치료 조성물을 포함하는데, NTP 단백질 및(또는) 그의 상응하는 DNA 분자는 단독으로 또는 종양 특이적 마커와 같은 다른 종류의 분자와 함께, 상기 분자, 중합체 또는 거대분자와 접합되거나, 이들에 연결되거나, 또는 이들 내에 포함된다. 예를 들어, 미국 특허 제5,714,166호 (Bioactive and/or Targeted Dendimer Conjugates)는 특히 표적 지시제(들)을 갖는 하나 이상의 덴드리머 및 그와 접합된 1종 이상의 생활성제로 이루어진 수지상 중합체 결합물을 제조하고 이를 사용하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 NTP 단백질 및(또는) 유전자 및 약물 전달 비히클, 예를 들어 지질 에멀젼, 미셀 (micelle) 중합체, 중합체 미소체 (microsphere), 전기활성 중합체, 히드로겔 및 리포좀의 치료 조성물을 포함한다.

원치않는 세포로 전달되는 NTP 또는 관련 유전자 또는 유전자 등가물의 용도는 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 종양 세포내 NTP의 과발현을 이용하여 종양 세포가 사멸하고 따라서 종양 세포 집단이 감소되도록 유도할 수 있다. 원치않는 세포 구성원들을 치료하기 위한 NTP의 유전자 또는 유전자 등가물의 전달은 적은 투여량을 필요로 하며 표적화된 세포 구성원의 세포 자손에게 전달되기 때문에, 치료 빈도 및 전체적인 치료가 줄어드는 이점을 가질 것으로 예상된다. 또한, 본 발명은 NTP를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 원치않는 세포 또는 주변 세포들로 전달하는 것을 포함하는데, 유전자의 발현 및 융합 단백질의 생산 및(또는) 분비 이후에 융합 단백질은 천연 효소 또는 프로테아제에 의해 또는 전구약물에 의해 절단되어 원치않는 세포, 그의 내부 또는 그 근처에서 NTP 단백질을 방출시킨다.

클로닝된 재조합 NTP 항체 결합물, 클로닝된 재조합 NTP 항체 단편 결합물, 및 클로닝된 재조합 NTP 항체-유사 단백질 결합물의 용도가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 표적화 결합체 (예를 들어, 항체, 항체 단편, 항체-유사 분자, 또는 암-특이적 수용체 또는 다른 종양 마커와 높은 친화성을 갖는 분자)와 연결된 클로닝된 NTP의 이점은 이 분자가 클로닝된 접합 분자의 제조 및 표준화된 생산에서의이점들 이외에도 상기 설명된 표적화 이점을 겸비한다는 점이다.

투여 제형

경구 투여를 위한 고체 투여 제형은 캡슐, 정제, 환제, 분말제 및 과립제를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 이러한 고체 투여 제형에서, 활성 화합물은 하기 사항들 중에서 하나 이상과 혼합된다: (a) 1종 이상의 불활성 부형제 (또는 담체), 예를 들어 시트르산나트륨 또는 인산이칼슘; (b) 충전제 또는 증량제, 예를 들어 전분, 락토스, 수크로스, 글루코스, 만니톨 및 규산; (c) 결합제, 예를 들어 카르복시메틸셀룰로스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈, 수크로스 및 아카시아; (d) 습윤제 (humectant), 예를 들어 글리세롤; (e) 붕해제, 예를 들어 아가-아가, 탄산칼슘, 포테이토 또는 타피오카 (tapioca) 전분, 알긴산, 여러 복합 실리케이트, 및 탄산나트륨; (f) 용액 지연제, 예를 들어 파라핀; (g) 흡수 촉진제, 예를 들어 4급 암모늄 화합물; (h) 습윤제 (wetting agent), 예를 들어 아세틸 알콜 및 글리세롤 모노스테아레이트; (i) 흡수제, 예를 들어 카올린 및 벤토나이트; 및 (j) 윤활제, 예를 들어 탈크, 스테아르산칼슘, 스테아르산마그네슘, 고상 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 라우릴 술페이트, 또는 이들의 혼합물. 캡슐, 정제 및 환제의 경우, 투여 제형은 또한 완충제를 포함할 수도 있다.

경구 투여를 위한 지질 투여 제형은 제약상 허용되는 에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭서를 포함한다. 활성 화합물 이외에도, 액체 투여 제형은 당업계에서 일반적으로 사용되는 불활성 희석제, 예를 들어 물 또는 다른 용매, 가용화제 및 유화제를 포함할 수 있다. 대표적인 유화제로는 에틸 알콜, 이소프로필 알콜, 에틸 카르보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 디메틸포름아미드, 오일, 예를 들어 면실유, 땅콩유, 옥수수배유, 올리브유, 피마자유 및 참기름, 글리세롤, 테트라히드로푸르푸릴 알콜, 폴리에틸렌글리콜, 소르비탄의 지방산 에스테르, 또는 이들 물질의 혼합물 등이 있다.

상기 불활성 희석제 이외에도, 조성물은 또한 보조제, 예를 들어 습윤제, 유화제 및 현탁제, 감미제, 향미제 및 향료제를 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물 중 활성 성분의 실제 투여량 수준을 달리하여 특정 조성물 및 투여 방법에 대하여 원하는 치료 반응을 얻는데 효과적인 NTP의 양을 알아낼 수 있다. 따라서, 선택된 투여량 수준은 목적하는 치료 효과, 투여 경로, 원하는 치료 기간 및 기타 요인에 따라 달라진다.

인간을 비롯한 포유동물에서, 유효량은 신체 표면적을 기준으로 투여될 수 있다. 다양한 크기와 종류의 동물, 및 인간에 대한 투여량 (신체 표면적 m²당 mg을 기준으로 함)의 상관관계는 문헌 (E. J. Freireich et al., Cancer Chemother. Rep., 50 (4): 219 (1966))에 기재되어 있다. 신체 표면적은 개체의 신장 및 체중으로부터 대략적으로 결정될 수 있다 (예를 들어, 문헌 (Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardsley, N. Y. pp. 537-538 (1970)) 참조).

숙주에게 투여되는 NTP의 총 일일 투여량은 단일 투여 또는 분할 투여로 제공될 수 있다. 투여 단위 조성물은 일일 투여량을 구성하는데 사용될 수 있는 바와 같이 그의 약수 (submultiple) 투여량을 포함할 수 있다. 그러나, 어떤 특정환자에 대한 구체적인 투여량 수준은 다른 약물 및 치료될 특정 질환의 중증도와 함께 체중, 전체적인 건강 상태, 성별, 식이요법, 투여 시간 및 경로, 투여되는 약물의 효능, 흡수 및 분비 속도를 비롯한 다양한 요인에 따라 달라질 것으로 이해된다.

투여 방법

본 발명에 따른 NTP 조성물을 투여하는 방법은 화합물을 에어로졸, 주입, 볼루스 (bolus) 주입, 이식 장치, 지속 방출형 장치 등을 통해 근육내, 경구, 정맥내, 복강내, 뇌내 (실질내), 뇌실내, 종양내, 병소내, 피부내, 경막내, 비내, 안내, 동맥내, 국소, 경피로 투여하는 것을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 NTP를 투여하는 다른 방법은 경피 또는 피부통과 경로에 의한 것이다. 이러한 실시양태의 한가지 에는 패치 (patch)의 사용이다. 구체적으로, 패치를 예를 들어 디메틸술폭시드 (DMSO) 또는 DMSO와 면실유의 혼합물 중 NTP의 미세 현탁액으로 제조하여, 피부낭 (skin pouch) 내부의 종양 위치부로부터 떨어져 있는, 종양 보유 포유동물의 피부와 접촉시킬 수 있다. 또한, 다른 매체, 또는 그와 다른 용매 및 고상 지지체와의 혼합물도 동등하게 작용한다. 패치는 NTP 화합물을 용액 또는 현탁액 형태로 포함할 수 있다. 이후, 예를 들어 스티치 (stitch), 클립 또는 다른 고정 기구를 이용하여 피부를 함께 포개고 붙들어서 형성시킨 환자의 피부낭에 패치를 삽입함으로써 패치를 환자의 피부에 적용할 수 있다. 이러한 피부낭은 포유동물의 방해 없이 피부와의 지속적인 접촉이 보장되도록 하는 방식으로 이용되어야 한다. 피부낭을 이용하는 것 이외에도, 피부와 접촉하는 패치의 확실한 배치를 보장하는 어떤 장치를 사용할 수 있다. 예를 들어, 접착성 밴드를 사용하여 패치를 피부에 고정시킬 수 있다.

NTP는 지속 방출형 제형 또는 제제로 투여될 수 있다. 지속 방출형 제제의 적합한 예에는 성형 제품, 예를 들어 피막 또는 미세캡슐 형태의 반투과성 중합체 매트릭스가 포함된다. 지속 방출형 매트릭스는 폴리에스테르, 히드로겔, 폴리락티드 (미국 특허 제3,773,919호, 유럽 특허 제58,481호), L-글루탐산과 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체 (Sidman et al, Biopolymers, 22:547-556 [1983]), 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트)(Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 [1981] and Langer, Chem. Tech., 12:98-105 [1982]), 에틸렌 비닐 아세테이트 (Langer et al., supra) 또는 폴리-D(-)-3-히드록시부티르산 (유럽 특허 제133,988호)를 포함한다. 지속 방출형 조성물은 또한 당업계에 공지된 여러 방법들 중 어떤 것에 의해 제조될 수 있는 리포좀을 포함할 수도 있다 (예를 들어, 문헌 (Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692 [1985]); 유럽 특허 제36,676호, 동 제88,046호 및 동 제143,949호).

본 발명의 NTP를 투여하는 다른 방법은 NTP를 종양 또는 치료될 다른 조직으로 직접 또는 간접적으로 주입하는 방법이다. 이러한 실시양태의 한가지 예는 NTP를 치료될 종양 또는 다른 조직으로 직접 주입하는 것이다. 치료는 1회 주입, 어떤 경우에는 다수회 주입, 또는 수시간, 수일 또는 수개월의 기간에 걸친 연속적인 주입으로 이루어질 수 있으며, 치료될 종양 또는 다른 조직의 퇴행 또는 파괴는 생검법, 영상화 또는 조직 성장을 모니터링하는 다른 방법에 의해 모니터링한다. 치료될 종양 또는 다른 조직내 주입은 생체내에서 종양 또는 조직에 도달하기 위해 코, 입, 귀, 질, 직장 또는 요도와 같은 체공내로 삽입된 장치에 의하거나 절개를 통한 것일 수 있으며, 적절한 주입 부위를 확인하기 위한 영상화 또는 광학 시스템, 예를 들어 초음파 또는 광섬유 스코프와 함께 수행할 수 있다.

이러한 실시양태의 다른 예는 NTP를 일정 시간 동안 조직에 지속적으로 주입할 수 있는 장치를 사용하는 것이다. 본 발명의 NTP를 투여하는 다른 방법은 제거 또는 파괴하는 것이 필요하거나 요구되는 종양 또는 다른 조직 또는 세포 구성원을 물리적으로 절단하거나, 제거하거나, 또는 사멸시키거나 파괴하기 위해 이용되는 수술 방법 또는 그와 유사한 방법과 관련되며, 여기서 본 발명의 NTP는 상기 방법에 의해 제거 또는 파괴되지 않은 임의의 종양 세포 또는 다른 세포 구성원의 성장을 방지하거나 방해할 목적으로 종양 또는 다른 조직이 제거된 부위의 주변에 있는 인접 부위(들)에 투여한다.

본 발명의 NTP를 투여하는 다른 방법은 치료될 종양 또는 다른 조직내에 장치를 이식하는 방법이다. 이러한 실시양태의 한가지 예는 NTP를 포함하는 웨이퍼 (wafer)를 치료될 종양 또는 다른 조직내에 이식하는 것이다. 웨이퍼는 치료 투여량의 NTP를 일정 시간 동안 조직내로 방출시킨다. 별법으로 또는 추가로, 조성물은 이식을 통해 본 발명의 NTP가 흡수된 막, 스펀지 또는 적절한 다른 물질의 영향 부위내로 국소적으로 투여될 수 있다. 이식 장치를 사용하는 경우, 장치는 임의의 적합한 조직 또는 기관에 이식할 수 있으며, 본 발명의 NTP의 전달은 볼루스, 지속적인 투여, 또는 지속적인 주입을 이용한 카테터 (catheter)를 통해 직접 수행할수 있다.

다른 투여 방법은 카피수 1 이상의 NTP 유전자를 치료될 세포에 도입하고, 필요하다면 이 유전자 카피들이 세포내에서 NTP를 생산하기 시작하도록 유도하는 것이다. 유전자요법을 적용할 수 있는 한가지 방식은 구성적 또는 유도가능한 프로모터에 작동가능하게 연결하여 "유전자 치료 DNA 구조물"을 형성시킬 수 있는 NTP 유전자 (본 발명의 NTP를 코딩하는 게놈 DNA, cDNA, 및(또는) 합성 DNA 또는 그의 단편, 변이체 또는 유도체)를 사용하는 것이다. 프로모터는 상기 구조물이 삽입될 세포 또는 조직 유형에서 활성이 있다면 내생성 NTP 유전자에 대하여 상동성 또는 이종성일 수 있다. 유전자요법 DNA 구조물의 다른 성분은 필요에 따라 부위-특이적 통합을 위해 설계된 DNA 분자 (예, 상동 재조합에 유용한 내생성 플랭킹 서열), 조직-특이적 프로모터, 인핸서(들) 또는 사일렌서 (silencer)(들), 모 세포에 비해 선택적 이점을 제공할 수 있는 DNA 분자, 형질전환된 세포, 음성 선별 시스템, 세포 특이적 결합제 (예를 들어, 세포 표적화를 위한 것)를 확인하기 위한 표지로서 유용한 DNA 분자, 세포 특이적 내부화 인자, 및 벡터에 의한 발현을 증대시키는 전사 인자뿐 아니라, 벡터 제조를 가능케 하는 인자를 임의로 포함할 수 있다.

유전자를 생체내 또는 생체외에서 세포 또는 조직에 전달하는 수단으로는 노출된 DNA의 직접적인 주입, 비행체 (ballistic) 방법, 리포좀-매개 전달, 수용체-매개 전달 (리간드-DNA 결합체), 전기천공 및 칼슘 포스페이트 침전법이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다 (미국 특허 제4,970,154호, WO 96/40958, 미국 특허제5,679,559호, 동 제5,676,954호 및 동 제5,593,875호). 이러한 방법들은 또한 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노계 바이러스, 천연두 바이러스, 렌티바이러스, 파필로마바이러스 또는 단순포진바이러스의 사용, DNA-단백질 결합체의 사용 및 리포좀의 사용을 포함한다. 유전자요법 벡터의 사용은 예를 들어 미국 특허 제5,672,344호, 동 제5,399,346호, 동 제5,631,236호 및 동 제5,635,399호에 기재되어 있다

NTP 유전자를 본원에 기술된 것들과 같은 방법을 이용하여 생체외에서 유전적으로 조작된 환자의 특정 세포로 이식을 통해 전달함으로써 본 발명의 NTP 또는 그의 단편, 변이체 또는 유도체를 발현 빛 분비시킬 수 있다. 이러한 세포는 동물 또는 인간 세포일 수 있으며, 환자 자신의 조직, 또는 인간 또는 인간 이외의 다른 공급원으로부터 유도될 수 있다. 임의로, 세포는 불멸화되거나 줄기 (stem) 세포일 수 있다. 그러나, 면역 반응의 발생을 감소시키기 위해서는, 세포를 캡슐화하여 주변 조직의 침윤을 방지하는 것이 바람직하다. 캡슐화 물질은 통상적으로 단백질 생성물(들)의 방출을 허용하지만 환자의 면역계 또는 주변 조직으로부터의 다른 해로운 인자에 의한 세포를 파괴는 방지하는 생체적합성의 반투과성 중합체 외피 또는 막이다. 세포의 막 캡슐화에 이용되는 방법은 당업자에게 친숙한 것이며, 캡슐화된 세포의 제조 및 이를 환자에게 이식하는 것은 과도한 실험 없이도 수행할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제4,892,538호, 동 제5,011,472호 및 동 제5,106,627호 참조). 생존 세포를 캡슐화하는 시스템은 PCT WO 91/10425에 기재되어 있다. 다양한 다른 지속형 또는 조절형 전달 수단, 예를 들어 리포좀 캐리어, 생-부식성 입자 또는 비즈를 제조하는 기술은 또한 당업자들에게 공지되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 제5,653,975호에 기재되어 있다. 세포는 캡슐화를 하거나 하지않고 환자의 적합한 신체 조직 또는 기관에 이식할 수 있다.

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하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 제공된 것이다. 그러나, 본 발명은 이들 실시예에 기재된 특정 조건 또는 세부사항으로 한정되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 본원 명세서를 통해, 미국 특허 문헌을 비롯하여 공개적으로 이용가능한 문서에 대한 임의의 모든 참고문헌은 본원에 참고로 특별히 포함된다.

실시예 1

이 실시예의 목적은 신경교종 및 신경모세포종 세포에 대한 NTP의 세포독성 효과를 시험하기 위한 것이다.

신경모세포종은 어린이에게 주로 영향을 끼치는 암이다. 이는 경부, 흉부, 복부 또는 골반의 신경 조직에서 시작한다. 신경모세포종은 일반적으로 복부의 부신 조직에서 발생한다. 신경모세포종이 진단되는 시점까지, 암은 흔히 가장 일반적으로는 림프절, 간, 폐, 골 및(또는) 골수로 확산된다.

신경교종은 뇌종양이다. 신경교종 종양이 특히 해로운 것은 이 종양이 급속하게 성장하여 뇌에서 확산되기 때문이다. 매년, 약 20,000명의 미국인들이 신경교종에 걸리는 것으로 밝혀졌다. 이들 중 절반 이상은 18개월 이내에 사망한다.

세포 배양:

냉동보존된 신경교종 및 신경모세포종 세포는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection (ATCC), Virginia)으로부터 입수하였다. 세포를 해동시키고, 현탁액 배지에서 희석시키고, 4 ℃에서 7분 동안 700 rpm에서 원심분리하였다. 이후, 세포 펠릿을 CACO-2 배지에 재현탁시키고, 대략 전면배양에 도달할 때까지 37 ℃, 5％ C0₂의 조건하에 표준 75 또는 175 cm²플라스크에서 배양하였다. 이어서, 세포에 트립신처리를 하고, CACO-2 배지에 재현탁시켜 최종 세포 밀도를 1.5 ×10⁵세포/ml로 하였다. 그 다음, 샘플 당 50 ㎕ 분획을 96 웰 플레이트의 웰마다 가하였다.

투여:

실험 I의 경우, 50 ㎕의 PBS (인산염 완충액)(음성 대조군), 인산염 완충 염수 PBS 중 100 μM 타목시펜 (양성 대조군), 또는 시험 제품을 각 샘플 배양물에 가하였다.

실험 II의 경우, DMSO (디메틸술폭시드) 중 1 mM 타목시펜을 CACO-2 배지에서 100 μM 농도로 희석시키고, 웰마다 100 ㎕를 양성 대조군 웰에 가하였다. 또한, CACO-2 배지 중 1％ DMSO로 이루어진 비히클 대조군을 이 실험에 추가하였다. 다른 음성 대조군은 인간 및 소의 혈청 알부민 및 다른 비독성 폴리펩티드로 구성되었다.

MTT 분석:

MTT 분석은 테트라졸륨 염 3,[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라졸륨브로마이드 (MTT)의 감소를 기준으로 세포 증식을 측정하는 민감한 분석법이다.

대조군 또는 시험 물질과 인큐베이션한 다음, 배지를 흡출해내고, MTT 100 ㎕를 각 웰에 가하였다. 이후, 플레이트를 37 ℃, 5％ CO₂에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, MTT를 산성화된 이소프로판올 (0.4 N HCl)로 대체하고, 플레이트를 덮어서 4 ℃에서 밤새 보관하였다. 그 다음, 플레이트를 회전 진탕기에서 1분 동안 천천히 교반하였으며, 570 nm의 방출 흡광도 및 650 nm의 배경 흡광도 사이의 차이를 자동화된 플레이트 판독기에서 분광광도법으로 측정하였다.

결과:

실험 I:

신경모세포종 및 신경교종 세포를 시험 물질 또는 대조군 용액으로 처리한 다음, 24시간 동안 인큐베이션하였다. 이 시점에서 MTT를 모든 배양물에 가하였다. 결과는 평균 흡광도 차이로 나타내고 음성 대조군의 비율로 제시하였으며, 표 4 (신경교종 세포에서의 세포독성) 및 표 5 (신경모세포종 세포에서의 세포독성)에 나타나 있다.

실험 2:

신경교종 세포 및 신경모세포종 세포를 이 실험에서 사용하였다. 대조군 또는 시험 용액과 함께 24시간 인큐베이션한 다음, MTT를 플레이트에 가하였다. 다른 플레이트에 24시간의 시점에서 신선한 배지, 대조군 또는 시험 용액을 공급한 다음, 3일 후 판독하였다. 결과는 평균 흡광도 차이 및 음성 대조군의 비율로 나타내었으며, 표 6 (신경교종 세포) 및 표 7 (신경모세포종 세포)에 나타나 있다.

결론:

AD7C-NTP로의 처리 후 24시간 및 96시간의 시점에서 신경교종 및 신경모세포종 세포에 대한 유의한 세포독성 효과가 분명하였다.

실시예 2

이 실시예의 목적은 주입 부위에서 조직에 대한 NTP의 효과를 측정하기 위한 것이다.

정상적인 래트 8마리에게 염수 중의 정제된 재조합 AD7C-NTP를 스테인레스 스틸 26 게이지 바늘을 통해 플라스틱 주사기로부터 전달되는 0.1 내지 10 ㎍/mL의 농도로 피부 및 피하의 다른 병소 세곳의 각각에 주입하였다.

동물을 24시간 동안 관찰하고, 24시간의 시점에서 고통없이 희생시켰다. 침윤된 24개의 병소 각각을 절제하고, 10％ 포르말린 중에 고정시키고, 파라핀 중에 함침시키고, 염색하고, 표준 조직병리학적 방법에 의해 검사하였다.

대조군 래트의 유사한 군에 (1) 염수 중 소 혈청 알부민 0.1％, (2) 정상 인간 혈청, (3) 생리학적 염수, (4) AD7C-NTP 정제와 유사한 방법을 이용하여 정제한, AD7C-NTP가 없는 벡터로부터의 이. 콜라이 단백질, (5) 이. 콜라이로부터 발현 및 정제된 비-NTP 재조합 단백질을 주입하고, 이어서 상기한 바와 같이 희생시켜 상기와 같이 주입 처리된 절제된 병소를 검사하였다.

결과

모든 실시예에서 AD7C-NTP의 주입은 주입 부위에서 조직의 급성 괴사를 상당히 나타내었다 (도 1 내지 5). 괴사는 AD7C-NTP가 주입된 부위의 근육 조직, 피하 결합 조직 및 피부에서 분명하였다. 24시간의 시점에서, 세포는 활기가 없어지고, 수축하고, 괴사하는 것으로 보였으며, 염증 세포의 침윤이 있었다. 괴사는 주입 부위와 상관관계가 있으며, 주입 부위를 넘어서 확산되는 것으로 보이지는 않는다.

경미한 염증 부위와는 다르게, 대조군은 괴사 또는 세포 손상의 증거를 나타내지 않았다. 근육 섬유층의 전체 부위가 괴사된 AD7C-NTP 주입과는 달리, 대조군은 근육 변화를 최소로 나타내거나 전혀 나타내지 않았다. 대조군 주입은 주입 부위에서 경미하거나 최소의 급성 염증, 및 주사바늘에 의한 병소의 미세출혈을 나타내었다.

실시예 3

이 실시예의 목적은 다른 인간 종양 또는 인간 이외의 기원을 갖는 종양에 대한 NTP의 효과를 측정하기 위한 것이다.

AD7C-NTP 침윤을, 유방 암종, 피부 암종 및 파필로마, 결장 암종, 뇌의 신경교종을 비롯한 다양한 다른 인간 종양 및 인간 이외의 기원을 갖는 종양, 및 설치류 모델의 다른 것들에 대하여 시험하였다. 종양을 실시예 2에 기재된 바와 같이 AD7C-NTP로 직접 침윤시키고, 실험 동물을 관찰하였으며, 24시간 내지 2주가 지난 시점에서 고통없이 희생시켰다. 희생 후, 종양의 조직병리학적 검사를 상기와 같이 수행하였다.

대조군 종양을 (1) 무처리, (2) 정상 인간 혈청으로 침윤처리, (3) 소 혈청 알부민으로 침윤처리, (4) 염수로 침윤처리하여 시험하였다.

결과

시험된 모든 경우에서, AD7C-NTP로의 침윤처리 후 종양 세포에서 상당한 괴사가 나타났다 (도 6 내지 10). 24시간 간격으로 2회 주입한 예들에서는, 1회 주입 후에 나타난 것보다 더 많은 종양 파괴가 나타났다. 모든 예들에서, 종양은 거의 완전히 퇴화하였다. 1회 주입한 이후의 다른 예들에서는, AD7C-NTP를 추가로 주입하지 않은 경우, 종양은 1 내지 2주 후 크게 성장하였다. AD7C-NTP를 1회 주입하여 처리하고 2주 후 조직학적으로 검사한 몇몇 종양에서는, 종양의 가장자리에 의해 이미 둘러싸인, 비어 있는 큰 공동이 나타났으며, 이는 침윤된 종양이 괴사 후에 공동화되어 사라졌음을 암시한다. 1회 주입하여 처리하고 2주 후 조직학적으로 검사한 다른 종양에서는, 대조군에서는 나타나지 않는 종양 파괴 및 이후의 섬유증으로 인해 종양내 넓은 범위에서 섬유질이 형성되었다. 대조군의 경우는 단지 병소의 미세출혈 및 염증 및 (때때로) 왜곡, 미미한 괴사를 나타내었으며, AD7C-NTP 주입에서 설명된 대규모 괴사에 대한 증거는 보이지 않았다.

* * * *

당업자라면 본 발명의 사상 또는 범위를 벗어남이 없이 본 발명의 방법 및 조성물에 대하여 다양한 변형 및 변화를 수행할 수 있음을 알 것이다. 따라서, 본 발명은 부가된 청구의 범위 및 그의 등가물의 범위내에 있다면 본 발명의 변형 및 변화를 포함하도록 의도된다.

Claims (46)

1. 치료 유효량의 신경 사 (thread) 단백질 (NTP)을 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 세포의 제거 또는 파괴를 필요로 하는 포유동물의 증상을 치료하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 NTP를 경구, 피하, 피부내, 정맥내, 근육내, 경막내, 복강내, 뇌내 (실질내), 뇌실내, 안내, 동맥내, 비내, 종양내, 병소내, 국소 및 경피로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의해 투여하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 치료제를 수술적 절개, 이식 (transplantation), 이식술 (grafting), 화학요법, 면역요법, 백신화, 열, 마이크로파 또는 전기에 의한 절제, 냉동요법, 레이저요법, 광요법, 유전자요법 및 방사선으로 이루어진 치료군으로부터 선택되는 환자의 치료 이전, 치료 동안 또는 치료 이후에 환자에게 투여하는 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 증상이 폐, 흉부, 위, 췌장, 전립선, 방광, 골, 난소, 피부, 신장, 누 (sinus), 결장, 소장, 위, 직장, 식도, 심장, 비장, 침샘, 혈액, 뇌 및 그의 골격계 (covering), 척수 및 그의 골격계, 근육, 결합 조직, 부신, 부갑상선, 갑상선, 자궁, 고환, 뇌하수체, 생식기관, 간, 담낭, 눈, 귀, 코, 인후부,편도, 입, 및 림프절 및 림프계로 이루어진 군으로부터 선택되는 조직의 양성 또는 악성 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 증상이 폐, 흉부, 위, 췌장, 전립선, 방광, 골, 난소, 피부, 신장, 누, 결장, 소장, 위, 직장, 식도, 심장, 비장, 침샘, 혈액, 뇌 및 그의 골격계, 척수 및 그의 골격계, 근육, 결합 조직, 부신, 부갑상선, 갑상선, 자궁, 고환, 뇌하수체, 생식기관, 간, 담낭, 눈, 귀, 코, 인후부, 편도, 입, 및 림프절 및 림프계로 이루어진 군으로부터 선택되는 조직의 과형성증, 비대증 또는 과성장증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 증상이 편도선 비대증인 방법.
7. 제5항에 있어서, 상기 증상이 전립선 과형성증인 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 증상이 폐, 흉부, 위, 췌장, 전립선, 방광, 골, 난소, 피부, 신장, 누, 결장, 소장, 위, 직장, 식도, 심장, 비장, 침샘, 혈액, 뇌 및 그의 골격계, 척수 및 그의 골격계, 근육, 결합 조직, 부신, 부갑상선, 갑상선, 자궁, 고환, 뇌하수체, 생식기관, 간, 담낭, 눈, 귀, 코, 인후부, 편도, 입, 및 림프절 및 림프계로 이루어진 군으로부터 선택되는 조직의 바이러스, 박테리아 또는 기생충 변형증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 증상이 폐, 흉부, 위, 췌장, 전립선, 방광, 골, 난소, 피부, 신장, 누, 결장, 소장, 위, 직장, 식도, 심장, 비장, 침샘, 혈액, 뇌 및 그의 골격계, 척수 및 그의 골격계, 근육, 결합 조직, 부신, 부갑상선, 갑상선, 자궁, 고환, 뇌하수체, 생식기관, 간, 담낭, 눈, 귀, 코, 인후부, 편도, 입, 및 림프절 및 림프계로 이루어진 군으로부터 선택되는 조직의 기형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
10. 제1항에 있어서, 상기 증상이 화장품으로 인한 조직 변형증인 방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 조직이 피부, 눈, 귀, 코, 인후부, 입, 근육, 결합 조직, 지방 조직, 모발 및 흉부로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
12. 제1항에 있어서, 상기 증상이 혈관 질환인 방법.
13. 제1항에 있어서, 상기 증상이 치질인 방법.
14. 제1항에 있어서, 상기 증상이 정맥류인 방법.
15. 제12항에 있어서, 상기 혈관 질환이 아테롬성경화증 또는 동맥경화증인 방법.
16. 제1항에 있어서, 상기 증상이 염증성 질환, 자가면역 질환, 대사성 질환, 유전성/유전 질환, 외상성 질환 또는 물리적 손상, 영양결핍성 질환, 감염성 질환, 아밀로이드 질환, 섬유증 질환, 축적성 질환, 선천성 기형, 효소결핍성 질환, 중독 (poisoning), 중독증 (intoxication), 환경성 질환, 방사선 질환, 내분비 질환, 퇴행성 질환 및 기계적 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
17. 제1항에 있어서, 상기 NTP가 항체, 항체 단편 및 항체-유사 결합 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 분자에 접합되거나, 연결되거나 또는 결합되며, 이 분자는 다른 세포에 결합되는 것보다 종양 또는 다른 표적에 결합되는데 더 높은 친화성을 갖는 것인 방법.
18. 제1항에 있어서, 상기 NTP가 단백질 또는 다른 분자에 접합되거나, 연결되거나 또는 결합되며, 형성된 물질이 종양- 또는 부위-특이적 효소 또는 프로테아제에 의해, 또는 종양 또는 다른 원치않는 세포를 표적화하는 항체 접합체에 의해 종양 또는 다른 원치않는 세포의 부위(들) 또는 그 근처에서 절단되어 NTP를 방출시키는 것인 방법.
19. 제1항에 있어서, 상기 NTP가 단백질 또는 다른 분자에 접합되거나, 연결되거나 또는 결합되며, 형성된 물질이 치료될 조직을 광 (레이저요법 또는 다른 광-작용성 또는 광-활성화요법에서), 다른 형태의 전자기 방사선, 예를 들어 적외선 방사선, 자외선 방사선, 엑스선 또는 감마선 방사선, 국소적 가열, 알파 또는 베타 방사선, 초음파 방출, 또는 다른 국소화 에너지 공급원에 노출시켰을 때 NTP를 방출시키는 것인 방법.
20. 제1항에 있어서, 상기 NTP가 다른 제약 조성물, 예를 들어 치료될 증상에 대해 적절한 사이토카인, 성장 인자, 항생제, 아폽토시스 (apoptosis) 유도제, 항염제 및(또는) 화학요법제와 조합되어 사용되는 방법.
21. 제1항에 있어서, 상기 NTP가 덴드리머 (dendrimer), 풀러렌 (fullerene) 및 다른 합성 분자, 중합체 및 거대분자와 조합되어 사용되며, 상기 NTP는 단독으로 또는 다른 세포에 결합되는 것보다 종양 또는 다른 표적에 결합되는데 더 높은 친화성을 갖는 분자와 함께, 상기 분자, 중합체 또는 거대분자와 접합되거나, 이들에 연결되거나, 또는 이들 내에 포함되는 것인 방법.
22. 제1항에 있어서, 상기 NTP가 NTP와 항체, 항체 단편 및 항체-유사 결합 분자의 군으로부터 선택되는 분자로 이루어진 신규한 단일 클로닝된 재조합 분자의 부분이며, 상기 분자는 다른 세포에 결합되는 것보다 종양 또는 다른 표적에 결합되는데 더 높은 친화성을 갖는 것인 방법.
23. 제1항에 있어서, 상기 NTP가 AD7c-NTP (서열 1), 서열 2 내지 9에 의해 확인되는 단백질, 췌장 신경 사 단백질, 췌장 사 단백질 및 임의의 단편, 동족체, 변이체, 유도체, 펩티드 모방체, 리버스 (reverse)-D 펩티드, 및 이들의 에난티오머로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
24. 제23항에 있어서, 상기 NTP를 경구, 피하, 피부내, 정맥내, 근육내, 경막내, 복강내, 뇌내 (실질내), 뇌실내, 안내, 동맥내, 비내, 종양내, 병소내, 국소 및 경피로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의해 투여하는 방법.
25. 제23항에 있어서, 상기 치료제를 수술적 절개, 이식, 이식술, 화학요법, 면역요법, 백신화, 열 또는 전기에 의한 절제, 냉동요법, 레이저요법, 광요법, 유전자요법 및 방사선으로 이루어진 치료군으로부터 선택되는 환자의 치료 이전, 치료 동안 또는 치료 이후에 환자에게 투여하는 방법.
26. 제23항에 있어서, 상기 증상이 폐, 흉부, 위, 췌장, 전립선, 방광, 골, 난소, 피부, 신장, 누, 결장, 소장, 위, 직장, 식도, 심장, 비장, 침샘, 혈액, 뇌 및 그의 골격계, 척수 및 그의 골격계, 근육, 결합 조직, 부신, 부갑상선, 갑상선, 자궁, 고환, 뇌하수체, 생식기관, 간, 담낭, 눈, 귀, 코, 인후부, 편도, 입, 및 림프절 및 림프계로 이루어진 군으로부터 선택되는 조직의 양성 또는 악성 종양인 방법.
27. 제23항에 있어서, 상기 증상이 폐, 흉부, 위, 췌장, 전립선, 방광, 골, 난소, 피부, 신장, 누, 결장, 소장, 위, 직장, 식도, 심장, 비장, 침샘, 혈액, 뇌 및 그의 골격계, 척수 및 그의 골격계, 근육, 결합 조직, 부신, 부갑상선, 갑상선, 자궁, 고환, 뇌하수체, 생식기관, 간, 담낭, 눈, 귀, 코, 인후부, 편도, 입, 및 림프절 및 림프계로 이루어진 군으로부터 선택되는 조직의 과형성증, 비대증 또는 과성장증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
28. 제27항에 있어서, 상기 증상이 편도선 비대증인 방법.
29. 제27항에 있어서, 상기 증상이 전립선 과형성증 또는 치질인 방법.
30. 제23항에 있어서, 상기 증상이 폐, 흉부, 위, 췌장, 전립선, 방광, 골, 난소, 피부, 신장, 누, 결장, 소장, 위, 직장, 식도, 심장, 비장, 침샘, 혈액, 뇌 및 그의 골격계, 척수 및 그의 골격계, 근육, 결합 조직, 부신, 부갑상선, 갑상선, 자궁, 고환, 뇌하수체, 생식기관, 간, 담낭, 눈, 귀, 코, 인후부, 편도, 입, 및 림프절 및 림프계로 이루어진 군으로부터 선택되는 조직의 바이러스, 박테리아 또는 기생충 변형증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
31. 제23항에 있어서, 상기 증상이 폐, 흉부, 위, 췌장, 전립선, 방광, 골, 난소, 피부, 신장, 누, 결장, 소장, 위, 직장, 식도, 심장, 비장, 침샘, 혈액, 뇌 및 그의 골격계, 척수 및 그의 골격계, 근육, 결합 조직, 부신, 부갑상선, 갑상선, 자궁, 고환, 뇌하수체, 생식기관, 간, 담낭, 눈, 귀, 코, 인후부, 편도, 입, 및 림프절 및 림프계로 이루어진 군으로부터 선택되는 조직의 기형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
32. 제23항에 있어서, 상기 증상이 화장품으로 인한 조직 변형증인 방법.
33. 제32항에 있어서, 상기 조직이 피부, 눈, 귀, 코, 인후부, 입, 근육, 결합 조직, 지방 조직, 모발 및 흉부로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
34. 제23항에 있어서, 상기 증상이 혈관 질환인 방법.
35. 제23항에 있어서, 상기 증상이 치질인 방법.
36. 제23항에 있어서, 상기 증상이 정맥류인 방법.
37. 제30항에 있어서, 상기 혈관 질환이 아테롬성경화증 또는 동맥경화증인 방법.
38. 제23항에 있어서, 상기 증상이 염증성 질환, 자가면역 질환, 대사성 질환, 유전성/유전 질환, 외상성 질환 또는 물리적 손상, 영양결핍성 질환, 감염성 질환, 아밀로이드 질환, 섬유증 질환, 축적성 질환, 선천성 기형, 효소결핍성 질환, 중독, 중독증, 환경성 질환, 방사선 질환, 내분비 질환, 퇴행성 질환 및 기계적 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
39. 제23항에 있어서, 상기 NTP가 항체, 항체 단편 및 항체-유사 결합 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 분자에 접합되거나, 연결되거나 또는 결합되며, 이 분자는 다른 세포에 결합되는 것보다 종양 또는 다른 표적에 결합되는데 더 높은 친화성을 갖는 것인 방법.
40. 제23항에 있어서, 상기 NTP가 NTP와 항체, 항체 단편 및 항체-유사 결합 분자의 군으로부터 선택되는 분자로 이루어진 신규한 단일 클로닝된 재조합 분자의 부분이며, 상기 분자는 다른 세포에 결합되는 것보다 종양 또는 다른 표적에 결합되는데 더 높은 친화성을 갖는 것인 방법.
41. 제23항에 있어서, 상기 NTP가 단백질 또는 다른 분자에 접합되거나, 연결되거나 또는 결합되며, 형성된 물질이 종양- 또는 부위-특이적 효소 또는 프로테아제에 의해, 또는 종양 또는 다른 원치않는 세포를 표적화하는 항체 접합체에 의해 종양 또는 다른 원치않는 세포의 부위(들) 또는 그 근처에서 절단되어 NTP를 방출시키는 것인 방법.
42. 제23항에 있어서, 상기 NTP가 단백질 또는 다른 분자에 접합되거나, 연결되거나 또는 결합되며, 형성된 물질이 치료될 조직을 광 (레이저요법 또는 다른 광-작용성 또는 광-활성화요법에서), 다른 형태의 전자기 방사선, 예를 들어 적외선 방사선, 자외선 방사선, 엑스선 또는 감마선 방사선, 국소적 가열, 알파 또는 베타 방사선, 초음파 방출, 또는 다른 국소화 에너지 공급원에 노출시켰을 때 NTP를 방출시키는 것인 방법.
43. 제23항에 있어서, 상기 NTP가 다른 제약 조성물, 예를 들어 치료될 증상에 대해 적절한 사이토카인, 성장 인자, 항생제, 아폽토시스 유도제, 항염제 및(또는) 화학요법제와 조합되어 사용되는 방법.
44. 제23항에 있어서, 상기 NTP가 덴드리머, 풀러렌 및 다른 합성 분자, 중합체 및 거대분자와 조합되어 사용되며, 상기 NTP는 단독으로 또는 다른 세포에 결합되는 것보다 종양 또는 다른 표적에 결합되는데 더 높은 친화성을 갖는 분자와 함께, 상기 분자, 중합체 또는 거대분자와 접합되거나, 이들에 연결되거나, 또는 이들 내에 포함되는 것인 방법.
45. 제23항에 있어서, 상기 NTP가 NTP와 항체, 항체 단편 및 항체-유사 결합 분자의 군으로부터 선택되는 분자로 이루어진 신규한 단일 클로닝된 재조합 분자의 부분이며, 상기 분자는 다른 세포에 결합되는 것보다 종양 또는 다른 표적에 결합되는데 더 높은 친화성을 갖는 것인 방법.
46. 치료 유효량의 NTP 유전자를 종양 또는 다른 표적 세포에게 투여하는 것을 포함하며, NTP 유전자의 발현을 유도하여 NTP 단백질을 발현시킴으로써 세포의 제거 또는 파괴를 필요로 하는 환자의 증상을 치료하기 위한 방법.