PL207588B1 - Peptyd NTP, środek zawierający ten peptyd i zastosowanie tego peptydu - Google Patents

Peptyd NTP, środek zawierający ten peptyd i zastosowanie tego peptydu

Info

Publication number
PL207588B1
PL207588B1 PL368912A PL36891202A PL207588B1 PL 207588 B1 PL207588 B1 PL 207588B1 PL 368912 A PL368912 A PL 368912A PL 36891202 A PL36891202 A PL 36891202A PL 207588 B1 PL207588 B1 PL 207588B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
peptide
ntp
protein
disease
peptides
Prior art date
Application number
PL368912A
Other languages
English (en)
Other versions
PL368912A1 (pl
Inventor
Paul A. Averback
Jack Gemmell
Original Assignee
Nymox Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nymox Corp filed Critical Nymox Corp
Publication of PL368912A1 publication Critical patent/PL368912A1/pl
Publication of PL207588B1 publication Critical patent/PL207588B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4711—Alzheimer's disease; Amyloid plaque core protein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/12—Keratolytics, e.g. wart or anti-corn preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/02—Antidotes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P41/00—Drugs used in surgical methods, e.g. surgery adjuvants for preventing adhesion or for vitreum substitution
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest peptyd NTP, środek zawierający ten peptyd i zastosowanie tego peptydu.
Wynalazek należy do dziedziny związanej z leczeniem stanów wymagających usunięcia lub zniszczenia elementów komórkowych, takich jak łagodne lub złośliwe nowotwory u ludzi, za pomocą białek i peptydów zawierających sekwencje aminokwasowe odpowiadające, podobne lub homologiczne do części sekwencji aminokwasowej białek włókienek neuronalnych.
Istota wielu terapii i procedur medycznych obejmuje usuwanie lub niszczenie szkodliwej lub niepożądanej tkanki. Przykłady takich istotnych terapii obejmują chirurgiczne usuwanie rozrostów nowotworowych, niszczenie nowotworów przerzutowych drogą chemioterapii oraz zmniejszanie rozrostu gruczołów (np. prostaty). Inne przykłady obejmują usuwanie niepożądanych włosów z twarzy, brodawek, tkanki podskórnej, tkanki limfoidalnej lub tkanki tłuszczowej.
Istniało oczywiste zapotrzebowanie na skuteczny środek, który niszczyłby i w ten sposób ułatwiał usuwanie lub hamował dalszy wzrost szkodliwych lub niepożądanych komórek i tkanki, ale który miałby głównie działanie miejscowe i minimalną toksyczność ogólnoustrojową lub jej brak.
Białka włókienek neuronalnych i ich pokrewne cząsteczki stanowią jedną grupę takich środków ujawnionych w publikacji US 20030054990. Peptydy zawierające sekwencje aminokwasowe odpowiadające części sekwencji aminokwasowej białka włókienek neuronalnych, AD7c-NTP są także takimi środkami. Peptydy te ujawniono w publikacji US 20030096350.
Rak jest spowodowany nieprawidłowością wewnętrznych mechanizmów regulatorowych komórki, co powoduje niekontrolowany rozrost i namnażanie komórki. Prawidłowe komórki tworzą tkanki i gdy te komórki tracą swoją zdolność do zachowywania się jako wyspecjalizowana, kontrolowana i skoordynowana jednostka (odró ż nicowanie) zaburzenie to prowadzi do nieładu w populacji komórek. Gdy to nastąpi powstaje nowotwór.
Łagodne rozrosty tkanki są nieprawidłowościami, w których pożądane jest usuwanie komórek z organizmu. Ł agodne nowotwory są proliferacjami komórek, które nie dają przerzutów w organizmie, a jednak wywołują objawy chorobowe. Takie nowotwory mogą być śmiertelne gdy są umiejscowione w niedostępnych obszarach w narządach, takich jak mózg. Istnieją łagodne nowotwory narządów, takich jak płuca, mózg, skóra, przysadka, tarczyca, kora i rdzeń nadnerczy, jajniki, macica, jądra, tkanka łączna, mięśnie, jelita, ucho, nos, gardło, migdałki, usta, wątroba, pęcherzyk żółciowy, trzustka, prostata, serce i inne narządy.
Operacja chirurgiczna jest często pierwszym etapem w leczeniu raka. Cel operacji różni się. Czasami jest ona stosowana do usuwania w możliwie jak największym stopniu widocznego nowotworu lub co najmniej do „odbarczenia” go (usunięcia większości masy(mas) nowotworu tak, żeby mniejsza jego ilość mogła być leczona w inny sposób). Zależnie od typu nowotworu oraz jego umiejscowienia operacja chirurgiczna może przynieść także pacjentowi pewną ulgę w objawach. Przykładowo, gdy lekarz może usunąć dużą część powiększającego się nowotworu mózgu, zmniejszy się ciśnienie w czaszce, co doprowadzi do polepszenia objawów u pacjenta.
Nie wszystkie nowotwory nadają się do operacji chirurgicznej. Niektóre z nich mogą być umiejscowione w częściach ciała, w których całkowite ich usunięcie jest niemożliwe. Przykładami takich nowotworów są nowotwory pnia mózgu (części mózgu kontrolującej oddychanie) lub nowotwór, który rozrósł się w lub wokół głównego naczynia krwionośnego. W tych przypadkach rola operacji chirurgicznej jest ograniczona ze względu na wysokie ryzyko związane z usunięciem nowotworu.
W niektórych przypadkach operacja chirurgiczna nie jest stosowana do usunię cia masy nowotworu, ponieważ nie jest ona potrzebna. Przykładem jest chłoniak Hodgkina, nowotwór węzłów chłonnych, który odpowiada bardzo dobrze na połączenie chemioterapii i radioterapii. W przypadku chłoniaka Hodgkina operacja chirurgiczna jest rzadko potrzebna do osiągnięcia wyleczenia, ale prawie zawsze jest stosowana do postawienia diagnozy.
Chemioterapia jest powszechną postacią terapii nowotworowej, która obejmuje stosowanie leków (zazwyczaj podawanych doustnie lub drogą iniekcji), które specyficznie atakują szybko dzielące się komórki (takie jak te występujące w nowotworze) w organizmie. Czyni to chemioterapię użyteczną w leczeniu nowotworów, które już dały przerzuty, a także nowotworów, w przypadku których istnieje duże ryzyko rozprzestrzenienia przez układ krwionośny i limfatyczny, ale nie są wykrywalne poza pierwotnym nowotworem. Chemioterapia może być także stosowana do wzmocnienia odpowiedzi
PL 207 588 B1 umiejscowionych nowotworów na operację chirurgiczną i radioterapię. Ma to miejsce np. w przypadku niektórych nowotworów głowy i szyi.
Niestety chemioterapia wpływa na inne komórki w organizmie człowieka, które także prawidłowo szybko się dzielą (takie jak wyściółka żołądka i włosy). Z tego powodu wiele środków chemioterapeutycznych wywołuje niepożądane skutki uboczne, takie jak mdłości, wymioty, niedokrwistość, wypadanie włosów lub inne objawy. Te skutki uboczne są przejściowe i istnieją leki, które mogą pomóc złagodzić wiele z tych skutków ubocznych. Wraz z postępem wiedzy badacze wynaleźli nowsze środki chemioterapeutyczne, które nie tylko skuteczniej zabijają komórki nowotworowe, ale także powodują mniej skutków ubocznych u pacjenta.
Chemioterapię podaje się pacjentom na wiele różnych sposobów. W niektórych przypadkach podaje się pigułki, a w innych stosuje się iniekcję dożylną lub inną. W przypadku chemioterapii drogą iniekcji pacjent udaje się na leczenie do gabinetu lekarza lub do szpitala. Inne środki chemioterapeutyczne wymagają ciągłego wlewu do krwioobiegu, 24 godziny na dobę. W przypadku tych typów chemioterapii można przeprowadzić niewielki zabieg chirurgiczny w celu wszczepienia niewielkiej pompy noszonej przez pacjenta. Wówczas pompa powoli podaje lek. W wielu przypadkach umieszcza się stałe miejsce dostępu w żyle pacjenta, aby wyeliminować konieczność powtarzalnych ukłuć igłą.
Radioterapia jest inną powszechnie stosowaną bronią w walce z rakiem. Promieniowanie zabija komórki nowotworowe uszkadzając DNA w komórkach nowotworowych. Promieniowanie stosuje się w róż ny sposób, z których najczę stszy obejmuje skierowanie wiązki promieniowania na pacjenta w wysoce precyzyjny sposób i zogniskowanie jej na nowotworze. Aby to przeprowadzić pacjent leży na stole i wiązka porusza się wokół niego/niej. Procedura trwa przez minuty, ale może być powtarzana codziennie przez kilka tygodni (zależnie od typu nowotworu), aby osiągnąć konkretną całkowitą przepisaną dawkę.
Czasami stosowana inna metoda napromieniania, nazywana brachyterapią, obejmuje wszczepienie radioaktywnych peletek (ziaren) lub drurów do organizmu w obszar nowotworu. Implanty mogą być tymczasowe lub stałe. W przypadku implantów stałych promieniowanie w ziarnach zanika w ciągu dni lub tygodni, tak że pacjent nie staje się radioaktywny. W przypadku implantów tymczasowych całkowita dawka promieniowania jest zazwyczaj dostarczana przez kilka dni i pacjent musi pozostać w tym czasie w szpitalu. W przypadku obu typów brachyterapii promieniowanie zazwyczaj dostarcza się do bardzo ściśle określonego obszaru, aby osiągnąć miejscowe zwalczenie nowotworu (w przeciwieństwie do działania na cały organizm jak w przypadku chemioterapii).
Niektórzy dokładnie wybrani pacjenci mogą być kierowani na przeszczepy szpiku kostnego. Procedurę tę zazwyczaj przeprowadza się gdy pacjent ma nowotwór, który jest szczególnie agresywny, albo gdy ma nowotwór, który nawrócił po leczeniu standardową terapią. Przeszczep szpiku kostnego jest skomplikowaną procedurą. Jest wiele jego typów i różnią się one pod względem wywoływanych skutków ubocznych oraz leczenia. Większość przeszczepów wykonuje się w specjalnych ośrodkach i w wielu przypadkach ich zastosowanie uważa się za eksperymentalne.
Istnieje wiele innych terapii, ale większość z nich jest nadal badana w próbach klinicznych i nie należy jeszcze do standardowego postępowania. Przykłady obejmują stosowanie immunoterapii, przeciwciał monoklonalnych, czynników przeciw angiogenezie i terapii genowej.
Immunoterapia:
Istnieją różne techniki zaprojektowane aby pomóc własnemu układowi immunologicznemu pacjenta w zwalczaniu nowotworu, niezależnie od radioterapii i chemioterapii. Często, aby osiągnąć ten cel, badacze wstrzykują pacjentowi specjalnie opracowaną szczepionkę.
Przeciwciała monoklonalne:
Są to przeciwciała zaprojektowane do przyłączenia do komórek rakowych (ale nie do prawidłowych komórek) przez wykorzystanie różnic pomiędzy komórkami rakowymi i nierakowymi pod względem ich antygenowości i/lub innych cech. Pacjentowi mogą być podawane przeciwciała same lub sprzężone z różnymi związkami cytotoksycznymi albo w postaci radioaktywnej, tak że przeciwciało selektywnie dociera do komórek rakowatych, tym samym dostarczając środek toksyczny lub radioaktywność do pożądanych komórek.
Czynniki przeciw angiogenezie:
Z uwagi na to, że komórki rakowe szybko się dzielą i nowotwory rosną, może to szybko spowodować niedobór dostarczanej krwi. Aby to zrekompensować niektóre nowotwory wydzielają substancje uważane za pomagające w wywołaniu wzrostu naczyń krwionośnych w ich pobliżu, tym samym
PL 207 588 B1 dostarczając komórkom rakowym naczyniowe źródło substancji odżywczych. Zaprojektowano terapie doświadczalne, które hamują wzrost naczyń krwionośnych w nowotworach.
Terapia genowa:
Rak jest produktem serii mutacji, które ostatecznie prowadzą do powstania komórki rakowej i jej nadmiernej proliferacji. Raki można leczyć wprowadzając geny do komórek rakowych, które będą działać tak, żeby sprawdzać lub hamować proliferację raka, uruchamiać zaprogramowane w komórce mechanizmy niszczenia komórki, wzmacniać immunologiczne rozpoznawanie komórki lub eksprymować prolek, który ulega przemianie w toksyczny metabolit lub cytokinę, która hamuje wzrost nowotworu.
Łagodne nowotwory i wady rozwojowe można także leczyć różnymi sposobami obejmującymi operacje chirurgiczne, radioterapię, terapię lekami, ablację cieplną lub elektryczną, krioterapię i inne. Pomimo tego, że łagodne nowotwory nie dają przerzutów, mogą one osiągać duże rozmiary i mogą nawracać. Chirurgiczna ekstyrpacja łagodnych nowotworów wiąże się ze wszystkimi trudnościami i skutkami ubocznymi operacji chirurgicznej w znaczeniu ogólnym i czę sto musi być wykonywana powtórnie w przypadku niektórych łagodnych nowotworów, takich jak gruczolaki przysadki mózgowej, oponiaki mózgu, rozrost prostaty i inne.
Istnieją inne stany, w których występują niepożądane elementy komórkowe, i selektywne usunięcie komórek jest pożądane. Przykładowo choroby serca i udary są często spowodowane miażdżycą tętnic, która jest proliferacyjną zmianą chorobową obejmującą elementy włóknisto-tłuszczowe i zmodyfikowane komórki mięśni gładkich, które zniekształcają ścianę naczynia krwionośnego, zwężają światło naczynia, ograniczają przepływ krwi, predysponują do powstawania ogniskowych skrzepów krwi i ostatecznie prowadzą do zablokowania naczynia i zawału. Różne terapie miażdżycy tętnic obejmują przeszczepy omijające; sztuczne przeszczepy; angioplastykę z rekanalizacją, łyżeczkowanie, napromienianie, terapię laserową lub usunięcie zmian w inny sposób; farmakoterapię w celu zahamowania miażdżycy tętnic przez obniżanie poziomu lipidów; terapie przeciwzakrzepowe oraz ogólne postępowanie obejmujące dietę, wysiłek fizyczny i styl życia. Potrzebny jest sposób usuwania uszkodzeń miażdżycowych bez ryzyka i skutków ubocznych zabiegów chirurgicznych.
Inne przykłady niepożądanych elementów komórkowych, w przypadku których pożądane jest selektywne usunięcie komórek, obejmują rozrosty wywoływane wirusem, takie jak brodawki. Innym przykładem są przerostowe masy zapalne występujące w stanach zapalnych oraz przerostowe blizny lub bliznowce. Można wymienić jeszcze kolejne przykłady w kontekście kosmetyki, tak jak usuwanie niepożądanego owłosienia, np. włosów na twarzy lub obkurczanie niepożądanych obszarów tkanek w celach kosmetycznych, takich jak skóra właściwa i tkanki łączne twarzy oraz skóra właściwa i tkanka łączna kończyn.
Jeszcze inne przykłady będą oczywiste dla fachowców. We wszystkich lub większości z tych przypadków istnieje potrzeba znalezienia terapii, które mogą usunąć lub zniszczyć niepożądane elementy komórkowe bez ryzyka i skutków ubocznych związanych ze zwykłymi terapiami, oraz usunąć niepożądane elementy komórkowe bardziej precyzyjnie.
Białka włókienek neuronalnych (NTP) stanowią rodzinę ostatnio scharakteryzowanych białek mózgowych. Jeden członek tej rodziny, AD7c-NTP, jest fosfoproteiną o masie ~41 kD związaną z błoną, która działa w związku z powstawaniem wypustek neurytów (de la Monte i in., J Clin. Invest., 100: 3093-3104 (1997); de la Monte i in., Alz., Rep., 2 : 327-332 (1999); de la Monte SM i Wands JR, Journal of Alzheimer's Disease, 3 : 345-353 (2001)). Gen kodujący AD7c-NTP i przewidywaną sekwencję białkową AD7c-NTP zidentyfikowano i opisano (de la Monte i in., J. Clin. Invest., 100 : 3093-3104 (1997)). Oprócz składników o masie ~41 kD, zidentyfikowano inne rodzaje białek włókienek neuronalnych (o masie ~26 kD, ~21 kD, ~17 kD i ~15 kD) i powiązano je z nowotworami neuroektodermalnymi, gwiaździakami i glejakami oraz z uszkodzeniami w wyniku niedotlenienia, niedokrwienia i zawał u mózgu (Xu i in., Cancer Research, 53: 3823-3829 (1993); de la Monte i in., J Neuropathol. Exp. Neurol., 55 (10) : 1038-50 (1996), de la Monte i in., J. Neurol. Sci., 138 (1-2) : 26-35 (1996); de la Monte i in., J Neurol. Sci., 135 (2) : 118-25 (1996); de la Monte i in., J. Clin. Invest., 100 : 3093-3104 (1997) oraz de la Monte i in., Alz. Rep., 2 : 327-332 (1999)).
Rodzaje białka włókienek neuronalnych opisano i zastrzeżono w opisach patentowych US nr 5948634, 5948888 i 5830670, wszystkie dotyczące „Neural Thread Protein Gene Expression and Detection of Alzheimer's Disease, oraz w opisie patentowym US 6071705, „Method of Detecting Neurological Disease or Dysfunction”. Jak podano w tych opisach patentowych, NTP ulega nadekspresji i jest wytwarzane podczas śmierci komórki. Zatem martwe i umierające komórki nerwowe są opisywane
PL 207 588 B1 jako nadprodukujące NTP, a tym samym jego obecność oznacza śmierć komórek nerwowych i początek choroby Alzheimera (AD).
Inne rodzaje białka włókienek neuronalnych zidentyfikowano jako inne produkty genu AD7c-NTP (np. białko o długości 112 aminokwasów opisane w bazie danych NCBI Entrez-Protein database pod nr dostępu XP_032307 PID g15928971) lub jako podobne do białek włókienek neuronalnych (np. białko o długości 106 aminokwasów opisane w bazie danych NCBI Entrez-Protein database pod nr dostępu AAH14951 PID g15928971, białko o długości 106 aminokwasów opisane w bazie danych NCBI Entrez-Protein database pod nr dostępu XP_039102 PID g18599339 i białko o długości 61 aminokwasów opisane w bazie danych NCBI Entrez-Protein database pod nr dostępu AAH02534 PID g12803421).
Białko włókienek neuronalnych jest związane z AD, a NTP ulega nadekspresji w związku ze śmiercią komórek w AD. AD7c-NTP mRNA jest nadeksprymowany w mózgu z AD w porównaniu z kontrolą; poziomy białka AD7c-NTP w mózgu i CSF są wyższe przy AD niż w przypadku kontroli; oraz immunoreaktywność AD7c-NTP jest wykrywana w płytkach starczych, w kłąbach neurofibrylarnych (NFT), degenerujących neuronach, włóknach neuropilowych oraz w dystroficznych wyrostach neurotycznych w mózgach osób z AD i zespołem Downa (Ozturk i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86 : 419-423 (1989); de la Monte i in., J Clin. Invest., 86 (3) : 1004-13 (1990); de la Monte i in., J Neurol. Sci., 113 (2) : 152-64 (1992); de la Monte i in., Ann. Neurol., 32 (6) : 733-42 (1992); de la Monte i in., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55 (10) : 1038-50 (1996), de la Monte i in., J. Neurol. Sci., 138 (1-2) : 26-35 (1996); de la Monte i in., J. Neurol. Sci., 135 (2) : 118-25 (1996); de la Monte i in., J Clin. Invest., 100 : 3093-3104 (1997) oraz de la Monte i in., Alz.. Rep., 2: 327-332 (1999)). NTP jest umiejscowione w komórkach, w drobnych wyrostkach w neuropilu lub występuje zewnątrzkomórkowo zarówno w mózgach osób z AD i zespołem Downa, de la Monte i in., Ann. Neurol., 32 (6) : 733-42 (1992).
Podwyższone poziomy białka AD7c-NTP wykryto zarówno w CSF, jak i moczu pacjentów z AD (de la Monte i Wands, Front Biosci 7 : 989-96 (2002); de la Monte i Wands, Journal of Alzheimer's Disease 3 : 345-353 (2001); Munzar i in., Alzheimer's Reports 4 : 61-65 (2001); Kahle i in., Neurology 54 : 1498-1504 (2000); Munzar i in., Alzheimer Reports 3 : 155-159 (2000); de la Monte i in., Alzheimer's Reports 2 : 327-332 (1999); oraz de la Monte i in., J Clin Invest 100 : 3093-3104 (1997).
Nadekspresję NTP powiązano także z procesem śmierci komórek w chorobie Alzheimera (de la Monte i Wands, J. Neuropathol. Exp. Neurol., 60 : 195-207 (2001); de la Monte i Wands, Cell Mol Life Sci 58 : 844-49 (2001). AD7c-NTP zidentyfikowano w tkance mózgowej osób z zespołem Downa (Wands i in., międzynarodowa publikacja patentowa WO 90/06993; de la Monte i in., J Neurol Sci 135 : 118-25 (1996); de la Monte i in., Alz. Rep., 2 : 327-332 (1999)). Istnieją także pewne dowody, że nadekspresja NTP może być także związana z jaskrą z normalnym ciśnieniem (Golubnitschaja-Labudova i in., Curr Eye Res 21 : 867-76 (2000)).
Udowodniono, że NTP jest skutecznym środkiem do wywoływania śmierci komórek zarówno w hodowlach in vitro komórek glejaka i komórek nerwiaka niedojrzałego, jak i in vivo w prawidłowej tkance mięśniowej, podskórnej tkance łącznej i skórze właściwej gryzoni oraz w różnych nowotworach pochodzących i niepochodzących od ludzi, w tym w raku sutka, raku i brodawczaku skóry, raku jelita, glejaku mózgu, oraz w innych modelach gryzoni. Patrz, publikacja US 22030054990.
Nadal istnieje potrzeba opracowania nowych, mniej toksycznych terapii do leczenia niepożądanych elementów komórkowych. Wynalazek spełnia tę potrzebę.
Wynalazek jest oparty częściowo na ustaleniu, że sekwencje peptydowe zawarte w AD7c-NTP są skutecznymi środkami do niszczenia lub usuwania szkodliwych lub niepożądanych komórek, oraz że ich warianty i homologi także występują w innych białkach w innych organizmach, w tym u ludzi i innych ssaków. Gdy sekwencje peptydowe zostaną ustalone, białka te mogą być znalezione przez fachowca z wykorzystaniem szeroko dostępnych publicznych i komercyjnych baz danych białek, takich jak National Center Biotechnology Information's Protein database i programów przeszukujących, takich jak BLAST® (Basic Local Alignment Search Tool). Patrz, Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller i David J. Lipman (1997), „Gapped BLAST and PSIBLAST: a new generation of protein database search programs, Nucleic Acids Res. 25 : 3389-3402.
Następnie fachowiec może dokonać selekcji tych białek z zastosowaniem opisanej metody badań, aby określić ich skuteczność jako środków do niszczenia lub usuwania niepożądanych lub szkodliwych komórek. Następnie fachowiec, po znalezieniu jednego lub większej liczby takich skutecznych środków, może określić, które części tych środków zawierają sekwencje homologiczne z sekwencjami
PL 207 588 B1 lub podobne do sekwencji peptydu AD7c-NTP opisanych tutaj lub opisanych w publikacji US 20030096350, zsyntetyzować te części tych środków sposobami znanymi fachowcom, oraz zbadać zsyntetyzowane związki pod kątem ich skuteczności jako środków do niszczenia lub usuwania niepożądanych lub szkodliwych komórek. Ponadto fachowiec może także zastosować sekwencje aminokwasowe któregokolwiek z takich znalezionych białek do określenia innych sekwencji peptydowych niepodobnych do sekwencji lub homologicznych z sekwencjami homologicznymi z sekwencjami lub podobnymi do sekwencji peptydowych AD7c-NTP tutaj opisanych, jak opisano w publikacji US 20030096350. Te nowo syntetyzowane sekwencje można następnie zbadać pod kątem ich skuteczności jako środków do niszczenia lub usuwania niepożądanych lub szkodliwych komórek.
Wynalazek dotyczy peptydu NTP o sekwencji aminokwasowej wybranej z grupy obejmującej:
SEQ ID NO. 11 (Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Pro-Val-Ala-Gly)
SEQ ID NO. 12 (Gly-Ala-Ile-Ser-Ala-His-Arg-Asn-Leu-Arg-Leu)
SEQ ID NO. 13 (Phe-Phe-Leu-Val-Glu-Met)
SEQ ID NO. 14 (Ser-Val-Thr-Gln-Ala-Gly-Val-Gln-Trp)
SEQ ID NO. 15 (Ile-Asp-Gln-Gln-Val-Leu-Ser-Arg-Ile-Lys-Leu-Glu-Ile-Lys-Arg-Cys-Leu) oraz
SEQ ID NO. 16 (Leu-Ser-Arg-Ile-Lys-Leu-Glu-Ile-Lys)
Wynalazek dotyczy również peptydu NTP określonego powyżej do stosowania jako lek.
Wynalazek dotyczy ponadto środka zawierającego substancję czynną oraz nośnik, charakteryzującego się tym, że jako substancję czynną zawiera peptyd określony powyżej.
Wynalazek dotyczy także zastosowania peptydu NTP zdefiniowanego powyżej do wytwarzania leku do leczenia stanu wymagającego usunięcia lub zniszczenia komórek, wybranego z grupy obejmującej łagodny lub złośliwy nowotwór tkanki, hiperplazję, przerost lub rozrost tkanki, wirusowe, bakteryjnie lub pasożytniczo zmienioną tkankę, wadę rozwojową tkanki, przerost migdałków, rozrost prostaty, łuszczycę, wyprysk, dermatozę, kosmetyczną modyfikację tkanki, chorobę naczyniową, hemoroidy, żylaki naczyń, miażdżycę tętnic lub stwardnienie tętnic, chorobę zapalną, chorobę autoimmunologiczną, chorobę metaboliczną, chorobę dziedziczną/genetyczną, chorobę urazową lub uraz fizyczny, chorobę wywołaną niedoborem pokarmowym, chorobę zakaźną, chorobę amyloidową, chorobę zwłóknieniową, chorobę spichrzeniową, wrodzoną wadę rozwojową, chorobę wywołaną niedoborem enzymatycznym, zatrucie, odurzenie, zwłaszcza alkoholem lub narkotykiem, chorobę środowiskową, chorobę popromienną, chorobę wewnątrzwydzielniczą, chorobę zwyrodnieniową.
Zgodne z wynalazkiem peptydy, środki i zastosowanie peptydów są użyteczne do leczenia niepożądanych proliferacji komórkowych, takich jak łagodne i złośliwe nowotwory, rozrost gruczołów (np. prostaty), niepożądane owłosienie twarzy, brodawki oraz niepożądana tkanka tłuszczowa. Leczenie polega na podawaniu potrzebującemu tego ssakowi terapeutycznie skutecznej ilości pokrewnego białka, pokrewnego peptydu lub peptydu NTP, odnośnie którego wiadomo, że jest skutecznym środkiem do wywoływania śmierci komórek. Określenia „pokrewne białko”, „pokrewny peptyd” i „peptyd NTP” zdefiniowano poniżej.
Peptydy według wynalazku zawierają co najmniej jedną sekwencję aminokwasową odpowiadającą części sekwencji aminokwasowej rodzaju białka włókienek neuronalnych. Środki według wynalazku zawierają peptydy i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Peptydy lub białka według wynalazku („peptydy śmierci komórki”) można podawać same lub można je sprzęgać z nośnikiem lub przeciwciałem i formułować w preparat. Peptydy śmierci komórek można podawać domięśniowo, doustnie, dożylnie, śródotrzewnowo, śródmózgowo (śródmiąższowo), do komór mózgowych, donowotworowo, do uszkodzenia, śródskórnie, doodbytniczo, donosowo, doocznie, dotętniczo, domiejscowo, przezskórnie, w aerozolu, we wlewach, w zastrzykach uderzeniowych, we wszczepianym urządzeniu, w układzie o przedł u ż onym uwalnianiu itd., samodzielnie lub w postaci sprzężonej z noś nikiem. Alternatywnie, peptyd śmierci komórek można eksprymować in vivo przez podawanie genu eksprymującego peptyd, przez podawanie szczepionki wywołującej takie wytwarzanie lub przez wprowadzanie komórek, bakterii lub wirusów eksprymujących peptyd in vivo, w wyniku modyfikacji genetycznej, albo w inny sposób.
Ponadto peptyd śmierci komórek można stosować w połączeniu z innymi terapiami do leczenia łagodnych lub złośliwych nowotworów oraz innych niepożądanych lub szkodliwych rozrostów komórkowych.
Zarówno powyższy ogólny opis, jak i poniższy opis szczegółowy są przykładowe i wyjaśniające, i mają na celu dalsze wyja ś nienie wynalazku. Inne przedmioty, korzy ś ci i nowe cechy bę dą wyraź nie wynikać z poniższego szczegółowego opisu wynalazku.
PL 207 588 B1
Określenia i wyrażenia stosowane w opisie mają znaczenie podane poniżej, o ile nie wskazano inaczej.
Określenie „AD7c-NTP” dotyczy białka o masie ~41 kD oraz genu i sekwencji kwasu nukleinowego kodujących to białko, opisanych w de la Monte i in., J. Clin. Invest., 100 : 3093-104 (1997), sekwencjach 120 i 121 w opisach patentowych US nr 5948634, 5948888 i 5830670 oraz pod nr GenBank AF010144, które to sekwencje kwasu nukleinowego i aminokwasową zilustrowano na fig. 1. Określenie „AD7c-NTP” obejmuje także biologicznie czynne fragmenty, warianty, pochodne, homologi i mimetyki AD7c-NTP.
Określenie „NTP” lub „białko włókienek neuronalnych” dotyczy białek włókienek neuronalnych i pokrewnych czą steczek (w tym biał ek wł ókienek trzustkowych) oraz sekwencji kwasu nukleinowego kodujących te białka oraz obejmuje (ale nie wyłącznie) poniższe białka i sekwencje kwasu nukleinowego kodujące sekwencje aminokwasowe tych białek:
(a) AD7c-NTP;
(b) rodzaje włóknistego białka neuronalnego o masie ~42, ~26, ~21, ~17, ~14 i ~8 kD, jak opisano w opisach patentowych US nr 5948634, 5948888, 5830670 i 6071705 oraz w de la Monte i in., J. Neuropathol. Exp. Neural, 55 (10) : 1038-50 (1996), de la Monte i in., J. Neurol. Sci., 138 (1-2) : 26-35 (1996); de la Monte i in., J. Neurol. Sci., 135 (2) : 118-25 (1996), de la Monte i in., J. Clin. Invest., 100 : 3093-3104 (1997) oraz de la Monte i in., Alz. Rep., 2 : 327-332 (1999);
(c) białka specyficznie rozpoznawane przez przeciwciało monoklonalne nr 2 z depozytu American Type Culture Collection, Manassas, Va., pod nr dostępu HB-12546 lub przeciwciało monoklonalne nr 5 z depozytu American Type Culture Collection, Manassas, Va., pod numerem dostępu HB-12545;
(d) białka kodowane przez gen AD7c-NTP;
(e) 122-aminokwasowe białko włókienek neuronalnych opisane w sekwencji 40 z opisów patentowych US nr 5830670, 5948634 i 5948888 oraz wymienione w NCBI Entrez-Protein pod nr dostępu AAE25447, PID g10048540, którego sekwencję aminokwasową zilustrowano na fig. 2 („NTP-122”);
(f) 112-aminokwasowe białko włókienek neuronalnych wymienione w NCBI Entrez-Protein pod nr dostępu XP_032307, PID g14725132, którego sekwencję aminokwasową zilustrowano na fig. 3 („NTP-112”);
(g) 106-aminokwasowe białko włókienek neuronalnych wymienione w NCBI Entrez-Protein pod nr dostępu AAH14951 PID g15928971, którego sekwencję aminokwasową zilustrowano na fig. 4 („NTP-106A”);
(h) 106-aminokwasowe białko podobne do białka włókienek neuronalnych wymienione w NCBI Entrez-Protein pod nr dostępu XP_039102, PID g18599339, którego sekwencję aminokwasową zilustrowano na fig. 5 („NTP-106B”);
(i) 98-aminokwasowe białko włókienek neuronalnych opisane w sekwencji 30 z opisów patentowych US nr 5830670, 5948634 i 5948888 oraz wymienione w NCBI Entrez-Protein pod nr dostępu AAE25445, PID g10048538, którego sekwencję aminokwasową zilustrowano na fig. 6 („NTP-98”);
(j) 75-aminokwasowe białko włókienek neuronalnych opisane w sekwencji 48 z opisów patentowych US nr 5830670, 5948634 i 5948888 oraz wymienione w NCBI Entrez-Protein pod nr dostępu AAE25448, PID g10048541, którego sekwencję aminokwasową zilustrowano na fig. 7 („NTP-75”);
(k) 68-aminokwasowe białko podobne do białka włókienek neuronalnych opisane w sekwencji 36 z opisów patentowych US nr 5830670, 5948634 i 5948888 oraz wymienione w NCBI Entrez-Protein pod nr dostępu AAE25446, PID g10048539, którego sekwencję aminokwasową zilustrowano na fig. 8 („NTP-68”);
(I) 61-aminokwasowe białko podobne do białka włókienek neuronalnych wymienione w NCBI Entrez-Protein pod nr dostępu AAH02534, PID g12803421, którego sekwencję aminokwasową zilustrowano na fig. 9 („NTP-61”);
(m) białko włókienek trzustki;
(n) białko włókienek neuronalnych trzustki (nPTP) opisane w opisie patentowym US 6071705;
oraz (o) białka specyficznie rozpoznawane przez przeciwciała wytwarzane przez hybrydomę z grupy obejmującej HB 9934, HB 9935 i HB 9936 zdeponowanych w American Type Culture Collection.
Określenie „peptyd NTP” dotyczy peptydów zawierających sekwencje aminokwasowe odpowiadające co najmniej części sekwencji aminokwasowej NTP lub fragmentów NTP i obejmuje homologi, pochodne, warianty, białka fuzyjne i peptydowe mimetyki takich peptydów, o ile kontekst nie wskazuje inaczej. Określenie „peptyd NTP” także obejmuje (ale nie wyłącznie) peptydy specyficznie wymienione
PL 207 588 B1 w publikacjach US 20030054990 i US 20030096350. Okreś lenie „peptyd NTP” także korzystnie obejmuje (ale nie wyłącznie) poniższe sekwencje aminokwasowe NTP:
(a) peptyd NTP nr 1: [SEQ ID NO 10], AD7c-NTP p239-243 SSWDY
Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr (b) peptyd NTP nr 2: [SEQ ID NO. 11] AD7c-NTP p31-39 PASASPVAG
Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Pro-Val-Ala-Gly (c) peptyd NTP nr 3 [SEQ ID NO. 12], AD7c-NTP p14-24 GAISAHRNLRL
Gly-Ala-Ile-Ser-Ala-His-Arg-Asn-Leu-Arg-Leu (d) peptyd NTP nr 4 [SEQ ID NO. 13], AD7c-NTP p53-58 FFLVEM
Phe-Phe-Leu-Val-Glu-Met (e) peptyd NTP nr 5 [SEQ ID NO. 14], AD7c-NTP p208 - 216 SVTQAGVQW
Ser-Val-Thr-Gln-Ala-Gly-Val-Gln-Trp (f) peptyd NTP nr 6 [SEQ ID NO. 15], NTP-122 p106-122 IDQQVLSRIKLEIKRCL
Ile-Asp-Gln-Gln-Val-Leu-Ser-Arg-Ile-Lys-Leu-Glu-Ile-Lys-Arg-Cys-Leu (g) peptyd NTP nr 7 [SEQ ID NO. 16], NTP-122 p111-119 LSRIKLEIK
Leu-Ser-Arg-Ile-Lys-Leu-Glu-Ile-Lys a także homologi, pochodne, warianty, fragmenty, białka fuzyjne i mimetyki peptydowe tych konkretnie wymienionych peptydów NTP.
Określenie „pokrewne białko” dotyczy białek zawierających jedną lub większą liczbę sekwencji aminokwasowych identycznych, bardzo podobnych lub homologicznych z jednym lub większą liczbą peptydów NTP.
Określenie „pokrewny peptyd” dotyczy peptydów zawierających sekwencje aminokwasowe odpowiadające co najmniej części sekwencji aminokwasowej pokrewnego białka i obejmuje homologi, warianty, białka fuzyjne, odwrotne peptydy D i mimetyki peptydowe takich peptydów. Określenie „pokrewny peptyd” także korzystnie obejmuje (ale nie wyłącznie) poniższe sekwencje aminokwasowe pokrewnych białek:
(a) pokrewny peptyd nr 1 [SEQ ID NO. 17] kanał 6 potencjału przejściowego receptora, wariant delta (nr dostępu NCBI CAC01686, PID g9716913), p356-377
GDHGRPNLSRLKLAIKYEVKKM
Gly-Asp-His-Gly-Arg-Pro-Asn-Leu-Ser-Arg-Leu-Lys-Leu-Ala-Ile-Lys-Tyr-Glu-Val-Lys-Lys-Met (b) pokrewny peptyd nr 2 [SEQ ID NO. 18] przypuszczalny pojemnościowy kanał wapniowy (nr dostępu NCBI NP_065122, PID g9966865), p345-360
QQSIAVKFLAVFGVSI
Gln-Gln-Ser-Ile-Ala-Val-Lys-Phe-Leu-Ala-Val-Phe-Gly-Val-Ser-Ile (c) pokrewny peptyd nr 3 [SEQ ID NO. 19] skrócony wariant gamma trp-pokrewnego białka 4, (nr dostępu NCBI AF063825_1, PID g6665596), p337-357
GLLFPVFSVCYLIAPKSPLGL
Gly-Leu-Leu-Phe-Pro-Val-Phe-Ser-Val-Cys-Tyr-Leu-Ile-Ala-Pro-Lys-Ser-Pro-Leu-Gly-Leu oraz homologi, pochodne, warianty, fragmenty, białka fuzyjne i mimetyki peptydowe tych specyficznie wymienionych pokrewnych peptydów.
Określenie „peptyd śmierci komórki” dotyczy pokrewnego białka lub pokrewnego peptydu, który, jak wykazano, jest skutecznym środkiem do wywoływania śmierci komórki.
Określenie „fragment” dotyczy białka lub polipeptydu zawierającego ciągłą podsekwencję sekwencji aminokwasowej białka NTP, peptydu NTP, pokrewnego białka lub pokrewnego peptydu i obejmuje naturalnie występujące fragmenty, takie jak warianty składania i fragmenty powstałe w wyniku naturalnie występującej in vivo aktywności proteazowej. Taki fragment może być skrócony na N-końcu, C-końcu i/lub wewnętrznie (np. w wyniku naturalnego składania). Można wytworzyć takie fragmenty z N-końcową metioniną lub bez niej. Określenie „fragment” obejmuje fragmenty, identyczne lub różne, z tego samego białka NTP lub peptydu NTP albo pokrewnego biał ka lub pokrewnego peptydu, ze wspólną sekwencją sąsiadujących aminokwasów lub bez niej, połączonych razem, bezpośrednio albo przez łącznik.
Określenie „wariant” dotyczy białka lub polipeptydu, w którym obecne jest jedno lub większa liczba podstawień, delecji i/lub insercji aminokwasów w porównaniu z sekwencją aminokwasową białka NTP, peptydu NTP, pokrewnego białka lub pokrewnego peptydu, i obejmuje naturalnie występujące alleliczne warianty lub warianty alternatywnego składania białka NTP, peptydu NTP, pokrewnego białka lub pokrewnego peptydu. Określenie „wariant” obejmuje zastąpienie jednego lub większej liczby aminoPL 207 588 B1 kwasów w sekwencji peptydu podobnymi lub homologicznymi aminokwasami lub niepodobnymi aminokwasami. Istnieje wiele skal według których aminokwasy można uszeregować jako podobne lub homologiczne. (Gunnar von Heijne, Sequence Analysis in Molecular Biology, str. 123-39 (Academic Press, New York, NY 1987). Korzystne warianty obejmują podstawienia alaniny w jednej lub większej liczbie pozycji aminokwasowych. Inne korzystne podstawienia obejmują podstawienia konserwatywne, które wywierają niewielki wpływ lub nie wywierają wpływu na ogólny ładunek netto, polarność lub hydrofobowość białka. Konserwatywne podstawienia podano w tabeli 1 poniżej.
T a b e l a 1
Konserwatywne podstawienia aminokwasów
Zasadowe: arginina lizyna histydyna
Kwasowe: kwas glutaminowy kwas asparaginowy
Nienaładowane polarne: glutamina asparagina seryna treonina tyrozyna
Niepolarne: fenyloalanina tryptofan cysteina glicyna alanina walina prolina metionina leucyna izoleucyna
Tabela 2 przedstawia inny schemat podstawień aminokwasów. T a b e l a 2
Pierwotna reszta Podstawienia
1 2
Ala gly; ser
Arg lys
Asn gln; his
Asp glu
Cys ser
Gln asn
Glu asp
Gly ala; pro
His asn; gln
Ile leu; val
Leu Ile; val
Lys arg; gln; glu
Met leu; tyr; ile
PL 207 588 B1 cd. tabeli 2
1 2
Phe met; leu; tyr
Ser thr
Thr ser
Trp tyr
Tyr trp; phe
Val ile; leu
Inne warianty mogą zawierać mniej konserwatywne podstawienia aminokwasowe, tak jak przez wybranie reszt różniących się bardziej znacząco ich wpływem na utrzymanie (a) struktury szkieletu polipeptydu w obszarze podstawienia, np. w konformacji kartki lub helikalnej, (b) ładunku lub hydrofobowości cząsteczki w docelowym miejscu, albo (c) objętości łańcucha bocznego. Podstawieniami, w przypadku których ogólnie przewiduje się , ż e wywierają bardziej znaczą cy wpł yw na dział anie, są takie, w których (a) glicyna i/lub prolina jest podstawiona (lub zastąpiona) inną resztą aminokwasową lub jest wydeletowana albo wstawiona; (b) reszta hydrofilowa, np. serylowa lub treonylowa, jest podstawiona (lub zastąpiona) resztą hydrofobową, np. leucylową, izoleucylową, fenyloanlaninową, walilową lub alanylową; (c) reszta cysteinowa jest podstawiona (lub zastąpiona) dowolną inną resztą;
(d) reszta mająca elektrododatni łańcuch boczny, np. lizylowa, arginylowa lub histydylowa jest podstawiona (lub zastąpiona) resztą mającą ładunek elektroujemny, np. glutamylem lub aspartylem; albo (e) reszta mająca duży łańcuch boczny, np. fenyloalanina, jest podstawiona (lub zastąpiona) resztą nie mającą takiego łańcucha, np. glicyną. Inne warianty obejmują te zaprojektowane tak, aby wytworzyć nowe miejsce(a) glikozylacji i/lub fosforylacji, albo te zaprojektowane tak, aby usunąć istniejące miejsce(a) glikozylacji i/lub fosforylacji. Warianty obejmują podstawienie co najmniej jednego aminokwasu w miejscu glikozylacji, miejscu rozszczepienia proteolitycznego i/lub reszty cysteiny. Warianty także obejmują białka NTP, peptydy NTP, pokrewne białka i pokrewne peptydy z dodatkowymi resztami aminokwasowymi przed i po sekwencji aminokwasowej białka NTP, peptydu NTP, pokrewnego białka i pokrewnego peptydu w peptydach łącznikowych. Przykładowo resztę cysteiny można dodać zarówno na N-, jak i na C-końcu pokrewnego peptydu w celu umożliwienia cyklizacji pokrewnego peptydu przez utworzenie wiązania disiarczkowego. Określenie „wariant” obejmuje także polipeptydy mające sekwencję pokrewnego białka lub pokrewnego peptydu zawierającą od co najmniej jednej do 25 lub większej liczby dodatkowych reszt aminokwasowych flankujących na końcu 3' albo 5' pokrewnego białka lub pokrewnego peptydu.
Określenie „pochodna” dotyczy chemicznie modyfikowanego białka lub polipeptydu, które zostały zmodyfikowane chemicznie lub w wyniku naturalnych procesów, takich jak obróbka i inne modyfikacje posttranslacyjne, ale także metodami modyfikacji chemicznej, jak np. przez dodanie jednej lub większej liczby cząsteczek glikolu polietylenowego, cukrów, fosforanów i/lub innych podobnych cząsteczek, przy czym cząsteczka lub cząsteczki nie są naturalnie dołączone do pokrewnych białek lub pokrewnych peptydów typu dzikiego. Pochodne obejmują sole. Takie modyfikacje chemiczne są dokładnie opisane w podstawowych tekstach oraz w bardziej szczegółowych monografiach, a także w obszernej literaturze badawczej i są one dobrze znane fachowcom. Należy wziąć pod uwagę, że taki sam typ modyfikacji może być obecny w takim samym lub zmiennym stopniu w kilku miejscach w danym biał ku lub polipeptydzie. Dane biał ko lub polipeptyd mo ż e takż e zawierać wiele typów modyfikacji. Modyfikacje mogą wystąpić gdziekolwiek w białku lub polipeptydzie, w tym w szkielecie polipeptydu, łańcuchach bocznych aminokwasów oraz na N- i C-końcach. Modyfikacje obejmują np. acetylowanie, acylowanie, ADP-rybozylowanie, amidowanie, kowalencyjne przyłączenie flawiny, kowalencyjne przyłączenie ugrupowania hemowego, kowalencyjne przyłączenie nukleotydu lub pochodnej nukleotydu, kowalencyjne przyłączenie lipidu lub pochodnej lipidu, kowalencyjne przyłączenie fosfatydyloinozytolu, sieciowanie, cyklizację, tworzenie wiązań disiarczkowych, odmetylowanie, tworzenie kowalencyjnych wiązań poprzecznych, tworzenie cysteiny, tworzenie piroglutaminianu, formylowanie, γ-karboksylowanie, glikozylację, tworzenie kotwicy GPI, hydroksylowanie, jodowanie, metylowanie, mirystoilowanie, utlenianie, obróbkę proteolityczną, fosforylowanie, prenylowanie, racemizację, glikozylację, przyłączenie lipidu, siarczanowanie, γ-karboksylację reszt kwasu glutaminowego, hydroksylowanie i ADP-rybozylowanie, selenoilowanie, siarczanowanie, pośredniczone przez tRNA dodanie
PL 207 588 B1 aminokwasów do białek, takie jak arginylowanie i ubikwitynowanie. Patrz, np. Proteins-Structure And Molecular Properties, wyd. 2, T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993) and Wold, F., „Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects”, str. 1-12 w Posttransla-tional Covalent Modification Of Proteins, B. C. Johnson, red., Academic Press, New York (1983); Seifter i in., Meth. Enzymol. 182 : 626-646 (1990) oraz Rattan i in., „Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging”, Ann. N.Y. Acad. Sci. 663: 48-62 (1992). Określenie „pochodne” obejmuje modyfikacje chemiczne powodujące rozgałęzienie i/lub cyklizację białka lub peptydu. Cykliczne, rozgałęzione i rozgałęzione koliste polipeptydy mogą powstać w wyniku naturalnych procesów posttranslacyjnych i mogą być także wytwarzane całkowicie syntetycznymi metodami.
Określenie „homolog” dotyczy białka, które jest co najmniej w 60% identyczne pod względem sekwencji aminokwasowej z białkiem NTP, peptydem NTP, pokrewnym białkiem lub pokrewnym peptydem, zależnie od okoliczności, co określa się znanymi metodami, które powszechnie stosuje się do porównywania podobieństwa w pozycjach aminokwasów dwóch polipeptydów. Stopień podobieństwa lub identyczności pomiędzy dwoma białkami można łatwo obliczyć znanymi metodami, w tym, ale nie wyłącznie, opisanymi w Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., red., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith D. W., red., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, część I, Griffin A. M., i Griffin H. G., red., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov M. i Devereux J., red., M Stockton Press, New York, 1991 oraz Carillo H. i Lipman D., SIAM, J. Applied Math., 48 : 1073 (1988). Korzystne metody określania identyczności zaprojektowano w celu uzyskania największego dopasowania pomiędzy badanymi sekwencjami. Metody określania identyczności i podobieństwa są skodyfikowane w publicznie dostępnych programach komputerowych.
Korzystne programy komputerowe użyteczne do określania identyczności i podobieństwa pomiędzy dwiema sekwencjami obejmują, ale nie wyłącznie, pakiet programów GCG (Devereux, J., i in., Nucleic Acids Research, 12(1) : 387 (1984)), BLASTP, BLASTN i FASTA, Atschul S. F. i in., J. Molec. Biol, 215 : 403-410 (1990). Program BLASTX jest publicznie dostępny z NCBI i innych źródeł (BLAST Manual, Altschul S. i in., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul S. i in., J. Mol. Biol, 215 : 403-410 (1990)). Przykładowo, stosując algorytm komputerowy, taki jak GAP (Genetic Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), dwa białka lub polipeptydy, dla których ma być określony procent identyczności sekwencji, porównuje się w celu optymalnego dopasowania ich odpowiadających aminokwasów („zakres dopasowania”, co wyznacza algorytm).
W połączeniu z algorytmem stosuje się karę za otwarcie przerwy (którą oblicza się jako 3 x (razy) średni diagonal; „średni diagonal” oznacza średnią diagonalną zastosowanej macierzy porównującej; „diagonal” oznacza punktację lub liczbę przypisaną każdemu perfekcyjnemu aminokwasowi przez konkretną macierz porównującą) oraz karę za wydłużenie przerwy (która zazwyczaj wynosi 1/10 razy kara za otwarcie przerwy), a także macierz porównującą, taka jak PAM 250 lub BLOSUM 62. Standardowa macierz porównująca (patrz, Dayhoff i in. w: Atlas of Protein Sequence and Structure, tom 5, suplement 3 [1978] macierz porównująca PAM250; patrz Henikoff i in., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89 : 10915-10919 [1992] macierz porównująca BLOSUM 62) także może być stosowana przez algorytm. Następnie algorytm oblicza procent identyczności. Homologi zazwyczaj mają jedno lub większą liczbę aminokwasowych podstawień, delecji i/lub insercji w stosunku do porównywanego białka NTP, peptydu NTP, pokrewnego białka lub pokrewnego peptydu, zależnie od okoliczności.
Określenie „mimetyk peptydu” lub „mimetyk” oznacza biologicznie aktywne związki, które naśladują aktywność biologiczną peptydu lub białka, ale nie mają już natury chemicznej peptydu, czyli nie zawierają jakichkolwiek wiązań peptydowych (czyli wiązań amidowych pomiędzy aminokwasami). W niniejszym opisie okre ś lenie mimetyk peptydu stosuje się w szerszym znaczeniu jako obejmują ce cząsteczki, które nie mają wcale natury peptydowej, takie jak pseudopeptydy, semipeptydy i peptoidy. Przykłady mimetyków peptydów w szerszym znaczeniu (gdzie część peptydu jest zastąpiona strukturą, w której brak jest wiązań peptydowych) opisano poniżej. Jakkolwiek całkowicie lub częściowo niepeptydowe, mimetyki peptydów według wynalazku wykazują przestrzenne rozmieszczenie ugrupowań chemicznych, które blisko przypominają trójwymiarowe rozmieszczenie grup aktywnych w peptydzie NTP, pokrewnym białku lub pokrewnym peptydzie, na którym oparty jest mimetyk peptydu. Wskutek tej podobnej geometrii miejsca czynnego, mimetyk peptydu wywiera wpływ na układy biologiczne, podobny do aktywności biologicznej peptydu NTP, pokrewnego białka i pokrewnego peptydu.
PL 207 588 B1
Mimetyki peptydów według wynalazku korzystnie są zasadniczo podobne zarówno pod względem trójwymiarowego kształtu, jak i aktywności biologicznej do opisanych tutaj peptydów NTP, pokrewnych białek lub pokrewnych peptydów. Przykłady znanych w dziedzinie wynalazku metod strukturalnego modyfikowania peptydu z wytworzeniem mimetyku peptydu obejmują inwersję centrów chiralnych szkieletu prowadzącą do struktur reszt D-amino-kwasów, które mogą, szczególnie na N-końcu prowadzić do zwiększenia odporności na rozkład proteolityczny bez niekorzystnego wpływu na aktywność. Przykład podano w publikacji „Tritriated D-ala1-Peptide T Binding”, Smith C. S. i in., Drug Development Res., 15, str. 371-379 (1988). Drugą metodą jest zmiana struktury cyklicznej w celu stabilizacji, tak jak N na C w międzyłańcuchowych imidach i laktamach (Ede i in., w Smith i Rivier (red.) „Peptides: Chemistry and Biology”, Escom, Leiden (1991), str. 268-270). Przykładem tego są konformacyjnie ograniczone związki tymopentyno-podobne, takie jak ujawnione w opisie patentowym US 4457489 (1985) (Goldstein G. i in.). Trzecią metodą jest zastępowanie wiązań peptydowych w pokrewnym białku lub pokrewnym peptydzie przez wiązania pseudopeptydowe, które nadają odporność na proteolizę.
Opisano szereg wiązań pseudopeptydowych, które ogólnie nie wpływają na strukturę i aktywność biologiczną peptydu. Jednym z przykładów tego podejścia jest podstawienie wiązaniami retro-inverso pseudopeptydowymi („Biologically active retroinverso analogues of thymopentin”, Sisto A. i in., w Rivier, J. E. i Marshall, G. R. (red.) „Peptides, Chemistry, Structure and Biology, Escom, Leiden (1990), str. 722-773) oraz Dalpozzo i in., (1993), Int. J. Peptide Protein Res., 41 : 561-566). Zgodnie z tą modyfikacją sekwencje aminokwasowe peptydów mogą być identyczne z opisanymi tutaj sekwencjami peptydu NTP, pokrewnego białka lub pokrewnego peptydu, z wyjątkiem tego, że jedno lub większa liczba wiązań peptydowych są zastąpione wiązaniem retro-inverso pseudopeptydowym. Korzystnie najbliższe N-końca wiązanie peptydowe jest podstawione, gdyż takie podstawienie nadaje odporność na proteolizę przez egzopeptydazy działające na N-koniec. Kolejne modyfikacje można także wprowadzić przez zastąpienie grup chemicznych aminokwasów innymi grupami chemicznymi o podobnej strukturze. Innym odpowiednim wiązaniem pseudopeptydowym, odnośnie którego wiadomo, że wzmacnia stabilność względem rozszczepienia enzymatycznego przy braku lub niewielkiej utracie aktywności biologicznej jest zredukowane izosteryczne wiązanie pseudopeptydowe (Couder i in., (1993), Int. J. Peptide Protein Res., 41 : 181-184).
Zatem sekwencje aminokwasowe tych peptydów mogą być identyczne z sekwencjami peptydu NTP, pokrewnego białka lub pokrewnego peptydu, z wyjątkiem tego, że jedno lub większa liczba wiązań peptydowych jest zastąpiona izosterycznym wiązaniem pseudopeptydowym. Określenie „sekwencja (e) aminokwasową (e) korzystnie oznacza sekwencję co najmniej dwóch aminokwasów, korzystnie co najmniej czterech, a najkorzystniej pięciu. Korzystnie najbliższe N-końca wiązanie peptydowe jest podstawione, gdyż takie podstawienie nadaje odporność na proteolizę przez egozpeptydazy działające na N-koniec. Synteza peptydów z jednym lub większą liczbą zredukowanych izosterycznych wiązań pseudopeptydowych jest znana (Couder i in., (1993), patrz powyżej). Inne przykłady obejmują wprowadzenie wiązań ketometylenowych lub metylosiarczkowych w celu zastąpienia wiązań peptydowych.
Peptoidowe pochodne peptydów NTP, pokrewnych białek i pokrewnych peptydów stanowią inną klasę mimetyków peptydów, które zachowują determinanty strukturalne ważne dla aktywności biologicznej, ale bez wiązań peptydowych, co nadaje odporność na proteolizę (Simon i in., Proc. Natl. Acad Sci USA, 89 : 9367-9371). Peptoidy są oligomerami N-podstawionych glicyn. Opisano kilka grup N-alkilowych, z których każda odpowiada łańcuchowi bocznemu naturalnego aminokwasu (Simon i in., (1992), patrz powyżej). Kilka lub wszystkie aminokwasy peptydów NTP, pokrewnego białka lub pokrewnego peptydu można zastąpić N-podstawioną glicyną odpowiadającą zastępowanemu aminokwasowi.
Określenie „mimetyk peptydu” lub „mimetyk” obejmuje także odwrotne D peptydy i enancjomery, jak zdefiniowano poniżej.
Określenie „odwrotny D peptyd” oznacza biologicznie aktywne białko lub peptyd składające się z D-aminokwasów uszeregowanych w odwrotnej kolejnoś ci w porównaniu z sekwencją L-aminokwasów peptydu NTP, pokrewnego białka lub pokrewnego peptydu. Zatem C-końcowa reszta L-aminokwasowego peptydu NTP, pokrewnego białka lub pokrewnego peptydu staje się N-końcową D-aminokwasowego peptydu itd. Przykładowo, peptyd NTP, SSWDY, staje się YdDdWdSdSd, gdzie Dd, Sd, Wd i Yd są D-aminokwasami odpowiadają cymi L-aminokwasom odpowiednio D, S, W i Y.
Określenie „enancjomer” oznacza biologicznie aktywne białko lub peptyd, w którym jedna lub większa liczba reszt L-aminokwasów w sekwencji aminokwasowej peptydu NTP, pokrewnego białka lub pokrewnego peptydu jest zastąpiona odpowiednią(mi) resztą(ami) D-aminokwasów.
PL 207 588 B1
Opisane aminokwasy i reszty aminokwasowe można określać według przyjętego jedno- lub trójliterowego kodu podanego w tabeli 3 poniżej.
T a b e l a 3
Aminokwas Symbol jednoliterowy Symbol trójliterowy
Alanina A Ala
Arginina R Arg
Asparagina N Asn
Kwas asparaginowy D Asp
Cysteina C Cys
Glutamina Q Gln
Kwas glutaminowy E Glu
Glicyna G Gly
Histydyna H His
Izoleucyna I Ile
Leucyna L Leu
Lizyna K Lys
Metionina M Met
Fenyloalanina F Phe
Prolina P Pro
Seryna S Ser
Treonina T Thr
Tryptofan W Trp
Tyrozyna Y Tyr
Walina V Val
Jak już opisano powyżej, wynalazek dotyczy środka zawierającego peptydy wywołujące śmierć komórki, określone powyżej. Korzystny peptyd śmierci komórki jest podobny lub homologiczny z peptydem NTP. Jednakże możliwe jest zastosowanie innych peptydów śmierci komórki opartych na częściach lub fragmentach pokrewnych białek. Przykładowo sekwencje peptydu AD7c-NTP i podobne warianty oraz homologi występują także w wielu różnych białkach pochodzących od ludzi i niepochodzących od ludzi („pokrewnych białkach”). W szczególności, gen AD7c-NTP zawiera sekwencje typu Alu, które są bardzo podobne do tych występujących także w innych genach ludzi oraz w genomach innych naczelnych.
Zatem uzasadnione jest założenie, że pewne, jeżeli nie wszystkie, pokrewne białka także okażą się skutecznymi środkami do wywoływania śmierci komórek, gdyż zawierają one sekwencje peptydowe homologiczne lub bardzo podobne do peptydów AD7c-NTP („pokrewnych peptydów”). Podobnie, fachowiec może zsyntetyzować specyficzne pokrewne peptydy na podsatwie sekwencji aminokwasowej dowolnego pokrewnego białka, odnośnie którego stwierdzono, że jest skutecznym środkiem do wywoływania śmierci komórek, oraz może je zbadać pod względem skuteczności jako środków do wywoływania śmierci komórek.
Inne sekwencje peptydowe pochodzące z pokrewnego białka, które uznano za skuteczny środek do wywoływania śmierci komórek, także mogą być skutecznymi środkami do wywoływania śmierci komórek. Fachowiec może zsyntetyzować bez zbędnych doświadczeń fragmenty skutecznego pokrewnego białka pokrywające całą sekwencję aminokwasową tego białka w celu zidentyfikowania innych skutecznych sekwencji peptydowych.
PL 207 588 B1
Niektóre pokrewne białka obejmują poniższe białka, co do których wiadomo, że zawierają aminokwasy identyczne, bardzo podobne lub homologiczne z sekwencjami peptydowymi NTP:
SEQ białka Sekwencje aminokwasowe białka
Identyfikacja ID NO.
Nr (PID) gl0121865 20 MEVSPLQPVNENMQVNKIKKNEDAKKRLSV
ERIYQKKTQL EHILLRPDTYIGSVELVTQQ MWVYDEDVGINYREVTFVPG Τ,ΥΚΤΡΠΓ,ΤΤν NAADNKQRDP KMSCIRVTID PENNLISIWN NGKGIPWEH KVEKMYVPALIFGQLLTSSN YDDDEKKVTG GRNGYGAKLC NIFSTKFTVE TASREYKKMF KQTWMDNMGR AGEMELKPFN GEDYTCITFQ PDLSKFKMQS LDKDIVALMV RRAYDIAGST KDVKVFLNGN KLPVKGFRSY VDMYLKDKLD ETGNSLKVIH EQVNHRWEVC LTMSEKGFQQISFVNSIATS KGGRHVDYVA DQIVTKLVDV VKKKNKGGVA VKAHQRELCN GAILAHCNLRLMGSSDSPAS ASRVAGIAGG CHHTQLIFVF LVETGFHHVG QAGLERLTSG DPPASASQSS GITDVKVKNH MWIFVNALIE NPTFDSQTKENMTLQPKSFG STCQLSEKFI KAAIGCGIVE SILNWVKFKA QVQLNKKCSA VKHNRIKGIP KLDDANDAGG RNSTECTLIL TEGDSAKTLA VSGLGWGRD KYGVFPLRGK ILNVREASHKQ
PL 207 588 B1 g!0257409
MTGDKGPQRL SGSSYGSISS PTSPTSPGPQ QAPPRETYLS EKIPIPDTKP GTFSLRKLWA FTGPGFLMSIAFLDPGNIES DLQAGAVAGF KLLWVLLWAT VLGLLCQRLA ARLGWTGKD LGEVCHLYYP KSESRSVAQS GVQWCDVSSL QPLPPRCPAP SSG gl0433567
MMLSVQENVH RCICKHYAPP TAPHLFFETE SHSVTQAGVQ WCDLGSLQPS PPGFKQFSCL SLSRSWDYRR VPLCLANFIV FLVETGFCRV GQAGLKLLTS SDLPASACQS AGDYRHEPLR LALTLCHFIS RTCTSYDFYICRDLERIPHG H gl0434441
MISAHRNLHL PGSSNSPASA FLSSWDYRHV PPCPANWFL VEMGFLHVGQ AGLELPTSDD PPTLASQSAGITGVSHRTWQ EFASLTVSQA VLRMLVWGPQ FENHCSKLLM ASEGDSSLVF FLYPLSNLN gl0436387
MQGSHSAVQA GVWWCHHDSL QPWPPGLRRS
SCLSLQSLWD YRSLALSLRL ACNGTTSAHC DLCLLSSSDS PASASQVAGITGEKTAEPHK AHAAQGERHL SSHMSPDENM TEKFCPGPRA SFHLRILAAS RHLYKRLLNE YTVTVLRDKS YLRNN g!0437485
MKNYYYFLGQ GLTLSPRLEC SSTISAHCNL HLLGSSNSPV AASPVAGTTG TCHHDWLIFV FLVETGFHHIGQTGLEFLTS GDPPTLASKS AGITGVSHCA WPTFLLNDMR HSFNKNLVII FYYPAIS g!0441986 gl0945428
MRRELLAGIL LRITFNFFLF FFLPFPLWF FIYFYFYFFL EMESHYVAQA GLELLGSSNP PASASLVAGT LSVHHCACFE SFTKRKKKLK KAFRFIQCLL LGLLKVRPLQ HQGVNSCDCE RGYFQGIFMQ AAPWEGT
MSKTLKKKKH WLSKVQECAV SWAGPPGDFG AEIRGGAERG EFPYLGRLRE EPGGGTCCIV SGKAPNPSDV LLEVNGTPVS GLTNRDTLAV IRHFREPIRL KTVKPGKVIN KDLRHYLSLQ FQKGSIDHKL QQVIRDNLYL RTIPCTIRAP RDGEVPGVDY NFISVEQFKA LEESGALLES GTYDGNFYGT PKPPAEPSPF QPDPVDQVLF DNEFDAESQR KRTTSVSKME RMDSSLPEEE EDEDKGAING SGNAENRERH SESSDWMKTY
PL 207 588 B1
PSYNQTNSSM DFRNYMMRDE TLEPLPKNWE MAYTDTGMIY FIDHNTKTTT WLDPRLCKKA KAPEDCEDGE LPYGWEKIED PQYGTYYVDF TLVAQAGVQW HDLGSLQPPP PGFNHLNQKT QFENPVEEAK RKKQLGQVEIGSSKPDMEKS HFTRDPSQLK GVLVRASLKK STMGFGFTII GGDRPDEFLQ VKNVLKDGPA AQDGKIAPGD VTVDINGNCV FGHTHADWQ MFQLVPVNQY VNLTLCRGYP LPDDSEDPW DIVAATPVIN GQSLTKGETC MNPQDFKPGA MVLEQNGKSG HTSTGDGLNG PSDASEQRVS MASSGSSQPE LVTIPLIKGP KGFGFAIADS PTGQKVKMIL DSQWCQGLQK EDHKEIYHQ NVQNLTHLQV VEVLKQFPVG ADVPLLILRG GPPSTTKTAK MKTDKKENAG SLEAINEPIP QPMPFPPSH RSGSPKLDPS EVYLKSKTLY EDKPPNTKDL DVFLRKQESG FGFRVLGGDG PDQSIYIGAI IPLGAAEKDG RLRAADELMCIDGIPVKGKS HKQVLDLMTT AARNGHVLLT VRRKIFYGEK QPEDDSSQAFISTQNGSPRL NRAEVPARPA PQEPYDWLQ RKENEGFGFVILTSKNKPPP GVIPHKIGRVIEGSPADRCG KLKYGDHISA VNGQSIVELS HANIVQLIKD AGVTVTLTVI AEEEHHGPPS GTNSARQSPA LQHRPMGQSQ ANHIPGDRSA LEGEIGKDVS TSYRHSWSDH KHLAQPDTAVIS WGSRHNQ NLGCYPVELE RGPRGFGFSL RGGKEYNMGL FILRLAEDGP AIKDGRIHVG DQIVEINGEP TQGITHTRAI ELIQAGGNKV LLLLRPGTGLIPDHGLAPSG LCSYVKPEQH gl 117849 28 MADDQGCIEE QGVEDSANED SVDAKPDRSS
FVPSLFSKKK KNVTMRSIKT TRDRVPTYQY NMNFEKLGKC UINNKNFDK VTGMGVRNGT DKDAEALFKC FRSLGFDVTV YNDCSCAKMQ DLLKKASEED HTNAACFACILLSHGEENME SCSVTQAGVQ RRDLGRLQPP PPRLAEGPSL MMASRPTRGP SMTQMLILDT RSQWKLTSSS PIPRFQAITR GGAQEEAPGL CKPSAPSWRS TEKTWKSCRS SPG gl 1493409 29 MGLSIASHFG LLIKK.VERNI LFFFRRSLAL
CQAGVQWRYL SQLTAASASW VQAILCLSLP SSWDYRHMPP RPANFCILSR DGISPCWPGW SRSLDLYIRP PRPPKVLRLQ A
PL 207 588 B1 gl1493483 gl2654881 gl2803929
MQIIFFFLFL RWSFTLVAQA GVQWRDLSSP QPPPPRFKRF SCLSPPSSWD YRHAPPHPAN FVFLVETGFL RVGQAGLELL TSGDPPASAS QSAGITGVSH HTQPDANNFL RKLFQKLF
MGHPRAIQPS VFFSPYDVHF LLYPIRCPYL KIGRFHIKLK GLHFLFSFLF FFFETQSHSV TRLECSGTIS AHCNLCLPGS SNSPASASQV AGTTGTCHHA QLIFVFLAEM GFHHIGQDGL DLNLVIHPPR SPKALGLQA
MPNHYSFCFC FCFCFRRSLA LSPRLECSGA ILAHGKLHLP GSRHSPASAS PVAGTKGARH HARLIFLYF g!3359183 gl 3375624
LFTNSPFSLL SPAQWLCFGT HLGHVQSVSH LQWEGSVQES LRSVRNSRCA LPMLSAPCSL SLHFLLFSLS PFFFFEIRVL LYRQAGVQWC YLGSLQPLPP GFKQFSCLSY PSSWDYRRPP PRQANFCIFS TDGVSPCWPR WSLSLDLMIR PPQPPEVLGL QV
MGRLVLLWGAAVFLLGGWMALGQGGAEGVQ IQIIYFNLET VQVTWNASKY SRINLTFHYR FNGDEAYDQC TNYLLQEGHT SGCLLDAEQR DDILYFSIRN GTHPYFTASR WMVYYLKPSS PKHVRFSWHQ DAVTVTCSDL SYGDLLYEVQ YRSPFDTEWQ TQSRSVTQAG VQWCDLCLLQ PSPPRFKRFS CLSLPSSWDY RHPPPRLANF CUSRDGYSP CWPGWSRTCD LR gl3375628
MEFLKVARRNKREQLEQIQKELSVLEEDIK RVEEMSGLYS PVSEDSTVPQ FEAPSPSHSS IIDSTEYSQP PGFSGSSQAG VQWRYLGSLQ PPPPRYKRFS CLTLPSSWDY RRLPPHLTKK QPWYNSTLAS RRKRLTAHFE DLEQCYFSTR MSRISDDSRT ASQLDEFQEC LSKFTRYNSV RPLATLSYAS DLYNGSSIVS SIEFDRDCDY FAIAGVTKKIKVYEYDTVIQ DAVDIHYPEN EMTCNSKISCISWSSYHKNL LASSDYEGTV ILWDGFTGQR SKVYQEHEKR CWSYDFNLMD PKLLASGSDD AKYKLWSTNL DNSVASIEAK ANVCCVKFSP SSRYHLAFGC ADHCYHYYDL RNTKQPIMVF KGHRKAVSYA KFVSGEEIVS ASTDSQLKLW NVGKPYCLRS FKGHINEKNF VGLASNGDYIACGSENNSLY LYYKGLSKTL LTFKFDTYKS YLDKDRKEDD TNEFYSAYCW
PL 207 588 B1 g!3376550 g!3430856 g!3431835 g!3435153 g!3489079
RALPDGESNV LIAANSQGTIKVLELV
MGSYFVARAG CKLLGLKGTS HFSLPKCRNC RREPLPGLFF LFFVFFFLRR SLALSPRLEC SGAIVAHCKL GLPGSLHSPA SASQVAGTIG TCHNTRIIFCILVETGFHRV SQDGVDLLTL
MDCGSVGGQR TQRLPGRQRL LFLPVGLSGR PGGSETSARR CPSALSDGLG ALRPRAPAAR GGVSRASPLL LLLLVPSPRL AAAAPRRQLG DWERSRLGYA APPAGRSGAW RCSPGVAAAA GALPQYHGPA PALVSCRREL SLSAGSLQLE RKRRDFTSSG SRKLYFDTHA LVCLLEDNES HSFIQAGVQW HSLGLLQPPP PGFKRSSHLI LLSSWDYRHA PPHLDNFSVF LLETGFHHVG QAGLKLLTSS DPPTLAS
MSPATTGTFL LTVYSIFSKV HSDRNVYPSA GVLFVHVLER EYFKGEFPPY PKPGEISNDP ITFNTNLMGY PDRPGWLRYIQRTPYSDGVL YGSPTAENVG KPTIIEITAY NRRTFETARH NLIINIMSAE DFPLPYQAEF FIKNMNVEEM LASEVLGDFL GAVKNVWQPE RLNAINITSA LDRGGRVPLPINDLKEGVYV MVGADVPFSS CLREVENPQN QLRCSQEMEP VITCDKKFRT QFYIDWCKIS LVDKTKQVST YQEVIRGEGI LPDGGEYKPP SDSLKSRDYY TDFLIILAVP SAVALVLFLILAYIMCCRRE GVEKRNMQTP DIQLVHHSAI QKSTKELRDM SKNREIAWPL STLPVFHPVT GEHPPLHTD NYDSTNMPLM QTQQWSFAPV AQAGVQWRDL GSLQPPPPRN LPHQTQIPQQ QTTGKWYP
MLGLRKAAAI SLLLRNVGLQ LATLLMSQKK LGFCGNFLFL NLAHQTKIS SSFFFFLRQS LTLSPRLECN GAISAHCHLR LPDSSNSPAS ASQVTGITGS HHHAWLIFVF LVETGFCHVG QDGLELLTSG DPPASASQSA GITGMSHHTW PTDLFFKTVL PARLGLWDSS V
MHAVPRGFGK KVRVGVQSCP SPFSGQACPQ PSSVFWSLLKNLPFLEHLELIGSNFSSAMP RNEPAIRNSL PPCSRAQSVG DSEVAAIGQL AFLRHLTLAQ LPSVLTGSGL VNIGPQCQQL RSLSLANLGM MGKWYMPAL SDMLKHCKRL RDLRLEQPYF SANAQFFQAL SQCPSLQRLC LVSRSGTLQP DAYLAFMARC LQWMCHLFT
PL 207 588 B1 gl3489081 gl 3540498 gl3543287 g!3569856 g!3591868
GESLATCKSL QQSLLRRWGE VTGRRPQLFT ELREEPSART SRATGRRQPC LPDSGWCCP CGRPLAVSGIILVGVSPSLV VKTTCVYRVL FKNLDYASIF FLVCLFETES HSWQAGVQW RDLSSLQPLL SGLQPQPPEQ LENELEIGFS YCFVI
MEEDEFIGEKIFQRYCAEFIKHSQQIGDSW EWRPSKDCSD GYMCKIHFQIKNGSVMSHLG ASTHGQTCLP MEVKSCSVTQ AGVQLRDLSS LQPPPSGFKQ FSCLSLPSNW DYRGSPLHLA NFLYF
MTTCEFEFIF LKEQVTRICNIAPLKAYFSV HKMGKILKKL SNFSFLTHRQ SLTLSPRLEC SGAISAHCNL HLLGSSNSAA SASRVAGTTG ACHHAQLIFV FLVETGFHHV GQDGLGLLTS
MSCNPSFGGI GKGHLMREVD ALDGLCSRIC DQSGVHYKVL NRRKGPAVWG LRAQIDRKLY KQNMQKEILN TPLLTVQEGA VEDLILTEPE PEHTGKCRVS GWLVDGSTV YAESVILTTG TFLRGMTVIG LETHPAGRLG DQPSIGLAQT LEKLGF WGR LKTGTPPRIA KESINFSILN KHIPDNPSIP FSFTNETVWIKPEDQLPCYL THTNPRVDEIVLKNLHLNSH VKETTRGPRY CPSIESKVLR FPNRLHQVWL EPEGMDSDLI YPQGLSMTLP AELQEKMITCIRGLEKAKVI QPDGVLLLLP RMECNGAISA HHNLPLPGYG VQYDYLDPRQITPSLETHLV QRLFFAGQIN GTTGYEEAAA QGVIAGINAS LRVSRKPPFV VSRTEGYIGV LIDDLTTLGT SEPYRMFTSR VEFRLSLRPD NADSRLTLRG YKDAGCVSQQ RYERACWMKS SLEEGISVLK SIEFLSSKWK KLIPEASIST SRSLPVRALD VLKYEEVDMD SLAKAVPEPL KKYTKCRELA ERLKIEATYE SVLFHQLQEIKGVQQDEALQ LPKDLDYLTI RDVSLSHEVR EKLHFSRPQTIGAASRIPGV TPAAIINLLR FVKTTQRRQS AMNESSKTDQ YLCD ADRLQE REL
MPFLYDISSC WTSFCFLFFS PLDGVLLCFP GWNAVARSQL TATSASQVQAILLVSASGVA GIIGTCHHAQ PIFVFLVEMG FHHVGQACLK LLNSGDPPAS ASQSAGITGM SHHARPFFFF FSF
MSEAENEFIN WVATAAIEAN CSQCWLCVEL PEAAGNGLPW RIVPANISEWICQYQWEWDN TWFCFDFLSQ SYSLSPRLEC SGTILAQCNL
PL 207 588 B1
CLLGSSDSPA SASQVAGHG ACRHAWLIFC IFSRDGYSPY CPG gl3591870 gl362993 gl3631907
MALFLDKMGS LQKGNYSSQS GMEPGSWQHK MKLQLILKSS KAYWLSDAA MSLQKYGRAL RYIKLALQSH DTYCCLCTNM LSEVLLFLSQ YLTLCGDIQL MLAQNANNRA AHLEEFHYQT KEDQEILHSL HRESSCQGVP QAWTTWFTVG LCSLAHAYLSIQKRGRNIRV LIFALYLFIY FLRRSFALVA QAGVQWCNLG SLKPPPPGFK QFSCLSLPSS WNYRHAPPCP ASPPWPPKVL GLQV
RSLTLWPSLE YSGTISAHCN LRLPGSSDSR ASASRAAGIT GVSHCARPCM LFDPEFDLLA GVQLLPFEPP TGKALSRKD
MEFRKLRGME TRPPANTARL QPPRDLRSSS PRKQLSESSD DDYDDVDIPT PAEDTPPPLP PKPKFRSPSD EGPGSMGDDG QLSPGVLVRC ASGPPPNSPR PGPPPSTSSP HLTAHSEPSL WNPPSRELDK PPLLPPKKEK MKRKGCALLV KLFNGCPLRIHSTAAWTHPS TKDQHLLLGA EEGIFILNRN DQEATLEMLF PSRTTWVYSI NNVLMSLSGK TPHLYSHSIL GLLERKEIRA GNPIAHISPH RLLARKNMVS TKIQDTKGCR ACCVAEGASS GGPFLCGALE TSWLLQWYQ PMNKFLLVRQ VLFPLPTPLS VFALLTGPGS ELPAVCIGVS PGRPGKSVLF HTVRFGALSC WLGEMSTEHR GPVQVTQVEE DMVMVLMDGS VKLYTPEGSP VRGLRTPEIP MTEAVEAVAM VGGQLQAFWK HGVQVWALGS DQLLQELRDP TLTFRLLGSP RLECSGTISP HCNLLLPGSS NSPASASRYA GITGL g!3644612 g!3646055
MSMVLGGPFS KGHTASDEYF QIFHNISFFE TESCSYAQAG VQWCNLGSLQ ALPPRFTPFS CLSLPSSWDY RHPPPCPDNV FVFSVETGLH CVSQDGLNLL TL
MDCGSVGGQR TQRLPGRQRL LFLPVGLSGR PGGSETSARR CLSALSDGLG ALRPRAPAAR GGVSRASPLL LLLLVPSPRL AAAAPRRQLG DWERSRLGYA APPAGRSSAW RCSPGVAAAA GALPQYHGPAPALVSCRREL SLSAGSLQLE RKRRDFTSSG SRKLYFDTHA LVCLLEDNES HSFIQAGVQW HSLGLLQPPP PGFKRSSHLI LLSSWDYRHA PPHLDNFSYF LLETGFHHYG
PL 207 588 B1 gl3646423 g!3648611 gl3651342 gl3652010 gl3653409
QAGLKLLTSS DPPTLAS
MNFFFKTEFL SVTQAGMQWH NFSSLQPLPP GFKQFSCLSL LSSWDYRHTP PCPANFCIFS RGGVSPCWSG WSRTPDFMIH PPRPPKVLRL QK
MPLAAYCYLR WGKGS YGEV TLVKHRRDGK QYVIKKLNLR NASSRERRAA EQEAQLLSQL ΚΗΡΝίνΊΎΚΕ SWEGGDGLLYIVMGFCEGGD LYRKLKEQKG QLLPENQWE WFVQIAMALQ YLHEKHILHR DLKTQNVFLT RTNHKVGDL GIARVLENHC DMASTLIGTP YYMSPELFSN KPYNYKSDVW ALGCCVYEMA TLKHAFNAKD MNSLVYRIIE GKLPPMPRDY SPELAELIRT MLSKRPEERP SVRSILRQPYIKRQISFFLE ATKIKTSKNNIKNGDSQSKP FATWSGEAE SNHEVIHPQP LSSEGSQTYIMGEGKCLSQE KPRASGLLKS PASLKAHTCK QDLSNTTELA TISSVNIDIL PAKGRDSVSD GFVQENQPRY LDASNELGGICSISQVEEEM LQDNTKSSAQ PENLIPMWSS DIVTGEKNEP VKPLQPLIKE QKPKDQSLAL SPKLECSGTILAHSNLRLLG SSDSPASASR VAGITGVCHH AQDQVAGECI IEKQGRIHPD LQPHNSGSEP SLSRQRRQKR REQTEHRGEK RQVRRDLFAF QESPPRFLPS HPIVGKVDVT STQKEAENQRRWTGSVSSS RSSEMSSSKD RPLSARERRR LKQSQEEMSS SGPSVRKASL SVAGPGKPQE EDQPLPARRL SSDCSVTQERKQIHCLSEDE LSSSTSSTDK SDGDYGEGKG QTNEINALVQ LMTQTLKLDS KESCEDVPVA NPVSEFKLHR KYRDTLILHG KVAEEAEEIH FKELPSAIMP GSEKIRRLVE VLRTDVIRGL GVQLLEQVYD LLEEEDEFDR EVRLREHMGE KYTTYSVKAR QLKFFEENMN F
MFISFGRLIF SFFLTWSLSL SPRLECSGTI LAHCNPTSQV QAILPASASR VAGITGMHHH TCLIFYLLYK MGFCHYGHAG LELYT
MESGQPSLSF YFLFIYFFEIGSHFVTQAGV
QWHNLDSLQL SLASAPQVAG TTGACHHARL IFGYFCRDWY LPC
MLLVDADQPE PMRSGARELA LFLTPEPGAE AKEVEETIEG MLLRLEEFCS LADLIRSDTS QILEENIPVL KAKLTEMRGIYAKYDRLEAF YKMYGHHYAF LEADVLQAER DHGAFPQALR
PL 207 588 B1
RWLGSAGLPS FRNYECSGTIPARCNLRLPG SSDSPASASQ VAGIPEVTCT GARDVRAAHT V gl3699916 56 MSRGNENRLT HRRQTVLREK GRRLANRGPA
YMFNDHSTSL SIEEERFLD A AEYGNIPWR KMLEECLSLN VNCVDYMGQN ALQLAVANEH LEITELLLKK ENLSRVGDAL LLAISKGYVR IVEAILNHPA FAEGKRLATS PSQSELQQDD F YAYDEDGTR FSHDVTPIIL AAHCQEYEIV HTLLRKGARIERPHDYFCKC TECSQKQKHD SFSHSRSRIN AYKGLASPAY LSLSSEDPVM TALELSNELA YLANIEKEFK NDYRKLSMQC KDFWGLLDL CRNTEEVEAILNGDAETRQP GDLARPNLSR LKLAIKYEYK KFVAHPNCQQ QLLSIWYENL SGLRQQTMAV KFLWLAVAI GLPFLALIYW CAPCSKMGKILRGPFMKFVA HAASFTIFLG LLYMNAADRF EGTKLLPNET STDNARQLFR MKTSCFSWME MLIIS WVIGM IWAECKEIWT QGPKEYLFEL WNMLDFGMLA EFAASFIARF MAFWHASKAQ SUDANDTLK DLTKVTLGDN YKYYNLARIK WDPTDPQHS EGLYAIAWL SFSRIAYILP ANESFGPLQI SLGRTYKDIF KFMVIFIMVF VAFMIGMFNL YSYYIGAKQN EAFTTYEESF KTLFWAIFGL SEVKS WINY NHKFIENIGY VLYGVYNVTM VIVLLNMLIA MINSSFQEIE DDADVEWKFA RAKLWFSYFE EGRTLPVPFN LVPSPKSLLY LLLKFKKWMS ELIQGHKKGF QEDAEMNKRN EEKKFGILGS HEDLSKFSLD RNQLAHNKQS STRSSEDFHL NSFSNPPRQY QKIMKRLIKR YVLQAQIDKE SDEVNEGELK EIKQDISSLR YELLEEKSQN TEDLAELIRK LGERLSLESK QEESRR gl3702149 57 MSRGNENRLT HRRQTVLREK GRRLANRGPA
YMFNDHSTSL SIEEERFLD A AEYGNIPWR KMLEECLSLN VNCVDYMGQN ALQLAVANEH LEITELLLKK ENLSRVGDAL LLAISKGYVR IYEAILNHPA FAEGKRLATS PSQSELQQDD FYAYDEDGTR FSHDVTPIIL AAHCQEYEIV HTLLRKGARI ERPHDYFCKC TECSQKQKHD SFSHSRSRIN AYKGLASPAY LSLSSEDPVM TALELSNELA VLANEEKEFK NDYRKLSMQC KDFWGLLDL CRNTEEYEAILNGDAETRQP GDLARPNLSR LKLAIKYEVK KFVAHPNCQQ QLLSIWYENL SGLRQQTMAV KFLWLAVAI GLPFLALIYW CAPCSKMGKI LRGPFMKFVA HAASFTIFLG LLYMNAADRF EGTKLLPNET
PL 207 588 B1 gl4043238 gl4192931 gl4198309 g!4249973 g!6226025
STDNARQLFR MKTSCFSWME MLIIS WVIGM IWAECKEIWT QGPKEYLFEL WNMLDFGMLA IFAASFIARF MAFWHASKAQ SHDANDTLK DLTKVTLGDN VKYYNLARIK WDPTDPQHS EGLYAIAWL SFSRIAYILP ANESFGPLQI SLGRTYKDIF KFMVIFIMVF VAFMIGMFNL YSYYIGAKQN EAFTTVEESF KTLFWAIFGL SEVRS WINY NHKFIENIGY VLYGVYNVTM VTVLLNMLIA MINSSFQEIE RNEEKKFGIL GSHEDLSKFS LDRNQLAHNK QSSTRSSEDF HLNSFSNPPR QYQKIMKRLIKRYYLQAQID KESDEVNEGE LKEIKQDISS LRYELLEEKS QNTEDLAELIRRLGERLSLE SKQEESRR
MESRSVAQAG VQWPDLGSLQ PLPPRFKRFF CLSLQSSWDY RHAPPRPANF VFLVETGFCH VSQAGLELLT SSDPPPRPPK VLR
MISVHCNLCL PGSSDPPASA SQVAGITGVR HCMASGAVLN KVRRHQCSGD LEVRGSHGSL GEAPWGKSVP GRGTASRKGP GAGVIGNSKE ASTGRAQWSA PVIPATQEAK AGGLLEPRSL ISAWATYQDLISINKLKEKR G
MTRSLFKGNF WSADILSTIG YDNIIQHLNN GRKNCKEFED FLKERAAIEE RYGKDLLNLS RKKPCGQSEINTLKRALEYF KQQVDNVAQC HIQLAQSLRE EARKMEEFRE KQKLQRKKME SHSVTQAGAQ WHDLGSLQAL PPGFMPFSCL SLPSSWNYRL PPPPRLAEPR NQDHGVA
MESHSVTQAG VQWRDLGSLQ PLPPGFKQFS HLSLPSSWDY RRYPPYLGNF CIFSGEGYSP CWPGWS
MGSLSTANVE FCLDVFKELN SNNIGDNIFF SSLSLLYALS MYLLGARGET AEQLEKVLHF SHIYDSLKPG FKDSPKCSQA GRIHSEFGVE FSQINQPDSN CTLSIANRLY GTKTMAFHQQ YLSCSEKWYQ ARLQTVDFEQ STEETRKTIN AWVENKTNGK VANLFGKSTIDPSSVMVLVN TTYFKGQRQN KFQVRETVKS PFQLSEGKNV TVEMMYQIGT FKLAFVKEPQ MQVLELPYVN NKLSMHLLP VGIANLKQIE KQLNSGTFHE WTSSSNMMER EVEVHLPRFK LEIKYELNSL LKPLGVTDLF NQVKADLSGM SPTKGLYLSK AIHKSYLDYS EEGTEAAAAT GDSIAYKSLP
PL 207 588 B1
MRAQFKANHP FLFFIRHTHT NTILFCGKLA SP gl6517174 63 MAQFYYKRNV NAPYRDRIPL RTYRAESELS
PSEKAYLNAV EKGDYASYKK SLEEAEIYFK ININCIDPLG RTALLIAIEN ENLELIELLL SFNVYVGDAL LHAIRKEWG AVELLLNHKK PSGEKQVPPILLDKQFSEFT PDITPIILAA HTNNYEIIKL LVQKGVSVPR PHEVRCNCVE CVSSSDVDSL RHSRSRLNIY KALASPSLIA LSSEDPFLTA FQLSWELQEL SKYENEFKSE YEELSRQCKQ FAKDLLDQTR SSRELEIILN YRDDNSLIEE QSGNDLARLK LAIKYRQKEF VAQPNCQQLL ASRWYDEFPG WRRRHWAVKM VTCFIIGLLF PVFSVCYLIA PKSPLGLFIR KPFIKFICHT ASYLTFLFLL LLASQHEDRS DLNRQGPPPT IVEWMILPWV LGFIWGEIKQ MWDGGLQDYI HDWWNLMDFV MNSLYLATIS LKIYAFYKYS ALNPRESWDM WHPTLVAEAL FAIANIFSSL RLISLFTANS HLGPLQISLG RMLLDILKFL FIYCLVLLAF ANGLNQLYFY YEETKGLTCK GIRCEKQNNA FSTLFETLQS LFWSIFGLIN LYVTNVKAQH EFTEFVGATM FGTYNYISLV YLLNMLIAMM NNS YQLIADH ADIE WKF ART KLWMSYFEEG GTLPTPFNVIPSPKSLWYLI KWIWTHLCKK KMRRKPESFG TIGVRTQHRR AADNLRRHHQ YQEYMRNLVK RYYAAMERDA KTEEGLTEEN FKELKQDISS FRFEYLGLLR GSKLSTIQSA NASKESSNSA DSDEKSDSEG NSKDKKKNFS LFDLTTLIHP RSAAIASERH NISNGSAL W QEPPREKQRK VNFVTDIKNF GLFHRRSKQN AAEQNANQIF SVSEEVARQQ AAGPLERNIQ LESRGLASRG DLSIPGLSEQ CVLVDHRERN TDTLGLQVGK RVCPFKSEKV WEDTVPHP KEKHAKEEDS SIDYDLNLPD TVTHEDYVTTRL gl6517176 64 MAQFYYKRNY NAPYRDRIPL RIYRAESELS
PSEKAYLNAV EKGDYASYKK SLEEAEIYFK ININCIDPLG RTALLIAIEN ENLELIELLL SFNVYVGDAL LHAIRKEWG AVELLLNHKK PSGEKQVPPILLDKQFSEFT PDITPIILAA HTNNYEIIKL LVQKGVSVPR PHEVRCNCVE CVSSSDVDSL RHSRSRLNIY KALASPSLIA LSSEDPFLTA FQLSWELQEL SKVENEFKSE YEELSRQCKQ FAKDLLDQTR SSRELEIILN YRDDNSLIEE QSGNDLARLK LAJKYRQKEA
PL 207 588 B1 g!6758330 g!710216 g!7978303
S YGEKLNRCG MADFRTTSMIGGI
MSQSPGFVTRRGGSPKAAPGAGARRNESQD YLLMDELGDD GYPQLQQPPY GYYPSFRGNE NRLTHRRQTV LREKGRRLAN RGPAYMFNDH STSLSIEEER FLDAAEYGNIPWRKMLEEC LSLNVNCVDY MGQNALQLAV ANEHLEITEL LLKKENLSRV GDALLLAISK GYVRIVEAIL NHPAFAEGKR LATSPSQSEL QQDDFYAYDE DGTRFSHDVT PHLAAHCQE YEIVHTLLRK GARIERPHDY FCKCTECSQK QKHDSFSHSR SRINAYKGLA SPAYLSLSSE DPVMTALELS NELAVLANIE KEFKNDYRKL SMQCKDFWG LLDLCRNTEE VEAILNGDAE TRQPGDLARP NLSRLKLAIK YEVKKFVAHP NCQQQLLSIW YENLSGLRQQ TMAVKFLWL AVAIGLPFLA LIYWCAPCSK MGKILRGPFM KFVAHAASFT IFLGLLVMNA ADRFEGTKLL PNETSTDNAR QLFRMKTSCF SWMEMLIIS W VIGMIWAECK EIWTQGPKEY LFELWNMLDF GMLAIFAASF IARFMAFWHA SKAQSIIDAN DTLKDLTKVT LGDNVKYYNL ARIKWDPTDP QIISEGLYAI AWLSFSRIA YILPANESFG PLQISLGRTV KDIFKFMVIFIMVFVAFMIG MFNLYSYYIG AKQNEAFTTV EESFKTLFWA EFGLSEVKSV VINYNHKFIE NIGYVLYGVY NVTMVTVLLN MLIAMINSSF QEIEDDADVE WKFARAKLWF SYFEEGRTLP VPFNLVPSPK SLLYLLLKFK KWMSELIQGH KKGFQEDAEM NKRNEEKKFG ILGSHEDLSK FSLDRNQLAH NKQSSTRSSE DFHLNSFSNP PRQYQKIMKR LKRYVLQAQ IDKESDEVNE GELKEIKQDISSLRYELLEE KSQNTEDLAE LIRKLGERLS LESKQEESRR
MGHPRAIQPS VFFSPYDVHF LLYPIRCPYL KIGRFHIKLK GLHFLFSFLF FFFETQSHSV TRLECSGTIS AHCNLCLPGS SNSPASASRV AGTAGTCRRA QLIFVFLAEM GFHHVGRDGL DLNLVIHPPR SPKALGLQA
MGSLSTANVE FCLDVFKELN SNNIGDNIFF SSLSLLYALS MVLLGARGET AEQLEKVLHF SHTVDSLKPG FKDSPKCSQA GRIHSEFGVE FSQINQPDSN CTLSIANRLY GTKTMAFHQQ YLSCSEKWYQ ARLQTVDFEQ STEETRKMIN AWVENKTNGK VANLFGKSTI DPSSVMVLVN TIYFKGQRQN KFQVRETVKS PFQLSEGKNV
PL 207 588 B1
TVEMMYQIGT FKLAFVKEPQ MQVLELPYVN NKLSMIILLP VGIANLKQIE KQLNSGTFHE WTSSSNMMER EVEVHLPRFK LEIKYELNSL LKPLGVTDLFNQVKADLSGM SPTKGLYLSK AIHKSYLDVS EEGTEAAAAT GDSIAVKSLP MRAQFKANHP FLFFIRHTHT NTILFCGKLA SP gl8376629 68 MLRNSTFKNM QRRHTTLREK GRRQ AIRGPA
YMFNEKGTSL TPEEERFLDS AEYGNIPWR KMLEESKTLN FNCVDYMGQN ALQLAVGNEH LEVIELLLKK ENLARVGDAL PLAISKGYYR IVEAILNHPA FAQGQRLTLS PLEQEŁRDDD FYAYDEDGTR FSHDITPIIL AAHCQEYEIV HILLLKGARIERPHDYFCKC NECTEKQRKD SFSHSRSRMN AYKGLASAAY LSLSSEDPVL TALELSNELA RLANIETEFK NDYRKLSMQC KDFVVGVLDL CRDTEEVEAILNGDVNFQVW SDHHRPSLSRIKLAIKYEVK KFVAHPNCQQ QLLTMWYENL SGLRQQSIAV KFLAVFGVSI GLPFLAIAYWIAPCSKLGRT LRSPFMKFVA HAYSFTIFLG LLWNASDRF EGVKTLPNET FTDYPKQIFR VKTTQFSWTE MLIMKWYLGM IWSECKEIWE EGPREYVLHL WNLLDFGMLS IFVASFTARF MAFLKATEAQ LYVDQHVQDD TLHNVSLPPE VAYFTYARDK WWPSDPQIIS EGLYAIAWL SFSRIAYILP ANESFGPLQI SLGRTVKDIF KFMVIFIMVF VAFMIGMFNL YSYYRGAKYN PAFTTYEESF KTLFWSIFGL SEVISWLKY DHKFIENIGY VLYGVYNVTM VWLLNMLIA MINNSYQEIE EDADVEWKFA RAKLWLSYFD EGRTLPAPFN LVPSPKSFYY LIMRIKMCLIKLCKSKAKSC ENDLEMGMLN SKFKKTRYQA GMRNSENLTA NNTLSKPTRY QKIMKRLIKR YVLKAQVDRE NDEYNEGELK EIKQDISSLR YELLEEKSQA TGELADLIQQ LSEKFGKNLN KDHLRVNKGK DI gl 843388 69 MKVRLLRQLS AAAKVKAPSG LQGPPQAHQF
ISLLLEEYGA LCQAARSIST FLGTLENEHL KKFQVTWELHNKHLFENLVF SEPLLQSNLP ALVSQIRLGT TTHDTCSEDT YSTLLQRYQR SEEELRRYAE EWLECQKRID AYVDEQMTMK TKQRMLTEDW ELFKQRRFIE EQLTNKKAVT GENNFTDTMR HVLSSRLSMP DCPNCNYRRR CACDDCSLSHILTCGIMDPP VIDDIHIHQL PLQVDPAPDYLAERSPPSVS SASSGSGSSS PITIQQHPRLILTDSGSAPT FCSDDEDYAP
PL 207 588 B1
LSAKFADIYP LSNYDDTEW ANMNGIHSEL NGGGENMALKDESPQISSTS SSSSEADDEE ADGESSGEPP GAPKEDGVLG SRSPRTEESK ADSPPPSYPT QQAEQAPNTC ECHVCKQEAS GLTPSAMTAG ALPPGHQFLS PEKPTHPALH LYPHIHGHVP LHTVPHLPRP LIHPTLYATP PFTHSKALPP APVQNHTNKH QVFNASLQDH IYPSCFGNTP EWNSSKFISL WGSEVMNDKN WNPGTFLPDTISGSEILGPT LSETRPEALP PPSSNETPAV SDSKEKKNAA KKKCLYNFQD AFMEANKWM ATSSATSSVS CTATTVQSSN SQFRVSSKRP PSVGDVFHGISKEDHRHSAP AAPRNSPTGL APLPALSPAA LSPAALSPAS TPHLANLAAP SFPKTATTTP GFVDTRKSFC PAPLPPATDG SISAPPSVCS DPDCEGHRCE NGVYDPQQDD GDESADEDSC SEHSSSTSTS TNQKEGKYCD CCYCEFFGHG GPPAAPTSRN YAEMREKLRL RLTKRKEEQP KKMDQISERE SWDHRRVED LLQFTNSSET KPVSSTRAAK RARHKQRKLE EKARLEAEAR AREHLHLQEE QRRREEEEDE EEEEDRFKEE FQRLQELQKL RAVKKKKKER PSKDCPKLDM LTRNFQAATE SVPNSGNIHN GSLEQTEEPE TSSHSPSRHM NHSEPRPGLG ADGDAADPVD TRDSKFLLPK EVNGKQHEPL SFFFDEMQHH KEGNGKQKLR QTSKASSEPA RRPTEPPKAT EGQSKPRAQT ESKAKWDLM SITEQKREER KVNSNNNNKK QLNHIKDEKS NPTPMEPTSP GEHQQNSKLV LAESPQPKGKNKKNKKKKGD RVNNSIDGVS LLLPSLGYNG AILAHCNLRL PGSSDCAASA SQWGITDDV FLPKDIDLDS VDMDETEREV EYFKRFCLDS ARQTRQRLSINWSNFSLKKA TFAAH g20140144 70 MGSLSTANVE FCLDVFKELN SNNIGDNIFF
SSLSLLYALS MVLLGARGET AEQLEKVLHF SHTVDSLKPG FKDSPKCSQA GRIHSEFGVE FSQINQPDSN CTLSIANRLY GTKTMAFHQQ YLSCSEKWYQ ARLQTVDFEQ STEETRKMIN AWVENKTNGK VANLFGKSTIDPSSVMVLVN IIYFKGQRQN KFQVRETVKS PFQLSEGKNV TVEMMYQIGT FKLAFVKEPQ MQVLELPYVN NKLSMnLLP VGIANLKQIE KQLNSGTFHE WTSSSNMMER EVEVHLPRFK LEIKYELNSL LKPLGVTDLFNQVKADLSGM SPTKGLYLSK AIHKSYLDVS EEGTEAAAAT GDSIAVKSLP MRAQFKANHP FLFFIRHTHT NTDLFCGKLA SP
PL 207 588 B1 g20476660 71 MMAALYPSTD LSGASSSSLP SSPSSSSPNE
VMALKDVREV KEENTLNEKL FLLACDKGDY YMVKKILEEN SSGDLNINCV DVLGRNAVTI TIENENLDIL QLLLDYGCQS ADALLVAIDS EWGAVDILL NHRPKRSSRP TIVKLMERIQ NPEYSTTMDV APVILAAHRN NYEILTMLLK QDVSLPKPHA VGCECTLCSA KNKKDSLRHS RFRLDIYRCL ASPALIMLTE EDPILRAFEL SADLKELSLV EVEFRNDYEE LARQCKMFAK DLLAQARNSRELEVILNHTS SDEPLDKRGL LEERMNLSRL KLAIKYNQKE FVSQSNCQQF LNTVWFGQMS GYRRKPTCKKIMTVLTVGIF WPVLSLCYLIAPKSQFGRIIHTPFMKFIIH GASYFTFLLL LNLYSLVYNE DKKNTMGPAL ERIDYLLILWIIGMIWSDIK RLWYEGLEDF LEESRNQLSF VMNSLYLATF ALKWAHNKF HDFADRKDWD AFHPTLVAEG LFAFANVLSY LRLFFMYTTS SILGPLQISM GQMLQDFGKF LGMFLLVLFS FTIGLTQLYD KGYTSKEQKD CVGIFCEQQS NDTFHSFIGT CFALFWYIFS LAHVAIFVTR FSYGEELQSF VGAVTVGTYN WWIVLTKL LVAMLHKSFQ LIANHEDKEW KFARAKLWLS YFDDKCTLPP PFNUPSPKT ICYMISSLSK WICSHTSKGK VKRQNSLKEW RNLKQKRDEN YQKVMCCLVH RYLTSMRQKM QSTDQATVEN LNELRQDLSK FRNEIRDLLG FRTSKYAMFY PRN g20546044 72 MAQFYYKRNV NAPYRDRIPL RIVRAESELS
PSEKAYLNAV EKGDYASVKK SLEEAEIYFK ININCIDPLG RTALLIAIEN ENLELIELLL SFNVYVGDAL LHAIRKEWG AVELLLNHKK PSGEKQVPPILLDKQFSEFT PDITPULAA HTNNYEIIKL LVQKGVSVPR PHEVRCNCVE CVSSSDVDSL RHSRSRLNIY KALASPSLIA LSSEDPFLTA FQLSWELQEL SKVENEFKSE YEELSRQCKQ FAKDLLDQTR SSRELEIILN YRDDNSLIEE QSGNDLARLK LAIKYRQKEF VAQPNCQQLL ASRWYDEFPG WRRRHWAVKM VTCFIIGLLF PVFSVCYLIA PKSPLGLFIR KPFIKFICHT ASYLTFLFLL LLASQHIDRS DLNRQGPPPT IVEWMILPWV LGFIWGEIKQ MWDGGLQDYI HDWWNLMDFV MNSLYLATIS LKTVAFVKYS ALNPRESWDM WHPTLVAEAL FAIANIFSSL RLISLFTANS HLGPLQISLG RMLLDILKFL FIYCLYLLAF ANGLNQLYF Y YEETKGLTCK
PL 207 588 B1
GIRCEKQNNA FSTLFETLQS LFWSIFGLIN LYVTNVKAQH EFTEFVGATM FGTYNVISLV VLLNMLIAMM NNS YQLIADH ADIEWKFART KLWMSYFEEG GTLPTPFNVIPSPKSLWYLI KWIWTHLCKKKMRRKPESFG TIGVRTQHRR AADNLRRHHQ YQVIMRNLVK RYVAAMIRDA KTEEGLTEEN FKELKQDISS FRFEVLGLLR GSKLSTIQSANASKESSNSA DSDEKSDSEG NSKDKKKNFS LFDLTTLIHP RSAAIASERH NISNGSALW QEPPREKQRK VNFVTDIKNF GLFHRRSKQN AAEQNANQIF SVSEEVARQQ AAGPLERNIQ LESRGLASRG DLSIPGLSEQ CVLVDHRERN TDTLGLQVGK RVCPFKSEKV WEDTVPIIP KEKHAKEEDS SIDYDLNLPD TVTHEDYVTTRL g20881287 73 MSQSPRFVTR RGGSLKAAPG AGTRKNESQD
YLLMDELGDD GYPQLPLPPY GYYPSFRGNE NRLTHRRQTILREKGRRLAN RGPAYMFNDH STSLSIEEER FLDAAEYGNIPWRKMLEEC HSLNVNCVDY MGQNALQLAV ANEHLEITEL LLKKENLSRV GDALLLAISK GYVRIVEAIL NHPAFAEGKRLATSPSQSEL QQDDFYAYDE DGTRFSHDVT PHLAAHCQE YEIVHTLLRK GARIERPHDY FCKCTECSQK QKHDSFSHSR SRINAYKGLA SPAYLSLSSE DPVMTALELS NELAVLANIE KEFKNDYRKL SMQCKDFWG LLDLCRNTEE VEAILNGDAETRQPGDFGRP NLSRLKLAIK YEVKKFVAHP NCQQQLLSIW YENLSGLRQQ TMAVKFLWL AVAIGLPFLA LIYWCAPCSK MGKILRGPFM KFVAHAASFT IFLGLLVMNA ADRFEGTKLL PNETSTDNAR QLFRMKTSCF SWMEMLIISW VIGMIWAECK EIWTQGPKEY LFELWNMLDF GMLAIFAASF IARFMAFWHA SKAQSHDAN DTLKDLTKVT LGDNVKYYNL ARIKWDPTDP QHSEGLYAI AWLSFSRIA YILPANESFG PLQISLGRTV KDIFKFMVIFIMVFVAFMIG MFNLYSYYIG AKQNEAFTTV EESFKTLFWAIFGLSEVKSV VINYNHKFIE NIGYVLYGV Y NVTMVIVLLN MLIAMINSSF QEIEDDADVE WKFARAKLWF SYFEEGRTLP VPFNLVPSPK SLLYLLLKFK KWMCELIQGQ KQGFQEDAEM NKRNEEKKFG ISGSHEDLSK FSLDKNQLAH NKQSSTRSSE DYHLNSFSNP PRQYQKIMKR LIKRYVLQAQ IDKESDEYNE GELKEIKQDISSLRYELLEE
PL 207 588 B1 g2105420 g2119643 g2119644 g2136328
KSQNTEDLAE LIRKLGERLS LEPKLEESRR
PSGLPLLPVL FALGGLLLLS NASCVGGVLW QRRLRRLAEA LNFPPHLHPG RŚEEDRYRNE YEESQWTGER DTQSSTVSTT EAEPYYRSLR DFSPQLPPTQ EEVSYSRGFT GEDEDMAFPG HLYDEVERTY PPSGAWGPLY DEVQMGPWDL HWPEDTYQDP RGIYDQVAGD LDTLEPDSLP FELRGHLVWG FNHVSQAGLK LLASSDPPAS ASQSAEITES HSWQVGVQW RYFGSLHPLP PGSRDSLASA SRIAGITAPW EAEVSRSPQG TQDSPVTRSG PPSRGWQSLS FDGGAFHLKG TGELTRALLV LRLCAWPPLV THGLLLQAWS RRLLGSRLSG AFLRASVYGQ FVAGETAEEV KGCVQQLRTL SLRPLLAVPT EEEPDSAAKR MRLHHVGQAG LELLTPAASG SVAQAGVQWR QSSDRGGGNQ AAASRSSLLQ EAAFSPPCGR LQLPAQPASR HGARGRGSMK AKSLTSRHLL ASQGQETIIK TKVRIPALWK AEPGQHSKTP SQQNKSQYVTTLWEADVGRS LENLQVSCLN AEQNQHLRAS LSRLHRVTPP AGTSTSGPPS AACIGWHSRL HRVAQYARAQ HVRLLVDAEY TSLNPALSLL VAALAVRWNS PGEGGPWVWN TYQACLKDTF ERLGRDAEAA HRAGLAFGVK LVRGAYLDKE RAVAQLHGME DPTQPDYEAT SELNRASPFS YSRCLELMLT HVARHGPMCH LMVASHNEES VRQATKRMWE LGIPLDGTVC FGQLLGMCDH VSLALGQAGY WYKSIPYGS LEEVIPYLIR RAQENRSVLQ GARREQELLS QELWRRLLPG CRRIPH
SCSVTLAGVQ WRDLGLLQPL PPKFKRFSCL SFPSSWDYR
EMEFNCESCS VTLAGVQWRD LGLLQPLPPK FKRFSCLSFP SSWDYR
MCPGIPGPRA EAAVGTTHPF SSPGAWLGSG SGSGPVGAPP PSPGLPPSWA AMMAALYPST DLSGASSSSL PSSPSSSSPN EVMALKDVRE VKEENTLNEK LFLLACDKGD YYMYKKILEE NSSGDLNINC VDVLGRNAVTITTENENLDI LQLLLDYGCQ KLMERIQNPE YSTTMDVAPV ILAAHRNNYEILTMLLKQDV SLPKPHAVGC ECTLCSAKNK KDSLRHSRFR LDIYRCLASP ALIMLTEEDPILRAFELSAD LKELSLVEVE FRNDYEELAR QCKMFAKDLL AQARNSRELE
PL 207 588 B1
VFLNHTSSDE PLDKRGLLEE RMNLSRLKLA IKYNQKEFVS QSNCQQFLNT VWFGQMSGYR RKPTCKKIMT VLTVGIFWPV LSLCYLIAPK SQFGRHHTP FMKFHHGAS YFTFLLLLNL YSLVYNEDKK NTMGPALERIDYLLILWIIG MIWSDIKRLW YEGLEDFLEE SRNQLSFVMN SLYLATFALK WAHNKFHDF ADRKDWDAFH PTLVAEGLFA FANVLSYLRL FFMYTTSSIL GPLQISMGQM LQDFGKFLGM FLLVLFSFTI GLTQLYDKGY TSKEQKDCVGIFCEQQSNDT FHSFIGTCFA LFWYIFSLAH VAIFVTRFSY GEELQSFVGA VIVGTYNVW VIVLTKLLVA MLHKSFQLIA NHEDKEWKFA RAKLWLSYFD DKCTLPPPFNIIPSPKTIC Y MISSLSKWIC SHTSKGKVKR QNSLKEWRNL KQKRDENYQK VMCCLVHRYL TSMRQKMQST DQATVENLNE LRQDLSKFRN EIRDLLGFRT SKYAMFYPRN g3766191 78 MSRGNENRLT HRRQTILREK GRRLANRGPA
YMFNDHSTSL SIEEERFLDA AEYGNTPWR KMLEECHSLN VNCVD YMGQD ALQLAVANEH LEITELLLKK ENLSRVGD AL LLAISKGYVR IVEAILNHPA FAEGKRLATS PSQSELQQDD FYAYDEDGTR FSHDVTPIIL AAHCQEYEIV HTLLRKGARIERPHDYFCKC TECSQKQKHD SFSHSRSRIN AYKGLASPAY LSLSSEDPVM TALELSNELA VLANIEKEFK NDYRKLSMQC KDFWGLLDL CRNTEEVEAILNGDAETRQP GDFGRPNLSR LKLAIKYEVK KFVAHPNCQQ QLLSIWYENL SGLRQQTMAV KFLWLAVAI GLPFLALIYW CAPCSKMGKILRGPFMKFVA HAASFTIFLG LLVMNAADRF EGTKLLPNET STDNARQLFR MKTSCFSWME MLHSWVIGM IWAECKEIWT QGPKEYLFEL WNMLDFGMLA IFAASFIARF MAFWHASKAQ SUDANDTLK DLTKVTLGDN VKYYNLARIK WDPTDPQIIS EGLYAIAWL SFSRIAYILP ANESFGPLQI SLGRTVKDIF KFMVIFIMVF VAFMIGMFNL YSYYIGAKQN EAFTTVEESF KTLFWAIFGL SEVKS WINY NHKFIENIGY VLYGVYNVTM VIVLLNMLIA MINSSFQEIE DDADVEWKFA RAKLWFSYFE EGRTLPVPFN LVPSPKSLLY LLLKFKKWMC ELIQGQKQGF QEDAEMNKRN EEKKFGISGS HEDLSKFSLD KNQLAHNKQS STRSSEDYHL NSFSNPPRQY QKIMKRLIKR YVLQAQIDKE SDEYNEGELK EEKQDISSLR
PL 207 588 B1
YELLEEKSQN TEDLAELIRK LGERLSLEPK LEESRR
g403460 79 DRLSLLSPRL ECNGMILAHC KLRLPGFKRF SCLSLPSSWD YRHVPPRQVH FVFSVETGFH RAGQAGLELL TSSVPPTSAF PKCWDYRRDD QAWPTLSSFR GLNKFAFLPK FFAHPISQFQ RVECNVGCPILLAMKYLAYS SLPGADTMLY FYFYEQEASL AVCNICRQKF HWVLYQISHL YRGVIVDNEL LHPDGRFTWTEFFLSWVKQN SLVDFFFGTE SRSVALLPRL ECSGAMSTLH TVLRPAYSHIYHPDVKEKTH FLGNVFNKRK LQKKILKTPN PLCALHSAPS PSLPPFLRCT GRLPFYLGLD DFLFVAGALM FLPVSFLNPH TLTWPPQCCT RSDCNPLRGQ REISALSHSL PTGLSMPL
g4200234 80 MAALYACTKC HQRFPFEALS QGQQLCKECR IAHPWKCTY CRTEYQQERL ECNGTISAHC NLHLPGSSDS PASSSRVAGITGIKTNTICK KCAQNVQLYG TPKPCQYCNIIAAFIGNKCQ RCTNSEKKYG PPYSCEQCKQ QCAFDRKDDR KKVDGKLLCWLCTLSYKRVL QKTKEQRKHL SSSSRAGHQE KEQYSRLSGG GHYNSQKTLS TSSIQNEIPK KKSKFESITT NGDSFSPDLA LDSPGTDHFVUAQLKEEVA TLKKMLHQKD QMILEKEKKITELKADFQYQ ESQMRAKMNQ MEKTHKEVTE QLQAKNRELL KQAAALSKSK KSEKSGAITS P
g4200238 81 MAALYACTKC HQRFPFEALS QGQQLCKECR IAHPWKCTY CRTEYQQERL ECNGTISAHC NLHLPGSSDS PASSSRVAGI TGIKTNTICK KCAQNVQLYG TPKPCQYCNIIAAFIGNKCQ RCTNSEKKYG PPYSCEQCKQ QCAFDRKDDR KKVDGKLLCW LCTLSYKRVL QKTKEQRKHL SSSSRAGHQE KEQYSRLSGG GHYNSFSPDL ALDSPGTDHF VIIAQLKEEV ATLKKMLHQK DQMILEKEKKITELKADFQY QESQMRAKMN QMEKTHKEVT EQLQAKNREL LKQAAALSKS KKSEKSGAIT SP
g423149 82 FFFFFFETES CSVAEAGVQW CDLGSLKSPP PGSSDSPASA SRVAGITGMH HHTQLIFVFL VETGSHMQLS DSTLVITTAQ NAKITARAPR DLFFFFFFFF
g4336401 83 LPLLPRMECR GMISAHCNLC RSGSSDSPAS
PL 207 588 B1 g4336402 g4379098 g4504601 g4507277
ASRVAGITGT CHHAQLSFPF FLFMRW
LPLLPRMECR GMISAHCNLC RSGSSDSPAS ASRVAGITGT CHHAQL
MDIEDEENMS SSSTDYKENRNLDNYSPKDG STPGPGEGSQ LSNGGGGGPG RKRPLEEGSN GHSKYRLKKR RKTPGPYLPK NALMQLNEIK PGLQYTLLSQ TGPVHAPLFV MSVEVNGQVF EGSGPTKKKA KLHAAEKALR SFVQFPNASE AHLAMGRTLS VNTDFTSDQA DFPDTLFNGF ETPDKAEPPF YVGSNGDDSF SSSGDLSLSA SPVPASLAQP PLPVLPPFPP PSGKNPVMIL NELRPGLKYD FLSESGESHA KSFVMSWVD GQFFEGSGRN KKLAKARAAQ SALAAIFNLH LDQTPSRQPIPSEGLQLHLP QVLADAVSRL YLGKFGDLTD NFSSPHARRK VLAGWMTTG TDVKDAKVIS VSTGTKCING EYMSDRGLAL NDCHAEIISR RSLLRFLYTQ LELYLNNKDD QKRSIFQKSE RGGFRLKENV QFHLYISTSP CGDARIFSPH EPILEGSRSY TQAGVQWCNH GSLQPRPPGL LSDPSTSTFQ GAGTTEPADR HPNRKARGQL RTKIESGEGTIPVRSNASIQ TWDGYLQGER LLTMSCSDKIARWNWGIQG SLLSIFYEPIYFSSHLGSL YHGDHLSRAM YQRISNIEDL PPLYTLNKPL LSGISNAEAR QPGKAPNFSV NWTVGDSAIE VINATTGKDE LGRASRLCKH ALYCRWXACA RQGSLPLTTL QDYQAQRVP
MLLSQNAFIV RSLNLVLMVYISLVFGISYD SPDYTDESCT FKISLRNFRSILSWELKNHS IYPTHYTLLY TIMSKPEDLK WKNCANTTR SFCDLTDEWR STHEAYVTVL EGFSGNTTLF SCSHNFWLAIDMSFEPPEFEIVGFTNHINV MVKFPSIVEE ELQFDLSLVIEEQSEGIYKK HKPEIKGNMS GNFTYHDKLIPNTNYCVSV YLEHSDEQAVIKSPLKCTLL PPGQESESAE SAKIGGHTY FLIALVLTSTIVTLKWIGYI CLRNSLPKYL RQGLTKGWNA VAIHRCSHNA LQSETPELKQ SSCLSFPSSW DYKRASLCPS D
MPLAAYCYLR WGKGSYGEV TLVKHRRDGK QYVIKKLNLRNASSRERRAA EQEAQLLSQL KHPNIVTYKE SWEGGDGLLYIYMGFCEGGD LYRKLKEQKG QLLPENQWE WFVQIAMALQ YLHEKKLHR DLKTQNVFLT RTNHKYGDL
PL 207 588 B1
GIARVLENHC DMASTLIGTP YYMSPELFSN KPYNYKSDVW ALGCCVYEMA TLKHAFNAKD MNSLVYRHE GKLPAMPRDY SPELAELIRT MLSKRPEERP SVRSILRQPYIKRQISFFLE ATKIKTSKNNIKNGDSQSKP FATWSGEAE SNHEVIHPQP LSSEGSQTYIMGEGKCLSQE KPRASGLLKS PASLKAHTCK QDLSNTTELA TISSVNIDIL PAKGRDSVSD GFVQENQPRY LDASNELGGICSISQVEEEM LQDNTKSSAQ PENLIPMWSS DIVTGEKNEP VKPLQPLIKE QKPKDQSLAL SPKLECSGTILAHSNLRLLG SSDSPASASR VAGITGVCHH AQDQVAGECI IEKQGRIHPD LQPHNSGSEP SLSRQRRQKR REQTEHRGEKRQVRRDLFAF QESPPRFLPS HPIVGKVDVT STQKEAENQR RWTGSVSSS RSSEMSSSKD RPLSARERRR LKQSQEEMSS SGPSVRKASL SVAGPGKPQE EDQPLPARRL SSDCSVTQER KQIHCLSEDE LSSSTSSIDK SDGDYGEGKG QTNEINALVQ LMTQTLKLDS KESCEDVPVA NPVSEFKLHR KYRDTLILHG KVAEEAEEIH FKELPSAIMP GSEKIRRLVE VLRTDVIRGL GVQLLEQVYD LLEEEDEFDR EVRLREHMGE KYTTYSVKAR QLKFFEENMN F g4507685 88 MMAALYPSTD LSGASSSSLP SSPSSSSPNE
VMALKDVREV KEENTLNEKL FLLACDKGDY YMVKKILEEN SSGDLNINCV DVLGRNAVTI TIENENLDIL QLLLDYGCQK LMERIQNPEY STTMDVAPVILAAHRNNYEILTMLLKQDVS LPKPHAVGCE CTLCSAKNKK DSLRHSRFRL DIYRCLASPA LIMLTEEDPILRAFELSADL KELSLVEVEF RNDYEELARQ CKMFAKDLLA QARNSRELEVILNHTSSDEP LDKRGLLEER MNLSRLKLAIKYNQKEFVSQ SNCQQFLNTV WFGQMSGYRR KPTCKKIMTV LTVGIFWPVL SLCYLIAPKS QFGRHHTPF MKFIIHGASY FTFLLLLNLY SLVYNEDKKN TMGPALERID YLLILWUGMIWSDIKRLWY EGLEDFLEES RNQLSFVMNS LYLATFALKV VAHNKFHDFA DRKDWDAFHP TLVAEGLFAF ANVLSYLRLF FMYTTSSILG PLQISMGQML QDFGKFLGMF LLVLFSFTIG LTQLYDKGYT SKEQKDCVGI FCEQQSNDTF HSFIGTCFAL FWYIFSLAHV AIFVTRFSYG EELQSFVGAVIVGTYNVWV IVLTKLLVAM LHKSFQLIAN HEDKEWKFAR AKLWLSYFDD KCTLPPPFNIIPSPKTICYM ISSLSKWICS HTSKGKVKRQ NSLKEWRNLK
PL 207 588 B1
QKRDENYQKV MCCLVHRYLT SMRQKMQSTD QATVENLNEL RQDLSKFRNEIRDLLGFRTS KYAMFYPRN g4507687 g4885373 g5730102
MEGSPSLRRM TVMREKGRRQ AYRGPAFMFN DRGTSLTAEE ERFLDAAEYG NIPWRKMLE ESKTLNVNCV DYMGQNALQL AVGNEHLEVT ELLLKKENLA RIGDALLLAI SKGYYRIYEA ILNHPGFAAS KRLTLSPCEQ ELQDDDFYAY DEDGTRFSPDITPHLAAHC QKYEWHMLL MKGARIERPH DYFCKCGDCM EKQRHDSFSH SRSRINAYKG LASPAYLSLS SEDPYLTALE LSNELAKLANIEKEFKNDYR KLSMQCKDFV VGVLDLCRDS EEVEAILNGD LESAEPLEVH RHKASLSRVK LAJKYEVKKF VAHPNCQQQL LTIWYENLSG LREQTIAIKC LWLWALGL PFLAIGYWIA PCSRLGKILR SPFMKFVAHA ASFIIFLGLL VFNASDRFEGITTLPNITVT DYPKQIFRVK TTQFTWTEMLIMVWVLGMMW SECKELWLEG PREYILQLWN VLDFGMLSIF IAAFTARFLA FLQATKAQQY VDSYVQESDL SEVTLPPEIQ YFTYARDKWL PSDPQIISEG LYAIAWLSF SRIAYILPAN ESFGPLQISL GRTVKDIFKF MVLFIMVFF A FMIGMFILYS YYLGAKVNAA FTTVEESFKT LFWSIFGLSE VTS WLKYDH KFIENIGWL YGIYNYTMW VLLNMLIAMINSSYQEIEDD SDVEWKFARS KLWLSYFDDGKTLPPPFSLV PSPKSFVYFI MRIYNFPKCR RRRLQKDIEM GMGNSKSRLN LFTQSNSRVF ESHSFNSILN QPTRYQQIMK RLIKRYVLKA QVDKENDEVN EGELKEIKQD ISSLRYELLE DKSQATEELAILIHKLSEKL NPSMLRCE
MSETYPPAPA ASAAPEKPLA GKKAKKPAKA AAASKKKPAG PSVSELIVQA ASSSKERGGV SLAALKKALA AAGYDYEKNN SRIKLGIKSL VSKGTLVQTK GTGASGSFKL NKKASSVETK PGASKVATKT KATGASKKLK KATGASKKSV KTPKKAKKPA ATRKSSKNPK KPKTVKPKKV AKSPAKAKAV KPKAAKARVT KPKTAKPKKA APKKK
MSQSPAFGPR RGSSPRGAAG AAARRNESQD
YLLMDSELGE DGCPQAPLPC YGYYPCFRGS DNRLAHRRQT VLREKGRRLA NRGPAYMFSD RSTSLSIEEE RFLDAAEYGNIPWRKMLEE CHSLNYNCYD YMGQNALQLA YANEHLEITE
PL 207 588 B1 g5802234 g6005868 g604969
LLLKKENLSRVGDALLLAIS KGYVRIVEAI LSHPAFAEGK RLATSPSQSE LQQDDFYAYD EDGTRFSHDVTPHLAAHCQ EYEIVHTLLR KGARIERPHD YFCKCNDCNQ KQKHDSFSHS RSRINAYKGL ASPAYLSLSS EDPVMTALEL SNELAVLANIEKEFKNDYKK LSMQCKDFW GLLDLCRNTE EVEAILNGDV ETLQSGDHGR PNLSRLKLAIKYEVKKFVAH PNCQQQLLSI WYENLSGLRQ QTMAVKFLW LAVAIGLPFL ALIYWFAPCS KMGKJMRGPF MKFVAHAASF TIFLGLLVMN AADRFEGTKL LPNETSTDNA KQLFRMKTSC FSWMEMLHS WVIGMIWAEC KEIWTQGPKE YLFELWNMLD FGMLAIFAAS FIARFMAFWH ASKAQSHDA NDTLKDLTKV TLGDNVKYYN LARIKWDPSD PQIISEGLYA IAWLSFSRIAYILPANESF GPLQISLGRT VKDIFKFMVIFIMVFVAFMIGMFNLYSYYI GAKQNEAFTT VEESFKTLFW AIFGLSEVKS WINYNHKFIENIGYVLYGV YNVTMVIVLL NMLIAMINSS FQEIEDDADV EWKFARAKLW FSYFEEGRTL PVPFNLVPSP KSLFYLLLKL KKWISELFQG HKKGFQEDAE MNKINEEKKL GILGSHEDLS KLSLDKKQVG HNKQPSIRSS EDFHLNSFNN PPRQYQKIMK RLIKRYVLQA QIDKESDEVN EGELKEIKQDISSLRYELLE EKSQNTEDLA ELIRELGEKL SMEPNQEETN R
SRDPPASASQ VTGIR
MASLSRALRV AAAHPRQSPT RGMGPCNLSS AAGPTAEKSV PYQRTLKEGQ GTSWAQGPS RPLPSTANW VIGGGSLGCQ TLYHLAKLGM SGAVLLERERLTSGTTWHTA GLLWQLRPSD VEVELLAHTR RWSRELEEE TGLHTGWIQN GGLFIASNRQ RLDEYKRLMS LGKAYGVESH VLSPAETKTL YPLMNVDDLY GTLYVPHDGT MDPAGTCTTL ARAASARGAQ VIENCPVTGI RVWTDDFGVR RVAGVETQHG SIQTPCWNC AGVWASAVGR MAGVKVPLVA MHHAYWTER IEGIQSFTLL PTLEYSGTVS AHCNLRLPGS SNSRASASHV AGIKCARHHT RLIFFCILVE TEFHHVAKAG LELLSSGNPPISDFQSARIT GVSHHA
LLWVLLWATV LGLLCQRLAA RLGWTGKDL GEVCHLYYPK SESRSVAQSG VQWCDVSSLQ PLPPRCPAPS SG
PL 207 588 B1 g6650810 96 METESGSVAQ AGVQWHNLGS LQPPPSRLKQ
LSYLSLPSSW DYRCTPPHPA NFLYFNRDGI SPCCPGWSPT PKLTQSTHLG LSKC g6665594 g6665596
MAQFYYKRNV NAPYRDRIPL RIVRAESELS
PSEKAYLNAV EKGDYASVKK SLEEAEIYFK ININCIDPLG RTALLIAIEN ENLELIELLL SFNVYVGDAL LHAIRKEWG AVELLLNHKK PSGEKQVPPILLDKQFSEFT PDITPIILAA HTNNYEIIKL LVQKGVSVPR PHEVRCNCVE CVSSSDVDSL RHSRSRLNIY KALASPSLIA LSSEDPFLTA FQLSWELQEL SKVENEFKSE YEELSRQCKQ FAKDLLDQTR SSRELEIILN YRDDNSLIEE QSGNDLARLK LAIKYRQKEF VAQPNCQQLL ASRWYDEFPG WRRRHWAVKM VTCFIIGLLF PVFS VCYLIA PKSPLGLFIR KPFIKFICHT ASYLTFLFLL LLASQHIDRS DLNRQGPPPT IVEWMILPWV LGFIWGEIKQ MWDGGLQDYI HDWWNLMDFV MNSLYLATIS LKIVAFVKYS ALNPRESWDM WHPTLVAEAL FAIANIFSSL RLISLFTANS HLGPLQISLG RMLLDILKFL FIYCLVLLAF ANGLNQLYFY YEETKGLTCK GIRCEKQNNA FSTLFETLQS LFWSIFGLIN LYVTNVKAQH EFTEFVGATM FGTYNVISLV VLLNMLIAMM NNSYQLIADH ADIEWKFART KLWMSYFEEG GTLPTPFNVIPSPKSLWYLI KWIWTHLCKK KMRRKPESFG TIGRRAADNL RRHHQYQEVM RNLVKRYVAA MIRDAKTEEV ARQQAAGPLE RNIQLESRGL ASRGDLSIPG LSEQCVLVDH RERNTDTLGL QVGKRVCPFK SEKVWEDTV ΡΠΡΚΕΚΗΑΚ EEDSSIDYDL NLPDTYTHED YYTTRL
MAQFYYKRNV NAPYRDRIPL RIYRAESELS
PSEKAYLNAV EKGDYASVKK SLEEAEIYFK ININCIDPLG RTALLIAIEN ENLELIELLL SFNVYVGDAL LHAIRKEWG AVELLLNHKK121 PSGEKQVPPILLDKQFSEFT PDITPIILAA HTNNYEIIKL LVQKGVSVPR PHEVRCNCVE CVSSSDVDSL RHSRSRLNIY KALASPSLIA LSSEDPFLTA FQLSWELQEL SKVENEFKSE YEELSRQCKQ FAKDLLDQTR SSRELEIILN YRDDNSLIEE QSGNDLARLK LAIKYRQKEF VAQPNCQQLL ASRWYDEFPG WRRRHWAYKM VTCFIIGLLF PVFSVCYLIA PKSPLGLFIR KPFIKFICHT ASYLTFLFLL LLASQHIDRS DLNRQGPPPT
PL 207 588 B1
IYEWMILPWV LGFIWGEIKQ MWDGGLQDYI HDWWNLMDFY MNSLYLATIS LKIVAFVKYS ALNPRESWDM WHPTLVAEAL FAIANIFSSL RLISLFTANS HLGPLQISLG RMLLDILKFL FIYCLVLLAF ANGLNQLYFY YEETKGLTCK GIRCEKQNNA FSTLFETLQS LFWSIFGLIN LYVTNYKAQH EFTEFVGATM FGTYNVISLV VLLNMLIAMM NNS YQLIARR AADNLRRHHQ YQEVMRNLVK RYVAAMIRDA KTEEGLTEEN FKELKQDISS FRFEVLGLLR GSKLSTIQSA NASKESSNSA DSDEKSDSEE EVARQQAAGP LERNIQLESR GLASRGDLSIPGLSEQCVLV DHRERNTDTL GLQVGKRVCP FKSEKVWED TVPIIPKEKH AKEEDSSIDY DLNLPDTVTH EDYYTIRL g6690167 g6690252 g7243280
MRTKSEREIH LCVLGFFXFF FETGSRSVAQ AGVQRHSHGS LQPRPPGLIQ FSHLSLPSSW DYRHAPPHLYNFL
100 RFFFFFFFEE SRSFAQAGVQ WRYLGSLQPP PPGFTRFSCL SLLSSWDYRR PPPRPANFLY F
101 ELSFPLLSLD FGAHQGLGSA DMGDMKTPDF
DDLLAAFDIP DIDANEAIHS GPEENEGPGG PGKPEPGVGS ESEDTAAASA GDGPGVPAQA SDHGLPPPDI SVVSVIVKNT VCPEQSEALA GGSAGDGAQA AGVTKEGPVG PHRMQNGFGS PEPSLPGTPH SPAPPSGGTW KEKGMEGKTP LDLFAHFGPE PGDHSDPLPP SAPSPTREGA LTPPPFPSSF ELAQENGPGM QPPVSSPPLG ALKQESCSPH HPQVLAQQGS GSSPKATDIP ASASPPPVAG VPFFKQSPGH QSPLASPKVP VCQPLKEEDD DEGPVDKSSP GSPQSPSSGA EAADEDSNDS PASSSSRPLK VRIKTIKTSC GNITRTVTQV PSDPDPPAPL AEGAFLAEAS LLKLSPATPT SEGPKVVSVQ LGDGTRLKGT VLPVATIQNA STAMLMAASV ARKAWLPGG TATSPKMIAKNVLGLVPQAL PKADGRAGLG TGGQKVNGAS VVMVQPSKTA TGPSTGGGTV ISRTQSSLVE AFNKJLNSKN LLPAYRPNLS PPAEAGLALP PTGYRCLECG DAFSLEKSLA RHYDRRSMRIEVTCNHCARR LVFFNKCSLL LHAREHKDKG LVMQCSHLVM RPVALDQMVG QPDITPLLPV AVPPVSGPLA LPALGKGEGA ITSSAITTVA AEAPVLPLST EPPAAPATSA YTCFRCLECK EQCRDKAGMA AHFQQLGPPA
PL 207 588 B1
PGATSNVCPT CPMMLPNRCS FSAHQRMHKN RPPHVCPECG GNFLQANFQT HLREACLHVS RRYGYRCPSC SWFGGVNSIKSHIQTSHCE VFHKCPICPM AFKSGPSAHA HLYSQHPSFQ TQQAKLIYKC AMCDTVFTHK PLLSSHFDQH LLPQRVSVFK CPSCPLLFAQ KRTMLEHLKN THQSGRLEET AGKGAGGALL TPKTEPEELA VSQGGAAPAT EESSSSSEEE EVPSSPEPPR PAKRPRRELG SKGLKGGGGG PGGWTCGLCH SWFPERDEYV AHMKKEHGKS VKKFPCRLCE RSFCSAPSLR RHVRVNHEGIKRWPCRYCT EGKRTFSSRLILEKHVQVRH GLQLGAQSPG RGTTLARGSS ARAQGPGRKR RQSSDSCSEE PDSTTPPAKS PRGGPGSGGH GPLRYRSSSS TEQSLMMGLRVEDGAQQCLD CGLCFASPGS LSRHRFISHK KRRGVGKASA LGLGDGEEEA PPSRSDPDGG DSPLPASGGP LTCKVCGKSC DSPLNLKTHF RTHGMAFIRA RQGAVGDN g7305597 102 MSQSPRFVTRRGGSLKAAPG AGTRRNESQD
YLLMDELGDD GYPQLPLPPY GYYPSFRGNE NRLTHRRQTI LREKGRRLAN RGPAYMFNDH STSLSIEEER FLDAVEYGNIPWWKMLEEC HSLNVNCVDY MGQNALQLAV ANEHLEITEL LLKKENLSRV GDALLLAISK GYVRIVEAIL NHPSFAEGKRLATSPSQSEL QQDDFYAYDE DGTRFSHDVT PULAAHCQE YEIVHTLLRK GARIERPHDY FCKCTECSQK QKHDSFSHSR SRINAYKGLA SPAYLSLSSE DPVMTALELS NELAVLANIE KEFKNDYRKL SMQCKDFWG LLDLCRNTEE VEAILNGDAE TRQPGDFGRP NLSRLKLAIK DEVKKFVAHP NCQQQLLSIW YENLSGLRQQ TMAVKFLWL AVAIGLPFLA LIYWCAPCSK MGKILPRPFM KFVAHAASFT IFLGLLVMNA ADRFEGTKLL PNETSTDNAR QLFRMKTSCF SWMEMLIISW VIGMIWAECK EIWTQGPKEY LFELWNMLDF GMLAIFAASF IARFMAFWHA SKAQSHDAN DTLKDLTKVT LGDNVKYYNL ARIKWDPTDP QHSEGLYAI AWLSFSRIA YILPANESFG PLQISLGRTV KDIFKFMVIFIMVFVAFMIG MFNLYSYYIG AKQNEAFTTV EESFKTLFWA IFGLSEVKSV VINYNHKFIE NIGYVLYGW NVTMVIVLLN MLIAMINSSF QEIEDDADVE WKFARAKLWF SYFEEGRTLP VPFNLVPSPK SLLYLLLKFK KWMCELIQGQ KQGFQEDAEM NKRNEEKKFG ISGSHEDLSK FSLDKNQLAH NKQSSTRSSE
PL 207 588 B1 g7512448 g7522630 g7669477
DYHLNSFSNP PRQYQKIMKR LIKRYVLQAQ EDKESDEYNE GELKEIKQDI SSLRYELLEE KSQNSEDLAE LIRKLGERLS LEPKLEESRR
103 GFLPATKNLL NEKNHGYLHT SWLLTEMCE RSPDMLAHFR ENEKLVPQLV RILKNLIMSG YSPGHDVSGISDPFLQVRIL RLLRILGRND DDSSEAMNDILAQVATNTET SKNVGNAJLY ETVLTIMDIK SESGLRVLAINILGRFLLNN DKNIRYVALT SLLKTVQTDH NAVQRHRSTI VDCLKDLDVSIKRRAMELSF ALVNGNNIRG MMKELLYFLD SCEPEFKADC ASGIFLAAEK YAPSKRWHID TIMRVLTTAG SYVRDDAVPN LIQLITNSVE MHAYTVQRL Y KAILGDYSQQ PLVQVAAWCIGEYGDLLVSG QCEEEEPIQV TEDEVLDILE SVLISNMSTS YTRGYALTAI MKLSTRFTCT VNRIKKWSIYGSSEDVELQ RRAVEYNALF KKYDHMRSAL LERMPVMEKV TTNGPTEIVQ TNGETEPAPL EIKPPPSGPQ PTSQANDLLD LLGGNDITPVIPTAPTSKPS SAGGELLDLL GDINLTGSHS VSQAGVQWDY LGSLQPLPPAFR
104 MWPNGSSLGP CFRPTNITLE ERRLIASPWF AASFCWGLA SNLLALSVLA GARQGGSHTR SSFLTFLCGL VLTDFLGLLV TGTIVVSQHA ALFEWHAVDP GCRLCRFMGV VMIFFGLSPL LLGAAMASER YLGITRPFSR PAVASQRRAW ATVGLVWAAA LALGLLPLLG VGRYTVQYPG SWCFLTLGAE SGDVAFGLLF SMLGGLSVGL SFLLNTVSVA TLCHVYHGQE AAQQRPRDSE VEMMAQLLGIMWASVCWLP LLVFIAQTVL RNPPAMSPAG QLSRTTEKEL LIYLRVATWN QILDPWVYIL FRRAVLRRLQ PRLSTRPRRS LTLWPSLEYS GTISAHCNLR LPGSSDSRAS ASRAAGITGV SHCARPCMLF DPEFDLLAGV QLLPFEPPTG KALSRKD
105 MDIEDEENMS SSSTDVKENRNLDNVSPKDG STPGPGEGSQ LSNGGGGGPG RKRPLEEGSN GHSKYRLKKR RKTPGPYLPK NALMQLNEIK PGLQYTLLSQ TGPVHAPLFV MSVEVNGQVF EGSGPTKKKA KLHAAEKALR SFVQFPNASE AHLAMGRTLS VNTDFTSDQA DFPDTLFNGF ETPDKAEPPF YVGSNGDDSF SSSGDLSLSA SPVPASLAQP PLPVLPPFPP PSGKNPYMIL NELRPGLKYD FLSESGESHA KSFYMSWYD
PL 207 588 B1
GQFFEGSGRN KKLAKARAAQ SALAAIFNLH LDQTPSRQPIPSEGLQLHLP QVLADAVSRL YLGKFGDLTD NFSSPHARRK VLAGVVMTTG TDVKDAKVIS VSTGTKCING EYMSDRGLAL NDCHAEHSR RSLLRFLYTQ LELYLNNKDD QKRSIFQKSE RGGFRLKENV QFHLYISTSP CGDARIFSPH EPILEGSRSY TQAGVQWCNH GSLQPRPPGL LSDPSTSTFQ GAGTTEPADR HPNRKARGQL RTKIESGEGTIPVRSNASIQ TWDGVLQGER LLTMSCSDKIARWNWGIQG SLLSIFYEPIYFSSIILGSL YHGDHLSRAM YQRISNIEDL PPLYTLNKPL LSGISNAEAR QPGKAPNFSV NWTVGDSAIE VINATTGKDE LGRASRLCKH ALYCRWMRVH GKYPSHLLRS KITKPNVYHE SKLAAKEYQA AKARLFTAFI KAGLGAWVEK PTEQDQFSLT P g7669479 106 MDEEDEENMS SSSTDVKENRNLDNVSPKDG
STPGPGEGSQ LSNGGGGGPG RKRPLEEGSN GHSKYRLKKR RKTPGPVLPK NALMQLNEIK PGLQYTLLSQ TGPVHAPLFV MSVEVNGQVF EGSGPTKKKA KLHAAEKALR SFVQFPNASE AHLAMGRTLS VNTDFTSDQA DFPDTLFNGF ETPDKAEPPF YVGSNGDDSF SSSGDLSLSA SPVPASLAQP PLPVLPPFPP PSGKNPVMIL NELRPGLKYD FLSESGESHA KSFVMSVWD GQFFEGSGRN KKLAKARAAQ SALAAIFNLH LDQTPSRQPIPSEGLQLHLP QVLADAVSRL VLGKFGDLTD NFSSPHARRK YLAGWMTTG TDVKDAKVIS VSTGTKCING EYMSDRGLAL NDCHAEnSR RSLLRFLYTQ LELYLNNKDD QKRSIFQKSE RGGFRLKENV QFHLYISTSP CGDARIFSPH EPILEGSRSY TQAGVQWCNH GSLQPRPPGL LSDPSTSTFQ GAGTTEPADR HPNRKARGQL RTKIESGEGT IPVRSNASIQ TWDGVLQGER LLTMSCSDKI ARWNWGIQG SLLSIFVEPIYFSSIILGSL YHGDHLSRAM YQRISNIEDL PPLYTLNKPL LSGISNAEAR QPGKAPNFSV NWTVGDSAIE VINATTGKDE LGRASRLCKH ALYCRWMRVH GKVPSHLLRS KITKPNYYHE SKLAAKEYQA AKVH g7770147 107 MEVLLFLFIF ETESCSVIRL ECSGSLQPPP
PRFKQFSCLS LPSSWDYRCP PPCPINFCIF GTDRYSPCWP GWSRSR
PL 207 588 B1 g7706747 g8922960 g8923251
108 MAQFYYKRNV NAPYRDRIPL RTVRAESELS PSEKAYLNAV EKGDYASVKK SLEEAEIYFK ININCIDPLG RTALLIAIEN ENLELIELLL SFNVYVGDAL LHAIRKEWG AVELLLNHKK PSGEKQVPPILLDKQFSEFT PDITPIILAA HTNNYEIIKL LVQKGVSVPR PHEVRCNCVE CVSSSDVDSL RHSRSRLNIY KALASPSLIA LSSEDPFLTA FQLSWELQEL SKVENEFKSE YEELSRQCKQ FAKDLLDQTR SSRELEHLN YRDDNSLIEE QSGNDLARLK LAIKYRQKEF VAQPNCQQLL ASRWYDEFPG WRRRHWAVKM VTCFHGLLF PVFSVCYLIA PKSPLGLFIR KPFIKFICHT ASYLTFLFLL LLASQHTORS DLNRQGPPPT IVEWMILPWV LGFIWGEIKQ MWDGGLQDYI HDWWNLMDFV MNSLYLATIS LKTVAFVKYS ALNPRESWDM WHPTLVAEAL FAIANIFSSL RLISLFTANS HLGPLQISLG RMLLDILKFL FIYCLVLLAF ANGLNQLYFY YEETKGLTCK GIRCEKQNNAFSTLFETLQS LFWSIFGLIN LYVTNVKAQH EFTEFVGATM FGTYNVISLV VLLNMLIAMMNNSYQLIADH ADIEWKFART KLWMSYFEEG GTLPTPFNVI PSPKSLWYLI KWIWTHLCKK KMRRKPESFG TIGRRAADNL RRHHQYQEVM RNLVKRYVAA MIRDAKTEEG LTEENFKELK QDISSFRFEV LGLLRGSKLS TIQSANASKE SSNSADSDEK SDSEGNSKDK KKNFSLFDLT TLIHPRSAAIASERHNISNG SALWQEPPR EKQRKVNFVT DIKNFGLFHR RSKQNAAEQN ANQIFSVSEE VARQQAAGPL ERNIQLESRG LASRGDLSIP GLSEQCVLVD HRERNTDTLG LQVGKRVCPF KSEKVWEDT νΡΠΡΚΕΚΗΑ KEEDSSIDYD LNLPDTVTHE DYVTTRL
109 MESYSVTQAG VQWHELCSLQ PSPPRFREMC IEQDGRVHLT WYFGKEEIN EVKGVLENTS KAANFRNFTFIQLNGEFSRG KGLDVGARFW KGSNVLLFFC DVDIYFTSEF LNTCRLNTQP GKKVFYPVLF SQYNPGHYG HHDAVPPLEQ QLVKKETGF WRDFGFGMTC QYRSDFINIG GFDLDIKGWG GEDVHLYRKY LHSNLIWRT PVRGLFHLWH EKRCMDELTP EQYKMCMQSK AMNEASHGQL GMLVFRHEIE AHLRKQKQKT SSKKT
110 MDITLVRKEL QELQNLYKQN STHTAQQAEL IQQLQVLNMD TQKVLRNQED VHTAESISYQ KLYNELHICF ETTKSNEAML RQSVTNLQDQ
PL 207 588 B1
LLQKEQENAK LKEKLQESQG APLPLPQESD PDYSAQVPHR PSLSSLEILM VSQKSEIEYL QEKLKIANEK LSENISANKG FSRKSIMTSA EGKHKEPPVK RSRSLSPKSS FTDSEELQKL RKAERKIENL EKALQLKSQE NDELRDAHEK RKERLQMLQT NYRAVKEQLK QWEEGSGMTE IRKIKRADPQ QLRQEDSDAV WNELAYFKRE NQELMIQKMN LEEELDELKV HISIDKAAIQ ELNRCVAERR EEQLFRSGED DEVKRSTPEK NGKEMLEQTL QKVIELENRL KSFEKRSRKL KEGNKKLMKE NDFLKSLLKQ QQEDTETREK ELEQIIKGSK DVEKENTELQ VKISELETEV TSLRRQVAEA NALRNENEELINPMEKSHQS ADRAKSEMAT MKVRSGRYDC KTTMTKVKFK AAKKNCSVGR HHTVLNHSIK VMSNVFENLS KDGWEDVSES SSDSEAQTSQ TLGTIIVETS QKISPTEDGKDQKESDPTED SQTQGKEIVQ TYLNIDGKTP KDYFHDKNAK KPTFQKKNCK MQKSSHTAVP TRVNREKYKNITAQKSSSNI ILLRERIISL QQQNSVLQNA KKTAELSVKE YKEVNEKLLH QQQVSDQRFQ TSRQTIKKLN LDLAGLRKEK EDLLKKLESS SEITSLAEEN SQVTFPRIQV TSLSPSRSMD LEMKQLQYKL KNATNELTKQ SSNVKTLKFE LLAKEEHIKE MHEKISRMER DITMKRHLIE DLKFRQKVNL ESNKSFSEML QNLDKKVKTL TEECSNKKVS IDSLKQRLNV AVKEKSQYEQ MYQKSKEELE KKDLKLTLLV SRISETESAM AEIETAASKQ LQELALQSEQ VLEGAQKTLL LANEKVEEFT TFVKALAKEL QNDVHWRRQIRELKKMKKN RDACKTSTHK AQTLAASILNISRSDLEEIL DTEDQVEIEK TKIDAENDKE WMLYIQKLLE GQSLTLSPRL KCNGAIMAHQ NLRLPDSSSS ASAS g8923273 111 MKWPEKNAV RIL WGRERGA RAMGAQRLLQ
ELVEDKTRWM KWEGKRVELP DSPRSTFLLA FSPDRTLLAS THVNHNIYIT EVKTGKCVHS LIGHRRTPWC VTFHPTISGLIASGCLDGEV RIWDLHGGSE SWFTDSNNAIASLAFHPTAQ LLLIATANEIHFWDRSRREP FAWKTASEM ERVRLVRFDP LGHYLLTATV NPSNQQGDDE PEIPIDGTEL SHYRQRALLQ SQPVRRTPLL HNFLHMLSSR SSGIQTEPFH PPEQASSTQQ DQGLLNRPSA FSTVQSSTAG NTLRNLSLGP TRRSLGGPLS SHPSRYHREIAPGLTGSEWT RTVLSLNSRS EAESMPPPRT SASSVSLLSV LRQQEGGSQA SYYTSATEGR GFPASGLATE
PL 207 588 B1 g8923360 g8923452 g8923454 g8923691 g8924071 g8924204
SDGGNGSSQNNSGSIRHELQ CDLRRFFLEY DRLQELDQSL SGEAPQTQQA QEMLNNNIES ERPGPSHQPT PHSSENNSNL SRGHLNRCRA CHNLLTFNND TLRWERTTPN YSSGEASSSW QVPSSFESVP SSGSQLPPLE RTEGQTPSSS RLELSSSASP QEERTVGVAF NQETGHWERI YTQSSRSGTV SQEALHQDMP EESSEEDSLR RRSLALSPRL EYSGAILAHC KLRLPGSCHS PASASQVAGT TGAHHHARLIFAFLVEMEFH HVSQAGLELL TSGDLPTSAS QVLGLQA
112 MVHSPRSLVA NPSQVLFFLS FLFFFFLRQS FALVAQAGVQ WRNLGSLQPP PPGFKQFSCL SLLSSWDYRH APPCPAYFVF LVDMGFPHVG QTGLELLTSG DPPASASQSA GITGGSHRAQ PTSSNPYGIV FFFLPVKTFS GMSQEAGDCR ET
113 MPTATGLTLL TSASSAISDP GGEVSAPWGG LRTWTQPLRC WERLLPPPGD PRTVAENTQQ DECGLPGSCP ARPLSRKPEC GREGILPCCS SSAWPEGSFR PFQMNLFSFL SFFFLFFFFL RWSLTLSPRL ECSSAISAHC NLRLPGSSNS PALASQVAGITGICHHARQIFVFLVETGFC HVGQAGLELLISGDSPASAF QSAGIIGVSH RARPGSVFLA RSEESLYLRP GQQSQEVKV
114 MLLVDADQPE PMRSGARELA LFLTPEPGAE AKEVEETIEG MLLRLEEFCS LADLIRSDTS QILEENIPVL KAKLTEMRGIYAKVDRLEAF VKMVGHHVAF LEADVLQAER DHGAFPQALR RWLGSAGLPS FRNVECSGTI PARCNLRLPG SSDSPASASQ VAGITEVTCT GARDVRAAHT V
115 MSVYSGKVLL QTTPPHVIGQ LDKLIREVST LDGVLEVRNE HFWTLGFGSL AGSVHVRIRR DANEQMVLAH VTNRLYTLVS TLTVQIFKDD WIRPALLSGP VAANVLNFSD HHVIPMPLLK GTDGLNPYVH FLWKINFFLF FDMESLSVAQ AGVQWHDLGS LQPHLPGSSN SACLSLPSSW DYRHAPPHLP NFCIISKDGV LPCWPCWS
116 MESRSVAQTG VHWHNLSSLQ PLPPRFKQFS CLSLRSSWDY THLPPCLANF FVFLVETAFR HVGQAGLKLL TSGDQPTSAS QSAGITGISH RTQPVGRFLITDSIFLFVTD LLKFSISS
117 MSKYLGGPFS KGHTASDKYF QIFHNISFFE
PL 207 588 B1 g8980667 g9716913 g9966865
TESCSVAQAG VQWCNLGSLQ ALPPRFTPFS CLSLPSSWDY RHPPPCPDNV FVFSVETGFH CVSQDGLNLL TL
118 MAQGTLIRVT PEQPTHAVCV LGTLTQLDIC SSAPEDCTSF SINASPGVW DIAHSPPAKK KSTGSSTWPL DPGVEVTLTM KAASGSTGDQ KVQISYYGPK TPPVKALLYL TAVDGVSPCH PGWSAMHDLA HCNLRLQVQAILCFSVPSSW TTGACHHAWLIFVFLVEMEF HHVGQAGLEL LTSGDLPASG SQSARITGMN HCARPSIFLILKYL
119 MSQSPAFGPR RGSSPRGAAG AAARRNESQD YLLMDSELGE DGCPQAPLPC YGYYPCFRGS DNRLAHRRQT VLREKGRRLA NRGPAYMFSD RSTSLSIEEE RFLDAAEYGN EPWRKMLEE CHSLNVNCVD YMGQNALQLA VANEHLEITE LLLKKENLSR VGDALLLAIS KGWRIVEAI LSHPAFAEGK RLATSPSQSE LQQDDFYAYD EDGTRFSHDV TPDLAAHCQ EYEIVHTLLR KGARIERPHD YFCKCNDCNQ KQKHDSFSHS RSRINAYKGL ASPAYLSLSS EDPVMTALEL SNELAVLANIEKEFKNDYKK LSMQCKDFW GLLDLRRNTE EVEAILNGDV ETLQSGDHGR PNLSRLKLAIKYEVKKMGKIMRGPFMKFVA HAASFTIFLG LLVMNAADRF EGTKLLPNET STDNAKQLFR MKTSCFSWME MLIISWVIGM IWAECKEIWT QGPKEYLFEL WNMLDFGMLA IFAASFIARF MAFWHASKAQ SUDANDTLK DLTKVTLGDN VKYYNLARIK WDPSDPQIIS EGLYAIAWL SFSRIAYTLP ANESFGPLQI SLGRTVKDIF KFMVIFIMVF VAFMIGMFNL YSYYIGAKQN EAFTTVEESF KTLFWAIFGL SEVKS WINY NHKFIENIGY VLYGVYNVTM VTVLLNMLIA MINSSFQEIE DDADVEWKFA RAKLWFS YFE EGRTLPVPFN LVPSPKSLFY LLLKLKKWIS ELFQGHKKGF QEDAEMNKIN EEKKLGILGS HEDLSKLSLD KKQVGHNKQP SIRSSEDFHL NSFNNPPRQY QKIMKRLIKR YVLQAQIDKE SDEVNEGELK EIKQDISSLR YELLEEKSQN TEDLAELIRE LGEKLSMEPN QEETNR
120 MLRNSTFKNM QRRHTTLREK GRRQ AIRGPA YMFNEKGTSL TPEEERFLDS AEYGNIPWR KMLEESKTLN FNCVDYMGQN ALQLAVGNEH LEVTELLLKK ENLARVGDAL LLAISKGWR IYEAILNHPA FAQGQRLTLS PLEQELRDDD
PL 207 588 B1
FYAYDEDGTR FSHDITPIIL AAHCQEYEIV HILLLKGARIERPHDYFCKC NECTEKQRKD SFSHSRSRMN AYKGLASAAY LSLSSEDPVL TALELSNELA RLANIETEFK NDYRKLSMQC KDFVVGVLDL CRDTEEYEAILNGDVNFQVW SDHHRPSLSRIKLAIKYEVK KFVAHPNCQQ QLLTMWYENL SGLRQQSIAV KFLAVFGVSI GLPFLAIAYWIAPCSKLGRT LRSPFMKFVA HAVSFTIFLG LLWNASDRF EGYKTLPNET FTDYPKQIFR VKTTQFSWTE MLIMKWVLGM IWSECKEIWE EGPREYYLHL WNLLDFGMLS IFVASFTARF MAFLKATEAQ LYVDQHVQDD TLHNVSLPPE VAYFTYARDK WWPSDPQHS EGLYAIAWL SFSRIAYILP ANESFGPLQI SLGRTYKDIF KFMYIFIMYF VAFMIGMFNL YSYYRGAKYN PAFTTVEESF KTLFWSIFGL SEYISWLKY DHKFIENIGY VLYGVYNVTM VWLLNMLIA MINNS YQEIE EDADYEWKFA RAKLWLSYFD EGRTLPAPFN LVPSPKSFYY LIMRIKMCLIKLCKSKAKSC ENDLEMGMLN SKFKKTRYQA GMRNSENLTA NNTLSKPTRY QKIMKRLIKR YVLKAQVDRE NDEVNEGELK EIKQDISSLR YELLEEKSQA TGELADLIQQ LSEKFGKNLN KDHLRYNKGK DI g9967846 121 MDDGCPQLPL PPHGYYPSLR GTDNRLTHRR
QTVLREKGRR LANRGPAYMF NDHSTTLSIE EERFLDAAEY GNIPWRKML EECLSLNYNC VDYMGQNALQ LAVANEHLEITELLLKKENL SRVGDALLLAISKGYVRIVE AILSHPAFAE GKRLATSPSQ SELQQDDFYA YDEDGTRFSH DVTPIILAAH CQEYEIVHTL LRKGARIERP HDYFCKCSEC NQKQKHDSFS HSRSRINAYK GLASPAYLSL SSEDPVMTAL ELSNELAVLA NIEKEFKNDY KKLSMQCKDF WGLLDLCRN TEEVEAILNG DVETCQSGDQ GRPNLSRLKL AIKYEVKKFV AHPNCQQQLL SIWYENLSGL RQQTMAVKFL WLGVAIGLP FL ALIYWCAP CSKMGKIMRG PFMKFVAHAA SFTIFLGLLV MNAADRFEGT KLRPNETSTD NAKQLFRMKT SCFSWMEMLIISWYIGMIWA ECKEIWAQGP KEYLFELWNM LDFGMLAIFA ASFIARFMAF WHASKAQSH DANDTLKDLT KVTLGEDVKY YNLARIKWDP SDPQHSEGL YAIAWLSFS RIAYILPANE SFGPLQISLG RTYKDIFKFM VIFIMVFVAF MIGMFNLYSY YIGAKQNEAF TTYEESFKTL FWAIFGLSEY KSWINYNHK
PL 207 588 B1
FIENIGYVLY GVYNVTMVIV LLNMLIAMIN SSFQEIEDDA DVEWKFARAK LWFSYFEEGR TLPVPFNLVP SPKSLLYLLL KFKKWGFELF QGHKKAFQED AEMNKKNEEK KFGILGSHED LSKLSVDKKQ LGQNKQSSIR SSEDFHLNSF NNPPRQYQKIMKRLIKRYVL QAQIDKESDE VNEGELKEIK QDISSLRYEL LEEKSQNTED LAELIRKLGE KLSSEPKQEEINR g9967886 122 MFNDHSTTLSIEEERFLDAA EYGNIPWRK
MLEECLSLNV NCVDYMGQNA LQLAVANEHL EITELLLKKE NLSRVGDALL LAISKGYVRI VEAILSHPAF AEGKRLATSL SQSELQQDDF YAYDEDGTRF SHDVTPHLA AHCQEYETVH TLLRKGARIE RPHDYFCKCS ECNQKQKHDS FSHSRSRINA YKGLASPAYL SLSSEDPVMT ALELSNELAV LANIEKEFKN DYKKLSMQCK DFWGLLDLC RNTEEVEAIL NGDIETCQPG DQGRPNLSRL KLAIKYEVKK FVAHPNCQQQ LLSIWYENLS GLRQQTMAVK FL WLGVAIG LPFLALIYWC APCSKMGKIM RGPFMKFVAH AASFTIFLGL LVMNAADRFE GTKLRPNETS TDNAKQLFRM KTSCFSWMEM LHSWVIGMV WAECKEIWAQ GPKEYLFELW NMLDFGMLAI FAASFIARFM AFWHASKAQS UDANDTLKD LTKVTLGEDV KYYNLARIKW DPSDPQHSE GLYAIAWLS FSRIAYILPA NESFGPLQIS LGRTVKDIFK FMVIFIMVFV AFMIGMFNLY SHYIGAKQNE AFTTYVISDV LTMEIAD g9967888 123 MDDGCPQLPL PPHGYYPSLR GTDNRLTHRR
QTVLREKGRR LANRGPAYMF NDHSTTLSIE EERFLDAAEY GNIPWRKML EECLSLNVNC VDYMGQNALQ LAVANEHLEITELLLKKENL SRVGDALLLAISKGYVRIVE AILSHPAFAE GKRLATSPSQ SELQQDDFYA YDEDGTRFSH DVTPHLAAH CQEYEIVHTL LRKGARIERP HDYFCECSEC NQKQKHDSFS HSRSRINAYK GLASPAYLSL SSEDPVMTAL ELSNELAVLA NIEKEFKNDY KKLSMQCKDF WGLLDLCRN TEEVEAILNG DVETCQPGDQ GRPNLSRLKL AIKYEVKKFV AHPNCQQQLL SIWYENLSGL RQQTMAVKFL WLGVAIGLP FLALIYWCAP CSKMGKIMRG PFMKFVAHAA SFTIFLGLLV MNAADRFEGT KLRPNETSTD NAKQLFRMKT SCFSWMEMLIISWVIARIKW DPSDPQIISE GLYAIAWLS FSRIAYILPA NESFGPLQIS
PL 207 588 B1
LGRTVKDIFK FMVIFIMVFV AFMIGMFHLY S YYIGAKQNE AFTTVEESFK TLFWAIFGLS EVKSWINYN HKFIENIGYV LYGWNVTMV IVLLNMLIAMINSSFQEEED DADVEWKFAR AKLWFSYFEE GRTLPVPFNL VPSPKSLLYL LLKFKKWGFE LFQGHKKAFQ EDAEMNKRNE EKKFGILGSH EDLSKLSVDK KQLGQNKQSS IRSSEDFHLN SFNNPPRQYQ KIMKRLIKRY VLQAQIDKES DEVNEGELKEIKQDISSLRY ELLEEKSQNT EDLAELIRKL GEKLSSEPKQ EEINR g9716913 124 MSQSPAFGPR RGSSPRGAAG AAARRNESQD
YLLMDSELGE DGCPQAPLPC YGYYPCFRGS DNRLAHRRQT VLREKGRRLA NRGPAYMFSD RSTSLSIEEE RFLDAAEYGNIPWRKMLEE CHSLNVNCVD YMGQNALQLA VANEHLEITE LLLKKENLSR VGDALLLAIS KGYVRIVEAI LSHPAFAEGK RLATSPSQSE LQQDDFYAYD EDGTRFSHDV TPHLAAHCQ EYEFYHTLLR KGARIERPHD YFCKCNDCNQ KQKHDSFSHS RSRINAYKGL ASPAYLSLSS EDPVMTALEL SNELAVLANIEKEFKNDYKK LSMQCKDF W GLLDLRRNTE EVEAILNGDV ETLQSGDHGR PNLSRLKLAIKYEVKKMGKIMRGPFMKFVA HAASFTIFLG LLVMNAADRF EGTKLLPNET STDNAKQLFR MKTSCFSWME MLIISWVIGM IWAECKEIWT QGPKEYLFEL WNMLDFGMLA IFAASFIARF MAFWHASKAQ SHDANDTLK DLTKYTLGDN VKYYNLARIK WDPSDPQUS EGLYAIAWL SFSRIAYILP ANESFGPLQI SLGRTVKDIF KFMVIFIMVF VAFMIGMFNL YSYYIGAKQN EAFTTVEESF KTLFWAIFGL SEVKSWINY NHKFIENIGY VLYGVYNVTM VTVLLNMLIA MINSSFQEIE DDADVEWKFA RAKLWFSYFE EGRTLPVPFN LVPSPKSLFY LLLKLKKWIS ELFQGHKKGF QEDAEMNKIN EEKKLGILGS HEDLSKLSLD KKQVGHNKQP SIRSSEDFHL NSFNNPPRQY QKIMKRLIKR YVLQAQIDKE SDEVNEGELK EIKQDISSLR YELLEEKSQN TEDLAELIRE LGEKLSMEPN QEEINR
PL 207 588 B1
Peptydy NTP, pokrewne białka, pokrewne peptydy oraz ich fragmenty, warianty, pochodne, homologi i mimetyki można wytwarzać sposobami znanymi fachowcom, takimi jak technika rekombinacji DNA, synteza białek i izolacja naturalnie występujących peptydów NTP, pokrewnych białek, pokrewnych peptydów oraz ich fragmentów, wariantów, pochodnych i homologów.
Peptyd NTP, pokrewne białko lub pokrewny peptyd można wytwarzać stosując dobrze znane techniki rekombinacji DNA, takie jak opisane w Sambrook i in., [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. [1989]) i/lub Ausubel i in., red., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers Inc. and Wiley and Sons, N.Y. [1994].
Gen lub cDNA kodujący peptyd NTP, pokrewne białko lub pokrewny peptyd można uzyskać, np. przez przeszukanie biblioteki genomowej lub cDNA lub amplifikację PCR. Sondy lub startery użyteczne do przeszukania biblioteki można wytwarzać w oparciu o informację o sekwencji innych znanych genów lub fragmentów genów z tej samej lub pokrewnej rodziny genów, takich jak np. konserwowane motywy występujące w innych pokrewnych białkach. Ponadto, gdy gen kodujący peptyd NTP, pokrewne białko lub pokrewny peptyd został zidentyfikowany w jednym gatunku, cały taki gen lub jego część można zastosować jako sondę do identyfikacji homologicznych genów u innych gatunków. Sondy lub startery można stosować do przeszukania bibliotek cDNA pochodzących z różnych tkanek, które uważa się za eksprymujące gen peptydu NTP, pokrewnego białka lub pokrewnego peptydu. Zazwyczaj przeszukiwanie prowadzi się w ostrych warunkach, aby zminimalizować liczbę fałszywych pozytywnych peptydów uzyskiwanych w wyniku takiego przeszukania.
Innym sposobem wytwarzania genu kodującego peptyd NTP, pokrewne białko lub pokrewny peptyd jest zastosowanie syntezy chemicznej zgodnie z metodami dobrze znanymi fachowcom, takimi jak opisane w Engels i in., (Angew. Chem. Intl. Ed., 28 : 716-734 [1989]). Metody takie obejmują, między innymi fosfotriestrowe, fosforoamidytowe i H-fosfonianowe metody syntezy kwasów nukleinowych. Korzystną metodą takiej syntezy chemicznej jest synteza na nośniku polimerowym zgodnie ze standardową metodą fosforoamidytową. Zazwyczaj DNA kodujący peptyd NTP, pokrewne białko lub pokrewny peptyd będzie miał długość kilkuset nukleotydów. Kwasy nukleinowe dłuższe niż 100 nukleotydów można syntetyzować w kilku fragmentach stosując te metody. Następnie fragmenty można ligować ze sobą z wytworzeniem pełnej długości peptydu NTP, pokrewnego białka lub pokrewnego peptydu. Zazwyczaj fragment DNA kodujący N-koniec białka będzie zawierał ATG, kodujący resztę metioniny. Ta metionina może, ale nie musi być obecna w dojrzałej postaci pokrewnego białka, pokrewnego peptydu lub peptydu NTP, zależnie od tego czy białko wytwarzane w komórce gospodarzu jest przeznaczone do wydzielania z tej komórki.
Gen, cDNA lub jego fragment kodujący pokrewne białko, pokrewny peptyd lub peptyd NTP można wstawić do odpowiedniego wektora ekspresyjnego lub amplifikującego z zastosowaniem standardowych metod ligacji. Wektor zazwyczaj wybiera się tak, aby był funkcjonalny w konkretnej stosowanej komórce gospodarzu (tj. wektor jest zgodny z maszynerią komórki gospodarza, tak że zachodzi amplifikacja genu i/lub ekspresja genu). Gen, cDNA lub jego fragment kodujący pokrewne białko, pokrewny peptyd lub peptyd NTP można amplifikować/eksprymować w prokariotycznych, drożdżowych, owadzich (układy bakulowirusowe) i/lub eukariotycznych komórkach gospodarzach. Wybór komórki gospodarza będzie zależeć częściowo od tego, czy pokrewne białko, pokrewny peptyd lub peptyd NTP ma być glikozylowany i/lub fosforylowany. Jeżeli tak, korzystne są drożdżowe, owadzie lub ssacze komórki gospodarze.
Zazwyczaj wektory stosowane w jakichkolwiek komórkach gospodarzach będą zawierać sekwencję 5'-flankującą (także nazywaną promotorem) oraz inne elementy regulatorowe, takie jak wzmacniacz(e), element miejsca startu replikacji, element zakończenia transkrypcji, kompletną sekwencję intronową zawierającą donorowe i akceptorowe miejsca składania, sekwencję peptydu sygnałowego, element miejsca wiązania rybosomu, sekwencję poliadenylacji, region polilinkerowy do wstawienia kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd, który ma być eksprymowany oraz element markera selekcji. Każdy z tych elementów omówiono poniżej. Ewentualnie wektor może zawierać sekwencję znacznikową, tj. cząsteczkę oligonukleotydu umiejscowioną na końcu 5' lub 3' sekwencji kodującej pokrewne białko, pokrewny peptyd lub peptyd; która to cząsteczka oligonukleotydowa koduje poliHis (taki jak heksaHis) lub inny znacznik, taki jak FLAG, HA (hemaglutynina wirusa grypy) lub myc, dla których istnieją dostępne w handlu przeciwciała. Ten znacznik zazwyczaj łączy się drogą fuzji z polipeptydem podczas ekspresji polipeptydu i może służyć jako narzędzie do oczyszczania na drodze powinowactwa do pokrewnego białka, pokrewnego peptydu lub peptydu NTP z komórki gospodarza. Oczyszczanie na drodze powinowactwa można przeprowadzić np. metodą chromatografii kolumnowej
PL 207 588 B1 z użyciem przeciwciał przeciw znacznikowi jako matrycy powinowactwa. Ewentualnie znacznik można następnie usuwać różnymi sposobami z oczyszczonego pokrewnego białka, pokrewnego peptydu lub peptydu NTP, np. z użyciem pewnych peptydaz.
Regiony zawiasowy i Fc ludzkiej immunoglobuliny mogą zostać sfuzowane z N-końcem albo z C-koń cem pokrewnego biał ka, pokrewnego peptydu lub peptydu NTP przez fachowca. Nastę pnie białko fuzyjne z Fc można oczyścić z użyciem kolumny powinowactwa z białkiem A. Wiadomo, że Fc wykazuje długi farmakokinetyczny okres półtrwania in vivo i stwierdzono, że białka sfuzowane z Fc wykazują zasadniczo dłuższy okres półtrwania in vivo niż ich niesfuzowane odpowiedniki. Fuzja z regionem Fc umożliwia również dimeryzację/multimeryzację cząsteczki, co może być użyteczne dla bioaktywności niektórych cząsteczek.
Sekwencja 5' flankująca może być homologiczna (tj. z tego samego gatunku i/lub szczepu co komórka gospodarz), heterologiczna (tj. z innego gatunku lub szczepu niż komórka gospodarz), hybrydowa (tj. może stanowić połączenie sekwencji 5' flankujących z większej niż jeden liczby gatunków), syntetyczna lub może być natywną sekwencją 5' flankującą genu pokrewnego białka, pokrewnego peptydu lub peptydu NTP. Źródłem sekwencji 5' flankującej może być jednokomórkowy organizm prokariotyczny lub eukariotyczny, jakikolwiek organizm kręgowca lub bezkręgowca albo jakakolwiek roślina, pod warunkiem, że sekwencja 5' flankująca działa w i może być aktywowana przez maszynerię komórki gospodarza.
Sekwencje 5' flankujące użyteczne w odpowiednich wektorach można otrzymywać kilkoma metodami dobrze znanymi w dziedzinie wynalazku. Zazwyczaj użyteczne tutaj sekwencje 5' flankujące inne niż sekwencja flankująca genu pokrewnego białka, pokrewnego peptydu lub peptydu NTP powinny być wcześniej zidentyfikowane przez mapowanie i/lub trawienie endonukleazą restrykcyjną, a zatem mogą być wyizolowane z odpowiedniego źródła tkankowego za pomocą odpowiednich endonukleaz restrykcyjnych. W niektórych przypadkach może być znana pełna sekwencja nukleotydowa sekwencji 5' flankującej. Tutaj sekwencję 5' flankującą można syntetyzować standardowymi metodami opisanymi powyżej dla syntezy i klonowania kwasów nukleinowych.
Gdy znana jest cała lub tylko część sekwencji 5' flankującej, można ją uzyskać drogą PCR i/lub przeszukania biblioteki genomowej odpowiednim oligonukleotydem i/lub fragmentami sekwencji 5' flankującej z tego samego lub innego gatunku.
Gdy nie jest znana sekwencja 5' flankująca, fragment DNA zawierający sekwencję 5' flankującą można wyizolować z większego fragmentu DNA zawierającego np. sekwencję kodującą lub nawet inny gen lub geny. Izolację można przeprowadzić przez trawienie endonukleazami restrykcyjnymi z uż yciem jednego lub wię kszej liczby starannie dobranych enzymów do izolacji odpowiedniego fragmentu DNA. Po strawieniu dany fragment można wyizolować przez oczyszczanie w żelu agarozowym, w kolumnie Qiagen® lub innymi metodami znanymi fachowcom. Wybór odpowiednich enzymów dla osiągnięcia tego celu będzie oczywisty dla fachowca.
Element miejsca startu replikacji zazwyczaj jest częścią prokariotycznych wektorów ekspresyjnych dostępnych w handlu i ułatwia amplifikację wektora w komórce gospodarzu. Amplifikacja wektora do pewnej liczby kopii może być, w niektórych przypadkach, istotna dla optymalnej ekspresji pokrewnego białka, pokrewnego peptydu lub peptydu NTP. Gdy wybrany wektor nie zawiera miejsca startu replikacji, może być ono zsyntetyzowane chemicznie w oparciu o znaną sekwencję i wligowane do wektora. Element zakończenia transkrypcji zazwyczaj jest umiejscowiony na 3' końcu sekwencji kodującej pokrewnego białka, pokrewnego peptydu lub peptydu NTP i służy do zakończenia transkrypcji pokrewnego białka, pokrewnego peptydu lub peptydu NTP. Zazwyczaj element zakończenia transkrypcji w komorkach prokariotycznych jest fragmentem bogatym w G-C, po którym następuje sekwencja poli-T. Podczas gdy element ten może być sklonowany z biblioteki lub zakupiony w handlu jako część wektora, może on być również łatwo zsyntetyzowany metodami syntezy kwasów nukleinowych, takimi jak te opisane powyżej.
Element genu markera selekcyjnego koduje białko potrzebne do przeżycia i wzrostu komórki gospodarza hodowanej w pożywce hodowlanej. Typowe geny markera selekcyjnego kodują białka, które (a) nadają oporność na antybiotyki lub inne toksyny, np. ampicylinę, tetracyklinę lub kanamycynę w przypadku prokariotycznych komórek gospodarzy, (b) uzupeł niają niedobory auksotroficzne komórki; albo (c) dostarczają kluczowych składników odżywczych niedostępnych ze złożonych pożywek. Korzystnymi markerami selekcyjnymi są gen oporności na kanamycynę, gen oporności na ampicylinę i gen oporności na tetracyklinę.
PL 207 588 B1
Element wiążący rybosom, powszechnie nazywany sekwencją Shine-Dalgarno (prokarioty) lub sekwencją Kozak (eukarioty), jest zazwyczaj potrzebny do inicjacji translacji mRNA. Element ten jest zazwyczaj umiejscowiony 3' względem promotora i 5' względem sekwencji kodującej syntetyzowanego pokrewnego białka, pokrewnego peptydu lub peptydu NTP. Sekwencja Shine-Dalgarno jest zmienna, ale zazwyczaj jest to polipuryna (tj. ma dużą zawartość A-G). Zidentyfikowano wiele sekwencji Shi ne-Dalgarno i każdą z nich może łatwo zsyntetyzować fachowiec stosując metody tutaj przedstawione i zastosować w wektorze prokariotycznym.
W przypadkach gdy korzystne jest aby pokrewne biał ko, pokrewny peptyd lub peptyd NTP był y wydzielane z komórki gospodarza, można zastosować sekwencję sygnałową, aby skierować pokrewne białko, pokrewny peptyd lub peptyd NTP na zewnątrz komórki gospodarza, w której jest syntetyzowany i C-końcowa część białka może zostać wydeletowana w celu przeciwdziałania zakotwiczeniu w bł onie. Zazwyczaj sekwencja sygnał owa jest umiejscowiona w regionie kodują cym genu lub cDNA pokrewnego białka/pokrewnego peptydu/peptydu NTP lub bezpośrednio na 5' końcu regionu kodującego genu pokrewnego białka/pokrewnego peptydu/peptydu NTP. Zidentyfikowano wiele sekwencji sygnałowych i dowolna z nich, która jest funkcjonalna w wybranej komórce gospodarzu może być zastosowana w połączeniu z genem lub cDNA pokrewnego białka/pokrewnego peptydu/peptydu NTP. Zatem sekwencja sygnałowa może być homologiczna lub heterologiczna względem genu lub cDNA pokrewnego białka/pokrewnego peptydu/peptydu NTP i może być homologiczna lub heterologiczna względem genu lub cDNA pokrewnego białka/pokrewnego peptydu/peptydu NTP. Ponadto sekwencję sygnałową można zsyntetyzować chemicznie metodami przedstawionymi powyżej. W większości przypadków wydzielanie polipeptydu z komórki gospodarza dzięki obecności peptydu sygnałowego powoduje usunięcie N-końcowej metioniny z polipeptydu.
W wielu przypadkach transkrypcja genu lub cDNA pokrewnego białka/pokrewnego peptydu/peptydu NTP może być zwiększona wskutek obecności w wektorze jednego lub większej liczby intronów. Jest to szczególnie prawdą gdy pokrewne białko, pokrewny peptyd lub peptyd NTP jest wytwarzany w eukariotycznych komórkach gospodarzach, szczególnie ssaczych komórkach gospodarzach. Stosowane introny mogą być naturalnie występującymi w genie pokrewnego białka/pokrywnego peptydu/peptydu NTP, szczególnie gdy stosowany gen stanowi sekwencja genomowa pełnej długości lub jej fragment. Gdy intron nie występuje naturalnie w genie (tak jak w przypadku większości cDNA), intron(y) można uzyskać z innego źródła. Pozycja intronu względem sekwencji flankującej i genu pokrewnego białka/pokrewnego peptydu/peptydu NTP jest ogólnie ważna, gdyż intron musi być transkrybowany aby działać. Zatem gdy gen pokrewnego białka/pokrewnego peptydu/peptydu NTP wstawiony do wektora ekspresyjnego jest cząsteczką cDNA, korzystną pozycją dla intronu jest 3' względem miejsca startu transkrypcji oraz 5' względem sekwencji poliA zakończenia transkrypcji. Korzystnie w przypadku cDNA pokrewnego białka/pokrewnego peptydu/peptydu NTP, intron lub introny będą umiejscowione po jednej lub drugiej stronie (tj. 5' lub 3') cDNA, tak że nie przerywa on sekwencji kodującej. W realizacji wynalazku można zastosować jakikolwiek intron z dowolnego źródła, włącznie z dowolnym organizmem wirusowym, prokariotycznym i eukariotycznym (roś linnym lub zwierzę cym), pod warunkiem, że jest on zgodny z komórką(ami), do której(ych) jest wstawiany. Obejmuje to również syntetyczne introny. Ewentualnie w wektorze można zastosować więcej niż jeden intron.
Gdy jeden lub większa liczba z wymienionych powyżej elementów nie jest obecna w stosowanym wektorze, można je pojedynczo uzyskać i wligować do wektora. Metody uzyskiwania każdego z tych elementów są dobrze znane fachowcom i porównywalne z metodami przedstawionymi powyż ej (tj. synteza DNA, przeszukiwanie bibliotek itp.).
Ostateczne wektory stosowane w realizacji wynalazku zazwyczaj konstruuje się z wyjściowych wektorów, takich jak wektor dostępny w handlu. Takie wektory mogą, ale nie muszą, zawierać niektóre elementy występujące w całkowitym wektorze. Gdy żaden z wymaganych elementów nie jest obecny w wyjś ciowym wektorze, każ dy element moż e być indywidualnie wligowany do wektora przez przecię cie wektora odpowiednią (-mi) endonukleazą (-ami) restrykcyjną (-ymi), tak że końce elementu do wligowania i końce wektora są zgodne dla ligacji. W niektórych przypadkach konieczne może być utworzenie tępych końców do zligowania ze sobą dla uzyskania zadowalającej ligacji. Tępe końce tworzy się najpierw przez wypełnienie „lepkich końców” za pomocą polimerazy DNA Klenowa lub polimerazy DNA T4 w obecności wszystkich czterech nukleotydów. Ta procedura jest dobrze znana w dziedzinie wynalazku i opisana, np. w Sambrook i in., jak wyżej. Alternatywnie, dwa lub większą liczbę elementów do wstawienia do wektora można najpierw zligować ze sobą (gdy mają one być umiejscowione obok siębie), a następnie wligować do wektora.
PL 207 588 B1
Dodatkową metodą konstruowania wektora jest przeprowadzenie wszystkich ligacji różnych elementów równocześnie w jednej mieszaninie reakcyjnej. W tym przypadku zostanie wytworzonych wiele nonsensownych lub niefunkcjonalnych wektorów ze względu na nieprawidłową ligację lub insercję elementów. Jednakże funkcjonalny wektor może być zidentyfikowany i wybrany przez trawienie endonukleazami restrykcyjnymi.
Korzystnymi wektorami w realizacji wynalazku są te, które są zgodne z komórkami gospodarzami bakteryjnymi, owadzimi i ssaczymi. Takie wektory obejmują, między innymi, pCRII, pCR3, i pcDNA3.1 (Invitrogen Company, San Diego, Calif.), pBSII (Stratagene Company, La Jolla, Calif.), pET15b (Novagen, Madison, Wis.), PGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ.), pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, Calif.), pETL (BlueBacII; Invitrogen) i pFastBacDual (Gibco/BRL, Grand Island, N.Y.).
Po skonstruowaniu wektora i wstawieniu kwasu nukleinowego kodującego pełnej długości lub skrócone pokrewne białko, pokrewny peptyd lub peptyd NTP w odpowiednie miejsce wektora, kompletny wektor może zostać wstawiony do odpowiedniej komórki gospodarza w celu amplifikacji i/lub ekspresji polipeptydu. Komórkami gospodarzami mogą być komórki prokariotyczne (takie jak E. coli) lub eukariotyczne komórki gospodarze (takie jak komórka drożdżowa, komórka owadzia lub komórka kręgowca). Komórka gospodarz, przy hodowaniu w odpowiednich warunkach, może syntetyzować pokrewne białko, pokrewny peptyd lub peptyd NTP, które mogą być następnie zebrane z pożywki hodowlanej (gdy komórka gospodarz wydziela je do pożywki) lub bezpośrednio z wytwarzającej je komórki gospodarza (gdy nie są wydzielane).
Po zebraniu pokrewne białko, pokrewny peptyd lub peptyd NTP można oczyścić takimi metodami, jak chromatografia na sitach molekularnych, chromatografia powinowactwa itp. Wybór komórki gospodarza do wytwarzania pokrewnego białka, pokrewnego peptydu lub peptydu NTP będzie zależeć częściowo od tego, czy pokrewne białko, pokrewny peptyd lub peptyd NTP ma być glikozylowany lub fosforylowany (w tym przypadku korzystne są eukariotyczne komórki gospodarze) oraz od sposobu w jaki komórka gospodarz jest w stanie zwinąć białko do jego natywnej struktury trzeciorzędowej (np. odpowiedniej orientacji mostków disiarczkowych itd.) tak, aby biologicznie aktywne białko zostało wytworzone przez pokrewne białko, pokrewny peptyd lub peptyd NTP wykazujące aktywność biologiczną. Pokrewne białko, pokrewny peptyd lub peptyd NTP może zostać zwinięty po syntezie w odpowiednich warunkach chemicznych, z jak omówiono poniżej. Odpowiednie użyteczne komórki lub linie komórkowe obejmują komórki ssacze, komórki jajnika chomika chińskiego (CHO), ludzkie embrionalne komórki nerki (HEK) 293 lub 293T lub komórki 3T3. Wybór odpowiednich ssaczych komórek gospodarzy oraz sposobu ich transformacji, hodowli, namnażania, przeszukiwania oraz wytwarzania i oczyszczania produktu mogą przeprowadzić fachowcy na podstawie podanych tutaj wskazówek. Inne odpowiednie ssacze linie komórkowe obejmują linie komórek małpy COS-1 i COS-7 oraz linię komórek CV-1. Kolejne przykładowe ssacze komórki gospodarze obejmują linie komórek naczelnych i linie komórek gryzoni, włącznie z transformowanymi liniami komórkowymi. Prawidłowe komórki diploidalne, szczepy komórek pochodzące z hodowli in vitro tkanki pierwotnej, a także pierwotne eksplanty są także odpowiednie. Komórki kandydaci mogą być genotypicznie różne pod względem genu selekcyjnego lub mogą zawierać dominująco działający gen selekcyjny. Inne odpowiednie ssacze linie komórkowe obejmują, ale nie wyłącznie, mysie komórki nerwiaka niedojrzałego N2A, HeLa, mysie komórki L-929, linie 3T3 pochodzące od myszy Swiss, Balb-c lub NIH, chomicze linie komórkowe BHK lub HaK.
Podobnie użytecznymi komórkami gospodarzami są komórki bakteryjne. Przykładowo, różne szczepy E. coli (np. HB101, DH5a, DH10 i MC1061) są dobrze znane jako komórki gospodarze w dziedzinie biotechnologii. Różne szczepy B. subtilis, Pseudomonas spp., innych Bacillus spp., Streptomyces spp. itp. można także zastosować w tej metodzie. Wiele szczepów komórek drożdżowych znanych fachowcom jest także dostępnych jako komórki gospodarze do eksprymowania polipeptydów według wynalazku.
Ponadto, gdy jest to wymagane, zgodnie z wynalazkiem można stosować układy komórek owadzich. Takie układy opisano np. w Kitts i in. (Biotechniques, 14 : 810-817 [1993]), Lucklow (Curr. Opin. Biotechnol, 4 : 564-572 [1993]) oraz Lucklow i in. (J. Virol, 67 : 4566-4579 [1993]). Korzystnymi komórkami owadzimi są Sf-9 i Hi5 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.).
Wstawienie (nazywane także transformacją lub transfekcją) wektora do wybranej komórki gospodarza można przeprowadzić stosując takie metody, jak metoda z chlorkiem wapnia, elektroporacja, mikroiniekcja, lipofekcja lub DEAE-deksrtranowa. Wybrana metoda będzie częściowo zależeć od typu
PL 207 588 B1 stosowanej komórki gospodarza. Metody te oraz inne odpowiednie metody są dobrze znane fachowcom, jak przedstawiono w, np. Sambrook i in., jak wyżej.
Komórki gospodarze zawierające wektor (tj. transformowane lub transfekowane) można hodować stosując standardowe pożywki znane fachowcom. Pożywki zazwyczaj będą zawierać wszystkie składniki odżywcze potrzebne do wzrostu i przeżycia komórek. Odpowiednimi pożywkami do hodowli komórek E. coli są np. Luria Broth (LB) i/lub Terrific Broth (TB). Odpowiednimi pożywkami do hodowli komórek eukariotycznych są RPMI1640, MEM, DMEM, z których wszystkie mogą być uzupełnione surowicą i/lub czynnikami wzrostowymi, jak jest to wymagane przez konkretną hodowaną linię komórkową. Odpowiednią pożywką dla hodowli owadzich jest pożywka Grace's wzbogacona ekstraktem drożdżowym, hydrolizatem laktalbuminowym i/lub płodową surowicą cielęcą, gdy jest to potrzebne. Zazwyczaj antybiotyk lub inny związek użyteczny do selektywnego wzrostu tylko transformowanych komórek dodaje się jako dodatek do pożywki. Stosowany związek będzie zależny od elementu markera selekcyjnego obecnego na plazmidzie, którym została stransformowana komórka gospodarz. Przykładowo, gdy elementem markera selekcyjnego jest oporność na kanamycynę, związkiem dodanym do pożywki hodowlanej będzie kanamycyna.
Ilość pokrewnego białka, pokrewnego peptydu lub peptydu NTP wytwarzana w komórce gospodarzu można oznaczyć stosując znane metody. Takie metody obejmują, bez ograniczeń, analizę Western blot, elektroforezę w żelu poliakrylamidowym z SDS, elektroforezę żelową w warunkach nie denaturujących, rozdział HPLC, spektrometrię masową, immunoprecypitację i/lub testy aktywności, takie jak testy zmiany migracji w żelu po związaniu DNA.
Gdy pokrewne białko, pokrewny peptyd lub peptyd NTP zostały zaprojektowane tak, aby były wydzielane z komórki gospodarza, większość pokrewnego białka, pokrewnego peptydu lub peptydu NTP można znaleźć w komórkowej pożywce hodowlanej. Białka wytworzone w ten sposób nie będą zazwyczaj zawierać N-końcowej metioniny, gdyż jest ona usuwana podczas wydzielania z komórki. Jednak gdy pokrewne białko, pokrewny peptyd lub peptyd NTP nie są wydzielane z komórek gospodarzy, będą one obecne w cytoplazmie i/lub jądrze (w przypadku komórek eukariotycznych) lub w cytozolu (w przypadku komórek gospodarzy będących bakteriami Gram-ujemnymi) i będą zawierać N-końcową metioninę.
W przypadku pokrewnego białka, pokrewnego peptydu lub peptydu NTP znajdującego się w cytoplazmie i/lub jądrze komórki gospodarza, komórki gospodarze zazwyczaj najpierw rozbija się mechanicznie lub za pomocą detergentu w celu uwolnienia zawartości wewnątrzkomórkowej do buforowanego roztworu. Następnie pokrewne białko, pokrewny peptyd lub peptyd NTP można wyizolować z tego roztworu.
Oczyszczanie pokrewnego białka, pokrewnego peptydu lub peptydu NTP z roztworu można prowadzić stosując różne metody. Gdy białko zostało zsyntetyzowane tak, że zawiera znacznik, taki jak heksaHistidyna (np. peptyd NTP/hexaHis) lub inny niewielki peptyd, taki jak FLAG (Sigma-Aldritch,
St. Louis, MI) lub peptyd wiążący kalmodulinę (Stratagene, La Jolla, CA) na jego C-końcu lub N-końcu, może być ono zasadniczo oczyszczane w jednoetapowym procesie przez przepuszczanie roztworu przez kolumnę powinowactwa, gdzie matryca kolumny wykazuje powinowactwo do znacznika lub bezpośrednio do białka (czyli stanowi przeciwciało monoklonalne specyficznie rozpoznające pokrewne białko lub pokrewny peptyd). Przykładowo, polihistydyna wiąże się z większym powinowactwem lub specyficznością z niklem, cynkiem i kobaltem, a zatem do oczyszczania pokrewnego białka/poliHis można zastosować chromatografię powinowactwa do unieruchomionych jonów metalu z użyciem żywicy powinowactwa opartej na niklu (jak stosuje się w układzie QIAexpress Qiagen lub Xpress System Invitrogen) lub żywicy powinowactwa opartej na kobalcie (jak stosuje się w układzie Talon BD Biosciences-CLONTECH). (patrz, np. Ausubel i in., red. Current Protocols in Molecular Biology, część 10.11.8, John Wiley & Sons, New York [1993]).
Gdy pokrewne białko, pokrewny peptyd lub peptyd NTP wytwarza się bez dołączonego znacznika i nie są dostępne przeciwciała można zastosować inne dobrze znane procedury oczyszczania. Takie procedury obejmują, ale nie wyłącznie, chromatografię jonowymienną, chromatografię na hydroksyapatycie, chromatografię z oddziaływaniami hydrofobowymi, chromatografię na sitach molekularnych, HPLC, natywną elektroforezę żelową w połączeniu z elucją z żelu oraz preparatywne ogniskowanie izoelektryczne (urządzenie/technika Isoprime, Hoefer Scientific). W niektórych przypadkach dwie lub większą liczbę z tych technik można połączyć w celu osiągnięcia zwiększonej czystości.
Gdy przewiduje się, że pokrewne białko, pokrewny peptyd lub peptyd NTP będzie występować głównie wewnątrzkomórkowo, materiał wewnątrzkomórkowy (w tym ciałka inkluzyjne bakterii Gram54
PL 207 588 B1
-ujemnych) można wyekstrahować z komórki gospodarza stosując standardowe techniki znane fachowcom. Przykładowo, komórka gospodarz może zostać zlizowana z uwolnieniem składników peryplazmy/cytoplazmy przez prasę French press, homogenizazję i/lub sonifikację, a następnie odwirowanie. Gdy pokrewne białko, pokrewny peptyd lub peptyd NTP wytworzyły ciałka inkluzyjne w cytozolu, ciałka inkluzyjne często mogą wiązać się z wewnętrznymi i/lub zewnętrznymi błonami komórkowymi, a zatem mogą występować głównie w materiale osadu po odwirowaniu. Następnie materiał osadu można poddać obróbce przy ekstremalnym pH lub środkiem chaotropowym, takim jak detergent, guanidyna, pochodne guanidyny, mocznik lub pochodne mocznika, w obecności środka redukującego, takiego jak ditiotreitol przy alkalicznym pH lub triskarboksyetylofosfina przy kwaśnym pH, w celu uwolnienia, rozerwania i rozpuszczenia ciałek inkluzyjnych. Pokrewne białko, pokrewny peptyd lub peptyd NTP w jego teraz rozpuszczalnej postaci można analizować metodą elektroforezy żelowej, immunoprecypitacji itp. Gdy wymagane jest wyizolowanie pokrewnego białka, pokrewnego peptydu lub peptydu NTP, izolację można przeprowadzić stosując znane metody, takie jak te podane poniżej oraz w Marston i in. (Meth Enz., 182 : 264-275 [1990]).
W niektórych przypadkach pokrewne biał ko, pokrewny peptyd lub peptyd NTP mogą nie być biologicznie aktywne po wyizolowaniu. Aby przywrócić aktywność biologiczną można zastosować różne metody ponownego zwijania lub przekształcania polipeptydu w jego strukturę trzeciorzędową i tworzenia wiązań disiarczkowych. Takie metody obejmują wystawienie rozpuszczonego polipeptydu na pH zazwyczaj powyżej 7 i w obecności określonego stężenia środka chaotropowego. Wybrany środek chaotropowy jest bardzo podobny do wybranego do stosowania w rozpuszczaniu ciałek inkluzyjnych, ale zazwyczaj w niższym stężeniu i nie jest to koniecznie taki sam środek chaotropowy, co stosowany w rozpuszczaniu. W większości przypadków roztwór do powtórnego zwijania/utleniania będzie także zawierać środek redukujący lub środek redukujący wraz z jego utlenioną postacią w określonym stosunku, w celu wytworzenia konkretnego potencjału redoks umożliwiającego mieszanie disiarczków z wystąpieniem tworzenia mostka(ów) pomiędzy cysteinami bia łka. Kilka z powszechnie stosowanych par redoks obejmuje cysteinę/cystaminę, glutation (GSH)/ditiobisGSH, chlorek miedziowy, ditiotreitol (DTT)/ditianoDTT, 2-merkaptoetanol(bME)/ditio(bME). W wielu przypadkach potrzebny jest współrozpuszczalnik, aby zwiększyć wydajność ponownego zwijania i najczęstsze odczynniki stosowane w tym celu obejmują glicerol, glikol polietylenowy o różnych masach cząsteczkowych i argininę.
Gdy ciałka inkluzyjne pokrewnego białka, pokrewnego peptydu lub peptydu NTP nie tworzą się w znaczącym stopniu w komórce gospodarzu, pokrewne białko, pokrewny peptyd lub peptyd NTP mogą głównie występować w supernatancie po odwirowaniu homogenatu komórkowego, i pokrewne białko, pokrewny peptyd lub peptyd NTP można wyizolować z supernatantu stosując metody takie jak przedstawione poniżej.
W tych sytuacjach gdy korzystna jest częściowa lub cał kowita izolacja pokrewnego białka, pokrewnego peptydu lub peptydu NTP, oczyszczanie można przeprowadzić stosując standardowe metody dobrze znane fachowcom. Takie metody obejmują, ale nie wyłącznie, rozdział elektroforetyczny, a następnie elektroelucję, różne typy chromatografii (immunopowinowactwa, na sitach molekularnych i/lub jonowymienną) i/lub wysokociśnieniową chromatografię cieczową. W niektórych przypadkach korzystne może być zastosowanie większej niż jedna liczby tych metod w celu całkowitego oczyszczenia.
Ponadto oprócz wytwarzania i oczyszczania pokrewnych białek, pokrewnych peptydów lub peptydów NTP technikami rekombinacji DNA, pokrewne białka, pokrewne peptydy lub peptydy NTP oraz ich fragmenty, warianty, homologi i pochodne można wytwarzać metodami syntezy chemicznej (takimi jak synteza peptydów na fazie stałej) stosując techniki znane w dziedzinie wynalazku oraz przedstawione w Merrifield i in. (J. Am. Chem. Soc, 85 : 2149 [1963]), Houghten i in. (Proc Natl Acad. Sci. USA, 82 : 5132 [1985]) oraz Stewart i Young (Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, Ill [1984]). Takie polipeptydy można syntetyzować z metioniną lub bez metioniny na N-końcu. Chemicznie syntetyzowane pokrewne białka, pokrewne peptydy lub peptydy NTP można utleniać stosując metody przedstawione w tych pozycjach literaturowych, z utworzeniem mostków disiarczkowych. Oczekuje się, że te pokrewne białka, pokrewne peptydy lub peptydy NTP będą mieć aktywność biologiczną porównywalną z pokrewnymi białkami, pokrewnymi peptydami lub peptydami NTP wytwarzanymi drogą rekombinacji lub oczyszczonymi ze źródeł naturalnych, a zatem można je stosować wymiennie z rekombinowanymi lub naturalnymi pokrewnymi białkami, pokrewnymi peptydami lub peptydami NTP.
Preparaty chemicznie modyfikowanego pokrewnego białka, pokrewnego peptydu lub peptydu NTP, w których pokrewne białko, pokrewny peptyd lub peptyd NTP są sprzężone z polimerem są objęte
PL 207 588 B1 zakresem wynalazku. Wybrany polimer jest najczęściej rozpuszczalny w wodzie, tak że białko, do którego jest dołączony, nie wytrąca się w środowisku wodnym, takim jak środowisko fizjologiczne. Wybrany polimer jest zazwyczaj zmodyfikowany tak, aby zawierał pojedynczą grupę reaktywną, taką jak ugrupowanie aktywnego estru do acylowania lub ugrupowanie aldehydu do alkilowania, tak że stopień polimeryzacji może być regulowany, jak przedstawiono w opisanych metodach. Polimer może mieć dowolną masę cząsteczkową i może być rozgałęziony lub nierozgałęziony. Zakresem polimerów pokrewnego białka/pokrewnego peptydu/peptydu NTP objęta jest mieszanina polimerów.
W niektórych przypadkach wymagane może być wytworzenie wariantów kwasu nukleinowego i/lub aminokwasowych wariantów naturalnie występujących pokrewnych białek, pokrewnych peptydów lub peptydów NTP. Warianty kwasu nukleinowego można wytwarzać przez ukierunkowaną mutagenezę, amplifikację PCR lub innymi odpowiednimi metodami, przy czym starter(y) ma(ją) wymaganą(e) mutację(e) punktową(e) (patrz Sambrook i in., jak wyżej, oraz Ausubel i in., jak wyżej, opisy technik mutagenezy). Syntezę chemiczną z zastosowaniem metod opisanych przez Engels i in., jak wyżej, także można zastosować do wytwarzania takich wariantów. Można również stosować inne metody znane fachowcom.
Korzystnymi wariantami kwasu nukleinowego są kwasy zawierające podstawienia nukleotydowe uwzględniające preferencję kodonów w komórce gospodarzu, która ma być stosowana do wytworzenia pokrewnego białka, pokrewnego peptydu lub peptydu NTP. Taką optymalizację kodonów można określić za pomocą algorytmów komputerowych z tabelami częstotliwości kodonów, takie jak Ecohigh.Cod dla preferencji kodonów wysoko eksprymowanych genów bakteryjnych z University of Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group, Madison, Wis. Inne użyteczne tabele częstotliwości kodonów obejmują Celegans_high.cod, Celegans_low.cod, Drosophila_high.cod, Human_high.cod, Maize_high.cod i Yeast_high.cod. Innymi korzystnymi wariantami są kodujące konserwatywne zmiany aminokwasowe opisane powyżej (np. w których ładunek lub polarność naturalnie występującego bocznego łańcucha aminokwasowego nie jest zasadniczo zmieniona przez podstawienie innym aminokwasem) w porównaniu z typem dzikim i/lub takie zaprojektowane w celu wytworzenia nowego (-ych) miejsca (miejsc) glikozylacji i/lub fosforylacji lub zaprojektowane w celu usunięcia istniejącego nowego miejsca (miejsc) glikozylacji i/lub fosforylacji.
Pokrewne białka, pokrewne peptydy, peptydy NTP, ich fragmenty, homologi, warianty, pochodne i sole można wytwarzać stosując typowe techniki syntezy peptydów znane fachowcom. Techniki te obejmują metody sprzęgania chemicznego (porównaj, Wunsch, E: „Methoden der organischen Chemie”, tom 15, roddział 1+2, Synthese von Peptiden, thime Verlag, Stuttgart (1974) oraz Barrany G.; Marrifield, R. B.: „The Peptides”, red E. Gross, J. Meienhofer, tom 2, rozdział 1, str. 1-284, Academic Press (1980)), metody sprzęgania enzymatycznego (patrz, Widmer F., Johansen J. T., Carlsberg Res. Commun., tom 44, str. 37-46. (1979) i Kullmann, W.: „Enzymatic Peptide Synthesis”, CRC Press Inc. Boca Raton, Fla. (1987) oraz Widmer, F., Johansen, J. T. w „Synthetic Peptides in Biology and Medicines:, red. Alitalo, K., Partanen, P., Vatieri, A., str. 79-86, Elsevier, Amsterdam (1985)), albo połączenie metod chemicznych i enzymatycznych gdy jest to korzystne ze względu na projektowanie i ekonomikę procesu. Stosując wskazówki tutaj zamieszczone fachowcy są w stanie zmienić sekwencję peptydową pokrewnego białka, pokrewnego peptydu lub peptydu NTP z wytworzeniem homologu mającego taką samą lub podobną aktywność biologiczną (biaktywność) co pierwotne lub natywne pokrewne białko, pokrewny peptyd lub peptyd NTP.
Korzystne może być stosowanie raczej mimetyku danego pokrewnego białka, pokrewnego peptydu lub peptydu NTP niż samego białka. Ogólnie mimetyki peptydów są bardziej biodostępne, dłużej działają i mogą być tańsze w produkcji niż białka i peptydy.
Zatem pokrewne białka, pokrewne peptydy i peptydy NTP opisane powyżej znajdują zastosowanie w opracowaniu takich małych związków chemicznych o podobnej aktywności biologicznej, a tym samym o podobnej użyteczności terapeutycznej. Mimetyki peptydów, pokrewnych białek, pokrewnych peptydów i peptydów NTP można opracować stosując techniki chemii kombinatoryjnej oraz inne techniki znane w dziedzinie (patrz np. Proceedings of the 20th European Peptide Symposium, red. G. Jung, E. Bayer, str. 289-336 oraz pozycje literaturowe tam przytoczone).
Przykłady metod strukturalnego modyfikowania peptydu, znane w dziedzinie wynalazku, w celu wytworzenia mimetyku peptydu obejmujące inwersję centrów chiralnych szkieletu prowadzącą do struktur reszt D-aminokwasów, w szczególności na N-końcu, prowadzą do zwiększenia stabilności pod względem rozkładu proteolitycznego bez niekorzystnego wpływu na aktywność. Przykład opisano w artykule „Tritriated D-ala1-Peptide T Binding”, Smith C. S. i in., Drug Development Res. 15, str. 371-379 (1988).
PL 207 588 B1
Drugą metodą jest zmiana struktury cyklicznej w celu stabilizacji, taka jak tworzenie międzyłańcuchowych imidów i laktamów pomiędzy N i C (Ede i in., w Smith i Rivier (red.) „Peptides: Chemistry and Biology”, Escom, Leiden (1991), str. 268-270). Przykładem tego są konformacynie ograniczone związki tymopentyno-podobne, takie jak ujawnione w opisie patentowym US 4457489 (1985), Goldstein G. i in.
Trzecią metodą jest podstawienie wiązań peptydowych w pokrewnym białku lub pokrewnym peptydzie przez wiązania pseudopeptydowe, które nadają odporność na proteolizę. Opisano kilka wiązań pseudopeptydowych, które ogólnie nie wpływają na strukturę i aktywność biologiczną peptydu. Jednym z przykładów tego podejścia jest podstawienie wiązaniami retro-inverso pseudopeptydowymi („Biologically active retroinverso analogues of thymopentin”, Sisto A. i in., w Rivier, J. E. i Marshall, G. R. (red.) „Peptides, Chemistry, Structure and Biology”, Escom, Leiden (1990), str. 722-773) oraz Dalpozzo i in., (1993), Int. J. Peptide Protein Res., 41 : 561-566). Zgodnie z tą modyfikacją, sekwencje aminokwasowe peptydów mogą być identyczne z opisanymi tutaj sekwencjami pokrewnych białek, pokrewnych peptydów i peptydów NTP, z wyjątkiem tego, że jedno lub większa liczba wiązań peptydowych jest zastąpiona wiązaniem retro-inverso pseudopeptydowym. Korzystnie najbliższe N-końca wiązanie peptydowe jest podstawione, gdyż takie podstawienie nadaje odporność na proteolizę przez egzopeptydazy działające na N-koniec.
Synteza peptydów z jednym lub większą liczbą zredukowanych wiązań retro-inverso pseudopeptydowych jest znana (Sisto (1990) oraz Dalpozzo i in. (1993), jak wyżej). Zatem wiązania peptydowe mogą być zastąpione wiązaniami niepeptydowymi, które umożliwiają przyjęcie przez mimetyk peptydu struktury, a tym samym aktywności biologicznej, podobnej do pierwotnego peptydu. Dalsze modyfikacje także można wprowadzić przez zastąpienie grup chemicznych aminokwasów innymi grupami chemicznymi o podobnej strukturze. Innym odpowiednim wiązaniem pseudopeptydowym, odnośnie którego wiadomo, że wzmacnia stabilność względem rozszczepiania enzymatycznego przy braku lub niewielkiej utracie aktywności biologicznej jest zredukowane izosteryczne wiązanie pseudopeptydowe (Couder i in., (1993), Int. J. Peptide Protein Res., 41 : 181-184). Zatem sekwencje aminokwasowe tych peptydów mogą być identyczne z sekwencjami pokrewnego białka, pokrewnego peptydu lub peptydu NTP, z wyjątkiem tego, że jedno lub większa liczba wiązań peptydowych jest zastąpiona izosterycznym wiązaniem pseudopeptydowym. Korzystnie najbliższe N-końca wiązanie peptydowe jest podstawione, gdyż takie podstawienie nadaje odporność na proteolizę przez egzopeptydazy działające na N-końcu. Synteza peptydów z jednym lub większą liczbą zredukowanych izosterycznych wiązań pseudopeptydowych jest znana w dziedzinie wynalazku (Couder i in., (1993), patrz powyżej). Inne przykłady obejmują wprowadzanie wiązań ketometylenowych lub metylosiarczkowych w celu zastąpienia wiązań peptydowych.
Peptoidowe pochodne pokrewnych białek, pokrewnych peptydów i peptydów NTP stanowią inną klasę mimetyków peptydów, które zachowują determinanty strukturalne ważne dla aktywności biologicznej, ale bez wiązań peptydowych, co nadaje odporność na proteolizę (Simon i in., Proc. Natl. Acad Sci USA, 89 : 9367-9371). Peptoidy są oligomerami N-podstawionych glicyn. Opisano kilka grup N-alkilowych, z których każda odpowiada łańcuchowi bocznemu naturalnego aminokwasu (Simon i in., (1992), jak wyżej). Kilka lub wszystkie aminokwasy pokrewnego białka, pokrewnego peptydu lub peptydów NTP są zastąpione N-podstawioną glicyną odpowiadającą zastępowanemu aminokwasowi.
W opracowaniu mimetyków peptydów może pomóc określenie struktury trzeciorzędowej pokrewnego białka, pokrewnego peptydu lub peptydu NTP metodami spektroskopii NMR, krystalografii i/lub komputerowego modelowania molekularnego. Metody te ułatwiają opracowanie nowych środków o większej sile i/lub większej biodostępności i/lub większej stabilności niż pierwotny peptyd (Dean (1994), BioEssays, 16 : 683-687; Cohen i Shatzmiller (1993), J. Mol Graph., 11 : 166-173; Wiley i Rich (1993), Med. Res. Rev., 13 : 327-384; Moore (1994), Trends Pharmacol Sci., 15 : 124-129; Hruby (1993), Biopolymers, 33 : 1073-1082; Bugg i in., (1993), Sci. Am., 269 : 92-98).
Gdy zostanie zidentyfikowany nowy związek, mimetyk peptydu, może on zostać zsyntetyzowany i zbadany metodami przedstawionymi w poniższych przykładach w celu określenia aktywności. Związki będące mimetykami peptydów otrzymane powyższymi metodami, mające aktywność biologiczną pokrewnych białek, pokrewnych peptydów lub peptydów NTP oraz podobną strukturę trójwymiarową znajdują zastosowanie. Dla fachowca będzie zrozumiałe, że mimetyk peptydu można wytworzyć z dowolnych pokrewnych białek, pokrewnych peptydów lub peptydów NTP mających jedną lub większą liczbę modyfikacji tutaj opisanych. Dalej będzie zrozumiałe, że mimetyki peptydów według wynalazku można dalej stosować do opracowania nawet jeszcze silniejszych związków niepeptydowych, dodatkowo poza ich użytecznością jako środków terapeutycznych.
PL 207 588 B1
Obecnie istnieje wiele organizacji mogących przeprowadzić syntezę pokrewnych białek, pokrewnych peptydów i peptydów NTP tutaj opisanych. Przykładowo, biorąc pod uwagę sekwencję peptydu NTP, organizacja może zsyntetyzować peptyd i przesłać zsyntetyzowany peptyd z dołączoną dokumentacją dowodu tożsamości peptydu.
Ponadto możliwe jest zastosowanie pokrewnych białek, pokrewnych peptydów i peptydów NTP i odpowiadają cych im cząsteczek kwasów nukleinowych w testach w celu oznaczania, jakościowo lub ilościowo, obecności pokrewnych białek, pokrewnego peptydu, peptydów NTP, DNA pokrewnego białka/pokrewnego peptydu/peptydu NTP lub odpowiadającego im RNA w próbkach tkanek lub płynów ustrojowych ssaka. Pokrewne białka, pokrewne peptydy, peptydy NTP oraz odpowiadające im cząsteczki kwasów nukleinowych mogą znaleźć zastosowanie w przygotowywaniu takich testów, bez względu na to czy pokrewne białko, pokrewny peptyd lub peptyd NTP lub kodowane pokrewne białko, pokrewny peptyd lub peptyd NTP wykazują, czy nie wykazują aktywności biologicznej. Sekwencje kwasu nukleinowego pokrewnego białka, pokrewnego peptydu lub peptydu NTP można zastosować jako źródło sond do hybrydyzacji w oznaczaniu, jakościowo lub ilościowo, obecności DNA lub zgodnego RNA pokrewnego białka, pokrewnego peptydu lub peptydu NTP w próbkach tkanek lub płynów ustrojowych ssaka.
Pokrewne białko, pokrewny peptyd lub peptyd NTP, które same nie są biologicznie aktywne, można stosować do wytwarzania przeciwciał rozpoznających i/lub wiążących pokrewne białka, pokrewne peptydy lub peptydy NTP. Takie przeciwciała można wytworzyć standardowymi metodami. Zatem przeciwciała reagujące z pokrewnymi białkami, pokrewnymi peptydami lub peptydami NTP, a takż e krótkoł a ń cuchowe fragmenty przeciwciał i inne reaktywne fragmenty takich przeciwciał takż e są użyteczne. Przeciwciała mogą być poliklonalne, monoklonalne, rekombinowane, chimeryczne, jednołańcuchowe i/lub bispecyficzne. Zazwyczaj przeciwciało lub jego fragment będzie pochodzić od człowieka lub będzie humanizowane, czyli wytworzone tak, żeby przeciwdziałać lub zminimalizować reakcję immunologiczną z przeciwciałem przy podaniu pacjentowi. Korzystnymi przeciwciałami są ludzkie przeciwciała, poliklonalne lub monoklonalne. Fragmentem przeciwciała może być dowolny fragment, który jest reaktywny z pokrewnymi białkami, pokrewnymi peptydami lub peptydami NTP według wynalazku, taki jak Fab', Fab', itd. Możliwe są także hybrydomy wytworzone przez dostarczenie dowolnego pokrewnego białka, pokrewnego peptydu lub peptydu NTP jako antygenu wybranemu ssakowi, a następnie sfuzowanie komórek ssaka (np. komórek śledziony) z pewnym typem komórek nowotworowych w celu wytworzenia nieśmiertelnych linii komórkowych znanymi metodami. Te metody stosowane do wytwarzania takich linii komórkowych oraz przeciwciał skierowanych przeciw całości lub częściom pokrewnego białka, pokrewnego peptydu lub peptydu NTP są opisane.
Przeciwciała można dalej stosować do celów diagnostycznych i badawczych in vivo i in vitro, np. w postaci znakowanej do wykrywania obecności pokrewnego białka, pokrewnego peptydu lub peptydu NTP w próbce płynu ustrojowego lub komórek.
Możliwe jest również zastosowanie jednego lub większej liczby pokrewnych białek, pokrewnych peptydów lub peptydów NTP jako wzorców do kalibracji w testach do oznaczania, jakościowo lub ilościowo, obecności pokrewnych białek, pokrewnego peptydu, peptydów NTP, DNA pokrewnego białka/pokrewnego peptydu/peptydu NTP lub odpowiadającego im RNA w próbkach tkanek lub płynów ustrojowych ssaka.
Wynalazek umożliwia realizację nowych sposobów leczenia stanów wymagających usunięcia komórek, takich jak łagodne i złośliwe nowotwory, rozrost gruczołów (np. prostaty), niepożądane włosy na twarzy, brodawki, niepożądana tkanka tłuszczowa. Taki sposób polega na podawaniu ssakowi potrzebującemu takiego leczenia terapeutycznie skutecznej ilości pokrewnego białka, pokrewnego peptydu lub peptydu NTP.
Stanem tym może być np. nowotwór płuc, sutka, żołądka, trzustki, prostaty, pęcherza, kości, jajnika, skóry, nerki, zatoki, okrężnicy, jelita, żołądka, odbytnicy, przełyku, krwi, mózgu i jego opon, rdzenia kręgowego i jego opon, mięśni, tkanki łącznej, nadnerczy, przytarczyc, tarczycy, macicy, jądra, przysadki, narządów rozrodczych, wątroby, pęcherzyka żółciowego, oka, ucha, nosa, gardła, migdałków, jamy ustnej, węzłów chłonnych i układu limfatycznego oraz innych narządów.
Stosowane tu określenie „nowotwór złośliwy” obejmuje wszystkie postacie ludzkich raków, mięsaków i czerniaków występujących w postaci słabo zróżnicowanej, średnio zróżnicowanej i dobrze zróżnicowanej.
Dzięki wynalazkowi zostało spełnione istniejące w dziedzinie wynalazku zapotrzebowanie na sposoby leczenia, które mogą usuwać łagodne nowotwory z mniejszym ryzykiem i mniejszymi niepo58
PL 207 588 B1 żądanymi skutkami ubocznymi niż operacja chirurgiczna. Szczególnie potrzebna jest metoda usuwania łagodnych nowotworów w obszarach chirurgicznie ryzykownych, takich jak umiejscowione głęboko w organizmie (np. mózgu, sercu, p ł ucach i innych).
Sposób leczenia stanów, w których komórki muszą być usuwane, można stosować w połączeniu ze zwykłymi metodami leczenia takich stanów, takimi jak wycięcie chirurgiczne, chemioterapia i radioterapia. Pokrewne białko, pokrewny peptyd lub peptyd NTP można podawać przed, podczas lub po takim zwykłym leczeniu.
Leczonym stanem może być także rozrost lub przerost tkanki wybranej z grupy obejmującej tkankę płuca, sutka, żołądka, trzustki, prostaty, pęcherza, kości, jajnika, skóry, nerki, zatoki, okrężnicy, jelita, żołądka, odbytnicy, przełyku, krwi, mózgu i jego opon, rdzenia kręgowego i jego opon, mieśni, tkankę łączną, nadnerczy, przytarczyc, tarczycy, macicy, jądra, przysadki, narządów rozrodczych, wątroby, pęcherzyka żółciowego, oka, ucha, nosa, gardła, migdałków, jamy ustnej, węzłów chłonnych i układu limfatycznego.
Inne stany, które mogą być leczone obejmują wirusowo, bakteryjnie lub pasożytniczo zmienioną tkankę wybraną z grupy obejmującej tkankę płuc, sutka, żołądka, trzustki, prostaty, pęcherza, kości, jajnika, skóry, nerki, zatoki, okrężnicy, jelita, żołądka, odbytnicy, przełyku, krwi, mózgu i jego opon, rdzenia kręgowego i jego opon, mięśni, tkankę łączną, nadnerczy, przytarczyc, tarczycy, macicy, jądra, przysadki, narządów rozrodczych, wątroby, pęcherzyka żółciowego, oka, ucha, nosa, gardła, migdałków, jamy ustnej, węzłów chłonnych i układu limfatycznego.
Leczonym stanem może być także wada rozwojowa lub zaburzenie tkanki wybranej z grupy obejmującej tkankę płuc, sutka, żołądka, trzustki, prostaty, pęcherza, kości, jajnika, skóry, nerki, zatoki, okrężnicy, jelita, żołądka, odbytnicy, przełyku, krwi, mózgu i jego opon, rdzenia kręgowego i jego opon, mięśni, tkankę łączną, nadnerczy, przytarczyc, tarczycy, macicy, jądra, przysadki, narządów rozrodczych, wątroby, pęcherzyka żółciowego, oka, ucha, nosa, gardła, migdałków, jamy ustnej, węzłów chłonnych i ukł adu limfatycznego.
W szczególności leczonym stanem moż e być przerost migdałków, rozrost prostaty, łuszczyca, wyprysk, choroby skóry lub żylaki odbytu. Leczonym stanem może być choroba naczyniowa, taka jak miażdżyca tętnic lub stwardnienie tętnic lub choroba naczyniowa, taka jak żylaki kończyn. Leczonym stanem może być także kosmetyczna modyfikacja tkanki, takiej jak tkanka skóry, oka, ucha, nosa, gardła, ust, mięśni, tkanka łączna, włosów lub tkanka sutka.
W skład środków terapeutycznych mogą wchodzić pokrewne białka, pokrewne peptydy i/lub peptydy NTP. Takie środki mogą zawierać terapeutycznie skuteczną ilość pokrewnego białka, pokrewnego peptydu lub peptydu NTP w mieszaninie z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. Materiałem nośnikowym może być woda do zastrzyków, korzystnie uzupełniona innymi materiałami powszechnie stosowanymi w roztworach do podawania ssakom. Zazwyczaj pokrewne białko, pokrewny peptyd lub peptyd NTP do stosowania terapeutycznego będzie podawany w postaci środka zawierającego pokrewne białko, pokrewny peptyd lub peptyd NTP w połączeniu z jednym lub większą liczbą fizjologicznie dopuszczalnych nośników, zaróbek lub rozcieńczalników. Przykładami odpowiednich nośników jest obojętna buforowana sól fizjologiczna lub sól fizjologiczna zmieszana z albuminą surowiczą. Korzystnie produkt formułuje się jako liofilizat z użyciem odpowiednich zaróbek (np. sacharozy). Można dodawać inne znane nośniki, rozcieńczalniki i zaróbki, gdy jest to potrzebne. Środki zawierają znane fachowcom bufory o odpowiednim zakresie wartości pH, w tym bufor Tris o pH około 7,0-8,5 lub bufor octanowy o pH około 4,0-5,5, które ponadto mogą zawierać sorbitol lub jego odpowiedni zamiennik.
Możliwe jest także zastosowanie pokrewnych białek, pokrewnych peptydów lub peptydów NTP sprzężonych lub połączonych lub związanych z przeciwciałem, fragmentem przeciwciała, cząsteczką podobną do przeciwciała lub cząsteczką o dużym powinowactwie do specyficznego markera nowotworowego, takiego jak receptor komórkowy, peptyd sygnałowy lub nadeksprymowany enzym, w celu skierowania do niepożądanych elementów komórkowych. Przeciwciało, fragment przeciwciała, cząsteczkę podobną do przeciwciała lub cząsteczkę o dużym powinowactwie do specyficznego markera nowotworowego stosuje się w celu skierowania koniugatu pokrewnego białka, pokrewnego peptydu lub peptydu NTP do specyficznej docelowej komórki lub tkanki. Przykładowo, do nowotworu z charakterystycznym antygenem powierzchniowym lub eksprymującym ten antygen, może być skierowana wiążąca cząsteczka przeciwciała, fragmentu przeciwciała lub cząsteczka podobna do przeciwciała i komórki nowotworowe mogą być uśmiercone przez pokrewne białko, pokrewny peptyd lub peptyd NTP. Takie podejście z zastosowaniem ukierunkowanych przeciwciał ma przewidywalne zalety obejmujące
PL 207 588 B1 obniżenie dawki, zwiększenie prawdopodobieństwa wiązania i wchłaniania przez komórki docelowe oraz zwiększenie przydatności do lokalizowania i leczenia nowotworów przerzutowych i nowotworów o mikroskopowych rozmiarach.
Ponadto istotne jest zastosowanie pokrewnych białek, pokrewnych peptydów oraz peptydów NTP sprzężonych lub połączonych lub związanych z białkiem lub inną cząsteczką do wytwarzania środka, który po rozszczepieniu w miejscu lub w pobliżu miejsca (miejsc) nowotworu lub niepożądanych komórek, przez enzym lub proteazę specyficzne dla nowotworu lub przez koniugat przeciwciała, który jest kierowany do nowotworu lub innych niepożądanych komórek, uwalnia pokrewne białko, pokrewny peptyd lub peptyd NTP w miejscu lub w pobliżu miejsca (miejsc) lub niepożądanych komórek.
Istotne jest zastosowanie pokrewnych białek, pokrewnych peptydów i peptydów NTP sprzężonych lub połączonych lub związanych z białkiem lub inną cząsteczką do wytwarzania środka uwalniającego pokrewne białko, pokrewny peptyd lub peptyd NTP lub pewien biologicznie aktywny fragment pokrewnego białka, pokrewnego peptydu lub peptydu NTP po wystawieniu leczonej tkanki na światło (tak jak w terapii laserowej lub innej terapii fotodynamicznej lub fotoaktywowanej), inne postacie promieniowania elektromagnetycznego, takie jak promieniowanie podczerwone, ultrafioletowe, promieniowanie rentgenowskie lub promieniowanie γ, umiejscowione doprowadzenie ciepła, promieniowanie α lub β, emisję ultradźwię ków lub inne źródła zlokalizowanej energii.
Pokrewne białka, pokrewne peptydy lub peptydy NTP można stosować same, razem lub w połączeniu z innymi środkami farmaceutycznymi, takimi jak cytokiny, czynniki wzrostowe, antybiotyki, środki wywołujące apoptozę, środki przeciwzapalne i/lub środki chemioterapeutyczne, zależnie od wymagań dla leczonego wskazania
Można wytwarzać środki terapeutyczne zwierające pokrewne białka, pokrewne peptydy lub peptydy NTP stosując dendrymery, fulereny i inne syntetyczne cząsteczki, polimery i makrocząsteczki, przy czym pokrewne białko, pokrewny peptyd lub peptyd NTP i/lub odpowiadająca mu cząsteczka DNA jest sprzężona z, dołączona do lub zamknięta w cząsteczce, polimerze lub makrocząsteczce, indywidualnie albo razem z innymi rodzajami cząsteczek, takimi jak marker specyficzny dla nowotworu. Przykładowo, w opisie patentowym US 5714166, Bioactive and/or Targeted Dendimer Conjugates, opisano sposoby wytwarzania i stosowania, między innymi, dendrytycznych polimerów koniugatów składających się z co najmniej jednego ukierunkowanego dendrymeru i co najmniej jednego sprzężonego z nim ś rodka bioaktywnego.
Użyteczne są środki terapeutyczne zawierające pokrewne białka, pokrewne peptydy lub peptydy NTP i/lub geny oraz nośniki dostarczające leki, takie jak emulsje lipidowe, micele polimerów, mikrosfery polimerowe, polimery elektroaktywne, hydrożele i liposomy.
Możliwe jest również przeniesienie genów lub odpowiedników genów pokrewnych białek, pokrewnych peptydów lub peptydów NTP lub pokrewnych do niepożądanych komórek. Nadekspresję pokrewnego białka, pokrewnego peptydu lub peptydu NTP w nowotworze można wykorzystać do indukcji śmierci komórek w nowotworze, a zatem i zmniejszenia populacji komórek nowotworowych. Przewiduje się, że przeniesienie genu lub odpowiednika genu pokrewnego białka, pokrewnego peptydu lub peptydu NTP do leczenia niepożądanych elementów komórkowych ma zalety polegające na stosowaniu mniejszej dawki i przekazywaniu do komórek potomnych leczonych elementów komórkowych, co wywołuje rzadszą potrzebę stosowania terapii i ogólnie potrzebę stosowania mniejszej liczby terapii. Możliwe jest także przeniesienie genów kodujących białko fuzyjne zawierające pokrewne białko, pokrewny peptyd lub peptyd NTP do niepożądanych komórek lub komórek sąsiednich, w których po ekspresji genu i wytworzeniu i/lub wydzieleniu białka fuzyjnego, białko fuzyjne jest rozszczepiane przez natywne enzymy lub proteazy lub przez prolek z uwolnieniem pokrewnego białka, pokrewnego peptydu lub peptydu NTP w niepożądanych komórkach, na nich lub w ich pobliżu.
Możliwe jest również zastosowanie sklonowanych koniugatów pokrewne białko-, pokrewny peptyd- lub peptyd NTP-przeciwciało; sklonowanych zrekombinowanych koniugatów pokrewne białko-, pokrewny peptyd- lub peptyd NTP-fragment przeciwciała oraz sklonowanych zrekombinowanych koniugatów pokrewne białko-, pokrewny peptyd- lub peptyd NTP-białko podobne do przeciwciała. Korzyścią z zastosowania koniugatu sklonowanego pokrewnego białka, pokrewnego peptydu lub peptydu NTP połączonego z ukierunkowaną cząsteczką (taką jak przeciwciało, fragment przeciwciała, cząsteczka podobna do przeciwciała lub cząsteczka o dużym powinowactwie do nowotworowo-specyficznego receptora lub markera nowotworowego) jest to, że taka cząsteczka ma opisane powyżej zalety ukierunkowania w połączeniu z zaletami związanymi z wytwarzaniem i standaryzacją sklonowanej sprzężonej cząsteczki.
PL 207 588 B1
Stałe postacie dawkowane do podawania doustnego obejmują, ale nie wyłącznie, kapsułki, tabletki, pigułki, proszki i granulki. W takich stałych postaciach dawkowanych związek czynny korzystnie jest zmieszany z co najmniej jedną z poniższych substancji: (a) jedną lub większą liczbą obojętnych zaróbek (lub nośników), takich jak cytrynian sodu lub fosforan dwuwapniowy; (b) wypełniaczami lub rozcieńczalnikami, takimi jak skrobie, laktoza, sacharoza, glukoza, mannitol i kwas krzemowy; (c) środkami wiążącymi, takimi jak karboksymetyloceluloza, alginiany, żelatyna, poliwinylopirolidon, sacharoza i guma arabska; (d) środkami utrzymującymi wilgoć, takimi jak gliceryna; (e) środkami rozsadzającymi, takimi jak agar, węglan wapnia, skrobia ziemniaczana lub tapiokowa, kwas alginowy, pewne złożone krzemiany i węglan sodu; (f) środkami opóźniającymi rozpuszczanie, takimi jak parafina; (g) środkami przyspieszającymi wchłanianie, takimi jak czwartorzędowe związki amoniowe; (h) środkami zwilżającymi, takimi jak alkohol acetylowy i monostearynian glicerolu; (i) środkami adsorbującymi, takimi jak kaolin i bentonit; oraz (j) środkami poślizgowymi, takimi jak talk, stearynian wapnia, stearynian magnezu, stałe glikole polietylenowe, laurylosiarczan sodu lub ich mieszaninami. W przypadku kapsułek, tabletek i pigułek postaci dawkowane mogą także zawierać środki buforujące.
Ciekłe postacie dawkowane do podawania doustnego obejmują farmaceutycznie dopuszczalne emulsje, roztwory, zawiesiny, syropy i eliksiry. Oprócz związków czynnych, ciekłe postacie dawkowane mogą zawierać powszechnie stosowane obojętne rozcieńczalniki, takie jak woda lub inne rozpuszczalniki, środki rozpuszczające i emulgujące. Przykładowymi środkami emulgującymi są alkohol etylowy, alkohol izopropylowy, węglan etylu, octan etylu, alkohol benzylowy, benzoesan benzylu, glikol propylenowy, glikol 1,3-butylenowy, dimetyloformamid, oleje, takie jak olej bawełniany, olej arachidowy, olej kukurydziany, olej oliwkowy, olej rycynowy i olej sezamowy, gliceryna, alkohol tetrahydrofurfurylowy, glikol polietylenowy, estry kwasów tłuszczowych sorbitanu lub mieszaniny tych substancji itp.
Oprócz takich obojętnych rozcieńczalników, środek może także zawierać środki pomocnicze, takie jak środki zwilżające, środki emulgujące i suspendujące, słodzące, smakowo-zapachowe i aromatyzujące.
Rzeczywiste poziomy dawkowania substancji czynnych w środkach według wynalazku mogą się różnić aby uzyskać ilość peptydu NTP, która jest skuteczna do osiągnięcia wymaganej odpowiedzi terapeutycznej na konkretny środek i sposób podawania. Zatem wybrany poziom dawki zależy od wymaganego efektu terapeutycznego, drogi podawania, wymaganego czasu trwania leczenia i innych czynników.
W przypadku ssaków, w tym ludzi, skuteczną ilość można podawać w odniesieniu do powierzchni ciała. Wzajemną zależność dawek dla zwierząt różnej wielkości, gatunków oraz ludzi (w mg/m2 powierzchni ciała) opisano w E. J. Freireich i in., Cancer Chemother. Rep., 50 (4) : 219 (1966). Powierzchnię ciała można w przybliżeniu określić na podstawie wzrostu i masy osobnika (patrz np. Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardsley, NY. str. 537-538 (1970)).
Całkowita dzienna dawka pokrewnego białka, pokrewnego peptydu lub peptydu NTP podawana gospodarzowi może być dawką pojedynczą lub podzieloną. Środki w postaci jednostek dawkowanych mogą zawierać takie ilości takich ich podwielokrotności, które mogą być stosowane do pokrycia dziennej dawki. Należy jednak rozumieć, że konkretny poziom dawki dla danego konkretnego pacjenta będzie zależeć od wielu czynników, w tym masy ciała, ogólnego stanu zdrowia, płci, diety, czasu i drogi podawania, działania podawanego leku, szybkości wchłaniania i wydalania, połączenia z innymi lekami oraz ciężkości konkretnej leczonej choroby.
Sposób podawania środka według wynalazku zawierającego pokrewne białko, pokrewny peptyd lub peptyd NTP obejmuje, ale nie wyłącznie, podawanie związków domięśniowo, doustnie, dożylnie, śródotrzewnowo, śródmózgowo (śródmiąższowo), do komór mózgowych, donowotworowo, do miejsca objętego chorobą, śródskórnie, doodbytniczo, donosowo, doocznie, dotętniczo, domiejscowo, przezskórnie, w aerozolu, we wlewie, w zastrzyku uderzeniowym, we wszczepianym urządzeniu, układzie do przedłużonego uwalniania itd.
Innym sposobem podawania pokrewnego białka, pokrewnego peptydu lub peptydu NTP według wynalazku jest podawanie przezskórne. W szczególności można wytworzyć plaster z jednorodną zawiesiną pokrewnego białka, pokrewnego peptydu lub peptydu NTP, np. w dimetylosulfotlenku (DMSO) lub mieszaninie DMSO z olejem bawełnianym i doprowadzić do kontaktu ze skórą ssaków z nowotworem, z dala od miejsca umiejscowienia nowotworu wewnątrz uchyłka skórnego. Inne podłoża i ich mieszaniny z innymi rozpuszczalnikami i stałymi nośnikami będą nadawały się równie dobrze. Plaster może zawierać pokrewne białko, pokrewny peptyd lub peptyd NTP w postaci roztworu lub zawiesiny. Następnie plaster można nałożyć na skórę pacjenta, np. przez umieszczenie go w uchyłku skórnym
PL 207 588 B1 pacjenta utworzonym przez zagięcie i utrzymywanie skóry ze sobą za pomocą lepkich substancji, klipsów i urządzeń przytrzymujących. Ten uchyłek powinien być utworzony w taki sposób, aby zapewnić ciągły kontakt ze skórą bez wpływu na ssaka. Poza wykorzystaniem uchyłka skórnego można zastosować dowolne urządzenie, które umożliwia mocne umieszczenie plastra w kontakcie ze skórą. Przykładowo, aby utrzymać plaster w miejscu na skórze można zastosować bandaż przylepny.
Pokrewne białko, pokrewny peptyd lub peptyd NTP można podawać w preparacie lub środku o przedłużonym uwalnianiu. Odpowiednie przykłady preparatów o przedłużonym uwalnianiu obejmują półprzepuszczalne matryce w postaci ukształtowanych produktów, np. błon lub mikrokapsułek. Matryce o przedłużonym uwalnianiu obejmują poliestry, hydrożele, polilaktydy (US 3773919, EP 58481), kopolimery kwasu L-glutaminowego i etylo-L-glutaminianu (Sidman i in., Biopolymers, 22 : 547-556 [1983]), poli(2-hydroksyetylometakrylan) (Longer i in., J. Biomed. Mater. Res., 15 : 167-277 [1981] oraz Langer, Chem. Tech., 12 : 98-105 [1982]), octan etylenowinylu (Langer i in., jak wyżej) lub kwas poli-D(-)-3-hydroksymasłowy (EP 133988). Środki o przedłużonym uwalnianiu mogą także zawierać liposomy, które można wytworzyć dowolną z szeregu metod znanych w dziedzinie wynalazku (np. Eppstein i in., Proc. Natl Acad. Sci USA, 82 : 3688-3692 [1985]; EP 36676; EP 88046 oraz EP 143949).
Innym sposobem podawania pokrewnego białka, pokrewnego peptydu lub peptydu NTP według wynalazku jest bezpośredni lub pośredni wlew pokrewnego białka, pokrewnego peptydu lub peptydu NTP do guza lub innej leczonej tkanki. Jednym przykładem tego rozwiązania jest bezpośrednie wstrzyknięcie pokrewnego białka, pokrewnego peptydu lub peptydu NTP do guza lub innej leczonej tkanki. Leczenie może obejmować podanie pojedynczego zastrzyku, kilku zastrzyków wykonanych w jednym czasie lub serię zastrzyków wykonywanych w ciągu godzin, dni lub miesięcy z cofaniem się lub zniszczeniem nowotworu lub leczonej tkanki, co monitoruje się za pomocą biopsji, obrazowania i innymi metodami monitorującymi wzrost tkanki. Wstrzyknięcie do guza lub innej leczonej tkanki można wykonać za pomocą urządzenia umieszczonego w otworze, takim jak nos, jama ustna, ucho, pochwa, odbyt lub cewka moczowa lub przez nacięcie w celu dotarcia do guza lub tkanki in vivo i można je wykonywać w połączeniu z układem obrazowania lub optycznym, takim jak wskaźnik ultradźwiękowy lub z włókna optycznego, w celu zidentyfikowania odpowiedniego miejsca (miejsc) do wstrzyknięcia. Innym przykładem takiej postaci jest zastosowanie urządzenia, które może zapewnić stały wlew pokrewnego białka, pokrewnego peptydu lub peptydu NTP do tkanki przez pewien czas.
Innym sposobem podawania pokrewnego białka, pokrewnego peptydu lub peptydu NTP według wynalazku jest połączenie z chirurgiczną lub podobną procedurą stosowaną do fizycznego wycięcia, usunięcia lub uśmiercenia albo zniszczenia w inny sposób nowotworu lub innej tkanki lub elementów komórkowych, które są wymagane lub pożądane do usunięcia lub zniszczenia, przy czym pokrewne białko, pokrewny peptyd lub peptyd NTP według wynalazku podaje się do najbliższego obszaru(ów) otaczającego(ych) obszar(y), z którego nowotwór lub inna tkanka została usunięta w celu zniszczenia lub zahamowania wzrostu jakichkolwiek komórek nowotworowych lub innych elementów komórkowych nieusuniętych lub niezniszczonych w wyniku tej procedury.
Innym sposobem podawania pokrewnego białka, pokrewnego peptydu lub peptydu NTP według wynalazku jest wszczepienie urządzenia do guza lub innej leczonej tkanki. Jednym przykładem tego rozwiązania jest wszczepienie płatka zawierającego pokrewne białko, pokrewny peptyd lub peptyd NTP do guza lub innej leczonej tkanki. Płatek uwalnia terapeutyczną dawkę pokrewnego białka, pokrewnego peptydu lub peptydu NTP do tkanki przez pewien czas. Alternatywnie lub dodatkowo, preparat można podawać domiejscowo przez wszczepienie do dotkniętego obszaru błony, gąbki lub innego odpowiedniego materiału na którym zostało zaadsorbowane pokrewne białko, pokrewny peptyd lub peptyd NTP. Gdy stosuje się wszczepiane urządzenie, urządzenie to można wszczepiać do jakiejkolwiek odpowiedniej tkanki lub narządu i podawanie pokrewnego białka, pokrewnego peptydu lub peptydu NTP może być bezpośrednie przez urządzenie w porcjach lub przy podawaniu ciągłym lub przez cewnik z zastosowaniem ciągłego wlewu.
Alternatywnym sposobem podawania jest wprowadzenie jednej lub większej liczby kopii genu kodującego pokrewne białko, pokrewny peptyd lub peptyd NTP do docelowej komórki oraz, gdy jest to potrzebne, zaindukowanie kopii genu do rozpoczęcia wytwarzania pokrewnego białka, pokrewnego peptydu lub peptydu NTP wewnątrzkomórkowo. Jednym ze sposobów zastosowania terapii genowej jest zastosowanie genu kodującego pokrewne białko, pokrewny peptyd lub peptyd NTP (albo genomowego DNA, cDNA i/lub syntetycznego DNA kodującego pokrewne białko, pokrewny peptyd lub peptyd NTP lub jego fragment, wariant, homolog lub pochodną), który może być funkcjonalnie sprzężony z konstytutywnym lub indukowalnym promotorem z wytworzeniem konstruktu DNA do terapii
PL 207 588 B1 genowej. Promotor może być homologiczny lub heterologiczny względem endogennego genu kodującego pokrewne białko, pokrewny peptyd lub peptyd NTP, pod warunkiem, że jest on aktywny w komórce lub typie tkanki do którego konstrukt będzie wstawiony. Inne składniki konstruktu DNA do terapii genowej mogą dodatkowo zawierać, gdy jest to wymagane, cząsteczki DNA zaprojektowane do miejscowo specyficznej integracji (np. endogenne sekwencje flankujące użyteczne do homologicznej rekombinacji), tkankowo specyficzny promotor, wzmacniacz(e) lub wyciszacz(e), cząsteczki DNA zdolne do zapewnienia korzyści selektywności względem komórki wyjściowej, cząsteczki DNA użyteczne jako znaczniki do identyfikacji transformowanych komórek, układy negatywnej selekcji, komórkowo specyficzne środki wiążące (takie jak np. do ukierunkowania na komórkę), komórkowo specyficzne czynniki internalizujące oraz czynniki transkrypcyjne do wzmocnienia ekspresji przez wektor, a takż e czynniki do umoż liwienia wytwarzania wektora.
Sposoby dostarczania genu do komórki lub tkanki in vivo lub ex vivo obejmują (ale nie wyłącznie) bezpośrednie wstrzyknięcie nagiego DNA, metody balistyczne, transfer za pośrednictwem liposomów, transfer za pośrednictwem receptorów (kompleks ligand-DNA), elektroporację, wytrącanie fosforanem wapnia, jak ujawniono np. w opisie patentowym US 4970154, WO 96/40958, opisach patentowych US nr 5679559, 5676954 i 5593875. Obejmują one także zastosowanie wektora wirusowego, takiego jak retrowirus, adenowirus, wirus adenosatelitarny, wirus ospy, lentiwirus, wirus brodawczaka lub wirus opryszczki pospolitej, zastosowanie koniugatu DNA-białko oraz zastosowanie liposomu. Zastosowanie wektorów do terapii genowej opisano np. w opisach patentowych US nr 5672344, 5399346, 5631236 i 5635399.
Gen kodujący pokrewne białko, pokrewny peptyd lub peptyd NTP można dostarczać przez wszczepienie do pewnych komórek pacjenta, które poddano procedurom inżynierii genetycznej ex vivo, z zastosowaniem opisanych metod, aby eksprymowa ł y i wydzielał y pokrewne biał ko, pokrewny peptyd lub peptyd NTP, jego fragmenty, warianty, homologi lub pochodne. Takie komórki mogą być komórami zwierzęcymi lub ludzkimi i mogą pochodzić z własnej tkanki pacjenta lub z innego źródła, pochodzącego lub niepochodzącego od człowieka. Ewentualnie komórki mogą być nieśmiertelne lub mogą być komórkami macierzystymi. Jednakże, aby zmniejszyć szansę odpowiedzi immunologicznej, korzystne jest aby komórki były kapsułkowane aby zapobiec naciekaniu sąsiadujących tkanek. Zazwyczaj materiały kapsułkujące są biozgodnymi, półprzepuszczalnymi polimerycznymi otoczkami lub błonami, które umożliwiają uwalnianie produktu(ów) białkowego(ych), ale przeciwdziałają zniszczeniu komórek przez układ immunologiczny gospodarza lub przez inne czynniki szkodliwe z sąsiednich tkanek. Metody stosowane do membranowego kapsułkowania komórek są znane fachowcom i wytwarzanie kapsułkowanych komórek oraz wszczepienie ich pacjentom można przeprowadzić bez nadmiernych doświadczeń. Patrz np. opisy patentowe US nr 4892538, 5011472 i 5106627. Układ do kapsułkowania żywych komórek opisano w publikacji PCT WO 91/10425. Metody formułowania różnych innych materiałów do przedłużonego lub kontrolowanego podawania, takich jak nośniki liposomowe, biorozkładalne cząstki lub kulki, są także znane fachowcom i opisane w, np. opisie patentowym US 5653975. Komórki, z kapsułkowaniem lub bez kapsułkowania, można wszczepić do odpowiednich tkanek i narządów ciała pacjenta.
Poniżej opisano figury rysunku powołane w niniejszym opisie.
Figura 1: Przedstawia kompletną sekwencję aminokwasową i sekwencję kwasu nukleinowego genu AD7c-NTP i białkowego produktu AD7c-NTP tego genu (sekwencje 120 i 121 z opisów patentowych US nr 5830670, 5948634 i 5948888; de la Monte i in., J. Clin. Invest., 100 : 3093-3104 (1997); nr dostępu NCBI Entrez-Protein AAC08737; PID g3002527) [SEQ ID NO. 1].
Figura 2: Przedstawia kompletne sekwencje aminokwasowe 122-aminokwasowego białka włókienek neuronalnych (sekwencja 40 z opisów patentowych US nr 5830670, 5948634 i 5948888; nr dostępu NCBI Entrez-Protein AAE25447 PID g10048540) [SEQ ID NO. 2] („NTP-122”).
Figura 3: Przedstawia kompletne sekwencje aminokwasowe 112-aminokwasowego białka włókienek neuronalnych (nr dostępu NCBI Entrez-Protein XP-032307 PID g15928971) [SEQ ID NO. 3] („NTP-112”).
Figura 4: Przedstawia kompletne sekwencje aminokwasowe 106-aminokwasowego białka podobnego do białka włókienek neuronalnych (nr dostępu NCBI Entrez-Protein AAH14951 PID g15928971) [SEQ ID NO. 4] („NTP-106A”).
Figura 5: Przedstawia kompletne sekwencje aminokwasowe 106-aminokwasowego białka podobnego do białka włókienek neuronalnych (nr dostępu NCBI Entrez-Protein XP_039102 PID g18599339) [SEQ ID NO. 5] („NTP-106B”).
PL 207 588 B1
Figura 6: Przedstawia kompletne sekwencje aminokwasowe 98-aminokwasowego białka włókienek neuronalnych (sekwencja 30 z opisów patentowych US nr 5830670, 5948634 i 5948888; nr dostępu NCBI Entrez-Protein AAE25445, PID g10048538) [SEQ ID NO. 6] („NTP-98”).
Figura 7: Przedstawia kompletne sekwencje aminokwasowe 75-aminokwasowego białka włókienek neuronalnych (sekwencja 48 z opisów patentowych US nr 5830670, 5948634 i 5948888; nr dostępu NCBI Entrez-Protein AAE25448, PID g10048541) [SEQ ID NO. 7] („NTP-75”).
Figura 8: Przedstawia kompletne sekwencje aminokwasowe 68-aminokwasowego białka włókienek neuronalnych (sekwencja 36 z opisów patentowych US nr 5830670, 5948634 i 5948888; nr dostępu NCBI Entrez-Protein AAE25446, PID g10048539) [SEQ ID NO. 8] („NTP-66”).
Figura 9: Przedstawia kompletne sekwencje aminokwasowe 61-aminokwasowego białka podobnego do białka włókienek neuronalnych (nr dostępu NCBI Entrez-Protein AAH02534, PID g12803421) [SEQ ID NO. 9] („NTP-61”).
W odniesieniu do wynalazku można specjalnie powołać przykłady podane w publikacji US 20030054990, gdzie ujawniono, że całe białko AD7c-NTP jest skutecznym środkiem do wywoływania śmierci komórek zarówno in vitro w hodowlach komórek glejaka i nerwiaka niedojrzałego oraz in vivo w prawidł owej tkance mięśniowej, podskórnej tkance łącznej oraz skórze właś ciwej gryzoni oraz w wielu różnych nowotworach pochodzących i niepochodzących od ludzi, włącznie z rakiem sutka, rakiem i brodawczakiem skóry, rakiem jelita, glejakiem mózgu oraz w innych modelach gryzoni. Można tu wymienić przykłady podane w publikacji US 20030096350, gdzie ujawniono, że peptydy NTP są skutecznymi środkami do wywoływania śmierci komórek in vivo w prawidłowej tkance mięśniowej, podskórnej tkance łącznej, skórze właściwej oraz innych tkankach gryzoni.
W celu zilustrowania wynalazku podano poniż sze przykł ady.
P r z y k ł a d 1
Celem tego przykładu było określenie wpływu peptydu nr 6 na tkankę w miejscach wstrzyknięcia.
Samce szczura Sprague-Dawley (o masie 300 g) uśpiono eterem i podano peptyd NTP nr 6 we wlewie śródprostatowym po chirurgicznym uwidocznieniu prostaty. Zastrzyki zawierały 300 μΐ peptydu NTP nr 6, 1 mg/ml w PBS pH 7,4 (1,0 mg/kg) (n = 8), kontrolne zastrzyki zawierały samą PBS (n = 6) oraz przeprowadzono próby kontrolne bez wstrzykiwania (n = 2). Szczury bezboleśnie uśmiercono po 72 godzinach. Gruczoły prostaty wypreparowano, utrwalono w 10% buforowanej formalinie przez 24 godziny, zatopiono w parafinie, pocięto i wybarwiono H & E. W przypadku każdego zwierzęcia cały gruczoł prostaty zatopiono i pocięto. Wszystkie wybarwione przekroje zbadano histologicznie i zmierzono. Dla każdej prostaty badano co najmniej 4 przekroje histologiczne i dla każdego przekroju histologicznego zmierzono dwie średnice (D) przekroju poprzecznego pod kątem 90° względem siebie (całkowita liczba > 8 pomiarów na prostatę). Średnią średnicę z tych pomiarów dla każdej prostaty zastosowano do obliczenia objętości według wzoru:
Π D
V = — π\ — 3 I 2
Wyniki
Zmniejszenie objętości prostaty przez peptyd NTP nr 6 wstrzyknięty szczurom określono jako średnio 45% w porównaniu z próbami kontrolnymi (brak było zauważalnej różnicy pomiędzy próbą kontrolną z wstrzykiwaniem samej PBS, a próbami kontrolnymi bez wstrzykiwania). Traktowana prostata szczurza wykazywała rozległy zanik nabłonka gruczołu, spłaszczenie i atrofię. Otwarte wlewy 1,0 mg/kg peptydu NTP nr 6 w PBS pH 7,4 do szczurzej prostaty spowodowały oszacowane zmniejszenie objętości prostaty > 40% w porównaniu z kontrolymi zwierzętami nietraktowanymi i traktowanymi PBS, po 72 godzinach.
P r z y k ł a d 2
Celem tego przykładu było określenie wpływu peptydu NTP nr 7 na tkankę w miejscu wstrzyknięcia.
Czterem normalnym szczurom wstrzyknięto do skóry oraz podskórnie, za każdym razem do czterech różnych ognisk oraz do mięśnia szkieletowego kończyny, za każdym razem do dwóch różnych ognisk, peptyd NTP nr 7 w soli fizjologicznej w ilościach 100 - 400 ml w stężeniu 0,1-1 mg/ml za pomocą strzykawek z tworzywa sztucznego z igłami ze stali nierdzewnej o rozmiarze 26.
PL 207 588 B1
Zwierzęta obserwowano przez 24 godziny i bezboleśnie uśpiono po 24 godzinach. Poszczególne ogniska nacieku wycięto, utrwalono w 10% formalinie, zatopiono w parafinie i wybarwiono oraz zbadano znanymi metodami histopatologicznymi.
Kontrolne zwierzęta otrzymywały samą sól fizjologiczną.
Wyniki
Wstrzyknięcie peptydu NTP nr 7 spowodowało ostrą nekrozę tkanki w miejscach wstrzyknięcia. Nekroza była widoczna w tkance mięśniowej, podskórnej tkance łącznej i skórze właściwej w miejscach, w które wstrzyknięto peptyd NTP nr 7. Nekroza korelowała z obszarem wstrzyknięcia i nie wydawała się rozprzestrzeniać dalej niż miejsce wstrzyknięcia.
Poza łagodnymi obszarami zapalnymi, kontrolne zwierzęta wykazywały brak widocznej nekrozy lub utraty komórek. Zwierzęta kontrolne wykazywały brak lub minimalne zmiany mięśni. Kontrolne zastrzyki spowodowały łagodne do minimalnie ostrego zapalenie w miejscach wstrzyknięcia i ogniskowy krwotok wywołany igłą.
P r z y k ł a d 3
Celem tego przykładu było określenie wpływu pokrewnego peptydu nr 1 na tkankę w miejscach wstrzyknięcia.
Szczurom podano do skóry i podskórnie, jak w przykładzie 2 powyżej, pokrewny peptyd nr 1.
Zwierzęta obserwowano przez 24 godziny i bezboleśnie uśpiono po 24 godzinach. Tkanki wycięto, utrwalono w 10% formalinie, zatopiono w parafinie i wybarwiono oraz zbadano standardowymi metodami histopatologicznymi.
Próby kontrolne były takie same jak w przykładzie 2.
Wyniki
Wstrzyknięcie pokrewnego peptydu nr 1 wywołało śmierć komórek i nekrozę tkanki w miejscach wstrzyknięcia. Podobnie jak w przykładzie 2, śmierć komórek obserwowano w tkance mięśniowej, podskórnej tkance łącznej i skórze właściwej w miejscach, w które wstrzyknięto pokrewny peptyd nr 1.
Poza łagodnymi obszarami zapalnymi, kontrolne zwierzęta wykazywały minimalną nekrozę lub utraty komórek. Kontrolne zastrzyki spowodowały łagodne do minimalnie ostrego zapalenie w miejscach wstrzyknięcia i sporadyczny ogniskowy krwotok wywołany igłą.
P r z y k ł a d 4
Celem tego przykładu było określenie wpływu pokrewnego peptydu nr 2 na tkankę w miejscach wstrzyknięcia.
Samce szczura Sprague-Dawley (o masie 300 g) uśpiono eterem i podano pokrewny peptyd nr 2 we wlewie śródprostatowym po chirurgicznym uwidocznieniu prostaty. Zastrzyki zawierały 300 μl peptydu pokrewnego peptydu nr 2, 1 mg/ml w PBS pH 7,4. (1,0 mg/kg) (n = 8), kontrolne zastrzyki zawierały samą PBS (n = 6) oraz przeprowadzono próby kontrolne bez wstrzykiwania (n = 2). Szczury bezboleśnie uśmiercono po 72 godzinach. Gruczoły prostaty wypreparowano, utrwalano w 10% buforowanej formalinie przez 24 godziny, zatopiono w parafinie, pocięto i wybarwiono H & E. W przypadku każdego zwierzęcia cały gruczoł prostaty zatopiono i pocięto. Wszystkie wybarwione przekroje zbadano histologicznie i zmierzono. W przypadku każdej prostaty badano co najmniej 4 przekroje histologiczne i dla każdego przekroju histologicznego zmierzono dwie średnice (D) przekroju poprzecznego pod kątem 90° względem siebie (całkowita liczba > 8 pomiarów na prostatę). Średnią średnicę z tych pomiarów dla każdej prostaty zastosowano do obliczenia objętości według wzoru:
Π D V = —π\ —
I 2
Próby kontrolne były jak w przykładzie 1.
Wyniki
Tak jak w powyższym przykładzie 1 wstrzyknięcie pokrewnego białka nr 2 wywołało znaczną utratę komórek i atrofię w prostacie po 72 godzinach. Zwierzęta kontrolne wykazały brak zmian lub minimalne zmiany, obejmujące łagodne lokalne zapalenie wywołane igłą.
PL 207 588 B1
P r z y k ł a d 5
Celem tego przykładu było określenie wpływu pokrewnego peptydu nr 3 na tkankę w miejscu wstrzyknięcia.
Normalnym szczurom wstrzyknięto do prostaty, jak w powyższych przykładach 1 i 4, pokrewny peptyd nr 3. Szczury bezboleśnie uśpiono po 72 godzinach i zbadano ich gruczoły prostaty, jak w powyższych przykładach 1 i 4.
Wyniki
Znaczącą utratę komórek i atrofię prostaty stwierdzono po 72 godzinach w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi, u których zmiany były minimalne.

Claims (4)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Peptyd NTP o sekwencji aminokwasowej wybranej z grupy obejmującej:
    SEQ ID NO. 11 (Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Pro-Val-Ala-Gly)
    SEQ ID NO. 12 (Gly-Ala-Ile-Ser-Ala-His-Arg-Asn-Leu-Arg-Leu)
    SEQ ID NO. 13 (Phe-Phe-Leu-Val-Glu-Met)
    SEQ ID NO. 14 (Ser-Val-Thr-Gln-Ala-Gly-Val-Gln-Trp)
    SEQ ID NO. 15 (Ile-Asp-Gln-Gln-Val-Leu-Ser-Arg-Ile-Lys-Leu-Glu-Ile-Lys-Arg-Cys-Leu) oraz
    SEQ ID NO. 16 (Leu-Ser-Arg-Ile-Lys-Leu-Glu-Ile-Lys).
  2. 2. Peptyd NTP określony w zastrz. 1 do stosowania jako lek.
  3. 3. Środek zawierający substancję czynną oraz nośnik, znamienny tym, że jako substancję czynną zawiera peptyd określony w zastrz. 1.
  4. 4. Zastosowanie peptydu NTP określonego w zastrz. 1 do wytwarzania leku do leczenia stanu wymagającego usunięcia lub zniszczenia komórek, wybranego z grupy obejmującej łagodny lub złośliwy nowotwór tkanki, hiperplazję, przerost lub rozrost tkanki, wirusowo, bakteryjnie lub pasożytniczo zmienioną tkankę, wadę rozwojową tkanki, przerost migdałków, rozrost prostaty, łuszczycę, wyprysk, dermatozę, kosmetyczną modyfikację tkanki, chorobę naczyniową, hemoroidy, żylaki naczyń, miażdżycę tętnic lub stwardnienie tętnic, chorobę zapalną, chorobę autoimmunologiczną, chorobę metaboliczną, chorobę dziedziczną/genetyczną, chorobę urazową lub uraz fizyczny, chorobę wywołaną niedoborem pokarmowym, chorobę zakaźną, chorobę amyloidową, chorobę zwłóknieniową, chorobę spichrzeniową, wrodzoną wadę rozwojową, chorobę wywołaną niedoborem enzymatycznym, zatrucie, odurzenie, zwłaszcza alkoholem lub narkotykiem, chorobę środowiskową, chorobę popromienną, chorobę wewnątrzwydzielniczą, chorobę zwyrodnieniową.
PL368912A 2001-07-19 2002-07-19 Peptyd NTP, środek zawierający ten peptyd i zastosowanie tego peptydu PL207588B1 (pl)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US30616101P 2001-07-19 2001-07-19
US30615001P 2001-07-19 2001-07-19
US33147701P 2001-11-16 2001-11-16
PCT/CA2002/001106 WO2003008444A2 (en) 2001-07-19 2002-07-19 Peptides effective in the treatment of tumors and other conditions requiring the removal or destruction of cells

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL368912A1 PL368912A1 (pl) 2005-04-04
PL207588B1 true PL207588B1 (pl) 2011-01-31

Family

ID=27405149

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL368912A PL207588B1 (pl) 2001-07-19 2002-07-19 Peptyd NTP, środek zawierający ten peptyd i zastosowanie tego peptydu

Country Status (22)

Country Link
US (2) US7192929B2 (pl)
EP (2) EP1417228B1 (pl)
JP (4) JP4587667B2 (pl)
KR (2) KR101005130B1 (pl)
CN (1) CN100475843C (pl)
AT (1) ATE353914T1 (pl)
AU (2) AU2002319050B2 (pl)
BR (2) BRPI0211200B8 (pl)
CA (2) CA2453967C (pl)
CY (1) CY1108009T1 (pl)
DE (2) DE60218179T2 (pl)
DK (1) DK1417228T3 (pl)
EA (1) EA006603B1 (pl)
ES (2) ES2281529T3 (pl)
IL (2) IL159903A0 (pl)
MX (1) MXPA04000561A (pl)
NO (1) NO333999B1 (pl)
NZ (2) NZ531115A (pl)
PL (1) PL207588B1 (pl)
PT (1) PT1417228E (pl)
WO (2) WO2003008443A2 (pl)
ZA (1) ZA200401320B (pl)

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050245451A1 (en) * 2000-04-05 2005-11-03 Pincus Matthew R Peptides selectively lethal to malignant and transformed mammalian cells
CA2439757A1 (en) * 2001-03-08 2002-09-26 Nymox Pharmaceutical Corporation Methods of using neural thread proteins to treat tumors and other conditions requiring the removal or destruction of cells
US7271240B2 (en) 2001-03-14 2007-09-18 Agensys, Inc. 125P5C8: a tissue specific protein highly expressed in various cancers
IL159903A0 (en) * 2001-07-19 2004-06-20 Nymox Corp Peptides effective in the treatment of tumors and other conditions requiring the removal or destruction of cells
US7317077B2 (en) * 2001-11-16 2008-01-08 Nymox Pharmaceutical Corporation Peptides effective in the treatment of tumors and other conditions requiring the removal or destruction of cells
DE60234047D1 (de) * 2001-12-04 2009-11-26 Millenium Pharmaceuticals Inc 15603, ein mitglied der humanen ionenkanal-familie
EP1646648A2 (en) * 2003-07-15 2006-04-19 Genova Ltd. Secreted polypeptide species reduced in cardiovascular disorders
BRPI0412664A (pt) * 2003-07-15 2006-09-26 Ca Nat Research Council método para tratar uma condição caracterizada por hiperproliferação de células da pele em um indivìduo em risco ou portador dessa condição e utilização de uma quantidade terapeuticamente efetiva de um análogo cìclico de hormÈnio de paratireóide humano (hpth)
WO2005075647A1 (en) * 2004-02-06 2005-08-18 Nymox Corporation Humanized antibody
US20060173490A1 (en) 2005-02-01 2006-08-03 Boston Scientific Scimed, Inc. Filter system and method
JP2009528298A (ja) 2006-02-28 2009-08-06 ナイモックス コーポレーション 細胞の除去または破壊を必要とする腫瘍および他の状態の治療に有効なペプチド
WO2007104149A1 (en) * 2006-03-10 2007-09-20 Nymox Corporation Method of preventing or reducing the risk or incidence of cancer using neural thread protein based peptides
US20080027005A1 (en) * 2006-07-31 2008-01-31 Paul Averback Peptides effective in the treatment of tumors and other conditions requiring the removal or destruction of cells
ES2824684T3 (es) * 2007-10-25 2021-05-13 Toray Industries Inductor de la respuesta inmunitaria
JP5572938B2 (ja) * 2007-10-25 2014-08-20 東レ株式会社 免疫誘導剤
US9539327B2 (en) * 2007-11-26 2017-01-10 The Research Foundation For The State University Of New York Small molecule cancer treatments that cause necrosis in cancer cells but do not affect normal cells
US9662370B2 (en) * 2008-04-24 2017-05-30 Therimunex Pharmaceuticals, Inc. Peptidyl diacylglycerides
EP2621526B1 (en) 2010-09-29 2018-06-06 Agensys, Inc. Antibody drug conjugates (adc) that bind to 191p4d12 proteins
RU2016117275A (ru) 2013-11-01 2017-12-04 Сфериум Биомед С.Л. Тельца включения для трансдермальной доставки терапевтических и косметических средств
US20160215031A1 (en) * 2015-01-27 2016-07-28 Nymox Pharnaceutical Corporation Method of treating disorders requiring destruction or removal of cells
US20160361380A1 (en) 2015-06-12 2016-12-15 Nymox Corporation Combination compositions for treating disorders requiring removal or destruction of unwanted cellular proliferations
US11628202B2 (en) 2015-07-24 2023-04-18 Nymox Corporation Methods of reducing the need for surgery in patients suffering from benign prostatic hyperplasia
US10183058B2 (en) * 2016-06-17 2019-01-22 Nymox Corporation Method of preventing or reducing the progression of prostate cancer
US10172910B2 (en) * 2016-07-28 2019-01-08 Nymox Corporation Method of preventing or reducing the incidence of acute urinary retention
US10532081B2 (en) 2016-09-07 2020-01-14 Nymox Corporation Method of ameliorating or preventing the worsening or the progression of symptoms of BPH
US10335453B2 (en) 2017-03-01 2019-07-02 Nymox Corporation Compositions and methods for improving sexual function
US10835538B2 (en) 2018-03-28 2020-11-17 Nymox Corporation Method of treating benign prostatic hyperlasia with antibiotics
US20200061150A1 (en) 2018-08-23 2020-02-27 Nymox Corporation Method of inducing selective prostate glandular pharmaco-ablation with sparing of nerves and preservation of sexual function
US11278588B2 (en) 2019-05-13 2022-03-22 Nymox Corporation Method of treating lower urinary tract symptoms with fexapotide triflutate
US20200360466A1 (en) 2019-05-13 2020-11-19 Nymox Corporation Method of improving lower urinary tract symptoms
US11298400B2 (en) 2019-05-13 2022-04-12 Nymox Corporation Method of enhancing the therapeutic efficacy of fexapotide triflutate in treating LUTS
US11231421B2 (en) 2019-07-31 2022-01-25 Nymox Corporation Methods of treating multifocal cancer
US11331374B2 (en) 2019-07-31 2022-05-17 Nymox Corporation Focal treatment of prostate cancer

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5948634A (en) * 1988-12-21 1999-09-07 The General Hospital Coporation Neural thread protein gene expression and detection of alzheimer's disease
AU4837990A (en) * 1988-12-21 1990-07-10 General Hospital Corporation, The Method of detecting neurological disease or dysfunction
KR20000075748A (ko) * 1997-02-26 2000-12-26 마빈 씨. 구트리 알츠하이머 병의 치료 또는 예방에 유효한 약물을 선별하기 위한 유전자 변형동물 및 세포계
EP1089734A2 (en) * 1998-06-26 2001-04-11 Georgetown University Medical Center Use of tempo and tempo derivatives for inducing cell death
AU2185199A (en) * 1998-09-30 2000-04-17 Yoko Aida Apoptosis inducers
WO2000034477A2 (en) * 1998-12-11 2000-06-15 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Neuron-associated proteins
DK1143994T3 (da) * 1999-01-11 2003-10-20 Leadd Bv Anvendelse af apoptosis-fremkaldende midler ved fremstilling af et medikament til behandling af (auto)immunitetssygdomme
CA2364630A1 (en) * 1999-03-12 2000-09-21 Human Genome Sciences, Inc. 50 human secreted proteins
JP2002543764A (ja) 1999-03-19 2002-12-24 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド ４６個のヒト分泌タンパク質
CA2364209A1 (en) 1999-03-26 2000-10-26 Human Genome Sciences, Inc. 49 human secreted proteins
AU3769700A (en) * 1999-03-26 2000-10-16 Human Genome Sciences, Inc. 45 human secreted proteins
AU3765500A (en) * 1999-03-26 2000-10-16 Human Genome Sciences, Inc. 50 human secreted proteins
CN1300779A (zh) * 1999-12-22 2001-06-27 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽－人神经元线蛋白17和编码这种多肽的多核苷酸
CN1300783A (zh) 1999-12-23 2001-06-27 上海生元基因开发有限公司 新的人神经元线蛋白及其编码序列
US20020127671A1 (en) * 2000-06-26 2002-09-12 Curtis Rory A.J. 52927, a novel human calcium channel and uses thereof
US6783969B1 (en) * 2001-03-05 2004-08-31 Nuvelo, Inc. Cathepsin V-like polypeptides
US6924266B2 (en) * 2001-05-25 2005-08-02 Nymox Corporation NTP-peptides and method for removal of tumors
IL159903A0 (en) * 2001-07-19 2004-06-20 Nymox Corp Peptides effective in the treatment of tumors and other conditions requiring the removal or destruction of cells

Also Published As

Publication number Publication date
KR20040018481A (ko) 2004-03-03
NO20040222L (no) 2004-03-19
DE60218179T2 (de) 2007-11-22
EA200400205A1 (ru) 2004-06-24
CY1108009T1 (el) 2013-09-04
DK1417228T3 (da) 2007-06-04
JP2011152133A (ja) 2011-08-11
IL159903A0 (en) 2004-06-20
JP2005507647A (ja) 2005-03-24
MXPA04000561A (es) 2005-02-17
IL159903A (en) 2010-02-17
CA2453967A1 (en) 2003-01-30
JP2005506061A (ja) 2005-03-03
WO2003008443A2 (en) 2003-01-30
DE60218179D1 (de) 2007-03-29
WO2003008443A3 (en) 2003-11-27
US7192929B2 (en) 2007-03-20
EA006603B1 (ru) 2006-02-24
ATE353914T1 (de) 2007-03-15
EP1417228A2 (en) 2004-05-12
AU2002319050B2 (en) 2008-09-11
DE60217507D1 (de) 2007-02-22
KR20040026686A (ko) 2004-03-31
AU2002319049B2 (en) 2007-10-25
BRPI0211200B8 (pt) 2021-07-27
ES2281529T3 (es) 2007-10-01
NZ531115A (en) 2005-03-24
CN1649895A (zh) 2005-08-03
JP2013215191A (ja) 2013-10-24
US7241738B2 (en) 2007-07-10
NZ531114A (en) 2006-12-22
JP5622885B2 (ja) 2014-11-12
ES2281528T3 (es) 2007-10-01
KR101005130B1 (ko) 2011-01-04
WO2003008444A2 (en) 2003-01-30
US20030109437A1 (en) 2003-06-12
CN100475843C (zh) 2009-04-08
EP1417227B1 (en) 2007-01-10
DE60217507T2 (de) 2007-11-15
WO2003008444A3 (en) 2003-11-20
PT1417228E (pt) 2007-05-31
BR0211199A (pt) 2004-10-26
BRPI0211200B1 (pt) 2020-03-17
EP1417228B1 (en) 2007-02-14
US20030096756A1 (en) 2003-05-22
ZA200401320B (en) 2005-01-26
CA2453965C (en) 2016-01-19
CA2453967C (en) 2014-01-07
NO333999B1 (no) 2013-11-11
PL368912A1 (pl) 2005-04-04
CA2453965A1 (en) 2003-01-30
JP4587667B2 (ja) 2010-11-24
BR0211200A (pt) 2004-09-28
EP1417227A2 (en) 2004-05-12
KR100966232B1 (ko) 2010-06-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8569446B2 (en) Peptides effective in the treatment of tumors and other conditions requiring the removal or destruction of cells
AU2002319050B2 (en) Peptides effective in the treatment of tumors and other conditions requiring the removal or destruction of cells
AU2002319049A1 (en) Peptides effective in the treatment of tumors and other conditions requiring the removal or destruction of cells
US6924266B2 (en) NTP-peptides and method for removal of tumors
AU2002319050A1 (en) Peptides effective in the treatment of tumors and other conditions requiring the removal or destruction of cells
CN114099636A (zh) 使用来源于神经丝蛋白的肽治疗需要破坏或移除细胞的病症的方法
AU2002256587A1 (en) Peptides derived from neural thread proteins and their medical use
EP1714979A2 (en) Peptides effective in the treatment of tumors and other conditions requiring the removal or destruction of cells
EP1847550A2 (en) Peptides effective in the treatment of tumors and other conditions requiring the removal or destruction of cells