DE60121146T2

DE60121146T2 - Anti-angiogenic properties of matin and of fragments or variants thereof

Info

Publication number: DE60121146T2
Application number: DE60121146T
Authority: DE
Inventors: Raghuram Boston KALLURI
Original assignee: Beth Israel Deaconess Medical Center Inc; Beth Israel Hospital Association
Current assignee: Beth Israel Deaconess Medical Center Inc
Priority date: 2000-03-29
Filing date: 2001-03-28
Publication date: 2007-05-31
Anticipated expiration: 2021-03-29
Also published as: JP2003528610A; EP1268783A2; WO2001073033A2; EP1268783B9; ATE331785T1; DE60121146D1; CA2403857A1; AU4599401A; NZ521625A; EP1268783B1; US20030108540A1; WO2001073033A3; US20080167227A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Basalmembranen sind dünne Schichten einer spezialisierten extrazellulären Matrix, die eine Stützstruktur bieten, auf der Epithel- und Endothelzellen wachsen, und die Muskeln oder Fett umgeben (Paulsson, M., 1992, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 27: 93–127). Basalmembranen sind immer mit Zellen assoziiert und es ist schon gut dokumentiert worden, dass Basalmembranen nicht nur eine mechanische Stütze bieten, sondern auch das Zellverhalten, wie beispielsweise die Differenzierung und Proliferation, beeinflussen. Vaskulare Basalmembranen bestehen aus Makromolekülen, wie Collagen, Laminin, Heparansulfatproteoglykanen, Fibronectin und Nidogen (auch Entactin genannt) (Timpl, R., 1996, Curr. Opin. Cell. Biol. 8: 618–624).
Die Angiogenese ist der Vorgang der Bildung neuer Blutgefäße aus solchen, die schon vorhanden sind (Madri, J. A. et al., 1986, J. Histochem. Cytochem. 34: 85–91; Folkman, J., 1972, Ann. Surg. 175: 409–416). Die Angiogenese ist ein komplizierter Vorgang, der das Entwickeln und die Migration von Endothelzellen, die Proliferation dieser Zellen und ihre Differenzierung zu röhrenartigen Strukturen und die Bildung einer Basalmembranmatrix um das sich entwickelnde Blutgefäß herum erfordert. Außerdem ist die Angiogenese ein Prozess, der für normale physiologische Vorgänge, wie die Wundheilung und die Remodellierung des Endometriums, kritisch ist (Folkman, J. et al., 1995, J. Biol. Chem. 267: 10931–10934). Es ist inzwischen gut dokumentiert, dass eine Angiogenese zur Metastase und zum Wachstum kompakter Tumoren einer Größe von mehr als einiger weniger mm³ erforderlich ist (Folkman, J., 1972, Ann. Surg. 175: 409–416; Folkman, J., 1995, Nat. Med. 1: 27–31). Die Ausdehnung der Tumormasse erfolgt nicht nur durch die Perfusion von Blut durch den Tumor, sondern auch durch parakrine Stimulierung der Tumorzellen durch mehrere Wachstumsfaktoren und Matrixproteine, die durch das neue Kapillarendothel gebildet werden (Folkman, J., 1995, Nat. Med. 1: 27–31). Kürzlich sind eine Anzahl von Inhibitoren identifiziert worden, nämlich Angiostatin (O'Reilly, M. S. et al., 1994, Cell 79: 315–28), Endostatin (O'Reilly, M. S. et al., 1997, Cell 88: 277–85) Restin (Ramchandran, R. et al., 1999, Biochem. Biophys. Res. Commun. 255: 735–9), Arrestin (Colorado, P. C. et al., 2000, Cancer Res. 60: 2520–6), Canstatin (Kamphaus, G. D. et al., 2000, J. Biol Chem., 275: 1209–15) und Tumstatin (Maeshima, Y. et al., 2000, J. Biol. Chem. 275: 21340–8; Maeshinia, Y. et al., 2000, J. Biol. Chem. 275: 23745–50) und von Pigmentepithel derivierter Faktor (PEDF) (Dawson, D. W. et al., 1999, Science 285: 245–8).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Protein, das aus den Aminosäuren 2132 bis 2338 oder aus den Aminosäuren 2132 bis 3084 der SEQ ID NO. 2 besteht, oder ein Fragment davon, das mindestens 25 aufeinander folgende Aminosäuren des Proteins umfasst, oder eine Variante des Proteins mit mindestens 70% Sequenzidentität mit diesem; wobei das Protein, die Variante oder das Fragment anti-angiogene Aktivität aufweist; unter der Voraussetzung, dass die Variante nicht die Sequenz aufweist, die als SEQ ID NO. 113 des WO 00/56754 dargestellt ist.
Die vorliegende Erfindung umfasst ein Protein (hier als „Matin" bezeichnet), das aus der G1-Domäne der α1-Kette von Laminin besteht. Das Laminin stammt bevorzugt aus Säugern.
Die vorliegende Erfindung umfasst Proteine, Fragmente und Varianten aus den anderen G-Domänen von Laminin, die innerhalb des Schutzumfangs von Anspruch 1 liegen.
Bevorzugte Varianten der vorliegenden Erfindung weisen mindestens 80% oder mindestens 90% Sequenzidentität mit den Aminosäuren 2132 bis 2338 oder den Aminosäuren 2132 bis 3084 der SEQ ID NO. 2 auf.
Das Protein, Fragment oder die Variante können in monomerer oder in multimerer (d.h. dimerer oder trimerer) Form vorliegen.
Ebenfalls innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung ist ein chimäres Protein (auch als Fusionsprotein bekannt), das das Protein, Fragment oder die Variante desselben umfasst, unter der Voraussetzung, dass es sich dabei nicht um ein Fusionsprotein von Glutathion-S-Transferase und der G1-, G2-, G3-, G4- oder G5-Domäne der menschlichen Laminin-α3-Kette handelt.
Bevorzugt umfasst das chimäre Protein mindestens ein Proteinmolekül, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus: Vascostatin oder Fragmenten davon, Arrestin oder Fragmenten davon, Canstatin oder Fragmenten davon, Tumstatin oder Fragmenten davon, Endostatin oder Fragmenten davon, Angiostatin oder Fragmenten davon, Restin oder Fragmenten davon, Apomigren oder Fragmenten davon oder anderen anti-angiogenen Proteinen oder Fragmenten davon besteht.
(Vascostatin umfasst die C-terminale Domäne von Nidogen und weist anti-angiogene Eigenschaften auf, Vascostatin ist in der internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/US01/40382 mit dem Titel „Anti-angiogenic and Anti-tumor Properties of Vascostatin and Other Nidogen Domains" von Raghuram Kalluri, eingereicht am 28. März 2001, beschrieben.)
Die Erfindung beinhaltet auch ein Polynukleotid, das das Protein, Fragment, die Variante oder das chimäre Protein der vorliegenden Erfindung kodiert.
Das Polynukleotid kann funktionsfähig an eine Expressionskontrollsequenz angeknüpft sein. Das Polynukleotid kann isoliert sein.
Ein erfindungsgemäßes Polynukleotid kann durch ein Verfahren hergestellt werden, umfassend

(a) die Herstellung einer oder mehrerer Polynukleotidsonden, die unter Bedingungen moderater oder hoher Stringenz an ein erfindungsgemäßes Polynukleotid hybridisieren;
(b) das Hybridisieren der Sonde(n) an Säuger-DNA; und
(c) das Isolieren des mit der/den Sonde(n) nachgewiesenen DNA-Polynukletoids, wobei die Nukleotidsequenz des isolierten Polynukleotids mit der Nukleotidsequenz des erfindungsgemäßen Polynukleotids korrespondiert.

Das Polynukleotid kann eine Subsequenz von SEQ ID NO. 1 sein. Beispielsweise kann es der Sequenz entsprechen, die sich etwa von deren Nukleotid 6442 bis etwa Nukleotid 7062 erstreckt, etwa von deren Nukleotid 7054 bis etwa Nukleotid 7599, etwa von deren Nukleotid 7600 bis etwa Nukleotid 8283, etwa von deren Nukleotid 8284 bis etwa Nukleotid 8685 oder etwa von deren Nukleotid 8686 bis etwa Nukleotid 9300.
Ein erfindungsgemäßes Polynukleotid kann (mit oder ohne funktionsfähiger Verknüpfung an eine Expressionskontrollsequenz) zum Transformieren einer Wirtszelle verwendet werden. Die Wirtszelle kann aus der Gruppe ausgewählt werden umfassend Bakterien-, Hefe-, Säuger-, Insekten- oder Pflanzenzellen, unter der Voraussetzung, dass die Wirtszelle nicht Teil eines menschlichen Embryos ist. Aus diesem Grund umfasst die vorliegende Erfindung eine Wirtszelle, wie beispielsweise eine Bakterien-, Hefe-, Säuger-, Insekten- oder Pflanzenzelle, die mit einem erfindungsgemäßen Polynukleotid transformiert worden ist, unter der Voraussetzung, dass die Wirtszelle nicht Teil eines menschlichen Embryos ist.
Die Polynukleotid- oder Wirtszelle kann in der Medizin verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst die Verwendung des Polynukleotids bei der Zubereitung einer therapeutischen Säugerzelle für die Behandlung eines Säugers, der an einer Beschwerde, wie oben beschrieben, leidet, wobei die Zubereitung das Behandeln einer Säugerzelle in vitro zum Insertieren des Polynukleotids darin umfasst, unter der Vorraussetzung, dass die Zelle nicht Teil eines menschlichen Embryos ist.
Die Säugerzelle kann aus der Gruppe ausgewählt werden bestehend aus: Blutzellen, TIL-Zellen, Knochenmarkzellen, Gefäßzellen, Tumorzellen, Leberzellen, Muskelzellen, Fibroblastzellen. Das Polynukleotid kann in die Zellen durch einen viralen Vektor insertiert werden.
Die Zelle kann eine transiente Expression erlauben.
Säugerwirtszellen können bei einem Vorgang zum Versorgen eines Säugers mit einem anti-angiogenen Protein verwendet werden, wobei die Säugerzellen in vivo innerhalb des Säugers eine therapeutisch wirksame Menge des anti-angiogenen Proteins in einer Menge exprimieren, die ausreicht, um die angiogene Aktivität in dem Säuger zu hemmen.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch eine pharmazeutische oder empfängnisverhütende Zusammensetzung umfassend ein Protein, Fragment, eine Variante, ein monomeres, multimeres oder chimäres Protein der vorliegenden Erfindung.
Die Zusammensetzung kann einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen.
Sie kann mindestens ein Proteinmolekül umfassen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Vascostatin oder Fragmenten davon, Arrestin oder Fragmenten davon, Canstatin oder Fragmenten davon, Tumstatin oder Fragmenten davon, Endostatin oder Fragmenten davon, Angiostatin oder Fragmenten davon, Restin oder Fragmenten davon, Apomigren oder Fragmenten davon oder anderen anti-angiogenen Proteinen oder Fragmenten davon.
Die vorliegende Erfindung umfasst des Weiteren das Fragment, die Variante, das monomere, multimere, chimäre Protein und die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung zur Verwendung in der Medizin.
Das Fragment, die Variante, das monomere, multimere, chimäre Protein und die Zusammensetzung können zum Kontaktieren von Säugergewebe verwendet werden und können daher bei der Behandlung von Säugern verwendet werden.
Das Protein, Fragment, die Variante, das monomere, multimere, chimäre Protein oder die Zusammensetzung können bei der Zubereitung eines Medikaments zur Behandlung einer krankhaften Störung, die die Angiogenese involviert, verwendet werden.
Die krankhafte Störung kann Krebs sein. Sie kann Tumorwachstum involvieren.
Die vorliegende Erfindung umfasst die Verwendung eines Proteins, Fragments, einer Variante, eines monomeren, multimeren oder chimären Proteins oder einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung bei der Zubereitung eines Medikaments zum Behandeln einer krankhaften Störung, die die Endothelzellenproliferation involviert.
Die vorliegende Erfindung umfasst des Weiteren die Verwendung des Proteins, Fragments, der Variante, des monomeren, multimeren, chimären Proteins oder der Zusammensetzung bei der Zubereitung eines Medikaments zum Behandeln einer krankhaften Störung ausgewählt aus der Gruppe umfassend Angiogenese-abhängige Krebsarten, gutartige Tumoren, rheumatoide Arthritis, diabetische Retinopathie, Fibrose, Psoriasis, okulare Angiogeneseerkrankungen, Osler-Webber-Syndrom, Herzmuskelangiogenese, Plaqueneovaskularisierung, Telangiectasie, Blutergelenke, Angiofibrome, Wundgranulation, Darmverklebungen, Artheriosklerose, Scleroderma, hypertrophe Narben, Katzenkratzerkrankung, Heliobacter pylori-Geschwüre, vaskuläre Dialysepfropfzugangsstenose und Fettleibigkeit.
Das Protein, Fragment, die Variante, das monomere, multimere, chimäre Protein oder die Zusammensetzung können mit einem radiotherapeutischen, chemotherapeutischen oder immuntherapeutischen Mittel zur gleichzeitigen, aufeinander folgenden oder getrennten Verwendung in einer Anti-Krebstherapie kombiniert werden.
Außer den verschiedenen oben besprochenen Ausgestaltungen umfasst die vorliegende Erfindung auch das Protein, Fragment, die Variante, das monomere, multimere, chimäre Protein, das Polynukleotid oder die Wirtszelle in isolierter Form.
Eine erfindungsgemäße Wirtszelle kann zur Herstellung eines Proteins, Fragments, einer Variante, eines monomeren, multimeren oder chimären Proteins gemäß der Erfindung mit folgenden Schritten verwendet werden:

a) das Anziehen der Wirtszelle in Kultur und
b) das Aufreinigen eines Proteins, Fragments, einer Variante, eines monomeren, multimeren oder chimären Proteins, das von dem Polynukleotid innerhalb der Wirtszelle kodiert wird, aus der Kultur.

Beispielsweise kann das Verfahren umfassen: (a) das Anziehen einer Kultur einer Wirtszelle, die mit dem Polynukleotid des Nukleotids 6442 bis Nukleotid 7062 der SEQ ID NO. 1 transformiert ist, wobei die Wirtszelle aus der Gruppe ausgewählt wird umfassend Bakterien-, Hefe-, Säuger-, Insekten- oder Pflanzenzellen; und (b) das Aufreinigen des Proteins aus der Kultur, so dass ein anti-angiogenes Polypeptid erzeugt wird. Alternativ kann das Polynukleotid beispielsweise auch etwa dem Nukleotid 7054 bis etwa Nukleotid 7599, Nukleotid 7600 bis etwa Nukleotid 8283, Nukleotid 8284 bis etwa Nukleotid 8685 oder Nukleotid 8686 bis etwa Nukleotid 9300 entsprechen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1A, 1B, 1C, 1D, 1E, 1F, 1G, 1H, 1I und 1J sind ein Diagramm, das die Sequenzen des Nukleotids (SEQ ID NO. 1) und der Aminosäure (SEQ ID NO. 2) der fünf globulären Domänen (G1, G2, G3, G4 und G5) der α1-Kette von Laminin-1 (GenBank Zugang Nr. NM_008480) darstellt. Die Vorwärts-Primer sind fett gedruckt mit einfacher Unterstreichung dargestellt, und reverse Primer sind mit doppelter Unterstreichung dargestellt. Die globuläre Domäne 1 (G1) erstreckt sich von etwa Nukleotid 6442 bis etwa Nukleotid 7062 und von etwa Aminosäure 2132 bis etwa Aminosäure 2338. Der für die G1-Domäne verwendete Vorwärts-Primer war 5'-CGG-GAT-CCT-AGA-GAC-TGC-ATC-CGC-GCC-TAT-3' (SEQ ID NO. 3), und der reverse Primer war
Die globuläre Domäne 2 (G2) erstreckt sich von etwa Nukleotid 7054 bis etwa Nukleotid 7599 und von etwa Aminosäure 2336 bis etwa Aminosäure 2517. Der für die G2-Domäne verwendete Vorwärts-Primer war 5'-CGG-GAT-CCT-CAG-ATA-GTA-ATT-CTC- TTC-AGC-ACC-3' (SEQ ID NO. 5), und der reverse Primer war
Die globuläre Domäne 3 (G3) erstreckt sich von etwa Nukleotid 7600 bis etwa Nukleotid 8283 und von etwa Aminosäure 2518 bis etwa Aminosäure 2745. Der für die G3-Domäne verwendete Vorwärts-Primer war 5'-CGG-GAT-CCT-CTG-CTG-GCC-ACA-TTC-GCC-A-3' (SEQ ID NO. 7), und der reverse Primer war
Die globuläre Domäne 4 (G4) erstreckt sich von etwa Nukleotid 8284 bis etwa Nukleotid 8685 und von etwa Aminosäure 2746 bis etwa Aminosäure 2879. Der für die G4-Domäne verwendete Vorwärts-Primer war 5'-CGG-GAT-CCT-CTC-CAG-GTG-CAG-CTG- AGC-ATT-3' (SEQ ID NO. 9), und der reverse Primer war
Die globuläre Domäne 5 (G5) erstreckt sich von etwa Nukleotid 8686 bis etwa Nukleotid 9300 und von etwa Aminosäure 2880 bis etwa Aminosäure 3084. Der für die G5-Domäne verwendete Vorwärts-Primer war 5'-CGG-GAT-CCT-CTG-GAT-AAA-GAC-AGG-CCC-TTG-3' (SEQ ID NO. 11), und der reverse Primer war

Die unterstrichenen Abschnitte der oben genannten Primer entsprechen der Lamininsequenz.
2 ist ein schematisches Diagramm, das den Matin-Klonierungsvektor pET22b(+) darstellt. Der Vorwärts- (SEQ ID NO. 3) und der reverse Primer (SEQ ID NO. 4) sowie die Stelle, in die Matin eingeklont wurde, sind gekennzeichnet.
3A und 3B sind Histogramme, die die Auswirkung variierender Konzentrationen von Matin (x-Achse) auf die Proliferation von Endothel-(C-PAE)Zellen (3A) und von Nicht-Endothel-(PC-3)Zellen (3B) zeigen. Die Proliferation wurde als Funktion der Methylen-Blaufärbung gemessen.
4 ist eine Kurve, die die Annexin-V-Fluoreszenz für Zellen, die mit Matin behandelt wurden, im Vergleich zu Kontrollen zeigt.
5A und 5B sind ein Paar von Balkendiagrammen, die die Caspase-3-Aktivität in Matin-behandelten CPAE-Zellen (5A) im Vergleich zu PC-3-Zellen (5B) zeigen.
6A und 6B sind ein Paar von Histogrammen, die die Zellviabilität bei steigenden Konzentrationen von Matin (x-Achse) in Abhängigkeit von OD₅₉₀ (y-Achse) in einem MTT-Apoptose-Assay für CPAE-Zellen (6A) im Vergleich zu PC-3-Zellen (6B) zeigen. Jeder Punkt stellt den Mittelwert +/– die Standardabweichung des Mittelwerts für Triplikat-Vertiefungen dar.
7 ist ein Liniendiagramm, das die Wirkung auf die Tumorgröße (mm³, y-Achse) zu Behandlungstagen (x-Achse) mit 20 mg/ml Matin (
) gegenüber Kontrollen (20 mg/ml Nephrin (O) und PBS (☐)) zeigt.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Eine umfangreiche Reihe verschiedener Krankheiten werden durch unerwünschte Angiogenese verursacht. Anders ausgedrückt könnten viele Krankheiten und unerwünschte Gesundheitszustände verhindert oder gemildert werden, wenn es möglich wäre, das Wachstum und die Ausdehnung von Kapillarblutgefäßen unter gewissen Bedingungen, zu gewissen Zeiten oder in spezifischen Geweben aufzuhalten.
Die Bildung neuer Kapillaren aus schon vorhandenen Gefäßen, also die Angiogenese, ist für den Vorgang des Tumorwachstums und der Metastase unerlässlich (Folkman, J. et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 10931–10934; Folkman, J., 1995, Nat. Med. 1: 27–31; Hanahan, D. et al., 1996, Cell 86: 353–364). Menschliche und tierische Tumore werden zu Beginn nicht vaskularisiert, wenn ein Tumor über einige wenige mm³ hinaus wächst, so kann er jedoch vaskularisieren (Folkman, J., 1995, Nat. Med. 1: 27–31; Hanahan, D. et al., 1996, Cell 86: 353–364). Der Übergang zu einem angiogenen Phänotyp erfordert sowohl die Aufregulierung von angiogenen Stimulatoren und die Herunterregulierung von Angiogenese-Inhibitoren (Folkman, J., 1995, Nat. Med. 1: 27–31). Der vaskulare Endothelwachstumsfaktor (VEGF) und der Basisfibroblastwachstumsfaktor (bFGF) sind die am häufigsten exprimierten angiogenen Faktoren in Tumoren. Vaskularisierte Tumore können einen oder mehrere dieser angiogenen Faktoren überexprimieren, wodurch das Tumorwachstum synergistisch unterstützt wird. Das Hemmen eines einzigen angiogenen Faktors, wie beispielsweise VEGF, mit einem Rezeptoragonisten ist eventuell nicht ausreichend, das Tumorwachstum aufzuhalten. Eine Anzahl von Angiogeneseinhibitoren sind vor Kurzem identifiziert worden und gewisse Faktoren wie beispielsweise ein IFN-α, Plättchenfaktor-4 (Maione, T. E. et al., 1990, Science 247: 77–79) und PEX (Brooks, P. C. et al., 1998, Cell 92: 391–400) werden nicht endogen mit Tumorzellen assoziiert, während Angiostatin (O'Reilly, M. S. et al., 1994, Cell 79: 315–328) und Endostatin (O'Reilly, M. S. et al., Cell 88: 277–285) tumorassoziierte Angiogeneseinhibitoren sind, die durch das Tumorgewebe selbst gebildet werden. Obwohl die Behandlung von Tumorwachstum und -metastase mit diesen endogenen Angiogeneseinhibitoren sehr wirksam ist und eine reizvolle Idee darstellt, müssen einige potentielle Probleme, die mit der anti-angiogenen Therapie verbunden sind, in Betracht gezogen werden. Eine verzögerte Toxizität, die durch chronische anti-angiogene Therapie hervorgerufen wird, sowie die Möglichkeit gestörter Wundheilung und reproduktiver Angiogenese, die während der Behandlung auftreten, müssen ernstlich in Betracht gezogen werden.
Bei der vorliegenden Erfindung werden ein Protein und Fragmente, Analoge, Derivate, Homologe und Mutanten desselben mit anti-angiogenen Eigenschaften zusammen mit Verfahren zur Verwendung dieses Proteins, der Analoge, Derivate, Homologe und Mutanten zum Hemmen von durch Angiogenese vermittelten proliferativen Krankheiten beschrieben. Das Protein umfasst die G1-Domäne der α1-Kette von Laminin und wird „Matin" genannt. Dieses Protein beträgt etwa 30 Dieses Protein beträgt circa 20 kDa und hemmt die Endothelzellenproliferation.
Laminin ist das am meisten vorkommende, nicht kollagene Protein, das in Basalmembranen auftritt. Es wurde erstmals aus EHS-(Engelbreth-Holm-Swarm)Tumoren in Mäusen und aus der embryonalen Karzinom-Zellinie in Mäusen M1536-B3 ausgereinigt. Diese onkogenen Quellen erzeugen große Mengen leicht extrahierbarer Basalmembran-ähnlichen Substanz, und die früheste Forschung an diesen Bausteinen der Basalmembran verwendeten diese Tumorlinien als Quellen, statt natürlich auftretender Basalmembranen. Für die Muster der Genexpression ist jedoch bekannt, dass sie sich zwischen onkogenen und natürlich auftretenden Geweben unterscheidet.
Laminin ist ein Protein mit mehreren Domänen (Paulsson, M., 1992, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 27: 93–127), mit drei einzelnen Polypeptidketten, α, β1 und β2, die durch Disulfid-Bindungen zu einer Kreuzform verbunden sind. Der N-terminale Abschnitt jeder Kette, der die Domänen III bis VI enthält, wobei jede einen Arm des Kreuzes bildet, und die C-terminalen Abschnitte (die Domänen I und II enthaltend) aller drei Ketten sind durch Disulfid-Bindungen zum vierten Arm verbunden. Mit anderen Worten bildet die N-terminale Hälfte der α-Kette die vertikalen Arme des Kreuzes, während die N-terminale Hälfte der β1- und der β2-Kette den linken und den rechten Arm bilden. Die C-terminalen Hälften aller drei Ketten verbinden sich, um den unteren vertikalen Arm des Kreuzes zu bilden. Die G-Domäne ist nur am C-terminalen Ende der α-Kette und an keiner der β-Ketten vorhanden. Die G-Domäne ist in fünf Subdomänen, G1 bis G5, unterteilt. Bei Merosin, eine Isoform von Laminin, wurde festgestellt, dass es einige Aminosäurenidentität mit dem C-Terminus der α-Kette von Mäuse-Laminin teilt und dass die allgemeine Domänenstruktur zwischen den beiden beibehalten wird.
Matin ist aus mehreren Quellen erhältlich. Solche Quellen umfassen insbesondere P19137 (LAMININ-ALPHA-1-KETTENVORSTUFE (LAMININ-A-KETTE)), MMMSA (Laminin- Alpha-1-Kettenvorstufe – Maus) und AAA39410 (Laminin-A-Kette [Mus musculus]). Menschliches Laminin weist eine etwas geringere Sequenzidentität mit SEQ ID NO. 2 auf, z.B. etwa 83%. Solche Sequenzen sind auch zur Gewinnung von Matin verwendbar und umfassen insbesondere P25391 (LAMININ-ALPHA-1-KETTENVORSTUFE (LAMININ-A-KETTE)), 514458 (Laminin-Alpha-1-Kettenvorstufe – menschlich) und CAA41418 (Laminin-A-Kette [Homo sapiens]). Andere Sequenzen weisen eine geringere Identität mit SEQ ID NO. 2 auf, können aber dennoch verwendbare Quellen für anti-angiogenes Matin sein. Diese können insbesondere PX0082 (Laminin, M-Kette – menschlich (Fragment)), MMHUMH (Laminin-Alpha-2-Kettenvorstufe – menschlich (Fragment)), AAB33989 (Laminin M-Kette, Merosin=Basalmembranprotein {G-Domäne}[menschlich, Plazenta, Peptidteil, 1751 aa][Homo sapiens]), AAA63215 (Merosin [Homo sapiens]), AAB18388 (Laminin-Alpha-2-Kette [Homo sapiens]), NP_000417 (Laminin-Alpha-2-Subeinheitenvorstufe; Laminin, Alpha-2 (Merosin)[Homo sapiens]), P24043 (LAMININ-ALPHA-2-KETTENVORSTUFE (LAMININ-M-KETTE)(MEROSIN, SCHWERE KETTE)), CAA81394 (Laminin-M-Kette (Merosin)[Homo sapiens]), XP_011387 (Laminin-Alpha-2-Subeinheitenvorstufe [Homo sapiens]), Q60675 (LAMININ-ALPHA-2-KETTENVORSTUFE (LAMININ-M-KETTE)(MEROSIN, SCHWERE KETTE)), 553868 (Laminin-Alpha-2-Kettenvorstufe – Maus), AAC52165 (Laminin-2-Alpha-2-Kettenvorstufe [Mus musculus]).
Interessanter Weise besitzen die verschiedenen globulären Domänen selbst verschiedene Graden der Sequenzidentität miteinander. Dies ist in Tabelle 1 unten dargestellt.
Tabelle 1. Prozent Sequenzidentität der globulären Domänen der Laminin-α-Kette der Maus.
Polynukleotide, die Matin kodieren, können ebenfalls aus verschiedenen Quellen bezogen werden. Zum Beispiel besitzen andere globuläre Domänen der Laminin-α-Kette von Mäusen (z.B.) allgemein mehr als 90% Sequenzidentität mit SEQ ID NO. 1 und umfassen insbesondere J04064 (Mus-musculus-Laminin-A-Kette mRNA, vollständige CDS) und X58531 (menschliches LAMA-mRNA für Laminin-A-Kette, Teil-CDS).
Wie hier offenbart, kann Matin in E. coli unter Anwendung eines Bakterienexpressionsplasmids, wie beispielsweise pET22b, hergestellt werden, das des periplasmischen Transports fähig ist, was zu einem löslichen Protein führt. Matin kann auch in anderen Zellen erzeugt werden, beispielsweise kann es als abgesondertes lösliches Protein in 293 Nierenzellen unter Anwendung des eukaryotischen pcDNA 3.1-Vektors erzeugt werden.
Durch E. coli erzeugtes Matin hemmt die Endothelzellenproliferation von Endothelzellen auf dosisabhängige Weise.
Die spezifische Hemmung der Endothelzellenproliferation und -migration durch Matin beweist dessen anti-angiogene Aktivität und dass es durch ein Zelloberflächenprotein/einen Zelloberflächenrezeptor wirken kann. Integrine sind potentielle Kandidatenmoleküle aufgrund ihres extrazellulären Matrixbindevermögens und der Fähigkeit, das Zellverhalten, wie beispielsweise die Migration und Proliferation, zu modulieren. Insbesondere ist a_vb₃-Integrin ein möglicher Rezeptor aufgrund seiner Induktion während der Angiogenese und seines promiskuitiven Bindevermögens. Die Angiogenese hängt auch von spezifischen Endothelzellenhaftungsvorkommnissen ab, die durch Integrin a_vb₃ vermittelt werden (Brooks, P. C. et al., 1994, Cell 79: 1157–1164). Matin kann die Wechselwirkung proliferierender Endothelzellen mit der Matrixkomponente stören und so Endothelzellen dazu bringen, eine Apoptosis durchzumachen (Re, F. Et al., 1994, J. Cell. Biol. 127: 537–546). Matrixmetalloproteinasen (MMP) sind als Schlüsselenzyme impliziert worden, die die Bildung neuer Blutgefäße in Tumoren regulieren (Ray, J. M. et al., 1994, Eur. Respir. J. 7: 2062–2072). Es ist kürzlich gezeigt worden, dass ein Inhibitor von MMP-2 (PEX) das Tumorwachstum durch Hemmen der Angiogenese unterdrücken kann (Brooks, P. C. et al., 1998, Cell 92: 391–400). Matin kann durch Hemmen der Aktivität von MMP wirken.
Der Begriff „Angiogenese", wie er hier verwendet wird, bedeutet die Bildung neuer Blutgefäße zu Geweben oder Organen und involviert die Endothelzellenproliferation. Unter normalen physiologischen Bedingungen machen Menschen oder Tiere eine Angiogenese nur in sehr spezifischen beschränkten Situationen durch. Beispielsweise ist die Angiogenese normalerweise bei der Wundheilung, der fötalen und embryonalen Entwicklung und der Bildung des Gelbkörpers des Endometriums und der Plazenta zu beobachten. Der Begriff „Endothel" bedeutet eine dünne Schicht flacher Epithelzellen, die seröse Hohlräume, Lymphgefäße und Blutgefäße auskleidet. „Anti-angiogene Aktivität" bezieht sich deshalb auf die Fähigkeit einer Zusammensetzung, das Wachstum von Blutzellen zu hemmen. Das Wachstum von Blutzellen ist eine komplizierte Serie von Vorfällen und umfasst den lokalisierten Abbau der Basalmembran, die unterhalb der einzelnen Endothelzellen liegt, die Proliferation dieser Zellen, die Migration der Zellen zur Position des künftigen Blutgefäßes, die Reorganisation der Zellen unter Bildung einer neuen Gefäßmembran, das Beenden der Endothelzellproliferation und das Einbauen von Perizyten und anderen Zellen, die die Wand des neuen Blutgefäßes stützen. „Anti-angiogene Aktivität", wie hier verwendet, umfasst daher das Unterbrechen irgendeiner oder aller dieser Stufen mit dem Endergebnis, dass die Bildung neuer Blutgefäße gehemmt ist.
Die anti-angiogene Aktivität kann die Endothel-hemmende Aktivität umfassen, was sich auf die Fähigkeit einer Zusammensetzung bezieht, die Angiogenese im Allgemeinen zu hemmen und beispielsweise das Wachstum oder die Migration von Rinderkapillarendothelzellen in einer Kultur in Gegenwart von Fibroblast-Wachstumsfaktor, von mit Angiogenese verbundenen Faktoren oder anderen bekannten Wachstumsfaktoren zu hemmen. Ein „Wachstumsfaktor" ist eine Zusammensetzung, die das Wachstum, die Reproduktion oder Syntheseaktivität von Zellen stimuliert. Ein „mit Angiogenese assoziierter Faktor" ist ein Faktor, der die Angiogenese entweder hemmt oder fördert. Ein Beispiel eines mit Angiogenese assoziierten Faktors ist ein angiogener Wachstumsfaktor, wie beispielsweise ein basischer Fibroblast-Wachstumsfaktor (bFGF), der ein Angiogenesepromotor ist. Ein anderes Beispiel eines mit der Angiogenese verbundenen Faktors ist ein Angiogenese hemmender Faktor wie beispielsweise Angiostatin (vergleiche z.B. US-Patentschrift Nr. 5,801,012; US-Patentschrift Nr. 5,837,682; US-Patentschrift Nr. 5,733,876; US-Patentschrift Nr. 5,776,704; US-Patentschrift Nr. 5,639,725; US-Patentschrift Nr. 5,792,845; WO 96/35774; WO 95/29242; WO 96/41194; WO 97/23500) oder Endostatin (vergleiche z.B. US-Patentschrift Nr. 5,854,205; US-Patentschrift Nr. 6,174,861; WO 97/15666).
Mit „im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität" oder „im Wesentlichen die gleiche oder eine überlegene biologische Aktivität" ist gemeint, dass die Zusammensetzung eine anti-angiogene Aktivität aufweist und sich ähnlich wie Matin, wie bei Standardassays bestimmt, verhält. „Standardassays" umfasst, ist jedoch nicht darauf beschränkt, diejenigen Protokolle, die im molekularen biologischen Stand der Technik zum Bestimmen der anti-angiogenen Aktivität, dem Zellzyklusstillstand und der Apoptosis verwendet werden. Derartige Assays umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Assays der Endothelzellproliferation, Endothelzellmigration, Zellzyklusanalyse und Endothelzellröhrenbildung, die Erfassung von Apoptosis, z.B. durch apoptote Zellmorphologie oder Annexin V-FITC-Assay, Chorioallantoinmembran- (CAM-) Assay und die Hemmung des Nierenkrebstumorwachstums in Nacktmäusen. Derartige Assays werden unten in den Beispielen und auch in U. S. S. N. 09/335,224 „Anti-Angiogenic Proteins and Methods of Use thereof (Anti-angiogene Proteine und Verfahren zur Verwendung derselben)", das am 17. Juni 1999 von Raghuram Kalluri eingereicht worden ist, und in U. S. S. N. 09/479,118, „Anti-Angiogenic Proteins and Receptors and Methods of Use thereof (Anti-angiogene Proteine und Rezeptoren und Verfahren zur Verwendung derselben)", das am 7. Januar 2000 von Raghuram Kalluri eingereicht worden ist, bereitgestellt.
„Matin" soll auch Fragmente, Mutanten, Homologe, Analoge und allele Varianten der Aminosäuresequenz, der „Matin"-Sequenz sowie „Matin" aus anderen globulären Domänen, globuläre Domänen aus anderen α-Ketten, andere Laminine, Laminine aus anderen Säugern, und Fragmente, Mutanten, Homologe, Analoge und allele Varianten der „Matin"-Aminosäuresequenz umfassen.
Man sollte sich auch im Klaren darüber sein, dass die vorliegende Erfindung innerhalb des Umfangs der Ansprüche irgendwelche Derivate von Matin umfassen soll, die eine endotheliale Hemmungsaktivität aufweisen (z.B. die Fähigkeit einer Zusammensetzung, die Angiogenese im Allgemeinen zu hemmen und beispielsweise das Wachstum oder die Migration von Rinderkapillarendothelzellen in einer Kultur in Gegenwart eines Fibroblastwachstumsfaktors, von mit Angiogenese assoziierten Faktoren oder anderen bekannten Wachstumsfaktoren zu hemmen). Die vorliegende Erfindung umfasst das gesamte Matin-Protein, Derivate dieses Proteins und biologisch aktive Fragmente dieses Proteins. Dies umfasst Proteine mit einer Matin-Aktivität, die Aminosäuresubstitutionen oder Zucker oder andere Moleküle aufweisen, die an funktionelle Aminosäuregruppen angeknüpft sind.
Die Erfindung umfasst auch Fragmente, Mutanten, Homologe und Analoge von Matin, die innerhalb des Umfangs der Ansprüche liegen. Ein „Fragment" eines Proteins ist hier als eine Aminosäuresequenz definiert, die kürzer als das Protein ist, das mindestens 25 aufeinander folgende Aminosäuren des vollen Polypeptids umfassen. Ein derartiges Fragment kann alternativ 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 oder 50 aufeinander folgende Aminosäuren des vollen Polypeptids umfassen. Das Fragment kann 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, oder 75 aufeinander folgende Aminosäuren des vollen Peptids umfassen. Derartige Moleküle können auch zusätzliche Aminosäuren umfassen, oder diese nicht umfassen, die aus dem Kloniervorgang stammen, z.B. Aminosäurereste oder Aminosäuresequenzen, die vollständigen oder teilweisen Linkersequenzen entsprechen. Um vollständig unter die vorliegende Erfindung zu fallen, müssen derartige Moleküle mit oder ohne derartigen zusätzlichen Aminosäureresten im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das Bezugspolypeptid aufweisen.
Weist das Molekül voller Länge mehr als eine Aktivität auf, so kann es beispielsweise möglich sein, die Aktivität durch Spalten des Proteins voller Länge in mehrere Fragmente „zu spalten", z.B. kann das Protein voller Länge in zwei Fragmente gespalten werden, wovon eines eine Aktivität aufweisen kann, während das andere eine andere Aktivität aufweist. Die beiden Fragmente können sich überlappen, oder auch nicht, und die beiden Aktivitäten können in dem Molekül voller Länge offensichtlich sein oder auch nicht. Beispielsweise kann das Molekül voller Länge die Aktivität „A" aufweisen und die beiden Fragmente desselben können jeweils die Aktivitäten „A₁" und „A₂" aufweisen, oder sie können die Aktivitäten „B" und „C" aufweisen. Aus diesem Grund ist beabsichtigt, dass, wenn angegeben wird, dass ein Fragment oder Mutant „im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das Bezugspolypeptid aufweisen muss", in Situationen, wo eine oder mehrere biologische Aktivitäten gespalten sind, das „Bezugspolypeptid" diejenige Subsequenz des Moleküls insgesamt sein soll, die dem Fragment oder Mutanten entspricht. Das heißt, das Fragment oder der Mutant muss im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität aufweisen wie der Teil des Moleküls insgesamt, dem es bzw. er entspricht.
Mit „Mutant" des Matins ist ein Polypeptid gemeint, das irgendwelche Änderungen in der Aminosäuresequenz im Vergleich mit der Aminosäuresequenz des entsprechenden Bezugsmatins umfasst. Derartige Änderungen können spontan oder durch Manipulationen durch den Menschen, chemisch Energie (z.B. Röntgenstrahlen) oder durch irgendeine Form chemischer Mutagenese oder durch genetisches Engineering oder durch Paarung oder andere Formen von Austausch genetischer Informationen auftreten. Mutationen umfassen z.B. Basenänderungen, Deletionen, Insertionen, Inversionen, Translokationen oder Verdoppelungen. Mutante Formen von Matin weisen entweder eine erhöhte oder reduzierte anti-angiogene Aktivität im Vergleich mit dem entsprechenden Bezugsmatinpolynukleotid auf und derartige Mutanten können zusätzliche Aminosäure umfassen oder auch nicht, die aus dem Vorgang des Klonierens deriviert sind, z.B. Aminosäurerückstände oder Aminosäuresequenzen, die vollständigen oder teilweisen Linkersequenzen entsprechen. Mutanten/Fragmente der erfindungsgemäßen anti-angiogenen Proteine können auch durch PCR-Klonieren oder durch Pseudomonas-Elastase-Digestion, wie von Mariyama, M. et al. (1992, J. Biol. Chem. 267: 1253–1258 beschrieben, gebildet werden.
Mit „Analog" von Matin ist ein nichtnatürliches Molekül gemeint, das im Wesentlichen entweder dem ganzen Matinmolekül oder einem Fragment oder einer allelen Variante desselben ähnlich ist und im Wesentlichen die gleiche oder eine bessere biologische Aktivität aufweist. Derartige Analoge sollen Derivate (z.B. chemische Derivate, wie oben definiert) des biologisch aktiven Matins sowie seiner Fragmente, Mutanten, Homologe und allelen Varianten umfassen, welche Derivate eine qualitativ ähnlichen Agonisten- oder Antagonistenwirkung wie das unmodifizierte Matinpolypeptid, -fragment- der -mutant, -homolog oder die allele -variante aufweisen.
Mit „Allel" von Matin ist eine Polypeptidsequenz gemeint, die eine natürlich vorkommende Sequenzvariation im Vergleich mit der Polypeptidsequenz des Bezugsmatinpolypeptids enthält. Mit „Allel" eines Polypeptids, das das Matinpolypeptid kodiert, ist ein Polypeptid gemeint, das eine Sequenzvariation im Vergleich mit der Bezugspolypeptidsequenz enthält, die das Bezugsmatinpolypeptid kodiert, wobei das Allel des Polypeptids, das das Matinpolypeptid kodiert, eine allele Form des Matinpolypeptids kodiert.
Es ist möglich, dass ein vorgegebenes Polypeptid entweder ein Fragment, ein Mutant, ein Analogon oder eine allele Variante von Matin sein kann und es kann zwei oder mehrere dieser Dinge sein, z.B. ein Polypeptid kann sowohl ein Analogon als auch ein Mutant des Matinpolypeptids sein. Beispielsweise kann eine gekürzte Version des Matinmoleküls (z.B. ein Fragment von Matin) im Labor gebildet werden. Wird dieses Fragment dann durch Mittel, die im Stand der Technik bekannt sind, mutiert, so wird ein Molekül gebildet, das sowohl ein Fragment als auch ein Mutant von Matin ist. Bei einem anderen Beispiel kann ein Mutant gebildet werden, von dem später entdeckt wird, dass er in einigen Säugerindividuen als allele Form von Matin vorkommt. Ein derartiges mutantes Matinmolekül würde daher sowohl ein Mutant als auch eine allele Variante sein. Derartige Kombinationen von Fragmenten, Mutanten, allelen Varianten und Analogen sollen in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sein.
In der vorliegenden Erfindung sind auch Proteine eingeschlossen, die im wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz wie Matin aufweisen, oder Polynukleotide, die im Wesentlichen die gleiche Nukleinsäuresequenz aufweisen wie die Polynukleotide, die Matin kodieren. „Im Wesentlichen die gleiche Sequenz" bedeutet eine Nukleinsäure oder ein Polypeptid, die bzw. das mindestens 70% Sequenzidentität mit einer Bezugssequenz, z.B. einer anderen Nukleinsäure oder einem Polypeptid, typischerweise mindestens etwa 80% Sequenzidentität mit der Bezugssequenz, bevorzugt mindestens etwa 90% Sequenzidentität, noch bevorzugter mindestens etwa 95% Identität und am bevorzugtesten mindestens etwa 97% Sequenzidentität mit der Bezugssequenz aufweist. Die Vergleichslänge für Sequenzen beträgt im Allgemeinen mindestens 75 Nukleotidbasen oder 25 Aminosäuren, noch bevorzugter mindestens 150 Nukleotidbasen oder 50 Aminosäuren und am bevorzugtesten 243–264 Nukleotidbasen oder 81–88 Aminosäuren. „Polypeptid", wie es hier verwendet wird, zeigt eine Molekularkette von Aminosäuren an und bezieht sich nicht auf eine spezifische Länge des Produkts. So sind Peptide, Oligopeptide und Proteine innerhalb der Definition von Polypeptiden eingeschlossen. Dieser Begriff soll auch Polypeptide umfassen, die Postexpressionsmodifikationen, wie beispielsweise Glykosylationen, Acetylationen, Phosphorylationen und dergleichen unterworfen worden sind.
„Sequenzidentität", wie es hier verwendet wird, bezieht sich auf die Sequenzähnlichkeit zwischen zwei polymeren Molekülen, z.B. zwei Polynukleotiden oder zwei Polypeptiden. Wenn eine Subeinheitsposition in beiden Molekülen durch die gleiche monomere Subeinheit besetzt ist, z.B. wenn eine Position in jedem der beiden Peptide durch Serin besetzt ist, so sind sie an dieser Position identisch. Die Identität zwischen zwei Sequenzen steht in direkter Abhängigkeit von der Anzahl der passenden oder identischen Positionen, z.B. wenn die Hälfte (z.B. 5 Positionen in einem Polymer einer Länge von 10 Subeinheiten) den Positionen in zwei Peptid- oder Verbindungssequenzen identisch ist, so sind die beiden Sequenzen 50% identisch; wenn 90% der Positionen, z.B. 9 von 10 zu einander passen, so haben die beiden Sequenzen 90% Sequenzidentität gemeinsam. Beispielsweise haben die Aminosäuresequenzen R₂R₅R₇R₁₀R₆R₃ und R₉R₈R₁R₁₀R₆R₃ 3 von 6 Positionen gemeinsam und sie haben daher 50% Sequenzidentität gemeinsam, während die Sequenzen R₂R₅R₇R₁₀R₆R₃ und R₈R₁R₁₀R₆R₃ 3 von 5 Positionen gemeinsam haben und sie daher 60% Sequenzidentität gemeinsam haben. Die Identität zwischen zwei Sequenzen steht in direkter Abhängigkeit von der Anzahl passender oder identischer Positionen. So wird, wenn ein Teil der Bezugssequenz in einem spezifischen Peptid deletiert ist, dieser deletierte Abschnitt für die Zwecke des Berechnens der Sequenzidentität nicht in Betracht gezogen, z.B. R₂R₅R₇R₁₀R₆R₃ und R₂R₅R₇R₁₀R₃ haben 5 von 6 Positionen gemeinsam und sie haben daher 83,3% Sequenzidentität gemeinsam.
Die Identität wird oft unter Anwendung von Sequenzanalyse-Software z.B. BLASTN oder BLASTP (bei http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ erhältlich) gemessen. Die Ausgangsparameter für das Vergleichen von zwei Sequenzen (z.B. „Blasten" von zwei Sequenzen gegeneinander, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html) durch BLASTN (für Nukleotidsequenzen) sind Belohnung für Passen = 1, Strafe für Fehlanpassung = –2, offene Lücke = 5, Dehnungslücke = 2. Bei Anwendung von BLASTP für Proteinsequenzen sind die Ausgangsparameter Belohnung für Passen = 0, Strafe für Fehlanpassung = 0, offene Lücke = 11 und Dehnungslücke = 1.
Wenn zwei Sequenzen die „Sequenzhomologie" gemeinsam ist, so bedeutet das, dass die beiden Sequenzen sich von einander nur durch konservative Substitutionen unterscheiden. Für Polypeptidsequenzen bestehen derartige konservative Substitutionen aus der Substitution einer Aminosäure bei einer vorgegebenen Position in der Sequenz für eine andere Aminosäuresequenz derselben Klasse (z.B. Aminosäuren, denen die Charakteristiken der Hydrophobizität, Ladung, pK oder andere konformationelle oder chemische Eigenschaften gemeinsam sind, z.B. Valin für Leucin, Arginin für Lysin) oder durch eine oder mehrere nichtkonservative Aminosäuresubstitutionen, -deletionen oder -insertionen, die sich an Positionen der Sequenz befinden, die die Konformation oder das Falten des Polypeptids nicht so weit ändern, dass die biologische Aktivität des Polypeptids zerstört wird. Beispiele „konservativer Substitutionen" umfassen die Substitution eines nichtpolaren (hydrophoben) Rests, wie Isoleucin, Valin, Leucin oder Methionin für eine andere; die Substitution eines polaren (hydrophilen) Rests für einen anderen, wie zwischen Arginin und Lysin, zwischen Glutamin und Asparagin, zwischen Threonin und Serin; die Substitution eines basichen Rests wie Lysin, Arginin oder Histidin für einen anderen; oder die Substitution eines sauren Rests wie Asparaginsäure oder Glutaminsäure für einander; oder die Verwendung eines chemisch derivierten Rests anstatt eines nicht derivierten Rests; vorausgesetzt, das Polypeptid weist die erforderliche biologische Aktivität auf. Zwei Sequenzen, denen Sequenzhomologie gemeinsam ist, können „Sequenzhomologe" genannt werden.
Die Erfindung zieht Mutante der Proteine und Peptide in Betracht, die hier offenbart werden, wobei die Mutation(en) die Aktivität des Proteins oder Peptides nicht wesentlich ändern, das heißt, die Mutationen effektiv „stille" Mutationen sind.
Die Homologie für Polypeptide wird typischerweise unter Anwendung von Sequenzanalyse-Software (z.B. das Sequenzsoftwarepaket der Genetics Computer Group, Universität von Wisconsin, Biology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705) gemessen. Die Proteinanalysesoftware stellt ähnliche Sequenzen aufeinander ab durch Zuweisen von Homologiegraden für verschiedene Substitutionen, Deletionen und andere Modifikationen. Konservative Substitutionen umfassen typischerweise Substitutionen innerhalb der folgenden Gruppen: Glycin, Alanin; Valin, Isoleucin, Leucin; Asparaginsäure, Glutaminsäure, Asparagin, Glutamin; Serin, Threonin; Lysin, Arginin; und Phenylalanin, Tyrosin.
Ebenfalls in die Erfindung eingeschlossen sind chemische Derivate von Matin. „Chemisches Derivat" bezieht sich auf ein jeweiliges Polypeptid, bei dem ein oder mehrere Reste chemisch durch Reaktion einer funktionellen Nebengruppe derivatisiert worden ist bzw. sind. Derartige derivatisierte Reste umfassen beispielsweise diejenigen Moleküle, in denen freie Aminosäuregruppen unter Bildung von Aminhydrochloriden, p-Toluolsulfonylgruppen, Carbobenzoxygruppen, tert-Butyloxycarbonylgruppen, Chloracetylgruppen oder Formylgruppen derivatisiert worden sind. Freie Carboxylgruppen müssen unter Bildung von Salzen, Methyl- und Ethylestern oder anderen Typen von Estern oder Hydraziden derivatisiert werden. Freie Hydroxylgruppen können unter Bildung von O-Acyl- oder O-Alkylderivaten derivatisiert werden. Der Imidazolstickstoff von Histidin kann unter Bildung von N-Imbenzylhistidin derivatisiert werden. Ebenfalls als chemische Derivate eingeschlossen sind diejenigen Peptide, die ein oder mehrere natürlich vorkommende Aminosäurederivate der zwanzig Standardaminosäuren enthalten. Beispielsweise: 4-Hydroxyprolin kann für Prolin substituiert werden; 4-Hydroxylysin kann für Lysin substituiert werden; 3-Methylhistidin kann für Histidin substituiert werden; Homoserin kann für Serin substituiert werden; und Ornithin kann für Lysin substituiert werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Fusionsproteine und chimäre Proteine, ihre Fragmente, Mutanten, Homologe, Analoge und allelen Varianten. Ein Fusions- oder chimäres Protein kann durch rekombinante Expression und das Klonierverfahren hergestellt werden, z.B. kann das Protein so hergestellt werden, dass es zusätzliche Aminosäuren oder Aminosäuresequenzen umfasst, die vollen oder teilweisen Linkersequenzen entsprechen. Ein Fusions- oder chimäres Protein kann aus einem Multimer eines einzigen Proteins, z.B. Wiederholungen der anti-angiogenen Proteine, bestehen oder die Fusions- und chimären Proteinen können aus mehreren Proteinen, z.B. mehreren der anti-angiogenen Proteine aufgebaut werden. Das Fusions- oder chimäre Protein kann eine Kombination von zwei oder mehr bekannten anti-angiogenen Proteinen (z.B. Angiostatin und Endostatin, oder biologisch aktiven Fragmenten von Angiostatin und Endostatin) oder ein anti-angiogenes Protein in Kombination mit einem Zielmittel (z.B. Endostatin mit epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) oder RGD-Peptiden) oder ein anti-angiogenes Protein in Kombination mit einem Immunoglobulinmolekül (z.B. Endostatin und IgG, spezifisch mit dem Fc-Anteil entfernt) umfassen. Die Fusions- und chimären Proteine können auch die anti-angiogenen Proteine, ihre Fragmente, Mutanten, Homologe, Analoge und allelen Varianten und andere anti-angiogene Proteine, z.B. Endostatin oder Angiostatin umfassen. Andere anti-angiogene Proteine können Arresten, Canstatin oder Tumstatin (PCT/US99/13737), Vascostatin, Restin und Apomigren (PCT/US98/28058) und Fragmente von Edostatin (PCT/US98/26057) umfassen. Der Begriff „Fusionsprotein" oder „chimäres Protein", wie er hier verwendet wird, kann auch zusätzliche Komponenten, z.B. zum Abgeben eines chemotherapeutischen Mittels umfassen, wobei ein Polynukleotid, das das chemotherapeutische Mittel kodiert, mit dem Polynukleotid verknüpft ist, das das anti-angiogene Protein kodiert. Fusions- oder chimäre Proteine können auch Multimere eines anti-angiogenen Proteins, z.B. ein Dimer oder Trimer, umfassen. Derartige Fusions- oder chimäre Proteine können durch posttranslationelle Modifikation mit einander verknüpft (z.B. chemisch verknüpft) werden, oder das gesamte Fusionsprotein kann rekombinant gemacht werden.
Multimere Proteine, die Matin, seine Fragmente, Mutanten, Homologe, Analoge und allelen Varianten umfassen, sollen auch in die vorliegende Erfindung eingeschlossen sein. Mit „Multimer" ist ein Protein gemeint, das zwei oder mehrere Kopien eines Subeinheitsproteins umfasst. Das Subeinheitsprotein kann eines der erfindungsgemäßen Proteine, z.B. zweimal oder mehrere Male wiederholtes Matin, oder ein Fragment, ein Mutant, Homolog, Analog oder eine und allele Variante, z.B. ein Matinmutant oder -fragment, der bzw. das zweimal oder mehrere Male wiederholt wird, sein. Ein derartiges Multimer kann auch ein Fusions- oder chimäres Protein sein, z.B. kann ein wiederholter Tumstatinmutant mit Polylinkersequenz kombiniert werden, und/oder ein oder mehrere anti-angiogene Peptide, die in einer einzigen Kopie vorliegen oder hintereinander wiederholt werden können, z.B. ein Protein kann zwei oder mehrere Multimere innerhalb des gesamten Proteins umfassen.
Die Erfindung umfasst auch eine Zusammensetzung umfassend ein oder mehrere isolierte Polynukleotid(e), die Matin kodieren, sowie Vektoren und Wirtszellen, die derartige Polynukleotide enthalten, sowie Verfahren zum Herstellen von Matin und seinen Fragmenten, Mutanten, Homologen, Analogen und allelen Varianten. Der Begriff „Vektor", wie er hier verwendet wird, bedeutet einen Träger, in den Stücke von Nukleinsäure insertiert oder kloniert werden können, welcher Träger zum Übertragen der Stücke von Nukleinsäure in eine Wirtszelle dient. Ein derartiger Vektor kann auch die Replikation und/oder Expression der übertragenen Nukleinsäurestücke bewerkstelligen. Beispiele von Vektoren umfassen Nukleinsäuremoleküle, die z.B. von einem Plasmid, Bakteriophagen oder Säuger-, Pflanzen- oder Insektenvirus deriviert sind, oder nichtvirale Vektoren, wie Liganden-Nukleinsäurekonjugate, Liposome oder Lipid-Nukleinsäurekomplexe. Es kann wünschenswert sein, dass das übertragene Nukleinsäuremolekül funktionsfähig mit einer Expressionskontrollsequenz verknüpft ist unter Bildung eines Expressionsvektors, der dazu fähig ist, die übertragenen Nukleinsäure zu exprimieren. Eine derartige Übertragung von Nukleinsäuren wird im Allgemeinen „Transformation" genannt und bezieht sich auf die Insertion eines exogenen Polynukleotids in eine Wirtzelle, gleichgültig, welches Verfahren für die Insertion verwendet wird. Beispielsweise sind Direkt-Uptake, Transduktion oder f-Paarung eingeschlossen. Das exogene Polynukleotid kann als nichtintegrierter Vektor, beispielsweise Plasmid beibehalten werden, oder es kann alternativ in das Wirtsgenom integriert werden. „Funktionsfähig verknüpft" bezieht sich auf eine Situation, in der die beschriebenen Komponenten sich in einem Verhältnis zu einander befinden, das es ihnen erlaubt, auf die für sie beabsichtige Art und Weise zu funktionieren, z.B. wird eine Kontrollsequenz, die „funktionsfähig" mit einer Kodiersequenz verknüpft ist, derart ligiert, dass die Expression der Kodiersequenz unter Bedingungen erreicht wird, die mit der Kontrollsequenz verträglich sind. Eine „Kodiersequenz" ist eine Polynukleotidsequenz, die in mRNA transkribiert und in ein Polypeptid translatiert wird, wenn es unter die Kontrolle geeigneter Regulationsequenzen gebracht (d.h. funktionsfähig damit verknüpft) wird. Die Grenzen der Kodiersequenz werden durch ein Translationsstartcodon am 5'-Terminus und ein Translationsstopcodon am 3'-Terminus bestimmt. Derartige Grenzen können natürlich vorkommen oder in die Polynukleotidsequenz durch im Stand der Technik bekannte Verfahren eingeführt oder hinzugegeben werden. Eine Kodiersequenz kann mRNA, cDNA oder rekombinante Polynukleotidsequenzen einschließen, ist jedoch nicht darauf beschränkt.
Der Vektor, in den das klonierte Polynukleotid kloniert wird, kann auf Grund seiner Funktionen in einem prokaryotischen Organismus gewählt oder alternativ kann er auf Grund seiner Funktionen in einem eukaryotischen Organismus gewählt werden. Zwei Beispiele von Vektoren, die das Klonieren eines Polynukleotids, das das Matin-Protein kodiert, und die Expression dieses Proteins aus dem Polynukleotid erlauben, sind die pET22b- und pET28(a)-Vektoren (Novagen, Madison, Wisconsin, USA) und ein modifizierter pPICZαA-Vektor (InVitrogen, San Diego, Kalifornien, USA), der die Expression des Proteins in Bakterien bzw. Hefe erlaubt (vergleiche beispielsweise WO 99/29878 und USSN 09/5889,483).
Sobald ein Polynukleotid in einen geeigneten Vektor kloniert worden ist, kann es in eine entsprechende Wirtszelle transformiert werden. Mit „Wirtzelle" ist eine Zelle gemeint, die als Empfänger übertragener Nukleinsäure durch einen Vektor verwendet worden ist oder verwendet werden kann. Wirtszellen können prokaryotisch oder eukaryotisch sein, von einem Säuger, einer Pflanze oder einem Insekt stammen und können als einzelne Zellen oder als Ansammlung, z.B. als Kultur oder in einer Gewebekultur oder in einem Gewebe oder einem Organismus, vorliegen. Wirtzellen können auch von normalem oder erkranktem Gewebe aus einem multizellulären Organismus, z.B. einem Säuger, deriviert sein. Wirtzelle, wie hier verwendet werden, soll nicht nur die ursprüngliche Zelle, die mit einer Nukleinsäure transformiert worden ist, sondern auch Abkömmlinge einer derartigen Zelle, die die Nukleinsäure immer noch enthalten, umfassen.
In einer Ausführungsform umfasst das isolierte Polynukleotid, das das anti-angiogene Protein kodiert zusätzlich einen Polynukleotidlinker, der ein Peptid kodiert. Derartige Linker sind den mit dem Stand der Technik vertrauten Fachleuten bekannt, beispielsweise können Linker mindestens ein zusätzliches Kodon umfassen, das mindestens eine zusätzliche Aminosäure kodiert. Typischerweise umfasst der Linker eine bis etwa zwanzig oder dreißig Aminosäuren. Der Polynukleotidlinker wird, wie das Polynukleotid, das das anti-angiogene Protein kodiert, translatiert, was zur Expression eines anti-angiogenen Proteins mit mindestens einem zusätzlichen Aminosäurerest am Amino- oder Carboxylterminus des anti-angiogenen Proteins führt. Wichtigerweise beeinflusst die zusätzliche Aminosäure bzw. beeinflussen die zusätzlichen Aminosäuren Aktivität des anti-angiogenen Proteins nicht.
Nach dem Insertieren des ausgewählten Polynukleotid in den Vektor wird der Vektor in einen entsprechenden prokaryotischen Stamm transformiert und der Stamm wird unter geeigneten Züchtungsbedingungen für die Herstellung des biologisch aktiven anti-angiogenen Proteins gezüchtet (d.h. gehalten), wobei ein biologisch aktives anti-angiogenes Protein oder ein biologisch aktiver anti-angiogener Mutant, ein biologisch aktives anti-angiogenes Fragment oder Fusionsfragment desselben gebildet wird. In einer Ausführungsform umfasst die Erfindung das Klonieren eines Polynukleotids, das ein anti-angiogenen Proteins kodiert, in die Vektoren pET22b, pET17b oder pET28a, die dann in Bakterien transformiert werden. Der Bakterienwirtsstam exprimiert dann das anti-angiogene Protein. Typischerweise werden die anti-angiogene Proteine in Mengen von etwa 10–20 Milligramm oder mehr pro Liter Züchtungsfluid hergestellt.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst der eukaryotische Vektor einen modifizierten Hefevektor. Ein Verfahren besteht darin, ein pPICzα-Plasmid zu verwenden, wobei das Plasmid eine multiple Klonierstelle enthält. In der multiplen Klonierstelle ist ein His.Tag-Motif in die multiple Klonierstelle insertiert. Außerdem kann der Vektor modifiziert werden, um eine Ndel-Stelle oder andere geeignete Restriktionsstellen zuzugeben. Derartige Stellen sind den mit dem Stand der Technik vertrauten Fachleuten allgemein bekannt. Die anti-angiogenen Proteine, die durch diese Ausführungsform hergestellt werden, umfassen ein Histidin-tag-Motif (His.tag), das ein oder mehrere Histidine, typischerweise etwa 5–20 Histidine umfasst. Das tag-Motif darf die anti-angiogenen Eigenschaften des Proteins nicht beeinträchtigen.
Ein Verfahren zum Herstellen von Matin besteht beispielsweise darin, das Polynukleotid der SEQ ID NO: 1 zu amplifizieren und in einen Expressionsvektor, z.B. pET22b, pET28(a), pPICZαA oder irgendeinen anderen Expressionsvektor zu klonieren, den Vektor, der das Polynukleotid enthält, in eine Wirtzelle zu transformieren, die dazu fähig ist, das Polypeptid, das durch das Polynukleotid kodiert wird, zu exprimieren, die transformierte Wirtzelle unter Züchtungsbedingungen zu züchten, die für das Exprimieren des Proteins geeignet sind, und daraufhin das Protein aus der Kultur zu extrahieren und zu reinigen. Beispielhafte Verfahren zum Herstellen anti-angiogener Proteine im Allgemeinen werden in den Beispielen unten und in USSN 09/335,224 „Anti-angiogene Proteine und Verfahren zur Herstellung derselben", die am 17. Juni 1999 von Raghuram Kalluri eingereicht worden ist, bereitgestellt. Das Matinprotein kann auch als Produkt transgener Tiere, z.B. als Komponente der Milch transgener Kühe, Ziegen, Schafe oder Schweine, wie in der US-Patenschrift Nr. 5,962,648 beschrieben, oder als Produkt einer transgenen Pflanze, z.B. mit Stärkemolekülen in Mais kombiniert oder verknüpft, oder wie in der US-Patenschrift Nr. 5,639,947 oder 5,990,385 beschrieben, exprimiert werden.
Matin kann auch durch herkömmliche bekannte chemische Syntheseverfahren hergestellt werden. Verfahren zum Bilden von erfindungsgemäßen Proteinen durch synthetische Mittel sind den mit dem Stand der Technik vertrauten Fachleuten bekannt. Die synthetisch gebildete Matinproteins besitzen auf Grund der Tatsache, dass sie primäre, sekundäre oder tertiäre strukturelle und/oder konformationelle Charakteristiken z.B. mit rekombinant hergestelltem Matin gemeinsam haben, gemeinsam damit biologische Eigenschaften, einschließlich biologische Aktivität. So kann die synthetisch gebildete Matinproteinsequenz als biologisch aktive oder immunologische Substituenten z.B. für rekombinant hergestelltes, gereinigtes Matinprotein beim Screenen therapeutischer Verbindungen und in immunologischen Vorgängen für die Entwicklung von Antibiotika verwendet werden.
Das Matinprotein ist zum Hemmen der Angiogenese, wie durch Standardassays bestimmt und in den Beispielen unten aufgeführt, nützlich.
Polynukleotide, die Matin kodieren, können aus isolierter DNA oder einer cDNA-Bibliothek kloniert werden. Nukleinsäurepolypeptide, die hier als „isoliert" bezeichnet werden, sind Nukleinsäuren oder Polypeptide, die im Wesentlichen von dem Material der biologischen Quelle frei sind (d.h. davon getrennt sind), von dem sie erhalten worden sind (z.B. wie es in einer Mischung von Nukleinsäuren oder in Zellen vorliegt), das einer weiteren Verarbeitung unterworfen worden sein kann. „Isolierte" Nukleinsäuren oder Polypeptide umfassen Nukleinsäuren oder Polypeptide, die durch hier beschriebene Verfahren, ähnliche Verfahren oder andere geeignete Verfahren erhalten worden sind, einschließlich im Wesentlichen reine Nukleinsäuren oder Polypeptide, Nukleinsäuren oder Polypeptide, die durch chemische Synthese, durch Kombinationen chemischer oder biologischer Verfahren hergestellt worden sind, oder rekombinant hergestellte Nukleinsäuren oder Polypeptide, die isoliert werden. Ein isoliertes Polypeptid bedeutet daher eines, das von anderen Proteinen, Kohlehydraten, Lipiden und anderen zellulären Komponenten relativ frei sind, mit denen es normalerweise assoziiert ist. Eine isolierte Nukleinsäure ist nicht direkt angrenzend (d.h. kovalent gebunden) an beide Nukleinsäuren, an die es im natürlich vorkommenden Genom der Organismen angrenzt, aus denen die Nukleinsäure deriviert ist. Der Begriff umfasst deshalb beispielsweise eine Nukleinsäure, die in einen Vektor (z.B. ein unabhängig replizierendes Virus oder Plasmid) eingebaut ist, oder eine Nukleinsäure, die in einem getrennten Molekül unabhängig von anderen Nukleinsäuren vorliegt, wie ein Nukleinsäurefragment, das durch chemische Mittel oder Restriktionsendonukleasebehandlung hergestellt wird.
Die erfindungsgemäßen Polynukleotide und Proteine können auch zum Konstruieren von Sonden zum Isolieren anderer anti-angiogene Proteine verwendet werden. Außergewöhnliche Verfahren werden in der US-Patentschrift Nr. 5,837,490 von Jacobs bereitgestellt. Die Konstruktion der Oligonukleotidsonde sollte bevorzugt folgenden Parametern entsprechen: (a) sie sollte für einen Bereich der Sequenz konstruiert sein, der die am wenigsten unklaren Basen („N"), falls überhaupt welche, aufweist und (b) sie sollte so konstruiert sein, dass sie eine T_m von etwa 80°C aufweist (unter der Annahme von 2°C für jedes A oder T und von 4 Grad für jedes G oder C).
Das Oligonukleotid sollte bevorzugt mit g-³²P-ATP (spezifische Aktivität 6000 Ci/mMol) und T4-Polynukleotidkinase unter Anwendung allgemein angewendeter Techniken für das Markieren von Oligonukleotiden markiert werden. Andere Markiertechniken können ebenfalls angewendet werden. Nicht eingebaute Label sollten bevorzugt durch Gelfiltrationschromatographie oder andere gut eingeführte Verfahren entfernt werden. Die Menge an Radioaktivität, die in die Sonde eingeführt wird, sollte durch Messen in einem Szintillationszähler quantifiziert werden, Bevorzugt sollte die spezifische Aktivität der dabei gebildeten Sonde etwa 4 × 10⁶ dpm/pMol getragen. Die Bakterienkultur, die den Pool von Klonen voller Länge enthält, sollte bevorzugt aufgetaut und 100 μl der Stammlösung sollte zum Beimpfen eines sterilen Züchtungskolbens, der 25 ml sterile Bouillon enthält, die 100 μg/ml Ampicillin enthält verwendet werden. Die Kultur sollte bevorzugt bis zur Sättigung bei 37°C gezüchtet werden und die gesättigte Kultur sollte bevorzugt mit frischer L- Bouillon verdünnt werden. Aliquote Teile dieser Verdünnungen sollten bevorzugt plattiert werden, um die Verdünnung und das Volumen zu bestimmen, die etwa 5000 einzelne und gut voneinander getrennte Kolonien auf festen bakteriologischen Medien ergeben, die L-Bouillon enthalten, die 100 μg/ml Ampicillin und 1,5% Agar enthält, in einer Petrischale von 150 mm beim Züchten über Nacht bei 37°C. andere bekannte Verfahren, einzelne, gut von einander getrennte Kolonien zu erhalten, können ebenfalls angewendet werden.
Standardkoloniehybridisierungsverfahren sollten zum Überführen der Kolonien auf Nitrocellulosefilter und zum Lysieren, Denaturieren und Brennen derselben verwendet werden. Hochstringente Bedingungen sind solche, die mindestens so stringent wie beispielsweise 1 × SSC bei 65°C oder 1 × SSC und 50% Formamid bei 42°C sind. Moderate Stringenzbedingungen sind diejenigen, die mindestens so stringent wie 4 × SSC bei 65°C oder 4 × SSC und 50% Formamid bei 42°C sind. Reduzierte Stringenzbedingungen sind diejenigen, die mindestens so stringent wie 4 × SSC bei –50°C oder 6 × SSC und 50% Formamid bei 40°C sind.
Das Filter wird dann bevorzugt 1 Stunde unter leichtem Rühren bei 65°C in 6 × SSC (20 × Stammlösung ist 175,3 g NaCl/Liter, 88,2 g Na-Citrat/Liter, mit NaOH auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt), enthaltend 0,5% SDS, 100 μg/ml Hefe-RNA und 10 mM EDTA (etwa 10 ml pro 150 mm Filter) inkubiert. Bevorzugt wird die Sonde dann der Hybridisierungsmischung in einer Konzentration von mehr als oder gleich 1 × 10⁶ dpm/ml zugegeben. Das Filter wird dann bevorzugt bei 65°C unter leichtem Rühren über Nacht inkubiert. Das Filter wird dann bevorzugt in 500 ml 2 × SSC/0,5% SDS bei Raumtemperatur ohne Rühren, bevorzugt gefolgt von 500 ml 2 × SSC/0,1% SDS bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln für 15 Minuten gewaschen. Eine dritte Wäsche mit 0,1 × SSC/0,5% SDS bei 65°C für 30 Minuten bis zu 1 Stunde steht zur Wahl. Das Filter wird dann bevorzugt getrocknet und einer Autoradiographie ausreichend lange unterworfen, um die Positiven auf dem Röntgenfilm sichtbar zu machen. Andere bekannte Hybridisierungsverfahren können ebenfall angewendet werden. Die positiven Kolonien werden dann aufgenommen, als Kultur gezüchtet und Plasmid-DNA wird unter Anwendung von Standardverfahren isoliert. Die Klone können dann durch Restriktionsanalyse, Hybridisierungsanalyse oder DNA-Sequenzieren nachgeprüft werden.
Stringenzbedigungen für die Hybrdisierung bezieht sich auf die Temperaturbedingungen und Pufferzusammensetzung, die die Hybridisierung einer ersten Nukleinsäuresequenz an eine zweite Nukleinsäuresequenz erlauben, wobei die Bedingungen den Identitätsgrad zwischen denjenigen Sequenzen, die aneinander hybridisieren, bestimmen. Daher sind „Hochstringenzbedingungen" diejenigen Bedingungen, unter denen nur Nukleinsäuresequenzen, die einander sehr ähnlich sind, hybridisieren. Die Sequenzen können einander weniger ähnlich sein, wenn sie unter moderaten Stringenzbedingungen hybridisieren. Eine noch geringere Ähnlichkeit ist erforderlich, wenn zwei Sequenzen unter Bedingungen geringer Stringenz hybridisieren sollen. Durch Ändern der Hybridisierungsbedingungen von einem Stringenzniveau, bei dem keine Hybridisierung stattfindet, auf ein Niveau, bei dem eine Hybridisierung zuerst beobachtet wird, können die Bedingungen bestimmt werden, unter denen eine vorgegebene Sequenz an derartige Sequenzen hybridisiert, die ihr am ähnlichsten sind. Die genauen Bedingungen, die die Stringenz einer spezifischen Hybridisierung bestimmen, umfassen nicht nur die Ionenstärke, Temperatur und die Konzentration der Destabilisierungsmittel wie Formamid, sonder auch andere Faktoren, wie die Länge der Nukleinsäuresequenzen, ihre Basenzusammensetzung, den Prozentsatz von Fehlanpassungsbasenpaaren zwischen den beiden Sequenzen und die Häufigkeit des Auftretens von Untergruppen der Sequenzen (z.B. kleine Strecken von Wiederholungen) innerhalb anderer nichtidentischer Sequenzen. Das Waschen ist der Schritt, in dem die Bedingungen festgelegt werden, um ein Mindestniveau an Ähnlichkeit zwischen den Sequenzen, die miteinander hybridisieren, zu bestimmen. Im Allgemeinen führt von der niedrigsten Temperatur, bei der nur eine homologe Hybridisierung erfolgt, eine Fehlanpassung von 1% zwischen zwei Sequenzen zu einem Abfallen der Schmelztemperatur (T_m) von 1°C für irgendeine ausgewählte SSC-Konzentration. Im Allgemeinen führt ein Verdoppeln der Konzentration von SSC zu einer Erhöhung der T_m von etwa 17°C. Unter Anwendung dieser Richtlinien kann die Waschtemperatur je nach dem erwünschten Fehlanpassungsniveau empirisch bestimmt werden. Die Hybridisierungs- und Waschbedingungen sind in Current Protocols in Molecular Biology, (Gegenwärtige Protokolle in der molekularen Biologie) (Ausubel, F. M. et al., Verfasser, John Wiley & Sons, Inc., 1995, mit Zusätzen zum auf den letzten Stand bringen) auf den Seiten 2.10.1 bis 2.10.16 und 6.3.1 bis 6.3.6 erklärt.
Unter Hochstringenzbedingungen können zur Hybridisierung entweder (1) 1 × SSC (10 × SSC = 3 M NaCl, 0,3 M Na₃-Citrat·2H₂O (88 g/Liter), pH-Wert auf 7,0 mit 1 M HCl), 1% SDS (Natriumdodecylsulfat), 0,1–2 mg/ml denaturierte Lachssperma-DNA bei 65°C, (2) 1 × SSC, 50% Formamid, 1% SDS, 0,1–2 mg/ml denaturierte Lachssperma-DNA bei 42°C, (3) 1% Rinderserumalbumin (Fraktion V), 1 mM Na2·EDTA, 0,5 M NaHPO₄ (pH-Wert 7,2) (1 M NaHPO₄ = 134 g NaHPO₄·7H₂O, 4 ml 85% H₃PO₄ pro Liter), 7% SDS, 0,1–2 mg/ml denaturierte Lachsperma-DNA bei 65°C, (4) 50% Formamid, 5 × SSC, 0,02 M Tris-HCl (pH-Wert 7,6) 1 × Denhardtsche Lösung (100× = 10 g Ficoll 400, 10 g Polyvinylpyrrolidon, 10 g Rinderserumalbumin (Fraktion V), Wasser auf 500 ml), 10% Dextransulfat, 1% SDS, 0,1–2 mg/ml denaturierte Lachssperma-DNA bei 42°C (5) 5 × SSC, 5 × Denhardtsche Lösung, 1% SDS, 100 μg/ml denaturierte Lachsperma-DNA bei 65°C oder (6) 5 × SSC, 5 × Denhardtsche Lösung, 50% Formamid, 1% SDS, 100 μg/ml denaturierte Lachsperma-DNA bei 42°C mit Hochstringenzwäschen von entweder (1) 0,3–0,1 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C oder (2) 1 mM Na₂EDTA, 40 mM NaHPO₄ (pH-Wert 7,2), 1% SDS bei 65°C angewendet. Die obigen Bedingungen sollen für DNA-DNA-Hybride von 50 Basenpaaren oder länger angewendet werden. Glaubt man, dass das Hybrid eine Länge von weniger als 18 Basenpaaren besitzt, so sollten die Hybridisierungs- und Waschtemperaturen 5–10°C unterhalb derjenigen der errechneten T_m des Hybrid liegen, wobei T_m in °C = (2 × die Anzahl von A- und B-Basen) + (4 × die Anzahl von G- und C-Basen) ist. Für Hybride, von denen man glaubt, dass sie eine Länge von etwa 18 bis etwa 49 Basenpaaren aufweisen, T_m in °C = (81,5°C + 16,6(log₁₀M) + 0,41(% G + C) – 0,61(% Formamid) – 500/l), wobei „M" die Molarität einwertiger Kationen (z.B. Na⁺) und „L" die Länge des Hybrids in Basenpaaren ist.
Unter moderaten Stringenzbedingungen können zur Hybridisierung entweder (1) 4 × SSC (10 × SSC = 3 M NaCl, 0,3 M Na₃-Citrat·2H₂O (88 g/Liter), pH-Wert auf 7,0 mit 1 M HCl), 1% SDS (Natriumdodecylsulfat), 0,1–2 mg/ml denaturierte Lachssperma-DNA bei 65°C, (2) 4 × SSC, 50% Formamid, 1% SDS, 0,1–2 mg/ml denaturierte Lachssperma-DNA bei 42°C, (3) 1% Rinderserumalbumin (Fraktion V), 1 mM Na2·EDTA, 0,5 M NaHPO₄ (pH-Wert 7,2) (1 M NaHPO₄ = 134 g NaHPO₄·7H₂O, 4 ml 85% H₃PO₄ pro Liter), 7% SDS, 0,1–2 mg/ml denaturierte Lachsperma-DNA bei 65°C, (4) 50% Formamid, 5 × SSC, 0,02 M Tris-HCl (pH-Wert 7,6) 1 × Denhardtsche Lösung (100× = 10 g Ficoll 400, 10 g Polyvinylpyrrolidon, 10 g Rinderserumalbumin (Fraktion V), Wasser auf 500 ml), 10% Dextransulfat, 1% SDS, 0,1–2 mg/ml denaturierte Lachssperma-DNA bei 42°C (5) 5 × SSC, 5 × Denhardtsche Lösung, 1% SDS, 100 μg/ml denaturierte Lachsperma-DNA bei 65°C oder (6) 5 × SSC, 5 × Denhardtsche Lösung, 50% Formamid, 1% SDS, 100 μg/ml denaturierte Lachsperma-DNA bei 42°C mit moderaten Stringenzwäschen von 1 × SSC bei 65°C angewendet werden. Die obigen Bedingungen sollen für DNA-DNA-Hybride von 50 Basenpaaren oder länger angewendet werden. Glaubt man, dass das Hybrid eine Länge von weniger als 18 Basenpaaren besitzt, so sollten die Hybridisierungs- und Waschtemperaturen 5–10°C unterhalb derjenigen der errechneten T_m des Hybrid liegen, wobei T_m in °C = (2 × die Anzahl von A- und B-Basen) + (4 × die Anzahl von G- und C-Basen) ist. Für Hybride, von denen man glaubt, dass sie eine Länge von etwa 18 bis etwa 49 Basenpaaren aufweisen, T_m in °C = (81,5°C + 16,6(log₁₀M) + 0,41(% G + C) – 0,61(% Formamid) – 500/l), wobei „M" die Molarität einwertiger Kationen (z.B. Na⁺) und „L" die Länge des Hybrids in Basenpaaren ist.
Unter niedrigen Stringenzbedingungen können zur Hybridisierung entweder (1) 4 × SSC (10 × SSC = 3 M NaCl, 0,3 M Na₃-Citrat·2H₂O (88 g/Liter), pH-Wert auf 7,0 mit 1 M HCl), 1% SDS (Natriumdodecylsulfat), 0,1–2 mg/ml denaturierte Lachssperma-DNA bei 50°C, (2) 6 × SSC, 50% Formamid, 1% SDS, 0,1–2 mg/ml denaturierte Lachssperma-DNA bei 40°C, (3) 1% Rinderserumalbumin (Fraktion V, 1 mM Na2·EDTA, 0,5 M NaHPO₄ (pH-Wert 7,2) (1 M NaHPO₄ = 134 g NaHPO₄·7H₂O, 4 ml 85% H₃PO₄ pro Liter), 7% SDS, 0,1–2 mg/ml denaturierte Lachsperma-DNA bei 50°C, (4) 50% Formamid, 5 × SSC, 0,02 M Tris-HCl (pH-Wert 7,6) 1 × Denhardtsche Lösung (100× = 10 g Ficoll 400, 10 g Polyvinylpyrrolidon, 10 g Rinderserumalbumin (Fraktion V), Wasser auf 500 ml), 10% Dextransulfat, 1% SDS, 0,1–2 mg/ml denaturierte Lachssperma-DNA bei 40°C (5) 5 × SSC, 5 × Denhardtsche Lösung, 1% SDS, 100 μg/ml denaturierte Lachsperma-DNA bei 50°C oder (6) 5 × SSC, 5 × Denhardtsche Lösung, 50% Formamid, 1% SDS, 100 μg/ml denaturierte Lachsperma-DNA bei 40°C mit niedrigen Stringenzwäschen von entweder 2 × SSC, 0,1% SDS bei 50°C oder (2) 0,5% Rinderserumalbumin (Fraktion V), 1 mM Na₂EDTA, 40 ml mM NaHPO₄ (pH-Wert 7,2), 5% SDS angewendet werden. Die obigen Bedingungen sollen für DNA-DNA-Hybride von 50 Basenpaaren oder länger angewendet werden. Glaubt man, dass das Hybrid eine Länge von weniger als 18 Basenpaaren besitzt, so sollten die Hybridisierungs- und Waschtemperaturen 5–10°C unterhalb derjenigen der errechneten T_m des Hybrid liegen, wobei T_m in °C = (2 × die Anzahl von A- und B-Basen) + (4 × die Anzahl von G- und C-Basen ist. Für Hybride, von denen man glaubt, dass sie eine Länge von etwa 18 bis etwa 49 Basenpaaren aufweisen, T_m in °C = (81,5°C + 16,6)log₁₀M) + 0,41(% G + C) – 0,61(% Formamid) – 500/l), wobei „M" die Molarität einwertiger Kationen (z.B. Na⁺) und „L" die Länge des Hybrids in Basenpaaren ist.
Bei Verfahren zum Hemmen der Angiogenese in Säugergewebe können Matin oder seine biologisch aktiven Fragmente, Homologe, Analoge, Derivate oder Mutanten verwendet werden. Verfahren zum Behandeln einer durch Angiogenese vermittelten Krankheit können eine wirksame Menge eines oder mehrerer der anti-angiogenen Proteine oder ein oder mehrer biologisch aktive Fragment derselben oder Kombinationen von Fragmenten, die eine anti-angiogene Aktivität aufweisen, oder Agonisten oder Antagonisten verwendet werden. Eine wirksame Menge eines anti-angiogenen Proteins ist eine Menge, die ausreicht, um die Angiogenese zu verhindern, die die Krankheit oder den krankhaften Zustand verursacht, wodurch die Krankheit oder der krankhafte Zustand vollständig oder teilweise gemildert wird. Die Milderung der durch Angiogenese vermittelten Krankheit kann durch Beobachten einer Milderung von Symptomen der Krankheit, z.B. einer Reduzierung der Größe eines Tumors oder eines gehinderten Tumorwachstums, festgestellt werden. Der Begriff „wirksame Menge", wie er hier verwendet wird, bedeutet auch die Gesamtmenge jeder aktiven Komponente der Zusammensetzung oder des Verfahrens, die ausreicht, um einen bedeutungsvollen Nutzen beim Patienten, z.B. der Behandlung, Heilung, Verhinderung oder Besserung des entsprechenden Krankheitszustands, oder eine Erhöhung der Behandlungs-, Heilungs-, Verhinderungs- oder Besserungsrate eines derartigen krankhaften Zustands, aufzuzeigen. Wenn er auf eine Kombination angewendet wird, so bezieht sich der Begriff auf kombinierte Mengen der aktiven Bestandteile, die zur therapeutischen Wirkung führen, gleichgültig, ob sie in Kombination, hintereinander oder gleichzeitig verabreicht werden. Durch Angiogenese vermittelte Krankheiten umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, kompakte Tumoren, im Blut getragene Tumoren (z.B. Leukämien), Tumormetastase, gutartige Tumoren (z.B. Hämangiome, Akustikneurinome, Neurofibrome, Organfibrose, Trachoma und eleangieektatische Granumome), rheumatische Arthritis, Psoriasis, Okulare Angiogeneserkrankungen (z.B. diabetische Retinopathie, Frühgeborenenretinopathie, Makuladegeneration, Hornhauttransplantatabstoßung, neovaskulares Glaukom, retrolentale Fibroplasie, Rubeosis), Osler-Webber-Syndrom, Herzmuskelangiogenese, Plaqueneovaskularisierung, Telangiectasie, Blutergelenke, Angiofibrome und Wundgranulation. Die anti-angiogenen Proteine sind auch bei der Behandlung von Krankheiten übermäßiger oder anormaler Stimulation von Endothelzellen nützlich. Diese Krankheiten umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Darmverklebungen, Crohn-Krankheit, Arteriosklerose, Scleroderma, Fibrose und hypertrophe Narben (d.h. Keloide). Die anti-angiogenen Proteine können auch als Empfängnisverhütungsmittel durch Verhindern der Vaskularisation verwendet werden, die zur Embryoimplantation erforderlich ist. Die anti-angiogenen Proteine sind bei der Behandlung von Krankheiten nützlich, bei denen die Angiogenese die pathologische Folge ist, wie Katzenkratzerkrankung (Rochele mineralia quintosa) und Geschwüren (Heliobacter pylori). Die anti-angiogenen Proteine können auch zum Verhindern der vaskulären Dialysepfropfzugangsstenose und der Fettleibigkeit, z.B. durch Hemmen der Kapillarbildung in fettem Gewebe, verwendet werden, um so die Ausbreitung zu verhindern. Die anti-angiogenen Proteine können auch zum Behandeln lokalisierter (z.B. nichtmetastasierter) Krankheiten verwendet werden. „Krebs" bedeutet ein neoplastisches Wachstum, ein hyperplastisches oder proliferatives Wachstum oder einen pathologischen Zustand anormaler Zellentwicklung und umfasst kompakte Tumoren, nichtkompakte Tumoren und anormale Zellproliferation, wie beispielsweise bei der Leukämie. „Krebs", wie hier angewendet, bedeutet auch von der Angiogenese abhängige Krebse und Tumoren, d.h. Tumoren, die für ihr Wachstum (Ausdehnung im Volumen und/oder der Masse) eine Erhöhung der Anzahl und Dichte der Blutgefäße erfordern, die sie mit Blut versorgen. „Regression" bezieht sich auf die Reduzierung der Tumormasse und -größe, wie unter Anwendung von Verfahren bestimmt, den mit dem Stand der Technik vertrauten Fachleuten bekannt sind.
Als Alternative können dort, wo eine Erhöhung der Angiogenese erwünscht ist, z.B. bei der Wundheilung oder in Herzgewebe auf einen Infarkt hin, Antikörper oder Antisera zu den anti-angiogenen Proteinen zum Blockieren lokalisierter nativer anti-angiogener Proteine und Vorgänge angewendet werden, wodurch die Bildung neuer Blutgefäße zum Hemmen der Atrophie von Gewebe verstärkt wird.
Die anti-angiogenen Proteine können in Kombination mit einander oder anderen Zusammensetzungen und Vorgängen zum Behandeln von Krankheiten verwendet werden, z.B. können Matin und Vascostatin in einer pharmazeutischen Zusammensetzung kombiniert werden, oder eines oder mehrere ihrer Fragment können in einer Zusammensetzung kombiniert werden, oder ein Tumor kann auf herkömmliche Weise durch chirurgischen Eingriff, Bestrahlen, Chemotherapie oder Immuntherapie, mit den anti-angiogenen Proteinen kombiniert behandelt werden, und dann können die anti-angiogenen Proteine daraufhin dem Patienten in einem Ausmaß verabreicht werden, um die Dormanz der Mikrometastasen zu verlängern und das Wachstum irgendeines restlichen primären Tumors zu stabilisieren und zu hemmen. Die anti-angiogenen Proteine oder Fragment, Antisera, Rezeptoragonisten oder Rezeptorantagonisten derselben oder Kombinationen derselben können auch mit anderen anti-angiogenen Verbindungen oder Proteinen, Fragmenten, Antisera, Rezeptoragonisten, Rezeptorantagonisten anderer anti-angiogenen Proteine (z.B. Angiostatin, Endostatin) kombiniert werden. Außerdem werden die anti-angiogenen Proteine oder ihre Fragment, Antisera, Rezeptoragonisten oder Rezeptorantagonisten oder Kombinationen derselben mit pharmazeutisch akzeptablen Trägern und wahlweise einer langanhaltend wirkenden Matrix, wie beispielsweise biologisch abbaubaren Polymeren unter Bildung therapeutischer Zusammensetzungen kombiniert. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzung können auch andere anti-angiogene Proteine oder chemische Verbindungen, wie Endostatin oder Angiostatin und Mutanten, Fragment und Analoge derselben enthalten. Die Zusammensetzungen können des Weiteren andere Mittel enthalten, die die Aktivität des Proteins erhöhen oder seine Aktivität oder Anwendung bei der Behandlung ergänzen, wie chemotherapeutische oder radioaktive Mittel. Derartige zusätzliche Faktoren und/oder Mittel können in die Zusammensetzung unter Bildung einer synergistischen Wirkung mit dem erfindungsgemäßen Protein oder zum Minimieren von Nebenwirkungen eingeschlossen werden. Außerdem kann die Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung gleichzeitig mit anderen Therapien erfolgen, z.B. kann sie in Verbindung mit einer Chemotherapie- oder Strahlungstherapiebehandlung verabreicht werden.
Die Angiogenese kann in Säuger- (z.B. menschlichen) Geweben durch Kontaktieren des Gewebes mit einer Zusammensetzung gehemmt werden, die das erfindungsgemäße Protein umfasst. Mit „Kontaktieren" ist nicht nur die topische Anwendung sondern sind auch diejenigen Abgabeweisen gemeint, durch die die Zusammensetzung in das Gewebe oder in die Zellen der Gewebe eingeführt wird.
Die Verwendung von Systemen zeitlich festgelegter Abgabe oder langanhaltender Abgabesysteme ist ebenfalls in der Erfindung eingeschlossen. Derartige Systeme sind in Situationen äußerst wünschenswert, wo ein chirurgischer Eingriff schwierig oder unmöglich ist, z.B. bei Patienten, die durch ihr Alter oder den Krankheitsverlauf selbst geschwächt sind oder wo die Risiko-Nutzen-Analyse die Kontrolle der Heilung diktiert.
Eine Matrix langanhaltender Wirkung, wie hier verwendet, ist eine Matrix, die aus Materialien, gewöhnlich Polymeren, hergestellt ist, die durch enzymatische oder Säure/Base-Hydrolyse oder durch Lösen abbaubar sind. Nachdem sie einmal in den Körper eingeführt worden ist, wird die Matrix durch Enzyme und Körperfluide bearbeitet. Wünschenswerterweise wird die Matrix langanhaltender Wirkung aus bioverträglichen Materialien wie Liposomen, Polylactiden (Polymilchsäure), Polyglykolid (Polymer von Glykolsäure), Polylactidcoglykolid (Copolymeren von Milchsäure und Glykolsäure)polyanhydriden, Poly(ortho)estern, Polyproteinen, Hyaluronsäure, Collagen, Chondroitinsulfat, Carbonsäuren, Fettsäuren, Phospholipiden, Polysacchariden, Nukleinsäuren, Polyaminosäuren, Aminosäuren wie Phenylalanin, Tyrosin, Isoleucin, Polynukleotiden, Polyvinylpropylen, Polyvinylpyrrolidon und Silicon ausgewählt. Eine bevorzugte biologisch abbaubare Matrix ist eine Matrix von einem von entweder Polylactid, Polyglykolid oder Polylactidcoglykolid (Copolymeren von Milchsäure und Glykolsäure).
Die erfindungsgemäße, Angiogenese modulierende Zusammensetzung kann ein Feststoff, eine Flüssigkeit oder ein Aerosol sein und kann durch irgendeinen bekannten Verabreichungsweg verabreicht werden. Beispiele fester Zusammensetzungen umfassen Pillen, Cremes und implantierbare Dosiereinheiten. Die Pillen können oral verabreicht werden, die therapeutischen Cremes können topisch verabreicht werden. Die implantierbare Dosiereinheit kann lokal, beispielsweise an einer Tumorstelle, verabreicht werden oder sie kann zur systemischen Freisetzung der die Angiogenese modulierenden Zusammensetzung beispielsweise subkutan verabreicht werden. Beispiele flüssiger Zusammensetzungen umfassen Rezepturen, die für die subkutane, intravenöse, intraarterielle Einspritzung geeignet sind und Rezepturen für die topische und intraokuläre Verabreichung. Beispiele von Aerosolrezepturen umfassen Inhalatorrezepturen für die Verabreichung in die Lungen.
Die Proteine und Proteinfragmente mit der oben beschriebenen anti-angiogenen Aktivität können als isolierte und im Wesentlichen gereinigte Proteine und Proteinfragmente in pharmazeutisch akzeptablen Rezepturen unter Anwendung von Formulierungsverfahren bereitgestellt werden, die den mit dem Stand der Technik vertrauten Fachleuten bekannt sind. Diese Rezepturen können durch Standardwege verabreicht werden. Im Allgemeinen können Kombinationen auf topischem, transdermalem, intraperitonealem, intrakranialem intrazerebroventrikularem, intrazerebralem, intravaginalem, intrauterinem, oralem, rektalem oder parenteralem (z.B. intravenösem, intraspinalem, subkutanem oder intramuskulärem) Weg verabreicht werden. Außerdem können die anti-angiogenen Proteine in biologisch abbaubare Polymere eingearbeitet werden, was die langanhaltende Freisetzung der Verbindung erlaubt, wobei die Polymere in der Nähe der Stelle implantiert werden, wo die Arzneimittelabgabe erwünscht ist, beispielsweise an der Stelle eines Tumors oder Implantats, derart, dass die anti-angiogenen Proteine langsam systemisch freigegeben werden. Osmotische Minipumpen können zum Bereitstellen einer gesteuerten Abgabe hoher Konzentrationen der anti-angiogenen Proteine durch Kanüle an die Stelle, die von Interesse ist, wie beispielsweise direkt in ein Metastasengeschwür oder in die Gefäßversorgung zum Tumor verwendet werden. Die biologisch abbaubaren Polymere und ihre Verwendung sind beispielsweise im Einzelnen bei Brem et al. (1991, J. Neurosurg. 74: 441–61 beschrieben.
Die Zusammensetzungen, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid enthalten, können intravenös, wie beispielsweise durch Einspritzen einer Einheitsdosis, verabreicht werden. Der Begriff „Einheitsdosis", wenn er mit Bezug auf eine erfindungsgemäße therapeutische Zusammensetzung verwendet wird, bezieht sich auf physikalisch unabhängige Einheiten, die als Einheitsdosis für den Patienten geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge aktives Material enthält, die zum Erzeugen der erwünschten therapeutischen Wirkung in Verbindung mit dem erforderlichen Verdünnungsmittel, d.h. einem Träger oder Vehikel, berechnet worden ist.
Verabreichungswege für die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen umfassen die intravenöse, intramuskuläre, intraperitoneale, intrasternale, subkutane und intraartikuläre Einspritzung und Infusion. Pharmazeutische Zusammensetzungen für die parenterale Einspritzung umfassen pharmazeutisch akzeptable sterile, wässrige und nichtwässrige Lösungen, Dispersionen, Suspensionen oder Emulsionen sowie sterile Pulver für die Rekonstitution zu sterilen einspritzbaren Lösungen oder Dispersionen kurz vor der Verwendung. Beispiele geeigneter wässriger und nichtwässriger Träger, Verdünnungsmittel, Lösungsmittel oder Vehikel umfassen Wasser, Ethanol, Polyole (z.B. Glycerin, Propylenglykol, Polyethylenglykol und dergleichen), Carboxymethylcellulose und geeignete Mischungen davon, Pflanzenöle (z.B. Olivenöl) und einspritzbare organische Ester wie Ethyloleat. Die richtige Fluidität kann beispielsweise durch Verwendung von Beschichtungsmaterialien wie Lecithin, durch Beibehalten der erforderlichen Teilchengröße im Falle von Dispersionen und durch Verwendung von Tensiden aufrechterhalten werden. Diese Zusammensetzungen können auch Hilfsmittel wie Konservierungsmittel, Benetzungsmittel, Emulgatoren und Dispergierhilfsmittel enthalten. Die Verhinderung der Wirkung von Mikroorganismen kann durch Einschließen verschiedener antibakterieller und antifungaler Mittel wie Paraben, Chlorbutanol, Phenolsorbinsäure und dergleichen sichergestellt werden. Es kann auch wünschenswert sein, isotonische Mittel wie Zucker, Natriumchlorid und dergleichen einzuschließen. Die Absorption der einspritzbaren pharmazeutischen Form über längere Zeit kann durch Einschließen von Mitteln wie Aluminiummonostearat und Gelatine herbeigeführt werden die die Absorption verzögern. Einspritzbare Depotformen werden durch Bilden von Mikroverkapselungsmatrizen des Arzneimittels in biologisch abbaubaren Polymeren wie beispielsweise Polylactid-Polyglykolid, Poly(orthoestern) und Poly(anhydriden) hergestellt. Je nach dem Verhältnis des Arzneimittels zum Polymer und der Natur des spezifischen angewendeten Polymers kann die Freisetzungsrate des Arzneimittels reguliert werden. Einspritzbare Depotformulierungen werden ebenfalls durch Einschließen des Arzneimittels in Liposome oder Mikroemulsionen, die mit Körpergeweben verträglich sind, hergestellt. Die einspritzbaren Formulierungen können beispielsweise durch Filtrieren durch ein Bakterien zurückhaltendes Filter oder durch Einarbeiten von Sterilisiermittel in Form steriler fester Zusammensetzungen sterilisiert werden, die in sterilem Wasser oder anderen sterilen einspritzbaren Medien kurz vor der Verwendung gelöst oder dispergiert werden können.
Die erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzungen können pharmazeutisch akzeptable Salze der darin enthaltenen Komponenten, die z.B. von anorganischen oder organischen Säuren deriviert sein können, umfassen. Mit „pharmazeutisch akzeptablem Salz" sind diejenigen Salze gemeint, die innerhalb des Umfang einer vernünftigen ärztlichen Beurteilung für die Verwendung im Kontakt mit den Geweben von Menschen oder niederen Tieren ohne übermäßige Toxizität, Reizung, allergische Reaktion und dergleichen und einem vernünftigen Nutzen-Risiko-Verhältnis entsprechend geeignet sind. Pharmazeutisch akzeptable Salze sind im Stand der Technik allgemein bekannt. Beispielsweise beschreiben S. M. Berge et al. pharmazeutisch akzeptable Salze im Einzelnen in J. Pharmaceutical Sciences (1977) 66: 1 et seq. Pharmazeutisch akzeptable Salze umfassen die sauren Additionssalze (die mit den freien Aminogruppen des Polypeptids gebildet werden), die mit anorganischen Säuren wie beispielsweise Salz- oder Phosphorsäure gebildet werden, oder organische Säuren wie Essig-, Wein-, Mandelsäure und dergleichen. Salze, die mit den freien Carboxylgruppen gebildet werden, können auch von anorganischen Basen wie beispielsweise Natrium, Kalium, Ammonium, Calcium oder Eisen(III)hydroxiden und organischen Basen wie Isopropylamin, Trimethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Procain und dergleichen deriviert werden. Die Salze können in situ während der endgültigen Isolierung und Reinigung der erfindungsgemäßen Verbindungen oder getrennt durch Reagieren einer freien Basenfunktion mit einer geeigneten organischen Säure hergestellt werden. Repräsentative saure Additionssalze umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Acetat, Adipat, Alginat, Citrat, Aspartat, Benzoat, Benzolsulfonat, Bisulfat, Butyrat, Campherat, Campfersulfonat, Digluconat, Glycerophosphat, Hemisulfat, Heptanoat, Hexanoat, Fumarat, Hydrochlorid, Hydrobromid, Hydroiodid, 2-Hydroxymethansulfonat (Isethionat), Lactat, Maleat, Methansulfonat, Nicotinat, 2-Naphthalinsulfonat, Oxalat, Pamoat, Pectinat, Persulfat, 3-Phenylpropionat, Picrat, Pivalat, Propionat, Succinat, Tartrat, Thiocyanat, Phosphat, Glutamat, Bicarbonat, p-Toluolsulfonat und Undecanoat. Auch können die basischen stickstoffhaltigen Gruppen mit Mitteln wie niedrigen Alkylhalogeniden wie Methyl-, Ethyl-, Propyl- und Butylchloriden, -bromiden und -iodiden; Dialkylsulfaten wie Dimethyl-, Diethyl-, Dibutyl- und Diamylsulfaten; langkettigen Halogeniden wie Decyl-, Lauryl-, Myristyl- und Stearylchloriden, -bromiden und -iodiden; Arylalkylhalogeniden wie Benzyl- und Phenethylbromiden und anderen quaternisiert werden. Wasser- oder öllösliche oder -dispergierbare Produkte werden dadurch erhalten. Beispiele von Säuren, die verwendet werden können, um pharmazeutisch akzeptable Additionssalze zu bilden, umfassen anorganische Säuren wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure und organische Säuren wie Oxalsäure, Maleinsäure, Bernsteinsäure und Zitronensäure.
Die Begriffe „pharmazeutisch akzeptabel" und „physiologisch tolerierbar" und grammatikalische Variationen derselben, wie sie sich auf Zusammensetzungen, Träger, Verdünnungsmittel und Reagenzien beziehen, werden austauschbar verwendet und bedeuten, dass die Materialien dazu fähig sind, einem Säuger verabreicht oder daran angewendet werden mit einem Minimum an unerwünschten physiologischen Auswirkungen wie Übelkeit, Schwindelgefühl, Magenverstimmungen und dergleichen. Die Herstellung einer pharmakologischen Zusammensetzung, die aktive Bestandteile enthält, die darin gelöst oder dispergiert sind, ist im Stand der Technik allgemein bekannt und braucht auf der Basis der Rezeptur nicht eingeschränkt zu werden. Typischerweise werden derartige Zusammensetzungen als einspritzbare Substanzen entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen hergestellt, jedoch können feste Formen, die für das Lösen geeignet sind, oder Suspensionen in Flüssigkeit vor der Verwendung ebenfalls hergestellt werden. Die Zubereitung kann auch emulgiert werden.
Der aktive Bestandteil kann mit Vehikeln, die pharmazeutisch akzeptabel und mit dem aktiven Bestandteil verträglich sind in Mengen, die für die Verwendung bei den hier beschriebenen therapeutischen Verfahren geeignet sind, gemischt werden. Geeignete Vehikel umfassen beispielsweise Wasser, physiologische Kochsalzlösung, Dextrose, Glycerin, Ethanol oder dergleichen und Kombinationen derselben. Außerdem kann die Zusammensetzung, falls erwünscht, geringe Mengen an Hilfssubstanzen wie Benetzungsmittel oder Emulgatoren, pH-Puffermittel und dergleichen enthalten, die die Wirksamkeit des aktiven Bestandteils verbessern.
Die erfindungsgemäßen anti-angiogenen Proteine können auch in eine Zusammensetzung eingearbeitet werden, die ein Prodrug umfasst. Der Begriff „Prodrug", wie hier verwendet, bezieht sich auf Verbindungen, die in vivo schnell unter Bildung der Stammverbindung, beispielsweise durch enzymatische Hydrolyse im Blut umgewandelt werden. Eine eingehende Diskussion ist bei T. Higuchi und V. Stella, Prodrugs as Novel Delivery Systems (Prodrugs als neuartige Abgabesysteme) Band 14, der ACS-Symposiumsserie und bei Edward B. Roche, Verfasser, Bioreversible Carriers in Drug Design (Bioreversible Träger bei der Entwicklung von Arzneimitteln), American Pharmaceutical Association und Pergamon Press, 1987 geboten. Der Begriff „pharmazeutisch akzeptables Prodrug", wie hier verwendet, bezieht sich auf (1) diejenigen Prodrugs der erfindungsgemäßen Verbindungen, die innerhalb des Umfangs einer vernünftigen ärztlichen Beurteilung zur Verwendung im Kontakt mit den Geweben von Menschen und Tieren ohne übermäßige Toxizität, Reizung, allergische Reaktion und dergleichen und einem geeigneten Nutzen/Risiko-Verhältnis entsprechend geeignet und für die für sie beabsichtigte Verwendung wirksam sind und (2) Zwitterionenformen, soweit möglich, der Stammverbindung.
Die Dosierung der erfindungsgemäßen anti-angiogenen Proteine hängt vom Krankheits- oder dem krankhaften Zustand, der behandelt wird und anderen klinischen Faktoren, wie dem Gewicht und dem Zustand des Menschen oder Tiers und dem Verabreichungsweg der Verbindung ab. Je nach der Halbwertzeit der anti-angiogenen Proteine in dem spezifischen Tier oder Menschen können die anti-angiogenen Proteine mehrere Male pro Tag bis einmal wöchentlich verabreicht werden. Man sollte sich im Klaren darüber sein, dass die vorliegende Erfindung auf die Anwendung sowohl bei Menschen als auch im tierärztlichen Bereich zutrifft. Die erfindungsgemäßen Verfahren ziehen einzelne sowie mehrfache Verabreichungen in Erwägung, die entweder gleichzeitig oder über eine längere Zeitspanne verabreicht werden. Außerdem können die anti-angiogenen Proteine in Verbindung mit anderen Therapieformen, z.B. der Chemotherapie, Röntgentherapie oder Immuntherapie, verabreicht werden.
Die anti-angiogenen Proteinrezepturen umfassen diejenigen, die für die orale, rektale, ophthalmische (einschließlich intravitreale oder intrakamerale), nasale, topische (einschließlich bukkale und sublinguale), intrauterine, vaginale oder parenterale (einschließlich subkutane, intraperitoneale, intramuskuläre, intravenöse, intradermale, intrakraniale, intratracheale und epidurale) Verabreichung geeignet sind. Die anti-angiogenen Proteinrezepturen können bequemerweise in Einheitsdosierform vorgelegt und durch herkömmliche pharmazeutische Techniken hergestellt werden. Derartige Techniken umfassen den Schritt des Assoziierens des aktiven Bestandteils und des bzw. der pharmazeutischen Träger(s) und Vehikel(s). Im Allgemeinen werden die Rezepturen durch einheitliches und inniges Assoziieren des aktiven Bestandteils mit den flüssigen Trägern oder feinverteilten festen Trägern oder beiden und daraufhin Formen des Produkts, falls notwendig, hergestellt.
Rezepturen, die für die parenterale Verabreichung geeignet sind, umfassen wässrige und nichtwässrige sterile Einspritzlösungen, die Antioxidantien, Puffermittel, Bakteriostate und gelöste Substanzen enthalten können, die die Rezeptur mit dem Blut des beabsichtigten Empfängers isotonisch machen; und wässrige und nichtwässrige sterile Suspensionen, die Suspendiermittel und Verdickungsmittel umfassen können. Die Rezepturen können in Einheitsdosen- oder Mehrfachdosenbehältern, beispielsweise dicht geschlossenen Ampullen und Phiolen vorgelegt werden und können im gefriergetrockneten (lyophilisierten) Zustand aufbewahrt werden, wo sie nur den Zusatz der sterilen flüssigen Trägers, beispielsweise Wasser, für das Einspritzen direkt vor der Verwendung erfordern. Aus dem Stegreif gebildete Einspritzlösungen und -suspensionen können aus sterilen Pulvern, Granulat und Tabletten der oben beschriebenen Art hergestellt werden.
Wenn eine wirksame Menge erfindungsgemäßes Protein oral verabreicht wird, so liegen die erfindungsgemäßen anti-angiogenen Proteine in Form einer Tablette, Kapsel, eines Pulvers, einer Lösung oder eines Elixiers vor. Wenn sie in Tablettenform verabreicht wird, so kann die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung außerdem einen festen Träger wie Gelatine oder ein Hilfsmittel enthalten. Die Tablette, Kapsel und das Pulver enthält etwa 5 bis 95% erfindungsgemäßes Protein und bevorzugt etwa 25 bis 90% erfindungsgemäß Protein. Wenn sie in flüssiger Form verabreicht wird, so kann ein flüssiger Träger wie Wasser, Benzin, Öle tierischen oder pflanzlichen Ursprungs wie Erdnussöl, Mineralöl, Sojabohnenöl oder Sesamöl oder synthetische Öle zugegeben werden. Die flüssige Form der pharmazeutischen Zusammensetzung kann des Weiteren physiologische Kochsalzlösung, Dextrose oder andere Saccharidlösung oder Glykole wie Ethylenglykol, Propylenglykol oder Polyethylenglykol enthalten. Wenn sie in flüssiger Form verabreicht wird, so enthält die pharmazeutische Zusammensetzung etwa 0,5 bis 90 Gew.-% erfindungsgemäßes Protein und bevorzugt etwa 1 bis 50% erfindungsgemäßes Protein.
Wenn eine wirksame Menge erfindungsgemäßes Protein intravenös, kutan oder subkutan verabreicht wird, so liegt das erfindungsgemäße anti-angiogene Protein in Form einer pyrogenfreien, parenteral akzeptablen wässrigen Lösung vor. Die Herstellung derartiger parenteral akzeptabler Proteinlösungen liegt – unter Berücksichtigung des pH-Werts, der Isotonizität, Beständigkeit und dergleichen, innerhalb der Fähigkeiten des Fachmanns. Eine bevorzugte pharmazeutische Zusammensetzung für die intravenöse, kutane oder subkutane Einspritzung sollte zusätzlich zum erfindungsgemäßen Protein ein isotonisches Vehikel wie Natriumchlorideinspritz-, Ringer-Einspritz-, Dextroseeinspritz-, Dextrose- und Natriumchlorideinspritz-, Ringer-Einspritzlösung mit Lactat oder ein anders Vehikel, wie im Stand der Technik bekannt, enthalten. Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann auch Stabilisatoren, Konservierungsstoffe, Puffermittel, Antioxidantien oder andere Zusatzmittel enthalten, die dem mit dem Stand der Technik vertrauten Fachmann bekannt sind.
Die Menge an erfindungsgemäßem Protein in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung hängt von der Art und Ernsthaftigkeit des Zustands, der behandelt wird, und der Art der vorherigen Behandlung, die der Patient erfahren hat, ab. Letzten Endes wird der behandelnde Arzt die Menge des erfindungsgemäßen Proteins bestimmen, mit der jeder einzelne Patient zu behandeln ist, bestimmt. Zu Beginn wird der behandelnde Arzt geringe Dosen des erfindungsgemäßen Proteins verabreichen und die Reaktion des Patienten beobachten. Größere Dosen des erfindungsgemäßen Proteins können erst dann verabreicht werden, wenn die optimale therapeutische Wirkung für den Patienten erreicht worden ist, und auf diesen Punkt hin wird die Dosis nicht mehr erhöht.
Die Dauer der intravenösen Therapie unter Anwendung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung wird je nach der Ernsthaftigkeit der Krankheit, die behandelt wird und dem Zustand und der potentiellen idiosynkratischen Reaktion jedes einzelnen Patienten unterschiedlich sein. Es wird in Betracht gezogen, dass die Dauer jeder Anwendung des erfindungsgemäßen Proteins im Bereich von 12 bis 24 Stunden kontinuierlicher intravenöser Verabreichung liegt. Letzten Endes wird der behandelnde Arzt die geeignete Dauer der intravenösen Therapie unter Anwendung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung bestimmen.
Bevorzugte Einheitsdosisrezepturen sind diejenigen, die eine Tagesdosis oder -einheit, Tagesteildosis oder einen geegneten Teil derselben des verabreichten Bestandteils enthalten. Man sollte sich im Klaren darüber sein, dass zusätzlich zu den Bestandteilen, die oben spezifisch erwähnt worden sind, die erfindungsgemäßen Rezepturen andere Mittel, die im Stand der Technik mit Bezug auf den Typ der in Frage kommenden Rezeptur herkömmlich sind, eingearbeitet werden können. Wahlweise können zytotoxische Mittel in die anti-angiogenen Proteine oder biologischen funktionellen Proteinfragmente derselben zum Bereitstellen einer doppelten Therapie für den Patienten eingearbeitet werden oder auf andere Weise damit kombiniert.
Die therapeutischen Zusammensetzung sind zurzeit auch für Anwendungen im tierärztlichen Bereich wertvoll. Insbesondere sind Haustiere und Rassepferde, außer Menschen, hocherwünschte Patienten für eine derartige Behandlung mit den erfindungsgemäßen Proteinen.
Zytotoxische Mittel wie Ricin können mit den anti-angiogenen Proteinen und Fragmenten derselben verknüpft werden, wodurch ein Werkzeug für die Zerstörung von Zellen bereitgestellt wird, die die anti-angiogenen Proteine binden. Diese Zellen sind an vielen Stellen aufzufinden, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, Mikrometastasen und primäre Tumoren. Proteine, die mit zytotoxischen Mitteln verknüpft sind, werden auf eine Art und Weise infusioniert, die zum Maximieren der Abgabe an die erwünschte Stelle geeignet ist. Beispielsweise werden die mit Ricin verknüpften Hochaffinitätsfragmente durch eine Kanüle in Gefäße, die die Zielstelle beliefern, oder direkt in die Zielstelle abgegeben. Derartige Mittel werden auch auf regulierte Weise durch osmotische Pumpen, die mit Infusionskanülen gekoppelt sind, abgegeben. Eine Kombination von Antagonisten zu den anti-angiogenen Proteinen kann gleichzeitig mit Stimulatoren der Angiogenese zum Erhöhen der Vaskularisation des Gewebes angewendet werden. Diese therapeutische Behandlung bietet eine wirksame Möglichkeit zum Zerstören von Metastasenkrebs.
Zusätzliche Behandlungsmethoden umfassen die Verabreichung der anti-angiogenen Proteine, Fragmente, Analoge, Antisera oder Rezeptoragonisten und -antagonisten derselben, die mit zytotoxischen Mitteln verknüpft sind. Man sollte sich im Klaren darüber sein, dass die anti-angiogenen Proteine menschlichen oder tierischen Ursprungs sein können. Die anti-angiogenen Proteine können auch synthetisch durch chemische Reaktion oder rekombinante Techniken in Verbindung mit Expressionssystemen hergestellt werden. Die anti-angiogenen Proteine können auch durch enzymatisches Spalten von isoliertem Laminin unter Bildung von Proteinen mit anti-angiogener Aktivität hergestellt werden. Die anti-angiogenen Proteine können auch durch Verbindungen hergestellt werden, die die Wirkung endogener Enzyme, die Laminin zu den anti-angiogenen Proteinen spalten nachahmen. Die Herstellung der anti-angiogenen Proteine kann auch durch Verbindungen moduliert werden, die die Aktivität von Spaltungsenzymen beeinflussen.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Gentherapie, wobei ein Polynukleotid, das die anti-angiogenen Proteine kodiert, Integrine, Integrinuntereinheiten oder ein Mutant, ein Fragment oder Fusionsprotein desselben, in einen Patienten eingeführt und reguliert wird. Verschiedene Verfahren zum Übertragen oder Abgeben von DNA an Zellen für die Expression des Genproduktproteins, ansonsten als Gentherapie bezeichnet, werden in Gene Transfer into Mammalian Somatic Cells in vivo (Genübertragung in somatische Säugerzellen in vivo), N. Yang (1992) Crit. Rev. Biotechn 12 (4): 335–56 offenbart. Die Gentherapie umfasst das Einarbeiten von DNA-Sequenzen in somatische Zellen oder Keimzelllinien zur Verwendung entweder bei der ex vivo- oder der in vivo-Therapie. Die Gentherapie hat die Wirkung des Ersetzens von Genen, des Erhöhens der normalen oder anormalen Genfunktion und des Bekämpfens infektiöser Krankheiten und anderer Pathologien.
Strategien für die Behandlung dieser medizinischen Probleme durch Gentherapie umfassen therapeutische Strategien, wie das Identifizieren des defekten Gens und das darauffolgende Zugeben eines funktionellen Gens entweder zum Ersetzen der Funktion des defektiven Gens oder zum Erhöhen eines kaum funktionellen Gens, oder prophylaktische Strategien wie Zugeben eines Gens für das Produktprotein, das für die Behandlung des Zustands geeignet ist oder das das Gewebe oder Organ für eine Behandlung zugänglicher macht. Als Beispiel einer prophylaktischen Strategie kann ein Gen, wie dasjenige, das ein oder mehrere der anti-angiogenen Proteine kodiert, in einen Patienten eingegeben werden und verhindert so das Auftreten der Angiogenese; oder ein Gen, das Tumorzellen für die Bestrahlung zugänglicher macht, könnte insertiert werden und dann würde das Bestrahlen des Tumors die Abtötung der Tumorzellen verbessern.
Viele Protokolle für die Übertragung der DNA oder von Regulationssequenzen der anti-angiogenen Proteine werden bei dieser Erfindung in Betracht gezogen. Die Transfektion von Promotorsequenzen, bei denen es sich um andere handelt als eine, die sich normalerweise als spezifisch mit den anti-angiogenen Proteinen assoziiert erwiesen hat, oder anderen Sequenzen, die die Herstellung der anti-angiogenen Proteine erhöhen würden, werden ebenfalls als Methoden der Gentherapie in Betracht gezogen. Ein Beispiel dieser Technologie ist bei Transkaryotic Therapies, Inc. Cambridge, Mass. vorzufinden, wobei die homologe Rekombination zum Insertieren eines „genetischen Wechsels" verwendet wird, durch den ein ErythropoietinGen in Zellen eingeschaltet wird. Man vergleiche Genetic Engineering New, Apr. 15, 1994. Derartige „genetische Wechsel" könnten zum Aktivieren der anti-angiogenen Proteine (oder ihrer Rezeptoren) in Zellen verwendet werden, die diese Proteine (oder Rezeptoren) normalerweise nicht exprimieren.
Genübertragungsmethoden für die Gentherapie fallen in drei breite Gruppen: physikalische (z.B. Elektroporation, direkte Genübertragung und Teilchenbombardierung), chemische (z.B. Träger auf Lipidbasis oder andere nichtvirale Vektoren) und biologische (z.B. von Viren derivierter Vektor- und Rezeptor-Uptake). Beispielsweise können nichtvirale Vektoren verwendet werden, die Liposome umfassen, die mit DNA beschichtet sind. Derartige Liposom/DNA-Komplexe können direkt intravenös in den Patienten eingespritzt werden. Man glaubt, dass die Liposom/DNA-Komplexe in der Leber konzentriert werden, wo sie die DNA an Makrophagen und Kupffer-Zellen abgeben. Diese Zellen sind langlebig und bieten so die Langzeitexpression der abgegebenen DNA. Außerdem können Vektoren oder die „nackte" DNA des Gens direkt in das erwünschte Organ, Gewebe oder den erwünschten Tumor für die gezielte Abgabe der therapeutischen DNA eingespritzt werden.
Gentherapiemethodologien können auch durch die Abgabestelle beschrieben werden. Grundsätzliche Wege zum Abgeben von Genen umfassen die ex vivo-Genübertragung, die in vivo-Genübertragung und die in vitro-Genübertragung. Die DNA wird in die Zellen transfiziert, die transfizierten Zellen werden zahlenmäßig vergrößert und dann in den Patienten erneut implantiert. Bei der in vitro-Gentherapie sind die transformierten Zellen Zellen, die in einem Kulturmedium gezüchtet werden, wie beispielsweise Gewebekulturzellen, und nicht spezifische Zellen aus einem spezifischen Patienten. Diese „Laborzellen" werden transfiziert, die transfizierten Zellen werden ausgewählt und entweder zum Implantieren in einen Patienten oder für andere Anwendungen expandiert.
Die in vivo-Genübertragung involviert das Einführen der DNA in die Zellen des Patienten, wenn sich die Zellen in dem Patienten befinden. Die Verfahren umfassen die Anwendung der viral vermittelten Genübertragung unter Anwendung nichtinfektiöser Viren zum Abgeben des Gens an den Patienten oder das Einspritzen nackter DNA in eine Stelle im Patienten und die DNA wird durch einen Prozentsatz der Zellen aufgenommen, in denen das Genproduktprotein exprimiert wird. Außerdem können die anderen hier beschriebenen Verfahren, wie beispielsweise die Verwendung einer „Genpistole", für die in vitro-Insertion der DNA oder von Regulationssequenzen, die die Herstellung der anti-angiogenen Proteine regulieren, angewendet werden.
Chemische Verfahren der Gentherapie können eine Verbindung auf Lipidbasis, nicht notwendigerweise ein Liposom, zum Übertragen der DNA durch die Zellmembran involvieren. Lipofectine oder Cytotectine, positive Ionen auf Lipidbasis, die an negativ geladene DNA binden, bilden einen Komplex, der die Zellmembran überqueren kann und die DNA in das Innere der Zelle überträgt. Bei einem anderen chemischen Verfahren wird die Endozytose auf Rezeptorbasis verwendet, was das Binden eines spezifischen Liganden an einen Zelloberflächenrezeptor und das Umhüllen und Transportieren desselben durch die Zellmembran hindurch involviert. Der Ligand bindet an die DNA und der gesamte Komplex wird in die Zelle transportiert. Der Ligand-Genkomplex wird in den Blutstrom eingespritzt und dann binden Zielzellen, die den Rezeptor aufgenommen haben, den Liganden spezifisch und transportieren den Ligand-DNA-Komplex in die Zelle.
Bei vielen Gentherapiemethodologien werden virale Vektoren zum Insertieren von Genen in Zellen verwendet. Beispielsweise sind geänderte Retrovirusvektoren bei ex vivo-Methoden zum Einführen von Genen in periphere und tumorinfiltrierende Lymphozyten, Hepatozyten, epidermale Zellen, Myozyten und andere somatische Zellen verwendet worden. Diese geänderten Zellen werden dann in den Patienten eingeführt, um das Genprodukt aus der insertierten DNA bereitzustellen.
Virale Vektoren sind auch zum Insertieren von Genen in Zellen unter Anwendung von in vivo-Protokollen verwendet worden. Um die gewebespezifische Expression fremder Gene zu dirigieren, können cis-wirkende Regulationselemente oder -promotoren, von denen bekannt, dass sie gewebespezifisch sind, verwendet werden. Als Alternative kann dies durch Anwendung der in situ-Abgabe von DNA oder viralen Vektoren an spezifische anatomische Stellen in vivo erreicht werden. Beispielsweise wurde die Genübertragung an Blutgefäße in vivo durch Implantieren in vitro transduzierter Endothelzellen in ausgewählte Stellen an Arterienwänden erreicht. Das Virus infizierte umgebenden Zellen, die das Genprodukt ebenfalls exprimierten. Ein viraler Vektor kann direkt an die in vivo-Stelle, beispielsweise durch einen Katheter, geliefert werden, was es erlaubt, dass nur gewisse Bereiche durch das Virus infiziert werden und eine stellenspezifische Langzeitgenexpression bereitgestellt wird. Die in vivo-Genübertragung unter Anwendung von Retrovirusvektoren ist auch in Brustgewebe und Lebergewebe durch Injizieren des geänderten Virus in Blutgefäße, die zu den Organen führen, aufgezeigt worden.
Virale Vektoren, die für Gentherapieprotokolle verwendet worden sind, umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Retroviren, andere RNA-Viren wie Poliovirus oder Sindbis-Virus, Adenovirus, adenoassoziiertes Virus, Herpesvirus, SV 40, Vaccinia und andere DNA-Viren. Replikationsdefektive murine retrovirale Vektoren sind die am häufigsten verwendeten Genübertragungsvektoren. Murine Leukämieretroviren bestehen aus einer einstrangigen RNA, die mit einem Nuklearkernprotein und Polymerase-(Pol)-Enzymen komplexverbunden, durch einen Proteinkern (gag) eingeschlossen und von einer Glykoproteinhülle (env) umgeben worden ist, die den Wirtsbereich bestimmt. Die genomische Struktur von Retroviren umfasst gag-, pol- und env-Gene, die durch die 5' und 3' langen terminalen Wiederholungen (LTR) umschlossen sind. Retrovirusvektorsysteme machen sich die Tatsache zu Nutze, dass ein minimaler Vektor, der die 5'- und 3'-LTR enthält, und die Packungssignale ausreichen, um die Vektorpackung, Infektion und Integration in Zielzellen zu erlauben, vorausgesetzt, dass die strukturellen Virusproteine in der Packungszelllinie trans geliefert werden. Grundlegende Vorteile retroviraler Vektoren für die Genübertragung umfassen die effiziente Infektion und Genexpression in den meisten Zelltypen, die genaue Einzelkopievektorintegration in chromosomale Zielzellen-DNA und die Leichtigkeit der Manipulation des retroviralen Genoms.
Das Adenovirus besteht aus linearer, doppelstrangiger DNA, die mit Kernproteinen komplexverbunden und mit Capsidprotein umgeben ist. Fortschritte in der molekularen Virologie haben zu der Möglichkeit geführt, die Biologie dieser Organismen zum Bilden von Vektoren auszunutzen, die in der Lage sind, neuartige genetische Sequenzen in Zielzellen in vivo zu transduzieren. Vektoren auf Adenovirusbasis exprimieren Genproduktproteine in hohen Niveaus. Adenovirusvektoren weisen hohe Infektionseffizienzen auf, selbst bei niedrigen Virustitern. Außerdem ist das Virus als zellfreies Virion vollständig infektiös, so dass das Einspritzen von Produzentzellinien nicht notwendig ist. Ein anderer potentieller Vorteil von Adenovirusvektoren ist die Fähigkeit, die Langzeitexpression heterologer Gene in vivo zu erreichen.
Mechanische Verfahren für das Abgeben von DNA umfassen fusogene Lipidvesikel, wie beispielsweise Liposome oder andere Vesikel für die Membranfusion, Lipidteilchen von DNA, die kationisches Lipid wie Lipofectin enthalten, durch Polylysin vermittelte Übertragung von DNA, direktes Einspritzen von DNA, wie die Mikroinjizierung von DNA in Keim- oder somatische Zellen, pneumatisch abgegebene, mit DNA beschichtete Teilchen, wie die Goldteilchen, die in einer „Genpistole" verwendet werden, und anorganische chemische Ansätze, wie Calciumphosphattransfektion. Durch Teilchen vermittelte Genübertragungsmethoden wurden zuerst beim Transformieren von Pflanzengeweben verwendet. Mit Hilfe eines Teilchenbombardiergeräts oder einer „Genpistole" wird eine Antriebskraft erzeugt zum Beschleunigen mit DNA beschichteter Hochdichteteilchen (wie beispielsweise Gold oder Wolfram) auf eine hohe Geschwindigkeit, die die Durchdringung der Zielorgane, -gewebe oder -zellen gestattet. Die Teilchenbombardierung kann in in vitro-Systemen oder mit ex vivo- oder in vivo-Techniken zum Einführen von DNA in Zellen, Gewebe oder Organe angewendet werden. Ein anderes Verfahren, die ligandenvermittelte Gentherapie, involviert das Komplexieren der DNA mit spezifischen Liganden unter Bildung von Ligand-DNA-Konjugaten, um die DNA an eine spezifische Zelle oder ein spezifisches Gewebe zu führen.
Es hat sich erwiesen, dass das Einspritzen von Plasmid-DNA in Muskelzellen einen hohen Prozentsatz von Zellen ergibt, die transfiziert sind und eine anhaltende Expression von Markergenen aufweisen. Die DNA des Plasmids kann in das Genom der Zelle integriert sein oder auch nicht. Die Nichtintegration der transfizierten DNA würde die Transfektion und Expression von Genproduktproteinen in terminal differenzierte, nichtproliferativ Gewebe für eine lange Zeitspanne ohne Gefahr von Mutationsinsertionen, -deletionen oder -änderungen des zellulären oder Mitochondriengenoms erlauben. Die Langzeit- jedoch nicht unbedingt permanente, Übertragung therapeutischer Gene in spezifische Zellen kann Behandlungen für genetische Krankheiten oder für die vorbeugende Verwendung bereitstellen. Die DNA könnte periodisch zum Aufrechterhalten des Genproduktniveaus, ohne dass Mutationen in den Genomen der Empfängerzellen auftreten, erneut eingespritzt werden. Die Nichtintegration exogener DNAs kann das Vorliegen mehrerer verschiedener exogener DNA-Konstrukte innerhalb einer Zelle erlauben, wobei alle Konstrukte verschiedene Genprodukte exprimieren.
Bei der Elektroporation für die Genübertragung wird elektrischer Strom zum Herstellen von Zellen oder Gewebe verwendet, die für die durch Elektroporation vermittelte Genübertragung zugänglich sind. Es wird ein kurzer elektrischer Impuls mit einer vorgegebenen Feldstärke zum Erhöhen der Durchlässigkeit einer Membran derart verwendet, dass DNA-Moleküle in die Zellen eindringen können. Diese Technik kann in in vitro-Systemen oder mit ex vitro- oder in vivo-Techniken zum Einführen von DNA in Zellen, Gewebe oder Organe angewendet werden.
Eine durch Träger vermittelte Genübertragung in vivo kann zum Transfizieren fremder DNA in Zellen verwendet werden. Der Träger-DNA-Komplex kann bequemerweise in Körperfluide oder den Blutstrom eingeführt und dann stellenspezifisch an das Zielorgan oder -gewebe im Körper geführt werden. Sowohl Liposome als auch Polykationen, wie Polylysin, Lipofectin oder Cytofectin, können verwendet werden. Liposome können entwickelt werden, die zellspezifisch oder organspezifisch sind und so wird die fremde DNA, die vom Liposom getragen wird, von den Zielzellen aufgenommen. Das Einspritzen von Immunliposomen, die auf einen spezifischen Rezeptor an gewissen Zellen gezielt werden, kann als bequemes Verfahren zum Insertieren der DNA in die Zellen, die den Rezeptor tragen, verwendet werden. Ein anders Trägersystem, das verwendet worden ist, ist das Asiaglykoprotein/Polylysinkonjugatsystem für das Tragen von DNA zu Hepatozyten für die in vivo-Genübertragung.
Die transfizierte DNA kann auch mit anderen Arten von Trägern komplexverbunden werden, so dass die DNA an die Empfängerzellen getragen wird und dann im Zytoplasma oder im Nukleoplasma vorliegt. DNA kann mit nuklearen Trägerproteinen in spezifisch engineerten Vesikelkomplexen gekoppelt und direkt in den Nukleus getragen werden.
Die Genregulation der anti-angiogenen Proteine kann durch Verabreichen von Verbindungen erreicht werden, die an das Gen binden, das eines der anti-angiogenen Proteine oder Kontrollregionen, die mit dem Gen assoziiert sind, oder dessen entsprechenden RNA-Transkript kodiert, um die Transkriptions- oder Translationsrate zu modifizieren. Außerdem können Zellen, die mit einer DNA-Sequenz transfiziert sind, die die anti-angiogenen Proteine kodiert, einem Patienten verabreicht werden, um eine in vivo-Quelle dieser Proteine bereitzustellen. Beispielsweise können Zellen mit einem Vektor transfiziert werden, der eine Nukleinsäuresequenz enthält, die die anti-angiogenen Proteine kodiert. Die transfizierten Zellen können Zellen sein, die aus dem normalen Gewebe des Patienten, dem erkrankten Gewebe des Patienten deriviert sind, oder sie können Nichtpatientenzellen sein.
Beispielsweise können Tumorzellen, die aus einem Patienten entfernt worden sind, mit einem Vektor transfiziert werden, der in der Lage ist, die erfindungsgemäßen Proteine zu exprimieren, und wieder in den Patienten eingeführt werden. Die transfizierten Tumorzellen bilden Proteinspiegel in dem Patienten, die das Wachstum des Tumors hemmen. Die Patienten können Menschen oder nichtmenschliche Tiere sein. Die Zellen können auch durch Nichtvektor- oder physikalische oder chemische Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, wie Elektroporation, Ionoporation oder durch eine „Genpistole" transfiziert werden. Außerdem kann die DNA direkt ohne Träger in einen Patienten eingespritzt werden Insbesondere kann die DNA in die Haut, Muskel oder das Blut eingespritzt werden.
Das Gentherapieprotokoll für das Transfizieren der anti-angiogenen Proteine in einen Patienten kann entweder durch Integrieren der DNA des anti-angiogenen Proteins in das Genom der Zellen, in Minichromosomen oder als getrenntes replizierendes oder nichtreplizierendes DNA-Konstrukt in das Zytoplasma oder Nukleoplasma der Zelle eingeführt werden. Die Expression der anti-angiogenen Proteine kann für eine lange Zeitspanne fortgeführt werden oder sie können periodisch eingespritzt werden, um ein erwünschtes Niveau des Proteins bzw. der Proteine in der Zelle, dem Gewebe oder Organ oder einen vorbestimmten Blutspiegel aufrecht zu erhalten.
Erfindungsgemäße Angiogenese hemmende Proteine können in einer mikrochemischen Standardanlage synthetisiert und mit HPLC und Massenspektrophotometrie auf ihre Reinheit hin geprüft werden. Proteinsyntheseverfahren, HPLC-Reinigung und Massenspektrometrie sind den mit dem Stand der Technik vertrauten Fachleuten allgemein bekannt. Die anti-angiogenen Proteine werden auch in rekombinanten E. Coli- oder Hefeexpressionssystemen hergestellt und mit Säulenchromatographie gereinigt.
Verschiedene Proteinfragmente der intakten anti-angiogenen Proteine können zur Verwendung bei mehreren Anwendungen, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, folgender synthetisiert werden: als Antigene für die Entwicklung spezifischer Antisera, als Agonisten und Antagonisten, die an Bindungstellen der anti-angiogenen Proteine aktiv sind, als Proteine, die an zytotoxische Mittel angeknüpft oder in Kombination damit verwendet werden zum Abtöten von Zellen, die die anti-angiogenen Proteine binden.
Die synthetischen Proteinfragmente der anti-angiogenen Proteine haben eine Reihe verschiedener Anwendungen. Das Protein, das an den bzw. die Rezeptor(en) der anti-angiogenen Proteine mit hoher Spezifizität und Avidität bindet, wird radiomarkiert und zum Sichtbarmachen und Quantifizieren von Bindungsstellen unter Anwendung audioradiographischer und von Membranbindungstechniken verwendet. Diese Anwendung bietet wichtige diagnostische und Forschungswerkzeuge. Die Kenntnis der Bindungseigenschaften des Rezeptors bzw. der Rezeptoren erleichtert das Untersuchen der Transduktionsmechanismen, die mit dem Rezeptor bzw. den Rezeptoren verbunden sind.
Die anti-angiogenen Proteine und die davon derivierten Proteine können mit anderen Molekülen unter Anwendung von Standardverfahren gekoppelt werden. Die Amino- und Carboxyltermini der anti-angiogenen Proteine enthalten sowohl Tyrosin- als auch Lysinreste und werden isotopisch und nichtisotopisch durch viele Techniken markiert, beispielsweise Radiomarkieren unter Anwendung herkömmlicher Techniken Tyrosinreste-Chloramin T, Iodogen, Lactoperoxidase; Lysinreste-Bolton-Hunter-Reagens). Diese Kopplungstechniken sind den mit den Stand der Technik vertrauten Fachleuten allgemein bekannt. Als Alternative wird Tyrosin oder Lysin Fragmenten zugegeben, die diese Reste nicht aufweisen, um das Markieren reaktiver Amino- und Hydroxylgruppen am Protein zu erleichtern. Die Kopplungstechnik wird auf der Basis der funktionellen Gruppen gewählt, die an den Aminosäuren zur Verfügung stehen, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, Amino, Sulfhydral, Carboxyl, Amid, Phenol und Imidazol. Verschiedene Reagenzien, die zum Bewirken dieser Verkopplungen verwendet werden, umfassen unter anderen Glutaraldehyd, diazotisiertes Benzidin, Carbodiimid und p-Benzochinon.
Die anti-angiogenen Proteine werden chemisch an Isotope, Enzyme, Trägerproteine, zytotoxische Mittel, fluoreszierende Moleküle, chemilumineszierende, biolumineszierende und andere Verbindungen für eine Reihe verschiedener Anwendungen gekoppelt. Die Effizienz der Kopplungsreaktion wird durch verschiedene Techniken bestimmt, die für die spezifische Reaktion geeignet sind. Beispielsweisewird die Radiomarkierung eines erfindungsgemäßen Proteins mit ¹²⁵I durch Anwenden von Chloramin T und Na¹²⁵I hoher spezifischer Aktivität erreicht. Die Reaktion wird mit Natriummetabisulfit beendet und die Mischung wird auf wegwerfbaren Säulen entsalzt. Das markierte Protein wird aus der Säule eluiert und Fraktionen werden aufgefangen. Aliquote Teile werden von jeder Fraktion entfernt und die Radioaktivität wird in einem Gammazähler gemessen. Auf diese Weise wird der unreagierte Na¹²⁵I von dem markierten Protein getrennt. Die Proteinfraktionen mit der höchsten spezifischen Radioaktivität werden für die darauffolgende Verwendung, wie die Analyse der Fähigkeit, an Antisera der anti-angiogenen Proteine zu binden, verwendet.
Außerdem ermöglicht das Markieren der anti-angiogenen Proteine mit kurzlebigen Isotopen das Sichtbarmachen von Rezeptorbindungsstellen in vivo unter Anwendung der Positronemissionstomographie oder anderer moderner radiographischer Techniken zum Bestimmen der Position von Tumoren mit den Bindungsstellen der Proteine.
Die systematische Substitution von Aminosäuren innerhalb dieser synthetisierten Proteine ergibt Hochaffinitätsproteinagonisten und -antagonisten gegen den Rezeptor bzw. die Rezeptoren der anti-angiogenen Proteine, die die Bindung an den bzw. die Rezeptor(en) verbessern. Derartige Agonisten werden zum Unterdrücken des Wachstums von Mikrometastasen verwendet, wodurch as Ausbreiten des Krebses eingeschränkt wird. Agonisten gegen die anti-angiogenen Proteine werden in Situationen ungenügender Vaskularisation zum Blockieren der Hemmungswirkungen der anti-angiogenen Proteine und zum Unterstützen der Angiogenese angewendet. Beispielsweise kann diese Behandlung therapeutische Wirkungen zum Unterstützen der Wundheilung bei Diabetes aufweisen.
Die Erfindung wird des Weiteren durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, die nicht so aufgefasst werden sollen, als ob sie auf irgendeine Weise Einschränkungen auf den Umfang derselben auferlegen.
BEISPIELE
Beispiel 1: Rekombinante Herstellung von Matin in E. coli
Die Nukleotid-(SEQ ID NO. 1) und die Aminosäure-(SEQ ID NO. 2)Sequenz für die α1-Kette von Laminin (GenBank Zugang Nr. NM_008480) sind in 1 dargestellt. Die Sequenz, die Matin kodiert (globuläre Domäne 1 oder die G1-Domäne, die sich etwa von Nukleotid 6442 bis Nukleotid 7062 erstreckt), wurde durch PCR aus dem Plasmid FBssrAi mit Hilfe des Vorwärts-Primers 5'-CGG-GAT-CCT-AGA-GAC-TGC-ATC-CGC-GCC-TAT-3' (SEQ ID NO. 3) und des reversen Primers
verstärkt (unterstrichene Abschnitte des Primers stellen die Laminin-Sequenz dar). Das daraus resultierende cDNA-Fragment wurde mit BamHI und HindIII verdaut und zu vorverdautem pET22b(+) ligiert (Novagen, Madison, Wisconsin, USA). Das Konstrukt ist in 2 dargestellt. Die Ligation ordnete Matin in-frame mit der peIB-Führungssequenz an, was periplasmische Lokalisierung und Expression von löslichem Protein ermöglichte. Das 3'-Ende der Sequenz wurde in-frame mit der Polyhistidin-Tag-Sequenz ligiert.
Es wurden Plasmidkonstrukte, die Matin kodieren, zuerst in E. coli HMS174 (Novagen, Madison, Wisconsin, USA) transformiert und dann in BL21 zur Expression (Novagen, Madison, Wisconsin, USA) transformiert. Es wurde eine über Nacht gezüchtete Bakterienkultur zum Beimpfen einer Kultur von 500 ml in LB-Medium (Fisher Scientific, Pittsburgh, Pennsylvania, USA) verwendet. Diese Kultur wurde etwa 4 Stunden lang gezüchtet, bis die Zellen eine OD₆₀₀ von 0,6 erreichten. Die Proteinexpression wurde dann durch Zugeben von IPTG bis zur Endkonzentration von 1 mM induziert. Nach einer 2stündigen Induktion wurden Zellen durch Zentrifugieren bei 5.000 × g geerntet und durch erneutes Suspendieren in 6 M Guanidin, 0,1 M NaH₂PO₄, 0,01 M Tris-HCl, pH-Wert 8,0 lysiert. Die erneut suspendierten Zellen wurden kurz beschallt und bei 12.000 × g 30 Minuten lang zentrifugiert. Die überstehende Fraktion wurde 4–6mal mit einer Geschwindigkeit von 2 ml pro Minute über eine Ni-NTA-Agarosesäule von 5 ml (Qiagen, Hilden, Deutschland) geführt. Nichtspezifisch gebundenes Protein wurde durch Waschen sowohl mit 10 mM als auch 25 mM Imidazol in 8 M Harnstoff, 0,1 M NaH₂PO₄, 0,01 M Tris-HCl, pH-Wert 8,0 entfernt. Matinprotein wurde aus der Säule mit steigenden Konzentrationen von Imidazol (50 mM, 125 mM und 250 mM) in 8 M Harnstoff, 0,1 M NaH₂PO₄, 0,01 M Tris-HCl, pH-Wert 8,0 eluiert. Das eluierte Protein wurde zweimal gegen PBS bei 4°C dialysiert. Ein Teil des gesamten Proteins wurde während der Dialyse ausgefällt. Das dialysierte Protein wurde aufgefangen und bei etwa 3.500 × g zentrifugiert und in unlöslich (Granulat) und lösliche (überstehende) Fraktionen getrennt.
Durch E. coli exprimiertes Matin wurde hauptsächlich als lösliches Protein isoliert und die SDS-PAGE-Analyse brachte eine monomere Bande bei etwa 30 kDa zum Vorschein. Die eluierten Fraktionen, die diese Bande enthielten, wurden bei den folgenden Versuchen verwendet. Die Proteinkonzentration in jeder Fraktion wurde durch BCA-Assay (Pierce Chemical Co, Rockford, Illinois, USA) und eine quantitative SDS-PAGE-Analyse unter Anwendung von Rasterdensitometry bestimmt.
Beispiel 2: Matin hemmt die Endothelzellproliferation
Die antiproliferative Wirkung von Matin auf C-PAE-Zellen wurde durch den Methylenblau-Färbungsassay unter Anwendung von durch E. coli gebildetem löslichem Protein untersucht.
Zelllinien und -kulturen. PC-3-(menschliche Prostata-Adenokarzinomzelllinie) und C-PAE-(Rinderlungen-Arterienendothelzelllinie)Zellen wurden von American Type Culture Collection erhalten. Die C-PAE-Zelllinien wurden in DMEM (Life Technologies/Gibco BRL, Gaithersburg, Maryland, USA), mit 10% Fötalkalbserum (FCS), 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 mg/ml Streptomycin ergänzt, gehalten.
Proliferationsassay. C-PAE-Zellen wurden unter Zusammenfließen in DMEM mit 10% FCS gezüchtet und 48 Stunden lang kontaktinhibiert gehalten. C-PAE-Zellen wurden zwischen der zweiten und der vierten Passage verwendet. PC-3-Zellen wurden in diesem Versuch als nicht-endothele Kontrollen verwendet. Die Zellen wurden durch 5-minütige Trypsinisierung (Life Technologies/Gibco BRL, Gaithersberg, Maryland, USA) bei 37°C geerntet. Zu jeder Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen, die mit 10 μg/ml Fibronectin beschichtet waren, wurde eine Suspension von 12.500 Zellen in DMEM mit 0,1% FCS gegeben. Die Zellen wurden 24 Stunden lang bei 37°C mit 5% CO₂ und 95% Feuchtigkeit inkubiert. Das Medium wurde entfernt und durch DMEM ersetzt, das 20% FCS enthielt. Die nicht stimulierten Zellen wurden mit 0,1% FCS inkubiert.
Unter Anwendung des Methylenblau-Färbeverfahren wurden 7000 Zellen in jede Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen plattiert und wie oben beschrieben behandelt. Die Zellen wurden dann mit dem Verfahren von Oliver et al. (Oliver, M. H. et al., 1989, J. Cell. Sci. 92: 513–518) gezählt. Nach 48 Stunden Behandlung wurden alle Vertiefungen mit 100 μl PBS gewaschen und die Zellen mit 10% Formalin in neutral-gepufferter Saline (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA) fixiert. Die Zellen wurden dann mit 1% Methylenblau (Sigma) in 0,01 M Boratpuffer, pH-Wert 8,5, gefärbt. Die Vertiefungen wurden mit 0,01 M Boratpuffer gewaschen und das Methylenblau mit 0,1 N HCl/Ethanol aus den Zellen extrahiert und die Absorptionsfähigkeit in einem Mikroplattenleser (Bio-Rad, Hercules, Kalifornien, USA) bei 655 nm gemessen. Polymyxin B (Sigma) mit einer Endkonzentration von 5 μg/ml wurde verwendet, um Endotoxin zu inaktivieren (Liu, S. et al., 1997, Clin. Biochem. 30: 455–463).
Die Ergebnisse sind in 3A und 3B gezeigt, bei denen es sich um ein Paar von Histogrammen handelt, die die Wirkung steigender Mengen Matin auf die Aufnahme von Farbstoff durch C-PAE-Zellen gegenüber PC-3-Zellen darstellen. Die Absorptionsfähigkeit bei OD₆₅₅ ist auf der y-Achse dargestellt. „0,5% FCS" steht für die mit 0,5% FCS behandelte (nicht stimulierte) Kontrolle und „10% FCS" ist die mit 10% FCS behandelte (stimulierte) Kontrolle. Die übrigen Balken stellen Behandlungen mit steigenden Konzentrationen von Matin dar. Matin hemmte die FCS-stimulierte Proliferation von C-PAE-Zellen in Dosis-abhängiger Weise. Der Unterschied zwischen dem Mittelwert der Zellanzahl bei der Matin-Behandlung gegenüber der Kontrolle war im Bereich 0,1–10,0 μg/ml mit p < 0,05 signifikant. Wenn PC-3-Zellen mit Matin behandelt wurden, wurde keine hemmende Wirkung beobachtet. In C-PAE-Zellen fiel die Farbstoffaufnahme bei einem Matin-Behandlungslevel von etwa 0,1 μg/ml auf das Niveau, das in nicht stimulierten Zellen sichtbar war. Jeder Balken stellt den Mittelwert der relativen Absorptionsfähigkeitseinheiten bei 655 nm ± der Standardabweichung des Mittelwerts für Triplikat-Vertiefungen dar. Diese Endothelzellenspezifität zeigt an, dass Matin mit großer Wahrscheinlichkeit ein wirksamer anti-angiogener Wirkstoff ist.
Beispiel 3: Matin induziert Apoptose von Endothelzellen
Annexin-V-FITC-Assay. Im frühen Stadium der Apoptose wird die Translokation des Membran-Phospholipids PS von der Innenfläche der Plasmamembran nach außen beobachtet (van Engeland, M. et al., 1998, Cytometry 31: 1–9; Zhang, G. et al., 1997, Biotechniques 23: 525–531; Koopman, G. et al., 1994, Blood 84: 1415–1420). Externalisiertes PS kann durch Färbung mit einem FITC-Konjugat von Annexin V nachgewiesen werden, welches eine natürlich hohe Bindungsaffinität zu PS aufweist (van Engeland, a.a.O.). Die Apoptose von Endothelzellen nach der Behandlung mit Matin wurde daher unter Verwendung von Annexin-V-FITC-Labeling bewertet.
C-PAE-Zellen (0,5 × 10⁶ pro Vertiefung) wurden auf einer Platte mit 6 Vertiefungen in mit 10% FCS ergänztem DMEM angesetzt. Am folgenden Tag wurde frisches Medium, das 10% FCS enthielt, entweder mit 80 ng/ml TNF-α (positive Kontrolle) oder Matin im Bereich zwischen 0,02 bis 20 μg/ml hinzugegeben. Die Kontrollzellen erhielten eine gleiche Menge PBS. Nach 18 Stunden Behandlung wurde das Medium, das schwimmende Zellen enthielt, gesammelt, und angeheftete Zellen wurden trypsiniert und zusammen mit schwimmenden Zellen bei 3.000 × g zentrifugiert. Die Zellen wurden dann in PBS gewaschen und in Bindungspuffer (10 mM HEPES/NaOH, pH-Wert 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl₂) erneut suspendiert. Annexin-V-FITC (Clontech, Palo Alto, Kalifornien, USA) wurde bis zu einer Endkonzentration von 150 ng/ml zugesetzt und die Zellen wurden im Dunklen 10 Minuten lang inkubiert. Die Zellen wurden wiederum in PBS gewaschen und in Bindungspuffer erneut suspendiert. Zellen mit Annexin-V-FITC-Label wurden mit Hilfe eines FACStar Plus Flusszytometers (Becton-Dickinson, Waltham, Massachusetts, USA) gezählt. Für jede Behandlung wurden 15.000 Zellen abgezählt und im Listmode gespeichert. Diese Daten wurden dann mit der Cell Quest Software (Becton-Dickinson, Waltham, Massachusetts, USA) analysiert.
Die Ergebnisse sind in 4 dargestellt, bei der es sich um eine Kurve handelt, die die Annexin-Fluoreszenz-Aktivität zeigt. Nach 18 Stunden Behandlung mit Matin bei 20 μg/ml wurde eine deutliche Verlagerung der höchsten Annexin-Fluoreszenz beobachtet. Die Verlagerung der Fluoreszenz-Intensität war für Matin bei 20 μg/ml und die positive Kontrolle TNF-α (80 ng/ml) ähnlich. Matin mit 2 μg/ml zeigte ebenfalls eine leichte Verlagerung in der Annexin-Fluoreszenz-Intensität, aber Konzentrationen unter 0,2 μg/ml zeigten keine Annexin-V-Positivität. Diese Verlagerung der Höchstintensität wurde nicht beobachtet, wenn Nicht-Endothelzellen (PC-3) verwendet wurden.
Caspase-3-Assay. Caspase-3 (CPP32) ist eine intrazellulare Protease, die in einem frühen Stadium der Apoptose aktiviert wird, und sie initiiert den zellularen Zusammenruch durch die Zersetzung struktureller und DNA-Reparatur-Proteine (Casciola-Rosen, L. et al., 1996, J. Exp. Med. 183: 1957–1964; Salvesen, G. S. et al., 1997, Cell 91: 443–446). Die Protease-Aktivität von Caspase-3 wurde spektrophotometrisch durch Nachweis des Chromophores (p-Nitroanilid) gemessen, das von dem gekennzeichneten Substrat (DEVD-pNA) abgespalten wurde.
C-PAE-Zellen oder PC-3-Zellen (0,5 × 10⁶ pro Vertiefung) wurden auf eine Platte mit 6 Vertiefungen, die mit Fibronectin (10 μg/ml) in DMEM, ergänzt mit 10% FCS, vorbeschichtet waren, plattiert und über Nacht inkubiert. Am folgenden Tag wurde das Medium durch DMEM ersetzt, das 2% FCS enthielt, und dann über Nacht bei 37°C inkubiert. Dann wurden die Zellen mit bFGF (3 ng/ml) in DMEM stimuliert, das mit 2% FCS ergänzt war und auch entweder TNF-α (80 ng/ml, positive Kontrolle) oder Matin (10 μg/ml) enthielt, und 24 Stunden lang inkubiert. Die Kontrollen erhielten PBS-Puffer. Nach 24 Stunden wurden die Supernatant-Zellen gesammelt, und angeheftete Zellen wurden trypsiniert und mit Supernatant-Zellen kombiniert. Die Zellen wurden gezählt und in Zelllyse-Puffer (Clontech, Palo Alto, Kalifornien, USA) bei einer Konzentration von 4 × 10⁷ Zellen/ml erneut suspendiert. Der Rest des Protokolls folgte den Anweisungen des Herstellers (Clontech, Palo Alto, Kalifornien, USA). Ein spezifischer Inhibitor von Caspase-3, DEVD-fmk (Asp-Glu-Val-Asp-Fluormethylketon) wurde verwendet, um die Spezifität des Assays zu bestätigen. Die Absorptionsfähigkeit wurde in einem Mikroplattenleser (Bio-Rad, Hercules, Kalifornien, USA) bei 405 nm gemessen.
Die Ergebnisse sind in 5A und 5B dargestellt, bei denen es sich um ein Paar von Histogrammen handelt, die die Höhe der Caspase-3-Aktivität in Abhängigkeit von der Absorptionsfähigkeit bei OD₄₀₅ (y-Achse) für C-PAE-Zellen (5A) und PC-3-Zellen (5B) unter verschiedenen Behandlungen (x-Achse) zeigt.
C-PAE-Zellen, die mit 20 μg/ml Matin behandelt wurden, zeigten einen 1,6-fachen Anstieg der Caspase-3-Aktivität, während die positive Kontrolle TNF-α einen vergleichbaren (1,7-fach) Anstieg im Vergleich zur Kontrolle ergab. Ein spezifischer Inhibitor der Caspase-3, DEVD-fmk, verringerte die Proteaseaktivität auf das Ausgangsniveau, was anzeigt, dass der Anstieg der gemessenen Aktivität spezifisch für Caspase-3 war. In nicht endothelen PC-3-Zellen gab es keinen Unterschied bei der Caspase-3-Aktivität zwischen der Kontrolle und den Matin-behandelten Zellen.
MTT-Assay. Die pro-apoptotische Aktivität von Matin wurde in C-PAE-Zellen untersucht. Die Zelllebensfähigkeit wurde mit einem MTT-(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid)Assay geprüft (Sugiyama, H. et al., 1998, Kidney Int. 54: 1188–1196). Dieser Assay ist eine quantitative colorimetrische Analyse für das Zellüberleben auf der Grundlage der Fähigkeit lebender Zellen, den Tetrazolium-Ring in aktiven Mitochondrien aufzuspalten. C-PAE-Zellen (7.000 pro Vertiefung) wurden auf eine Platte mit 96 Vertiefungen in DMEM, das 10% FCS enthielt, plattiert. Am folgenden Tag wurden den Vertiefungen entweder TNF-α (positive Kontrolle, 80 ng/ml) oder verschiedene Konzentrationen Matin zugegeben und dann 24 Stunden lang inkubiert. Dann wurde den Vertiefungen MTT-Lösung (5 mg/ml; CHEMICON International, Temecula, Kalifornien, USA) mit einer Rate von 10 μl/Vertiefung zugegeben und 4 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Es wurde Säure-Isopropanol zugesetzt und gründlich gemischt. Die Absorptionsfähigkeit wurde in einem Mikroplattenleser (Bio-Rad, Hercules, Kalifornien, USA) bei 590 nm gemessen.
Die Ergebnisse sind in 6A und 6B dargestellt, bei denen es sich um ein Paar von Histogrammen handelt, die die Zelllebensfähigkeit (in Abhängigkeit von OD₅₉₀, y-Achse) bei steigenden Konzentrationen von Matin (x-Achse) zeigen. Jeder Punkt stellt den Mittelwert ± die Standardabweichung des Mittelwerts für Triplikat-Vertiefungen dar.
Matin verringerte die Zelllebensfähigkeit auf Dosis-abhängige Weise. Bei 10 μg/ml verringerte Matin die Zelllebensfähigkeit um etwa 80%, verglichen mit den Kontrollen. Es wurde keine inhibitorische Wirkung in Matin-behandelten PC-3-Zellen beobachtet.
Beispiel 4: Matin hemmt Tumorwachstum in vivo
Fünf Millionen PC-3-Zellen wurden geerntet und subkutan in den Rücken von 7 bis 9 Wochen alten, männlichen, athymischen, nackten Mäusen injiziert. Die Tumoren wurden mit einer Schublehre gemessen und das Volumen mit der Standardformel Breite² × Länge × 0,52 berechnet. Den Tumoren wurde dann gestattet, auf 100 mm³ zu wachsen und die Tiere wurden dann in Gruppen zu je 5 oder 6 Mäusen eingeteilt. Matin oder Nephrin wurde 10 Tage lang täglich in sterilem PBS seinen jeweiligen Versuchsgruppen intraperitoneal injiziert (20 mg/kg). Die Kontrollgruppe erhielt Vehikelinjektionen (entweder BSA oder PBS). Das Tumorvolumen wurde über 10 Tage alle zwei oder drei Tage berechnet. Nephrin ist ein nicht von Kollagen abgeleitetes Protein, das als Kontrolle verwendet wurde. Das Nephrin war in pET22b exprimiert, wie bei Matin.
Die Ergebnisse sind in 7 dargestellt, die eine Kurve ist, welche die Tumorgröße in mm³ (y-Achse) zu Behandlungstagen (x-Achse) für die PBS-Kontrolle (☐), 20 mg/kg Matin (
) und 20 mg/kg Nephrin (O) zeigt. Matin, das in E. coli hergestellt wurde, hemmte das Wachstum von menschlichen PC-3-Prostatatumoren signifikant (7).
SEQUENZENLISTE

Claims

Protein, bestehend aus den Aminosäuren 2132 bis 2338 oder den Aminosäuren 2132 bis 3084 der SEQ ID NO: 2, oder ein Fragment des Proteins, das wenigstens 25 aufeinander folgende Aminosäuren des Proteins umfasst, oder eine Variante des Proteins mit wenigstens 70% Sequenzidentität damit, wobei das Protein, die Variante oder das Fragment anti-angiogene Aktivität aufweist, mit der Maßgabe, daß die Variante nicht die in der SEQ ID NO: 113 der WO 00/56754 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist.
Protein nach Anspruch 1, bei dem es sich um die G1-Domäne der α1-Kette von Maus-Laminin handelt.
Variante gemäß Anspruch 1 mit wenigstens 80% Sequenzidentität mit dem Protein.
Variante gemäß Anspruch 1 mit wenigstens 90% Sequenzidentität mit dem Protein.
Protein, Fragment oder Variante gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei es sich um ein Monomer handelt.
Multimer eines Proteins, eines Fragments oder einer Variante gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4.
Chimäres Protein, das ein Protein, ein Fragment oder eine Variante davon gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 umfasst, mit der Maßgabe, daß es sich dabei nicht um ein Fusionsprotein von Glutathion-S-Transferase und der G1-, G2-, G3-, G4- oder G5- Domäne der α3-Kette von menschlichem Laminin handelt.
Chimäres Protein gemäß Anspruch 7, das zusätzlich wenigstens ein Proteinmolekül umfasst, das aus der Gruppe, bestehend aus: Vascostatin oder Fragmenten davon, Arrestin oder Fragmenten davon, Canstatin oder Fragmenten davon, Tumstatin oder Fragmenten davon, Endostatin oder Fragmenten davon, Angiostatin oder Fragmenten davon, Restin oder Fragmenten davon, Apomigren oder Fragmenten davon oder anderen anti-angiogenen Proteinen oder Fragmenten davon, ausgewählt ist.
Pharmazeutische oder empfängnisverhütende Zusammensetzung, die ein Protein, ein Fragment, eine Variante, ein monomeres, multimeres oder chimäres Protein mit der in einem der Ansprüche 1 bis 8 angegebenen Bedeutung umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, die zusätzlich ein pharmazeutisch verträgliches Trägermittel umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 9 oder 10, die zusätzlich wenigstens ein Proteinmolekül umfasst, das aus der Gruppe, bestehend aus: Vascostatin oder Fragmenten davon, Arrestin oder Fragmenten davon, Canstatin oder Fragmenten davon, Tumstatin oder Fragmenten davon, Endostatin oder Fragmenten davon, Angiostatin oder Fragmenten davon, Restin oder Fragmenten davon, Apomigren oder Fragmenten davon oder anderen anti-angiogenen Proteinen oder Fragmenten davon, ausgewählt ist.
Protein, Fragment, Variante, monomeres, multimeres, chimäres Protein oder Zusammensetzung mit der in einem der Ansprüche 1 bis 11 angegebenen Bedeutung zur Verwendung in der Medizin.
Verwendung eines Proteins, eines Fragments, einer Variante, eines monomeren, multimeren oder chimären Proteins oder einer Zusammensetzung mit der in einem der Ansprüche 1 bis 11 angegebenen Bedeutung, jedoch unter Nichtbeachten der Maßgaben in Ansprüchen 1 und 7, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Erkrankung, die Angiogenese involviert.
Verwendung gemäß Anspruch 13, wobei es sich bei der Erkrankung um Krebs handelt.
Verwendung gemäß Anspruch 13, wobei die Erkrankung Tumorwachstum involviert.
Verwendung eines Proteins, eines Fragments, einer Variante, eines monomeren, multimeren, chimären Proteins oder einer Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, jedoch unter Nichtbeachten der Maßgaben in Ansprüchen 1 und 7, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Erkrankung, die endotheliale Zellproliferation involviert.
Verwendung eines Proteins, eines Fragments, einer Variante, eines monomeren, multimeren, chimären Proteins oder einer Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, jedoch unter Nichtbeachten der Maßgaben in Ansprüchen 1 und 7, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Erkrankung, die aus der Gruppe, umfassend Angiogenese-abhängige Krebsarten, gutartige Tumoren, rheumatoide Arthritis, diabetische Retinopathie, Fibrose, Psoriasis, Okulare Angiogeneseerkrankungen, Morbus Osler, Herzmuskelangiogenese, Plaqueneovaskularisierung, Telangiektasie, Blutergelenke, Angiofibrom, Wundgranulation, Darmverklebungen, Atherosklerose, Skleroderm, hypertrophe Narben, Katzenkratzerkrankung, Helicobacter pylori-Geschwüre, vaskuläre Dialysepfropfzugangsstenose und Fettleibigkeit, ausgewählt ist.
Kombination aus einem Protein, einem Fragment, einer Variante, einem monomeren, multimeren, chimären Protein oder einer Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 und einem radiotherapeutischen, chemotherapeutischen oder immuntherapeutischen Mittel zur gleichzeitigen, getrennten oder aufeinander folgenden Verwendung in einer Anti-Krebstherapie.
Polynukleotid, das das Protein, das Fragment, die Variante oder das chimäre Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 kodiert.
Polynukleotid nach Anspruch 19, wobei das Polynukleotid operativ mit einer Expressionskontrollsequenz verknüpft ist.
Wirtszelle, z.B. eine Zelle, die aus der Gruppe, umfassend Bakterien-, Hefe-, Säugetier-, Insekten- oder Pflanzenzellen ausgewählt ist und die mit dem Polynukleotid nach Anspruch 19 oder 20 transformiert ist, wobei die Wirtszelle nicht Bestandteil eines menschlichen Embryos ist.
Polynukleotid, das das Protein, das Fragment, die Variante oder das chimäre Protein mit der in einem der Ansprüche 1 bis 8 angegebenen Bedeutung kodiert, oder das operativ mit einer Expressionskontrollsequenz verknüpfte Polynukleotid oder eine Wirtszelle gemäß Anspruch 21 zur Verwendung in der Medizin.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins, eines Fragments, einer Variante oder eines monomeren, multimeren oder chimären Proteins, das bzw. die durch das Polynukleotid nach Anspruch 19 oder 20 kodiert wird, wobei das Verfahren das Folgende umfasst: (a) das Anziehen einer Kultur aus einer Wirtszelle nach Anspruch 21 und (b) das Aufreinigen des Proteins, des Fragments, der Variante oder des chimären Proteins aus der Kultur.
Verwendung eines Polynukleotids, das das Protein, das Fragment, die Variante oder das chimäre Protein mit der in einem der Ansprüche 1 bis 8 angegebenen Bedeutung, jedoch unter Nichtbeachten der Maßgaben in Ansprüchen 1 und 7, kodiert, oder des operativ mit einer Expressionskontrollsequenz verknüpften Polynukleotids bei der Zubereitung eines Medikaments zur Behandlung einer wie in einem der Ansprüche 13 bis 17 beschriebenen Erkrankung.
Verwendung nach Anspruch 24, wobei es sich bei dem Medikament um eine Säugetierzelle handelt, die nicht Teil eines menschlichen Embryos ist, und die Herstellung die Behandlung der Zelle in vitro zur Einführung des Polynukleotids darin involviert
Verwendung nach Anspruch 25, wobei die Zelle die transiente Expression erlaubt.
Verwendung nach Anspruch 25 oder 26, wobei die Zelle aus der Gruppe, bestehend aus: Blutzellen, TIL-Zellen, Knochenmarkszellen, vaskulären Zellen, Tumorzellen, Leberzellen, Muskelzellen und Fibroblastenzellen, gewählt wird.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 25 bis 27, wobei das Polynukleotid durch einen viralen Vektor in die Zelle eingeführt wird.
Verwendung gemäß Anspruch 24, wobei das Medikament das Polynukleotid sowie ein Trägermittel umfasst.
Protein, Fragment, Variante, monomeres, multimeres oder chimäres Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, Polynukleotid gemäß Anspruch 19 oder Anspruch 20 oder Wirtszelle gemäß Anspruch 21, wobei das Protein, das Fragment, die Variante, das monomere, multimere oder chimäre Protein, das Polynukleotid oder die Wirtszelle in isolierter Form vorliegt.