KR20010015869A - 레스틴 및 그의 사용 방법 - Google Patents

Abstract

신규의 항-혈관형성 단백질인 레스틴 뿐만 아니라 그의 단편이 기술된다. 높은 역가로 단백질을 발현시키는 방법도 기술된다.

Description

레스틴 및 그의 사용 방법 {RESTIN AND METHODS OF USE THEREOF}

발명의 배경

전이성 암을 예후하는 것은 그다지 만족스럽지 못한 상태이다. 방사선 치료요법과 화학요법의 진보에도 불구하고, 과거 수 십년 동안, 치료받은 환자의 장기간 생존가능성은 최저한도로만 개선된 것으로 나타났다. 전이성 암에 이용가능한 중요한 치료 옵션의 결여는 새로운 치료 요법의 개발에 초점을 맞추어야 할 필요가 있다는 것을 역설한다. 이와 관련하여, 고형 종양의 종양 혈관계를 표적화한 것이 최근 몇몇 동물 모델 시스템에서 유망한 결과를 나타내었다(Baillie et al. (1995) Br. J. Cancer 72:257-67; Bicknell, R. (1994) Ann. Oncol. 5(Suppl) 4:45-50; Fan et al. (1995) Trends Pharmacol. Sci. 16:57-66; Thorpe, P.E. and Burrows, F.J. (1995) Breast Cancer Res. Treat. 36:237-51; Burrows, F.J. and Thorpe, P.E. (1994) Pharmacol. Ther. 64:155-74). 예를 들면, 누드 마우스 모델에서는, 야생형 VHL 유전자를 RCC 종양 세포주인 786-0 세포에 도입한 결과, 종양 성장이 억제되었고(Iliopoulos et al. (1995) Nat. Med. 1:822-26), 혈관형성이 억제되었다.

수 ㎣를 초과하는 고형 종양의 성장은 새로운 혈관 형성에 의존한다( Folkman, J. (1971) N. Engl. J. Med. 285:1182-86). 수 많은 연구 결과, 원발성 종양과 전이성 성장은 모두 혈관형성-의존성인 것으로 나타났다(Folkman, J. (1971) N. Engl. J. Med. 285:1182-86; Folkman, J. (1972) Ann. Surg. 175:409-16; Folkman, J. and Shing, Y. (1992) J. Biol. Chem. 267:10931-34; Folkman, J. (1996) Sci. Am. 275:150-54]. 수 많은 혈관형성 억제제가 동정되었다. 혈소판 인자-4(Maione et al. (1990) Science 247:77-79; Gupta et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci.(USA) 92:7799-7803], 인터페론 α, 인터페론-유도성 단백질-10, 및 PEX(Angiolillo et al. (1995) J. Exp. Med. 182:155-62; Strieter et al. (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun. 210:51-57; Brooks et al. (1998) Cell 92:391-400)와 같은 특정 억제제는 "종양과 관련성"이 없는 반면, 기타 두 가지 억제제인 안지오스타틴 및 엔도스타틴은 "종양-관련성"이 있다(O'Reilly et al. (1994) Cell 79:315-28; O'Reilly et al. (1997) Cell 88:277-85). 매트릭스 메탈로엘라스타제를 상향 조절하는 종양-침윤성 마크로파아지에 의해 생성된 혈관형성에 대한 강력한 내인성 억제제인 안지오스타틴은 광범위한 원발성 및 전이성 종양의 성장을 억제시킨다(Lannutti et al. (1997) Cancer Res. 57:5277-80; O'Reilly et al. (1994) Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 59:471-82; O'Reilly, M.S., (1997) Exs. 79:273-94; Sim et al. (1997) Cancer Res. 57:1329-34; Wu et al. (1997) Biochem. Biophys. Res. Commun. 236:651-54).

최근, 오렐리(O'Reilly) 등((1997) Cell 88:277-85)은 쥐의 혈관내피종 세포주(EOMA)로부터 혈관형성 억제제인 엔도스타틴을 분리하였다. 탐지가능한 종양을 지니고 있지 않은 만성 신부전증 환자에게서 인간 엔도스타틴의 특정 단편의 순환 수준이 탐지된 바 있으나, 이 단편은 결실을 가지고 있었고, 항혈관형성 활성이 없었다(Standker et al. (1997) FEBS Lett. 420:129-33). 엔도스타틴의 아미노 말단 서열은 XVIII형 콜라겐의 카르복시 말단 부분에 대응한다. 엔도스타틴은 내피 증식과 혈관형성의 특이적 억제제이다. 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli)에서 발현된 리폴딩되지 않은 침전 단백질의 전신 투여는 이종이식 모델에서 루이스(Lewis) 폐 암종, T241 섬유육종, B16 흑색종 및 EOMA(O'Reilly et al. (1997) Cell 88:277-85) 세포의 성장 퇴행을 초래한다. 또한, 연구된 3가지 종양 타입에서 어떠한 약물 내성도 나타나지 않았다. 엔도스타틴을 반복해서 투여한 결과, 종양 휴지를 가져온 것으로 보고되었다(Boehm et al. (1997) Nature 390:404-407).

이러한 연구 결과는 암 치료에 대한 새로운 방법을 제시하고 있으며 화학요법시 종종 관찰되는 약물 내성을 극복하기 위한 유망한 방법을 제공한다. 그러나, 이 모든 연구에서는, 리폴딩되지 않은 침전 형태의 억제제 단백질이 현탁액의 형태로 종양-보유 동물에게 투여되었다. 또한, 종양 퇴행을 유도하고 종양 휴지를 일으키기 위해서는 다량의 단백질이 요구되었다. Kerbel((1997) Nature 390:335-36)에 의해 지적된 바와 같이, 이 단백질과 등가인 경구 약물이 필요하다. 이 단백질의 재조합 형태를 가용성 형태로 이용할 수 있다면, 메카니즘 연구가 착수될 수 있다. 또한, 생체내 조건하에서 가용성 단백질의 효능을 연구하기 전에 이러한 단백질을 사용하여 시험관내에서 초기 시험을 수행할 수 있다. 또한, 이 단백질에 의해 제시된 큰 가능성에도 불구하고, 시험하기에 충분한 양의 단백질 생성의 어려움 및 이들의 항혈관형성 성질에 관한 일관성 없는 시험 결과로 인해 이 단백질의 임상 가능성을 평가하는 것이 좌절되었다고 보고된 바 있다(King, R.T. (1998) Wall Street J., page 1 Nov. 12; Leff, D.N. (1998) BioWorld Today 9:1, Oct. 20). 현 시점에서는, 시험관내 및 생체내에서 신뢰할 수 있는 성질을 갖는 가용성 형태의 항혈관형성 단백질을 다량으로 제조하는 방법이 절실히 요구된다.

발명의 개요

신규의 항혈관형성 단백질인 레스틴 뿐만 아니라, 그의 단편, 돌연변이체, 유도체 및 융합 단백질이 기술된다. 레스틴은 XV형 콜라겐의 C-말단 단편의 단백분해성 단편이고, 약 20kDa이다. "아포미그렌"으로 명명되는 한 단편은 엔도스타틴과 동등한 또는 보다 우수한 항혈관형성 활성을 가진 것으로 밝혀졌다.

본 발명은 "레스틴"으로 명명되는 분리된 항혈관형성 펩티드, 및 "아포미그렌"으로 명명되는 그의 단편의 발견에 관한 것이다. 레스틴은 약 170 내지 약 200개 아미노산 잔기를 포함하고, 사람의 XV형 콜라겐의 α1 사슬의 NC10 도메인의 C-말단과 70% 이상의 서열 동일성을 갖는다. 아포미그렌은 레스틴의 단편이고, 사람의 XV형 콜라겐의 α1 사슬의 NC10 도메인의 C-말단에 대응하는 마지막 80 내지 90개 인접 아미노산을 포함한다.

또한, 본 발명은 상보적인 서열 및 본원에서 기술된 서열을 하이브리드화하는 서열을 가지며 발현 서열에 작동적으로 연결되는, 레스틴 및 아포미그렌을 엔코딩하는 분리된 폴리누클레오티드, 및 이러한 작제물로 형질전환된 숙주 세포를 포함한다. 레스틴 및 아포미그렌에 대한 항체도 개시된다.

또한, 본 발명은 레스틴 및 아포미그렌의 제조 방법, 레스틴 및 아포미그렌을 포함하는 융합 단백질, 및 레스틴 및 아포미그렌 또는 이의 융합 생성물을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 레스틴 및 아포미그렌을 엔코딩하는 폴리펩티드의 제조 방법도 개시한다.

또한, 본 발명은 암을 포함한 많은 질병과 질환 상태에서 일어나는 혈관형성을 특히 억제하기 위하여, 레스틴 및 아포미그렌을 포함하는 조성물을 포유동물 조직과 접촉시키는 것을 포함하는, 이러한 포유동물 조직에서 혈관형성 활성을 억제시키는 방법을 포함한다.

본 발명은 아포프토시스(apoptosis)를 유도하기 위한 레스틴 및 아포미그렌의 용도, 또는 아포프토시스를 방지하기 위한 EM 1의 항체도 개시한다. 본 발명은 추가로, 유전자 치료 방법에 있어서 레스틴 및 아포미그렌의 용도를 개시한다. 표적된 세포는 어떠한 포유동물 세포, 특히 림프구, 혈구, TIL 세포, 골수 세포, 혈관 세포, 종양 세포, 간 세포, 근육 세포 및 섬유아세포일 수 있다.

관련 출원

본 출원은, 이들의 전문이 본원에 참고문헌으로 삽입되어 있는, 1997년 12월 8일자로 출원된 제 60/067,888호, 1998년 4월 22일자로 출원된 제 60/082,663호 및 1998년 11월 16일자로 출원된 제 60/108,536호 출원에 대하여 우선권을 주장한다.

도 1은 레스틴 누클레오티드 서열의 도표이다(서열 번호:).

도 2는 레스틴 아미노산 서열의 도표이다(서열 번호:).

도 3은 InVitrogen(San Diego, California, USA)에서 입수된 변형된 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 발현 벡터의 개략도이다.

도 4는 변형된 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 발현 벡터의 개략도이다.

도 5는 변형된 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 발현 시스템에 레스틴을 클로닝하는 것을 나타내는 개략도이다.

도 6은 다양한 라이브러리로부터 단백질 발현을 나타내는, 쿠우마시 블루로 염색된 SDS-PAGE 전기영동 겔이다.

도 7은 레스틴 단백질의 친수성, 표면 확률, 유연성, 및 항원 인덱스의 4개 도로 구성된다.

도 8은 레스틴 단백질의 양쪽친화성 헬릭스, 양쪽친화성 시트, 및 2차 구조를 나타내는 3개의 도로 구성된다.

도 9는 아포미그렌 단백질의 C-말단 85개 아미노산과 맞추어진 인간 콜라겐 타입 XV의 α1 사슬의 완전한 길이를 나타내는 개략도이다. 흑색 칸은 콜라겐성 영역을 나타내고, 흰색 칸은 비-콜라겐성 도메인을 나타낸다.

도 10은 아포미그렌의 아미노산 서열, 및 마우스(MENDO) 및 인간 엔도스타틴 (HENDO)의 C-말단의 아미노산 서열의 일렬도이다.

도 11은 Ni-NTA 컬럼으로부터의 용리 결과를 나타내는 그래프이다. 용리 pH(좌측 y-축) 및 280nm에서의 흡광도(우측 y-축)가 각 분획(x-축)에 대하여 나타난다.

도 12는 SDS-PAGE 겔의 사진이다. 크기가 kDa으로 좌측에 제시된다. 레인 (1)은 크기 마커, 레인 (2)는 Ni-NTA 컬럼에 로딩하기 전의 아포미그렌 단백질 여액; 레인 (2)는 컬럼으로부터 유동관통; 레인 (4)는 분획 (4); 레인 (5) 및 (6)은 각각 비환원 및 환원 분획 (23); 레인 (7)은 분획 (24); 레인 (8)은 분획 (27)을 포함한다.

도 13a, 13b, 13c는 아포미그렌 처리후 C-PAE 세포의 변화를 상 대조 현미경에 의해 모니터링하여 나타낸 3개 한 셋트의 사진이다. 도 13a는 대조; 도 13b는 0.05㎍/ml의 아포미그렌으로 처리한 것; 도 13c는 0.7㎍/ml의 아포미그렌 처리한 것이다. 사진은 처리 24시간 후에 촬영되였고, 400배 확대로 나타난다.

도 14는 bFGF 및 세균으로부터 발현된 정제된 가용성 아포미그렌 단백질로 처리된 C-PAE 세포에서 티미딘 혼입을 나타내는 그래프이다. 아포미그렌(●), 및 마우스 엔도스타틴 (□) 및 인간 엔도스타틴(○)의 농도를 x축에 나타냈고,³H-티미딘 혼입을 y축에 나타내었다.

도 15는 아포미그렌에 있어서의 세포 주기 분석을 나타내는 막대 그래프이다. x-축은 0 내지 1000ng/ml 범위의 아포미그렌의 농도를 나타내고, y-축은 S-기의 세포 백분율을 나타낸다. C-PAE 세포는 흑색 바로 표시되고, IMR-90 세포는 흰색 바로 표시된다.

도 16은 상이한 농도의 아포미그렌, 및 마우스 엔도스타틴 및 인간 엔도스타틴에 있어서 내피 세포 이동의 저해를 나타낸다. 여러 가지 단백질의 농도는 x-축, bFGF에 반응하여 이동된 세포의 백분율은 y-축에 제시된다. 대조는 아포미그렌 처리 IC-21 세포(■)이고, 처리군은 ECV304 세포에 대한 아포미그렌 및 마우스 엔도스타틴 및 인간 엔도스타틴으로 구성된다.

도 17은 레스틴으로 처리된 ECV304 세포에서 모든 이동의 저해를 나타내는 막대 그래프이다. 세포 이동의 양이 y-축에 제시되고, x-축은 무처리(-bFGF, 대조), bFGF(양성 대조), 및 3.0, 62.5, 12, 25 및 50㎍/ml의 레스틴으로 처리된 ECV304 세포를 제시한다.

도 18은 신장 암 세포(RCC)에 대한 레스틴의 효과를 엔도스타틴과 대조하여 나타낸 그래프이다. 종양 용적은 ㎣으로 y-축에 나타내고, 처리후의 일수(x-축)에 대하여 도시된다. 레스틴(●)은 비처리 대조 종양(■)과 비교하여, 종양 성장을 늦추는데 있어서 엔도스타틴(○)에 필적하는 것으로 나타났다.

도 19는 융모 요막(CAM) 검정에 의해 측정되는, 다양한 농도의 아포미그렌(x-축)의 혈관형성 반응(y-축)에 대한 효과를 나타내는 막대 그래프이다. 아포미그렌(0.5, 1, 5, 10, 20 및 50㎍/메쉬)을 비히클 단독, 및 VEGF 및 FGF-2에 대하여 시험하였다.

도 20a 내지 20b는 다양한 항혈관형성 단백질을 클로닝 및 발현하는데 사용되는 작제물, 프라이머, 클로닝 부위, 및 벡터를 나타내는 챠트이다. 발현된 단백질의 아미노산 서열도 제공된다.

광범위한 질환이 바람직하지 못한 혈관형성의 결과 일어난다. 달리 언급하면, 특정 시간에 또는 특정한 조직에서 어떤 조건 하에서 모세혈관의 성장 및 확장을 중지시키는 것이 가능하다면, 많은 질환 및 바람직하지 못한 질병상태가 예방되거나 경감될 수 있다. 몇가지 항혈관형성 단백질(예를 들면, 안지오스타틴, 엔도스타틴)이 발견되었지만, (1) 이들의 특성을 적절히 시험할 수 있도록 하기에 충분한 양의 단백질을 생성시키는 능력, 및 (2) 이들 단백질에 기인된 항혈관형성 성질의 재생가능성에 관한 문제점이 보고된 바 있다.

본 발명에서는, 신규의 항혈관형성 단백질인 레스틴 뿐만 아니라, 그의 단편, 융합 단백질 및 항체가 기술된다. 또한, 레스틴 및 그의 단편을 엔코딩하는 폴리누클레오티드 뿐만 아니라, 이러한 폴리누클레오티드를 포함하는 백터 및 숙주 세포가 기술된다. 생물학적 활성 성분으로서 레스틴을 포함하는 조성물 뿐만 아니라 혈관형성을 특징으로 하는 질환 및 질병의 치료에서와 같이 포유동물 조직에서 혈관형성 활성을 억제시키기 위한 레스틴의 사용 방법도 기술된다.

본 발명은 혈관형성에 의해 매개되거나 이와 관련된 질환 및 질병의 탐지 및 치료용 조성물 및 방법을 포함한다. 다른 항혈관형성 단백질(예컨대, 안지오스타틴, 엔도스타틴)과는 달리, 레스틴은 사람의 XV형 콜라겐의 α1 사슬의 NC10 도메인의 약 200개 최종 C-말단 아미노산에 대응하는 약 170 내지 200개 아미노산의 단백분해성 단편이다. 엔도스타틴과 달리, 레스틴은 헤파린에 대하여 친화성이 없거나 최소정도의 친화성을 갖는다.

보다 더 상세하게는, 본 발명은 사람의 XV형 콜라겐의 α1 사슬의 NC10 도메인의 C-말단에서 약 200 개 아미노산에 대응하는 약 170 내지 200개 아미노산의 단백질인 "레스틴"으로 명명되는 단백질을 기술한다. 안지오스타틴 및 엔도스타틴과 달리, 레스틴은 체액으로부터 성공적으로 분리된 바 없고, 천연 XV형 콜라겐 분자를 제외하고는 천연으로 존재하지 않는 듯하다. 레스틴은 분리된 DNA 또는 cDNA 라이브러리로부터 클로닝될 수 있다. 레스틴은 환원 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 측정된 바와 같이, 약 20kDa의 분자량을 가진다. 또한 본 발명은 마우스 레스틴, 그의 단편, 돌연변이체, 유도체 또는 융합 단백질을 포함한다.

레스틴은 콜라겐 타입 XV 분자의 일부로서 천연에 존재하지만, 이는 재조합적으로 제조될 수 있는데, 예컨대 레스틴(도 2, 서열 번호: )을 엔코딩하는 폴리누클레오티드 서열(도 1, 서열 번호: )은, 예컨대 하기 표 1에 수록된 전방 및 후방 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있다. 그 증폭에 사용된 주형 핵산은 어떠한 포유류동물 유래의 것일 수 있다.

표 1. 항혈관형성 단백질을 증폭시키는데 사용된 작제물 및 프라이머 서열

그 다음에, 결과로서 생성된 증폭 생성물은 적합한 벡터 내로 클로닝될 수 있다. "프라이머"라는 용어는, 표적 누클레오티드 서열에 상보적이고, 이러한 표적 누클레오티드 서열과 하이브리드화하는데 사용되며, DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제 또는 역전사효소에 의해 촉매되는 누클레오티드 중합 반응에 대한 개시 지점으로서 작용하는 특이적 올리고누클레오티드 서열을 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "레스틴"은 그 아미노산 서열의 단편, 돌연변이체, 상동물, 동족체 및 대립유전자성 변이체 뿐만 아니라, 마우스 레스틴, 마우스 레스틴 아미노산 서열의 단편, 돌연변이체, 상동물, 동족체 및 대립유전자성 변이체를 포함하는 것으로 한다.

본 발명이 내피 억제 활성(예를 들면, 혈관형성을 일반적으로 억제하고, 예컨대, 섬유아세포 성장 인자, 혈관형성-관련 인자 또는 기타 공지된 성장 인자의 존재하에서 배양물 중에서 소의 모세관 내피 세포의 성장 또는 이동을 억제하기 위한 조성물의 능력)을 가진 레스틴의 어떠한 유도체도 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 본 발명은 완전한 레스틴 단백질, 레스틴 단백질의 유도체 및 레스틴 단백질의 생물학적 활성 단편을 포함한다. 이들은 아미노산 치환체를 갖거나 당 또는 아미노산 작용기에 결합된 기타 분자를 갖는 레스틴 활성을 가진 단백질을 포함한다. 본 발명은 레스틴 및 레스틴 수용체를 코딩하는 유전자, 및 이들 유전자에 의해 발현되는 단백질도 포함한다.

또한, 본 발명은 레스틴을 엔코딩하는 분리된 폴리누클레오티드를 포함하는 조성물 뿐만 아니라, 이러한 폴리누클레오티드를 함유하는 벡터 및 숙주 세포, 및 레스틴 및 그의 단편, 돌연변이체, 상동물, 동족체 및 대립유전자성 변이체의 제조 방법을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같은 "벡터"라는 용어는 핵산 조각이 삽입 또는 클로닝될 수 있는 담체를 의미하고, 이 담체는 핵산 조각을 숙주 세포 내로 운반시키는 작용을 한다. 이러한 벡터는 이와 같이 운반된 핵산 조각의 복제 및/또는 발현을 일으킬 수도 있다. 벡터의 예로서, 예컨대 플라스미드, 박테리오파아지, 또는 포유동물, 식물 또는 곤충 바이러스로부터 유도된 핵산 분자, 또는 리간드-핵산 접합체, 리포좀 또는 지질-핵산 복합체와 같은 비-바이러스성 벡터가 포함된다. 운반된 핵산 분자는, 운반된 핵산을 발현시킬 수 있는 발현 벡터를 형성하기 위하여, 발현 조절 서열에 작동적으로 연결되는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 핵산의 운반은 일반적으로 "형질전환"이라 지칭되고, 이는 삽입에 사용된 방법에 상관없이, 숙주 세포 내로 외인성 폴리누클레오티드가 삽입되는 것을 언급한다. 예를 들면, 직접적인 흡수, 형질도입 또는 f-교배가 포함된다. 외인성 폴리누클레오티드는 비-통합 벡터, 예컨대 플라스미드로서 유지될 수 있거나, 또는 대안적으로 숙주 게놈으로 통합될 수 있다. "작동적으로 연결된"이라 함은 기술된 성분들이 이들이 의도된 방식으로 기능할 수 있도록 해주는 관계에 있는 상황을 언급하는데, 예를 들면 코딩 서열에 "작동적으로 연결된" 조절 서열은 코딩 서열의 발현이 조절 서열에 적합한 조건하에서 이루어지는 방식으로 연결된다. "코딩 서열"은 적당한 조절 서열의 조절(예를 들면, 이러한 서열에 작동적으로 연결된)하에 놓여진 경우에, mRNA 내로 전사되어 폴리펩티드로 해독되는 폴리누클레오티드 서열이다. 이러한 코딩 서열의 경계는 5'-말단에서의 해독 출발 코돈 및 3'-말단에서의 해독 정지 코돈에 의해 결정된다. 이러한 경계는 천연적으로 존재할 수 있거나, 또는 당해 분야에 공지된 방법에 의해 폴리누클레오티드 서열 내로 도입되거나 이에 첨가될 수 있다. 코딩 서열로서 mRNA, cDNA 및 재조합 폴리누클레오티드 서열이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.

클로닝된 폴리누클레오티드가 클로닝되는 벡터는, 이러한 벡터가 원핵 생물에서 작용하기 때문에 선택될 수 있고, 또는 대안적으로 진핵 생물에서 작용할 수 있기 때문에 선택된다. 레스틴 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드의 클로닝, 및 그 폴리누클레오티드로부터 상기 단백질의 발현 모두를 허용하는 벡터의 두 가지 예는 세균 및 효모에서의 상기 단백질의 발현을 각각 허용하는 pET28(a) 벡터 (Novagen, Madison, Wisconsin, USA) 및 변형된 pPICZαA 벡터(InVitrogen, San Diego, California, USA)이다.

일단 폴리누클레오티드가 적합한 벡터 내로 클로닝되면, 이는 적당한 숙주 세포 내로 형질전환될 수 있다. "숙주 세포"는 벡터를 통하여 운반된 핵산의 수용체이거나 수용체로서 사용될 수 있는 세포를 의미한다. 숙주 세포는 원핵성 또는 진핵성, 포유동물, 식물 또는 곤충일 수 있으며, 단일 세포로서 존재하거나, 집합체, 예를 들면 배양물로서 존재하거나 또는 조직 배양물 또는 조직 또는 생물 중에 존재할 수 있다. 숙주 세포는 다세포 생물, 예를 들면 포유동물 유래의 정상적인 조직 또는 병든 조직으로부터 유도될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 숙주 세포는 핵산으로 형질전환된 본래의 세포 뿐만 아니라 상기 핵산을 여전히 포함하고 있는 이러한 세포의 자손을 포함한다.

한 구현예에 있어서, 항혈관형성 단백질을 엔코딩하는 분리된 폴리누클레오티드는 한 펩티드를 엔코딩하는 하나의 폴리누클레오티드 링커를 추가적으로 포함한다. 이러한 링커는 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들면 상기 링커는 하나 이상의 추가적인 아미노산을 엔코딩하는 하나 이상의 추가적 코돈을 포함할 수 있다. 일반적으로, 링커는 1 내지 약 20개 또는 30개 아미노산을 포함한다. 상기 폴리누클레오티드 링커는 항혈관형성 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드에서와 같이 해독되며, 그 결과 항혈관형성 단백질의 아미노 또는 카르복시 말단에서 하나 이상의 추가적인 아미노산 잔기를 갖는 항혈관형성 단백질이 발현된다. 항혈관형성 단백질에 결합된 몇가지 링커가 도 20에 예시되어 있다. 중요한 것은, 추가적인 아미노산 또는 아미노산들이 항혈관형성 단백질의 활성을 상쇄시키지 않는다는 것이다.

선택된 폴리누클레오티드를 벡터 내로 삽입시킨 후, 상기 벡터를 적당한 원핵성 균주 내로 형질전환시키고, 이 균주를 생물학적 활성의 항혈관형성 단백질의 생성에 적합한 배양 조건 하에서 배양(예를 들면, 유지)함으로써 생물학적 활성의 항혈관형성 단백질, 또는 그의 돌연변이체, 유도체, 단편 또는 융합 단백질을 생성한다. 한 구현예에 있어서, 본 발명은 항혈관형성 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 벡터 pET17b 또는 pET28a 내로 클로닝시킨 다음, 이를 세균 내로 형질전환시키는 것을 포함한다. 그 다음에, 상기 세균성 숙주 균주는 항혈관형성 단백질을 발현시킨다. 일반적으로, 항혈관형성 단백질은 배양액 1리터 당 약 10 내지 20mg 이상의 양으로 생성된다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 진핵성 벡터는 효모 벡터를 포함한다. 본원에 기술된 바와 같이, 한 방법은 다중 클로닝 부위를 포함한 pPICzα 플라스미드를 이용한다. 상기 다중 클로닝 부위는 다중 클로닝 부위인 His.태그 모티브 내로 삽입하였다. 추가적으로, 상기 벡터는 NdeI 부위 또는 기타 적합한 제한 부위를 첨가하기 위하여 변형될 수 있다. 이러한 부위는 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 구현예에 의해 생성된 항혈관형성 단백질은 하나 이상의 히스티딘, 일반적으로 약 5 내지 20개 히스티딘을 포함하는 히스티딘 태그 모티브(His.태그)를 포함한다. 놀랍게도, 이러한 His.태그가 항혈관형성 활성을 상쇄시키지 않는다.

본 구현예에 있어서, 바람직한 효모 발현 시스템은 피치아 파스토레스 (Pichia pastores)이다. 또한, 생물학적 활성 단백질은 일반적으로 배양 비히클(액체) 1리터 당 약 10 내지 20mg의 농도로 생성된다.

레스틴을 제조하는 한 방법은, 예를 들면 서열 번호: 의 폴리누클레오티드를 증폭시키고, 이를 발현 벡터, 예컨대 pET28(a), pPICZαA 또는 몇몇 기타 발현 벡터 내로 클로닝시키며, 서열 번호: 의 폴리누클레오티드를 포함하는 벡터를 상기 폴리누클레오티드에 의해 엔코딩된 폴리펩티드를 발현할 수 있는 숙주 세포 내로 형질전환시키고, 상기 형질전환된 숙주 세포를 단백질 발현에 적합한 배양 조건 하에서 배양시킨 다음, 상기 배양물로부터 상기 단백질을 추출 및 정제시키는 것이다. 일반적으로 항혈관형성 단백질, 특히 레스틴을 제조하는 예시적 방법이 하기 실시예에서 제공되며, 또한 그 전문이 본원에서 참고문헌으로 삽입된 Vikas P. Sukhatme에 의해 1998년 12월 8일자로 출원된 미국 특허원 제 XX/XXX,XXX호 "항혈관형성 단백질의 제조 방법"에 제공되어 있다. 레스틴 단백질은 또한, 형질전환성 동물의 생성물로서, 예를 들면 형질전환성 소, 염소, 양 또는 돼지의 유즙 성분으로서, 또는 예를 들면 옥수수 중의 전분 분자와 배합되거나 연결된 형질전환성 식물 생성물로서 발현될 수 있다.

레스틴은 종래의 공지된 화학 합성에 의해 생성될 수 있다. 합성법에 의해 본 발명의 단백질을 작제하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예컨대, 재조합적으로 생성된 레스틴과 1차, 2차 또는 3차 구조적 및/또는 입체형태적 특성을 공유하게 함으로써 합성적으로 작제된 레스틴 단백질 서열은 생물학적 활성을 포함하여 이들과 공통된 생물학적 특성을 보유할 수 있다. 따라서, 합성적으로 작제된 레스틴 단백질 서열은 치료 화합물의 스크리닝 및 항체 개발을 위한 면역학적 방법에 있어서, 예컨대 재조합적으로 생성, 정제된 레스틴 단백질에 대한 생물학적 활성 또는 면역학적 대체물로서 이용될 수 있다.

레스틴 단백질은 표준 검정에서 측정되고 하기 실시예에서 제공된 바와 같이, 혈관형성을 억제하는데 유용하다. 레스틴은 기타 세포 타입, 예를 들면 IMR-90 세포 또는 IC-21 세포의 성장을 억제시키지 않는다. 시험은 ECV304 세포를 사용한 내피 세포 이동 검정에서는, 레스틴 처리로 2.0 내지 5.0㎍/ml의 수치에서 50%의 저해하는 결과를 가져왔음을 나타냈다. 즉, 레스틴은 약 2.0 내지 5.0㎍/ml의 ED₅₀을 가진다. 이는 엔도스타틴과 유사하지만, 아포미그렌에 대하여 발견된 활성 보다는 못하다. 생체내 연구에서(예컨대, 신장 암 세포(RCC) 모델), 인간 레스틴 처리는 종양 성장을 20 내지 50% 저해하는 결과를 가져왔다. 마우스 엔도스타틴이 더 우수한 성과를 나타냈는데, 이는 아마 마우스 혈관구조에 대해서는 마우스 단백질이 보다 더 적합하기 때문일 것이다. 본원에서 사용된 바와 같은 "ED₅₀"은 조성물이 없는 경우에 나타나는 생물학적 효과에 비하여 생물학적 효과를 1/2로 감소시키는 조성물의 양에 대한 약어이다.

본원에서 사용된 바와 같이, "혈관형성"이라는 용어는 새로운 혈관이 조직이나 기관 내로 생성되는 것을 의미하며, 내피 세포 증식과 관련이 있다. 정상적인 생리학적 조건 하에서는, 사람이나 동물은 극히 특정한 제한된 상황 하에서만 혈관형성을 경험한다. 예를 들면, 혈관형성은 정상적으로는 상처 치유, 태아 및 배아성 발육, 및 황체, 자궁내막 및 태반의 형성시 관찰된다. "내피"라는 용어는 장막강, 림프관 및 혈관을 정렬시키는 편평한 상피 세포 박층을 의미한다. 따라서, "항혈관형성 활성"은 혈관의 성장을 억제시키는 특정 조성물의 능력을 지칭한다. 혈관의 성장은 복잡한 일련의 사건이고, 이는 개개의 내피 세포 아래에 놓여 있는 기저막의 국재화된 파쇄, 이들 세포의 증식, 상기 세포의 미래 혈관 위치로의 이동, 새로운 혈관 막을 형성하기 위한 세포 재구성, 내피 세포 증식의 중지, 및 혈관주위세포 및 새로운 혈관벽을 지지해 주는 기타 세포의 혼입을 포함한다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같은 "항혈관형성 활성"은 이들 단계 중의 어느 단계 또는 모든 단계의 저해를 포함하며, 최종적으로 새로운 혈관의 형성이 억제되는 결과를 가져온다.

항혈관형성 활성은, 혈관형성을 일반적으로 억제하는 조성물의 능력, 예컨대 섬유아세포 성장 인자, 혈관형성-관련 인자 또는 기타 공지된 성장 인자의 존재하에서 배양물 중의 소 모세혈관 내피 세포의 성장 또는 이동을 억제하기 위한 조성물의 능력을 가리키는 내피 억제 활성을 포함할 수 있다. "성장 인자"는 세포의 성장, 재생 또는 합성 활성을 자극하는 조성물이다. "혈관형성-관련 인자"는 혈관형성을 억제시키거나 증진시키는 인자이다. 혈관형성-관련 인자의 한 예는 혈관형성 증진제인 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)와 같은 혈관형성적 성장 인자이다. 혈관형성-관련 인자의 또 다른 예는, 예컨대 안지오스타틴(미국 특허 제 5,801,012호, 제 5,837,682호, 제 5,733,876호, 제 5,776,704호, 제 5,639,725호, 제 5,792,845호, WO 96/35774, WO 95/29242, WO 96/41194, WO 97/23500 참조) 또는 엔도스타틴(WO 97/15666 참조)과 같은 혈관형성 억제 인자이다.

"실질적으로 동일한 생물학적 활성" 또는 "실질적으로 동일하거나 우수한 생물학적 활성"이라 함은 조성물이 항혈관형성 활성을 가지고 있고, 표준 검정에서 측정된 바와 같이 레스틴과 유사하게 행동하는 것을 의미한다. "표준 검정"은 항혈관형성 활성, 세포 주기 저지 및 아포프토시스를 평가하기 위한 분자 생물학 분야에서 사용되는 프로토콜을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 이러한 검정은 내피 세포 증식, 내피 세포 이동, 세포 주기 분석 및 내피 세포 튜브 형성의 검정, 예컨대 아포프토틱 세포 형태학 또는 아넥신(Annexin) V-FITC 검정에 의한 아포프토시스의 탐지, 융모 요막(CAM) 검정, 및 누드 마우스에서의 신장암 종양 성장의 억제를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 이러한 검정은 하기 실시예, 및 이들의 전문이 본원에 참조문헌으로 삽입되어 있는, 1997년 12월 8일자로 출원된 미국 특허원 제 60/067,888호, 1998년 4월 22일자로 출원된 미국 특허원 제 60/082,663호, 1998년 11월 16일자로 출원된 미국 특허원 제 60/108,536호, 및 Vikas P. Sukatme에 의해 1998년 12월 8일자로 출원된 "항혈관형성 펩티드 및 그의 사용 방법"이라는 미국 특허원 제 XX/XXX,XXX호 및 Vikas P. Sukatme에 의해 1998년 12월 8일자로 출원된 "항혈관형성 단백질의 제조 방법"이라는 미국 특허원 제 XX/XXX,XXX호에 제공된다.

본 발명은 레스틴의 단편, 돌연변이체, 상동물 및 동족체도 기술한다. 레스틴의 "단편"은 레스틴 폴리펩티드의 25개 이상의 연속된 아미노산을 포함하는, 레스틴 분자 보다 더 짧은 아미노산 서열이다. 이러한 돌연변이체는, 예컨대 완전하거나 부분적인 링커 서열에 대응하는 아미노산 서열 또는 아미노산 잔기를 클로닝하는 방법으로부터 유도된 추가적인 아미노산을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 본 발명에 포함되기 위해서는, 이러한 추가적인 아미노산 잔기를 갖거나 갖지 않는 이러한 돌연변이체가 참조 폴리펩티드의 천연물 또는 완전한 길이 변형물과 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 가져야 한다.

"아포미그렌"으로 명명되는 이러한 단편의 하나는 표준 검정에 의해 측정될 때, 인간 또는 마우스 엔도스타틴의 항혈관형성 활성과 동등 또는 보다 더 우수한 것으로 나타났다. 아포미그렌은 서열 번호: 의 약 아미노산 97 내지 약 아미노산 181인 레스틴 자체의 마지막 약 85개 아미노산 잔기를 포함한다:

따라서, 아포미그렌을 엔코딩하는 폴리누클레오티드 서열은 서열 번호: 의 약 뉴클레오티드 289 내지 약 누클레오티드 543에 대응하고, 서열 번호: 으로부터 전방 프라이머 5'-AAG AAT GCG GCC GCT TAC TTC CTA GCG TCT GTC ATG AAA CTG TTT TCG AT-3' 및 레스틴에 대하여 사용된 것과 동일한 역전 프라이머를 가지고 증폭될 수 있다. 아포미그렌의 클로닝 및 발현은 레스틴 그 자체에 대한 것과 같이, 하기 실시예에서 예시된 바와 같이 수행된다. 아포미그렌은 보다 더 작은 펩티드가 중량 기준으로 보다 더 효능이 크고, 조직으로 보다 더 잘 침투할 수 있다는 점에서 혈관형성성 질환의 치료에 있어서 장점을 제공한다.

레스틴의 "돌연변이체"라 함은 등가의 참조 레스틴 폴리펩티드의 아미노산 서열에 관하여 아미노산 서열에 있어서의 모든 변화를 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 변화는 자발적으로 또는 사람에 의한 조작, 화학적 에너지(예컨대, X-선), 기타 형태의 화학적 변이유발, 유전 공학적 처리에 의해 또는 교배 또는 기타 형태의 유전 정보 교환의 결과로서 일어날 수 있다. 돌연변이는, 예컨대 염기 교환, 결실, 삽입, 역위, 전위 또는 복제를 포함한다. 레스틴의 돌연변이체 형태는 등가의 참조 레스틴 폴리펩티드에 비해 증가되거나 저하된 항혈관형성 활성을 나타낼 수 있으며, 이러한 돌연변이체는, 예컨대 완전하거나 부분적인 링커 서열에 대응하는 아미노산 서열 또는 아미노산 잔기를 클로닝하는 방법으로부터 유도된 추가적인 아미노산을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.

레스틴의 "동족체"이라 함은 완전한 레스틴 분자 또는 그의 단편 또는 대립유전자성 변이체와 실질적으로 유사하고, 실질적으로 동일하거나 우수한 생물학적 활성을 지니고 있는 비천연의 분자를 의미한다. 이러한 동족체는 변형되지 않은 레스틴 폴리펩티드, 단편, 돌연변이체, 상동물 또는 대립유전자성 변이체와 정성적으로 유사한 효능제 또는 길항제 효과를 나타내는 생물학적 활성의 레스틴 유도체(예컨대, 상기 정의된 바와 같은 화학적 유도체) 뿐만 아니라, 이의 단편, 돌연변이체, 상동물 및 대립유전자성 변이체를 포함하는 것으로 해석된다.

레스틴의 "대립유전자"라 함은 참조 레스틴 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열에 관하여 자연적으로 일어나는 서열 변이를 포함하는 폴리펩티드 서열을 의미한다. 레스틴 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드의 "대립유전자"라 함은 참조 레스틴 폴리펩티드를 엔코딩하는 참조 폴리누클레오티드 서열에 관하여 서열 변이를 함유하는 폴리누클레오티드를 의미하고, 여기서 레스틴 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드의 대립유전자는 대립유전자 형태의 상기 레스틴 폴리펩티드를 엔코딩한다.

소정의 폴리펩티드가 레스틴의 단편, 돌연변이체, 동족체 또는 대립유전자성 변이체일 수 있거나, 또는 이는 이들 중의 둘 이상일 수 있는데, 예를 들면 폴리펩티드는 레스틴 폴리펩티드의 동족체 및 돌연변이체 양자 모두일 수 있다. 예를 들면, 레스틴 분자의 단축된 변형물(예를 들면, 레스틴의 단편)이 실험실 내에서 생성될 수 있다. 그 다음에, 상기 단편을 당해 분야에서 공지된 수단을 통하여 돌연변이시키는 경우, 레스틴의 단편이자 돌연변이체인 특정 분자가 생성된다. 또 다른 예에서는, 레스틴의 돌연변이체가 생성될 수 있는데, 이는 몇가지 포유동물 개체에서 레스틴의 대립유전자로서 존재하는 것으로 이후 밝혀졌다. 따라서, 이러한 돌연변이체 레스틴 분자는 레스틴의 돌연변이체이자 대립유전자성 변이체일 것이다. 이러한 단편, 돌연변이체, 대립유전자성 변이체 및 동족체의 조합은 본 발명에 포함되는 것으로 해석된다.

레스틴 또는 아포미그렌과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질, 또는 레스틴 또는 아포미그렌을 엔코딩하는 폴리누클레오티드와 실질적으로 동일한 핵산 서열을 갖는 폴리누클레오티드는 본 발명에 포함된다. "실질적으로 동일한 서열"이라 함은 참조 서열, 예컨대 또 다른 핵산 또는 폴리펩티드와 약 70% 이상의 서열 동일성, 일반적으로 참조 서열과 약 80% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 참조 서열과 약 90% 이상의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 참조 서열과 약 95% 이상의 서열 동일성, 가장 바람직하게는 참조 서열과 약 97% 이상의 서열 동일성을 나타내는 핵산 또는 폴리펩티드를 의미한다. 서열에 대한 비교 길이는 일반적으로 75개 이상의 누클레오티드 염기 또는 25개 아미노산, 더욱 바람직하게는 150개 이상의 누클레오티드 염기 또는 50개 아미노산, 및 가장 바람직하게는 243 내지 264개의 누클레오티드 염기 또는 81 내지 88개 아미노산일 것이다. 본원에서 사용된 바와 같은 "폴리펩티드"는 아미노산의 분자 사슬을 가리키며, 특정한 길이의 생성물을 언급하는 것이 아니다. 따라서, 펩티드, 올리고펩티드 및 단백질은 폴리펩티드의 정의 내에 포함된다. 이러한 용어는 또한, 글리코실화, 아세틸화, 포스포릴화 등과 같은 발현후 변형이 가해진 폴리펩티드를 포함한다. 레스틴은, 일반적으로 엔도스타틴과 70% 미만의 아미노산 서열 동일성을 나타낸다.

본원에서 사용된 바와 같은 "서열 동일성"이라 함은 2개의 중합체성 분자, 예를 들면 2개의 폴리누클레오티드 또는 2개의 폴리펩티드 간의 아단위 서열 유사성을 언급한다. 이들 두 분자 모두에서 아단위 위치가 동일한 단량체성 아단위에 의해 점유된 경우, 예를 들면 두 펩티드 각각에서의 특정 위치가 세린에 의해 점유되는 경우에는, 이들이 상기 위치에서 동일하다. 두 서열간의 동일성은 매칭 또는 동일한 위치의 수와 직접적인 함수 관계인데, 예를 들어 2개의 펩티드 또는 화합물 서열에서 위치의 1/2(예를 들어, 길이가 10개 아단위인 중합체에서 5개 위치)이 동일한 경우에는, 두 서열이 50% 동일한 것이고; 위치의 90%, 예를 들면 10개 중의 9개가 매칭되는 경우에는, 두 서열이 90% 서열 동일성을 공유하는 것이다. 예로써, 아미노산 서열 VRGLQP과 HAFLQP는 6개 위치 중에 3개를 공통적으로 가지므로, 50% 서열 동일성을 공유하는 반면, 서열 VRGLQP와 AFLQP는 5개 위치 중에 3개를 공통적으로 지니고 있으므로, 60% 서열 동일성을 공유한다. 두 서열 간의 동일성은 매칭되거나 동일한 위치의 수와 직접적인 함수 관계이다. 따라서, 참조 서열의 일부가 특정한 펩티드에서 결실된 경우, 그 결실된 부분은 서열 동일성을 계산하는데 고려되지 않는데, 예를 들면 VRGLQP와 VRGLP는 6개 위치 중에 5개를 공통적으로 가지므로 83.3% 서열 동일성을 공유한다.

동일성은 종종 서열 분석 소프트웨어, 예컨대 BLASTN 또는 BLASTP (http://www.ncbi.nlm.gov/BLAST/에서 입수가능)를 사용하여 측정한다. 누클레오티드 서열용 BLASTN에 의해 두 서열을 비교하기 위한 디폴트 파라미터(예를 들면, 서로에 대하여 두 서열을 "블래스트"-하는 것, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ gorf/b12.html)는 매치에 대한 보상=1, 미스매치에 대한 패널티=-2, 오픈 갭=5, 및 신장 갭=2이다. 단백질 서열용 BLASTP를 사용하는 경우, 디폴트 파라미터는 매치에 대한 보상=0, 미스매치에 대한 패널티=0, 오픈 갭=11 및 신장 갭=1이다.

두 서열이 "서열 상동성"을 공유하는 경우, 이는 두 서열이 단지 보존적 치환에서만 서로 상이하다는 것을 의미한다. 폴리펩티드 서열의 경우, 이러한 보존적 치환은 상기 서열중 소정의 위치에서 동일한 부류의 또 다른 아미노산에 대체하는 하나의 아미노산의 치환(예를 들어, 소수성, 전하, pK 또는 기타 입체형태 또는 화학적 성질의 특징을 공유하는 아미노산, 예를 들면, 류신을 대체하는 발린, 라이신을 대체하는 아르기닌), 또는 폴리펩티드의 생물학적 활성을 파괴시키는 정도로 폴리펩티드의 입체형태 또는 폴딩을 변형시키지 않는 서열 위치에 국재된, 하나 이상의 비-보존적 아미노산 치환, 결실 또는 삽입에 의해 이루어진다. "보존적 치환"의 예로서, 상기 폴리펩티드가 필수적인 생물학적 활성을 나타내는 경우에, 또 다른 잔기를 대체하는 이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌 등의 하나의 비-극성(소수성) 잔기의 치환; 아르기닌과 라이신간, 글루타민과 아스파라긴간, 글리신과 세린간과 같은 또 다른 잔기를 대체하는 하나의 극성(친수성) 잔기의 치환; 또 다른 잔기를 대체하는 라이신, 아르기닌 또는 히스티닌과 같은 하나의 염기성 잔기의 치환; 또는 또 다른 잔기를 대체하는 아스파르트산 또는 글루탐산과 같은 하나의 산성 잔기의 치환; 비-유도체화 잔기 대신 화학적으로 유도체화된 잔기의 사용이 포함된다. 서열 상동성을 공유하는 두 서열을 "서열 상동물"로 칭할 수 있다.

폴리펩티드에 대한 상동성은 일반적으로 서열 분석 소프트웨어(예를 들면, 서열 분석 소프트웨어 패키지; the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705)를 사용하여 측정된다. 단백질 분석 소프트웨어는 각종 치환, 결실 및 기타 변형에 대하여 상동성의 정도를 지정함으로써 유사한 서열을 매칭시킨다. 보존적 치환은 일반적으로 다음 기 내에서의 치환을 포함한다: 글리신, 알라닌; 발린, 이소류신, 류신; 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌, 라이신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신.

또한, 본 발명에는 레스틴 및 아포미그렌의 화학적 유도체가 포함된다. "화학적 유도체"는 측부 작용기의 반응에 의해 화학적으로 유도체화된 하나 이상의 잔기를 갖는 피검 대상 폴리펩티드를 언급한다. 이러한 유도체화 잔기는, 예를 들면 아민 하이드로클로라이드를 형성하기 위하여 유리 아미노기가 유도체화된 분자, p-톨루엔 설포닐기, 카르보벤족시기, t-부틸옥시카르보닐기, 클로로아세틸기 또는 포르밀기를 포함한다. 유리 카르복시기는 염, 메틸 및 에틸 에스테르 또는 기타 유형의 에스테르 또는 하이드라지드를 형성하기 위하여 유도체화될 수 있다. 유리 히드록시기는 O-아실 또는 O-알킬 유도체를 형성하기 위하여 유도체화될 수 있다. 히스티딘의 이미다졸 질소는 N-임벤질히스티딘을 형성하기 위하여 유도체화될 수 있다. 또한, 화학적 유도체로서, 20개 표준 아미노산중 하나 이상의 천연 아미노산 유도체를 함유하는 펩티드가 포함된다. 예를 들면, 프롤린이 4-하이드록시프롤린으로 대체될 수 있고; 라이신이 5-히드록시라이신으로 대체될 수 있으며; 히스티딘이 3-메틸히스티딘으로 대체될 수 있고; 세린이 호모세린으로 대체될 수 있으며; 라이신이 오르니틴으로 대체될 수 있다.

레스틴을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 분리된 DNA 또는 cDNA 라이브러리로부터 클로닝할 수 있다. 본원에서 "분리된"으로서 지칭된 핵산 또는 폴리펩티드는, 추가적인 프로세싱을 거칠 수 있는, 상기 핵산 또는 폴리펩티드가 수득되는(예를 들면, 핵산 혼합물 또는 세포 중의 존재물로서) 생물학적 공급원 물질을 거의 함유하고 있지 않는(즉, 이들 물질로부터 분리 제거된) 핵산 또는 폴리펩티드이다. "분리된" 핵산 또는 폴리펩티드는 본질적으로 순수한 핵산 또는 폴리펩티드, 화학적 합성에 의해, 화학적 방법 또는 생물학적 방법의 조합에 의해 생성된 핵산 또는 폴리펩티드, 및 재조합적으로 생성되는 분리된 핵산 또는 폴리펩티드를 포함하여, 본원에 기술된 방법, 유사한 방법 또는 기타 적합한 방법에 의해 수득되는 핵산 또는 폴리펩티드를 포함한다. 따라서, 분리된 폴리펩티드는 정상적으로는 결합되는 기타 단백질, 탄수화물, 지질 및 기타 세포 성분을 비교적 함유하지 않는 폴리펩티드를 의미한다. 분리된 핵산은 핵산이 유도되는 생물의 천연 게놈에 바로 인접한 핵산 양쪽 모두와 바로 인접(즉, 공유적으로 연결)되어 있지 않다. 따라서, 상기 용어는, 예를 들면 특정 벡터(예를 들면, 자가 복제 바이러스 또는 플라스미드) 내로 혼입되는 핵산, 또는 화학적 방법이나 제한 엔도뉴클레아제 처리에 의해 생성된 핵산 단편과 같은 다른 핵산과 독립적인 별개의 분자로서 존재하는 핵산을 포함한다.

본 발명의 폴리누클레오티드 및 단백질은 기타 항혈관형성 단백질을 분리시키는 프로브를 고안하는데 사용될 수도 있다. 특별한 방법이, 전문이 본원에 참고문헌으로 삽입되어 있는 야코브(Jacobs) 등의 미국 특허 제 5,837,490호에 제공된다. 올리고누클레오티드 프로브의 고안은 바람직하게는 이들 파라미터를 따라야 한다: (a) 있다면, 가장 적은 수의 불명료한 염기("N's")를 갖는 서열 영역으로 고안되어야 하고; (b) T_m이 대략 80℃(A 또는 T 각각에 대해서 2℃, G 또는 C 각각에 대해서 4℃로 가정)가 되도록 고안되어야 한다.

올리고누클레오티드는, 바람직하게는 올리고누클레오티드를 표지시키는데 통상적으로 이용되는 기술을 사용하여 g-³²P ATP(특이적 활성 6000Ci/mmole) 및 T4 폴리누클레오티드 키나제로 표지되어야 한다. 기타 표지화 기술이 이용될 수도 있다. 혼입되지 않은 표지는, 바람직하게는 겔 여과 크로마토그래피 또는 기타 확립된 방법에 의해 제거되어야 한다. 프로브 내로 혼입된 방사능의 양은 신틸레이션 계수기에서 정량적으로 측정되어야 한다. 바람직하게는, 결과물인 프로브의 특이 적 활성은 대략 4 x 10⁶dpm/pmole이어야 한다. 완전한 길이의 클론의 풀을 함유하는 세균성 배양물은, 앰피실린을 100㎍/ml으로 함유하는 멸균성 L-브로쓰 25ml를 함유하는 멸균성 배양 플라스크를 접종하기 위하여, 바람직하게는 해동되어 모액 100㎕가 사용되어야 한다. 이러한 배양물은, 바람직하게는 37℃에서 포화상태까지 성장되어야 하고, 포화된 배양물은, 바람직하게는 새로운 L-브로쓰에서 희석되어야 한다. 이들 희석액의 분취량은, 바람직하게는 37℃에서 하룻밤 성장될 때 150mm 페트리 디쉬 중에서 앰피실린 100㎍/ml와 한천 1.5%를 함유하는 L-브로쓰를 함유하는 고형의 세균학적 배지 상에서 대략 5000개의 별개의 잘 분리된 콜로니를 산출할 희석율과 용적을 결정하기 위하여 평판배양되어야 한다. 별개의 잘 분리된 콜로니를 수득하기 위한 기타 공지된 방법이 이용될 수도 있다.

그 다음에, 상기 콜로니를 니트로셀룰로즈 필터로 옮기고, 이들을 융해, 변성 및 베이킹하기 위하여 표준 콜로니 하이브리드화 방법이 이용되어야 한다. 고도로 엄격한 조건은, 예를 들면 적어도 65℃에서의 1 x SSC, 또는 42℃에서의 1 x SSC 및 50% 포름아미드의 정도로 엄격한 조건이다. 중간 정도로 엄격한 조건은 적어도 65℃에서의 4 x SSC, 또는 42℃에서의 4 x SSC 및 50% 포름아미드의 정도로 엄격한 조건이다. 엄격성이 감소된 조건은 적어도 50℃에서의 4 x SSC, 또는 40℃에서의 6 x SSC 및 50% 포름아미드의 정도로 엄격한 조건이다.

그 다음에, 상기 필터는, 바람직하게는 0.5% SDS, 효모 RNA 100㎍/ml 및 10mM EDTA(150mm 필터당 대략 10ml)를 함유하는 6 x SSC(20x 모액은 175.3g NaCl/l, 88.2g 시트르산 나트륨/l이고, NaOH를 이용하여 pH 7.0으로 조정)에서 온화하게 진탕하면서 65℃에서 1시간 동안 배양된다. 바람직하게는, 그 다음에 상기 프로브는 1 x 10⁶dpm/ml 이상의 농도로 하이브리드화 혼합물에 첨가된다. 그 다음에, 상기 필터는, 바람직하게는 하룻밤 동안 온화하게 진탕하면서 65℃에서 배양된다. 그 다음에, 상기 필터는, 바람직하게는 진탕하지 않고 실온에서 2x SSC/0.5% SDS 500ml에서 세척된 후, 15분 동안 온화하게 진탕하면서 실온에서 2x SSC/0.1% SDS 500ml에서 세척된다. 65℃에서 30분 내지 1시간 동안 0.1x SSC/0.5% SDS로 세 번째 세척하는 것은 임의적이다. 그 다음에, 필터는, 바람직하게는 건조되고, 양화를 X-선 필름 상에서 가시화하기에 충분한 시간 동안 오토라디오그라피가 적용된다. 기타 공지된 하이브리드화 방법이 이용될 수도 있다. 그 다음에, 양성 콜로니는 선별되어, 배양액에서 성장되고, 플라스미드 DNA가 표준 방법을 이용하여 분리된다. 그 다음에, 상기 클론은 제한 분석, 하이브리드화 분석 또는 DNA 서열화에 의해 확인될 수 있다.

본 발명은 레스틴, 그의 단편, 돌연변이체, 상동물, 동족체 및 대립유전자성 변이체를 포함하는 융합 단백질 및 키메릭 단백질도 포함한다. 융합 또는 키메릭 단백질은 단일 단백질의 다중체, 예를 들면 레스틴의 반복체 또는 아포미그렌의 반복체로 구성될 수 있고, 또는 융합 및 키메릭 단백질은 여러 개의 단백질, 예를 들면 레스틴 및 아포미그렌으로 이루어질 수 있다. 융합 단백질은 2 이상의 공지된 항혈관형성 단백질(예를 들면, 안지오스타틴, 엔도스타틴 또는 안지오스타틴 및 엔도스타틴의 생물학적 활성 단편)의 조합물, 또는 표적화제와 조합된 항혈관형성 단백질(예를 들면, 상피 성장 인자(EGF) 또는 RGD 펩티드와 조합된 엔도스타틴), 또는 면역글로불린 분자와 조합된 항혈관형성 단백질(예를 들면, 엔도스타틴과 특히 Fc 부분이 제거된 IgG)을 포함할 수 있다. 융합 및 키메릭 단백질은 레스틴, 아포미그렌, 그들의 단편, 돌연변이체, 상동물, 동족체 및 대립유전자성 변이체, 및 기타 항혈관형성 단백질, 예를 들면, 엔도스타틴, 안지오스타틴 또는 EM1을 포함할 수 있다(전문이 본원에서 참고문헌으로 삽입된 Vikas P. Sukhatme에 의해 1998년 12월 8일자로 출원된 미국 특허원 제 XX/XXX,XXX호 "항혈관형성 펩티드 및 그의 사용 방법"에 기술된 바와 같다). 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "융합 단백질"은, 예를 들어 화학치료제를 운반하기 위한 추가적인 성분을 포함할 수도 있는데, 여기서 화학치료제를 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 항혈관형성 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드에 연결되어 있다. 융합 단백질은 항혈관형성 단백질의 다중체, 예를 들면 엔도스타틴의 이량체 또는 삼량체도 포함할 수 있다. 이러한 융합 단백질은 해독후 변형을 통하여 함께 연결될 수 있거나(예를 들면, 화학적으로 연결), 또는 완전한 융합 단백질이 재조합적으로 제조될 수 있다.

또한, 본 발명은 포유동물 조직에서 혈관형성을 억제 또는 증진시키기 위하여 생물학적 성분으로서 레스틴 뿐만 아니라 이의 단편, 돌연변이체, 상동물, 동족체 및 대립유전자성 변이체를 포함하는 조성물, 및 혈관형성 활성 또는 그의 결여를 특징으로 하거나 이와 관련된 질환 및 질병의 진단, 예후 및 치료에 있어서 상기 조성물의 용도를 포함한다. 이러한 방법은 경구, 국소, 주사, 이식, 서방출 또는 기타 전달 방법에 의한 투여를 포함할 수 있다.

본 발명은 혈관형성 활성과 관련된 질환 또는 질병의 치료용 조성물 중의 생물학적 활성 약제로서 레스틴, 및 그의 단편, 돌연변이체, 상동물, 동족체, 대립유전자성 변이체, 및 융합 및 키메릭 단백질의 용도를 포함한다. 이러한 질환의 치료 방법은 병에 걸린 조직을 레스틴, 그의 단편, 돌연변이체, 상동물, 동족체, 또는 대립유전자성 변이체를 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 포함한다.

본 발명은 치료적 유효량의 레스틴 또는 그의 생물학적 활성 단편, 또는 항혈관형성 활성을 보유한 레스틴 단편의 조합물, 또는 레스틴 효능제 또는 길항제를 사용하여 혈관형성-매개 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 혈관형성-매개 질환은 암, 고형 종양, 혈액성 종양(예컨대, 백혈병), 종양 전이, 양성 종양(예컨대, 혈관종, 음향 신경종, 신경섬유종, 트라코마 및 화농성 육아종), 류마치스성 관절염, 건선, 안구 혈관형성 질환(예컨대, 당뇨병성 망막증, 조숙 망막증, 퇴화성 반점, 각막 이식 거부, 신생혈관성 녹내장, 후방수정체 섬유증식증, 피부조홍), 오슬러-웹버(Osler-Webber) 증후군, 심근 혈관형성증, 플래크 신생혈관형성, 모세혈관확장증, 혈우병 관절증, 섬유성혈관종 및 창상 육아형성을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 레스틴은 내피 세포의 과도한 자극 또는 비정상적 자극의 질환을 치료하는데 유용하다. 이들 질환은 장관 유착증, 크론병(Crohn's disease), 아테롬성 동맥경화증, 공피증 및 비후성 반흔(즉, 켈로이드)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 레스틴은 배아 이식에 요구되는 혈관형성을 예방함으로써 산아조절제로서 사용될 수 있다. 레스틴은 묘조병(Rochele minalia quintosa) 및 궤양 (Heliobacter pylori)과 같이 병리학적 결과로서 혈관형성을 나타내는 질환의 치료에 유용하다. 레스틴 및 아포미그렌은, 예컨대 지방 조직에서의 모세혈관 형성을 억제하여 그의 팽창을 방지함으로써 투석 이식 혈관 과다 협착증 및 비만을 예방하는데 사용될 수도 있다. 레스틴 및 아포미그렌은 국재화된(예를 들면, 비전이된) 질환을 치료하는데 사용될 수도 있다. "암"은 신생물성 성장, 과형성 또는 증식성 성장, 또는 비정상적인 세포 발육의 병리학적 상태를 의미하며, 고형 종양, 비고형 종양, 및 백혈병에서 관찰되는 바와 같은 어떠한 비정상적인 세포 증식도 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같은 "암"은 혈관형성-의존적 암 및 종양, 즉 이들의 성장(용적 및/또는 덩어리 팽창)을 위해서는 이들에게 혈액을 공급해주는 혈관의 수와 밀도 증가를 필요로 하는 종양을 의미한다. "퇴행"은 종양 덩어리와 크기의 감소를 언급한다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "치료적 유효량"은 유의성있는 환자 이익, 즉 관련된 의학적 질환의 치료, 치유, 예방 또는 경감, 또는 이러한 질환의 치료율, 치유율, 예방율 또는 경감율의 증가를 나타내기에 충분한 조성물 또는 방법의 각 활성 성분의 총량을 의미한다. 조합물로 적용되는 경우, 상기 용어는 연속적으로 또는 동시에 조합 투여되는지 여부에 상관없이, 치료 효과를 가져오는 활성 성분의 조합량을 지칭한다.

대안적으로는, 예컨대 상처 치유, 또는 경색후 심장 조직에서 혈관형성 증가가 요망되는 경우에는, 레스틴 단백질에 대한 항체 또는 항혈청은 국재화된 본래의 항혈관형성 단백질 및 프로세스를 차단시킴으로써 새로운 혈관의 형성을 증가시켜 조직의 위축을 억제하기 위하여 사용될 수 있다.

레스틴은 질환 치료를 위한 기타 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있다. 예를 들면, 종양은 레스틴과 함께 통상 수술, 방사선처리, 화학요법, 또는 면역요법을 이용하여 치료될 수 있고, 그 다음에 미소전이물의 휴지 상태를 연장시키고 모든 잔류성 원발성 종양의 성장을 안정화 및 억제하기 위하여 레스틴이 연속적으로 환자에게 투여될 수 있다. 레스틴 또는 아포미그렌, 또는 그의 단편, 항혈청, 수용체 효능제, 또는 수용체 길항제, 또는 이들의 조합물은 기타 항혈관형성 화합물, 또는 기타 항혈관형성 단백질(예컨대, 안지오스타틴, 엔도스타틴, EM1), 그의 단편, 항혈청, 수용체 효능제, 수용체 길항제와 조합될 수 있다. 추가적으로, 레스틴, 레스틴 단편, 레스틴 항혈청, 레스틴 수용체 효능제, 레스틴 수용체 길항제, 또는 이들의 조합물은 치료적 조성물을 형성하기 위하여 약제학적으로 허용되는 부형제, 및 임의적으로 생체분해성 중합체와 같은 서방출 매트릭스와 조합된다. 본 발명의 조성물은 기타 항혈관형성 단백질 또는 화학적 화합물, 예를 들어 엔도스타틴, 안지오스타틴, EM1(전문이 본원에 참고문헌으로 삽입된, Vikas P. Sukhatme에 의해 1998년 12월 8일자로 출원된 미국 특허원 제XX/XXX,XXX호 "항혈관형성 펩티드 및 그의 사용 방법"에 기술), 및 이의 돌연변이체, 단편 및 동족체를 포함할 수도 있다. 조성물은 화학요법제 또는 방사선 치료제와 같이, 단백질의 활성을 증진시키거나, 이의 활성을 부여하거나, 또는 치료에 사용하게 해주는 기타 약제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 추가적인 인자 및/또는 약제는 본 발명의 단백질과의 상승 효과를 창출하거나, 부작용을 최소화하기 위하여 당해 조성물에 포함될 수 있다. 추가적으로, 본 발명의 조성물의 투여는 기타 치료법, 예컨대 화학요법 또는 방사선 요법 레지멘과 함께 투여될 수 있다.

본 발명은 포유동물 조직을 본 발명의 단백질을 포함하는 조성물과 접촉시킴으로써 이러한 조직에서의 혈관형성을 억제하는 방법을 포함한다. "접촉시키는 것"이란 국소적 투여 뿐만 아니라, 조성물을 조직 또는 조직의 세포 내로 도입하는 전달 방식을 의미한다.

시간조절 방출 또는 서방출 전달 시스템의 사용도 본 발명에 포함된다. 이러한 시스템은 수술이 어렵거나 불가능한 상황, 예컨대 환자가 고령 또는 질환 자체에 의해 쇠약해진 경우, 또는 위험-이익 분석이 치료 보다는 조절을 지시하는 경우에 상당히 바람직하다.

본원에서 사용된 바와 같은 서방출 매트릭스는 효소 가수분해 또는 산/염기 가수분해, 또는 해리에 의해 분해가능한 물질, 통상적으로 중합체로 만들어진 매트릭스이다. 일단 체내에 삽입되면, 이러한 매트릭스는 효소 및 체액에 의해 작용된다. 서방출 매트릭스는, 바람직하게는 리포좀, 폴리락티드(폴리락트산), 폴리글리콜라이드(글리콜산의 중합체), 폴리락티드 코글리콜라이드(락트산 및 글리콜산의 공중합체)폴리무수물, 폴리(오르토)에스테르, 폴리단백질, 하이알루론산, 콜라겐, 콘드로이틴 설페이트, 카르복시산, 지방산, 인지질, 폴리사카라이드, 핵산, 폴리아미노산, 페닐알라닌, 티로신, 이소류신과 같은 아미노산, 폴리누클레오티드, 폴리비닐 프로필렌, 폴리비닐피롤리돈 및 실리콘과 같은 생체적합성 물질로부터 선택된다. 바람직한 생체분해성 매트릭스는 폴리락티드, 폴리글리콜라이드, 또는 폴리락티드 코글리콜라이드(락트산 및 글리콜산의 공중합체) 중의 어느 하나의 매트릭스이다.

본 발명의 혈관형성-조절성 조성물은 고형, 액상 또는 에어로졸일 수 있으며, 공지된 어떠한 투여 경로로도 투여될 수 있다. 고형 조성물의 예로서 환제, 크림 및 이식성 투여 단위가 포함된다. 환제는 경구 투여할 수 있고, 크림은 국소적으로 투여할 수 있다. 이식성 투여 단위는 국소적으로, 예컨대 종양 부위에 투여될 수 있거나, 혈관형성-조절성 조성물을 전신적으로 방출, 예컨대 피하적으로 방출시키기 위해 이식될 수 있다. 액상 조성물의 예로서 피하, 정맥내, 관절내 주사용으로 적용되는 제형, 및 국소 및 안내 투여용 제형이 있다. 에어로졸 제형의 예로서 폐에 투여하기 위한 흡입제 제형이 포함된다.

상기 항혈관형성 활성을 가지는 레스틴 단백질 및 단백질 단편은 당업자에게 공지된 제형화 방법을 사용하여 약제학적으로 허용되는 제형 중에 분리된 실질적으로 정제된 단백질 및 단백질 단편으로서 제공될 수 있다. 이들 제형은 표준 경로로 투여될 수 있다. 일반적으로, 조합물은 국소, 경피, 복강내, 두개내, 뇌실내, 뇌내, 질내, 자궁내, 경구, 직장 또는 비경구(예컨대, 정맥내, 척수내, 피하 또는 근육내) 경로로 투여될 수 있다. 또한, 레스틴은 화합물의 서방출을 허용해주는 생체분해성 중합체 내로 혼입될 수 있으며, 중합체는 약물 전달이 요망되는 부위, 예컨대 종양 또는 이식된 부위 근처에서 레스틴이 체내에 서서히 방출되도록 이식된다. 삼투압 미니펌프는 고농도 레스틴이 캐뉼라를 통하여 직접 상기 종양에 대한 혈관내 공급물 또는 전이성 성장물 내와 같이 관심있는 부위에 조절된 방식으로 전달되도록 하기 위해 사용될 수 있다. 생체분해성 중합체 및 이의 용도는, 예컨대 전문이 본원에 참고문헌으로 삽입되어 있는 Brem et al. (1991) (J. Neurosurg. 74:441-446)에 상세히 기술된다.

본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 조성물은, 예컨대 단위 용량을 주사함으로써 정맥내 투여될 수 있다. 용어 "단위 용량"은 본 발명의 치료적 조성물과 관련하여 사용되는 경우, 피검자에 대한 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 별개의 단위를 언급하고, 각 단위는 요구되는 부형제, 즉 담체 또는 비히클과 함께 목적하는 치료적 효과를 나타내도록 계산된 활성 물질의 예정량을 포함한다.

본 발명의 조성물의 투여 방식은 정맥내, 근육내, 복강내, 흉골내, 피하 및 관절내 주사 및 주입을 포함한다. 비경구 주사용 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 멸균성 수성 또는 비수성 용액, 분산제, 현탁제 또는 유제 뿐만 아니라 사용 직전에 멸균성 주사용 용액 또는 분산제로 재구성하기 위한 멸균성 산제를 포함한다. 적합한 수성 및 비수성 담체, 부형제, 용매 또는 비히클의 예로서 물, 에탄올, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 카르복시메틸셀룰로즈 및 이들의 적합한 혼합물, 식물성 오일(예컨대, 올리브유) 및 에틸 올레에이트와 같은 주사용 유기 에스테르가 포함된다. 예를 들면, 레시틴과 같은 코팅 물질의 사용, 분산제의 경우 요구되는 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 적당한 유동성이 유지될 수 있다. 이들 조성물은 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 보조제를 포함할 수도 있다. 미생물 작용의 방지는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등과 같은 각종 항균제 및 항진균제를 포함시킴으로써 확보될 수 있다. 당, 염화나트륨 등과 같은 등장화제를 포함하는 것이 바람직할 수도 있다. 흡수를 지연시키는, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 약제를 포함시킴으로써 주사용 약제학적 형태의 흡수가 연장될 수 있다. 주사용 데포 형태는 폴리락티드-폴리글리콜리드, 폴리(오르토에스테르) 및 폴리(무수물) 등의 생체분해성 중합체로 약물의 마이크로캅셀 매트릭스를 형성시킴으로써 제조된다. 중합체에 대한 약물의 비율과 사용된 특정한 중합체의 성질에 따라서, 약물 방출 속도가 조절될 수 있다. 데포 주사용 제형은 신체 조직과 부합되는 리포좀 또는 마이크로에멀젼에 약물을 포획시킴으로써 제조되기도 한다. 주사용 제형은, 예를 들어 세균-보존 필터를 통하여 여과시키거나, 또는 사용하기 직전에 멸균수 또는 기타 멸균성 주사용 비히클에 용해되거나 분산시킬 수 있는 멸균성 고형 조성물의 형태에 멸균제를 혼입시킴으로써 멸균될 수 있다.

본 발명의 치료적 조성물은, 예를 들면 무기산 또는 유기산으로부터 유도될 수 있는 성분들의 약제학적으로 허용되는 염을 조성물내에 포함할 수 있다. "약제학적으로 허용되는 염"이라 함은 올바른 의학적 판단의 범주내에서 부적당한 독성, 자극, 알레르기성 반응 등이 없이 사람 및 하등 동물의 조직과 접촉하여 사용하는데 적합하고, 합리적인 이익/위험 비가 적당한 염을 의미한다. 약제학적으로 허용되는 염은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들면, S.M.Berge 등은 본원에 참고문헌으로 삽입된 J.Pharmaceutical Sciences (1977) 66:1 et seq.에서 약제학적으로 허용되는 염을 상세히 기술한다. 약제학적으로 허용되는 염은, 예컨대 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 타르타르산, 만델산과 같은 유기산을 사용하여 형성된 산 부가염(폴리펩티드의 유리 아미노기를 사용하여 형성)을 포함한다. 유리 카르복시기를 사용하여 형성되는 염은, 예컨대 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화철과 같은 무기 염기 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유도될 수 있다. 이러한 염은 본 발명의 화합물을 최종적으로 분리 및 정제하는 동안에 그 자리에서, 또는 유리 염기 작용기를 적당한 유기산과 반응시킴으로써 별도로 제조될 수 있다. 대표적인 산 부가염은 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 시트레이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 벤젠설포네이트, 바이설페이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포설포네이트, 디글루코네이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵토네이트, 헥사노에이트, 푸마레이트, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 하이드로요오다이드, 2-히드록시메탄설포네이트(이세티오네이트), 락테이트, 말레에이트, 메탄설포네이트, 니코티네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 옥살레이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 석시네이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, 포스페이트, 글루타메이트, 바이카보네이트, p-톨루엔설포네이트 및 운데카노에이트를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 또한, 염기성 질소 함유 기는 메틸, 에틸, 프로필, 및 부틸 클로라이드, 브로마이드 및 요오다이드와 같은 저급 알킬 할라이드; 디메틸, 디에틸, 디부틸 및 디아밀 설페이트와 같은 디알킬 설페이트; 데실, 라우릴, 미리스틸 및 스테아릴 클로라이드, 브로마이드 및 요오다이드와 같은 장쇄 할라이드; 벤질 및 펜에틸 브로마이드 등과 같은 아릴알킬 할라이드와 같은 약제를 사용하여 4급화될 수 있다. 이로써 수용성 또는 유용성 또는 분산성 생성물이 수득된다. 약제학적으로 허용되는 산 부가 염을 형성하는데 이용될 수 있는 산의 예로서 염산, 브롬화수소산, 황산 및 인산과 같은 무기산 및 옥살산, 말레산, 석신산 및 시트르산과 같은 유기산이 포함된다.

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "약제학적으로 허용되는", "생리학적으로 허용되는" 및 이의 문법상 다양한 표현들은 이들이 조성물, 담체, 부형제 및 시약을 언급하는 경우, 상호교환적으로 사용되며, 그 물질이 구토, 현기증, 배탈 등과 같은 바람직하지 못한 생리학적 효과를 최소한도로 하면서 포유동물에게 투여될 수 있다는 것을 나타낸다. 거기에 용해 또는 분산된 활성 성분을 포함하는 약리학적 조성물의 제조는 당해 분야에서 널리 알려져 있고, 제형에 따라 제한될 필요는 없다. 일반적으로, 이러한 조성물은 액상 용액 또는 현탁제와 같은 주사제로서 제조되지만, 사용 이전에 액체 중에서 용액 또는 현탁제에 적합한 고형 형태로 제조될 수도 있다. 제제는 유화될 수도 있다.

활성 성분은, 약제학적으로 허용되며 활성 성분과 배합가능한 부형제와 본원에 기술된 치료 방법에서 사용하기에 적합한 양으로 혼합될 수 있다. 적합한 부형제의 예는 물, 식염수, 덱스트로즈, 글리세롤, 에탄올 등 및 이들의 조합물을 포함한다. 또한, 필요에 따라, 조성물은 습윤제 또는 유화제, pH 완충제 및 기타 활성 성분의 효능을 증진시키는 물질과 같은 보조 물질을 소량 함유할 수 있다.

본 발명의 레스틴 폴리펩티드는 전구약물을 포함하는 조성물중에 포함될 수도 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "전구약물"은, 예를 들면 혈액 중에서 효소적 가수분해에 의해 생체내에서 신속하게 변환되어 모 화합물을 생성시키는 화합물을 지칭한다. 이에 대한 철저한 논의가 본원에 참고 문헌으로 삽입된 T.Higuchi and V.Stella, Prodrugs as Novel Delivery Systems, Vol.14 of thd A.C.S. Symposium Series, Edward B.Roche, ed., Bioreversible Carriers in Drug Design, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987에 제공되어 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "약제학적으로 허용되는 전구약물"은 (1) 올바른 의학적 판단의 범주 내에서, 부적당한 독성, 자극, 알레르기성 반응 등없이 사람 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하는데 적합하고, 이익 대 위험 비가 적당하며, 의도된 용도에서 유효하고; (2) 가능한 경우, 모 화합물의 쯔비터이온 형태를 지칭한다.

본 발명의 레스틴의 투여량은 치료되는 질환 상태 또는 질병 및 사람 또는 동물의 체중 및 건강상태와 같은 임상적 인자 및 화합물의 투여 경로에 따라서 좌우될 것이다. 사람 또는 동물을 치료하는 경우에는, 약 10mg/체중kg 내지 약 20mg/체중kg의 레스틴 단백질 또는 아포미그렌 단백질이 투여될 수 있다. 조합 치료법, 예를 들면 본 발명의 레스틴 단백질 또는 아포미그렌 단백질을 방사선 치료, 화학요법, 또는 면역치료법과 조합하는 경우에는, 투여량을, 예를 들어 약 0.1mg/체중kg 내지 약 0.2mg/체중kg으로 감소시킬 수 있다. 특정한 동물 또는 사람에서는 레스틴의 반감기에 따라서, 레스틴은 1일 수 회 내지 1주 1회 투여될 수 있다. 본 발명은 사람 및 가축용 모두에 적용되는 것으로 해석되어야 한다. 본 발명의 방법은 동시에 또는 장기간에 걸쳐 제공되는, 수회 뿐만 아니라 1회 투여를 의도로 한다. 또한, 레스틴 및/또는 아포미그렌은 기타 형태의 치료법, 예를 들어 화학요법, 방사선 치료 또는 면역치료법과 연계하여 투여될 수 있다.

레스틴 제형에는 경구, 직장, 안(초자체내 또는 방내 포함), 비내, 국소(볼 및 설하 포함), 자궁내, 질 또는 비경구(피하, 복강내, 근육내, 정맥내, 피내, 두개내, 기관내 및 경막외 포함) 투여에 적합한 것들을 포함한다. 레스틴 제형은 편리하게 단위 투여량 형태로 제공될 수 있고 통상적인 약제학적 기술에 의해 제조될 수 있다. 이러한 기술은 활성 성분과 약제학적 담체(들) 또는 부형제(들)을 혼합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 이러한 제형은 활성 성분을 액상 담체 또는 미세하게 나누어진 고형 담체 또는 둘 다와 균일하고도 친밀하게 혼합시킨 다음, 필요에 따라, 생성물을 성형함으로써 제조한다.

비경구 투여에 적합한 제형은 항산화제, 완충제, 제균제 및 제형을 투여 예정자의 혈액과 등장화시키는 용질을 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 주사 용액; 및 현탁화제 및 농조화제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁제를 포함한다. 제형은 단일-용량 또는 수회 용량 용기, 예를 들면 밀봉된 앰플 및 바이알로 제공될 수 있고, 사용 직전에 멸균성 액상 담체, 예컨대 주사용수의 첨가만을 요구하는 동결 건조된 상태로 저장될 수 있다. 즉석의 주사 용액 및 현탁제는 상기 종류의 멸균된 산제, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.

본 발명의 단백질의 치료적 유효량이 경구 투여되는 경우, 본 발명의 레스틴 단백질은 정제, 캅셀제, 산제, 용액 또는 엘릭실제의 형태일 것이다. 정제 형태로 투여되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 젤라틴과 같은 고형 담체 또는 보조제를 추가적으로 포함할 수 있다. 정제, 캅셀제 및 산제는 본 발명의 단백질을 약 5 내지 95%, 및 바람직하게는 약 25 내지 90% 포함한다. 액상 형태로 투여되는 경우, 물, 석유, 땅콩유, 광유, 대두유 또는 참깨유와 같은 동물 또는 식물 기원의 오일, 또는 합성 오일과 같은 액상 담체가 첨가될 수 있다. 액상 형태의 약제학적 조성물은 생리학적 식염수, 덱스트로즈 또는 기타 사카라이드 용액, 또는 글리콜, 예를 들면, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜을 추가로 포함할 수 있다. 액상 형태로 투여되는 경우, 당해 약제학적 조성물은 본 발명의 단백질을 약 0.5 내지 90%, 바람직하게는 약 1 내지 50% 함유한다.

본 발명의 단백질의 치료학적 유효량이 정맥내, 피부 또는 피하 주사에 의해 투여되는 경우, 본 발명의 단백질은 발열성물질이 제거된 비경구적으로 허용되는 수성 용액의 형태일 것이다. pH, 등장성, 안정성 등과 적당한 관련성이 있는, ㅇ;러한 비경구적으로 허용되는 단백질 용액의 제조는 당해 분야의 기술 범위 내이다. 정맥내, 피부 또는 피하 주사용으로 바람직한 약제학적 조성물은 본 발명의 단백질 이외에, 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 덱스트로즈 주사액, 덱스트로즈와 염화나트륨 주사액, 락테이트화 링거 주사액, 또는 당해 분야에 공지된 바와 같은 기타 비히클과 같은 등장성 비히클을 함유해야 한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 안정화제, 보존제, 완충제, 항산화제, 또는 당업자에게 공지된 기타 첨가제를 포함할 수도 있다.

본 발명의 약제학적 조성물내의 본 발명의 단백질의 양은 치료되는 질환의 종류 및 중증도, 및 환자에게 수행된 이전 치료의 종류에 좌우될 것이다. 궁극적으로, 담당의가 각각의 개개 환자를 치료하기 위한 본 발명의 단백질의 양을 결정할 것이다. 초기에는, 담당의가 본 발명의 단백질을 저용량 투여한 다음, 환자의 반응을 관찰할 것이다. 환자에 대한 최적의 치료 효과가 얻어질 때까지 본 발명의 단백질이 보다 많은 용량으로 투여될 수 있으며, 최적의 효과가 얻어지는 시점에서 투여량은 더 이상 증가되지 않는다.

본 발명의 약제학적 조성물을 이용한 정맥내 치료 기간은 치료되는 질환의 중증도, 및 각각의 개개 환자의 상태 및 잠재적인 특이체질 반응에 따라서 좌우될 것이다. 본 발명의 단백질의 각 투여 기간은 연속 정맥내 투여의 12 내지 24시간의 범위내일 것으로 생각된다. 궁극적으로, 담당의는 본 발명의 약제학적 조성물을 이용하는 적절한 정맥내 치료 기간을 결정할 것이다.

바람직한 단위 투여량 제형은 투여된 성분의 1일 용량 또는 단위, 1일 서브용량, 또는 이의 적당한 분획을 포함한 것이다. 특히 상기 언급된 성분들 이외에, 본 발명의 제형은 문제의 제형 유형과 관련하여 당해 분야에서 통상적인 기타 약제를 포함할 수 있는 것으로 해석되어야 한다. 임의적으로, 환자에게 이중 치료를 제공하기 위하여, 세포독성제가 레스틴 단백질 또는 이의 생물학적 작용성 단백질 단편에 혼입되거나 배합될 수 있다.

치료적 조성물은 수의학적 용도로도 유용하다. 사람 이외에, 특히 가축 및 순종 말이 본 발명의 단백질을 이용한 이러한 치료에 요망되는 환자이다.

리신과 같은 세포독성제를 레스틴, 및 고친화성 레스틴 단백질 단편에 연결시킴으로써 레스틴과 결합하는 세포를 파괴하기 위한 도구가 제공된다. 이들 세포는 미소전이물 및 원발성 종양을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 많은 위치에서 발견될 수 있다. 세포독성제에 연결된 단백질은, 목적하는 위치로의 전달을 최대화하도록 고안된 방식으로 주입된다. 예를 들면, 리신-연결된 고친화성 레스틴 단편은 캐뉼라를 통하여 표적 부위 공급 혈관 내로 전달되거나 또는 표적에 직접적으로 전달된다. 이러한 제제는 주입용 캐뉼라와 커플링된 삼투압 펌프를 통하여 조절된 방식으로도 전달된다. 레스틴 길항제의 조합물은 조직의 혈관형성을 증가시키기 위하여 혈관형성의 자극인자와 함께 적용될 수 있다. 이러한 치료적 레지멘은 전이성 암을 파괴시키는데 유효한 수단을 제공한다.

추가적인 치료 방법은 세포독성제에 연결된 레스틴, 레스틴 단편, 레스틴 동족체, 레스틴 항혈청, 또는 레스틴 수용체 효능제 및 길항제의 투여를 포함한다. 레스틴은 사람 또는 동물 기원일 수 있는 것으로 해석되어야 한다. 레스틴은 화학적 반응이나 발현 시스템과 연계하는 재조합 기술에 의해 합성적으로 제조될 수도 있다. 레스틴은 항혈관형성 활성을 지닌 단백질을 생성시키기 위하여 분리된 플라스미노겐 또는 플라스민을 효소적으로 절단하여 제조될 수도 있다. 레스틴은 플라스미노겐을 레스틴으로 절단시키는 내인성 효소의 작용을 모사하는 화합물에 의해 제조될 수도 있다. 레스틴 생성은 플라스미노겐 절단 효소의 활성에 영향을 미치는 화합물에 의해 조절될 수도 있다.

이들 단백질 서열은 가능한 서열 상동물을 결정하기 위하여 GenBank, Brookhaven Protein, SWISS-PROT, 및 PIR과 같은 단백질 서열 네이타베이스를 사용하여 공지된 서열과 비교된다. 이 정보는 다른 분자들과 고도의 서열 상동성을 나타내는 서열의 제거를 촉진하고, 이로써 레스틴에 대한 항혈청, 효능제 및 길항제의 개발에 있어서 고도의 특이성에 대한 가능성을 증가시킨다.

본 발명은, 레스틴 또는 아포미그렌, 또는 그의 돌연변이체, 단편, 또는 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드가 환자에게 도입되어 조절되는 유전자 치료도 포함한다. 유전자 치료법으로서 기타 언급되는, DNA를 유전자 생성물 단백질의 발현용 세포에 전이 또는 전달시키는 각종 방법이, 본원에 참고문헌으로 삽입되어 있는 Gene Transfer into Mammalian Somatic Cells in vivo, N.Yang(1992) Crit. Rev. Biotechn. 12(4):335-356에 개시된다. 유전자 치료는 DNA 서열을 생체외 또는 생체내 치료에 사용하기 위한 체세포 또는 생식 세포주 내로 혼입시키는 것을 포함한다. 유전자 치료는 유전자를 대체하고, 정상적이거나 비정상적인 유전자 기능을 증대시키며, 감염성 질환 및 기타 병리 상태를 물리치는 기능을 한다.

유전자 치료를 이용하여 이들 의학적 질환을 치료하는 방법은 결함있는 유전자를 동정후 결함있는 유전자의 기능을 대체하거나 약간의 기능성 유전자를 증대시키기 위하여 기능성 유전자를 첨가하는 것과 같은 치료 방법; 또는 질환 상태를 치료하거나 조직 또는 기관을 치료 레지멘에 보다 더 감수성을 갖게 하는 생성물 단백질에 대한 유전자를 첨가하는 것과 같은 예방 방법이 포함된다. 예방 방법의 한 예로서, 레스틴과 같은 유전자는 환자에게 위치됨으로써 혈관형성의 발생을 방지할 수 있으며; 또는 종양 세포를 방사선에 보다 더 감수성이 되도록 만드는 유전자가 삽입될 수 있고, 그 다음에 종양을 방사선 처리하면 종양 세포의 사멸이 증가된다.

레스틴 DNA 또는 레스틴 조절 서열을 전이시키는 많은 프로토콜이 본 발명에 계획되어 있다. 레스틴과 특이적으로 결합되는 것으로 통상 발견되는 것 이외의 프로모터 서열, 또는 레스틴 단백질의 생성을 증가시키는 기타 서열의 형질감염도 유전자 치료법으로서 계획되어 있다. 세포 중의 에리트로포이에틴 유전자를 작동시키는 "유전자 스위치"를 삽입하기 위해 상동성 재조합을 이용하는, 이러한 기술의 한 예가 Transkaryotic Therapies, Inc., of Cambridge, Mass에서 발견된다. Genetic Engineering News, Apr. 15, 1994를 참조하라. 이러한 "유전자 스위치"는 레스틴(또는 레스틴 수용체)를 정상적으로 발현하지 않는 세포에서 레스틴(또는 레스틴 수용체)를 활성화시키는데 이용될 수 있다.

유전자 치료를 위한 유전자 전이 방법은 3개의 광범위한 카테고리로 분류된다: 물리적(예컨대, 전기천공, 직접적인 유전자 전이 및 입자 충격), 화학적(예컨대, 지질계 담체, 또는 기타 비바이러스성 벡터) 및 생물학적(예컨대, 바이러스-유도된 벡터 및 수용체 흡수) 카테고리. 예를 들면, DNA로 피복된 리포좀을 포함하는 비바이러스성 벡터가 사용될 수 있다. 이러한 리포좀/DNA 복합체는 환자에게 직접적으로 정맥내 주사될 수 있다. 리포좀/DNA 복합체는 간에 농축되어 거기서 DNA를 마크로파아지와 쿠퍼(Kupffer) 세포에 전달하는 것으로 생각된다. 이들 세포는 장기간 생존하므로 전달된 DNA가 장기간 발현되도록 한다. 추가적으로, 벡터 또는 유전자의 "노출된" DNA는 치료적 DNA의 표적화된 전달을 위해 목적하는 기관, 조직 또는 종양에 직접 주사될 수 있다.

유전자 치료 방법론은 전달 부위측면에서 기술될 수도 있다. 유전자를 전달하는 기본적인 방법으로는 생체외 유전자 전이, 생체내 유전자 전이, 및 시험관내 유전자 전이가 있다. 생체외 유전자 전이에서는, 환자로부터 세포를 채취한 다음 세포 배양물에서 성장시킨다. DNA를 상기 세포 내로 형질감염시키고, 형질감염된 세포를 수적으로 확장시킨 다음, 환자에 재이식한다. 시험관내 유전자 전이에서는, 형질전환된 세포가 특정한 환자 유래의 특정한 세포가 아니라, 조직 배양 세포와 같이 배양물에서 성장하는 세포이다. 이들 "실험실 세포"를 형질감염시키고, 형질감염된 세포를 선별하여 환자에 이식하거나 기타 사용을 이해 수적으로 확장시킨다.

생체내 유전자 전이는 세포가 환자 내에 있는 경우에 환자의 세포 내로 DNA를 도입하는 것을 포함한다. 방법으로는 유전자를 환자에 전달하기 위하여 감염되지 않은 바이러스를 사용하는 바이러스 매개의 유전자 전이를 이용하는 것 또는 노출된 DNA를 환자 중의 한 부위에 주사하고 DNA가 유전자 생성물 단백질이 발현되는 일부의 세포에 흡수되도록 하는 것이 포함된다. 추가적으로, "유전자 총(gun)"의 사용과 같이, 본원에 기재된 기타 방법은 레스틴 DNA 또는 레스틴 조절 서열의 시험관내 삽입을 위해 사용될 수 있다.

유전자 치료의 화학적 방법은 DNA를 세포막 내로 가로질러 전달하기 위하여, 반드시 리포좀일 필요는 없는 지질계 화합물을 이용할 수 있다. 음성 하전된 DNA와 결합되는 지질계 양성 이온인 리포펙틴 또는 사이토펙틴이, 세포막을 가로지를 수 있고 세포 내부에 DNA를 제공할 수 있는 복합체를 만든다. 또 다른 화학적 방법은 특이적 리간드를 세포 표면 수용체와 결합시키고 외피를 형성시키며 세포막을 가로질러 수송하는 것을 포함하는, 수용체-기초의 엔도사이토시스를 이용한다. 리간드는 DNA와 결합하고 완전한 복합체가 세포 내로 수송된다. 리간드 유전자 복합체가 혈류 내로 주사된 다음, 수용체를 갖는 표적 세포는 리간드를 특이적으로 결합하여 리간드-DNA 복합체를 세포 내로 수송할 것이다.

많은 유전자 치료 방법은 유전자를 세포 내로 삽입시키기 위하여 바이러스성 벡터를 이용한다. 예를 들면, 변형된 레트로바이러스 벡터는 유전자를 말초 및 종양-침윤성 림프구, 간세포, 상피 세포, 근세포 또는 기타 체세포 내로 도입하기 위하여 생체외 방법에서 사용되어 왔다. 그 다음에, 이와 같이 변형된 세포는 삽입된 DNA로부터 유전자 생성물을 제공하기 위하여 환자에게 도입된다.

바이러스성 벡터는 생체내 프로토콜을 이용하여 유전자를 세포 내로 삽입시키는데 이용되기도 하였다. 외래 유전자의 조직-특이적 발현을 지시하기 위하여, 조직-특이적인 것으로 공지되어 있는 시스-작용 조절 요소가 사용될 수 있다. 대안적으로는, 이는 DNA 또는 바이러스성 벡터를 생체내에서 특이적인 해부학적 부위에 원위치 전달함으로써 달성될 수 있다. 예를 들면, 생체내에서 혈관으로의 유전자 전이는 시험관내 형질도입된 내피 세포를 동맥 벽 상의 선택된 부위에 이식시킴으로써 달성되었다. 바이러스는 상기 유전자 생성물을 발현시키는 주변 세포를 감염시켰다. 바이러스성 벡터는, 예를 들면 카테터에 의해 생체내 부위에 직접적으로 전달될 수 있고, 이로써 단지 특정 영역만이 바이러스에 의해 감염되도록 하며, 장기간 부위 특이적 유전자 발현을 제공한다. 또한, 레트로바이러스 벡터를 이용한 생체내 유전자 전이는, 변형된 바이러스를 기관과 통하는 혈관 내로 주입함으로써 포유동물 조직과 간 조직에서 입증되어 왔다.

유전자 치료 프로토콜에 사용되어 온 바이러성 벡터는 레트로바이러스; 폴리오바이러스 또는 신드비스 바이러스와 같은 기타 RNA 바이러스; 아데노바이러스; 아데노-관련 바이러스; 헤르페스 바이러스; SV 40; 백시니아 및 기타 DNA 바이러스를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 복제-결함성 쥐의 레트로바이러스성 벡터가 가장 광범위하게 이용되고 있는 유전자 전이 벡터이다. 쥐의 백혈병 레트로바이러스는 핵 코어 단백질 및 폴리머라제(pol)효소와 복합체를 형성하고, 단백질 코어(gag)에 의해 싸여져 있으며, 숙주 범위를 결정하는 당단백질 외막(env)으로 둘러 싸여 있는 단일 가닥 RNA로 구성된다. 레트로바이러스의 게놈 구조는 5' 및 3' 장 말단 반복물(LTR)로 둘러 싸여진 gag, pol 및 env 유전자를 포함한다. 레트로바이러스성 벡터 시스템은, 바이러스성 구조 단백질이 패키징 세포주에서 트랜스로 제공되는 경우, 5' 및 3' LTRs 및 패키징 시그날을 함유하는 최소 벡터가 벡터를 패키징, 감염 및 표적 세포 내로의 통합하도록 하는데 충분하다는 사실을 활용하고 있다. 유전자 전이를 위한 레트로바이러스성 벡터의 기본적인 이점은 대부분의 세포 유형에서의 효과적인 감염 및 유전자 발현, 표적 세포 염색체성 DNA로의 정확한 단일 복사 벡터 통합, 및 레트로바이러스성 게놈의 조작 용이성을 포함한다.

아데노바이러스는, 코어 단백질과 복합체를 형성하고 캡시드 단백질로 둘어 싸여 있는 선형의 이중 가닥 DNA로 구성된다. 분자 바이러스학의 진보로 인해, 신규한 유전자 서열을 생체내에서 표적 세포 내로 형질도입할 수 있는 벡터를 생성시키는 이러한 생물의 생태를 활용할 수 있게 되었다. 아데노바이러스성 벡터는 유전자 생성물 단백질을 고도로 발현할 것이다. 아데노바이러스성 벡터는 바이러스 역가가 낮은 경우일지라도, 높은 감염 효율을 나타낸다. 추가적으로, 바이러스는 생산자 세포주의 주입이 필요하지 않을 정도의 세포 무함유 비리온으로서 완전히 감염성이다. 아데노바이러스성 벡터에 대한 또 다른 잠재적인 이점은 이종 유전자를 생체내에서 장기간 발현시킬 수 있는 능력이다.

DNA 전달의 기계적 방법에는 리포좀과 같은 퓨소제닉 지질 소포 또는 막 융합용 기타 소포, 리포펙틴과 같은 양이온성 지질을 혼입시키는 DNA의 지질 입자, DNA의 폴리라이신-매개의 전이, 생식 세포 또는 체세포 내로의 DNA의 미소주입과 같은 DNA의 직접적인 주입, "유전자 총"에서 사용된 골드 입자와 같이 공기식으로 운반된 DNA-피복된 입자, 인산칼슘 형질감염과 같은 무기 화학적 접근이 포함된다. 입자-매개의 유전자 전이 방법이 식물 조직을 형질전환시키는데 최초로 사용되었다. 입자 충격 장치 또는 "유전자 총"이 있어서는, 원동력이 발생되어 DNA-피복된 고밀도 입자(골드 또는 텅스텐과 같은)를 표적 기관, 조직 또는 세포의 침투를 허용하는 고속으로 가속화시킨다. 입자 충격은 DNA를 세포, 조직 또는 기관 내로 도입하기 위하여 시험관내 시스템에서, 또는 생체외 또는 생체내 기술과 함께 사용될 수 있다. 또 다른 방법인 리간드-매개의 유전자 치료는 리간드-DNA 접합체를 형성시켜 DNA가 특이적 세포 또는 조직으로 향하도록 하기 위하여 DNA를 특정한 리간드와 복합체를 형성시키는 것을 포함한다.

플라스미드 DNA를 근육 세포 내로 주입하면, 형질감염되고 마커 유전자를 지속적으로 발현시키는 세포가 높은 백분율로 생성된다는 사실이 밝혀졌다. 플라스미드의 DNA는 세포의 게놈 내로 통합되거나 통합되지 않을 수 있다. 형질감염된 DNA의 비통합은 세포 또는 미토콘드리아 게놈에서 돌연변이성 삽입, 결실 또는 변형의 우려 없이 장기간 동안 말단 분화된 비증식성 조직에서 형질감염 및 유전자 생성물 단백질의 발현을 허용한다. 반드시 영구적이지는 않은 장기간 동안, 치료 유전자를 특정 세포내로 전이시키면, 유전적 질환에 대한 치료 또는 예방적 치료를 제공할 수 있다. DNA는 수용자 세포의 게놈에서 돌연변이 발생 없이 유전자 생성물을 수준을 유지시키기 위하여 주기적으로 재주입될 수 있다. 외인성 DNA의 비통합은 각종 유전자 생성물을 발현하는 작제물 모두를 포함하는 하나의 세포 내에 몇몇 상이한 외인성 DNA 작제물의 존재를 허용할 수 있다.

유전자 전이를 위한 전기천공은 세포 또는 조직을 전기천공-매개의 유전자 전이에 감수성을 갖도록 하기 위하여 전류를 이용한다. DNA 분자가 세포 내로 침투될 수 있는 방식으로 막의 투과성을 증가시키기 위하여 소정의 전기장 강도를 가진 간단한 전기 임펄스가 사용된다. 이러한 기술은 DNA를 세포, 조직 또는 기관 내로 도입하기 위하여 시험관내 시스템에서 사용되거나 생체외 또는 생체내 기술과 함께 사용될 수 있다.

생체내 담체 매개의 유전자 전이는 외래 유전자를 세포 내로 형질감염시키기 위하여 사용될 수 있다. 담체-DNA 복합체는 편리하게는 체액 또는 혈류 내로 도입되어 체내의 표적 기관 또는 조직에 부위-특이적으로 들어갈 수 있다. 폴리라이신, 리포펙틴 또는 사이토펙틴과 같은 리포좀 및 폴리양이온 모두가 사용될 수 있다. 세포 특이적이거나 기관 특이적인 리포좀이 개발될 수 있으므로, 그 리포좀에 의해 운반된 외래 DNA는 표적 세포로 들어가게 될 것이다. 특정 세포 상의 특이적 수용체를 표적으로 하는 면역리포좀의 주입은 DNA를 수용체 보유 세포 내로 삽입하는 편리한 방법으로서 이용될 수 있다. 사용되어 온 또 다른 담체 시스템은 DNA를 생체내 유전자 전이를 위해 간세포에 운반하기 위한 아시알로당단백질/폴리라이신 접합체 시스템이다.

형질감염된 DNA는, 그 DNA가 수용자 세포에 운반된 다음 세포질 또는 핵질에서 잔류하도록 기타 종류의 담체와 복합체를 형성할 수 있다. DNA는 특이적으로 엔지니어링된 소포 복합체 중의 담체 핵 단백질과 커플링되어 핵에 적접적으로 운반될 수 있다.

레스틴의 유전자 조절은 레스틴 유전자와 결합되거나, 또는 레스틴 유전자 또는 이의 상응하는 RNA 전사체와 연관된 영역을 제어하여 전사 또는 해독 속도를 변형시키는 화합물을 투여함으로써 달성할 수 있다. 추가적으로, 레스틴을 엔코딩하는 DNA 서열로 형질감염된 세포는 레스틴의 생체내 공급원을 제공하기 위하여 환자에 투여될 수 있다. 예를 들면, 세포는 레스틴을 엔코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질감염될 수 있다. 형질감염된 세포는 환자의 정상 조직, 환자의 병든 조직으로부터 유도된 세포일 수 있거나, 또는 환자 유래의 세포가 아닐 수 있다.

예를 들면, 환자로부터 제거된 종양 세포는 본 발명의 레스틴 단백질을 발현시킬 수 있는 벡터로 형질감염된 다음, 상기 환자에 재도입될 수 있다. 형질감염된 종양 세포는 환자에서 종양의 성장을 억제시키는 수준으로 레스틴을 생성한다. 환자는 사람이거나 사람이 아닌 동물일 수 있다. 세포는 비-벡터에 의해, 또는 전기천공, 이온천공 또는 "유전자 총"과 같이 당해 분야에서 공지된 물리적 또는 화학적 방법에 의해 형질감염될 수 있다. 추가적으로, 레스틴 DNA는 담체의 도움없이 환자에게 직접적으로 주입될 수 있다. 특히, 레스틴 DNA는 피부, 근육 또는 혈액에 주입될 수 있다.

레스틴을 환자에게 형질감염시키기 위한 유전자 치료 프로토콜은 레스틴 DNA를 세포의 게놈, 미니염색체 내로 철저히 통합하거나, 또는 세포의 세포질 또는 핵질에서 별개의 복제성 또는 비복제성 DNA로서 철저히 통합하는 것일 수 있다. 레스틴 발현은, 세포, 조직 또는 기관 중에서 레스틴 단백질의 필요한 수치 또는 예정된 혈중 수치를 유지하기 위하여 장기간 지속될 수 있거나 주기적으로 재주입될 수 있다.

또한, 본 발명은 신규한 항혈관형성 단백질을 시험하는데 사용될 수 있고, 혈관형성 활성이나 이의 결여를 특징으로 하거나 이와 관련된 질환 및 질병을 진단, 예후 또는 치료하는데 사용될 수도 있는 항체 및 항혈청을 포함한다. 이러한 항체 및 항혈청은 필요에 따라, 예를 들면 경색-후 심장 조직에서 혈관형성을 상향 조절하는데 사용될 수도 있고, 레스틴 단백질에 대한 항체 또는 항혈청은 국재화된 본래의 항혈관형성 단백질 및 프로세스를 차단하여 새로운 혈관 형성을 증가시키며 심장 조직의 위축을 억제시키기 위하여 사용될 수 있다. 또한, 레스틴 및 아포미그렌은 아포프토시스를 유도하기 위하여 사용될 수 있고, 또는 그의 항체는 세포 또는 조직에서 아포프토시스를 방지하기 위하여 사용될 수 있다. 아포프토시스에 대한 검정은 Vikas P. Sukhatme에 의하여 1998년 12월 8일 출원된 미국 특허원 제 XX/XXX,XXX호의 "항혈관형성 펩티드 및 그의 사용 방법" 및 Dhanabal et al.(1998)("엔도스타틴은 내피 세포 아포프토시스를 유도한다", J. Biol. Chem.,제출됨) 에서 제공된다.

이러한 항체 및 항혈청은 진단, 예후 또는 치료용 조성물을 형성하기 위하여 약제학적으로 허용되는 조성물 및 담체와 조합될 수 있다. 용어 "항체" 또는 "항체 분자"는 면역글로불린 분자 집단 및/또는 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분, 즉 항체 결합 부위 또는 파라토프(paratope)를 함유하는 분자를 지칭한다.

레스틴을 특이적으로 결합시키는 항체를 이용하는 수동적 항체 치료법은 재생, 발육, 및 상처 치유 및 조직 복구와 같은 혈관형성-의존적인 과정을 조절하기 위하여 사용될 수 있다. 또한, 레스틴 항체의 Fab 영역으로 지시된 항혈청은 레스틴을 결합하는 내인성 레스틴 항혈청의 능력을 차단시키기 위하여 사용될 수 있다.

본 발명의 레스틴은 저해제 및 그의 수용체에 특이적인 항체를 생성시키기 위하여 사용될 수도 있다. 이러한 항체는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 레스틴 또는 레스틴 수용체와 특이적으로 결합되는 이들 항체는 체액 또는 조직 중에서의 레스틴 또는 레스틴 수용체를 탐지하거나 정량화하기 위하여 당업자에게 널리 공지된 진단 방법과 키트에서 사용될 수 있다. 이들 시험 결과는 암 및 기타 혈관형성 매개 질환의 발생 또는 재발을 진단하거나 예견하기 위하여 사용될 수 있다.

본 발명은 혈관형성 활성을 특징으로 하는 질환을 진단하거나 예후하는데 있어서, 레스틴, 레스틴의 항체, 및 레스틴 및/또는 그의 항체를 포함하는 조성물의 용도도 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "예후 방법"은 질환, 특히 혈관형성 의존적 질환이 있는 것으로 진단된 사람 또는 동물에서 질환의 진행 상태를 예견할 수 있게 해주는 방법을 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "진단 방법"은 사람 또는 동물에서 혈관형성 의존적 질환의 존재 여부 또는 유형을 결정할 수 있게 해주는 방법을 의미한다.

레스틴은 레스틴을 결합할 수 있는 항체를 탐지하고 정량화하기 위한 진단 방법과 키트에서 사용될 수 있다. 이들 키트는 원위치에서 원발성 종양에 의해 분비된 레스틴의 존재하에서 미소전이물의 확산을 나타내는 순환성 레스틴 항체의 탐지를 허용한다. 이러한 순환성 항-레스틴 항체를 가진 환자는 다발성 종양 및 암이 더 잘 진행될 수 있으며, 치료 후 또는 관해 기간에 암이 더 잘 재발할 수 있다. 이들 항-레스틴 항체의 Fab 단편은 항-레스틴 항체를 중화시키는데 사용될 수 있는 항-레스틴 Fab-단편 항혈청을 생성하기 위하여 항원으로서 사용될 수 있다. 이러한 방법은 항-레스틴 항체에 의한 순환성 레스틴의 제거를 저하시킴으로써, 순환성 레스틴 수치를 효과적으로 상승시킬 것이다.

본 발명은 레스틴에 특이적인 수용체의 분리도 포함한다. 조직에 대한 고친화성 결합을 보유하는 단백질 단편은 친화성 컬럼 상에서 레스틴 수용체를 분리하기 위하여 사용될 수 있다. 레스틴 수용체의 분리 및 정제는 레스틴의 작용 기전을 밝혀내기 위한 기본적인 단계이다. 레스틴 수용체의 분리 및 레스틴 효능제 및 길항제의 동정으로, 생물학적 활성에 대한 최종 경로인 레스틴 수용체의 활성을 조절하기 위한 약물의 개발이 촉진될 것이다. 이러한 수용체를 분리는 원위치 및 용액 하이브리드화 기술을 사용하여 수용체의 위치 및 합성을 모니터하기 위한 누클레오티드 프로브의 작제를 가능하게 한다. 또한, 레스틴 수용체에 대한 유전자는, 레스틴과 결합하고 국소적 혈관형성을 억제시키는 세포 유형, 조직 또는 종양의 능력을 증가시키기 위하여, 분리되어 발현 벡터 내로 혼입되며, 환자의 종양 세포와 같은 세포 내로 형질감염될 수 있다.

레스틴 단백질은 배양된 종양 세포로부터 레스틴 수용체를 분리하기 위한 친화성 컬럼을 개발하기 위하여 사용될 수 있다. 레스틴 수용체의 분리 및 정제후 아미노산 서열화를 수행한다. 이러한 정보를 이용하여, 레스틴 수용체를 코딩하는 유전자가 동정 및 분리될 수 있다. 그 다음에, 클로닝된 핵산 서열이, 수용체를 발현할 수 있는 벡터 내로 삽입하기 위해 개발된다. 이들 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 레스틴 수용체를 코딩하는 핵산 서열을 종양 세포 내로 형질감염시키고, 형질감염된 종양 세포에 의해 수용체를 발현시키면, 내인성 또는 외인성 레스틴에 대한 이들 세포의 반응성이 향상되어 전이성 성장율이 감소된다.

본 발명의 혈관형성 억제성 단백질은 표준 미량화학 기술로 합성되어 HPLC 및 질량 분광법으로 순도가 검사될 수 있다. 단백질 합성법, HPLC 정제법 및 질량 분광법은 당업자에게 통상적으로 공지되어 있다. 레스틴 단백질 및 레스틴 수용체 단백질은 재조합 이. 콜라이(E. coli) 또는 효모 발현 시스템에서 생성되고, 컬럼 크로마토그래피로 정제된다.

완전한 레스틴 분자의 상이한 단백질 단편은 하기를 포함하나 이에 한정되지 않는 몇가지 용도를 위하여 합성될 수 있다; 특이적 항혈청 개발용 항원으로서, 레스틴 결합 부위에서 활성인 효능제 및 길항제로서, 레스틴과 결합하는 세포를 표적하여 사멸하기 위한 세포독성제와 연결되거나 이와 조합하여 사용되는 단백질로서 의 용도. 이들 단백질을 포함하는 아미노산 서열은 분자의 외부 영역 상에서의 이들의 위치를 기준으로 하여 선별되며, 항혈청에 대한 결합이 용이하다. 레스틴의 아미노 및 카르복시 말단 뿐만 아니라 상기 분자의 중간 영역은 합성하고자 하는 단편들 중에서 별개로 제시된다.

레스틴의 합성 단백질 단편은 다양한 용도를 가진다. 레스틴 수용체와 매우 특이적으로 탐욕스럽게 결합하는 단백질은 방사선표지되어, 오토라디오그라피 및 막 결합 기술을 이용한 결합 부위의 가시화 및 정량을 위해 사용한다. 본 출원은 중요한 진단 및 조사 도구를 제공한다. 레스틴 수용체의 결합 성질에 관한 지식은 상기 수용체와 연결된 형질도입 기전에 관한 연구를 촉진시킨다.

표준 방법을 사용하여, 레스틴 및 레스틴 유래의 단백질은 다른 분자에 커플링될 수 있다. 레스틴의 아미노 말단 및 카르복시 말단 모두는 티로신과 라이신 잔기를 포함하며, 많은 기술, 예를 들면 통상적인 기술을 이용한 방사선표지화(티로신 잔기-클로라민 T, 요오도겐, 락토퍼옥시다제; 라이신 잔기-볼튼-헌터(Bolton-Hunter)시약)를 사용하여, 동위원소 및 비동위원소로 표지화된다. 이들 커플링 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 대안적으로는, 티로신 또는 라이신은 이들 잔기를 갖지 않는 단편에 첨가되어 단백질중의 반응성 아미노기 및 히드록시기의 표지화를 촉진시킨다. 커플링 기술은 아미노, 설프히드릴, 카르복시, 아미드, 페놀 및 이미다졸을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 아미노산중에 이용가능한 작용기를 기준으로 하여 선택된다. 이들 커플링을 수행하는데 사용된 각종 시약으로는 글루타르알데히드, 디아조화 벤지딘, 카보디이미드 및 p-벤조퀴논이 있다.

레스틴 단백질은 동위원소, 효소, 담체 단백질, 세포독성제, 형광성 분자, 화학발광체, 생물학적 발광체 및 각종 용도용 기타 화합물에 화학적으로 커플링된다. 커플링 반응의 효율은 특이적 반응에 적당한 상이한 기술을 이용하여 결정된다. 예를 들면,¹²⁵I를 사용한 레스틴 단백질의 방사선표지화는 특이적 활성이 높은 클로라민 T 및 Na¹²⁵I를 사용하여 수행된다. 반응은 나트륨 메타바이설파이트를 사용하여 종결되고, 혼합물은 1회용 컬럼 상에서 탈염된다. 표지된 단백질은 컬럼으로부터 용리되어 분획이 수집된다. 각 분획으로부터 분취량이 제거되고 방사능이 감마 계수기로 측정된다. 이러한 방식으로, 미반응의 Na¹²⁵I이 표지된 단백질로부터 분리된다. 가장 높은 특이적 방사능을 가진 단백질 분획은 레스틴 항혈청과 결합하는 능력의 분석과 같은 후속되는 용도를 위해 저장된다.

또한, 수명이 짧은 동위원소를 사용한 레스틴 단백질의 표지화는 레스틴 결합 부위를 갖는 종양의 위치를 찾기 위하여 양전자 방출 단층촬영법 또는 기타 현대식 라디오그라피 기술을 사용한 생체내 수용체 결합 부위의 가시화를 가능케 한다.

이들 합성된 단백질 내에서의 아미노산의 계통적 치환은 수용체에 대한 레스틴 결합을 증진시키거나 감소시키는, 레스틴 수용체에 대한 고친화성 단백질 효능제 및 길항제를 생성시킨다. 이러한 효능제는 미소전이물의 성장을 억제시킴으로써, 암의 확산을 제한하기 위하여 사용될 수 있다. 레스틴에 대한 길항제는 레스틴의 억제 효과를 차단시키고 혈관형성을 증진시키기 위하여, 부적절한 혈관형성 의 경우에 적용된다. 예를 들면, 이러한 처리는 당뇨병 환자의 상처 치유를 증진시키는 치료 효과를 가질 수 있다.

본 발명의 레스틴 단백질은 영양원 또는 영양 보충물로서 사용될 수도 있다. 이러한 용도에는 단백질 또는 아미노산 보충물로서의 용도, 탄소원으로서의 용도, 질소원으로서의 용도 및 탄수화물 공급원으로서의 용도가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 이러한 경우, 본 발명의 레스틴 단백질은 특정한 생물의 식품에 첨가될 수 있거나, 또는 산제, 환제, 액제, 현탁제 또는 캅셀제의 형태와 같이, 별개의 고형 또는 액상 제제로서 투여될 수 있다. 미생물의 경우, 본 발명의 단백질 또는 폴리누클레오티드는 미생물이 배양되는 배지에 첨가될 수 있다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 예시되지만, 이는 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하여 해석되는 것을 의미하지 않는다. 반대로, 본원의 명세서의 판독 후, 당업자 스스로가 본 발명의 요지 및/또는 첨부된 청구의 범위를 벗어나지 않고 제안할 수 있는 각종의 기타 구현예, 변형 및 이의 균등물에 대하여 방책이 있을 수 있다는 것을 명백히 인지해야 한다.

실시예 1: 세포 및 세포주

ATCC(American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, 20110-2209, USA)로부터 입수한 C-PAE(소의 폐동맥 내피, ATCC No. CCL-209)세포를, 10% 태아 소 혈청, 100U/ml의 페니실린, 100㎍/ml의 스트렙토마이신, 및 2mM L-글루타민을 함유한 DMEM 배지에서 유지시켰다. 상기 세포를 5% 이산화탄소 존재 하에서, 37℃의 가습된 환경에서 배양하였다. IMR-90, 폐 섬유아세포 및 IC-21, 마크로파지 전구 세포를 ATCC로부터 구입하였고, C-PAE 세포와 유사한 조건 하에서 유지시켰다. HMVE-L 세포(폐 유래의 인간 미소혈관 내피 세포, Clonetics, San Diego, California, USA)를 EGM-2MV 배지에서 유지시켰다.

실시예 2: 레스틴의 분리

하기 CDNA 라이브러리를 DNA-PCR을 위한 주형으로서 사용하였다.

K562 - 에르티로이드 라이브러리

JMN - 인간 메소티올리오마

HFK - 인간 태아 신장 라이브러리

786-0 - 인간 신장 세포 암

MAB - 인간 성인 뇌

293 - 대조

XV형 콜라겐 NC10 도메인의 N-말단 부분에 대응하는 프라이머를 GIBCO-BRL(Life Technologies, Gaithersburg, Maryland, USA)로부터 합성하였다. 사용된 프라이머는 5'-TTT TTT GAA TTC ATT TCA AGT GCC AAT TAT GAG AAG CCT GCT CTG CAT TTG-3'(상류 프라이머) 및 5'-AAG AAT GCG GCC GCT TAC TTC CTA GCG TCT GTC ATG AAA CTG TTT TCG AT-3'(하류 프라이머)이었다.

표준 프로토콜을 사용하여 증폭을 수행하였다. 간단하게, 각 cDNA 라이브러리로부터 100ng의 DNA를 주형으로 사용하였다. 하기 파라미터를 가지고 30 주기 동안 증폭을 수행하였다: 각각 1분 동안, 변성용으로 94℃, 어닐링용으로는 60℃, 및 신장용으로는 72℃.

본원에서 "레스틴"으로 명명된, 540bp 증폭된 단편을 정제하고, EcoRI 및 NotI로 소화시켰다. XV형 콜라겐을 피치아(Pichia) 발현 벡터(pPICZαA, InVitrogen, San Diego, California, USA)내에 클로닝한 것을 도 5에 개략적으로 도시하였다. pPICZαA 벡터도 상기 제한 효소로 소화시켜 레스틴 단편과 연결하였다. 초기의 형질전환을 숙주 균주 Top 10F' (InVitrogen, San Diego, California, USA)를 가지고 수행하였다. 변형을 확인하기 위하여 pPICZαA-CXV로 지칭되는 양성 클론을 서열화하였다. 그 다음에, 플라스미드를 SacI 효소로 선형화하고, 염화 리튬 형질전환을 통하여 효모 숙주 균주 GS 115(InVitrogen, San Diego, California, USA)에 상동성 재조합하는데 사용하였다. 상기 재조합은 피치아(Pichia) 발현 매뉴얼에 기술된 대로 수행하였다. 콜로니를 YPD/제오신 판에서 30℃에서 2일간 성장시켰다. 제오신 위에서 성장한 클론을 소규모 유도용으로 선택하였다. 유도 과정은 제조업체(InVitrogen, San Diego, California, USA)가 제시한 대로 수행하였다. 레스틴을 K592 및 HFK 라이브러리로부터 성공적으로 유도하였다. HFK 클론을 이후의 모든 조사용으로 사용하였다.

실시예 3: 피치아(Pichia) 발현 시스템에서 레스틴의 발현

단일 콜로니를 YPD/제오신으로부터 500ml 격벽 플라스크 안의 25ml BMGY/Zeo(100㎍/ml)에 접종시켰다. 배양이 OD600 2 내지 6에 도달할 때까지 교반 하는 인큐베이터(250rpm)중에서 30℃로 배양물을 성장시켰다. 1ℓ 배양물을 접종하기 위하여 로그 상의 성장 상태인 세포를 1:100으로 희석하여 사용하였다. 500ml의 BMGY 배지를 첨가하였고, 세포를 2ℓ 격벽 플라스크에서 성장시켰으며, 배양은 OP600 15 내지 20에 도달하였다. 상기 세포를 실온에서 10분간 5000rpm으로 원심분리하여 수득하였다. 상등액을 따라내고, 재조합 단백질의 발현을 유도하기 위하여 세포 펠렛을 300 내지 400ml의 BMMY 배지에 재현탁시켰다. 유도를 유지하기 위하여, 100% 메탄올을 24시간 마다 최종 농도 0.5%로 첨가시켰다. 상등액을 유도 2일, 3일, 및 4일째에 수집하였고, 쿠우마시(Coomassie) 염색된 SDS-PAGE에 의하여 단백질 발현에 대하여 분석하였다.

실시예 4: 헤파린-세파로즈 컬럼을 이용한 레스틴의 정제

상등액을 60 내지 70%의 황산 암모늄으로 침전하여 농축하였다. 침전된 단백질을 10분간 10,000rpm에서 원심분리하였고, 펠렛은 인산 완충 식염수에 재분산시켜, 4℃에서 하룻밤 동안 투석하였다. 10mM Tris 및 50mM NaCl, pH 7.4로 최종 투석을 시행하였다. 폴리프레프 컬럼을 5ml 헤파린-세파로즈 수지(Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, New Jersey, USA)로 패킹하였고, 10mM Tris, 50mM NaCl, pH 7.4로 평형화하였다. 농축된 조단백질 샘플을 20 내지 30ml 배치로 컬럼에 10 내지 15ml/hour의 유속으로 로딩하였다. 컬럼을 280㎚에서의 흡광도가 0.001을 초과할 때까지 평형 완충제로 세척하였다. 결합 단백질의 용리를 계단식 농도구배의 NaCl(0.2M, 0.6M 및 1.0M)에 의해 수행하였다. 용리 프로필은 어떠한 명확한 단백질 피이크도 나타내지 못했고, 샘플을 SDS-PAGE에 의해 분석하였을 때, 대부분의 단백질은 컬럼에 결합하지 않았다. 염화나트륨의 농도의 감소 및 pH의 변화는 결합 프로필을 변화시키지 않았다. 재조합 단백질은 헤파린 컬럼에 결합하지 않았다.

실시예 5: His. 태그 레스틴 재조합 단백질의 구조

아미노 말단에서 레스틴 분자에 대한 His. 태그 모티브는 정제를 단순화한다. 2개의 상보적인 올리고누클레오티드 프라이머인 5'-AAT TCC ATC ACC ATC ACC ATC ACG-3'(상류), 및 5'-AAT TCG TGA TGG TGA TGG TGA TGG-3'(하류)를 합성하였다. 이러한 프라이머는 EcoRI 제한효소 부위의 측면에 있는 히스티딘 잔기를 코딩한다(6개 히스티딘 잔기를 한번에). pPICZαA-CXV 구조를 EcoRI로 소화시켰다. 각 프라이머 50㎕(100μM)를 혼합하였고, 95℃에서 5분간 변성시켰으며, 얼음으로 즉시 냉각시켰다. 어닐링된 프라이머를 16℃에서 하룻밤 동안 EcoRI로 소화된 벡터 골격에 연결시켰다. 리가제를 70℃에서 10분간 가열-불활성화시켰고, 과량의 프라이머를 Glass Max 정제 컬럼(Gibco/BRL, Gaithersburg, Maryland, USA)을 사용하여 제거하였다. 연결된 벡터를 숙주 균주 Top 10F'(InVitrogen, San Diego, California, USA)를 사용하여 형질전환시켰다. 재조합 클론을 PCR 및 제한 효소 분석에 의하여 스크리닝하였다. 또한, His. 태그 모티브의 존재를 서열화에 의하여 확인하였고, 그 작제물을 "pPICZαA/His.레스틴"이라고 명명하였다.

재조합 pPICZαA/His.레스틴을 SacI로 선형화하였고, 재조합을 균주 GS115 (InVitrogen, San Diego, California, USA)를 사용하여 수행하였다.

실시예 6: 아포미그렌의 마우스 및 인간 엔도스타틴의 C-말단과의 상동성

엔도스타틴과 상동성을 나타내는 서열에 대한 GenBank를 조사하였다. 이러한 서열의 하나가 사람의 XV형 콜라겐의 C-말단 영역이었다. 도 9는 사슬 전부와 관련하여 XV형 콜라겐의 완전한 길이 α1 사슬의 C-말단 아미노산 85개를 나타낸다. 도 10은 사람의 XV형 콜라겐의 85개 최종 C-말단 아미노산과 인간 및 마우스 엔도스타틴간의 상동성을 나타낸다. 사람의 XV형 콜라겐의 이 영역을 본원에서 아포미그렌으로 명명하였다. 이러한 단백질들의 C-말단 아미노산 간에는 60%의 아미노산 동일성이 존재한다. 보존적인 치환을 고려할 때에는, 이 영역은 약 75%의 아미노산 동일성을 공유한다.

실시예 7: 인간 아포미그렌의 클로닝, 발현, 및 정제

사람의 XV형 콜라겐의 C-말단의 85개 아미노산(255bp)를 엔코딩하는 서열을 Vent DNA 폴리머라제를 사용하여, 주형으로 부분적인 NC10 도메인(555bp)을 포함하는 pPICZαA-CXV 벡터에서 증폭하였다. 하기 프라이머를 가지고 각각 1분간 94℃에서 변성, 60℃에서 어닐링 및 72℃에서 신장을 30주기 수행하여 증폭하였다: 5'-TTC CAT ATG ATA TAC TCC TTT GAT GGT CGA GAC ATA ATG ACA-3' 및 5'-AAG AAT GCG GCC GCT TAC TTC CTA GCG TCT GTC ATG AAA CTG TTT TC GAT-3'. 본원에서 "아포미그렌"으로 명명된 MGSSHHHHHHSSGLVPAGSHM-아포미그렌의 예상 단백질 서열을 제공하기 위하여, 증폭된 DNA(255bp)를 QIA 정제 키트(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 정제하였고, NdeI 및 NotI으로 소화시켰으며(이 부위는 상기 프라이머에 밑줄로 표시하였다), NdeI 및 NotI으로 미리 소화시킨 pET28(a) 발현 벡터(Novagen, Madison, Wisconsin, USA)에 연결시켰다(도 10). 아포미그렌이 엔도스타틴처럼 헤파린과 결합할 것이라는 보장이 없었기 때문에 정제 과정에서 보조하기 위하여 히스티딘 태그를 발현 벡터로부터 사용하였다. 이들 모두의 전문이 본원에서 참고문헌으로 삽입된, Dhanabal 등(1999)에 의해 기술되고("인간 엔도스타틴의 클로닝, 발현, 및 시험관내 활성", Cancer research 출판), Vikas P. Sukhatme에 의해 1998년 12월 8일 출원된 미국 특허원 제 XX/XXX,XXX호 "항혈관형성 단백질의 제조 방법"에서도 기술된 바에 따라, 재조합 아포미그렌의 발현, 프로세싱 및 정제를 8M의 요소의 존재 하에서 Ni-NTA 컬럼을 사용하여 수행하였다. 컬럼으로부터 단백질을 용리하기 위하여 2단계 pH 프로토콜(pH 8.0 및 2.0)을 사용하였고, 그 결과를 각 분획(x축)에 대한 용리 pH(왼쪽 y축) 및 280nM에서의 흡광도(오른쪽 y축)를 나타내는 그래프인 도 11에 나타내었다. 분획 (4) 부근에서 작은 피이크를 관찰하였고, 분획 (23)에서 큰 피이크를 관찰하였다. 선택한 분획에서 15ml의 샘플을 취하여, SDS-PAGE에 의해 분석하였고, 그 결과를 도 12에 나타내었다. 레인 (1)은 크기 마커, 레인 (2)는 Ni-NTA 컬럼에 로딩하기 전의 아포미그렌 단백질 여액; 레인 (2)는 컬럼으로부터 유동관통; 레인 (4)는 분획 (4); 레인 (5) 및 (6)은 각각 비환원 및 환원 분획 (23); 레인 (7)은 분획 (24); 레인 (8)은 분획 (27)을 포함한다. 유동-관통 분획에는 단백질이 없었고, 이는 아포미그렌이 Ni-NTA 컬럼에 단단히 결합되었음을 암시한다. 약간량의 단백질이 pH 8.0 세척액에 용리되었으나(레인 (4), 분획 (4)), 단백질의 대부분은 pH 2.0의 스트립 용액에서 용리된다(레인 (5) 내지 (8)). 23, 35, 46, 및 69kDa에 대응하는, 분자량이 보다 더 높은 복합체가 나타난다. 레인 (5) 및 (6)은 분획 (23)의 비환원 및 환원 샘플이고, 14kDa의 단일의 분리된 밴드를 환원 샘플에서 관찰하였다. DTT로 환원하는 조건에서는, 보다 더 높은 복합체는 모두 14kDa크기의 단일 밴드로 전환된다. 대부분의 단백질은 분획 (20) 내지 (26)에서 발견되었다.

정제된 아포미그렌(분획 (20) 내지 (26))을 풀링하였고, 요소 농도를 감소시키면서 계단식 투석을 사용하여 서서히 리폴딩시켰다. pH 7.4, 4℃에서, 멸균된 1XPBS에 대하여 최종 투석을 시행하였다. 투석 중에, 약간의 단백질이 용액으로부터 침전하였으나, 상당한 분획이 가용성 형태로 남아 있었다. 가용성 단백질을 소량 분취하여 -70℃에서 저장하였고, 새로운 분취량을 각 검정에 사용하였다. 단백질의 농도를 BCA 단백질 검정(Puerce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA)에 의해 측정하였다. 정제된 가용성 단백질에 대한 엔도톡신 수치를 LAL 검정을 수행함으로써 측정하였고(Associate of Cape Cod, Inc., Falmouth, Massachusetts, USA), 그 수치는 200㎍/ml의 단백질 농도에 있어서, 약 6단위/ml이었다. 이전의 실험에서는, 이러한 수치는 사용된 어떠한 검정에 대해서도 가시적인 영향을 주지않았다. 히스티딘 태그 항체로 정제된 단백질에 대하여 웨스턴 블롯 분석을 시행하였고, 그 결과 양성 면역반응성을 나타내었다.

실시예 8: 아포미그렌은 내피 세포의 형태를 변화시킨다

아포미그렌 단백질(0.5 내지 1.0㎍/ml)을 내피 세포에 첨가했을 때, 내피 세포의 형태에서 현격한 변화가 일어났다. 아포프토틱 세포에서 일반적으로 나타나는 바와 같이, 세포는 원형화되고, 분리된 것으로 나타났고, 막 수포형성, 세포질 수축, 및 염색질 농축이 관찰되었다. 이러한 변화를 3개 현미경 사진 한 셋트인 도 13에 나타내었다. 융합성 C-PAE 세포를 트립신처리하였고, 아포미그렌 0.05㎍/ml 및 0.7㎍/ml를 동시에 첨가한 3ng/ml bFGF를 포함하는 2% FBS에서 약 50% 컨플루언시로 평판배양하였다. 처리 24시간 후에, 사진을 촬영하였다(400배 배율). 아포미그렌의 농도를 증가시키면 아포프토틱 형태를 가진 세포의 수가 증가하는 것으로 나타났다. 도 13b 및 13c는 아포미그렌 처리 세포(각각 0.05mg/ml 및 0.07mg/ml)를 비처리한 대조 내피 세포(도 13a)와 비교하여 나타내었다. 이러한 변화는 IMR-90과 같은 비내피 세포에서는 관찰되지 않았다.

아포프토틱 형태는 마우스 엔도스타틴으로 처리한 동일한 내피 세포에서도 나타났지만, 5 내지 10배 높은 농도에서 나타났을 뿐이었다. 인간 엔도스타틴은 이 세포에 명백한 영향을 나타내지 않았다.

실시예 9: 내피 세포의 증식

아포미그렌의 C-PAE 세포에 대한 항증식 효과를 시험하기 위하여, 이들 모두의 전문이 본원에서 참고문헌으로 삽입된 Dhanabal 등(1999)에 의해 기술되고("인간 엔도스타틴의 클로닝, 발현, 및 시험관내 활성", Cancer research 출판), Vikas P. Sukhatme에 의해 1998년 12월 8일 출원된 미국 특허원 제 XX/XXX,XXX호 "항혈관형성 단백질의 제조 방법"에서도 기술된 바에 따라, 티미딘 혼입 검정을 수행하였다. 엔도스타틴에 있어서 이전의 데이터에 기초하여, 1 내지 20㎍/ml 농도 범위의 아포미그렌을 가지고 초기의 실험을 수행하였다. C-PAE 세포를 피브로넥틴 (10mg/ml)으로 코팅된 24-웰 플레이트에서 2% FBS를 포함하는 DMEM 0.5ml내에 웰 당 12,500개 세포로 평판배양하였다. 37℃에서 24시간 배양한 후, 배지를 새로운 DMEM 및 시험대상 단백질 함유 또는 비함유의 bFGF(R & D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA)3ng/ml를 포함하는 2% FBS로 교체하였다. 세포를 24 시간 동안 1 mCi의³H-티미딘으로 펄싱하였다. 배지를 흡인하였고, 세포를 PBS로 3회 세척한 다음, 1.5N NaOH(웰 당 100ml)를 첨가하여 가용화하였으며, 37℃에서 30분간 배양하였다. 세포 관련 방사능을 액체 신틸레이션 계수기로 측정하였다.

본 시험에서는, bFGF(3ng/ml 및 2% FBS) 및 세균으로부터 발현된 정제된 용해성 아포미그렌 단백질에 반응하는 메틸³H-티미딘 흡수의 저해를 C-PAE 세포에서 시험하였다. 결과를 도 14에 도시하였다. 아포미그렌(●), 및 마우스 엔도스타틴 (□) 및 인간 엔도스타틴(○)의 농도를 x축에 나타냈고,³H-티미딘 혼입을 y축에 나타내었다. 각 데이터의 점은 대표 실험으로부터 얻은 3개 수치의 평균이다. 대조 샘플(bFGF만을 함유)에서의 DNA 합성을 100%인 것으로 간주하였다. 특정한 농도에서 아포미그렌 및 마우스 엔도스타틴 및 인간 엔도스타틴간의 비교를 나타낸다. 일반적으로, C-PAE 세포에서 bFGF 유도성 증식의 용량의존적인 저해가 나타났다. 아포미그렌 1㎍/ml에서, C-PAE 세포의 증식을 기초 활성(즉, bFGF가 없는 경우) 미만으로 완전히 저해하였다. 보다 더 낮은 농도, 예컨대 0.05 내지 0.9㎍/ml의 아포미그렌은 용량의존적인 효과를 나타내어, 0.1㎍/ml는 300 내지 400ng/ml의 범위의 ED₅₀치를 나타냈다. 엔도스타틴에 대하여 미리 만든 데이터와 비교할 때, 아포미그렌의 활성은 확실히 우수하였다.

실시예 10: 세포 주기 검정

C-PAE 및 IMR-90 세포의 성장을 완전 배지에서 48 시간 동안 접촉 저해함으로써 저지하였다. 세포를 트립신처리에 의해 채취하였고, 피브로넥틴(10㎍/ml)로 코팅된 6개 웰의 플레이트에 접종하였다. 각 웰에 3ng/ml의 bFGF로 보충된 1% FCS에 0.2 내지 0.3×106 개의 세포를 접종하였다. 용량 반응성 시험을 위하여, 상이한 농도의 인간 아포미그렌을 첨가하였고, 처리 21 내지 24 시간 후에 세포를 채취하였다. 세포를 PBS 완충제로 세척하였고, 70% 얼음같이 찬 에탄올로 고정시켰다. 고정된 세포는 실온에서 30분간 2% FCS 및 0.1% Tween-20을 포함한 PBS 완충제에서 재수화시켰다. 그 다음에, 세포를 10분간 1500x g으로 원심분리하였고, RN아제(5㎍/ml)를 첨가한 상기 PBS 완충제 0.5ml에 재현탁시켰다. RN아제 소화를 37℃에서 1시간 수행한 후, 요오드화 프로피듐(5㎍/ml)으로 염색하였다. 세포를 Becton Dickinson FACStar plus 유동 세포계산기(Becton Dickinson, Waltham, Massachusetts, USA)를 사용하여 분석하였다. 세포 주기의 다른 기에서 세포의 백분율을 계산하기 위하여, ModFit 소프트웨어를 사용하였다. 이들 모두의 전문이 본원에서 참고문헌으로 삽입된, Dhanabal 등(1999)에 의해 기술되고("인간 엔도스타틴의 클로닝, 발현 및 시험관내 활성", Cancer research 출판), Vikas P. Sukhatme에 의해 1998년 12월 8일 출원된 미국 특허원 제 XX/XXX,XXX호 "항혈관형성 단백질의 제조 방법"에서도 기술된 바에 따라, 프로토콜을 일반적으로 수행하였다.

결과를 막대 그래프인 도 15에 나타내었다. x축은 0 내지 1000ng/ml 범위의 아포미그렌 농도를 나타내고, y축은 S-기에서 세포의 백분율을 나타낸다. C-PAE 세포를 흑색 막대로 표시하였고, IMR-90 세포를 흰색 막대로 표시하였다. bFGF 및 1% FBS 단독으로만 처리한 대조 세포를 100%로서 간주하였다. 접촉 저해된 세포는 S-기에서 7% 세포인 것으로 나타났다. 트립신처리 후에, 약 50% 컨플루언시로 평판배양하고, bFGF(3ng/ml) 및 1% FBS 로 자극시, 21시간 후에 S-기 세포의 4.8배 증가가 관찰되었다(도 15). 용량의존적인 G1 세포 주기 저지가 0.06 내지 1.0㎍/ml 농도 범위의 아포미그렌에 있어서 나타났고, ED₅₀이 약 500ng/ml이었다. 이 효과의 특이성을 검사하기 위하여, 아포미그렌을 IMR-90 섬유아세포에 대해서도 시험하였다. IMR-90 세포에 대하여 완전 배지(10% FBS)를 자극제로 사용하였다. 접촉 저해된 세포와 비교할 때, S-기 세포의 14배 증가가 관찰되었으나, 아포미그렌의 존재시에, 내피 세포에서 효과를 나타낸 동일한 용량에서 세포 주기 저지는 나타나지 않았다. 완전 배지를 내피 세포에 대한 자극제로서 사용한 실험에서, 아포미그렌은 bFGF 자극에서 나타난 바와 같이, 용량의존적 방식으로 세포 주기 저지를 초래하였고, 이는 아포미그렌이 몇 개의 성장 인자의 자극을 무효화할 수 있다는 것을 암시한다.

실시예 11: 내피 세포의 아포프토시스 및 아넥신 V- FITC 검정

아포미그렌이 내피 세포의 증식을 저해하고, 이 세포에 대해 심한 형태적 영향을 나타내기 때문에, 내피 세포의 아포프토시스를 유도하는 아포미그렌의 능력에 대하여 연구하였다. 아포프토시스의 개시 후에, 대부분의 세포 타입은 막 인지질 포스파티딜세린(PS)을 혈장 세포막의 내부 표면으로부터 외부로 전위시킨다(van Engeland et al.(1998) Cytometry 31:1-9; Zhang et al. (1997) biotechniques 23:525-31; Koopman et al. (1994) Blood 84:1415-20). PS, 따라서 아포프토시스는 PS에 대하여 친화성을 갖는 38kDa의 칼슘 의존성 인지질 결합 단백질인 아넥신 V의 FITC 접합체로 염색함으로써 검출할 수 있다. PS는 일반적으로 수포 형성 및 DNA 분열 이전에 검출될 수 있다.

포스파티딜세린(PS)에 대하여 높은 친화성을 갖는 칼슘 의존성 인지질 결합 단백질인 아넥신 V를 초기 단계 아포프토시스를 검출하기 위하여 사용하였다. 간단하게는, 200,000개 세포를 피브로넥틴 코팅된 6개 웰의 플레이트에서 2% FBS 및 3ng/ml의 bFGF를 포함하는 DMEM 중에서 평판배양하였다. 상이한 농도의 재조합 아포미그렌을 각 웰에 첨가하였고, 세포를 채취하여 처리 18시간 후에 프로세싱하였다. 세포를 분석하기 직전에 요오드화 프로피듐(PI)으로 염색하였다. 아넥신 V 양성 및 PI 음성인 세포만을 분석하기 위하여 게이팅을 수행하였다. 인간 재조합 TNF-α(40ng/ml)를 양성 대조로서 사용하였다. 이들 모두의 전문이 본원에서 참고문헌으로 삽입된, Dhanabal 등(1999)에 의해 기술되고("인간 엔도스타틴의 클로닝, 발현 및 시험관내 활성", Cancer research 출판), Vikas P. Sukhatme에 의해 1998년 12월 8일 출원된 미국 특허원 제 XX/XXX,XXX호 "항혈관형성 단백질의 제조 방법"에서도 기술된 바에 따라, 나머지 프로토콜을 수행하였다.

증식하는 C-PAE 세포를 0.1 내지 1㎍/ml의 상이한 농도 범위의 아포미그렌으로 처리하였을 때, 점점 더 많은 수의 세포가 원형화되었고, 피브로넥틴-코팅된 플레이트로부터 분리되었다. 대조에서는, 세포가 미변형된 내피 세포 형태를 나타냈고, 반면 아포미그렌으로 처리한 세포는 원형화된 것으로 나타났고, 아포프토틱 세포의 막 수포형성 특성을 나타내었다. 대조와 아포미그렌 처리 세포간의 평균 형광 강도 차이는 0.05 내지 1.0㎍/ml에서 현저하였다(p=0.01). 이 실험을 HMVE-L 세포에 있어서 반복하였고, 2.5 내지 5㎍/ml 범위의 아포미그렌 농도는 양성 대조 TNF-α(40ng/ml) 및 5% 에탄올에 대하여 언급된 바와 같이 형광성에서 필적할 만한 시프트를 나타내었다. 또한, 세포내 카스파제 활성을 아포미그렌 처리 C-PAE 세포에서 측정하였고, 대조 세포와 비교할 때 2배의 증가를 나타내었다.

실시예 12: 내피 세포 이동 검정

이들 모두의 전문이 본원에서 참고문헌으로 삽입된, Dhanabal 등(1999)에 의해 기술되고("인간 엔도스타틴의 클로닝, 발현 및 시험관내 활성", Cancer research 출판), Vikas P. Sukhatme에 의해 1998년 12월 8일 출원된 미국 특허원 제 XX/XXX,XXX호 "항혈관형성 단백질의 제조 방법"에서도 기술된 바에 따라, ECV304 및 IC-21 세포에서 이동 검정을 수행하였다. 일반적으로, 이동 검정을 폴리카보네이트 막(25x80mm PVD 무함유, 8μ 소공, Poretics Corp., Livermore, California, USA)을 가진 12개 웰의 화학주성 챔버(Neuro-Probe, Inc., Cabin John, Maryland, USA)를 사용하여 수행하였다. 37℃에서 하룻밤 동안, 0.5% 젤라틴, 1mM CaCl₂및 150mM NaCl을 포함하는 용액으로 챔버를 코팅함으로써 챔버에 대한 성장 인자의 비특이적인 결합을 방지하였다. EVC 304 세포를 5ng/ml DiI(1, 1'-디옥타데실-3, 3, 3', 3'-테트라메틸인도카르보시아닌 퍼클로레이트 DiIC18, Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA)을 포함한 10% FBS에서 하룻밤 동안 성장시켰고, 0.5% BSA를 포함한 PBS로 세척하였다. 트립신처리 후에, 세포를 쿨터-카운터 Z1(Luton, U.K.)을 사용하여 계수하였고, 0.5% FBS를 포함한 배지 199(Gibco/BRL, Gaithersburg, Maryland, USA)에서 300,000 세포/ml로 희석시켰다. 하부 챔버를 25ng/ml bFGF를 포함한 배지 199로 충전하였다. 상부 챔버에는 상이한 농도의 재조합 단백질을 가지고 15,000세포/웰로 접종하였다. 세포를 37℃에서 4시간 동안 이동하도록 하였다. 그 때, 막의 상부 표면의 세포를 세포 스크레이퍼로 제거하였고, 하부 표면의 이동된 세포를 3% 포름알데히드로 고정시켰으며, PBS로 세척하였다. 디지털 카메라로 550nM에서 형광 현미경을 사용하여 고정된 막의 이미지를 얻었고, 각 막에서의 세포의 수를 OPTIMAS(6.0 버전) 소프트웨어(Media Cybernetics, L.P., Silver Spring, MD, USA)를 사용하여 측정하였다.

C-PAE 세포는 bFGF 및 VEGF에 반응하여 이동하지 않기 때문에, 인간 ECV304 세포를 상이한 농도의 아포미그렌 및 자극제로서 bFGF를 사용한 이 검정에 사용하였다. 그 결과를 x축에 여러 종의 단백질의 농도, y축에 bFGF에 반응하여 이동한 세포의 백분율을 나타낸 그래프인 도 16에 나타내었다. 대조는 아포미그렌 처리 IC-21 세포(■)이고, 처리군는 ECV304 세포에 대한 아포미그렌(●) 및 마우스(□) 및 인간(○) 엔도스타틴으로 구성된다.

아포미그렌은 이러한 용량에서 IC-21 마크로파지 전구 세포의 이동에 영향을 주지 않았으나, 내피 세포에서는 0.15 내지 1.25㎍/ml의 용량에서 심한 이동 저해가 관찰되었고, 150ng/ml에서는 약 80%의 저해가 초래되었다(도 16). 이전의 연구에서는 엔도스타틴이 보다 더 고용량에서 ECV304 내피 세포의 이동을 저해하는 것으로 나타났다(10 내지 15㎍/ml에서 5ng/ml 이하의 ED₅₀및 80% 저해)(Dhanabal 등(1999) "인간 엔도스타틴의 클로닝, 발현 및 시험관내 활성", Cancer research 출판).

세포 이동에 대한 레스틴의 효과도 연구하였다. 아포미그렌에 관하여 검정을 수행하였고, 그 결과를 도 17에 나타내었다. 신장 암 세포(RCC) 종양 성장의 저해에 대한 레스틴의 효과도 연구하였고, 이들 모두의 전문이 본원에서 참고문헌으로 삽입된, Vikas P. Sukhatme에 의해 1998년 12월 8일 출원된 미국 특허원 제 XX/XXX,XXX호 "항혈관형성 펩티드 및 그의 사용 방법", 및 Vikas P. Sukhatme에 의해 1998년 12월 8일 출원된 미국 특허원 제 XX/XXX,XXX호 "항혈관형성 단백질의 제조 방법"에서 기술된 바에 따라, 수행하였다.

그 결과를, 레스틴이 비처리 대조 종양과 비교하여 종양 성장을 저해하는데 있어서 엔도스타틴에 필적하여 수행하였음을 나타내는 도 18에 제시하였다.

실시예 13: 신장 종양 모델에서 안지오스타틴의 효과

무흉선의 누드 마우스에 신장 종양 세포주 768-0을 피하 이식하였다. 인산 완충 식염수 200 리터에 약 500만개의 세포를 각 마우스의 옆구리에 접종시켰다. 각 종양은 약 200㎟에 이르도록 하였다.

약 20㎍의 정제된 재조합 레스틴 또는 엔도스타틴(1mg/kg)을 각 동물에게 3주간 매일 복강내 투여하였다. 그 결과를 레스틴이 엔도스타틴에 필적하여 수행하였음을 나타내는 도 18에 나타내었다.

실시예 14: CAM 검정

생체내에서 bFGF 유도성 혈관형성을 차단하는 아포미그렌의 능력을 융모 요막(CAM) 검정을 사용하여 시험하였다. 수정시킨 흰색 레그호온 닭의 달걀(SPAFAS, Inc., Norwish CT)을 100㎟의 페트리 접시 위에 오프닝하고, 38℃에서 가습된 인큐베이터에서 11일까지 성장시켰다. 0.73mg/ml 농도의 비트로겐(Collagen Biomaterials, Palo Alto, CA)을 포함하고 비히클 단독, VEGF + FGF-2, 또는 his.아포미그렌(0.5, 1, 5, 10, 20, 또는 50㎍/ml)으로 보충된 펠렛을 37℃에서 2시간 중합시켰다. 펠렛을 나이론 메쉬에 놓고, CAM의 주변에 배향하였다. 배아를 24시간 동안 인큐베이터로 반송하였다. 콜라겐 메쉬에 대한 신생 모세혈관의 침투를 닭 배아의 순환내로 FITC-덱스트란을 주사함으로써 평가하였다. 실험의 말기에, 메쉬를 절개하고, 혈관 밀도의 평가를 NIH Image 1.59 프로그램을 사용하여 행하였다. 검정을 3회 수행하였고, 4개의 독립적인 실험을 수행하였다. 그 결과를 도 19에 나타내었다.

균등물

본 발명을 그의 바람직한 구현예를 참고하여 상세하게 나타내고, 기술하였으나, 당업자에 의해 첨부된 청구범위에서 정의된 발명의 요지 및 범주에서 벗어나지 않고 형식상 및 세부에 걸쳐서 다양한 변화가 가능한 것으로 해석된다.

Claims (87)

1. 약 170 내지 약 200개 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하고, 사람의 XV형 콜라겐의 α1 사슬의 NC10 도메인의 C-말단과 70% 이상의 서열 동일성을 가지는, 항혈관형성 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 분리된 레스틴.
2. 서열 번호: 의 아미노산 서열을 포함하는, 항혈관형성 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 분리된 레스틴.
3. 170 내지 200개의 아미노산 잔기를 포함하고 사람의 XV형 콜라겐의 α1 사슬의 NC10 도메인의 C-말단을 추가로 포함하는 단백질인 항혈관형성 단백질을 엔코딩하는 분리된 폴리누클레오티드.
4. 서열 번호: 의 아미노산 서열을 포함하는 항혈관형성 단백질을 엔코딩하는 분리된 폴리누클레오티드.
5. 제 3항에 있어서, 분리된 폴리누클레오티드가 (a) 서열 번호: 의 누클레오티드 서열, (b) 서열 번호: 의 누클레오티드에 상보적인 서열, 또는 (c) 서열 번호: 의 누클레오티드 서열과 엄격한 조건 하에서 하이브리드화하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리누클레오티드.
6. 프라이머 5'-TTT TTT GAA TTC ATT TCA AGT GCC AAT TAT GAG AAG CCT GCT CTG CAT TTG-3' 및 5'-AAG AAT GCG GCC GCT TAC TTC CTA GCG TCT GTC ATG AAA CTG TTT TCG AT-3'에 의해 증폭된 누클레오티드 서열을 포함하는 분리된 폴리누클레오티드.
7. 제 2항에 있어서, 분리된 레스틴의 항혈관형성 단편이 서열 번호: 의 아미노산 서열의 25개 이상의 인접 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 레스틴의 항혈관형성 단편.
8. 단편이 사람의 XV형 콜라겐의 α1 사슬의 NC10 도메인의 C-말단에 대응하는 80 내지 90개의 인접 아미노산을 포함하는 분리된 레스틴의 항혈관형성 단편.
9. 제 2항에 있어서, 단편이 서열 번호: 의 아미노산 97 내지 아미노산 181을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 레스틴의 항혈관형성 단편.
10. 서열번호: 의 아미노산 서열의 단편을 포함하고, 상기 단편은 서열 번호: 의 아미노산 97 내지 아미노산 181을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 항혈관형성 단백질을 엔코딩하는 분리된 폴리누클레오티드.
11. (a) 단편이 서열 번호: 의 누클레오티드 289 내지 누클레오티드 543을 포함하는 누클레오티드 서열을 포함하는, 서열 번호: 의 누클레오티드 서열의 단편, (b) 단편이 서열 번호: 의 누클레오티드 289 내지 누클레오티드 543을 포함하는 누클레오티드 서열을 포함하는, 서열 번호: 의 누클레오티드 서열의 단편에 상보적인 서열, 또는

    (c) 단편이 서열 번호: 의 누클레오티드 289 내지 누클레오티드 543을 포함하는 누클레오티드 서열을 포함하는, 서열 번호: 의 누클레오티드 서열의 단편과 엄격한 조건 하에서 하이브리드화하는 서열을 포함하는 분리된 폴리누클레오티드.
12. 제 3항의 분리된 폴리누클레오티드의 대립유전자 변종인 폴리누클레오티드.
13. 제 11항에 있어서, 폴리누클레오티드가 발현 조절 서열과 작동적으로 연결되는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리누클레오티드.
14. 제 13항의 폴리누클레오티드로 형질전환된 숙주 세포.
15. 제 14항에 있어서, 세포가 세균, 효모, 포유동물, 곤충 또는 식물 세포로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
16. (a) 세균, 효모, 포유동물, 곤충 또는 식물 세포로부터 선택되고, 제 11항의 폴리누클레오티드로 형질전환된 숙주 세포를 배양물을 성장시키는 단계; 및

    (b) 배양물로부터 단백질을 정제하는 단계를 포함하는 제 11항의 폴리누클레오티드에 의해 엔코딩된 단백질의 제조 방법.
17. 제 1항의 분리된 레스틴 및 하나 이상의 추가적인 단백질을 포함하는 융합 단백질.
18. 제 17항에 있어서, 레스틴, 엔도스타틴, 안지오스타틴, 아포미그렌 및 엔도스타틴 돌연변이체 단편 EM1을 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 분자를 추가로 포함하는 융합 단백질.
19. 제 7항의 분리된 레스틴 단편 및 하나 이상의 추가적인 단백질을 포함하는 융합 단백질.
20. 제 19항에 있어서, 레스틴, 엔도스타틴, 안지오스타틴, 아포미그렌 및 엔도스타틴 돌연변이체 단편 EM1을 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 분자를 추가로 포함하는 융합 단백질.
21. 제 9항의 분리된 레스틴 단편 및 하나 이상의 추가적인 단백질을 포함하는 융합 단백질.
22. 제 21항에 있어서, 레스틴, 엔도스타틴, 안지오스타틴, 아포미그렌 및 엔도스타틴 돌연변이체 단편 EM1을 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 분자를 추가로 포함하는 융합 단백질.
23. 생물학적 활성 성분으로서 제 1항의 분리된 레스틴을 포함하는 조성물.
24. 제 23항의 조성물 및 약제학적으로 배합가능한 담체의 조성물.
25. 생물학적 활성 성분으로서 제 7항의 분리된 레스틴 단편을 하나 이상 포함하는 조성물.
26. 제 25항의 조성물 및 약제학적으로 배합가능한 담체의 조성물.
27. 생물학적 활성 성분으로서 제 9항의 분리된 레스틴 단편을 하나 이상 포함하는 조성물.
28. 제 27항의 조성물 및 약제학적으로 배합가능한 담체의 조성물.
29. 생물학적 활성 성분으로서 제 17항의 융합 단백질을 포함하는 조성물.
30. 생물학적 활성 성분으로서 제 19항의 융합 단백질을 포함하는 조성물.
31. 생물학적 활성 성분으로서 제 21항의 융합 단백질을 포함하는 조성물.
32. 조직을 서열 번호: 의 아미노산 서열을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 포유동물 조직에서 혈관형성 활성의 저해 방법.
33. 제 32항에 있어서, 조성물이 서열 번호: 의 아미노산 97 내지 아미노산 181을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
34. 혈관형성 활성을 특징으로 하는 질환을 저해하기 위하여 제 23항의 조성물을 사용하는 방법으로서, 상기 질환을 가진 환자에게 상기 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
35. 제 34항에 있어서, 질환이 혈관형성 의존성 암, 양성 종양, 류마치스성 관절염, 건선, 안구 혈관형성 질환, 오슬러-웹버 증후군, 심근 혈관형성증, 플래크 신생혈관형성, 모세혈관확장증, 혈우병 관절증, 섬유성혈관종, 창상 육아형성, 장관 유착증, 아테롬성 동맥경화증, 공피증, 비후성 반흔, 묘조병, 헬리오박터 필로리 궤양, 투석 이식 혈관 과다 협착증, 피임 및 비만을 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
36. 제 35항에 있어서. 질환이 암인 것을 특징으로 하는 방법.
37. 제 36항에 있어서, 질환이 신장암인 것을 특징으로 하는 방법.
38. 혈관형성 활성을 특징으로 하는 질환을 치료하기 위하여 제 23항의 조성물을 사용하는 방법으로서, 상기 질환을 가진 환자에게 상기 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
39. 제 38항에 있어서, 질환이 암인 것을 특징으로 하는 방법.
40. 제 39항에 있어서, 질환이 신장암인 것을 특징으로 하는 방법.
41. 혈관형성 활성을 특징으로 하는 질환을 치료하기 위하여 제 24항의 조성물을 사용하는 방법으로서, 상기 질환을 가진 환자에게 상기 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
42. 제 41항에 있어서, 질환이 암인 것을 특징으로 하는 방법.
43. 제 42항에 있어서, 질환이 신장암인 것을 특징으로 하는 방법.
44. 혈관형성 활성을 특징으로 하는 질환을 치료하기 위하여 제 25항의 조성물을 사용하는 방법으로서, 상기 질환을 가진 환자에게 상기 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
45. 제 44항에 있어서, 질환이 암인 것을 특징으로 하는 방법.
46. 제 45항에 있어서, 질환이 신장암인 것을 특징으로 하는 방법.
47. 혈관형성 활성을 특징으로 하는 질환을 치료하기 위하여 제 26항의 조성물을 사용하는 방법으로서, 상기 질환을 가진 환자에게 상기 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
48. 제 47항에 있어서, 질환이 암인 것을 특징으로 하는 방법.
49. 제 45항에 있어서, 질환이 신장암인 것을 특징으로 하는 방법.
50. 혈관형성 활성을 특징으로 하는 질환을 치료하기 위하여 제 27항의 조성물을 사용하는 방법으로서, 상기 질환을 가진 환자에게 상기 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
51. 제 50항에 있어서, 질환이 암인 것을 특징으로 하는 방법.
52. 제 52항에 있어서, 질환이 신장암인 것을 특징으로 하는 방법.
53. 혈관형성 활성을 특징으로 하는 질환을 치료하기 위하여 제 28항의 조성물을 사용하는 방법으로서, 상기 질환을 가진 환자에게 상기 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
54. 제 53항에 있어서, 질환이 암인 것을 특징으로 하는 방법.
55. 제 54에 있어서, 질환이 신장암인 것을 특징으로 하는 방법.
56. 혈관형성 활성을 특징으로 하는 질환을 치료하기 위하여 제 29항의 조성물을 사용하는 방법으로서, 상기 질환을 가진 환자에게 상기 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
57. 제 56항에 있어서, 질환이 암인 것을 특징으로 하는 방법.
58. 제 57에 있어서, 질환이 신장암인 것을 특징으로 하는 방법.
59. 혈관형성 활성을 특징으로 하는 질환을 치료하기 위하여 제 30항의 조성물을 사용하는 방법으로서, 상기 질환을 가진 환자에게 상기 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
60. 제 59항에 있어서, 질환이 암인 것을 특징으로 하는 방법.
61. 제 60항에 있어서, 질환이 신장암인 것을 특징으로 하는 방법.
62. 혈관형성 활성을 특징으로 하는 질환을 치료하기 위하여 제 31항의 조성물을 사용하는 방법으로서, 상기 질환을 가진 환자에게 상기 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
63. 제 62항에 있어서, 질환이 암인 것을 특징으로 하는 방법.
64. 제 63항에 있어서, 질환이 신장암인 것을 특징으로 하는 방법.
65. 포유동물에 레스틴 단백질을 제공하는 방법으로서, 서열 번호: 의 폴리누클레오티드를 삽입하기 위하여 시험관내에서 처리된 포유동물 세포를 인간에게 도입하는 단계 및 레스틴 단백질의 치료적 유효량을 상기 포유동물에서 생체내 발현시키는 단계를 포함하는 방법.
66. 제 65항에 있어서, 세포가 림프구인 것을 특징으로 하는 방법.
67. 제 66항에 있어서, 림프구가 T-림프구 및 B-림프구를 포함한 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
68. 제 65항에 있어서, 세포가 혈구, TIL 세포, 골수 세포, 혈관 세포, 종양 세포, 간 세포, 근육 세포, 섬유아세포를 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
69. 제 65항에 있어서, 폴리누클레오티드가 바이러스 벡터에 의해 세포내로 삽입되는 것을 특징으로 하는 방법.
70. 포유동물에 아포미그렌 단백질을 제공하는 방법으로서, 서열 번호: 의 누클레오티드 289 내지 누클레오티드 543을 포함하는 서열 번호: 의 폴리누클레오티드를 삽입하기 위하여 시험관내에서 처리된 포유동물 세포를 인간에게 도입하는 단계 및 레스틴 단백질의 치료적 유효량을 상기 포유동물에서 생체내 발현시키는 단계를 포함하는 방법.
71. 제 70항에 있어서, 세포가 림프구인 것을 특징으로 하는 방법.
72. 제 71항에 있어서, 림프구가 T-림프구 및 B-림프구를 포함한 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
73. 제 70항에 있어서, 세포가 혈구, TIL 세포, 골수 세포, 혈관 세포, 종양 세포, 간 세포, 근육 세포, 섬유아세포를 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
74. 제 60항에 있어서, 폴리누클레오티드가 바이러스 벡터에 의해 세포내로 삽입되는 것을 특징으로 하는 방법.
75. 분리된 폴리누클레오티드의 누클레오티드 서열이 서열 번호: 의 누클레오티드의 서열에 대응하는 분리된 폴리누클레오티드를 생성하는 방법으로서 하기 단계를 포함하는 방법:

    (a) 중정도의 엄격한 조건 하에서 하기로 구성된 군으로부터 선택된 누클레오티드 서열과 하이브리드화하는 하나 이상의 폴리누클레오티드 프로브를 제조하는 단계;

    (ⅰ) 서열 번호: ;

    (ⅱ) 서열 번호: 의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 엔코딩하는 분리된 누클레오티드; 및

    (ⅲ) 사람의 XV형 콜라겐의 α1 사슬의 NC10 도메인의 C-말단에 대응하는 181개 인접 아미노산을 엔코딩하는 분리된 폴리누클레오티드;

    (b) 상기 프로브를 포유동물 DNA에 하이브리드화하는 단계; 및

    (c) 프로브로 탐지된 DNA 폴리누클레오티드를 분리하는 단계.
76. 제 75항의 방법에 따라 생성된 분리된 폴리누클레오티드.
77. 제 76항의 폴리누클레오티드를 포함하는 분리된 폴리누클레오티드.
78. 분리된 폴리누클레오티드의 누클레오티드 서열이 서열 번호: 의 누클레오티드의 서열에 대응하는 분리된 폴리누클레오티드를 생성하는 방법으로서 하기 단계를 포함하는 방법:

    (a) 중정도의 엄격한 조건 하에서 하기로 구성된 군으로부터 선택된 누클레오티드 서열과 하이브리드화하는 하나 이상의 폴리누클레오티드 프라이머를 제조하는 단계;

    (ⅰ) 서열 번호: ;

    (ⅱ) 서열 번호: 의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 엔코딩하는 분리된 누클레오티드; 및

    (ⅲ) 사람의 XV형 콜라겐의 α1 사슬의 NC10 도메인의 C-말단에 대응하는 181개 인접 아미노산을 엔코딩하는 분리된 폴리누클레오티드;

    (b) 상기 프라이머를 포유동물 DNA에 하이브리드화하는 단계;

    (c) 포유동물 DNA 서열을 증폭하는 단계; 및

    (d) 단계(c)의 폴리누클레오티드 생성물을 분리하는 단계.
79. 제 78항의 방법에 따라 생성되는 분리된 폴리누클레오티드.
80. 제 79항의 폴리누클레오티드를 포함하는 분리된 폴리누클레오티드.
81. 제 1항의 분리된 레스틴에 대한 항체.
82. 제 2항의 분리된 레스틴에 대한 항체.
83. 제 7항의 분리된 레스틴의 단편에 대한 항체.
84. 제 8항의 분리된 레스틴의 단편에 대한 항체.
85. 제 9항의 분리된 레스틴의 단편에 대한 항체.
86. 제 1항의 레스틴 단백질의 분리된 돌연변이체, 유도체, 동족체 또는 상동물.
87. 제 86항의 레스틴 돌연변이체, 유도체, 동족체 또는 상동물을 엔코딩하는 분리된 폴리누클레오티드.