WO2000017240A1 - Hmw-endostatin zur hemmung des wachstums von tumoren und von gefässwucherungen und zur diagnose von gefäss- und tumorerkrankungen - Google Patents

Hmw-endostatin zur hemmung des wachstums von tumoren und von gefässwucherungen und zur diagnose von gefäss- und tumorerkrankungen Download PDF

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WO2000017240A1
WO2000017240A1 PCT/EP1999/006963 EP9906963W WO0017240A1 WO 2000017240 A1 WO2000017240 A1 WO 2000017240A1 EP 9906963 W EP9906963 W EP 9906963W WO 0017240 A1 WO0017240 A1 WO 0017240A1
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hmw
endostatin
diseases
treatment
glycosylated
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PCT/EP1999/006963
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Ludger STÄNDKER
Wolf-Georg Forssmann
Harald John
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Haemopep Pharma Gmbh
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • HMW-Endostatin to inhibit the growth of tumors and vascular examinations and to diagnose vascular and tumor diseases
  • the present invention relates to peptides with angiostatic properties, which are referred to as HMW-Endostatin (High Molecular Weight - Endostatin), and a medicament containing the natural and synthetic peptides for therapeutic purposes in tumor and vascular diseases.
  • HMW-Endostatin High Molecular Weight - Endostatin
  • HMW endostatin HMW endostatin and can be used for the purpose of disease analysis and as a medication.
  • the HMW endostatins were first obtained from the hemofiltrate of kidney patients after ultrafiltration on the hemodialysis machine and were characterized on the basis of their molecular mass and the 30 amino acids of the N-terminus.
  • a patented process (Forssmann, 1988; DE 36 33 707 C2), which describes the process for obtaining proteins from hemofiltrate, was refined to produce the human HMW endostatin.
  • the fractions containing HMW endostatin can be recognized by mass spectrometry from the molecules with a molecular weight below 30 kDa obtained by this method, which are filtered off in the case of venous or arterio-venous shunt connection.
  • the substances can be purified by means of further processes until finally uniform proteins have been isolated and their composition and sequence have been elucidated.
  • the substances are a human peptide, which surprisingly has the property of very potently inhibiting the growth of tumors and vessels.
  • the molecule has an extremely high plasma half-life, which makes it particularly suitable for therapy. that makes it seem valuable.
  • the Folkman group (Harvard Medical School, Boston, USA) has described a related mouse protein with the property of inhibiting the growth of tumors and vessels (O'Reilly et al, Cell 88, 277-285, 1997 ).
  • the HMW endostatins according to the invention show therapeutic importance as an important circulating peptide of human blood.
  • the HMW endostatins are further characterized in that they can be obtained by chemical synthesis and by genetic engineering production and can surprisingly be used for numerous other purposes, including analysis in human blood as a diagnostic feature of diseases of vascular growth, the growth of Tumors and metastases.
  • the present invention thus relates to new peptides, the HMW endostatins, their preparation, the peptides-containing medicinal products, and natural and pharmacologically compatible derivatives of HMW endostatin, in particular amidated, acetylated, phosphorylated and glycosylated HMW endostatin derivatives and Fragments of the peptide.
  • Mass spectrometry was able to determine the molecular weights for the four HMW endostatins with 22001 ⁇ 0.02% (1), 19904 + 0.02% (2), 20995 ⁇ 2.5 (3) and 21843 ⁇ 0.02% (4) daltons become.
  • Naturally occurring peptides can in particular be glycosylated.
  • the peptide HMW-Endostatin (1) has the amino acid sequence VHLRPARPTSPPAHSHRDFQPVLHLVALNSPLSGGMRGIRGADFQCFQQAR AVGLAGTFRAFLSSRLQDLYSIVRRADRAAVPIVNLKDELLFPSWEALFSGS EGPLKPGARIFSFDGKDVLRHPTWPQKSVGLGLSS
  • the peptide HMW-Endostatin (4) has the amino acid sequence
  • They may be fragments of collagen alpha 1 (XVIII).
  • the peptide HMW-Endostatin (2) has the amino acid sequence
  • the peptide HMW-Endostatin (3) has the amino acid sequence
  • HMW-Endostatin (1) and HMW-Endostatin (4) are preferably at residue 9 (corresponds to T 125 according to the numbering of Sasaki et al., EMBO J. 17 (1998) 4249-4256).
  • residue 9 corresponds to T 125 according to the numbering of Sasaki et al., EMBO J. 17 (1998) 4249-4256.
  • a completely deglycosylated derivative with a Obtained molecular weight of 21.345 daltons NANA: N-acetylneuraminic acid; Gal: galactose; NAc: N-acetyl).
  • HMW-Endostatin (4) starting from the same glycosylation with a molecular weight of 21.843 daltons, a partially deglycosylated derivative with a mass of 21.552 daltons and a deglycosylated derivative with a mass of 21.187 daltons are obtained.
  • Preferred glycosylated derivatives and fragments of HMW endostatin (2) and (3) have masses of 20.995, 19.904 and 16.373 daltons.
  • the present invention further relates to various processes for the preparation of the HMW endostatins or their derivatives by prokaryotic or eukaryotic expression, by isolation from human blood by means of chromatography in a known manner, and finally by the customary processes of solid-phase and liquid-phase synthesis from the protected amino acids by coupling, deblocking and chromatographic purification.
  • the pharmaceutical preparation contains HMW endostatin or a physiologically acceptable salt of the HMW endostatins.
  • the form and composition of the medicinal product containing HMW-Endostatin depends on the type of administration.
  • the HMW endostatin can be administered parenterally, intranasally, orally and by inhalation.
  • HMW endostatin is preferably packaged into an injection preparation, either as a solution or as a lyophilisate for dissolution immediately before use.
  • the pharmaceutical preparation can also contain auxiliaries which are, for example, due to filling technology, contribute to the solubility, stability or sterility of the pharmaceutical or increase the efficiency of absorption into the body.
  • the daily dose to be administered for HMW-Endostatin depends on the indication and the use of certain derivatives. It is preferably in the range from 1 ⁇ m to 1 g per dose.
  • the peptide HMW-endostatin according to the invention is characterized in that it is also particularly suitable for long-term therapy in the case of tumor diseases or other diseases which are characterized by uncontrolled vascular growth and does not trigger an immune reaction in the case of long-term treatment.
  • the molecule has an extremely high plasma half-life, which makes it appear to be particularly valuable for therapy.
  • the preparation according to the invention is particularly suitable for combination therapy with chemotherapy or radiation therapy or following chemotherapy or radiation therapy for cancer.
  • the preparation according to the invention can also be used as a means of therapy and diagnosis for vascular diseases of the supporting and connective tissue, the respiratory tract, the cardiovascular system and the urogenital system, the nervous system and the eye, since it can be used for the production of human-compatible antibodies which are suitable are changes in vascular growth in these organs determine or influence them.
  • Hemofiltrate was used as the starting material, which is obtained in large quantities in the treatment of renal insufficiency patients and contains all plasma components up to a molecular size of approximately 20,000 Daltons.
  • the hemofiltrate was obtained using a hemofiltration system from Sartorius using cellulose triacetate filters with an exclusion size of 20,000 daltons (type SM 40042, Sartorius, Göttingen, FRG).
  • the filtrate originated from kidney-deficient patients who were in a stable metabolic state due to long-term hemofiltration and was protected against proteolytic degradation by acidification and cooling to 4 ° C. immediately after collection.
  • a total of 10,000 1 hemofiltrate were processed in twelve extractions using a cation exchange column (TSK SP 650 (M), Merck, Darmstadt, DE).
  • the pooled extracts were successively eluted on the above-mentioned column material through various buffers with different pH values (so-called pH pool eluates) (Schulz-Knappe, P., Schrader, M., Ständker, L., Richter, R., Hess, R., Jürgens, M., & Forssmann, WG (1997) A peptide bank generated by large scale preparation of circulating human peptides. J. Chromatogr.A, 776, 125-1329).
  • Eluent A water with 1 OmM HC1 and 20% methanol
  • Fractions 27 + 28 contained the peptide substances according to the invention.
  • Eluent A water with 0.1% by volume of trifluoroacetic acid
  • Eluent B 80% acetonitrile with 0.1 vol% trifluoroacetic acid
  • Fractions 41 contained the peptide substance according to the invention HMW endostatin (2) and HMW endostatins (3).
  • Fractions 43 contained the peptide substance HMW endostatin (1) according to the invention.
  • the HMW endostatin molecules may be sequence variants or differently glycosylated forms of human collagen alpha 1 (XV) or collagen alpha 1 (XVIII), since the measured molecular masses do not correspond to the masses that can be derived from the amino acid sequence of human collagen alpha 1 (XV) or collagen alpha 1 (XVIII).
  • the purified peptides were used directly for measurement in capillary zone electrophoresis.
  • the electropherogram shows only one peak and no further peaks of secondary components. This result shows that high-purity HMW endostatin molecules were present in the final cleaning stage.
  • Capillary Uncoated fused silica, 500 mm x 75 ⁇ m ID buffer: 100 mM sodium phosphate pH 2.5
  • the purified native peptides are analyzed by Edman degradation on an ABI 473 A sequencer using the standard program. The samples were applied to a Polybrene membrane in amounts between 100 and 400 pmol. It turned out for the HMW endostatins
  • the proliferation assay was carried out as described in the literature (O'Reilly, M., et al. Cell 88, 277-285, 1997).
  • the isolated high-purity HMW endostatin was added to the bovine capillary endothelial cells and inhibited the proliferation of these cells in a concentration-dependent manner.
  • Half-maximal inhibition of proliferation in this assay was achieved at a concentration of 20 ng / ml HMW-Endostatin, which surprisingly indicates a very potent anti-angiogenic effect.
  • HMW endostatin showed no antiproliferative activity.

Abstract

Die Erfindung betrifft HMW-Endostatine.

Description

HMW-Endostatin zur Hemmung des Wachstums von Tumoren und von Gefaß ucherungen und zur Diagnose von Gefäß- und Tumorerkrankungen
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Peptide mit angiostatischen Eigenschaften, die als HMW-Endostatin (High Molecular Weight - Endostatin) bezeichnet werden, sowie ein Arzneimittel enthaltend die natürlichen und synthetischen Peptide zu therapeutischen Zwecken bei Tumor- und Gefäßerkrankungen.
Diese Stoffe sind dadurch gekennzeichriet, daß sie insbesondere aus Hämofiltrat oder Hämodialysat, das aus menschlichem Blut abfiltriert wird, gewonnen werden können. Die Peptide werden als HMW-Endostatin bezeichnet und können zum Zwecke der Analyse von Erkrankungen und als Medikament verwendet werden.
Die HMW-Endostatine wurden erstmals aus dem Hämofiltrat Nierenkranker nach Ultrafiltration am Hämodialyseapparat gewonnen und wurden anhand ihrer molekularen Masse und den 30 Aminosäuren des N-Terminus charakterisiert. Zur Darstellung des humanen HMW-Endostatin wurde ein patentiertes Verfahren (Forssmann, 1988; DE 36 33 707 C2), welches die für Gewinnung von Eiweißstoffen aus Hämofiltrat beschreibt, verfeinert. Aus den mit diesem Verfahren gewonnenen Molekülen mit einem Molekulargewicht unter 30 kDa, die bei veno- venöser oder arterio-venöser Shuntverbindung abfiltriert werden, können die HMW- Endostatin enthaltenden Fraktionen durch Massenspektrometrie erkannt werden. Es wurde weiter festgestellt, daß mittels weiterer Verfahren diese Substanzen aufgereinigt werden können, bis schließlich einheitliche Eiweißstoffe isoliert und in ihrer Zusammensetzung und Sequenz aufgeklärt wurden. Die Stoffe sind ein humanes Peptid, welche überraschenderweise die Eigenschaft besitzt, sehr potent das Wachstum von Tumoren und Gefäßen zu hemmen. Überraschenderweise besitzt das Molekül eine extrem hohe Plasmahalbwertszeit, was es für die Therapie als beson- ders wertvoll erscheinen lässt. Bislang ist schon von der Arbeitsgruppe Folkman (Harvard Medical School, Boston, USA) ein verwandtes Protein der Maus mit der Eigenschaft beschrieben worden, das Wachstum von Tumoren und Gefäßen zu hemmen (O'Reilly et al, Cell 88, 277-285, 1997).
Die erfindungsgemäßen HMW-Endostatine, deren Struktur bisher unbekannt war und deren Bildungsstätte im Körper noch ungeklärt ist, zeigen überraschenderweise eine therapeutische Bedeutung als wichtige zirkulierende Peptid des menschlichen Blutes.
Die HMW-Endostatine sind weiter dadurch gekennzeichnet, daß sie durch chemische Synthese und durch gentech ologische Produktion gewonnen werden können und überraschenderweise für zahlreiche weitere Belange genutzt werden können, unter anderem für die Analyse im menschlichen Blut als Diagnosemerkmal von Erkrankungen des Gefäßwachstums, des Wachstums von Tumoren und von Metastasen.
Die vorliegende Erfindung betrifft also neue Peptide, die HMW-Endostatine, ihre Herstellung, die Peptide enthaltende Arzneimittel, sowie natürliche und pharmako- logisch verträgliche Derivate von HMW-Endostatin, insbesondere amidierte, acety- lierte, phosphorylierte und glycosylierte HMW-Endostatin-Derivate und Fragmente des Peptides. Durch Massenspektrometrie konnten die Molekulargewichte für die vier HMW-Endostatine mit 22001 ± 0,02% (1), 19904 + 0,02% (2), 20995 ± 2.5 (3) und 21843 ± 0,02% (4) Dalton bestimmt werden.
Natürlich vorkommende Peptiden können insbesondere glykosyliert sein.
Das Peptid HMW-Endostatin (1) hat die Aminosäure-Sequenz VHLRPARPTSPPAHSHRDFQPVLHLVALNSPLSGGMRGIRGADFQCFQQAR AVGLAGTFRAFLSSRLQDLYSIVRRADRAAVPIVNLKDELLFPSWEALFSGS EGPLKPGARIFSFDGKDVLRHPTWPQKSVWHGSDPNGRRLTESYCETWRTE APSATGQASSLLGGRLLGQSAASCHHAYIVLCIENSFMTAS
Das Peptid HMW-Endostatin (4) hat die Aminosäuresequenz
VHLRPARPTSPPAHSHRDFQPVLHLVALNSPLSGGMRGIRGADFQCFQQAR AVGLAGTFRAFLSSRLQDLYSIVRRADRAAVPIVNLKDELLFPSWEALFSGS EGPLKPGARIFSFDGKDVLRHPTWPQKSVWHGSDPNGRRLTESYCETWRTE APSATGQASSLLGGRLLGQSAASCHHAYIVLCIENSFMT
Es handelt sich möglicherweise um Fragmente des Kollagen-alpha 1 (XVIII).
Die vollständigen Ammosäuresequenzen wurden aus den eigenen Sequenzanalysen bestimmt bzw. aus der bereits bekannten cDNA-Sequenz für Kollagen-alpha 1 (XVIII) hergeleitet (Oh, S.P. et al., Genomics 19, 494-499, 1994).
Das Peptid HMW-Endostatin (2) hat die Aminosäure- Sequenz
YEKPALHLAALNMPFSGDIRADFQCFKQARAAGLLSTYRAFLSSHLQDLSTI VRKAERYSLPIVNLKGQVLFNNWDSIFSGHGGQFNMHIPIYSFDGRDIMTDP SWPQKVIWHGSSPHGVRLVDNYCEAWRTADTAVTGLASPLSTGKILDQKA YSCANRLIVLCIENSFMTDARK
Das Peptid HMW-Endostatin (3) hat die Aminosäuresequenz
PHQLLPPPNPISSANYEKPALHLAALNMPFSGDIRADFQCFKQARAAGLLST
YRAFLSSHLQDLSTIVRKAERYSLPIVNLKGQVLFNNWDSIFSGHGGQFNMH
IPIYSFDGRDIMTDPSWPQKVIWHGSSPHGVRLVDNYCEAWRTADTAVTGL ASPLSTGKILDQKAYSCANRLIVLCIENSFMTDARK
Es handelt sich vermutlich um Fragmente von Kollagen-alpha 1 (XV).
Diese vollständigen Aminosäuresequenzen wurden aus der Sequenzanalyse bestimmt bzw. aus der bereits bekannten cDNA-Sequenz für Kollagen-alpha 1 (XV) hergeleitet (Muragaki, Y. et al., J. Biol. Chem., 269, 4042-4046, 1994).
HMW-Endostatin (1) und HMW-Endostatin (4) sind vorzugsweise am Rest Nummer 9 (entspricht T125 gemäß der Nummerierung von Sasaki et al., EMBO J. 17 (1998) 4249-4256). Bei einer stufenweisen Deglycosylierung des natürlichen HMW-Endostatin (1), das einen Gal-GalNac-NANA Rest trägt (MW = 22,001 Da), werden Derivate mit einen Gal-GalNAc Rest (MW = 21,710 Dalton) und ein vollständig deglycosyliertes Derivat mit einem Molekulargewicht von 21,345 Dalton erhalten (NANA: N-Acetylneuraminsäure; Gal: Galactose; NAc: N-Acetyl).
Für HMW-Endostatin (4) ergibt sich ausgehend von der gleichen Glycosylierung mit einem Molekulargewicht von 21,843 Dalton ein teilweise deglycosylieres Derivat mit einer Masse von 21,552 Dalton und ein deglycosyliertes Derivat mit einer Masse von 21,187 Dalton.
Bevorzugte glycosylierte Derivate und Fragmente von HMW-Endostatin (2) und (3) weisen Massen von 20,995, 19,904 und 16,373 Dalton auf.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter verschiedene Verfahren zur Herstellung der HMW-Endostatine oder ihrer Derivate durch prokaryontische oder eukaryonti- sche Expression, durch Isolierung aus menschlichem Blut über Chromatographie- Verfahren in bekannter Weise, und schließlich durch die üblichen Verfahren der Festphasen- und Flüssigphasen-Synthese aus den geschützten Aminosäuren mittels Kopplung, Deblockierung und chromatographischer Reinigung. Die Arzneimittelzubereitung enthält HMW-Endostatin oder ein physiologisch verträgliches Salz der HMW-Endostatine. Die Form und Zusammensetzung des Arzneimittels, welches HMW-Endostatin enthält, richtet sich nach der Art der Verabreichung. Das HMW-Endostatin kann parenteral, intranasal, oral und mittels Inhalation verabreicht werden. Vorzugsweise wird HMW-Endostatin zu einem Injektionspräparat, entweder als Lösung oder als Lyophilisat zur Auflösung unmittelbar vor Gebrauch, konfektioniert. Die Arzneimittelzubereitung kann außerdem Hilfsstoffe enthalten die z.B. abfülltechnisch bedingt sind, einen Beitrag zur Löslichkeit, Stabilität oder Sterilität des Arzneimittels leisten oder den Wirkungsgrad der Aufnahme in den Körper erhöhen.
Die zu verabreichende Tagesdosis für HMW-Endostatin hängt von der Indikation und der Anwendung bestimmter Derivate ab. Sie liegt bevorzugt im Bereich von 1 μm bis 1 g pro Dosis.
Das erfindungsgemäße Peptid HMW-Endostatin ist dadurch gekennzeichnet, daß es sich besonders auch für die Langzeit-Therapie bei Tumorerkrankungen oder anderen Erkrankungen, die durch ein unkontrolliertes Gefäßwachstum gekennzeichnet sind, eignet und bei Dauerbehandlung keine Immunreaktion auslöst. Überraschenderweise besitzt das Molekül eine extrem hohe Plasmahalbwertszeit, was es für die Therapie als besonders wertvoll erscheinen läßt. Das erfindungsgemäße Präparat ist insbesondere für die Kombinationstherapie mit Chemo- oder Strahlentherapie oder in Anschluß an Chemo- oder Strahlentherapie bei Krebs geeignet.
Das erfindungsgemäße Präparat ist weiter als Mittel zur Therapie und Diagnose bei Gefäßerkrankungen des Stütz- und Bindegewebes, der Atemwege, des Herz- Kreislaufsystems und Urogenitalapparates, des Nervensystems und des Auges einzusetzen, da es zur Herstellung von human verträglichen Antikörpern verwandt werden kann, die geeignet sind, Änderungen des Gefäßwachstums in diesen Orga- nen festzustellen oder zu beeinflussen.
Beispiele
Isolierung und Charakterisierung von zirkulierendem HMW-Endostatin (1) und von zirkulierendem HMW-Endostatin (2) aus humanem Hämofiltrat
Als Ausgangsmaterial wurde Hämofiltrat verwendet, das in großen Mengen bei der Behandlung niereninsuffizienter Patienten anfällt und alle Plasmabestandteile bis zu einer Molekülgröße von etwa 20.000 Dalton enthält.
I. Gewinnung des Rohpeptidmaterials
Das Hämofiltrat wurde mittels einer Hämofiltrationsanlage der Firma Sartorius unter Verwendung von Cellulosetriacetat-Filtern mit einer Ausschlußgröße von 20.000 Dalton (Typ SM 40042, Sartorius, Göttingen, BRD) gewonnen. Das Filtrat stammte von niereninsuffizienten Patienten, die sich durch Langzeit-Hämofiltration in einer stabilen Stoffwechsellage befanden, und wurde unmittelbar nach der Gewinnung mittels Ansäuern und Abkühlung auf 4°C gegen proteolytischen Abbau geschützt. In zwölf Extraktionen mit einer Kationenaustauschersäule (TSK SP 650(M), Merck, Darmstadt, DE) wurden insgesamt 10.000 1 Hämofiltrat verarbeitet. Die gepoolten Extrakte wurden auf dem obengenannten Säulenmaterial nacheinander durch verschiedene Puffer mit unterschiedlichen pH- Werten (sogenannte pH- Pool Eluate) eluiert (Schulz-Knappe, P., Schrader, M., Ständker, L., Richter, R., Hess, R., Jürgens, M., & Forssmann, W.G. (1997) A peptide bank generated by large scale preparation of circulating human peptides. J. Chromatogr.A, 776, 125- 1329). Anschließend erfolgte eine RP-Fraktionierung der einzelnen pH-Pool Eluate auf einer präparativen RP-Säule (Pharmacia, Fine-line) mit 80% Acetonitril, 10 mM HC1 als Elutionspuffer (Gradient 0-60%B in 60 min) wie in der oben bezeichneten Literaturstelle bereits beschrieben. Die entstehenden salzfreien Rohfraktionen wurden anschließend gefriergetrocknet.
I. Präparative RP -Chromatographie
67 mg der Rohfraktion Nr 25 entstammend aus dem pH-Pool-Eluat 7 (Charge 04/1997) wurden mittels präparativer RP-Chromatographie grob nach Hydrophobi- zität getrennt. Von einer PrepPak Cartridge der Firma Vydac mit den Dimensionen 47 x 300 mm wurden Fraktionen abgesammelt.
Gerät: BioCad HPLC (Perseptive Biosystems, Freiburg, DE)
Säule: Vydac PrepPak Cartridge 47 x 300 mm
Material: Vydac, 300 Ä, 15 - 20 μm
Eluent A: Wasser mit 1 OmM HC1 sowie 20% Methanol
Eluent B : 100% Methanol mit 1 OmM HC1
Gradient: 0 - 25% Eluent B 6.25 min
25 - 75% Eluent B 51.25 min
100% Eluent B 56.25 min
Flußrate: 40 ml / min Fraktionen: 50 ml bzw. 1.2 min Absorption: 214 nm und 280 nm
Die Fraktionen 27 + 28 enthielten die erfindungsgemäßen Peptidsubstanzen.
III. Analytische RP-HPLC
In einem Gradienten auf einer Vydac-Säule (10 x 250 mm Stahlmantel, Material: RP C4, 300 Ä, 5 μm) konnte eine weitere Auftrennung der Fraktionen 27 + 28 aus der vorhergehenden Chromatographiestufe erzielt werden. Die Eluenten waren Wasser mit 0,1 Vol% Trifluoressigsäure und 80% Acetonitril mit 0,1 Vol% Trifluo- ressigsäure. Gerät: Kontron HPLC-Anlage
Säule: Vydac, Stahlmantel 10 x 250 mm
Material: Vydac RP-C4, 300 Ä, 5 μm
Eluent A: Wasser mit 0, 1 Vol% Trifluoressigsäure
Eluent B: 80% Acetonitril mit 0,1 Vol% Trifluoressigsäure
Gradient: 0 - 30% Eluent B 7 min
30 - 65% Eluent B 77 min
65 - 100% Eluent B 82 min Flußrate: 2 ml / min Fraktionen: 2 ml bzw. 1 min Absorption: 214 und 280 nm
Die Fraktionen 41 enthielt die erfindungsgemäße Peptidsubstanz HMW-Endostatin (2) und HMW-Endostatine (3).
Die Fraktionen 43 enthielt die erfindungsgemäße Peptidsubstanz HMW-Endostatin (1).
IV. Bestimmung der molekularen Masse von zirkulierendem HMW-Endostatin m ittels Elektrospray-Massenspektrometrie Die Molekularmassen wurden von den nativen, gereinigten HMW-Endostatin Molekülen aus der Präparation im Schritt III gemessen. Für die drei Substanzen wurden drei molekulare Massen mit Hilfe eines Elektrospray-Massenspektrometer (Sciex API III, Perkin-Elmer, Langen, DE) gemessen. Es zeigten sich Peaks von den acht- bis elffach protonierten Molekülen. Die Molekularmassen betrugen 19904±0,02% für HMW-Endostatin (2), 20995±2.5 Dalton für HMW-Endostatin (3) sowie 21999±4.2 Dalton für HMW-Endostatin (1). Bei den HMW-Endostatin Molekülen handelt es sich möglicherweise um Sequenzvarianten oder unterschiedlich glykosi- lierte Formen des humanen Kollagen-alpha 1 (XV) bzw. Kollagen-alpha 1 (XVIII), da die gemessenen Molekularmassen nicht mit den aus der Aminosäuresequenz des humanen Kollagen-alpha 1 (XV) bzw. des Kollagen-alpha 1 (XVIII) herleitbaren Massen übereinstimmen.
V. Reinheitsbestimmung mittels Kapülar-Zonen-Elektrophorese
Die aufgereinigten Peptide wurden direkt zur Messung in der Kapillar-Zonen- Elektrophorese verwendet. Das Elektropherogramm zeigt lediglich einen Peak und keine weiteren Peaks von Nebenbestandteilen. Dieses Ergebnis zeigt, daß in der Endreinigungsstufe hochreine HMW-Endostatin Moleküle vorlagen.
Gerät: P/ACE System 2000, Beckman Instruments GmbH, München, DE
Kapillare: Uncoated Fused Silica, 500 mm x 75 μm ID Puffer: 100 mM Natriumphosphat pH 2,5
0,02% Hydroxypropylmethylcellulose Temperatur: 25°C
Injektion: 20 sec entspricht 120 nl Laufzeit: 25 Minuten Strom: 80 mA, konstant
Absorption: 200 nm
VI. Sequenzanalyse von HMW-Endostatin
Die aufgereinigten nativen Peptide werden mittels Edman- Abbau auf einem ABI 473 A Sequenzer unter Verwendung des Standard-Programms analysiert. Die Proben wurden auf eine Polybrene-Membran in Mengen zwischen 100 und 400 pmol aufgetragen. Es ergaben sich für die HMW-Endostatine
HMW-Endostatin (1)
VHLRPARPTSPPAHSHRDFQPVLHLVALNS... HMW-Endostatin (4)
VHLRP ARPTSPP AHSHRDFQP VLHL VALNS ...
HMW-Endostatin (2)
YEKP ALHL AALNMPFSGDIRADFQCFKQ ÄRA...
HMW-Endostatin (3)
PHQLLPPPNPISS ANYEKPALHLAALNMPFSGDIRADFQCFKQ ÄRA...
VII. Bestimmung der biologischen Wirksamkeit von HMW-Endostatin Alle mit Hilfe des beschriebenen Verfahrens aus humanem Hämofiltrat isolierten hochreinen HMW-Endostatine wurde zur Bestimmung der biologischen Funktion in Endothelzell-Proliferationsassays eingesetzt. Für diesen Assay wurden bovine Kapillarendothelzellen aus der Nebennierenrinde von frisch geschlachteten Kälbern, wie in der Literatur beschrieben (Folkman, J. et al., 1979), in Kultur genommen.
Die Ausführung des Proliferationsassays wurde, wie in der Literatur beschrieben (O'Reilly, M., et al. Cell 88, 277-285, 1997), durchgeführt. Das isolierte hochreine HMW-Endostatin wurde den bovinen Kapillarendothelzellen zugegeben und hemmte in konzentrationsabhängigerweise die Proliferation dieser Zellen. Eine halbmaximale Hemmung der Proliferation in diesem Assay wurde bei einer Konzentration von 20 ng/ml HMW-Endostatin erreicht, was überraschenderweise auf eine sehr potente anti-angiogene Wirkung hinweist. In Proliferationsassays, die mit nicht-endothelialen Zellen durchgeführt wurden, z.B. NIH 3T3-Zellen und LMTK- Zellen, zeigte HMW-Endostatin keine antiproliferative Wirkung.

Claims

Patentansprüche
1. HMW-Endostatin erhältlich durch
• Gewinnung von Hämofiltrat niereninsuffizienter Patienten durch Hämofiltration mit Cellulosetriacetatfiltern mit einer Ausschlußgröße von 20.000 Da,
Abkühlung des Hämofiltrats auf 4°C nach Ansäuern
• Chromatographie an einer Kationenaustauschersäule gemäß der Methode in J. Chromatogr. A., 776, 125 - 1329,
• Fraktionierung an Reverse Phase C4 mit A: 0.1 Vol% TFA, B: 80 Vol% Aceto- nitril, 0,1 Vol.-% TFA (Gradient 0 bis 30% B in 7 min, 30-65% B in 77 min),
• Untersuchung der Fraktionen auf Anwesenheit von HMW-Endostatin mittels Massenspektrometrie.
2. HMW-Endostatin nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß es sich um
HMW-Endosatin (1) mit der Aminosäure-Sequenz
VHLRPARPTSPPAHSHRDFQPVLHLVALNSPLSGGMRGIRGADFQCFQ
QARAVGLAGTFRAFLSSRLQDLYSIVRRADRAAVPIVNLKDELLFPSW
EALFSGSEGPLKPGARIFSFDGKDVLRHPTWPQKSVWHGSDPNGRRLT
ESYCETWRTEAPSATGQASSLLGGRLLGQSAASCHHAYIVLCIENSFM
TAS und glykosiliertes HMW-Endostatin (1) mit einem Molekulargewicht von 22 kDa
oder HMW-Endostatin (4) mit der Aminosäure-Sequenz
VHLRPARPTSPPAHSHRDFQPVLHLVALNSPLSGGMRGIRGADFQCFQ
QARAVGLAGTFRAFLSSRLQDLYSIVRRADRAAVPIVNLKDELLFPSW
EALFSGSEGPLKPGARIFSFDGKDVLRHPTWPQKSVWHGSDPNGRRLT
ESYCETWRTEAPSATGQASSLLGGRLLGQSAASCHHAYIVLCIENSFM
T
und glykosiliertes HMW-Endostatin (4) mit einem Molekulargewicht von 21,8 kDa.
oder HMW-Endostatin (2) mit der Aminosäure-Sequenz
YEKPALHLAALNMPFSGDIRADFQCFKQARAAGLLSTYRAFLSSHLQD LSTIVRKAERYSLPIVNLKGQVLFNNWDSIFSGHGGQFNMHIPIYSFDG RDIMTDPSWPQKVIWHGSSPHGVRLVDNYCEAWRTADTAVTGLASPL STGKILDQKAYSCANRLIVLCIENSFMTDARK
und glykosiliertes HMW-Endostatin (2) mit dem Molekulargewicht 20 kDa
oder HMW-Endostatin (3) mit der Aminosäure-Sequenz
PHQLLPPPNPISSANYEKPALHLAALNMPFSGDIRADFQCFKQARAAGL LSTYRAFLSSHLQDLSTIVRKAERYSLPIVNLKGQVLFNNWDSIFSGHG GQFNMHIPIYSFDGRDIMTDPSWPQKVIWHGSSPHGVRLVDNYCEAW RTADTAVTGLASPLSTGKILDQKAYSCANRLIVLCIENSFMTDARK und glykosiliertes HMW-Endostatin (3) Formen mit dem Molekulargewicht 21 kDa
oder ein natürliches und pharmakologisch verträgliches Derivat und Variante, insbesondere amidierte, acetylierte, phosphorylierte und glykosylierte HMW- Endostatin-Derivate handelt.
3. HMW-Endostatin nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß HMW- Endostatin (1) oder HMW-Endostatin (4) am T9 glykosyliert, bevorzugt durch Gal-GalNAc-NANA oder ein Fragment davon.
4. Verfahren zur Herstellung des HMW-Endostatin nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das HMW-Endostatin durch prokaryonti- sche oder eine eukaryontische Expression hergestellt und chromatographisch gereinigt wird.
5. Verfahren zur Herstellung des HMW-Endostatin nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man es aus menschlichem Blut über Chromatographie- Verfahren isoliert.
6. Verfahren zur Herstellung des HMW-Endostatin nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das HMW-Endostatin durch Festphasen- und Flüssigphasen-Synthese aus den geschützten Aminosäuren, die in der ausgegebenen Sequenz enthalten sind, herstellt, deblockiert und es mit den gängigen Chromatographie- Verfahren reinigt.
7. Arzneimittel, enthaltend das HMW-Endostatin nach einem der Ansprüche 1 bis 3 neben üblichen Hilfs- und Zusatzstoffen.
8. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 7 zur Behandlung von Erkrankungen des menschlichen Organismus, insbesondere in Verbindung mit Gefäßwucherungen, Krebs oder Erkrankungen des Herzkreislauf- und Nervensystems.
9. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 7 zur Behandlung von Erkrankungen des menschlichen Organismus, insbesondere mit Beteiligung des Intu- gementes und der Sinnesorgane, insbesondere des Auges.
10. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 7 zur Behandlung von Systemerkrankungen bei Mangel von HMW-Endostatin insbesondere durch Anwendung von HMW-Endostatin zur Substitutionstherapie.
11. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 7 zur Behandlung von chronischen Erkrankungen, teils vergesellschaftet mit Erkrankungen gemäß Ansprüchen 8 bis 10, indem es in geeigneter Form für die Behandlung für die Elektrolytwirkung bei Tumor- und Gefäßerkrankungen benutzt wird.
12. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 7 zur Behandlung von akuten Erkrankungen gemäß Ansprüchen 8 bis 10, indem es in geeigneter Form für die Behandlung in der Intensivpflege dieser Erkrankungen benutzt wird.
13. Antikörper dadurch gekennzeichnet, daß sie gegen HMW-Endosatin nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder synthetische Teilstücke gerichtet sind.
14. Arzneimittel nach Anspruch 7 in galenischen Applikationsformen, insbesondere der lyophilisierten, mit Mannit aufgenommenen Form in sterilen Ampullen zur Auflösung in physiologischer Kochsalzlösung und/oder Infusionslösungen zur wiederholten Einzelinjektion und/oder Dauerinfusion in Mengen von 30 Mikrogramm bis 30 Milligramm reines HMW-Endostatin pro Therapie- Einheit.
15. Diagnostikmittel enthaltend spezifische Antikörper gemäß Anspruch 13.
16. Nukleinsäuren kodierend für HMW-Endostatin nach einem der Ansprüche 1 bis 2.
17. Diagnostisches Verfahren umfassend den Schritt der Bestimmung der Konzentration des HMW-Endostatin nach einem der Ansprüche 1 bis 3 im Blut.
18. Arzneimittel enthaltend Antikörper nach Anspruch 13 zur Behandlung der Überexpression von HMW-Endostatin.
PCT/EP1999/006963 1998-09-21 1999-09-21 Hmw-endostatin zur hemmung des wachstums von tumoren und von gefässwucherungen und zur diagnose von gefäss- und tumorerkrankungen WO2000017240A1 (de)

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US6852691B1 (en) 1997-12-08 2005-02-08 Beth Israel Deaconess Medical Center Anti-angiogenic peptides and methods of use thereof

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WO1997040073A2 (de) * 1996-04-22 1997-10-30 Haemopep Pharma Gmbh BIOLOGISCH AKTIVER EIWEISSSTOFF - KOLLAGENFRAGMENT HF-COLL-18/514cf - ZUR HEMMUNG DES WACHSTUMS VON TUMOREN UND VON GEFÄSSWUCHERUNGEN
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