DE4309815A1 - Verfahren zur Gewinnung und Anwendung des Guanylatzyklavaktivierenden Peptid I (GAP-I) - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung eines Eiweißstoffes in reiner oder partiell aufgereinigter Form aus menschlichen und tierischen Körperflüssigkeiten, der die Fähigkeit besitzt, den transepithelialen Transport von Elektrolyten und Wasser zu steuern. Dieser Stoff ist dadurch gekennzeichnet, daß er insbesondere aus Hämofiltrat oder Hämodialysat, das aus menschlichem und tierischem Blut abfiltriert wird, gewonnen werden kann. Der Stoff ist als Guanylatcyclase Activating Peptide I (GAP-I) bezeichnet und kann zum Zwecke (1) der Analyse von Erkrankungen, (2) zur medizinischen und gewerblichen Verwendung als Medikament benutzt werden.

Der Stoff GAP-I wurde erstmals aus dem Hämofiltrat Nierenkranker nach Ultrafiltration am Hämodialyseapparat gewonnen und über einen Biotest der Stimulation der Guanylatcyclase-C von Darmzellen (T84- Zellinie) funktionell charakterisiert. Zur Darstellung des GAP-I wurde ein patentiertes Verfahren (Forssmann, 1988; Offenlegungsschrift DE 36 33 707 A1) verfeinert, welches zuvor für die Gewinnung von Eiweißstoffen aus Hämofiltrat erfunden wurde. Aus den mit diesem Verfahren gewonnenen Molekülen von einem Molekulargewicht unter 20 kDalton, die bei veno-venöser oder arterio-venöser Shuntverbindung abfiltriert werden, können die Fraktionen enthaltend das GAP-I überraschenderweise durch einen Funktionstest erkannt werden. Das bisher bekannte Verfahren wurde also benutzt, um die Rohpeptidextrakte zu gewinnen, mit denen überraschenderweise bei der Anwendung an T84-Kolonkarzinomzellen in Zellkultur ein starker Effekt bemerkt wurde, indem die Generierung des Second Messengers cGMP unter dem Einfluß dieser Substanz überraschend stark aktiviert wurde. Es wurde weiter festgestellt, daß bei speziellen weiteren Aufreinigungsverfahren diese biologische Aktivität konzentriert werden konnte, bis schließlich ein einheitlicher Eiweißstoff identifiziert und in seiner Struktur aufgeklärt wurde. Der Wert dieser Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß dieser Stoff aus dem bisher als wertlos betrachteten Hämofiltrat aufgereinigt werden kann, um als wirtschaftlich verwertbare Substanz benutzt zu werden. Der genannte Stoff GAP-I ist weiter dadurch gekennzeichnet, daß er durch chemische Synthese und durch gentechnologische Produktion gewonnen werden kann und überraschenderweise für zahlreiche weitere Belange genutzt werden kann, u. a. für die Analyse im menschlichen Blut als pathognomonisches Diagnosemerkmal von Erkrankungen des Magen-Darm- und Urogenitaltraktes sowie des Respirationstraktes, Kardiovaskulären Sytems und des Nervenapparates.

Die vorliegende Erfindung betrifft also ein neues Peptid, das GAP-I (Guanylatcyclase Activating Peptide), seine Herstellung, dieses enthaltende Arzneimittel sowie dieses enthaltende Aufbereitungen und seine Verwendung dafür.

In jüngster Zeit hat sich immer mehr gezeigt, daß Stoffe für die Regulation der Funktion des Magendarmtraktes diagnostisch und therapeutisch von großem Interesse sind und daß wahrscheinlich noch eine große Zahl unbekannter Faktoren existieren, die von klinisch verwertbarer Bedeutung sind. Dazu können auch Faktoren gehören, die sowohl bei der Behandlung von Verdauungs-, Kreislauf- und Atemwegserkrankungen als auch bei der Hormonsubstitution bei vielen Erkrankungen durch regelmäßige Gabe über einen langen Zeitraum, gegebenenfalls lebenslang, verabreicht werden können, um diese Krankheitsvorgänge im positiven Sinne zu steuern.

In einigen Arbeiten (Guarino, Cohen, Thompson, Dharmsathaphorn and Giannella, Am.J.Physiol. 253: G775-G780, 1987) wurde nun nachgewiesen, daß bestimmte Zellinien aus Epithelien des Magendarmtraktes (z. B. T84 Zellen des Dickdarms, menschliche Coloncarcinomzellen) durch bereits bekannte Peptide, die aus Bakterien abgegeben werden (hitzestabile Enterotoxine) über Membranrezeptoren spezifisch beeinflußt werden.

Bei der Suche nach der Existenz weiterer auf diese Weise charakterisierbarer Wirkstoffe wurde überraschenderweise das GAP-I als biologisch aktives Molekül im menschlichen Plasma gesunder und kranker Menschen gefunden. Damit wurde ein Molekül entdeckt, dessen Struktur bisher unbekannt war und dessen Bildungsstätte im Körper noch ungeklärt ist. Die therapeutische und wirtschaftliche Verwendung wurde geprüft und das GAP-I wurde überraschenderweise als wichtiges zirkulierendes Peptid des menschlichen Blutes erkannt.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit:
Ein Blutpeptid GAP-I mit der Aminosäurensequenz

sowie seine natürlichen und pharmakologisch verträglichen Derivate, insbesondere amidierte, acetylierte, phosphorylierte und glycosylierte GAP-I Derivate und weitere Fragmente des Peptides. Durch Massenspektrometrie konnte ein Molekulargewicht von 10 336 Dalton festgestellt werden (Beispiel 1), und durch genomische Analyse der zur cDNA gehörige, weitere Abschnitt der Aminosäurensequenz bestätigt werden, die auch in mehreren Sequenzierungen von Teilstücken nach Endoproteaseabbau erkannt wurden (Beispiel 1).

Damit ist weiter Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues Peptid, das GAP-I, bereitzustellen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es als ein gut zugängliches Arzneimittel mit biologischer und therapeutischer Aktivität eines natürlichen Analogons des im Blut vorkommenden Stoffes verwandt werden kann.

Weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Herstellungsverfahrens für dieses GAP-I sowie die Anwendung des GAP-I als Arzneimittel für verschiedene therapeutische und diagnostische Indikationen. Dazu kann das GAP-I als hochreiner Stoff oder - wenn für die bestimmte Verwendung ausreichend - innerhalb eines teilweise aufgereinigten Peptidgemisches verwandt werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiter verschiedene Verfahren zur Herstellung dieses GAP-I oder seiner Derivate dadurch gekennzeichnet, daß dieses über eine prokaryontische oder eine enkaryontische Expression hergestellt und chromatographisch gereinigt wird, sowie ein weiteres Verfahren zur Herstellung der GAP-I bezogenen Moleküle bzw. seiner Derivate, indem man es aus menschlichem Blut über Chromatographie-Verfahren in bekannter Weise isoliert, und schließlich ein Verfahren zur Herstellung des GAP-I oder seiner Derivate, indem man diese GAP-I-Moleküle durch die üblichen Verfahren der Festphasen- und Flüssigphasen-Synthese aus den geschützten Aminosäuren, die in der angegebenen Sequenz enthalten sind, herstellt, deblockiert und es mit den gängigen Chromatographie-Verfahren reinigt (Beispiel 2).

Die GAP-I-Moleküle wurden chemisch synthetisiert (vgl. Beispiel 2) und als Arzneimittel zubereitet. Auch die gentechnologische Herstellung über übliche Vektoren ist erarbeitet: auf gentechnologischem Wege wird das GAP-I-Peptid sowohl (1) in pro­ als auch (2) in eukaryontischen Organismen hergestellt. Hierfür werden u. a. Expressionsvektoren zur sekretorischen Expression (z. B. pSP6, pRit-Derivate, Pharmacia), zur direkten cytoplasmatischen Expression (z. B. pKK-Derivate, Pharmacia) oder Expression als Fusionsprotein (pMC1871, Pharmacia) benutzt. Für die eukaryontische Expression haben wir verschiedene Organismen und Vektoren zur Verfügung, z. B. Insektenzellen (Summers and Smith, Tex.Agric.Exp.Stn.(bull) 1555, 1987), Hefen (Hitzeman et al., Nature, 293, 717-722, 1981), filamentöse Pilze (Yelton et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 81, 1470-1474, 1984)) und Säugerzellen (Zettlmeissl et al., Biotechnology, 5 720-725, 1987), von denen wir vorzugsweise die Insektenzellen benutzen. Die exprimierten Peptide der GAP-I-Familie werden mit Methoden der Chromatographie gereinigt, vorzugsweise wie in Beispiel 1 angegeben.

Die Arzneimittelzubereitung enthält GAP-I oder ein physiologisch verträgliches Salz des GAP-I. Die Form und Zusammensetzung des Arzneimittels, welches das GAP-I enthält, richtet sich nach der Art der Verabreichung. Das humane GAP-I kann parenteral, intranasal, oral und mittels Inhalation verabreicht werden. Vorzugsweise wird GAP-I zu einem Injektionspräparat, entweder als Lösung oder als Lyophilisat zur Auflösung unmittelbar vor Gebrauch, konfektioniert. Die Arzneimittelzubereitung kann außerdem Hilfsstoffe enthalten, die abfülltechnisch bedingt sind, einen Beitrag zur Löslichkeit, Stabilität oder Sterilität des Arzneimittels leisten oder den Wirkungsgrad der Aufnahme in den Körper erhöhen.

Die zu verabreichende Tagesdosis für GAP-I hängt von der Indikation und der Anwendung bestimmter Derivate ab. Bei i.v./i.m. Injektion liegt sie im Bereich von 100 bis 1200 Einheiten (µg)/Tag, bei täglicher subcutaner Injektion vorzugsweise bei 300-2400 Einheiten (µg)/Tag.

Die Bestimmung der biologischen Aktivität für das GAP-I basiert auf Messungen gegen internationale und hauseigene Referenzpräparationen für humanes GAP-I oder seiner Analoga in einem gebräuchlichen biologischen Testverfahren für dieselben. Dazu wird vorzugsweise ein standardisierter cGMP Generationstest mit T84-Zellen benutzt (Beispiel 4).

Das erfindungsgemäße Peptid GAP-I ist dadurch gekennzeichnet, daß dieses Peptid oder ein dazu gewonnener Antagonist/Fragment (Beispiel 3) sich besonders auch für die Langzeit-Therapie bei Durchfallerkrankungen eignen, da sie über eine ausgezeichnete biologische Wirksamkeit verfügen und andererseits auch bei Dauerbehandlung keine Immunreaktion auslösen.

Aufgrund der biologischen Wirkung ist gezeigt, daß das erfindungsgemäße Präparat weiter als Mittel zur Therapie von Nierenerkrankungen, Heuerkrankungen, in der Intensivpflege und bei Lungenerkrankungen anzuwenden ist.

Das erfindungsgemäße Präparat ist weiter als Mittel zur Therapie und Diagnose bei Stoffwechselerkrankungen des Magen-Darm-Traktes (insbesondere Dünndarm und Bauchspeicheldruse), der Atemwege, des Herz-Kreislaufsystems und Urogenitalapparates sowie des Nervensystems einzusetzen, da es zur Herstellung von human verträglichen Antikörpern verwandt werden kann (vergl. Beispiel 5), die geeignet sind, Änderungen der Stoffwechsellage dieser Organe festzustellen oder zu beeinflussen.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen und den folgenden Abbildungen, auf die in den Beispielen Bezug genommen wird, erläutert:

Es zeigen:

Abb. 1

cGMP-Generationstest zur Feststellung der GAP-I-Aktivität:
Die T84-Zellen werden in einer 1 : 1 (Vol : Vol) Mischung aus Ham′s F12 Medium (Gibco, Eggenstein, FRG) und Eagle Medium modifiziert nach Dulbecco (DMEM) (Gibco, Eggenstein, FRG) gezüchtet. Das Medium ist mit 10% fetalem Kälberserum (FCS, Gibco, Eggenstein, FRG), 50 U/ml Penicillin und 50 µg/ml Streptomycin supplementiert. Die Zellen in den Kulturplatten (Nunc, Wiesbaden, FRG, 24-Lochplatten) werden bis zur Konfluenz gezüchtet. Im Experiment werden die Zellen 60 min lang mit den Hämofiltratfraktionen der einzelnen Reinigungsschritte, bzw. mit aufgereinigtem oder synthetisch hergestelltem GAP-I inkubiert. Nach dieser Inkubationszeit werden die Zellüberstände dekantiert und das intrazelluläre cGMP der Zellen wird durch Zugabe von eiskaltem 70%igem Äthanol extrahiert. Der cGMP-Gehalt der Zellextrakte wird mit Hilfe eines spezifischen Radioimmunoassays bestimmt (Kaever und Resch, Biochem.Biophys.Acta 846 : 216-225, 1985). Die GAP-I enthaltenden Hämofiltratfraktionen (beispielsweise die Fraktionen der Minuten 78 bis 84 der Chromatographie in der Reinigungsstufe 1, wie in Abb. 2 schraffiert gezeigt) führen zu einer deutlichen Zunahme der Bildung von cGMP in den T84-Zellen. Die Abbildungen zeigt die cGMP-Bildung in allen Fraktionen der Reinigungsstufe 1 des Hämofiltrat-Alginsäure-Extraktes im Vergleich zu einer Stimulierung der T84-Zellen durch verschiedene Konzentrationen des hitzestabilen Enterotoxins (E 5763, Sigma-Chemie, Deisenhofen, FRG).

Abb. 2

Präparative Large-Scale-RP-Chromatographie des Alginsäure- Extraktes aus Hämofiltrat zur Grobauftrennung nach Molekulareigenschaften und zur Entsalzung des Rohpeptidextraktes. Im schraffierten Bereich befinden sich die durch den cGMP- Generations-Test mit T84 Zellen bestimmten GAP-I-Fraktionen. Sie eluieren bei einer Retentionszeit von 78 bis 84 Minuten bzw. bei 61 bis 69% Lösungsmittel B. Diese Fraktionen wurden für die weitere Aufreinigung gepoolt und benutzt.

Abb. 3

Präparative Large-Scale-RP-Chromatographie II zur Grobauftrennung der biologisch aktiven Fraktionen, die aus der Auftrennung in Abb. 2 gewonnen wurden. Im schraffierten Bereich befinden sich wieder die durch den cGMP-Generationstest bestimmten GAP-I- Fraktionen, nämlich bei einer Retentionszeit von 83 bis 85 Minuten und 61 bis 62% Elutionspuffer B.

Abb. 4

Semipräparative RP-Chromatographie der Auftrennung der cGMP- generierenden Fraktionen aus der präparativen RP-Chromatographie nach Abb. 3. Im schraffierten Bereich bei 75 bis 80 Minuten Retentionszeit bzw. 48 bis 49% Lösungsmittel B befinden sich die durch den cGMP-Generations-Test bestimmten, weiter gereinigten GAP-I-Fraktionen.

Abb. 5

Analytische RP-Chromatographie I der Auftrennung der cGMP- generierenden Fraktionen aus der semipräparativen RP- Chromatographie nach Abb. 4. Im schraffierten Bereich bei 75 bis 78 Minuten Retentionszeit bzw. 50 bis 54% Lösungsmittel B befinden sich die durch den cGMP-Generations-Test bestimmten, weiter gereinigten GAP-I-Fraktionen.

Abb. 6

Analytische RP-Chromatographie II der Auftrennung der cGMP- generierenden Fraktionen aus der analytischen RP-Chromatographie I nach Abb. 5. Im schraffierten Bereich des Peaks bei 42 bis 52 Minuten Retentionszeit bzw. 46 bis 48% Lösungsmittel B befinden sich die durch den cGMP-Generations-Test bestimmten, weiter gereinigten GAP-I-Fraktionen.

Abb. 7

Analytische RP-Chromatographie III der Auftrennung der cGMP- generierenden Fraktionen aus der analytischen RP-Chromatographie II nach Abb. 6. Im schraffierten Bereich bei 50 Minuten Retentionszeit bzw. 65% Lösungsmittel B befindet sich die durch den cGMP-Generations-Test bestimmte, weiter gereinigte GAP-I-Fraktion.

Abb. 8

Analytische RP-Chromatographie IV der Auftrennung der cGMP- generierenden Fraktion aus der analytischen RP-Chromatographie III nach Abb. 7. Rechromatographie auf derselben Säule mit anderen Eluenten. Im schraffierten Bereich des Peaks bei 70 Minuten Retentionszeit bzw. 61% Lösungsmittel B befindet sich die durch den cGMP-Generations-Test bestimmte, hochgereinigte GAP-I-Fraktion.

Abb. 9

Sequenzanalyse: Nach Auftragen von 114 des Materials aus dem endgereinigten GAP-I nach Chromatographie in Abb. 8, ca. 250 pmol, kommen die Amonosäurenreste von Position 1 bis 47 deutlich ohne nachweisbare Nebensequenzen festgestellt werden. Die Art der Sequenzierung ist im Text ausführlich beschrieben. Die weiteren Sequenzanteile des GAP-I wurden durch Abbau und Fragmentsequenzierung sowie Massenspektrometrie und Aminosäurenanalyse gewonnen

Abb. 10

Massenspektrum des nativen, gereinigten GAP-I, aus der Präparation von Abb. 8. Das gefundene Molekulargewicht von MG 10 335 stimmt im Fehlerbereich < 0,1% mit der theoretisch berechneten Masse von MG 10 336 des sequenzierten Moleküls überein. Nebensubstanzen sind nicht sichtbar. Diese Massenbestimmung wurde wieder durch Gegensequenzierung bestätigt.

Abb. 11

Darstellung der immunreaktiven Molekülform von GAP-I im Westernblot. Ein Äquivalent von 340 ml Hämofiltrat partiell aufgereinigter Peptide reicht für die Darstellung eines Peptides bei etwa 10 000 kD aus, das mit Antikörpern gegen GAP-I erfaßt wird. Die Gelelektrophorese bestätigt die Molekülgröße der Sequenzanalyse und Massenspektrometrie des nativen, gereinigten GAP-I.

Abb. 12

Konzentrationsabhängige Wirkung von GAP-I im Vergleich zu hitzestabilem Enterotoxin, CDD/ANP-99-126 und Urodilatin (CDD/ANP-99-126). Man erkennt die Zunahme des cGMP-Gehaltes im Zellaufschluß gegenüber der Kontrolle und in Abhängigkeit der Zugabe der Agonisten.

Beispiel 1 Direkter Nachweis der Aminosäuren-Sequenz des zirkulierenden, biologisch aktiven GAP-I nach Isolierung aus Hämofiltrat

Als Ausgangsmaterial wurde Hämofiltrat verwendet, das in großen Mengen bei der Behandlung niereninsuffizienter Patienten anfällt und alle Plasmabestandteile bis zu einer Molekülgröße von ca. 20 000 Dalton enthält.

I. Gewinnung des Rohpeptidmaterials

Das Hämofiltrat wurde mittels einer Hämofiltrationsanlage der Firma Sartorius unter Verwendung von Cellulosetriacetat-Filtern mit einer Ausschlußgröße von 20 000 Dalton (Typ SM 40042, Sartorius, Göttingen, BRD) gewonnen. Das Filtrat stammte von niereninsuffizienten Patienten, die sich durch Langzeit- Hämofiltration in einer stabilen Stoffwechsellage befanden. 720 l Hämofiltrat wurden gewonnen und unmittelbar nach der Gewinnung mittels Ansäuern und Abkühlung auf 4°C gegen proteolytischen Abbau geschützt. Anschließend wurde durch Alginsäureextraktion nach dem Verfahren von Forssmann der DE 36 33 797 A1 eine Rohpeptidfraktion (ca. 46,5 g) gewonnen. Davon wurden in einer ersten Reinigung, die unten beschrieben ist, 6,5 g weiter verarbeitet.

II. Isolierung des GAP-I in sieben Reinigungsschritten

Zunächst führten wir eine Entsalzung und Fraktionierung des Rohpeptidmaterials über RP-C4 Festphase (Stufe 1) durch (Abb. 2). Es folgte eine präparative Large-Scale-RP-Chromatographie II der bioaktiven Fraktionen (Abb. 3). Die in der Abb. 3 gezeigten Fraktionen bei einer Retentionszeit um 83 Minuten (schraffiert) enthielten die höchste Bioaktivität bezüglich des cGMP- Generationstestes an T84-Zellen und wurden für die weitere Auftrennung gepoolt. In Reinigungsstufe 3 verwandten wir eine semipräparative Reverse- Phase-Chromatographie (Abb. 4). Der bioaktive GAP-I-haltige Pool wurde durch eine Vakuumverdampfung eingeengt auf etwa 50% des Ausgangsvolumens, um besonders die organischen Lösungsmittelkomponenten zu entfernen. Über eine analytische RP-Chromatographie I als Reverse-Phase (RP)- Chromatographie wurde das GAP-I haltige Material weiter gereinigt, wie in Abb. 5 im Detail angegeben. Die biologische Aktivität erscheint dabei im Bereich eines größeren Peaks bei einer Retentionszeit von 75 bis 78 Minuten. Die bioaktiven Fraktionen aus 3 identischen Läufen wurden gepoolt und lyophillisiert und für die nächsten Reinigungsschritte vorbereitet. Die letzten drei Reinigungsschritte (Abb. 6 bis 8) wurden auf einer analytischen Microbore-HPLC- RP-C18-Säule unter Verwendung von verschiedenen Laufmitteln durchgeführt. Im letzten Reinigungsschritt war das gesuchte cGMP- aktivierende Peptid (GAP-I) in einer einzigen Fraktion (s. Abb. 8) nachzuweisen. Der Reinheitsgrad der isolierten Substanz konnte mit Hilfe eines Dioden-Array-Systems während des Endisolierungs-Chromatogrammes schon auf < 95% angegeben werden. Diese Fraktion wurde im Bioassay getestet, ansequenziert, auf Aminosäurengehalt untersucht, im Massenspektrometer analysiert (Abb. 10) und mittels der Kapillarzonenelektrophorese (CE) auf Reinheit geprüft (s. u.). Weiter wurde die Gesamtstruktur der Aminosäuren- Sequenz aufgrund der Durchsequenzierung von Einzelfragmenten nach Lys-C- Endoprotease-Abbau aufgeklärt (Abb. 9).

3. Sequenzanalytische Bestimmung der Primärstruktur des GAP-I

Aus der bioaktiven Fraktion des Laufes der Endreinigung wurde 25 µl aus der Gesamtmenge von 100 µl zur Aminosäuren-Sequenz-Analyse benutzt. Nach Isolierung aus Hämofiltrat wie oben beschrieben, wurden mit Hilfe des Gasphasensequenators Typ 470 A (Applied Biosystems) sequenziert. Der EDMAN-Abbau (Edman und Begg, Eur. J. Biochem. 1, 80-91, 1967) erfolgte mit dem Standardprogramm PTHRUN. Die Analyse der derivatisierten Aminosäuren wurde im on-line-Verfahren über einen ABI 120 A Chromatographen unter Verwendung des Standardprotokolls ABI durchgeführt.

Für diese Fraktion eine Sequenz von 47 Aminosäuren bestimmt werden, weitere 5 Aminosäure-Reste kommen nur mit Vorbehalt ermittelt werden. Über die gefundene Sequenz ist bekannt, daß sie in Homologie zu der mit der cDNA abgeleiteten Aminosäurensequenz in den Positionen 22 bis 115 übereinstimmt (De Sauvage et al. Proc. Natl.Acad.Sci USA 89 : 9089-9093, 1992).

4. Nachweis des Molekulargewichtes des nativen GAP-I durch Massenspektrometrie

Das Endprodukt der Aufreinigung nach Stufe 7 wurde im Massenspektrometer untersucht. Mittels dieser Bestimmung wurde festgestellt, daß alle Fraktionen, die GAP-I Bioaktivität aufwiesen, auch ein Molekül mit einem MG von 10.336 Dalton enthielten.

5. Nachweis des Reinheitsgehaftes des isolierten, nativen GAP-I durch Kapillarzonenelektrophorese

Desweiteren wurde das Endprodukt der Aufreinigung mittels der Kapillar-Zonen- Elektrophorese auf seine Reinheit geprüft. Diese Methode ist geeignet, Verunreinigungen bis in den unteren Picogrammbereich nachzuweisen und ergibt eine ebenfalls hochauflösende Reproduzierbarkeit in der Darstellung eines bestimmten Peptides.

Durch die Kapillarzonen-Elektrophorese ist bestätigt, daß die Fraktion einen auf GAP-I zu beziehenden Peak enthielt.

6. Nachweis der C-terminalen Aminosäuren-Sequenz des isolierten, nativen GAP-I durch Endoprotease-Abbau (Endoprotease Lys C) sowie Bromcyan- Spaltung und Sequenzierung der Teilfragmente

Um die gesamte Primärstruktur des GAP-I, das aufgrund aus der Massenspektrometrie gefundenen Molekulargewichtes etwa 90 bis 100 Aminosäuren besitzen mußte, zu bestimmen, wurde eine Aufklärung der C-terminalen Sequenz über Herstellung von Teilfragmenten und deren Sequenzierung vorgenommen.

Der Endprotease-Abbau durch Lys-C-Endprotease ergab nach Auftrennung mehrere deutliche Peaks. Diese Peaks wurden, wie oben bei der Gesamtsequenzierung beschrieben, analysiert und die Teilsequenzen, wie sie in Abb. 9 beschrieben sind, erhalten.

Beispiel 2 Chemische Synthese des humanen Guanylatcyclase-Aktivierenden Peptides I (GAP-I) 1. Synthese des kieselgurverstärkten Fmoc-Leu-Harzes

Das Fmoc-Aminosäureanhydrid (5 Äquivalente) wurde in einem Minimalvolumen N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und in einem Rundkolben zu dem Hydroxymethylphenoxyacetyl-norleucin-Harz hinzugefügt. 4- Dimethylaminopyridin (1 Äquivalent) wurde ebenfalls in einem Minimalvolumen DMF gelöst und in den Rundkolben gegeben. Nach 1 Stunde Reaktionszeit wurde der Überschuß der Reagentien durch Filtration entfernt und das Harz auf einem Filter gründlich gewaschen.

2. Strategie der Synthese des humanen GAP-I

Für die Synthese des Peptids mit der Formel:

wurde die Durchflußmethode (Atherton und Sheppard, Solid phase peptide synthesis. IRL Press, Oxford, 1989) angewendet. Die genannte Peptidsequenz wurde mit Hilfe einer automatischen Peptidsynthese-Apparatur (Milligen 9050) unter Verwendung der Fmoc-Pentafluorophenylester (OPfp) synthetisiert.

Das Peptid wurde vom Trägerharz durch Zugabe einer Mischung von Trifluoressigsäure-Anisol-Ethandithiol-Phenol 94 : 2 : 2 : 2 (v/v/v/w) abgespalten und mit Ether gefällt. Das HPLC-gereinigte Peptid wurde mit Hilfe von Aminosäureanalyse, analytischer HPLC und Aminosäuresequenzanalyse charakterisiert.

3. Praktische Durchführung der Synthese des humanen GAP-I

Die Synthese von

wurde mit dem automatischen 9050 PepSynthesizer (Programm Version 1.3), MilliGen/Biosearch, nach der continuous flow-Methode durchgeführt. Fmoc- Aminosäurepentafluorophenylester waren L-konfiguriert und in 0,8 mmol- Portionen verwendet. Alle zur Synthese notwendigen Reagenzien wurden von MilliGen/Biosearch bezogen: N,N-Dimethylformamid, 20% Piperidin in N,N- Dimethylformamid und 1-Hydroxybenzotriazol. Die L-Aminosäurederivate wurden in vierfachem Überschuß eingesetzt. Die terminalen Aminogruppen waren Fmoc-geschützt. Asparagin- und Glutaminsäure wurden als N^w-tert­ butylester, Tyrosin und Serin als tert-butylether, Histidin und Lysin als N^w-Boc- Verbindungen und Arg als N^G-2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl(Pmc)- Derivat eingesetzt. Die Synthese wurde ausgehend vom Kieselgur-Harz Fmoc- Leu-Pepsyn KA (MilliGen/Biosearch), also mit trägergebundener C-terminaler Aminosäure (0,091 meq Leu/g, 1,60 g) durchgeführt. Die Acylierung von Fmoc- Arg(Pmc)-OH wurde unter Anwesenheit von O-(1H-Benzotriazol-1-yl)- N,N,N′,N′-tetramethyluronium-tetrafluoroborat (TBTU), 1-Hydroxybenzotriazol und Diisopropylethylamin durchgeführt. Folgender Synthesecyclus wurde verwendet: Fmoc-Abspaltung mit 20% Piperidin in DMF (7 min), waschen mit DMF (12 min), Acylierung (30 min; bei Fmoc-Val-OPfp 45 min), und waschen mit DMF (8 min). Die fortschreitende Synthese wurde durch kontinuierliche UV- Detektion verfolgt. Die Synthese wurde mit der Abspaltung des N-terminalen Fmoc-Restes abgeschlossen. Das harzgebundene Peptid wurde dreimal mit je 50 ml Isopropanol, Eisessig, Isopropanol und Diethylether gewaschen und getrocknet.

Die Abspaltung vom Harz erfolgte mit Trifluoressigsäure/Phenol/ Ethandithiol/Thioanisol/Wasser 10 : 0,75 : 0,25 : 0,5 : 0,5 (v/w/v/v/v, 5 ml). Die Lösung wird in vacuo eingeengt und das Produkt durch Zugabe von Diethylether ausgefällt. Das erhaltene Rohpeptid wird mehrere Male mit Diethylether gewaschen und getrocknet. Aus 240 mg Peptid-Harz werden so 65 mg Rohpeptid erhalten.

Die Reinigung erfolgte unter Benutzung eines in unabhängiger Synthese hergestellten Standards von GAP-I, dessen korrekte Sequenz durch MS (Massenspektrometrie) und Sequenzanalyse bestätigt war. Im ersten Schritt wurde das deblockierte Rohmaterial mit einer Kationen-Austauscher-HPLC gereinigt (Parcosil PepKat 2 × 10 cm, 300 Å, 7 µ, Flußrate 9 ml/min, 230 nm, Elutionsmittel A=5 mM NaH₂PO₄; B=5 mM NaH₂PO₄ + 1 M NaCl, Gradient: 5%-100% in 60 min), wobei der Hauptpeak entsprechend der Referenzsubstanz bei 28,17 min erscheint. Im zweiten Reinigungsschritt bei gleichzeitiger RP-HPLC zur Entsalzung (Parcosil ProRP C4 2 × 10 cm, 300 Å, 7 µ, Flußrate 7 ml/min, 230 um, Elutionsmittel A=0,1% Trifluoressigsäure in Wasser; B=0,1% Trifluoressigsäure in Acetonitril/Wasser 4 : 1, Gradient: 0%-100% B in 60 min). Ausbeute: 6,6 mg (1,5 mmol, 14,8%) wurde ein Peak bei 30,80 min erhalten, der in einer analytischen RP-HPLC mit C18-Material einen scharfen einheitlichen Peak ergibt.

Die Identität des synthetisierten Materials mit der vorgegebenen Primärstruktur von GAP-1 wurde durch MS (Plasmadesorptionsmethode, Bio-Ion, Applied Biosystems) und Gegensequenzierung in einem Gasphasensequenator (Modell 470, Applied Biosystems) nachgewiesen. Die biologische Aktivität des synthetischen GAP-I wurde im Funktionstest durch die cGMP-Generations­ stimulierende Wirkung an T84-Koloncarcinom-Zellen nachgewiesen: dieser zeigte, daß das synthetische Material eine korrekte biologische Aktivität aufweist.

Beispiel 3 Herstellung von biologische aktiven Fragmenten des GAP-I aus nativem und synthetischem GAP-I

Aus dem gesamten GAP-I-Molekül von 94 Aminosäuren wurden durch enzymatische Verdauung verschiedene Fragmente hergestellt, deren biologische Aktivität getestet wurde und überraschenderweise stellte sich heraus, daß alle Fragmente enthaltend den C-Terminus von Position 80 bis Position 94 biologisch aktiv waren. Unter anderem wurden durch Endoprotease-Abbau mit Endoprotease Lys C, Endoprotease Asp N und Endoprotease Gly C folgende biologisch aktiven Fragmente, die auch durch Resynthese geprüft wurden, gewonnen:

Beispiel 4 Biologische Wirkung und Anwendung des GAP-I

Wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde Hämofiltrat chromatographisch aufgearbeitet, wobei GAP-I-enthaltende Fraktionen in allen Reinigungsstufen gefunden wurden. Die gemäß Beispiel 1 gefundenen aktiven Fraktionen in Reinigungsstufe 4 und 7 (Endreinigung) wurden für den folgenden Test als Substanz eingesetzt (Abb. 12). Auf diese Weise konnte aus dem Hämofiltrat in beiden Reinigungsstufen eine Fraktion nachgewiesen werden, die die biologische, cGMP-generierende Wirkung wie GAP-I zeigte. Gleichartige Ergebnisse erzielten wir mittels der synthetischen Molekülformen gemäß Beispiel 2 und 3.

Die Zellen wurden nach Aussaat in 24-Loch-Platten nach Bildung einer konfluenten Zellschicht (nach ca. 4-8 Tagen) verwendet. Die Inkubation erfolgte mit 0,5 ml Zellmedium bei 37 Grad Celsius. Die GAP-I-Peptid enthaltenden Präparate wurden unmittelbar vor Versuchsbeginn mit Zellmedium verdünnt. Im ersten Versuchsansatz wurden 1,5 × 10⁵ Zellen mit GAP-I während 60 min lang inkubiert. Zur Kontrolle wurden Zellen mit Kulturmedium ohne jeglichen Zusatz und mit verschiedenen Konzentrationen an synthetischem GAP-I inkubiert. Die erhaltenen Werte der cGMP-Generation sind als Mittelwerte von Dreifachansätzen ± S.D . . angegeben. Gleichzeitig wurden innerhalb derselben Versuche als Referenzsubstanzen natriuretische Peptide getestet (Abb. 12). Der Zusatz von GAP-I bzw. die Zusammensetzung des Mediums wurde zu Beginn der Inkubation vorgenommen und während der Versuchszeit bleiben die Proben im Inkubator bei 37,5°C.

Die Ergebnisse zeigen, daß signifikante Unterschiede in der Wirksamkeit des GAP-I im Vergleich zu den Kontrollen mit den untersuchten Zellsystem bestehen.

Außerdem besteht eine Dosis abhängige Wirkung. Dieses Ergebnis läßt auf Unterschiede in der Wirkungsweise dieses Peptides schließen, die sich auf den Aktivierungsmechanismus des GAP-I beziehen. Damit ist gezeigt, daß GAP-I die cGMP Generation der T 84-Zellen über einen bereits früher identifizierten Receptor für Endsotoxin beeinflussen muß.

In ähnlicher Weise wurde festgestellt daß auch weitere Zellarten auf GAP-I mehr oder weniger ansprechen, u. a. Belegzellen des Magens, Kryptenzellen des Dünndarms, Schaltzellen der Pankreasgänge und Leber, die unter Verwendung des GAP-I auch die intracelluläre Ca⁺⁺ Konzentration ändern.

Beispiel 5 Herstellung und Anwendung von segmentspezifischen Antikörpern zum humanen GAP-I

Zur Herstellung von Antikörpern wurden als Antigene zwei Peptide gewählt, die zum Teil überlappenden Sequenzen aus dem Aminoterminus des GAP-I Moleküls entsprechen. Weitere Antikörper wurden gegen C-terminale Sequenzen nach Beispiel 3 produziert.

Sequenz 1: Gln-Asp-Gly-Asn-Phe-Ser-Phe-Ser-Leu-Glu-Ser-Val-Lys
Sequenz 2: Glu-Ser-Val-Lys-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-Gln-Glu-Pro-Gln

Die Peptide wurden als MAP′s ("Multiple Antigenic Peptides") synthetisiert. Bei dieser Methode macht man sich die Trifunktionalität der Aminosäure Lysin zunutze und verwendet die beiden Aminogruppen eines gebundenen Lysins zur weiteren Peptidbindung. Mit der Kopplung weiterer Lysine verdoppeln sich die so verfügbaren Aminogruppen nach jedem Zyklus. Nach drei Kopplungsschritten erhält man ein aus sieben Aminosäuren bestehendes Lysingerüst, an dessen acht freien Aminogruppen jeweils sukzessive die folgenden Aminosäuren der beiden GAP-I Teilsequenzen gebunden wurden. Durch diese Kopplung an ein Lysingerüst wurden die beiden Peptide in achtfacher Kopie an einem einzigen Molekül erhalten.

Zur Herstellung von Amiseren wurden pro Peptid jeweils drei Kaninchen mit Antigenmengen von 1.0 mg (Erstimmunisierung) und 0.5 mg (Nachimmunisierung) geimpft. Die in 0.9% NaCl gelösten Peptide wurden dabei zur unspezifischen Aktivierung des Immunsystems im Verhältnis 1 : 2 mit kompletten Freud′schem Adjuvants (Erstimmunisierung) bzw. mit inkompletten Freud′schem Adjuvans (Nachimmunisierung) versetzt. Die Impfung erfolgte intradermal in den Rücken, im Abstand von 4 Wochen.

Zur Gewinnung der Antiseren wurden 10 ml Blut pro Tier an einer lateralen Ohrvene abgenommen. Das Blut wurde zur Gerinnung 4 Stunden bei -4 Grad Celsius stehengelassen und danach bei 2500 × g bei 4 Grad Celsius über 15 Minuten zentrifugiert. Die Seren wurden bei -20 Grad Celsius aufbewahrt. Die Nullseren wurden unmittelbar vor der Erstimmunisierung entnommen, die Antiseren im wöchentlichen Abstand. Die Reaktion der Antikörper in den Immunseren wurde mit der ELISA-Methode und im Western-Blot (nach SDS- Polyakrylamid Gelelektrophorese der bioaktiven, GAP-I enthaltenden Hämofiltrat Fraktionen) überprüft.

Mit Hilfe der positiven Antiseren wurden nach etablierten Methode zwei spezifische Radioimmunoassays zur Quantifizierung von immunreaktivem GAP-I in biologischen Flüssigkeiten aufgebaut.

Als Tracer wurden die folgenden Peptide benutzt:

Peptid 1: 125Iod-Tyr Gln-Asp-Gly-Asn-Phe-Ser-Phe-Ser-Leu-Glu-Ser-Val-Lys
Peptid 2: 125Iod-TyrGlu-Ser-Val-Lys-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-Gln-Glu-Pro-Gln

Als Eichsubstanzen wurden die folgenden linearen Peptide eingesetzt:

Peptid 1: Gln-Asp-Gly-Asn-Phe-Ser-Phe-Ser-Leu-Glu-Ser-Val-Lys
Peptid 2: Glu-Ser-Val-Lys-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-Gln-Glu-Pro-Gln

Die Tests mit den Antikörpern im RIA bestätigen, daß GAP-I im Blut meßbar ist. Damit können diese als diagnostisches Verfahren herangezogen werden. Mit C-terminalen Antikörpern wird analog verfahren und überraschenderweise erhalten wir teils gleichartige, teils verschiedene Ergebnisse.

Claims (14)

1. GAP-I mit der Aminosäurensequenz sowie seine natürlichen und pharmakologisch verträglichen Derivate, insbesondere amidierte, acetylierte, phosphorylierte und glycosylierte GAP-I- Derivate. Weiterhin natürliche und künstliche Fragmente mit biologischer Wirkung, die aus der Aminosäurensequenz abgeleitet werden.

2. Verfahren zur Herstellung des GAP-I oder seiner Derivate und seiner Fragmente nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß dieses über eine prokaryontische oder eine enkaryontische Expression hergestellt und chromatographisch gereinigt wird.

3. Verfahren zur Herstellung des GAP-I oder seiner Derivate und seiner Fragmente nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man es aus menschlichem Blut über übliche Chromatographie-Verfahren in bekannter Weise isoliert.

4. Verfahren zur Herstellung des GAP-I oder seiner Derivate und seiner Fragmente nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das GAP-I oder seine Derivate durch die üblichen Verfahren der Festphasen- und Flüssigphasen- Synthese aus den geschützten Aminosäuren, die in der ausgegebenen Sequenz enthalten sind, herstellt, deblockiert und es mit den gängigen Chromatographie- Verfahren reinigt.

5. Arzneimittel, enthaltend das humane, zirkulierende GAP-I oder seiner Derivate und seiner Fragmente nach Anspruch 1 oder hergestellt nach Ansprüchen 2 bis 4, das GAP-I als aktiven Wirkstoff neben üblichen Hilfs- und Zusatzstoffen.

6. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 5 zur Behandlung von Erkrankungen, die bei Funktionsstörungen des Elektrolyt-Wasser-Haushaltes auftreten (Nieren- und Darmerkrankungen).

7. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 5 zur Behandlung von Erkrankungen des menschlichen Organismus, insbesondere mit Beteiligung des Magen-Darm-Traktes, der Atemwege und des Urogenitalapparates.

8. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 5 zur Behandlung von Erkrankungen des menschlichen Organismus, insbesondere mit Beteiligung des Herzkreislauf- und Nervensystems.

9. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 5 zur Behandlung von Erkrankungen des menschlichen Organismus, insbesondere mit Beteiligung des Intugementes und der Sinnesorgane.

10. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 5 zur Behandlung von Systemerkrankungen bei Überproduktion oder Mangel von GAP-I, insbesondere bei z. B. durch Anwendung gegen dieses gebildete Amikörper oder zur Verwendung von GAP-I zur Substitutionstherapie.

11. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 5 zur Behandlung von chronischen Erkrankungen, teils vergesellschaftet mit Erkrankungen gemäß Ansprüchen 6 bis 10, indem es in geeigneter Form für die Behandlung für die Elektrolytwirkung bei Erkrankungen auf den Knochenumbau (Osteoporose) oder am Zahnapparat benutzt wird.

12. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 5 zur Behandlung von akuten Erkrankungen, gemäß Ansprüchen 6 bis 12, indem es in geeigneter Form für die Behandlung in der Intensivpflege dieser Erkrankungen benutzt wird.

13. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 5 zur Diagnose von Erkrankungen, insbesondere nach irgendeinem der Ansprüche 6 bis 12, indem spezifische Antikörper gegen das synthetische Peptid oder seiner Derivate und seiner Fragmente hergestellt werden und die Blutkonzentration GAP-I über Immuntests gemessen wird.

14. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 5 in verschiedenen galenischen Applikationsformen, insbesondere der lyophilisierten, mit Mannit aufgenommenen Form in sterilen Ampullen zur Auflösung in physiologischer Kochsalzlösung und/oder Infusionslösungen zur wiederholten Einzelinjektion und/oder Dauerinfusion in Mengen von 300 Mikrogramm bis 30 Milligramm reines GAP-I pro Therapie-Einheit.