WO1995003410A2 - Ein für guanylatcyclase activating peptide i (gcap-i) kodierendes gen - Google Patents

Ein für guanylatcyclase activating peptide i (gcap-i) kodierendes gen Download PDF

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WO1995003410A2
WO1995003410A2 PCT/EP1994/002391 EP9402391W WO9503410A2 WO 1995003410 A2 WO1995003410 A2 WO 1995003410A2 EP 9402391 W EP9402391 W EP 9402391W WO 9503410 A2 WO9503410 A2 WO 9503410A2
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Wolf-Georg Forssmann
Oliver Hill
Hans-Dieter Zucht
Michaela Kuhn
Hans-Jürgen MÄGERT
Knut Adermann
Manfred Raida
Peter Schulz-Knappe
Andreas Pardigol
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Forssmann Wolf Georg
Oliver Hill
Zucht Hans Dieter
Michaela Kuhn
Maegert Hans Juergen
Knut Adermann
Manfred Raida
Schulz Knappe Peter
Andreas Pardigol
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • GCAP-I guanylate cyclase Activating Peptide I
  • the invention relates to a gene coding for guanylate cyclase activating peptides I (GCAP-I), the GCAP-I peptide itself and its preparation and use in therapy, pharmacy and diagnostics.
  • GCAP-I guanylate cyclase activating peptides I
  • the substance GCAP-I was first obtained from the Hämofiltrat Nieren ⁇ ill after ultrafiltration at the hemodialysis apparatus and functionally characterized by a bioassay of the stimulation of guanylate cyclase C of intestinal cells (T84 cell line).
  • T84 cell line guanylate cyclase C of intestinal cells
  • a method described in DE 36 33 707 AI was refined, which was invented for the recovery of protein from hemofiltrate. From the molecules obtained with this method from a molecular weight of less than 20 kDalton, which are filtered off in veno-venous or arterio-venous shunt connection, the fractions containing the GCAP-I can be detected by aforensics ⁇ test.
  • GCAP-I can be obtained by chemical synthesis and by genetic engineering and surprisingly can be used for numerous other concerns, including as pathognomic diagnostic feature of diseases of the gastrointestinal and genitourinary tract, for analysis in human blood and the respiratory tract, cardiovascular System and the nervous system.
  • the present invention relates to a gene encoding Guany ⁇ latcyclase activating peptide GCAP-I according to claims 1 to 5.
  • the isolation of the gene and elucidation of the nucleic acid sequence of the peptide coding for the peptide GCAP-I regions and 5 'flanking gene segments were made by mole ⁇ kularbiologische methods, which are described below.
  • the human gene has the structure shown schematically below:
  • Phage 35 phage The gene was used from recombinant phage lambda pHG35 ver ⁇ . This was isolated from a commercially available human gene bank of the company Stratagene. Fragments pHG35-9 / pHG35-6-3 and pHG35-5-17 were isolated. The sequence of these fragments is shown in Figure 18 and Figure 19 (pHG35-5-17).
  • the present invention also relates to the peptide GCAP-I (guanylate cyclase activating peptides) as an expression product of the gene of the invention, its preparation, this peptide-containing drug and its use.
  • GCAP-I guanylate cyclase activating peptides
  • GCAP-I is a biologically active molecule in the plasma of healthy and diseased humans. This became a molecule whose structure was previously unknown and whose educational site is still unclarified in the body. The therapeutic and economical use was tested and the GCAP-I was surprisingly recognized as an important circulating peptide of human blood.
  • the present invention thus relates to:
  • the present invention provides a novel peptide, the GCAP-I, which can be used as a readily available drug with biological and therapeutic activity as a natural analogue of the blood-borne substance.
  • the present invention further describes a preparation method for GCAP-I and its use as Medicaments for various therapeutic and diag nostic indications.
  • the GCAP-I can be used as a highly purified substance or - if sufficient for the particular use - within a partially purified peptide mixture.
  • the present invention further relates to various processes for the preparation of this GCAP-I or its derivatives, characterized in that it is prepared via a prokaryotic or a eukaryotic expression and chromatographically purified and a further process for the preparation of the GCAP-I related molecules or the derivatives of GCAP-I, by isolating it from human blood Chromato ⁇ graphy method in a conventional manner, and finally a method for producing the GCAP-I or its derivatives by passing the GCAP-I molecules by the usual Solid-phase and liquid-phase synthesis methods are prepared from the protected amino acids contained in the specified sequence, deblocked and purified by the usual chromatography method (Example 2).
  • the GCAP-I molecules were chemically synthesized (see Example 2) and prepared as pharmaceuticals. Also, the gen ⁇ technological production via conventional vectors is er ⁇ works: by genetic engineering, the GCAP-I peptide both (1) in pro- and (2) produced in eukaryotic organisms.
  • expression vectors for secretory expression eg pSP6, pRit derivatives, Pharmacia
  • direct cytoplasmic expression eg pKK derivatives, Pharmacia
  • pMC1871, Pharmacia for direct cytoplasmic expression as a fusion protein
  • various organisms and vectors have been used, e.g. Insect cells (Summers and Smith, Tex. Agric. Exp. Stn.
  • the expressed peptides of the GCAP-I family can be purified by methods of chromatography, preferably as indicated in Example 1.
  • the pharmaceutical preparation contains GCAP-I or a physiologically acceptable salt of GCAP-I.
  • the form and composition of the medicament containing the GCAP-I depends on the mode of administration. Human GCAP-I can be administered parenterally, intranasally, orally and by inhalation.
  • GCAP-I is formulated into an injection preparation, either as a solution or as a lyophilizate, for dissolution immediately before use.
  • the medicament preparation may also contain auxiliaries which are dependent on the filling technique, contribute to the solubility, stability or sterility of the medicament or increase the efficiency of uptake into the body.
  • the daily dose to be administered for GCAP-I depends on the indication and use of certain derivatives. At i.v./i.m. Injection is in the range of 100 to 1200 units ( ⁇ g) / day, with daily subcutaneous injection preferably 300 to 2400 units ( ⁇ g) / day.
  • Determination of biological activity for GCAP-I is based on measurements against international and in-house reference preparations for human GCAP-I or its analogs in a common biological assay procedure for the same.
  • a standardized cGMP generation test with T84 cells is preferably used (Example 4).
  • the peptide GCAP-I according to the invention or an antagonist / fragment obtained therefrom is also particularly suitable for long-term therapy in diarrheal diseases, since they have excellent biological activity and, on the other hand, do not trigger an immune reaction even during prolonged treatment. Because of its biological effect, the preparation according to the invention can also be used as an agent for the treatment of kidney diseases, heart diseases, in intensive care and in lung diseases.
  • the preparation according to the invention can furthermore be used as an agent for therapy and diagnosis in the case of metabolic diseases of the gastrointestinal tract (in particular the small intestine and pancreas), the respiratory tract, the cardiovascular system and the urogenital apparatus as well as of the nervous system, since it is suitable for the production of human-compatible Antibodies can be used (see Example 5), which are suitable to detect or influence changes in the metabolic position of these organs.
  • the gene belonging to GCAP-I has been analyzed by molecular biological techniques and can thus be used as a prerequisite for diagnostic and therapeutic application.
  • the gene according to the invention of the peptide GCAP-I according to the invention contains a gene regulation system controlled by glucocorticoids. It is possible to derive therapeutic principles from the genomic sequence for diseases of the gastrointestinal tract, the nervous system, the urogenital system, the respiratory tract, the locomotor system, the skin and its appendic glands and the cardiovascular system (see Example 6).
  • the genomic sequence is also suitable for the generation of vectors for gene expression.
  • FIG. 1 The invention will now be elucidated by way of examples and the following figures, which are referred to in the examples.
  • T84 cells are modified in a 1: 1 (vol: vol) mixture of urinary F12 medium (Gibco, Eggenstein, FRG) and Eagle's medium modified to Dulbecco (DMEM) (Gibco, Eggenstein, FRG).
  • the medium is supplemented with 10% fetal calf serum (FCS, Gibco, Eggenstein, FRG), 50 U / ml penicillin and 50 ⁇ g / ml streptomycin.
  • FCS fetal calf serum
  • FCS Gibco, Eggenstein, FRG
  • penicillin 50 ⁇ g / ml streptomycin.
  • the cells in the culture plates (Nunc, Wiesbaden, FRG, 24-well plates) are grown to confluency. In the experiment, the cells are 60 min.
  • the figure shows the formation of cGMP in all fractions of purification stage 1 of the hemofiltrate-alginic acid extract in comparison to stimulation of the T84 cells by various concentrations of the heat-stable enterotoxin (E 5763, Sigma-Chemie, Deisenhofen, FRG).
  • Analytical RP-chromatography II of the separation of the cGMP-generating fractions from the analytical RP-chromatography I according to FIG. 5.
  • hatched area of the peak at 42 to 52 minutes of retention time or 46 to 48% of solvent B are those through the cGMP -Generations- test certain, further purified GCAP-I fractions.
  • the hatched area at 50 minutes of retention time or 65% of solvent B is determined by the cGMP generation test. Further purified GCAP-I fraction.
  • GCAP-I guanylin
  • CDD / ANP-99-126 heat-stable enterotoxin
  • CDD / ANP-95-126 urodilatin
  • FIG. 14 Illustration of the isolation of a phage clone in the third post-screening of the genomic phage library.
  • the arrow marks the phage clone 35; this was applied to the plate in a serial dilution and visualized in a Southern hybridization.
  • FIG. 14 Illustration of the isolation of a phage clone in the third post-screening of the genomic phage library.
  • the arrow marks the phage clone 35; this was applied to the plate in a serial dilution and visualized in a Southern hybridization.
  • FIG. 14 Illustration of the isolation of a phage clone in the third post-screening of the genomic phage library.
  • the arrow marks the phage clone 35; this was applied to the plate in a serial dilution and visualized in a Southern hybridization.
  • FIG. 14 Illustration of the isolation of a phage clone in the third post-screening of the genomic phage library.
  • the above figure shows a gel electrophoretic separation of fragments of the GCAP35-4 plasmid in a 1% agarose gel after degradation with various restriction endonucleases.
  • 0.5 ⁇ g of DNA was applied per lane in each case.
  • the DNA was stained with ethidium bromide and the gel image digitized in translucent UV light with a video camera (System Bioprofil Fa. Fröbel, Laboratory Technology).
  • the individual lanes are numbered at the bottom of the gel.
  • genomic sequence of the human GCAP-I gene in its nucleotide sequence Result of the genomic sequence of the human GCAP-I gene in its nucleotide sequence.
  • the numbering of the nucleotide sequence refers to the translation start.
  • GCAP-I Organization of the human GCAP-I gene.
  • the organization derived from the genomic sequence of the GCAP-I gene is shown schematically.
  • the dissected nucleotide sequence shows the promoter system. Further, exon 1, intron 1, exon 2, intron 2, exon 3 and the 3 'non-annotated region are shown schematically.
  • Figure 18 shows the nucleotide sequence of the insert pHG35-9 / pHG35-6-3 of the gene of the invention. In the sequence the most important eye-catching motifs are highlighted. With solid arrows above the sequences, the inverted repeats (IR 1-10) are marked. The dashed arrows above the inverted repeats identify the direct repeats identified by computer analysis. Note the symmetry of the distances between the described sequence motifs. showy is the location of the inverted repeats within the direct repeats.
  • Figure 19 shows the nucleotide sequence of the insert pHG35-5-17.
  • the sequence identifies the main sequence motifs identified by computer analysis. Based on the sequence comparison with the T7 promoter of the polylinker phage pHG35, the unique localization of this fragment within the total insertion of phage pHG35 was possible.
  • the sequence of the phage polylinker shown in FIG. 20 is printed in bold in the listed sequence and underlined. In addition, it is homologous to Alu-repetitive sequences homologous area indicated by dashed arrows.
  • Figure 20 shows the construction of the phage polylinker.
  • the T7 promoter sequence of the phage polylinker and the S.AL-I site could be identified in the sequence of the SstI fragment 35-5-17.
  • another SstI fragment, the pHG35-6-3 fragment could be determined from the phage pHG35. These represent the 5 'flanking region of human guanylin gene.
  • the order and orientation of these fragments to the 5 '-terminal promoter region of guanylingene could be determined. A total of 2,000 base pairs of 5'-flanking sequence information were determined.
  • the starting material used was hemofiltrate, which is obtained in large quantities in the treatment of patients with kidney failure and contains all plasma components up to a molecular size of about 20,000 daltons.
  • the hemofiltrate was obtained by means of a hemofiltration plant from Sartorius using cellulose triacetate filters with an exclusion size of 20,000 daltons (type SM 40042, Sartorius, Göttingen, FRG).
  • the filtrate was from kidney-deficient patients who were in a stable metabolic state by long-term hemofiltration.
  • 720 1 of hemofiltrate were recovered and protected immediately after recovery by acidification and cooling to 4 ° C against proteolytic degradation.
  • a crude peptide fraction (about 46.5 g) was obtained by alginic acid extraction according to the method of Forssmann, DE 36 33 797 A1. Of these, 6.5 grams were further processed in a first purification, which is described below. 2.
  • step 1 desalting and fractionation of the crude peptide material were performed over RP-C4 solid phase (step 1) ( Figure 2). This was followed by a preparative large-scale RP chromatography II of the bioactive fractions (FIG. 3).
  • a semi-preparative reverse-phase chromatography (FIG. 4) was used.
  • the bioactive GCAP-I-containing pool was concentrated by evaporation in a vacuum to about 50% of the initial volume to remove especially the organic solvent components.
  • the GCAP-I-containing material was further purified by analytical RP-chromatography I as reverse-phase (RP) chromatography, as detailed in FIG.
  • the biological activity appears in the range of a larger peak with a retention time of 75 to 78 minutes.
  • the bioactive fractions from 3 identical runs were pooled and lyophilized and prepared for the next purification steps.
  • the last three purification steps (FIGS. 6 to 8) were carried out on an analytical Microbore HPLC-RP-C18 column using different runners.
  • the desired cGMP-activating peptide (GCAP-I) was to be detected in a single fraction (see FIG. 8).
  • the degree of purity of the isolated substance could already be given as> 95% with the aid of a diode array system during the final isolation chromatogram.
  • This fraction was tested in a bioassay, sequenced, assayed for amino acid content, analyzed in the mass spectrometer (FIG. 10) and tested for purity by means of capillary zone electrophoresis (CE) (see below). Further, the overall structure of the amino acid sequence was elucidated due to the sequencing of single fragments after Lys-C and Asp-N endoprotease degradation ( Figure 9). 3. Sequence analytical determination of the primary structure of the GCAP-I.
  • the final product of the purification was tested for its purity by means of capillary zone electrophoresis. This method is suitable for contamination in the prove lower picogram and gives a eben ⁇ if high-resolution reproducibility in the representation of a particular peptide.
  • GCAP-I human guanylate cyclase-activating peptide I
  • the Fmoc amino acid anhydride (5 equivalents) was dissolved in a minimum volume of N, N-dimethylformamide (DMF) and added to the hydroxymethylphenoxyacetyl-norleucine resin in a round bottom flask.
  • 4-Dimethylaminopyridine (1 equivalent) was also dissolved in a minimum volume DMF and placed in the Given round bottom flask. After 1 hour reaction time, the excess of the reagents was removed by filtration and the resin was washed thoroughly on a filter.
  • the peptide was cleaved from the carrier resin by addition of a mixture of trifluoroacetic anisole-ethanidithiol-phenol 94: 2: 2: 2 (v / v / v / w) and precipitated with ether.
  • the HPLC-purified peptide was characterized by amino acid analyzes, analytical HPLC and amino acid sequence analysis.
  • Asparagine and glutamic acid were used as N-tert-butyl ester, tyrosine and serine as t-butyl ether, histidine and lysine as Nw-Boc compounds and Arg as NG-2, 2, 5, 7, 8-pentamethylchroman-6 sulfonyl (Pmc) derivative used.
  • the synthesis was carried out starting from the kieselguhr resin Fmoc-Leu-Pepsyn KA (MilliGen / Biosearch), ie with a carrier-bound C-terminal amino acid (0.091 meq Leu / g, 1.60 g).
  • Fmoc-Arg (Pmc) -OH was performed in the presence of O- (1H-benzotriazol-1-yl) -N, N, N ', N'-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TBTU), 1-hydroxybenzotriazole and Diisopropyl ethylamine performed.
  • the following synthetic cycle was used: Fmoc cleavage with 20% piperidine in DMF (7 min), washing with DMF (12 min), acylation (30 min, Fmoc-Val OPfp 45 min) and washing with DMF (8 min). The progressive synthesis was followed by continuous UV detection. The synthesis was completed with the cleavage of the N-terminal Fmoc residue.
  • the resin-bound peptide was washed three times with 50 ml each of isopropanol, glacial acetic acid, isopropanol and diethyl ether and dried.
  • the cleavage from the resin was carried out with trifluoroacetic acid / phenol / Et handithiol / thioanisole / water 10: 0.75: 0.25: 0.5: 0.5 (v / w / v / v / v, 5 ml).
  • the solution is concentrated in vacuo and the product is precipitated by the addition of diethyl ether.
  • the crude peptide obtained is washed several times with diethyl ether and dried. From 240 mg of peptide-resin thus obtained 65 mg of crude peptide.
  • the cells were used after seeding in 24-well plates after formation of a confluent cell layer (after about 4 to 8 days).
  • the incubation was carried out with 0.5 ml of cell medium at 37 ° C.
  • the preparations containing GCAP-I peptide were dissolved in the cell medium immediately before the start of the experiment.
  • 1.5 ⁇ 10 s cells were incubated with GCAP-I for 60 min.
  • As a control cells were incubated with culture medium without any addition and with various concentrations of synthetic GCAP-I.
  • the values obtained for the cGMP generation are given as mean values of triplicate ⁇ SD.
  • natriuretic peptides were tested as reference substances within the same experiments (FIG. 12).
  • the addition of GCAP-I or the composition of the medium was carried out at the beginning of the incubation and during the test period the samples remain in the incubator at 37.5.degree.
  • two peptides were selected as antigens which correspond in part to overlapping sequences from the amino terminus of the GCAP-I molecule. Further antibodies were produced against C-terminal sequences according to example 3.
  • Lys Sequence 2 Glu-Ser-Val-Lys-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-Gln-Glu-Pro
  • the peptides were synthesized as MAP's ("Multiple Antigenic Peptides") (Pasmett, McGrath, Journal of Biol. Chem. 263 (4), 1719, 1988).
  • This method makes use of the trifunctionality of the amino acid lysine and uses the two amino groups of a bound lysine to further peptide bond. With the coupling of other lysines, the available amino groups double after each cycle. After three coupling steps, one obtains a lysine scaffold consisting of seven amino acids, to whose eight free amino groups the successive amino acids of the two GCAP-I partial sequences were successively bound. Through this coupling to a lysine backbone, the two peptides were obtained in eight copies on a single molecule.
  • antisera For the production of antisera, three rabbits were inoculated per peptide with antigen amounts of 1.0 mg (initial immunization) and 0.5 mg (subsequent immunization). The in 0.9% NaCl dissolved peptides were added for nonspecific activation of the immune system in a ratio of 1: 2 with complete Freund's adjuvant (first immunization) or with Freund's complete Freund's adjuvant (subsequent immunization). The vaccination was carried out at intervals of 4 weeks intradermally in the back.
  • the antisera 10 ml of blood per animal were taken from a lateral ear vein. The blood was allowed to clot for 4 hours at 4 ° C and then centrifuged at 2,500 x g at 4 ° C for 15 minutes. The sera are stored at -20 ° C. The null sera were taken immediately before the first immunization, the antisera at weekly intervals. The reaction of the antibodies in the immune sera was examined by the ELISA method and in the Western blot (after SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of the bioactive GCAP-I containing hemofiltrate fractions.
  • Peptide 1 125 J-Tyr-Gln-Asp-Gly-Asn-Phe-Ser-Phe-Ser-Leu-Glu
  • Peptide 2 125 J-Tyr-Glu-Ser-Val-Lys-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-Gln-
  • Peptide 1 Gln-Asp-Gly-Asn-Phe-Ser-Phe-Ser-Leu-Glu-Ser-Val-Lys
  • Peptide 2 Glu-Ser-Val-Lys-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-Gln Glu-Pro-Gln
  • the isolation of the gene according to the invention was carried out by screening a genomic phage library. It was necessary to prepare a specific hybridization probe as described below.
  • rat duodenal tissue was isolated and the messenger ribonucleic acid contained therein isolated. From this, so-called first-strand-copy DNA was produced via a "reverse transcriptase" reaction.
  • a degenerate PCR primer was constructed (GY 1, CCNAAYACNTGYGARATHTGYGC). With this primer and with oligo (dT) as a counter primer, a cDNA fragment from first strand cDNA was amplified using the polymerase chain reaction (Maegert, HJ et al., X67669, see EMBL Data Library). The amplification conditions in the PCR reaction were as follows:
  • PCR fragment thus obtained was purified by gel electrophoresis in NuSieve GTG agarose (Biozyme) and then isolated from the agarose by Membran ⁇ filtration cartridges (Millipore 0.45 micrometer Duraporemem bran and PTTK polysulfone membrane) by the appropriate DNA band was prepared with the gel and by fractional filtration according to the manufacturer (Millipore, Bedorf, MA, USA) was centrifuged in the cartridges.
  • the isolated cDNA fragment was labeled with a 32 PdCTP (random primed labeling kit from Boehringer, Mannheim).
  • the human gene bank (La bda Fix TM, Strategene, LaJolla, CA, USA) was plated according to the manufacturer's instructions.
  • This bank is a pool of modified lambda bacteriophages (bacterial viruses), each of which has inherited a portion of the human genome.
  • a ge ⁇ nomic equivalent which corresponds to about 400,000 phages, was plated and searched by means of a so-called. Plaque hybridmaschinestest the phage clone, which had inserted the human GCAP-I gene ( Figure 13).
  • the phage DNA was transferred to a nylon filter with the aid of a filter pad
  • phage could be isolated (term clone 35 and clone 43).
  • the phage DNA was isolated by means of a cesium chloride density gradient centrifugation method and an initial characterization of the insertion was carried out by means of restriction endonuclease digestion with subsequent agarose gel electrophoresis.
  • the cleavage pattern of these two clones was very similar and gave, after degradation of the DNA with the restriction enzyme SstI, nine bands for the clone "35" and eight bands for the clone "43".
  • the bands were transferred out of the agarose gel onto a nylon filter using the Southern blot technique, and then again hybridized with the cDNA fragment used to enrich the phage clones.
  • Two clones from clone "35" were identified which gave a particularly strong hybridization signal, hereinafter called 35-4 (band number 4, 4,000 bases in size) and 35-9 (band number 9, 500 bases in size).
  • Both the 4 kilobase and the 0.5 kb fragment were purified by gel electrophoresis, similar to the method described for the preparation of the cDNA fragment, prepared by means of membrane filtration from the GTG agarose gel and subsequently into the Sst I-cut plasmid pBluescript einkloniert and transformed Escherichia coli (strain XL-1 blue) with it.
  • the following is the plasmid with the 4 kb insertion as GCAP35-4, which is designated with the 0.5 kb insertion as GCAP35-9. Sequencing of the plasmid GCAP35-4
  • the complementary strand was sequenced with specific synthetic oligonucleotides derived from the sequence information (so-called primer walking).

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Abstract

Gen kodierend für Guanylatcyclase Activating Peptide-I (GCAP-I).

Description

Ein für Guanylatcyclase Activating Peptide I (GCAP-I) kodierendes Gen
Die Erfindung betrifft ein für Guanylatcyclase Activating Peptide I (GCAP-I) kodierendes Gen, das GCAP-I Peptid selbst sowie dessen Herstellung und Einsatz in Therapie, Pharmazie und Diagnostik.
Der Stoff GCAP-I wurde erstmals aus dem Hämofiltrat Nieren¬ kranker nach Ultrafiltration am Hämodialyseapparat gewonnen und über einen Biotest der Stimulation der Guanylatcyclase-C von Darmzellen (T84-Zell-Linie) funktioneil charakterisiert. Zur Darstellung des GCAP-I wurde ein in der DE 36 33 707 AI beschriebenes Verfahren verfeinert, welches für die Gewinnung von Eiweißstoffen aus Hämofiltrat erfunden wurde. Aus den mit diesem Verfahren gewonnenen Molekülen von einem Mole¬ kulargewicht unter 20 kDalton, die bei veno-venöser oder arterio-venöser Shuntverbindung abfiltriert werden, können die das GCAP-I enthaltenden Fraktionen durch einen Funktions¬ test erkannt werden. Das an sich bekannte Verfahren wurde benutzt, um die Rohpeptidextrakte zu gewinnen, mit denen überraschenderweise bei der Verwendung an T8 -Kolonkarzinom- zellen in Zellkultur ein starker Effekt bemerkt wurde, in dem die Generierung des Second Messengers cGMP unter dem Einfluß dieser Substanz stark aktiviert wurde. Es wurde weiter festgestellt, daß bei speziellen weiteren Auf- reinigungsverfahren diese biologische Aktivität konzentriert werden konnte, bis schließlich ein einheitlicher Eiweißstoff identifiziert wurde, dessen Struktur aufgeklärt werden konnte. Der Wert dieser Erfindung ergibt sich unter anderem daraus, daß dieser Stoff aus dem bisher als wertlos be¬ trachteten Hämofiltrat aufgereinigt werden kann, um als wirtschaftlich verwertbare Substanz benutzt zu werden. GCAP-I ist durch chemische Synthese und durch gentechnologische Produktion gewinnbar und kann überraschenderweise für zahl¬ reiche weitere Belange genutzt werden, unter anderem als pathognomonisches Diagnosemerkmal von Erkrankungen des Magen- Darm- und Urogenitaltraktes, für die Analyse im menschlichen Blut sowie des Respirationstraktes, kardiovaskulären Systems und des Nervenapparates.
Vorliegende Erfindung betrifft ein Gen kodierend für Guany¬ latcyclase Activating Peptid GCAP-I gemäß den Ansprüchen 1 bis 5. Die Isolierung des Gens und Aufklärung der Nuclein- säuresequenz der für das Peptid GCAP-I kodierenden Regionen sowie 5' -flankierende Genabschnitte erfolgten durch mole¬ kularbiologische Methoden, die weiter unten beschrieben werden.
Insbesondere das humane Gen weist die nachfolgend schematisch dargestellt Struktur auf:
Polylinker Polylinker
Figure imgf000004_0001
Gesamtinsertion des Phagen phHG 35 Das Gen wurde aus rekombinanten Phagen Lambda-pHG35 ver¬ wendet. Diese wurde aus eine kommerziell erhältlichen humanen Genbank der Firma Stratagene isoliert. Es wurden die Frag¬ mente pHG35-9 / pHG35-6-3 sowie pHG35-5-17 isoliert. Die Sequenz dieser Fragmente ist in Figur 18 und Figur 19 (pHG35-5-17) wiedergegeben.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch das Peptid GCAP-I (Guanylatcyclase Activating Peptide) als Expressionsprodukt des erfindungsgemäßen Gens, seine Herstellung, dieses Peptid enthaltende Arzneimittel sowie dessen Verwendung.
In jüngster Zeit hat sich zunehmend gezeigt, daß Stoffe für die Regulation der Funktion des Magendarmtraktes diagnostisch und therapeutisch von großem Interesse sind und daß wahr¬ scheinlich noch eine große Zahl unbekannter Faktoren existie¬ ren, die von klinisch verwertbarer Bedeutung sind. Dazu könnten auch Faktoren gehören, die sowohl bei der Behandlung von Verdauungs-, Kreislauf- und Atemwegserkrankungen als auch bei der Hormonsubstitution bei vielen Erkrankungen durch regelmäßige Gabe über einen langen Zeitraum, gegebenenfalls lebenslang, verabreicht werden könnten, um diese Krankheits- vorgänge im positiven Sinne zu steuern.
In einigen Arbeiten (Guarino, Cohen, Thompson, Dharmsatha- phorn and Giannella, Am. J. Physiol. 253: G775 - G780, 1987) wurde nun nachgewiesen, daß bestimmte Zeil-Linien aus Epithelien des Magendarmtraktes (z. B. T84-Zellen des Dick¬ darms, menschliche Kolonkarzinomzellen) durch bereits be¬ kannte Peptide, die aus Bakterien abgegeben werden (hitze¬ stabile Enterotoxine) über Membranrezeptoren spezifisch beeinflußt werden.
Bei der Suche nach der Existenz weiterer auf diese Weise charakterisierbarer Wirkstoffe wurde nun überraschenderweise das GCAP-I als biologisch aktives Molekül im Plasma gesunder und kranker Menschen gefunden. Damit wurde ein Molekül entdeckt, dessen Struktur bisher unbekannt war und dessen Bildungsstätte im Körper noch ungeklärt ist. Die thera¬ peutische und wirtschaftliche Verwendung wurde geprüft und das GCAP-I wurde überraschenderweise als wichtiges zirku¬ lierendes Peptid des menschlichen Blutes erkannt.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit:
Ein Blutpeptid GCAP-I mit der Aminosäuresequenz
Val-Thr-Val-Gln-Asp-Gly-Asn-Phe-Ser-Phe-Ser-Leu-Glu-
Ser-Val-Lys-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-Gln-Glu-Pro-Gln-
Glu-Pro-Arg-Val-Gly-Lys-Leu-Arg-Asn-Phe-Ala-Pro-Ile-
Pro-Gly-Glu-Pro-Val-Val-Pro-Ile-Leu-Cys-Ser-Asn-Pro-
Asn-Phe-Pro-Glu-Glu-Leu-Lys-Pro-Leu-Cys-Lys-Glu-Pro-
Asn-Ala-Gln-Glu-Ile-Leu-Gln-Arg-Leu-Glu-Glu-Ile-Ala-
Glu-Asp-Pro-Gly-Thr-Cys-Glu-Ile-Cys-Ala-Tyr-Ala-Ala-
Cys-Thr-Gly-Cys
sowie seine natürlichen und pharmakologisch verträglichen Derivate, insbesondere amidierte, acetylierte, phosphory- lierte und glycosylierte GCAP-I Derivate und weitere Frag¬ mente des Peptides. Durch Massenspektrometrie konnte ein Molekulargewicht von 10.336 Dalton festgestellt werden (Beispiel 1) , und durch genomische Analyse der zur CDNA gehörige, weitere Abschnitt der Aminosäuresequenz bestätigt werden, die auch in mehreren Sequenzierungen von Teilstücken nach Endoproteaseabbau erkannt wurden (Beispiel 1) .
Die vorliegende Erfindung stellt ein neues Peptid, das GCAP- I, bereit, das als ein gut zugängliches Arzneimittel mit bio¬ logischer und therapeutischer Aktivität als natürliches Analogon des im Blut vorkommenden Stoffes verwandt werden kann.
Die vorliegende Erfindung beschreibt weiterhin ein Her¬ stellungsverfahren für GCAP-I sowie dessen Anwendung als Arzneimittel für verschiedene therapeutische und diag¬ nostische Indikationen. Dazu kann das GCAP-I als hochreiner Stoff oder - wenn für die bestimmte Verwendung ausreichend - innerhalb eines teilweise aufgereinigten Peptidgemisches verwandt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter verschiedene Verfahren zur Herstellung dieses GCAP-I oder seiner Derivate, dadurch gekennzeichnet, daß dieses über eine prokaryontische oder eine eukaryontische Expression hergestellt und chromato¬ graphisch gereinigt wird sowie ein weiteres Verfahren zur Herstellung der GCAP-I bezogenen Moleküle bzw. der Derivate des GCAP-I, indem man es aus menschlichem Blut über Chromato¬ graphie-Verfahren in an sich bekannter Weise isoliert, und schließlich ein Verfahren zur Herstellung des GCAP-I oder seine Derivate, indem man die GCAP-I Moleküle durch die üblichen Verfahren der Festphasen- und Flüssigphasen-Synthese aus den geschützten Aminosäuren, die in der angegebenen Sequenz enthalten sind, herstellt, deblockiert und es mit den gängigen Chromatographie-Verfahren reinigt (Beispiel 2) .
Die GCAP-I-Moleküle wurden chemisch synthetisiert (vgl. Beispiel 2) und als Arzneimittel zubereitet. Auch die gen¬ technologische Herstellung über übliche Vektoren ist er¬ arbeitet: auf gentechnologischem Wege wird das GCAP-I-Peptid sowohl (1) in pro- als auch (2) in eukaryontisehen Organismen hergestellt. Hierfür werden unter anderem Expressionsvektoren zur sekretorischen Expression (z. B. pSP6, pRit-Derivate, Pharmacia) , zur direkten cytoplasmatischen Expression (z. B. pKK-Derivate, Pharmacia) , zur direkten cytoplasmatischen Expression als Fusionsprotein (pMC1871, Pharmacia) benutzt. Für die eukaryontische Expression wurden verschiedene Organismen und Vektoren eingesetzt, z. B. Insektenzellen (Summers and Smith, Tex. Agric. Exp. Stn. (bull) 1555, 1987) , Hefen (Hitzeman et al. , Nature, 293, 717 - 722, 1981), filamentöse Pilze (Yelton et al. , Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 81, 1470 - 1474, 1984) und Säugerzellen (Zettlmeissl et al., Biotechnology, 5., 720 - 725, 1987) . Vorzugsweise wurden die Insektenzellen benutzt. Die exprimierten Peptide der GCAP-I-Familie können mit Methoden der Chromatographie gereinigt werden, vorzugsweise wie in Beispiel 1 angegeben.
Die ArzneimittelZubereitung enthält GCAP-I oder ein physio¬ logisch verträgliches Salz des GCAP-I. Die Form und Zusammen¬ setzung Arzneimittels, welches das GCAP-I enthält, richtet sich nach der Art der Verabreichung. Humanes GCAP-I kann parenteral, intranasal, oral und mittels Inhalation ver¬ abreicht werden. Vorzugsweise wird GCAP-I zu einem In¬ jektionspräparat, entweder als Lösung oder als Lyophilisat, zur Auflösung unmittelbar vor Gebrauch, konfektioniert. Die ArzneimittelZubereitung kann außerdem Hilfsstoffe enthalten, die abfülltechnisch bedingt sind, einen Beitrag zur Löslich¬ keit, Stabilität oder Sterilität des Arzneimittels leisten oder den Wirkungsgrad der Aufnahme in den Körper erhöhen.
Die zu verabreichende Tagesdosis für GCAP-I hängt von der Indikation und der Anwendung bestimmter Derivate ab. Bei i.v./i.m. Injektion liegt sie im Bereich von 100 bis 1.200 Einheiten (μg) /Tag, bei täglicher subcutaner Injektion vorzugsweise bei 300 bis 2.400 Einheiten (μg)/Tag.
Die Bestimmung der biologischen Aktivität für GCAP-I basiert auf Messungen gegen internationale und hauseigene Referenz- praparationen für humanes GCAP-I oder seiner Analoga in einem gebräuchlichen biologischen Testverfahren für dieselben. Dazu wird vorzugsweise ein standardisierter cGMP Generationstest mit T84-Zellen benutzt (Beispiel 4) .
Das erfindungsgemäße Peptid GCAP-I oder ein dazu gewonnener Antagonist/Fragment (Beispiel 3) eignet sich insbesondere auch für die Langzeit-Therapie bei Durchfallerkrankungen, da sie über eine ausgezeichnete biologische Wirksamkeit verfügen und andererseits auch bei Dauerbehandlung keine Immunreaktion auslösen. Aufgrund seiner biologischen Wirkung kann das erfindungs- gemäße Präparat weiter als Mittel zur Therapie von Nieren¬ erkrankungen, Herzerkrankungen, in der Intensivpflege und bei Lungenerkrankungen angewendet werden.
Das erfindungsgemäße Präparat ist weiter als Mittel zur Therapie und Diagnose bei Stoffwechselerkrankungen des Magen- Darm-Traktes (insbesondere Dünndarm und Bauchspeicheldrüse) , der Atemwege, des Herz-Kreislaufsystems und des Urogenital¬ apparates sowie des Nervensystems einsetzbar, da es zur Herstellung von human verträglichen Antikörpern verwandt werden kann (vgl. Beispiel 5), die geeignet sind, Änderungen der Stoffwechsellage dieser Organe festzustellen oder zu beeinflusse .
Erfindungsgemäß wurde das zu GCAP-I gehörende Gen durch molekularbiologische Techniken analysiert und ist somit als Voraussetzung zur diagnostischen und therapeutischen An¬ wendung verwendbar.
Das erfindungsgemäße Gen des erfindungsgemäßen Peptides GCAP- I enthält ein durch Glucocorticoide gesteuertes Gen¬ regulationssystem. Es ist möglich für Erkrankungen des gastrointestinalen Traktes, des Nervensystems, des Uro¬ genitalsystems, der Atemwege, des lokomotorischen Systems, der Haut und seiner Anhangsdrüsen und des Herz-Kreislauf- Systems aus der genomischen Sequenz therapeutische Prinzipien abzuleiten (siehe Beispiel 6) .
Die genomische Sequenz ist darüber hinaus für die Erstellung von Vektoren zur Genexpression geeignet.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen und den folgenden Figuren, auf die in den Beispielen Bezug genommen wird, erläutert. Figur 1
cGMP-Generationstest zur Feststellung der GCAP-1-Aktivität: Die T84-Zellen werden in einer 1 : 1 (Vol : Vol) Mischung aus Harn' s F12 medium (Gibco, Eggenstein, FRG) und Eagle's Medium modifiziert nach Dulbecco (DMEM) (Gibco, Eggenstein, FRG) gezüchtet. Das Medium ist mit 10 % fetalem Kälberserum (FCS, Gibco, Eggenstein, FRG) , 50 U/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin Supplementiert. Die Zellen in den Kultur¬ platten (Nunc, Wiesbaden, FRG, 24-Lochplatten) werden bis zur Konfluenz gezüchtet. Im Experiment werden die Zellen 60 min. lang mit den Hämofiltratfraktionen der einzelnen Reinigungsschritte, bzw. mit aufgereinigtem oder synthetisch hergestelltem GCAP-I, inkubiert. Nach dieser Inkubationszeit werden die Zeilüberstände dekantiert und das intrazelluläre cGMP der Zellen wird durch Zugabe von eiskaltem 70 %-igem Ethanol extrahiert. Der cGMP-Gehalt der Zellextrakte wird mit Hilfe eines spezifischen Radioimmunoassays bestimmt (Kaever und Resch, Biochem. Biophys. Acta 846: 216 - 225, 1985) . Die GCAP-I enthaltenden Hämofiltratfraktionen (bei¬ spielsweise die Fraktionen der Minuten 78 bis 84 der Chroma¬ tographie in der Reinigungsstufe 1, wie in Figur 2 schraf¬ fiert gezeigt) führen zu einer deutlichen Zunahme der Bildung von cGMP in den T84 Zellen. Die Figur zeigt die cGMP-Bildung in allen Fraktionen der Reinigungsstufe 1 des Hämofiltrat- Alginsäure-Extraktes im Vergleich zu einer Stimulierung der T84-Zellen durch verschiedene Konzentrationen des hitze¬ stabilen Enterotoxins (E 5763, Sigma-Chemie, Deisenhofen, FRG) .
Figur 2
Präparative Large-Scale-RP- Chromatographie des Alginsäure- Extraktes aus Hämofiltrat zur Grobauf trennung nach Molekular¬ eigenschaften und zur Entsalzung des Rohpeptidextraktes . Im schraffierten Bereich befinden sich die durch den cGMP- Generations-Test mit T84-Zellen bestimmten GCAP-I -Fraktionen. Sie eluieren bei einer Retentionszeit von 78 bis 84 Minuten bzw. bei 61 bis 69 % Lösungsmittel B. Diese Fraktionen wurden für die weitere Aufreinigung gepoolt und benutzt.
Säule: Stahlmantel 30 x 125 mm Material Parcosil RP-C4, 300 Ä, 20 - 45 μm Eluent A Wasser mit 0,01 N HCl Eluent B 80 % Acetonitril, 20 % Wasser
(V : V) mit 0,01 N HCl
Gradient: 0 - 0 % Eluent B 5 min
0 - 100 % Eluent B 120 min
100 - 100 % Eluent B 5 min
100 - 0 % Eluent B 3 min
0 - 0 % Eluent B 10 min
Flußrate: 5 ml/min
Fraktionen: 10 ml/2 min ab min 1
Absorption: 230 nm und : 280 nm
Figur 3
Präparative Large-Scale-RP-Chromatographie II zur Grobauf¬ trennung biologisch aktiver Fraktionen, die aus der Auf- trennung in Figur 2 gewonnen wurden. Im schraffierten Bereich befinden sich 'wieder die durch den cGMP-Generationstest bestimmten GCAP-I-Fraktionen, nämlich bei einer Retentions¬ zeit von 83 bis 85 Minuten bzw. 61 bis 62 % Elutionspuffer B.
Säule: Stahlmantel 20 x 125 mm Material Parcosil RP-C4, 250 Ä, 20 - 45 μm Eluent A Wasser mit 0,1 % Trifluoressigsäure Eluent B 80 % Isopropanol, 20 % Wasser (V : V) mit 0,1 % Trifluoressigsäure
Gradient 0 - 0 % Eluent B 5 min 0 - 10 % Eluent B 10 min 10 - 10 % Eluent B 5 min 10 - 100 % Eluent B 120 min 100 - 100 % Eluent B 5 min
100 - 0 % Eluent B 5 min
0 - 0 % Eluent B 10 min
Flußrate: 3 ml/min
Fraktionen: 6 ml/2 min ab min 20
Absorption: 230 nm und 280 nm
Figur 4
Semipräparative RP-Chromatographie der Auftrennung der cGMP- generierenden Fraktionen aus der präparativen RP-Chromato¬ graphie nach Figur 3. Im schraffierten Bereich bei 75 bis 80 Minuten Retentionszeit bzw. 48 bis 49 % Lösungsmittel B befinden sich die durch den cGMP-Generations-Test bestimmten, weiter gereinigten GCAP-I-Fraktionen.
Säule: Stahlmantel 10 x 125 mm Material Parcosil RP-C4, 300 Ä, 5 μm Eluent A Wasser mit 0,1 % Trifluoressigsäure Eluent B 80.% Acetonitril, 20 % Wasser
(V V) mit 0,1 % Trifluoressigsäure
Gradient: 0 0 % Eluent B 15 min
0 30 Eluent B 5 min
30 80 Eluent B 150 min
80 100 Eluent B 5 min
100 100 Eluent B 5 min
100 0 Eluent B 5 min
0 0 Eluent B 10 min
Flußrate: 2 ml/min
Fraktionen: 4 ml/2 min ab min 20 bis min 170
Absorption: 230 nm und 280 nm
Figur 5
Analytische RP-Chromatographie I der Auftrennung der cGMP- generierenden Fraktionen aus der semipräparativen RP-Chroma¬ tographie nach Figur 4. Im schraffierten Bereich bei 75 bis 78 Minuten Retentionszeit bzw. 50 bis 54 % Lösungsmittel B befinden sich die durch den cGMP-Generations-Test bestimmten, weiter gereinigten GCAP-I-Fraktionen.
Säule: Stahlmantel 4 x 250 mm Material Parcosil Pro-RP-C18, 100 Ä, 5 μm Eluent A Wasser mit 0,1 % Trifluoressigsäure Eluent B 80 % Acetonitril, 20 % Wasser
(V V) mit 0,1 % Trifluoressigsäure
Gradient: 0 0 % Eluent B 10 min
0 20 % Eluent B 5 min
20 60 % Eluent B 60 min
60 100 % Eluent B 5 min
100 100 % Eluent B 5 min
100 0 % Eluent B 5 min
0 0 % Eluent B 10 min
Flußrate: 0,7 ml/min
Fraktionen: 0,7 ml/1 min ab min 15 bis min 75
Absorption: 230 nm und 280 nm
Figur 6
Analytische RP-Chromatographie II der Auftrennung der cGMP- generierenden Fraktionen aus der analytischen RP-Chromato- graphie I nach Figur 5. Im schraffierten Bereich des Peaks bei 42 bis 52 Minuten Retentionszeit bzw. 46 bis 48 % Lösungsmittel B befinden sich die durch den cGMP-Generations- Test bestimmten, weiter gereinigten GCAP-I-Fraktionen.
Säule: Stahlmantel 2,1 x 100 mm Material: Vydac RP-C18, 300 Ä, 5 μm Säulen¬ temperatur: 35°C Eluent A: Wasser mit 0,01 % N HCl Eluent B: 80 % Acetonitril, 20 % Wasser
(V : V) mit 0,01 % N HCl Gradient: 0 5 % Eluent B 10 min
5 - 30 % Eluent B 10 min
30 - 60 % Eluent B 60 min
60 - 100 % Eluent B 10 min
100 - 100 % Eluent B 5 min
100 0 Eluent B 5 min
0 0 % Eluent B 10 min
Flußrate: 0,2 ml/min
Fraktionen: 0,2 ml/1 min ab min 20 bis min 80
Absorption: 230 nm und : 280 nm
Figur 7
Analytische RP-Chromatographie III der Auftrennung der cGMP- generierenden Fraktionen aus der analytischen RP-Chromato- graphie II nach Figur 6. Im schraffierten Bereich bei 50 Minuten Retentionszeit bzw. 65 % Lösungsmittel B befindet sich die durch den cGMP-Generations-Test bestimmte, weiter gereinigte GCAP-I-Fraktion.
Säule: Stahlmantel 2,1 x 100 mm Material: Vydac RP-C18, 300 Ä, 5 μm Säulen- temperatur: 35°C Eluent A: Wasser mit 0,08 % Heptafluorbuttersäure Eluent B: 50 % Isopropanol, 30 % Methanol, 20 % Wasser (V : V : V) mit 0,05 % Heptafluor¬ buttersäure
Gradient: 0 - 0 % Eluent B 10 min
0 - ,100 % Eluent B 80 min 100 - 100 % Eluent B 5 min 100 - 0 % Eluent B 5 min
0 - 0 % Eluent B 10 min
Flußrate: 0,2 ml/min
Fraktionen: 0,2 ml/1 min ab min 10 bis min 80
Absorption: 230 nm und 280 nm Figur 8
Analytische RP-Chromatographie IV der Auftrennung der cGMP- generierenden Fraktionen aus der analytischen RP-Chromato¬ graphie III nach Figur 7. Rechromatographie auf derselben Säule mit anderen Eluenten. Im schraffierten Bereich des Peaks bei 70 Minuten Retentionszeit bzw. 61 % Lösungsmittel B befindet sich die durch den cGMP-Generations-Test be¬ stimmte, hochgereinigte GCAP-I-Fraktion.
Säule: Stahlmantel 2,1 x 100 mm Material: Vydac RP-C18, 300 Ä, 5 μm Säulen¬ temperatur: 35°C Eluent A: 20% Methanol, 80 % Wasser (V : V) mit 0,1 % Trifluoressigsäure
Eluent B: 100 % Methanol mit 0,08 % Trifluoressig¬ säure
Gradient: 0 - 0 % Eluent B 10 min
0 - 100 % Eluent B 100 min
100 - 100 % Eluent B 5 min
100 - 0 % Eluent B 5 min
0 - 0 % Eluent B 10 min
Flußrate: 0,2 ml/min
Fraktionen: 0,1 ml/0,5 min ab min 10 bis min 110
Absorption: 210 nm und 230 nm
Figur 9
Sequenzanalyse: Nach Auftragen von 1/4 des Materials aus dem endgereinigten GCAP-I nach Chromatographie in Figur 8, ca. 250 pmol, konnten die Aminosäurereste von Position 1 bis 47 deutlich ohne nachweisbare Nebensequenzen festgestellt werden. Die Art der Sequenzierung ist im Text ausführlich beschrieben. Die weiteren Sequenzanteile des GCAP-I wurden durch Abbau und Fragmentsequenzierung sowie Massenspektro- metrie und Aminosäureanalyse gewonnen. Figur 10
Massenspektrum des nativen, gereinigten GCAP-I aus der Prä¬ paration von Figur 8. Das gefundene Molekulargewicht von MG 10.335 stimmt im Fehlerbereich +/- 0,1 % mit der theoretisch berechneten Masse von MG 10.336 des sequenzierten Moleküls überein. Nebensubstanzen sind nicht sichtbar. Diese Massenbe¬ stimmung wurde wieder durch Gegensequenzierung bestätigt.
Figur 11
Darstellung der immunreaktiven Molekülform von GCAP-I im Westernblot. Ein Äquivalent von 170 ml Hämofiltrat partiell aufgereinigter Peptide reicht für die Darstellung eines Peptides bei etwa 10.000 kD aus, das mit Antikörpern gegen GCAP-I erfaßt wird. Die Gelelektrophorese bestätigt die Molekülgröße der Sequenzanalyse und Massenspektrometrie des nativen gereinigten GCAP-I.
Figur 12
Konzentrationsabhängige Wirkung von GCAP-I (Guanylin) im Vergleich zu hitzestabilem Enterotoxin, CDD/ANP-99-126 und Urodilatin (CDD/ANP-95-126) . Man erkennt die Zunahme des cGMP-Gehaltes im Zellaufschluß gegenüber der Kontrolle und in Abhängigkeit der Zugabe der Agonisten.
Figur 13
Darstellung der Isolierung eines Phagenklones beim dritten Nachscreenen der genomischen Phagenbank. Der Pfeil markiert den Phagenklon 35; dieser wurde in einer Verdünnungsreihe auf die Platte aufgetragen und in einer Southernhybridi- sierung sichtbar gemacht. Figur 14
Die obenstehende Figur zeigt eine gelelektrophoretische Auftrennung von Fragmenten des GCAP35-4 Plasmides in einem 1 % Agarosegel nach Abbau mit verschiedenen Restriktions- endonucleasen. Pro Spur wurden jeweils 0,5 μg DNA aufge¬ tragen. Die DNA wurde mit Ethidiumbromid angefärbt und das Gelbild in durchscheinendem UV-Licht mit einer Videokamera digitalisiert (System Bioprofil Fa. Fröbel, Labortechnik) . Die einzelnen Spuren sind am unteren Rand des Gels numeriert.
Spur 1 GCAP35-4 / Kpnl
Spur 2 GCAP35-4 / Dral
Spur 3 GCAP35-4 / HindiII
Spur 4 GCAP35-4 / HindiII + SstI
Spur 5 GCAP35-4 / PstI
Spur 6 GCAP35-4 / PstI + SstI
Spur 7 Größenmarker pBSK-Reihe
Spur 8 Größenmarker Lambda-DNA, verdaut mit Hindlll
Spur 9 GCAP35-4 / Xbal
Spur 10: GCAP35-4 / Xbal + SstI
Spur 11: GCAP35-4 / Xhol
Spur 12: GCAP35-4 / Xhol + SstI
Spur 13: GCAP35-4 / Notl
Spur 14: GCAP35-4 / EcoRI
Fragmentgroßen der Größenmarker:
I. pBSK-Reihe: 2,5 kb, 2,2 kb, 1,1 kb, 1,0 kb, 0,7 kb, 0,45 kb,
II. Lambda-DNA/HindiII (soweit sie im Gel sichtbar sind) : 23,1 kb, 9,4 kb, 6,5 kb, 4,3 kb, 2,3 kb, 2,0 kb. Figur 15
Ergebnis der genomischen Sequenz des humanen GCAP-I Gens in seiner Nucleotidabfolge. Die Numerierung der Nucleotidsequenz bezieht sich auf den Translationsstart.
Figur 16
Organisation des humanen GCAP-I Gens. Die aus der genomischen Sequenz des GCAP-I Gens abgeleitete Organisation ist schema¬ tisch dargestellt. Die aufgeschlüsselte Nucleotidsequenz zeigt das Promotersystem. Weiter sind Exon 1, Intron 1, Exon 2, Intron 2, Exon 3 und die 3' -nichtransscribierte Region schematisch dargestellt.
Figur 17
Auflistung bekannter Motive im humanen GCAP-I Gen. Genannt sind Position, das jeweilige Motiv und die entsprechende Konsensussequenz. Abweichungen im Motiv von Konsensus sind mit kleinen Buchstaben gekennzeichnet. Weiterhin ist der entsprechende, die Konsensussequenz bindende Faktor genannt. Zu den Motiven R und S gibt es keinen bislang bekannten Bindungsfaktor.
Figur 18
Figur 18 zeigt die Nucleotidsequenz der Insertion pHG35-9/pHG35-6-3 des erfindungsgemäßen Gens. In der Sequenz sind die wichtigsten auffälligen Motive hervorgehoben. Mit durchgezogenen Pfeilen oberhalb der Sequenzen sind die invertierten Wiederholungen (IR 1-10) gekennzeichnet. Die gestrichelten Pfeile oberhalb der invertierten Wiederholungen kennzeichnen die mittels Computeranalyse identifizierten direkten Wiederholungen. Man beachte die Symmetrie der .Abstände zwischen den beschriebenen Sequenzmotiven. Auffällig ist die Lokalisation der invertierten Wiederholungen inner¬ halb der direkten Wiederholungen.
Figur 19
Die Figur 19 zeigt die Nucleotidsequenz der Insertion pHG35- 5-17.
In der Sequenz sind die wichtigsten mittels Computeranalyse identifizierten Sequenzmotive gekennzeichnet. Aufgrund des Sequenzvergleich mit dem T7-Promoter des Polylinkers des Phagen pHG35, wobei die eindeutige Lokalisation dieses Fragments innerhalb der Gesamtinsertion des Phagen pHG35 möglich war. Die in Figur 20 dargestellte Sequenz des Phagen- polylinkers ist in der aufgeführten Sequenz fettgedruckt und unterstrichen. Zudem ist er zu Alu-repetitiven Sequenzen homologe Bereich durch gestrichelte Pfeile gekennzeichnet.
Figur 20
Die Figur 20 zeigt die Konstruktion des Phagenpolylinkers. Die T7-Promotersequenz des Phagenpolylinkers sowie die S.AL-I- Schnittstelle konnte in der Sequenz des SstI-Fragmentes 35-5-17 identifiziert werden. Neben dem pHG35-9-Fragment konnte aus dem Phagen pHG35 ein weiteres SstI-Fragment bestimmt werden, das pHG35-6-3-Fragment. Diese repräsentieren die 5' -flankierende Region des humanen Guanylingens. Durch DirektSequenzierung aus DNA des Phagen pHG35 mit spezifischen Primern konnte die Reihenfolge und Orientierung dieser Fragmente zum 5' -terminalen Promoterbereich des Guanylingens ermittelt werden. Insgesamt 2.000 Basenpaare 5' -flankierende Sequenzinformationen wurden ermittelt. Zusätzlich wurde ein weiteres 2.736 Basenpaare großes Sstl-Fragment sequenziert, welches ca. 10 kbp vom postulierten Transkriptionsstartpunkt im 5' -flankierenden Bereich des Guanylingens lokalisiert wurde. Das Fragment mit der Bezeichnung pHG35-5-17 konnte in seiner "Sense" Orientierung verlaufenden Stranges aufgrund des Sequenzvergleiches mit der Phagenpolylinkerregion identi¬ fiziert werden. Durch eine computerunterstützte Sequenz- analyse mit dem Programm "Mac Molly, Tetra, Version 123" (Firma Soft Gene, Berlin) konnten zahlreiche potentielle Bindungsmotive für bereits charakterisierte Transkriptions- faktoren auf dem "Sense"- und "Antisense"-Strang identi¬ fiziert werden. Zudem wurden in regelmäßigen Abständen auftretende "direct repeats" and "inverted repeats" sowie möglicherweise Z-DNA-bildende Puri-Pyrimidin-Alternationen im 5' -flankierenden Bereich identifiziert.
Beispiel 1
Direkter Nachweis der Aminosäure-Sequenz des zirkulierenden, biologisch aktiven GCAP-I nach Isolierung aus Hämofiltrat.
Als Ausgangsmaterial wurde Hämofiltrat verwendet, das in großen Mengen bei der Behandlung niereninsuffizienter Patienten anfällt und alle Plasmabestandteile bis zu einer Molekülgröße von ca. 20.000 Dalton enthält.
1. Gewinnung des Rohpeptidmaterials
Das Hämofiltrat wurde mittels einer Hämofiltrationsanlage der Firma Sartorius unter Verwendung von Cellulosetriacetat- Filtern mit einer Ausschlußgröße von 20.000 Dalton (Typ SM 40042, Sartorius, Göttingen, BRD) gewonnen. Das Filtrat stammte von niereninsuffizienten Patienten, die sich durch Langzeit-Hämofiltration in einer stabilen Stoffwechsellage befanden. 720 1 Hämofiltrat wurden gewonnen und unmittelbar nach der Gewinnung mittels Ansäuern und Abkühlung auf 4°C gegen proteolytischen Abbau geschützt. Anschließend wurde durch Alginsäureextraktion nach dem Verfahren von Forssmann, der DE 36 33 797 AI, eine Rohpeptidfraktion (ca. 46,5 g) gewonnen. Davon wurden in einer ersten Reinigung, die unten beschrieben ist, 6,5 g weiter verarbeitet. 2. Isolierung des GCAP-I
Zunächst wurde eine Entsalzung und Fraktionierung des Roh- peptidmaterials über RP-C4 Festphase (Stufe 1) durchgeführt (Figur 2) . Es folgte eine präparative Large-Scale-RP-Chroma- tographie II der bioaktiven Fraktionen (Figur 3) . Die in der Figur 3 gezeigten Fraktionen bei einer Retentionszeit um 83 Minuten (schraffiert) enthielten die höchste Bioaktivität bezüglich des cGMP-Generationstestes an T84-Zellen und wurden für die weitere Auftrennung gepoolt. In Reinigungsstufe 3 wurde eine semipräparative Reverse-Phase-Chromatographie (Figur 4) verwandt. Der bioaktive GCAP-I-haltige Pool wurde durch eine Vakuumverdampfung eingeengt auf etwa 50% des Ausgangsvolumens, um besonders die organischen Lösungsmittel- komponenten zu entfernen. Über eine analytische RP-Chromato- graphie I als Reverse-Phase (RP) -Chromatographie wurde das GCAP-I haltige Material weiter gereinigt, wie in Figur 5 im Detail angegeben. Die biologische Aktivität erscheint dabei im Bereich eines größeren Peaks bei einer Retentionszeit von 75 bis 78 Minuten. Die bioaktiven Fraktionen aus 3 iden¬ tischen Läufen wurden gepoolt und lyophilisiert und für die nächsten Reinigungsschritte vorbereitet. Die letzten drei Reinigungsschritte (Figuren 6 bis 8) wurden auf einer ana¬ lytischen Microbore-HPLC-RP-C18-Säule unter Verwendung von verschiedenen Laufmittein durchgeführt. Im letzten Reini¬ gungsschritt war das gesuchte cGMP-aktivierende Peptid (GCAP- I) in einer einzigen Fraktion (siehe Figur 8) nachzuweisen. Der Reinheitsgrad der isolierten Substanz konnte mit Hilfe eines Dioden-Array-Systems während des Endisolierungs-Chroma- togramms schon auf > 95 % angegeben werden. Diese Fraktion wurde im Bioassay getestet, ansequenziert, auf Aminosäure- gehalt untersucht, im Massenspektrometer analysiert (Figur 10) und mittels der Kapillarzonenelektrophorese (CE) auf Reinheit geprüft (s. u. ) . Weiter wurde die GesamtStruktur der Aminosäure-Sequenz aufgrund der Durchsequenzierung von Einzelfragmenten nach Lys-C- und Asp-N-Endoprotease-Abbau aufgeklärt (Figur 9) . 3. Sequenzanalytische Bestimmung der Primärstruktur des GCAP-I.
Aus der bioaktiven Fraktion des Laufes der Endreinigung wurde 25 μl aus der Gesamtmenge von 100 μl zur Aminosäure-Sequenz- Analyse benutzt. Nach Isolierung aus Hämofiltrat wie oben beschrieben, wurden mit Hilfe des Gasphasensequenators Typ 473 A (Applied Bioystems) sequenziert. Der EDMAN-Abbau (Edman und Begg, Eur. J. Biochem. 1, 80 - 91, 1967) erfolgte mit dem Standardprogramm PTHRUN. Die Analyse der derivatisierten Aminosäuren wurde im On-Line-Verfahren über einen integrier¬ ten Chromatographen unter Verwendung des Standardprotokolls ABI durchgeführt.
Für diese Fraktion konnte eine Sequenz von 47 Aminosäuren bestimmt werden, weitere 5 Aminosäure-Reste konnten nur mit Vorbehalt ermittelt werden. Über die gefundene Sequenz ist bekannt, daß sie in Homologie zu der mit der cDNA abge¬ leiteten Aminosäuresequenz in den Positionen 22 bis 115 übereinstimmt (De Sauvage et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 9089 - 9093, 1992) .
4. Nachweis des Molekulargewichtes des nativen GCAP-I durch Massenspektrometrie.
Das Endprodukt der Aufreinigung nach Stufe 7 wurde im Massen- spektrometer untersucht. Mittels dieser Bestimmung wurde festgestellt, daß alle Fraktionen, die GCAP-I-Bioaktivität aufwiesen, auch ein Molekül mit einem MG von 10.336 Dalton enthielten (Figur 10) .
5. Nachweis des Reinheitsgehaltes des isolierten, nativen GCAP-I durch KapillarZonenelektrophorese.
Desweiteren wurde das Endprodukt der Aufreinigung mittels der Kapillar-Zonen-Elektrophorese auf seine Reinheit geprüft. Diese Methode ist geeignet, Verunreinigungen bis in den unteren Picogrammbereich nachzuweisen und ergibt eine eben¬ falls hochauflösende Reproduzierbarkeit in der Darstellung eines bestimmten Peptides.
Durch die Kapillarzonen-Elektrophorese ist bestätigt, daß die Fraktion einen einzigen, auf GCAP-I zu beziehenden, Peak enthielt.
6. Nachweis der C-terminalen Aminosäure-Sequenz des iso¬ lierten, nativen GCAP-I durch Endoprotease-Abbau (Endo- protease Lys-C und Asp-N) und Sequenzierung der Teil¬ fragmente.
Um die gesamte Primärstruktur des GCAP-I, das aufgrund aus der Massenspektrometrie gefundenen Molekulargewichtes etwa 90 bis 100 Aminosäuren besitzen mußte, zu bestimmen, wurde eine Aufklärung der C-terminalen Sequenz über Herstellung von Teilfragmenten und deren Sequenzierung vorgenommen.
Der Endoprotease-Abbau durch Lys-C-Endoprotease ergab nach Auftrennung mehrere deutliche Peaks. Diese Peaks wurden, wie oben bei der Gesamtsequenzierung beschrieben, analysiert und die Teilsequenzen wie sie in Figur 9 beschrieben sind, erhalten.
Beispiel 2
Chemische Synthese des humanen Guanylatcyclase-.Aktivierenden Peptides I (GCAP-I) .
1. Synthese des Fmoc-Leu-Harzes
Das Fmoc-Aminosäureanhydrid (5 Äquivalente) wurde in einem Minimalvolumen N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und in einem Rundkolben zu dem Hydroxymethylphenoxyacetyl-norleucin-Harz hinzugefügt. 4-Dimethylaminopyridin (1 Äquivalent) wurde ebenfalls in einem Minimalvolumen DMF gelöst und in den Rundkolben gegeben. Nach 1 Stunde Reaktionszeit wurde der Überschuß der Reagenzien durch Filtration entfernt und das Harz auf einem Filter gründlich gewaschen.
2. Strategie der Synthese des humanen GCAP-I.
Für die Synthese des Peptids mit der Formel:
Val-Thr-Val-Gln-Asp-Gly-Asn-Phe-Ser-Phe-Ser-Leu-Glu- Ser-Val-Lys-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-Gln-Glu-Pro-Gln- Glu-Pro-Arg-Val-Gly-Lys-Leu-Arg-Asn-Phe-Ala-Pro-Ile- Pro-Gly-Glu-Pro-Val-Val-Pro-Ile-Leu-Cys-Ser-Asn-Pro- Asn-Phe-Pro-Glu-Glu-Leu-Lys-Pro-Leu-Cys-Lys-Glu-Pro- Asn-Ala-Gln-Glu-Ile-Leu-Gln-Arg-Leu-Glu-Glu-Ile-Ala- Glu-Asp-Pro-Gly-Thr-Cys-Glu-Ile-Cys-Ala-Tyr-Ala-Ala- Cys-Thr-Gly-Cys
wurde die Durchflußmethode (Atherton und Sheppard, Solid phase peptide synthesis, IRL Press, Oxford, 1989) angewendet. Die genannte Peptidsequenz wurde mit Hilfe einer auto¬ matischen Peptidsynthese-Apparatur (Milligen 9050) unter Verwendung der Fmoc-Pentafluorophenylester (OPfp) syntheti¬ siert.
Das Peptid wurde vom Trägerharz durch Zugabe einer Mischung von Trifluoressigsäure-Anisol-Ethanidithiol-Phenol 94 : 2 : 2 : 2 (v/v/v/w) abgespalten und mit Ether gefällt. Das HPLC-gereinigte Peptid wurde mit Hilfe von Aminosäure¬ analysen, analytischer HPLC und Aminosäuresequenzanalyse charakterisiert.
3. Praktische Durchführung der Synthese des humanen GCAP-I.
Die Synthese von
Val-Thr-Val-Gln-Asp-Gly-Asn-Phe-Ser-Phe-Ser-Leu-Glu- Ser-Val-Lys-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-Gln-Glu-Pro-Gin- Glu-Pro-Arg-Val-Gly-Lys-Leu-Arg-Asn-Phe-Ala-Pro- Ile- Pro-Gly-Glu-Pro-Val-Val-Pro- Ile-Leu-Cys-Ser-Asn-Pro- Asn-Phe-Pro-Glu-Glu-Leu-Lys -Pro-Leu- Cys-Lys -Glu- Pro- Asn-Ala-Gln-Glu- Ile-Leu-Gln-Arg-Leu-Glu-Glu-Ile-Ala- Glu-Asp-Pro-Gly-Thr-Cys-Glu- Ile-Cys-Ala-Tyr-Ala-Ala- Cys-Thr-Gly-Cys ,
wurde mit dem automatischen 9050 PepSynthesizer (Programm Version 1.3) , MilliGen/Biosearch, nach der continuous flow- Methode durchgeführt. Fmoc-Aminosäurepentafluorophenylester waren L-konfiguriert und wurden in 0,8 mmol-Portionen ver¬ wendet. Alle zur Synthese notwendigen Reagenzien wurden von MilliGen/Biosearch bezogen: N,N-Dirnethylformamid, 20 % Piperidin in N,N-Dimethylformamid und 1-Hydroxybenzotriazol. Die L-Aminosäurederivate wurden in vierfachem Überschuß eingesetzt. Die terminalen Aminogruppen waren Fmoc-geschützt. Asparagin- und Glutaminsäure wurden als Nw-tert-butylester, Tyrosin und Serin als t-Butylether, Histidin und Lysin als Nw-Boc-Verbindungen und Arg als NG-2, 2, 5, 7, 8-penta- methylchroman-6-sulfonyl (Pmc) -Derivat eingesetzt. Die Syn¬ these wurde ausgehend vom Kieselgur-Harz Fmoc-Leu-Pepsyn KA (MilliGen/Biosearch) , also mit trägergebundener C-terminaler Aminosäure (0,091 meq Leu/g, 1,60 g) durchgeführt. Die Acylierung von Fmoc-Arg(Pmc) -OH wurde unter Anwesenheit von O- (lH-Benzotriazol-1-yl) -N,N,N' ,N' -tetramethyluronium-tetra- fluoroborat (TBTU) , 1-Hydroxybenzotriazol und Diisopropyl- ethylamin durchgeführt. Folgender Synthesezyklus wurde verwendet: Fmoc-Abspaltung mit 20 % Piperidin in DMF (7 min) , waschen mit DMF (12 min) , Acylierung (30 min; bei Fmoc-Val- OPfp 45 min) und waschen mit DMF (8 min) . Die fortschreitende Synthese wurde durch kontinuierliche UV-Detektion verfolgt. Die Synthese wurde mit der Abspaltung des N-terminalen Fmoc- Restes abgeschlossen. Das harzgebundene Peptid wurde dreimal mit je 50 ml Isopropanol, Eisessig, Isopropanol und Diethyl- ether gewaschen und getrocknet. Die Abspaltung vom Harz erfolgte mit Trifluoressig¬ säure /Phenol /Et handithiol/Thioanisol /Wasser 10 : 0,75 : 0,25 : 0,5 : 0,5 (v/w/v/v/v, 5 ml) . Die Lösung wird in vacu eingeengt und das Produkt durch Zugabe von Diethylether ausgefällt. Das erhaltene Rohpeptid wird mehrere Male mit Diethylether gewaschen und getrocknet. Aus 240 mg Peptid-Harz werden so 65 mg Rohpeptid erhalten.
Die Reinigung erfolgte unter Benutzung eines in unabhängiger Synthese hergestellten Standards von GCAP-I, dessen korrekte Sequenz durch MS (Massenspektrometrie) und Sequenzanalyse bestätigt war. Im ersten Schritt wurde das deblockierte Rohmaterial mit einer Kationen-Austauscher-HPLC gereinigt (Parcosil PepKat 2 x 10 cm, 300 Ä, 7 μ, Flußrate 9 ml/min, 230 nm, Elutions ittel A = 5 mM NaH2P04; B = 5 mM NaH2P04 + 1 M NaCl, Gradient: 5 % - 100 % in 60 min) , wobei der Haupt- peak entsprechend der Referenzsubstanz bei 28,17 min er¬ scheint. Im zweiten Reinigungsschritt bei gleichzeitiger RP- HPLC zur Entsalzung (Parcosil ProRP C4 2 x 10 cm, 300 Ä, 7 μ, Flußrate 7 ml/min, 230 nm, Elutionsmittel A = 0,1 % Trifluor¬ essigsäure in Wasser; B = 0,1 % Trifluoressigsäure in Aceto- nitril/Wasser 4 : 1, Gradient: 0 % - 100 % B in 60 min) . Ausbeute: 6,6 mg (1,5 mmol, 14,8 %) wurde ein Peak bei 30,80 min erhalten der bei Rechromatographie auf einer analytischen RP-C18-Säule einen scharfen einheitlichen Peak ergibt.
Die Identität des synthetisierten Materials mit der vor¬ gegebenen Primärstruktur von GCAP-I wurde durch MS (Plasma- desorptionsmethode, Bio-Ion, Applied Biosystems) und Gegen¬ sequenzierung in einem Gasphasensequenator (Modell 470, Applied Biosystems) nachgewiesen. Die biologische Aktivität des synthetischen GCAP-I wurde im Funktionstest durch die cGMP-Generations-stimulierende Wirkung an T84-Kolonkarzinom- Zellen nachgewiesen: dieser zeigte, daß das synthetische Material eine korrekte biologische .Aktivität aufweist . Beispiel 3
Herstellung von biologisch aktiven Fragmenten des GCAP-I aus nativem und synthetischem GCAP-I:
Aus dem gesamten GCAP-I-Molekül von 94 Aminosäuren wurden durch enzymatische Verdauung verschiedene Fragmente her¬ gestellt, deren biologische Aktivität getestet wurde und überraschenderweise stellte sich heraus, daß alle Fragmente enthaltend den C-Terminus von Position 80 bis Position 94 biologisch aktiv waren. Unter anderem wurden durch Endo¬ protease-Abbau mit Endoprotease Lys-C, Endoprotease Asp-N und Endprotease Gly-C folgende biologisch aktiven Fragmente, die auch durch Resynthese geprüft wurden, gewonnen:
1.
Glu-Pro-Asn-Ala-Gln-Glu-Ile-Leu-Gln-Arg-Leu-Glu-Glu- Ile-Ala-Glu-Asp-Pro-Gly-Thr-Cys-Glu-Ile-Cys-Ala-Tyr- Ala-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys.
2.
Asp-Pro-Gly-Thr-Cys-Glu-Ile-Cys-Ala-Tyr-Ala-Ala-Cys- Thr-Gly-Cys
3.
Thr-Cys-Glu-Ile-Cys-Ala-Tyr-Ala-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys
Beispiel 4
Biologische Wirkung und .Anwendung des GCAP-I:
Wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde Hämofiltrat chromato¬ graphisch aufgearbeitet, wobei GCAP-I-enthaltende Fraktionen in allen Reinigungsstufen gefunden wurden. Die gemäß Beispiel 1 gefundenen aktiven Fraktionen in Reiniungsstufe 4 und 7 (Endreinigung) wurden für den folgenden Test als Substanz eingesetzt (Figur 12) . Auf diese Weise konnte aus dem Hämo¬ filtrat in beiden Reinigungsstufen eine Fraktion nachgewiesen werden, die die biologische, cGMP-generierende Wirkung wie GCAP-I zeigte. Gleichartige Ergebnisse wurden mittels der synthetischen Molekülformen gemäß Beispiel 2 und 3 erzielt.
Die Zellen wurden nach Aussaat in 24-Loch-Platten nach Bildung einer konfluenten Zellschicht (nach ca. 4 - 8 Tagen) verwendet. Die Inkubation erfolgte mit 0,5 ml Zellmedium bei 37 °C. Die GCAP-I-Peptid enthaltenden Präparate wurden un¬ mittelbar vor Versuchsbeginn im Zellmedium gelöst. Im ersten Versuchsansatz wurden 1,5 x 10s Zellen mit GCAP-I während 60 min inkubiert. Zur Kontrolle wurden Zellen mit Kulturmedium ohne jeglichen Zusatz und mit verschiedenen Konzentrationen an synthetischem GCAP-I inkubiert. Die erhaltenen Werte der cGMP-Generation sind als Mittelwerte von Dreifachansätzen ± S.D. angegeben. Gleichzeitig wurden innerhalb derselben Versuche als Referenzsubstanzen natriuretische Peptide getestet (Figur 12) . Der Zusatz von GCAP-I bzw. die Zusammen¬ setzung des Mediums wurde zu Beginn der Inkubation vorge¬ nommen und während der Versuchszeit bleiben die Proben im Inkubator bei 37,5°C.
Die Ergebnisse zeigen, daß signifikante Unterschiede in der Wirksamkeit des GCAP-I im Vergleich zu den Kontrollen mit den untersuchten Zellsystemen bestehen. Außerdem besteht eine Dosis abhängige Wirkung. Dieses Ergebnis läßt auf Unter¬ schiede in der Wirkungsweise dieses Peptides schließen, die sich auf den Aktivierungsmechanismus des GCAP-I beziehen. Damit ist gezeigt, daß GCAP-I die cGMP Generation der T84- Zellen über einen bereits früher identifizierten Rezeptor für Enterotoxin beeinflussen muß.
In ähnlicher Weise wurde ermittelt, daß auch weitere Zell- arten auf GCAP-I mehr oder weniger ansprechen, unter anderem Belegzellen des Magens, Kryptenzellen des Dünndarms, Schalt¬ zellen der Pankreasgänge und Leber, die unter Verwendung des GCAP-I auch die intracelluläre Ca++ Konzentration ändern.
Beispiel 5
Herstellung und Anwendung von segmentspezifischen Antikörpern gegen humanes GCAP-I
Zur Herstellung von Antikörpern wurden als Antigene zwei Peptide gewählt, die zum Teil überlappenden Sequenzen aus dem Aminoterminus des GCAP-I-Moleküls entsprechen. Weitere Antikörper wurden gegen C-terminale Sequenzen nach Beispiel 3 produziert.
Sequenz 1: Gln-Asp-Gly-Asn-Phe-Ser-Phe-Ser-Leu-Glu-Ser-Val-
Lys Sequenz 2: Glu-Ser-Val-Lys-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-Gln-Glu-Pro-
Gln
Die Peptide wurden als MAP's ("Multiple Antigenic Peptides") synthetisiert (Pasmett, McGrath, Journal of Biol . Chem. 263(4), 1719, 1988) . Bei dieser Methode macht man sich die Trifunktionalitat der .Aminosäure Lysin zunutze und verwendet die beiden Aminogruppen eines gebundenen Lysins zur weiteren Peptidbindung. Mit der Kopplung weiterer Lysine verdoppeln sich die so verfügbaren Aminogruppen nach jedem Zyklus. Nach drei Kopplungsschritten erhält man ein aus sieben Aminosäuren bestehendes Lysingerüst, an dessen acht freien Aminogruppen jeweils sukzessive die folgenden Aminosäuren der beiden GCAP- I-Teilsequenzen gebunden wurden. Durch diese Kopplung an ein Lysingerüst wurden die beiden Peptide in achtfacher Kopie an einem einzigen Molekül erhalten.
Zur Herstellung von Antiseren wurden pro Peptid jeweils drei Kaninchen mit Antigenmengen von 1,0 mg (Erstimmunisierung) und 0,5 mg (Nachimmunisierung) geimpft. Die in 0,9 % NaCl gelösten Peptide wurden dabei zur unspezifischen Aktivierung des Immunsystems im Verhältnis 1 : 2 mit komplettem Freud'sehen Adjuvans (Erstimmunisierung) bzw. mit in¬ komplettem Freud'sehen Adjuvans (Nachimmunisierung) versetzt. Die Impfung erfolgte im Abstand von 4 Wochen intradermal in den Rücken.
Zur Gewinnung der Antiseren wurden 10 ml Blut pro Tier an einer lateralen Ohrvene abgenommen. Das Blut wurde zur Gerinnung 4 Stunden bei 4°C stehengelassen und danach bei 2.500 x g bei 4°C über 15 Minuten zentrifugiert. Die Seren werden bei minus 20°C aufbewahrt. Die Nullseren wurden unmittelbar vor der Erstimmunisierung entnommen, die Anti¬ seren im wöchentlichen Abstand. Die Reaktion der Antikörper in den Immunseren wurde mit der ELISA-Methode und im Western- Blot (nach SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese der bio¬ aktiven, GCAP-I enthaltenden Hämofiltrat Fraktionen über¬ prüft.
Mit Hilfe der positiven Antiseren wurden nach etablierten Methode zwei spezifische Radioimmunoassays zur Quanti¬ fizierung von immunreaktivem GCAP-I in biologischen Flüssig¬ keiten aufgebaut.
Als Tracer wurden die folgenden Peptide benutzt:
Peptid 1: 125J-Tyr-Gln-Asp-Gly-Asn-Phe-Ser-Phe-Ser-Leu-Glu-
Ser-Val-Lys
Peptid 2: 125J-Tyr-Glu-Ser-Val-Lys-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-Gln-
Glu-Pro-Gln
Als Eichsubstanzen wurden die folgenden linearen Peptide eingesetzt:
Peptid 1: Gln-Asp-Gly-Asn-Phe-Ser-Phe-Ser-Leu-Glu-Ser-Val-Lys Peptid 2: Glu-Ser-Val-Lys-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-Gln-Glu-Pro-Gln Die Tests mit den Antikörpern im RIA bestätigen, daß GCAP-I im Blut meßbar ist. Damit können diese als diagnostische Verfahren herangezogen werden. Mit C-terminalen Antikörpern wird analog verfahren und überraschenderweise werden teils gleichartige, teils verschiedene Ergebnisse erhalten.
Beispiel 6
Darstellung und Anwendung des menschlichen Gens gehörend zum humanen GCAP-I
Die Isolierung des erfindungsgemäßen Genes erfolgte über das Screening einer genomischen Phagenbank. Dazu war es nötig, eine spezifische Hybridisierungssonde herzustellen, wie nachstehend beschrieben.
Darstellung der spezifischen Hybridisierungssonde
Zunächst wurde Duodenalgewebe aus Ratte isoliert und die darin enthaltene Botenribonucleinsäure isoliert. Hieraus wurde über eine "Reversetranskriptase"-Reaktion sog. Erst¬ strang-copy-DNA hergestellt.
Bezogen auf die Proteinsequenz des Peptides GCAP-I wurde ein degenerierter PCR-Primer konstruiert (GY 1, CCNAAYACNTGYGARATHTGYGC) . Mit diesem Primer und mit Oligo(dT) als Gegenprimer wurde mit Hilfe der Polymerase-Ketten- Reaktion ein cDNA-Fragment aus Erststrang cDNA amplifiziert (Maegert, HJ et al. , X67669, see EMBL Data Library) . Die Amplifikationsbedingungen in der PCR-Reaktion waren folgende:
94°C denaturieren, 30 Sekunden
45°C Annealing, 30 Sekunden
72°C Polymerisation für 1 Minute.
Insgesamt wurden 40 Amplifikationszyklen durchgeführt, um die gewünschte cDNA zu gewinnen. Das so gewonnene PCR-Frag- ment wurde gelelektrophoretisch in NuSieve GTG-Agarose (Fa. Biozyme) gereinigt und anschließend mittels Membran¬ filtrationskartuschen (Millipore 0,45 Mikrometer Duraporemem- bran und PTTK Polysulfonmembran) aus der Agarose isoliert, indem die entsprechende DNA-Bande mit dem Gel präpariert wurde und über fraktionierte Filtration nach Angaben des Herstellers (Fa. Millipore, Bedorf, MA, USA) in den Kartuschen zentrifugiert wurde.
Dieses aufgereinigte PCR-Fragment wurde in pUC18 T-Vektor (Marchuk et al. , Nucleic Acid Res. 19: 1154, 1990) ein- kloniert. Escherichia coli Bakterien (Stamm JM 109) wurden nach dem PEG-Protokoll (Nishimura et al. , Nucleic Acid Res. 18: 6169, 1990) mit diesem Vektor transformiert.
Das isolierte cDNA-Fragment wurde mit a32PdCTP markiert ("random primed labeling kit" der Fa. Boehringer, Mannheim) .
Die humane Genbank (La bda Fix™, Fa. Strategene, LaJolla, CA, USA) wurde nach Angaben des Herstellers ausplattiert. Bei dieser Bank handelt es sich um einen Pool modifizierter Lambda-Bakteriophagen (Bakterienviren) , die jeweils in sich ein Teil des menschlichen Genoms inseriert haben. Ein ge¬ nomisches Äquivalent, welches etwa 400.000 Phagen entspricht, wurde ausplattiert und mit Hilfe eines sog. Plaque- hybridisierungstest der Phagenklon gesucht, der das mensch¬ liche GCAP-I Gen inseriert hatte (Figur 13) .
Von den ausplattierten Phagen wurden mit Hilfe eines Filter¬ abklatsches die Phagen DNA auf einen Nylonfilter übertragen
(Hybond N+, Fa. Amersham, Braunschweig) . Mittels eines DNA¬ DNA Hybridisierungsverfahrens (Southernblot) wurde die am Filter gebundene DNA mit Hilfe des markierten cDNA Fragmentes hybridisiert. Als Hybridisierungslösung wurde 1 mol/1 NaCl, 50 mmol/1 TRIS-HC1 0,1 % Natriumdodecylsulfat, und 10% Dextransulfat verwendet. Unspezifisch gebundene Sonden-DNA
(cDNA-Fragment) wurde durch Waschen der Filter bei Hybridi- sierungstemperatur (50°C) für 10 min mit 2 mal SSC-Lösung durchgeführt (0,3 mol/1 NaCl, 0,03 mol/1 Trinatriumacetat, pH = 7,0) . Der gewaschene Filter wurde anschließend auf einen Röntgenfilm aufgelegt, wodurch die spezifisch gebundene Sonden-DNA sichtbar gemacht werden konnte und diejenigen Phagen isoliert wurden, die ein besonders starkes Hybridi- sierungssignal ergaben. Dieses Verfahren wurde dreimal nacheinander durchgeführt, um diejenigen Phagen zu isolieren, die das Gen für GCAP-I enthielten (siehe Figur 13) .
Es konnten letztlich zwei Phagen isoliert werden (Bezeichnung Klon 35 und Klon 43) . Die Phagen-DNA wurde mit Hilfe einer Cäsiumchloriddichtegradienten-Zentrifugationsmethode isoliert und mittels Restriktionsendonucleaseabbau mit anschließender Agarose-Gelelektrophorese eine erste Charakterisierung der Insertion durchgeführt. Das Spaltmuster dieser beiden Klone war sehr ähnlich und ergab nach Abbau der DNA mit dem Re¬ striktionsenzym SstI für den Klon "35" neun Banden und für den Klon "43" acht Banden. Die Banden wurden mit Hilfe der Southernblottechnik aus dem Agarosegel heraus auf einen Nylonfilter übertragen und anschließend wiederum mit dem cDNA-Fragment, welches zur Anreicherung der Phagenklone diente, eine Hybridisierungsanalyse durchgeführt. Es konnten zwei Banden aus dem Klon "35" identifiziert werden, die ein besonders starkes Hybridisierungssignal ergaben, nachfolgend 35-4 -(Bande Nummer 4, 4.000 Basen Größe) und 35-9 genannt (Bande Nummer 9, 500 Basen Größe) .
Sowohl das 4 Kilobasen als auch das 0,5 kb umfassende Frag¬ ment wurden ähnlich der für die Präparation des cDNA-Frag- mentes beschriebenen Methode gelelektrophoretisch gereinigt, mittels Membranfiltration aus dem GTG-Agarosegel präpariert und anschließend jeweils in das mit Sst I geschnittene Plasmid pBlueskript einkloniert und Escherichia coli (Stamm XL-1 blue) damit transformiert. Im folgenden wird das Plasmid mit der 4 kb Insertion als GCAP35-4, das mit der 0,5 kb Insertion als GCAP35-9 bezeichnet. Sequenzierung des Plasmids GCAP35-4
Nach einer Restriktionskartierung des Plasmids GCAP35-4 (siehe Figur 14) wurde die Kombination der Restriktionsenzyme Kpnl und Notl gewählt, um eine Exonukleasekinetik durch¬ zuführen. Hierbei handelt es sich um einen gerichteten Abbau des Ausgangsplasmides (Henikoff S., Methods Enzymol. 155: 12, 1987) . Die daraus erhaltenen, in der Insertion verkürzten Subplasmide wurden gemäß der Didesoxymethode nach Sanger mit dem vektorspezifischen 21M13 Primer sequenziert, die lesbare Sequenzweite betrug jeweils etwa 350 Nucleotide. Hierfür wurde ein Fluoreszenz-Sequenzer (Modell 373A, Fa. Applied Biosystems, Weiterstadt, FRG) eingesetzt. Für die Sequen¬ zierung wurden sowohl das Dye-Primer-, als auch das Dye- Terminator-Verfahren durchgeführt (Smith L.M. et al. , Nature 321: 674, 1986) .
Aus den sich überlappenden Bereichen der 21M13-Sequen¬ zierungen wurde die Gesamtsequenz der ersten 2.000 Basenpaare der Insertion zusammengestellt, die den größten Teil des humanen GCAP-1 Gens abdecken, beginnend im Intron 1 bis zum 3' -nichttranscribierten Bereich (siehe Figur 15/16) .
Zur Kontrolle der so erhaltenen Sequenz wurde der Gegenstrang mit aus der Sequenzinformation abgeleiteten, spezifischen synthetischen Oligonukleotiden sequenziert (sog. Primer- walking) .
Sequenzierung von GCAP 35-9
Für die Sequenzierung von GCAP35-9 war aufgrund der geringen Insertionsgröße keine Exonucleasekinetik nötig. Die Sequen¬ zierung erfolgte direkt mit den plasmidspezifischen Primern (Primer: 21M13 und 13M21) . Die so gewonnen Sequenzdaten wurden ebenfalls mittels zweier synthetischer Oligonucleotide verifiziert (s. o.) . Auf dieser Insertion befand sich sowohl die Promoterregion, als auch Exon 1 sowie der Beginn von Intron 1 des GCAP-I-Genes (siehe Figur 15/16) .
Über die Sequenzanalyse konnten wichtige regulatorische Elemente im Gen des GCAP-I und ihre Anordnung festgestellt werden (siehe Figur 17) .

Claims

A n s p r ü c h e
1 . Gen kodierend für Guanylatcyclase Activating Peptide- I (GCAP- I) .
2 . Gen nach Anspruch 1 kodierend für humanes GCAP- I .
3 . Gen nach Anspruch 1 und/oder 2 mit nachfolgender Struk¬ tur
Polylinker Polylinker
Figure imgf000036_0001
Geamtinsertion des Phagen phHG 35
4. Gen nach Anspruch 1 mit der Nucleinsäuresequenz pHG 35-5-17
GAGCTCTAAT ACGACTCACT ATAGGGCGTC GACTCGATCA CTTAGGATAA TGGAGGCTCT
CTCGAGATTA TGCTGAGTGA TATCCCGCAG CTGAGCTAGT GAATCCTATT ACCTCCGAGA
10 20 30 40 50 60
GAAGGAGAAA TGCCTTGCCC AGGCCACCCA GTTTAGTGAG TGGCCAGATC AAGACTCAAG
CTTCCTCTTT ACGGAACGGG TCCGGTGGGT CAAATCACTC ACCGGTCTAG TTCTGAGTTC
70 80 90 100 110 120
CCCCAGTGTC TGGATTCAGA GTCCGTTGTT TTTCTCACAT ACCACACAAT CCTTTACTTA
GGGGTCACAG ACCTAAGTCT CAGGCAACAA AAAGAGTGTA TGGTGTGTTA GGAAATGAAT
130 140 150 160 170 180
GGCTATTTGA GGAAAAGACA TAAAGGTAAT GGGGTTGGGG GTGGATTTAA AACCTTGAAG
CCGATAAACT CCTTTTCTGT ATTTCCATTA CCCCAACCCC CACCTAAATT TTGGAACTTC
190 200 210 220 230 240
AACTGTGTGG CAGACAGCAG TTAGGAAGGA GTTGGGATCA AGTGATATGT CCTTTGCTGA
TTGACACACC GTCTGTCGTC AATCCTTCCT CAACCCTAGT TCACTATACA GGAAACGACT
250 260 270 280 290 300
AGGGGGAAGG AATGTTAACC TGTTGTGAGT GCTTACTACT AATTTGTAAG TGGCACCATA
TCCCCCTTCC TTACAATTGG ACAACACTCA CGAATGATGA TTAAACATTC ACCGTGGTAT
310 320 330 340 350 360 AGGTGGTAAG GCTCTGGAGC CAGATTGCTT GTGTTTGAAT CTTCATGCTT TGCCACTTAA
TCCACCATTC CGAGACCTCG GTCTAACGAA CACAAACTTA GAAGTACGAA ACGGTGAATT
370 380 390 400 410 420
TGGCTGTGTG ATATTAGGCA AGCTACCTAA CCCTCCTACC TCAGCTTCCC TGTTTGTAAA
ACCGACACAC TATAATCCGT TCGATGGATT GGGAGGATGG AGTCGAAGGG ACAAACATTT
430 440 450 460 470 480
AGGGGCTAAT AAAACTACCT GTGTCCTCGA GTTGTTAGGA TTGAATGAGA ATCATGTAAA
TCCCCGATTA TTTTGATGGA CACAGGAGCT CAACAATCCT AACTTACTCT TAGTACATTT
490 500 510 520 530 540
TTAGTGCCTG ACCCACATTA AGGAACTTAT AAGTTTTTTT TAAATGGAGG CATTTTACCT
AATCACGGAC TGGGTGTAAT TCCTTGAATA TTCAAAAAAA ATTTACCTCC GTAAAATGGA
550 560 570 580 590 600
ATATTGTGAT ATACTGAAAA CCTTAGCATT AAATAATTGT ACAAGAAAAT ATTTCAGGGC
TATAACACTA TATGACTTTT GGAATCGTAA TTTATTAACA TGTTCTTTTA TAAAGTCCCG
610 620 630 640 650 660
ATATGAGAAA AATGAGTAGC AGACTACTTG AAATTTTGTA ATCAGAGTAC TAAAAAAAAA
TATACTCTTT TTACTCATCG TCTGATGAAC TTTAAAACAT TAGTCTCATG ATTTTTTTTT
670 680 690 700 710 720
TCCAGTAAAA CTTCCACAAC AGTTAAAAGG ATATGTATAA TTNGTNATAA AAGGAAGAGT
AGGTCATTTT GAAGGTGTTG TCAATTTTCC TATACATATT AANCANTATT TTCCTTCTCA
730 740 750 760 770 780
TCTACAAGTA GATATCATCC NCTACTTTGA GAAAGCAGCT GGTTTAGTAG GGGGGGGGCT
AGATGTTCAT CTATAGTAGG NGATGAAACT CTTTCGTCGA CCAAATCATC CCCCCCCCGA
790 800 810 820 830 840
TTCAGNTACG GTGGNGACAC AGTCCCANTG GNNTCAAATT GGGGGNGCNC AACNGGACAT
AAGTCNATGC CACCNCTGTG TCAGGGTNAC CNNAGTTTAA CCCCCNCGNG TTGNCCTGTA
850 860 870 880 890 900
NGNCNAACTG GNACAGTAGN GGCTTGGNAA GGNNGGGCTT CTNNNCTCAG GCTGTGGTTC
NCNGNTTGAC CNTGTCATCN CCGAACCNTT CCNNCCCGAA GANNNGAGTC CGACACCAAG
910 920 930 940 950 960
CTTCTGGTTT CCTGTGTTCC CTTGTTGATG TCCTCTGTGT TCACTTGACA TTACTTGGTG
GAAGACCAAA GGACACAAGG GAACAACTAC AGGAGACACA AGTGAACTGT AATGAACCAC
970 980 990 1000 1010 1020
GCACAGAAAT TAGCTTGCTG GGGAAAATTC AGTATGACGT CATTGGTGCA CTGCCATCAT
CGTGTCTTTA ATCGAACGAC CCCTTTTAAG TCATACTGCA GTAACCACGT GACGGTAGTA
1030 1040 1050 1060 1070 1080
TATCCTGTTT ACCATTCTCA TGGGAGCCAA TTCATGTTAC TGAAACAACG TATTGGAGCA
ATAGGACAAA TGGTAAGAGT ACCCTCGGTT AAGTACAATG ACTTTGTTGC ATAACCTCGT
1090 1100 1110 1120 1130 1140
AAACAGNCTG T.AAGAGCAGT GGCTACATTG GCACTTTTCT CGTGTCTTCC TTACTGCAGC
TTTGTCNGAC ATTCTCGTCA CCGATGTAAC CGTGAAAAGA GCACAGAAGG AATGACGTCG
1150 1160 1170 1180 1190 1200
CTGGTATAAT GGAAGGAGTG TGGATCAAGT GAACTGACCT CAGATCCTAT CTTTGTCCCC
GACCATATTA CCTTCCTCAC ACCTAGTTCA CTTGACTGGA GTCTAGGATA GAAACAGGGG
1210 1220 1230 1240 1250 1260
TACTGGTTGT GTGACTTTGG GTAATTTACT CATCCTCTTA AACCGTATCC CCTTACCTAT
ATGACCAACA CACTGAAACC CATTAAATGA GTAGGAGAAT TTGGCATAGG GGAATGGATA
1270 1280 1290 1300 1310 1320 AAAATAAGGA TCATAAGAGC CACTTTTTGA AGGCTTATGG TTGAATTAGT GAGATAATGT
TTTTATTCCT AGTATTCTCG GTGAAAAACT TCCGAATACC AACTTAATCA CTCTATTACA
1330 1340 1350 1360 1370 1380
GTGCCTGGCA TATANGGAAG TACACAGTAG GGGTTAAGTT TATTNCTACC TTTCTTCTCT
CACGGACCGT ATATNCCTTC ATGTGTCATC CCCAATTCAA ATAANGATGG AAAGAAGAGA
1390 1400 1410 1420 1430 1440
ACCCAAGTCG CTGCTATNAT TGCCTCTTTC CTTCCAGGCC ATCACAGAGC CATGAACCAG
TGGGTTCAGC GACGATANTA ACGGAGAAAG GAAGGTCCGG TAGTGTCTCG GTACTTGGTC
1450 1460 1470 1480 1490 1500
CAGCACATGA TGCCTTCCCA AGCCTTCCAG ATGCGGCGTT CCCTGCCTCC AGATGACATC
GTCGTGTACT ACGGAAGGGT TCGGAAGGTC TACGCCGCAA GGGACGGAGG TCTACTGTAG
1510 1520 1530 1540 1550 1560
CAGGATGACT TTGATTGGGA TTCAATTGTG TAGGGCTTGT TTCTGCAAGA CACCAGACCC
GTCCTACTGA AACTAACCCT AAGTTAACAC ATCCCGAACA AAGACGTTCT GTGGTCTGGG
1570 1580 1590 1600 1610 1620
TAACGTTACC TTTCTGTGCA GTGAAGGGAA AGGTTTAAGA GAATCCAGTT GAGAAAACAA
ATTGCAATGG AAAGACACGT CACTTCCCTT TCCAAATTCT CTTAGGTCAA CTCTTTTGTT
1630 1640 1650 1660 1670 1680
ACTTGCTAAT CACTTTACCA ATGTAATCAA AATAACTTTT AAAGACAATC AGAAGGATTT
TGAACGATTA GTGAAATGGT TACATTAGTT TTATTGAAAA TTTCTGTTAG TCTTCCTAAA
1690 1700 1710 1720 1730 1740
AAGCTGGATA ACTTACTGCT TAAATCTGAC CCAAGCAAGT ACTACATGTT TGTCTCCCTG
TTCGACCTAT TGAATGACGA ATTTAGACTG GGTTCGTTCA TGATGTACAA ACAGAGGGAC
1750 1760 1770 1780 1790 1800
CCAGCTGCCC TATGTAGCTC CTAACTGTTG TGTGATTTGG ACGGCTTTTT GCCTGTTTGT
GGTCGACGGG ATACATCGAG GATTGACAAC ACACTAAACC TGCCGAAAAA CGGACAAACA
1810 1820 1830 1840 1850 1860
GTCAGTTTGA TGTTAACCAC NAGTGACAGA CTGATTTTTC AGACGGAGCC TATTTTGCTG
CAGTCAAACT ACAATTGGTG NTCACTGTCT GACTAAAAAG TCTGCCTCGG ATAAAACGAC
1870 1880 1890 1900 1910 1920
CAAGCGTTTT ATATAAAAGG TACATATGTG TAANTCTATG TNCNAAANTT ACTGAAAGGC
GTTCGCAAAA TATATTTTCC ATGTATACAC ATTNAGATAC ANGNTTTNAA TGACTTTCCG
1930 1940 1950 1960 1970 1980
TTCAGTTTTT NCTAATTGGA TTATTATGTC TTGAAAGTTA TTGTCAGTTT TTATTCCTTG
AAGTCAAAAA NGATTAACCT AATAATACAG AACTTTCAAT AACAGTCAAA AATAAGGAAC
1990 2000 2010 2020 2030 2040
TTAGGCTATT TNCTGCAGGA TGCTTTTAAC TGATGTAGGA AACTGAAAGG AAATAGATTT
AATCCGATAA ANGACGTCCT ACGAAAATTG ACTACATCCT TTGACTTTCC TTTATCTAAA
2050 2060 2070 2080 2090 2100
TTTCCAAAAC CCAGTTCCCC TTATTTAATC TTTTTTAGAA ATGTGGGTAA TGAATTCTAT
AAAGGTTTTG GGTCAAGGGG AATAAATTAG AAAAAATCTT TACACCCATT ACTTAAGATA
2110 2120 2130 2140 2150 2160
CTAATAAGTC AAGGAAACCA GAATTTGACA CACTCCAACA ATCCAAAGGG GCATGTTGCT
GATTATTCAG TTCCTTTGGT CTTAAACTGT GTGAGGTTGT TAGGTTTCCC CGTACAACGA
2170 2180 2190 2200 2210 2220
CCTGAGCAGC ATGAAGAACT GACCAAATTG GTTTTGATGC TTGGGGGATC ATAGAGTATT
GGACTCGTCG TACTTCTTGA CTGGTTTAAC CAAAACTACG AACCCCCTAG TATCTCATAA
2230 2240 2250 2260 2270 2280
TATGTCTGCT TTTCTAAATC TGCATTATAA TAGCTCTAAA ATTTGTTGAT TGGTAAGAAA
ATACAGACGA AAAGATTTAG ACGTAATATT ATCGAGATTT TAAACAACTA ACCATTCTTT
2290 2300 2310 2320 2330 2340
TTGGGCATTG CTTGGCTCTT TAAACACATC AGTGCTTCCA CATTCACCTA TGTATTTATT
AACCCGTAAC GAACCGAGAA ATTTGTGTAG TCACGAAGGT GTAAGTGGAT ACATAAATAA
2350 2360 2370 2380 2390 2400
ATNCAAAAGT GTCATTTTAA TATTTATTGC TACCNTCTGN GAATGCTTAG CTCCTGTCGG
TANGTTTTCA CAGTAAAATT ATAAATAACG ATGGNAGACN CTTACGAATC GAGGACAGCC
2410 2420 2430 2440 2450 2460
GCTCATTAAG GNGAAATGTG TCTGAAAGCA CAGAACTATT ATNATTNTTT TCTTTTTTTG
CGAGTAATTC CNCTTTACAC AGACTTTCGT GTCTTGATAA TANTAANAAA AGAAAAAAAC
2470 2480 2490 2500 2510 2520
AGATGGAGTC TTGCCCTGTT GCCCAGGCTG GAGTGCAGTG GCACGATCTC GGCTCACTGC TCTACCTCAG AACGGGACAA CGGGTCCGAC CTCACGTCAC CGTGCTAGAG CCGAGTGACG
2530 2540 2550 2560 2570 2580
AAACCTCCGC CTCCCGGGTT CAAGCAATTC TCCTGCCTCA GCCTCCCGAG TAGCTGGGAG
TTTGGAGGCG GAGGGCCCAA GTTCGTTAAG AGGACGGAGT CGGAGGGCTC ATCGACCCTC
2590 2600 2610 2620 2630 2640
TGCAGGTGCA CACCGCCATG CCTGGCTGAT TTTTTGTATT TTAGTAGAGA TGGGGTTTCA
ACGTCCACGT GTGGCGGTAC GGACCGACTA AAAAACATAA AATCATCTCT ACCCCAAAGT
2650 2660 2670 2680 2690 2700
CCATGTTGCC TGGGCTGGTT GCAAACTCTT GAGCTC
GGTACAACGG ACCCGACCAA CGTTTGAGAA CTCGAG
2710 2720 2730
5. Gen nach Anspruch 3 mit der Nucleinsäuresequenz pHG 35- 9/35-6-3
GTGTATACAC ACGTCAGGAC ACACACCTCA GTGTATACAC ACaCGTCAGG GGACACACAC
CACATATGTG TGCAGTCCTG TGTGTGGAGT CACATATGTG TGTGCAGTCC CCTGTGTGTG
10 20 30 40 50 60
CTCAGTGTAT ACACACaCGT CAGGACTTAC ACACCTCAGG ACATACACGC ACCTCAGTGT
GAGTCACATA TGTGTGTGCA GTCCTGAATG TGTGGAGTCC TGTATGTGCG TGGAGTCACA
70 80 90 100 110 120
ATACACACAT GTCAGGANAC ACACACCTCA GGAAACACAC GCACCTC&GT GTATACACAC
TATGTGTGTA CAGTCCTNTG TGTGTGGAGT CCTTTGTGTG CGTGGAGTCA CATATGTGTG
130 140 150 160 170 180
ACATCAGGGC ACACATACCT CAGGACACAC ACGCTCCTCÄ GTGTATACAC ACACGTCAGG
TGTAGTCCCG TGTGTATGGA GTCCTGTGTG TGCGAGGAGT CACATATGTG TGTGCAGTCC
190 200 210 220 230 240
ACTTACACAC ACCJCAGTGT ATACACACT^ ATCAGGACAC ACACAGCTCA GGACACACAC
TGAATGTGTG TGGAGTCACA TATGTGTGTG TAGTCCTGTG TGTGTCGAGT CCTGTGTGTG
250 260 270 280 290 300
ACACCTCAGG AGACACACAC ACACCTCAGT GTATACACAC ACGTCAGCAC ACACACACCT
TGTGGAGTCC TCTGTGTGTG TGTGGAGTCA CATATGTGTG TGCAGTCGTG TGTGTGTGGA
310 320 330 340 350 360
CAGGACACAT ACGCACCTCA GGACACATAC GCACCTCAGT GTATACACAC ACGTCAGGAC
GTCCTGTGTA TGCGTGGAGT CCTGTGTATG CGTGGAGTCA CATATGTGTG TGCAGTCCTG
370 380 390- 400 410 420 TTACACACGT CAGGACACAC ACACCTCAGG GCANACATGC ACCTCaGTGT ATACAr ^ac
AATGTGTGCA GTCCTGTGTG TGTGGAGTCC CGTNTGTACG TGGAGTCACA TATGTGTGTG
430 440 450 460 470 430
CTCGGCACAC ACACGCACAA CACAGGAGAT GCACTCAGCT CAGCATACAC ACACACACCT
GAGCCGTGTG TGTGCGTGTT GTGTCCTCTA CGTGAGTCGA GTCGTATGTG TGTGTGTGGA
490 500 510 520 530 540
CAGTGGACAT ACACACACAT ATCTCAGTGC ATATACACAC ATGAGCATAC ACACACCCCA
GTCACCTGTA TGTGTGTGTA TAGAGTCACG TATATGTGTG TACTCGTATG TGTGTGGGGT
550 560 570 580 590 600
GCAGACACCC CAGCAGACAC ACATCCCAGG AAACACACAC ACCTCGGTGT ACACACACGC
CGTCTGTGGG GTCGTCTGTG TGTAGGGTCC TTTGTGTGTG TGGAGCCACA TGTGTGTGCG
610 620 630 640 650 660
GCCTGTGTAT ATACACACTG ACACACACAC CTCGATGTAT ATATGCACAC CTCCTTGGAC
CGGACACATA TATGTGTGAC TGTGTGTGTG GAGCTACATA TATACGTGTG GAGGAACCTG
670 680 690 700 710 720
AGACACAGAT ACCTTGGTGT ACACGGACAC ACATATACCC CTCAGCATAC ACACACATAC
TCTGTGTCTA TGGAACCACA TGTGCCTGTG TGTATATGGG GAGTCGTATG TGTGTGTATG
730 740 750 760 770 780
ACCTCAGCAT ATATACACAT ACACTCCTCA GTGTACACAC ATGCCTCAGC ACACACACAC
TGGAGTCGTA TATATGTGTA TGTGAGGAGT CACATGTGTG TACGGAGTCG TGTGTGTGTG
790 800 810 820 830 840
CTTCAGCACA AGCACACATA CAAACACACC TTGGCTACAC ACACCCATCA GGGTATATAC
GAAGTCGTGT TCGTGTGTAT GTTTGTGTGG AACCGATGTG TGTGGGTAGT CCCATATATG
850 860 870 880 890 900
AGACACCTTG GCATACACAG ACATACACAT CTCCGCAGAC ACACCCCCCC TTAACACACA
TCTGTGGAAC CGTATGTGTC TGTATGTGTA GAGGCGTCTG TGTGGGGGGG AATTGTGTGT
910 920 930 940 950 960
CACACACACA CACACACACA CTCACCAAAA AGGGGTGGGA AATCCAGTGC AGCTGTGAGG
GTGTGTGTGT GTGTGTGTGT GAGTGGTTTT TCCCCACCCT TTAGGTCACG TCGACACTCC
970 980 990 1000 1010 1020
ACTGCCCTGG GAGCTGGGCC AGGAGCTACC TGCCCCTCCC TGAGGGCCTT GTCCCTGCAG
TGACGGGACC CTCGACCCGG TCCTCGATGG ACGGGGAGGG ACTCCCGGAA CAGGGACGTC
1030 1040 1050 1060 1070 1080
TTCCCTCCTG GTCAGGCCCT GCTCTCTCCA ATTCCCTCTT CAGTGTTGAC TCTCCCCACC
AAGGGAGGAC CAGTCCGGGA CGAGAGAGGT TAAGGGAGAA GTCACAACTG AGAGGGGTGC-
1090 1100 1110 1120 1130 1140
CAGGAATTCC TGCCCAACCT CCCGCCCCAG GGCTGTCCTG GCATCGGGCC AGGTTGGCTG
GTCCTTAAGG ACGGGTTGGA GGGCGGGGTC CCGACAGGAC CGTAGCCCGG TCCAACCGAC
1150 1160 1170 1180 1190 1200
AGTAGAAAGA TGACAATCCC AGGGCTACCC TTTCTCCTGT GTCCTGGGGA TTCCTGCTCA
TCATCTTTCT ACTGTTAGGG TCCCGATGGG AAAGAGGACA CAGGACCCCT AAGGACGAGT
1210 1220 1230 1240 1250 1260
CAACAGCACA CAGTGAATGC ACGCTGCCCT GAGGGCGCAG TCTGAATGTG GTCAAAGTCT
GTTGTCGTGT GTCACTTACG TGCGACGGGA CTCCCGCGTC AGACTTACAC CAGTTTCAGA
1270 1280 1290 1300 1310 1320 ATAGGGGCGC GGGCACACCC AAGCAATTCC CCAGTGAGAT CCGCGGAAAG GGGACTGTAT
TATCCCCGCG CCCGTGTGGG TTCGTTAAGG GGTCACTCTA GGCGCCTTTC CCCTGACATA
1330 1340 1350 1360 1370 1380
CTGCAGGGGC AAGGGGGGCG GGCGGATTGG GGAGGAGCTC ATTCGAGGAC ACCCTGAGGC
GACGTCCCCG TTCCCCCCGC CCGCCTAACC CCTCCTCGAG TAAGCTCCTG TGGGACTCCG
1390 1400 1410 1420 1430 1440
TGCAGGGCAG GCAGGACAGG ATGGGGACCA GCACAGGATG GGGACAGCCT GTGACTCAGA
ACGTCCCGTC CGTCCTGTCC TACCCCTGGT CGTGTCCTAC CCCTGTCGGA CACTGAGTCT
1450 1460 1470 1480 1490 1500
CAGGCAGGAG GTCACCAGAG GGGCCAGGGA GGACCAGGAG CTGCTGTGGC TGCTAAAAAT
GTCCGTCCTC CAGTGGTCTC CCCGGTCCCT CCTGGTCCTC GACGACACCG ACGATTTTTA
1510 1520 1530 1540 1550 1560
AATATGGGAA TGGACCTCTG CTGAGCACCT TCTGTGTGCC AGGCATTGAG CTAAATGTTT
TTATACCCTT ACCTGGAGAC GACTCGTGGA AGACACACGG TCCGTAACTC GATTTACAAA
1570 1580 1590 1600 1610 1620
TTAAAACCTC ACTTGATTCT CCAAACAGTA ATGCCTACCA CACACCTACC CCATGAGGTA
AATTTTGGAG TGAACTAAGA GGTTTGTCAT TACGGATGGT GTGTGGATGG GGTACTCCAT
1630 1640 1650 1660 1670 1680
GGTATTATTT TTGGTTCCCA CAGGGGACAC AAGGGACAAC GAGACTCAGA GAGGGGAAAG
CCATAATAAA AACCAAGGGT GTCCCCTGTG TTCCCTGTTG CTCTGAGTCT CTCCCCTTTC
1690 1700 1710 1720 1730 1740
CATTGGCCCA AGTTCACACG CCTCACAACT GGGCAGTAGG TGGAACGGAA CCCAGGCTGT
GTAACCGGGT TCAAGTGTGC GGAGTGTTGA CCCGTCATCC ACCTTGCCTT GGGTCCGACA
1750 1760 1770 1780 1790 1800
GCGGAGGGCT TCCTTGAGGT CGCGGCAATC AAACCCAGAC CCTGACTTGC CCTGCAGCCT
CGCCTCCCGA AGGAACTCCA GCGCCGTTAG TTTGGGTCTG GGACTGAACG GGACGTCGGA
1810 1820 1830 1840 1850 1860
CCCCCGTGGA ATTTCTCACA TTTCCCTGAA TATTCCAGGC CCGTCTCACC TCCTGGCTGT
GGGGGCACCT TAAAGAGTGT AAAGGGACTT ATAAGGTCCG GGCAGAGTGG AGGACCGACA
1870 1880 1890 1900 1910 1920
CCCTTTGGCA TGAAATGGCC TTCTGTCCTC AGTCCCTTCT CTGGGAAAAC TTCCACCCAT
GGGAAACCGT ACTTTACCGG AAGACAGGAG TCAGGGAAGA GACCCTTTTG AAGGTGGGTA
1930 1940 1950 1960 1970 1980
TCTCCAGAGC TCAGCCCCCA GTGCAGCCCC GTCACCTCAT CCTAATCACC CCACCCTAAT
AGAGGTCTCG AGTCGGGGGT CACGTCGGGG CAGTGGAGTA GGATTAGTGG GGTGGGATTA
1990 2000 2010 2020 2030 2040
CGCCTTGCGT TTCACTGTCG GGCTGGGCCC CCCTCCTCJAA GGGCAGGGTC TGCCGGCCCC
GCGGAACGCA AAGTGACAGC CCGACCCGGG GGGAGGAGTT CCCGTCCCAG ACGGCCGGGG
2050 2060 2070 2080 2090 2100
ACACAGCAGC ACAGGGCAGT CGTGAGTGAA TGTGCCTTGT TGGTGAATGA ATGCAGGACC
TGTGTCGTCG TGTCCCGTCA GCACTCACTT ACACGGAACA ACCACTTACT TACGTCCTGG
2110 2120 2130 2140 2150 2160
CAGCCCGGCT GTGGGTCAAA GTAGGTGCTC AGGGAGGGGC CGGGGCCCCC CCTGCCTGGC
GTCGGGCCGA CACCCAGTTT CATCCACGAG TCCCTCCCCG GCCCCGGGGG GGACGGACCG
2170 2180 2190 2200 2210 2220
6. Expressionsprodukte des humanen Gens nach .Ansprüchen 2 bis 5 als GCAP-I mit der nachstehenden Aminosäure¬ sequenz
Val-Thr-Val-Gln-Asp-Gly-Asn-Phe-Ser-Phe-Ser-Leu-Glu-
Ser-Val-Lys-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-Gln-Glu-Pro-Gln-
Glu-Pro-Arg-Val-Gly-Lys-Leu-Arg-Asn-Phe-Ala-Pro-Ile-
Pro-Gly-Glu-Pro-Val-Val-Pro-Ile-Leu-Cys-Ser-Asn-Pro-
Asn-Phe-Pro-Glu-Glu-Leu-Lys-Pro-Leu-Cys-Lys-Glu-Pro-
Asn-Ala-Gln-Glu-Ile-Leu-Gln-Arg-Leu-Glu-Glu-Ile-Ala-
Glu-Asp-Pro-Gly-Thr-Cys-Glu-Ile-Cys-Ala-Tyr-Ala-Ala-
Cys-Thr-Gly-Cys,
sowie seine natürlichen und pharmakologisch verträg¬ lichen Derivate, insbesondere amidierte, acetylierte, phosphorylierte und glycosylierte GCAP-I-Derivate sowie natürliche und künstliche Fragmente mit biologischer Wirkung, die aus der Aminosäuresequenz abgeleitet werden.
7. Verfahren zur Herstellung des GCAP-I oder seiner Deri¬ vate und seiner Fragmente nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß dieses über eine prokaryontische oder eukaryontische Expression hergestellt und chroma¬ tographisch gereinigt wird.
8. Verfahren zur Herstellung des GCAP-I oder seiner Deri¬ vate und seiner Fragmente nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man es aus menschlichem Blut über übliche Chromatographie-Verfahren in an sich bekannter Weise isoliert.
9. Verfahren zur Herstellung des GCAP-I oder seiner Deri¬ vate und seiner Fragmente nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man das GCAP-I oder seine Derivate durch Festphasen- und/oder Flüssigphasen-Synthese aus den geschützten Aminosäuren, die in der ausgegebenen Sequenz enthalten sind, hergestellt, deblockiert und gegebenenfalls gereinigt.
10. Arzneimittel enthaltend das humane, zirkulierende GCAP- I oder seine Derivate und/oder seine Fragmente nach Anspruch 6 bis 9, das GCAP-I als aktiven Wirkstoff neben üblichen Hilfs- und Zusatzstoffen.
11. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 10 zur Be¬ handlung von Erkrankungen, die bei Funktionsstörungen des Elektrolyt-Wasser-Haushaltes auftreten (Nieren- und Darmerkrankungen) .
12. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 10 zur Be¬ handlung von Erkrankungen des menschlichen Organismus, insbesondere mit Beteiligung des Magen-Darm-Traktes, der Atemwege und des Urogenitalapparates.
13. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 10 zur Be¬ handlung von Erkrankungen des menschlichen Organismus, insbesondere mit Beteiligung des Herzkreislauf- und Nervensystems.
14. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 10 zur Be¬ handlung von Erkrankungen des menschlichen Organismus, insbesondere mit Beteiligung des Integumentes und der Sinnesorgane.
15. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 10 zur Be¬ handlung von Systemerkrankungen bei Überproduktion oder Mangel von GCAP-I, insbesondere bei, z. B. durch Anwen¬ dung gegen dieses gebildete Antikörper oder zur Ver¬ wendung von GCAP-I, zur Substitutionstherapie.
16. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 10 zur Be¬ handlung von chronischen Erkrankungen, teils vergesell¬ schaftet mit Erkrankungen gemäß Ansprüchen 11 bis 15, indem es in geeigneter Form für die Behandlung für die Elektrolytwirkung bei Erkrankungen auf den Knochenumbau (Osteoporose) oder am Zahnapparat benutzt wird.
17. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 10 zur Be¬ handlung von akuten Erkrankungen gemäß Ansprüchen 11 bis 16, indem es in geeigneter Form für die Behandlung in der Intensivpflege dieser Erkrankungen benutzt wird.
18. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 10 zur Dia¬ gnose von Erkrankungen, insbesondere nach irgendeinem der Ansprüche 11 bis 17, indem spezifische Antikörper gegen das Peptid oder seiner Derivate und seiner Frag¬ mente hergestellt werden und die Blutkonzentration von GCAP-I über Immuntests gemessen wird.
19. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 10 in ver¬ schiedenen galenischen Applikationsformen, insbesondere der lyophilisierten, mit Mannit aufgenommenen Form in sterilen Ampullen zur Auflösung in physiologischer Kochsalzlösung und/oder Infusionslösungen zur wieder¬ holten Einzelinjektion und/oder Dauerinfusion in Mengen von 300 μg bis 30 mg reines GCAP-I pro Therapie-Ein¬ heit .
20. Verwendung des humanen Gens für die Erkennung und Behandlung der in Ansprüchen 11 bis 17 genannten Er¬ krankungen, indem Gensonden aus dem sequenzierten Bereich abgeleitet, synthetisch oder biotechnologisch hergestellt, und zur Diagnose über Hybridisierungs- techniken (z. B. Southern- und Northern-Blots) sowie mit spezifischer PCR-Reaktion benutzt werden.
21. Verwendung der im Gen des humanen GCAP-I nach An¬ sprüchen 2 bis 5 beschriebenen Nucleotidsequenz zur Konstruktion von Vektoren, die speziell in der Gen- therapie für GCAP-I abhängige Erkrankungen eingesetzt werden können.
22. Verwendung des humanen Gens nach Ansprüchen 2 bis 5 mit seiner erarbeiteten Nucleotidsequenz zur Konstruktion von Expressionssystemen, bestehend aus den in dieser Gensequenz enthaltenen Nucleotidfragmenten zur Pro¬ duktion von GCAP-I bezogenen Peptiden für die wirt¬ schaftliche Verwertung, insbesondere die Behandlung der in Ansprüchen 11 bis 17 genannten Erkrankungen.
23. Verwendung des humanen Gens mit seiner Nucleotidsequenz zur Veränderung des Genoms bei Tieren, die wirtschaft¬ liche Verwendung finden, z. B. in Form von transgenen Spezies oder modifizierten Tierarten, die besonders resistent gegen die in Ansprüchen 11 bis 17 genannten Erkrankungen sind.
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WO1997006258A2 (de) * 1995-08-03 1997-02-20 Forssmann Wolf Georg cDNA-SEQUENZ UND DARAUS ABGELEITETE AMINOSÄURESEQUENZ DES VORLÄUFERPROTEINS VON HUMANEM GCAP-II/UROGUANYLIN SOWIE AMINOSÄURESEQUENZ DES IM HUMANEN BLUT ZIRKULIERENDEN FRAGMENTES
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