DE3876240T2 - Sorbin und abgeleitete peptide, die die absorption durch die mucosa erhoehen. - Google Patents
Sorbin und abgeleitete peptide, die die absorption durch die mucosa erhoehen.Info
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Description
- Die Erfindung betrifft Polypeptide und Peptidderivate, die insbesondere in der Lage sind, die Absorption, speziell von Wasser, Elektrolyten und Nahrungsmitteln über die Schleimhäute zu verstärken.
- Insbesondere betrifft sie Polypeptide von höherer Reinheit und Peptide, die mit diesen Polypeptiden Aminosäuresequenzen gemeinsam haben.
- Es wurden bereits biologische Fraktionen beschrieben, die, insbesondere ausgehend von den Darmschleimhäuten des Schweins, erhalten worden waren, die die obigen Eigenschaften aufweisen. Es handelt sich jedoch um Präparate, bei denen das oder die Wirkprinzipien mit zahlreichen anderen Bestandteilen vermischt sind, die leicht nicht erwünschte Sekundärwirkungen hervorrufen, die sie für therapeutische Anwendungen wenig geeignet machen. Über Polypeptide, die aus den Eingeweiden des Schweins extrahiert wurden, wurde bereits berichtet, aber es gab bisher weder ein Anzeichen über ein vollständiges Verfahren zur Erzeugung solcher Produkte noch über ihre Sequenz.
- Der Einsatz eines Verfahrens zur Reinigung der Polypeptidextrakte aus den Eingeweiden des Schweins ermöglichte es den Erfindern, ein Polypeptid zu isolieren, das beim HPLC- Verfahren einen einzigen Peak zeigte und die weiter oben aufgeführten Aktivitäten aufwies. Dieses Polypeptid wird im weiteren Verlauf der Beschreibung und in den Patentansprüchen als Sorbin bezeichnet. Es konnten nun Derivate dieses Polypeptids und Peptidfragmente entwickelt werden, die biologische Aktivitäten von großem Interesse aufwiesen, insbesondere zeigten sie diejenigen von Sorbin.
- Die Erfindung betrifft die Bereitstellung definierter, hochgereinigter Polypeptide, die als Reagentien und Wirkprinzipien von Medikamenten verwendbar sind sowie ihre Antikörper.
- Weiterhin betrifft sie die Bereitstellung von Peptidderivaten, d.h. die insbesondere einer oder mehreren Aminosäuresequenzen dieser Polypeptide entsprechen, die eine bestimmte biologische Aktivität aufweisen.
- Die Erfindung betrifft ferner die Erzeugung dieser Polypeptide und ihrer Derivate auf verschiedenen Wegen, insbesondere durch Extraktion, gentechnologisch oder, insbesondere für die Peptide, auf chemischem Wege.
- Die Erfindung betrifft weiterhin die kommerzielle Nutzung der biologischen Eigenschaften dieser Peptide und Polypeptide in Arzneimitteln.
- Die erfindungsgemäßen Polypeptide sind dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Teil der Nucleotidsequenz, die sie exprimiert, in der Lage ist, mit mindestens einem Teil des Sorbin- Gens der folgenden Aminosäurensequenz (I) zu hybridisieren:
- Solche Polypeptide sind zweckmäßigerweise in der Lage, eine Steigerung von Wasser, Elektrolyten und Nährstoffen durch die Schleimhäute, insbesondere durch die Verdauungsschleimhäute, hervorzurufen.
- Zur Erläuterung dieser Sequenz und derjenigen, die oben angegeben ist, wird die folgende Nomenklatur mit einem Buchstaben für die Aminosäuren angewendet:
- Alanin=ala=A/ Arginin=arg=R/ Asparagin=asn= N/Asparaginsäure=asp=D/ Glutaminsäure=glu=E/ Glutamin=gln= Q/Glycin=gly=G/ Histidin=his=H/ Isoleucin=ile=I/ Leucin=leu= L/Lysin=lys=K/ Methionin=met=M/ Phenylalanin=phe= F/Prolin=pro=P/ Serin=ser=S/ Threonin=thr=T/ Trytophan=trp= W/Tyrosin=tyr=Y/ Valin=val=V/.
- Die Erfindung betrifft vorzugsweise Polypeptide und Peptidderivate, die mindestens einen Teil eines Heptapeptids mit der Sequenz (II) einschließen:
- P.V.T.K.P.Q.A. - NH&sub2;
- Die erfindungsgemäßen Polypeptide und Peptide sind weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens einen Teil eines Decapeptids einschließen, das der Aminosäurensequenz (III) gehorcht:
- H.E.R.P.V.T.K.P.Q.A. - NH&sub2;.
- Gemäß einer weiteren Eigenschaft umfassen die erfindungsgemäßen Polypeptide und Peptide mindestens einen Teil der folgenden Sequenz (IV) mit 40 Aminosäuren:
- Die Erfindung betrifft insbesondere ein Polypeptid oder Sorbin, das zusätzlich zu den zuvor genannten Eigenschaften eine erhöhte Reinheit aufweist. So ist Sorbin gekennzeichnet durch einen einzigen HPLC-Peak mit einer Retentionszeit von 20 bis 22 Minuten auf einer Mikro-Bondapak C&sub1;&sub8;-Säule von Waters (3,9 x 300 mm) mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 1,5ml/min, bei Verwendung eines Lösungsmittels A, bestehend aus 40 % Methanol und 0,1 % Trifluoressigsäure, und einem Lösungsmittel B aus 80 % Methanol und 0,1 % TFA, wobei der Gradient mit B von 0 bis 75 % in 30 Minuten verläuft.
- Mit der obigen Chromatographiesäule entspricht das erfindungsgemäße Sorbin bei Verwendung desselben Lösungsmittelsystems, aber eines Gradienten von 0 bis 100 % in 20 Minuten, einem Peak, der bei einer Retentionszeit von 15 bis 16 Minuten erhalten wird.
- Das gereinigte Sorbin, wie es nach den obigen Angaben mittels HPLC erhalten worden ist, weist insbesondere 153 Aminosäuren auf und gehorcht der Aminosäurensequenz (I). Das Molekulargewicht dieser Peptidkette beträgt 17 483.
- Ausgehend von den obigen Polypeptiden können verschiedene Peptidfragmente erzeugt werden, insbesondere Sorbin, wobei diese Fragmente hinsichtlich der Absorption durch die Verdauungsschleimhäute oder der verschiedenen biologischen Aktivitäten vom selben Aktivitätstyp sind wie diese Polypeptide.
- Die bevorzugten Peptide umfassen mindestens einen Teil der Sequenz (IV).
- Weitere bevorzugte Peptide umfassen oder entsprechen den Hepta- und Dekapeptiden, die den Aminosäurensequenzen (II) und (III) gehorchen, die weiter oben angegeben sind.
- Selbverständlich ist es möglich, bestimmte Aminosäuren in den Sequenzen (I) bis (IV) zu ersetzen, ohne die Aktivität zu modifizieren oder umgekehrt wird ihnen dank dieser Modifikationen eine gegenteilige Wirkung übertragen, wie sie das eine der folgenden Beispiele zeigt.
- Insbesondere können die basischen Aminosäuren mit diesen Sequenzen durch andere basische Aminosäuren ersetzt werden, wie durch Arginin, Lysin und Histidin. Ebenso können die Aminosäuren mit sauren Gruppen, wie Asparaginsäure und Glutaminsäure, ausgetauscht werden.
- Es ist weiterhin möglich, substitutionelle Gruppen in die Aminosäuren der Peptidkette einzuführen, um ihren Abbau zu verzögern und ihre Wirkungsdauer zu verbessern.
- Die Erfindung betrifft weiterhin Antikörper, die in der Lage sind, die oben definierten Polypeptide und Peptide spezifisch zu erkennen.
- Außerdem betrifft die Erfindung m-RNA-Sequenzen, die den oben definierten Polypeptid- und Peptidderivaten entsprechen. Sie betrifft insbesondere die m-RNA-Sequenz, die der Aminosäurensequenz (I) entspricht.
- Die DNA-Fragmente, die in der Lage sind, mindestens für einen Teil der Polypeptide und ihre oben definierten Derivate zu codieren, sind ebenso wie die codierten Produkte Gegenstand der Erfindung, insbesondere die Polypeptide und Peptide, die eine Aktivität auf die Absorptionsfähigkeit der Schleimhäute ausüben.
- Diese Nucleotidsequenzen sind ferner durch ihre Eigenschaft gekennzeichnet, mit einem Gen zu hybridisieren, das in der Lage ist, mindestens einen Teil der Sorbinsequenz (I) zu exprimieren.
- Die Erfindung betrifft weiterhin Mittel zur Erzeugung von Sorbin und seiner erfindungsgemäßen Derivate.
- Ein Herstellungsverfahren umfaßt die Reinigung durch Flüssigkeitschromatographie und HPLC der aus den Organen von Säugern extrahierten Peptide.
- Gemäß klassischer Verfahren werden diese Peptide mit Essigsäure extrahiert, mit Natriumchlorid ausgesalzen und dann durch alkoholische Fällung gereinigt. Der erzeugte Niederschlag der Peptide wird gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren den folgenden Schritten unterzogen:
- - chromatographisches Reinigen auf Carboxymethylcellulose (CMC) mit Elution durch 0,04 M Ammoniumbicarbonat.
- - Aufnehmen der aktiven Fraktion und erneutes Chromatographieren auf CMC mit Elution durch 0,03 M Ammoniumbicarbonat.
- - Aufnehmen der aktiven Fraktion, die mindestens einer Reinigung durch HPLC (high pressure liquid chromatography) mit einem Lösungsmittel A, bestehend aus Wasser mit 0,1 % Trifluoressigsäure und einem Lösungsmittel B, bestehend aus Acetonitril mit 0,1 % TFA, unterzogen worden war.
- Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden die aufeinanderfolgenden Reinigungen mit HPLC folgendermaßen durchgeführt:
- - unter Verwendung einer Mikro-Bondapak C&sub1;&sub8;-Säule von Waters (7,8 x 300 mm) und eines Gradienten mit Lösungsmittel B von 0 bis 20 % in 10 Minuten, dann von 20 auf 40 % in 40 Minuten und einer Durchflußgeschwindigkeit von 3 ml/Minute wird das aktive Produkt mit einer Retentionszeit von 37 bis 39 Minuten eluiert.
- - unter Verwendung einer Mikro-Bondapak CN-Säule von Waters (3,9 x 300 mm) mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 1,5 ml/Minute und eines Lösungsmittels A, bestehend aus Wasser und 0,1 % TFA, und eines Lösungsmittels B, bestehend aus Acetonitril und 0,1 % TFA, unter Zugabe von Lösungsmittel B als Gradient im Verhältnis 0 bis 20 % in 10 Minuten, dann von 20 bis 40 % in 40 Minuten, wird die aktive Fraktion mit einer Retentionszeit von 37 bis 41 Minuten eluiert.
- - unter Verwendung einer Mikro-Bondapak C&sub1;&sub8;-Säule von Waters (3,9 x 300 mm) mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 1,5 ml/Minute, eines Lösungsmittels A aus 40 % Methanol und 0,1 % TFA, eines Lösungsmittels B, bestehend aus 80 % Methanol und 0,1 % TFA, wobei Gradient B von 0 bis 75 % in 30 Minuten verläuft, beträgt die Retentionszeit von Sorbin 20 bis 22 Minuten.
- Auf einem anderen Weg werden die Polypeptide und ihre Derivate erfindungsgemäß durch die DNA-Rekombinationstechnik erzeugt.
- Ausgehend von einer Nucleotidsequenz, die für Sorbin codiert (die Sequenz wird entweder direkt, ausgehend vom Sorbin-Genom erzeugt oder ausgehend von der entsprechenden m-RNA oder synthetisch), wird die Herstellung dieses Proteins fortgesetzt, indem in der Gentechnik bereits klassisch gewordene Techniken angewendet werden.
- Die Erfindung betrifft ferner vorübergehende Hilfsmittel, wie Vektoren und Bakterienstämme, die zur Erzeugung der Polypeptide verwendbar sind.
- Auf einem noch anderen Weg werden die Polypeptide und ihre Derivate, insbesondere die Peptidfragmente dieser Polypeptide, synthetisch hergestellt.
- In dieser Hinsicht wurden klassische Techniken, insbesondere Festphasentechniken, angewendet.
- Ein Verfahren dieses besonders geeigneten Typs besteht in der Technik der FMOC-Aminosäuren, entwickelt von Carpino et al. in J.O.C 37, 3404-3409 (1972) und Meinhofer in Int. J. Pept. Pro. Res; 1978, 11: 246-249.
- Die FMOC-Amionosäuren (Fluorenylmethoxycarbonyl) werden entweder in Form der Anhydride (instabil, daher in-situ hergestellt durch Aktivierung mit Dicyclohexylcarbodiimid in Dichlormethan) verwendet oder in Form der aktiven Ester (Pentafluorphenylester (PFP)) auf dem Wege der Bildung einer Esterbindung mit DMAP (4-Dimethylaminopyridin) in DMF (Dimethylformamid).
- Die Kupplung wird durchgeführt durch einen kontinuierlichen Umlauf in einer Harzsäule während etwa 35 bis 60 Minuten. Zweckmäßigerweise werden handelsübliche Harze verwendet, die aus Kieselgur-Verbunden und Polyamidgel bestehen, welches in den Poren der makroporösen Kieselgur-Matrix polymerisiert ist, beispielsweise: das Harz Pepsyn-KA (das bei einer Behandlung mit 95 % TFA ein Peptid freisetzt, welches auf eine Aminosäure mit einer freien Säurefunktion endigt), das Harz Pepsyn-B (welches ein Peptid ergibt, dessen C-terminales Ende eine Amidgruppe aufweist, nachdem es mit ammoniakalischem Methanol gespalten worden ist) und das Harz Pepsyn KH (welches nach Spaltung mit 1 % TFA ein geschütztes Aminosäureende ergibt). Die Entfernung der Schutzgruppe vom N-terminalen Ende wird mit 20 % Piperidin in DMF durchgeführt. Die folgenden Aminosäuren werden nach und nach in DMF zugegeben, während ein Katalysator (HOBT, 1-Hydroxybenzotrialzol) vorhanden ist oder nicht, dann vor der Zugabe der nächsten Aminosäure von der Schutzgruppe befreit. Zwischen jeder Stufe der Kupplung und Entfernung der Schutzgruppe wird der Überschuß der Reaktionspartner durch Waschen mit DMF entfernt.
- Am Ende der Umsetzung wird das Peptid vom Harz mit einem Lösungsmittel losgelöst, das je nach Typ des weiter oben angegebenen Harzes geeignet ist. Die Schutzgruppen der Seitengruppen werden mit TFA entfernt. Eine Reinigung über Hochdruckflüssigkeitschromatographie wird anschließend durchgeführt, um unvollständige Peptide oder Peptide, deren Schutzgruppen unvollständig entfernt worden sind, zu entfernen und Peptide zu erhalten, die durch ihre Retentionszeiten, Aminosäurenzusammensetzung und Sequenz eindeutig gekennzeichnet sind.
- Diese Technik besitzt keinen Ausschließlichkeitscharakter, und es können auch andere als die oben beschriebenen Techniken in homogener Lösung oder in fester Phase angewendet werden.
- Beispielsweise wird das Syntheseverfahren in homogener Lösung angewendet, welches von Houben-Weyl in "Methode der organischen Chemie" (Méthode de la chimie organique), herausgegeben von E. Wensch, Bd. 15-I et II, THIEME, Stuttgart 1974, beschrieben ist.
- Dieses Syntheseverfahren besteht in einer schrittweisen Kondensation von jeweils zwei aufeinanderfolgenden Aminoacylen in der erforderlichen Reihenfolge oder in der Kondensation von Aminoacylen und zuvor gebildeten Fragmenten, die schon mehrere Aminoacylreste in der geeigneten Reihenfolge enthalten oder auch mehreren Fragmenten, die zuvor so hergestellt worden sind, wobei selbstverständlich zuvor alle reaktiven Funktionen an diesen Aminoacylen oder Fragmenten sorgfältig geschützt worden sind, mit Ausnahme einer Aminofunktion an einem und einer Carboxylfunktion am anderen Aminoacyl oder umgekehrt, die normalerweise, insbesondere nach der Aktivierung der Carboxylfunktion, gemäß den bei der Peptidsynthese gut bekannten Verfahren, an der Bildung von Peptidbindungen beteiligt sein müssen. Als Variante können Kupplungsreaktionen angewendet werden, die klassische Kupplungsreagentien vom Carbodiimid- Typ verwenden, wie beispielsweise 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid. Weist das verwendete Aminoacyl eine zusätzliche Aminofunktion auf (beispielsweise im Fall von Lysin) oder eine weitere saure Funktion (beispielsweise im Fall von Glutaminsäure), so werden diese Funktionen geschützt, beispielsweise durch Carbobenzoxy- oder t-Butyloxycarbonylgruppen, was die Aminofunktionen betrifft, oder durch t-Butylestergruppen, was die Carboxylfunktionen betrifft. Selbstverständlich wird jede andere reaktive Funktion geschützt. Beispielsweise kann, wenn eines der betreffenden Aminoacyle eine SH-Gruppe (beispielsweise Cystein) enthält, eine Acetamidomethyl- oder Paramethoxybenzylgruppe verwendet werden.
- Im Fall einer schrittweisen Synthese, die Aminosäure für Aminosäure verläuft, beginnt die Umsetzung vorzugsweise mit der Kondensation des C-terminalen Endes der Aminosäure mit der Aminosäure, die dem benachbarten Aminoacyl in der gewünschten Sequenz entspricht, usw., Schritt für Schritt bis zum N-terminalen Ende der Aminosäure. Gemäß einem anderen erfindungsgemäßen bevorzugten Verfahren wird das von R.D.Merrifield in dem Artikel "Solid phase peptide synthesis" (J.Am.Chem.Soc., 454, 2149-2154) beschriebenen Verfahren angewendet.
- Zur Herstellung einer Peptidkette gemäß dem Verfahren von Merrifield wurde ein sehr poröses polymeres Harz verwendet, auf dem die erste C-terminale Aminosäure der Kette befestigt wird. Diese Aminosäure wird vorübergehend über ihre Carboxylgruppe an dem Harz befestigt, und ihre Aminofunktion wird geschützt beispielsweise durch die t-Butyloxycarbonylgruppe.
- Wenn so die erste Aminosäure mit dem C-terminalen Ende auf dem Harz befestigt ist, wird die Schutzgruppe der Aminofunktion durch Waschen des Harzes mit einer Säure entfernt.
- Falls die Schutzgruppe der Aminofunktion eine t-Butyloxycarbonylgruppe ist, kann sie durch Behandeln des Harzes mit Hilfe von Trifluoressigsäure entfernt werden.
- Anschließend erfolgt die Kupplung der zweiten Aminosäure, die das zweite Aminoacyl der gesuchten Sequenz liefert, ausgehend vom C-terminalen Aminoacylrest, an die ungeschützte Aminofunktion der ersten C-terminalen Aminosäure, die mit der Kette verbunden ist. Vorzugsweise wird die Carboxylfunktion dieser zweiten Aminosäure aktiviert, beispielsweise durch Dicyclohexylcarbodiimid, und die Aminofunktion wird geschützt, beispielsweise durch t-Butyloxycarbonyl.
- So wird der erste Teil der gesuchten Peptidkette erhalten, der zwei Aminosäuren trägt und dessen endständiges Amin geschützt ist. Wie zuvor wird die Aminofunktion von der Schutzgruppe befreit, und es kann anschließend mit der Verknüpfung des dritten Aminoacyl unter Bedingungen fortgefahren werden, die denen der Addition des zweiten C-terminalen Endes der Aminosäure analog sind.
- So wird eine nach der anderen Aminosäure, die die Peptidkette aufbauen, an die zuvor jedes Mal von der Schutzgruppe befreite Aminogruppe des bereits gebildeten Teils der Kette, der mit dem Harz verbunden ist, angeknüpft.
- Wenn die Gesamtheit der gewünschten Peptidkette gebildet worden ist, werden die Schutzgruppen der verschiedenen Aminosäuren, die die Peptidkette bilden, entfernt und das Peptid beispielsweise mit Hilfe von Fluorwasserstoffsäure von dem Harz losgelöst.
- Die Studie der pharmakologischen Eigenschaften der Polypeptide und ihrer Derivate zeigte ihre günstige Wirkung auf die Absorption, insbesondere von Wasser, Elektrolyten und Nährstoffen, durch die Schleimhäute, insbesondere durch die Verdauungschleimhäute.
- Die durchgeführten Arbeiten zeigten, daß Sorbin in verringerten Mengen ziemlich weit verteilt wird, jedoch vorherrschend insbesondere im Bereich der Hypophyse, der Nebennieren, der Bronchien und des Duodenum.
- Das Vorliegen von Sorbin in verschiedenen Geweben teilt diesem Peptid und seinen Fragmenten eine allgegenwärtige Rolle zu beim zellulären Transport von Elektrolyten, insbesondere von Chlorid, in allen Bereichen und insbesondere im Verdauungstrakt, bei den bronchialen Sekretionen und im Zentralnervensystem. Im Bereich des Zentralnervensystems wirkt es auf Störungen des Verhaltens, die insbesondere mit einem ionischen Ungleichgewicht verbunden sind.
- Diese günstigen Eigenschaften werden von einer großen unschädlichkeit begleitet.
- Die Erfindung betrifft Arzneimittel, die als ihr aktives Prinzip eine wirksame Menge der Polypeptide und ihrer Derivate, wie sie oben definiert worden sind, in Verbindung mit einem pharmazeutischen Trägerstoff enthalten.
- Die Arzneimittel können intravenös oder buccal verabreicht werden.
- Zur intravenösen Verabreichung werden injizierbare Ampullen verwendet. Diese Präparationen enthalten zweckmäßigerweise 10 bis 50 pmol pro zu gebender Einheit, vorzugsweise 20 bis 40 pmol.
- Weitere Verabreichungsformen sind Pillen, Tabletten, Kapseln mit einer verzögerten Freisetzung im Darmbereich, die 50 bis 500 pmol Wirkprinzip, vorzugsweise 150 bis 200 pmol Wirkprinzip, enthalten.
- Angesichts ihrer Eigenschaften auf die Absorption sind diese Präparate insbesondere folgendermaßen anwendbar:
- - zur Behandlung von infektiösen Diarrhoen und akuten Lebensmittelvergiftungen aufgrund der günstigen Wirkung auf die Steigerung der Absorption von Wasser und Elektrolyten,
- - zur Zusatzbehandlung der parenteralen Wiederbelebung bei einer enteralen Wiedereinführung von Nahrung im Verlauf von infektiösen Krankheiten, chirurgischen Eingriffen, insbesondere im Verdauungsbereich,
- - zur Behandlung bestimmter chronischer Malabsorptionen durch den Anstieg der Absorption von Zuckern und Aminosäuren, der mit einem Anstieg der Absorption von Wasser und Elektrolyten einhergeht,
- - zur Behandlung bestimmter Elektrolytstörungen, insbesondere der Mucoviscidose, gekennzeichnet durch eine Störung der Rückabsorption von Elektrolyten im Bereich der Schweiß-, Speichel-, Bronchial-, Eingeweide- und Bauchspeicheldrüsen,
- - zur Behandlung von Fett- und Wassersucht mit substituierten Derivaten der erfindungsgemäßen Polypeptide und Peptide, die die Absorption von Wasser, Elektrolyten und Nährstoffen unterdrücken.
- Die Erfindung betrifft außerdem die biologischen Reagentien, deren Wirkprinzipien aus Sorbin und seinen Derivaten bestehen. Diese biologischen Reagentien können verwendet werden als Referenz- oder Standardsubstanzen bei den möglichen Wirkungsstudien über die Absorption von Wasser und Elektrolyten mit den Verbindungen.
- Weitere Eigenschaften und Vorteile der Erfindung gehen aus den folgenden Beispielen hervor zur Herstellung von reinem Sorbin und Peptidfragmenten sowie zu ihrer biologischen Aktivität.
- Im Verlauf einer Folge von Verfahrensweisen 1) wird zunächst gemäß den klassischen Verfahren ein Niederschlag der Peptide isoliert in Form von Salzen durch Extraktion, ausgehend von Eingeweiden des Schweins.
- Der erhaltene Salzkuchen wird anschließend einem Reinigungsvorgang 2) unterzogen, um das Sorbin zu isolieren.
- 1. Peptidextraktion, ausgehend von Eingeweiden des Schweins gemäß dem von V.Mutt, Clin. Endocri. 1976, 5, supp. 175S- 183S beschriebenen Verfahren.
- Eingeweide des Schweins, die dem oberen Drittel des Darms entsprechen, werden im Schlachthaus gesammelt und in Wasser zum Kochen gebracht, dann tiefgefroren aufbewahrt. Sie werden anschließend in Stücke geschnitten und durch Macerieren in 0,5 M Essigsäure 12 Stunden lang behandelt. Das Macerat wird filtriert, an Algininsäure adsorbiert, mit 0,2 M Chlorwasserstoffsäure (HCl) eluiert. Die Peptide werden aus dem Eluat durch Natriumchlorid ausgefällt, das bis zur Sättigung zugegeben wird (1 Tonne Eingeweide ergibt 1 kg Niederschlag).
- Der Niederschlag wird in Wasser im Verhältnis 20 g auf 100 ml aufgelöst. Zwei Volumina 95%iges Ethanol werden hinzugegeben. Der pH der Lösung wird über eine Glaselektrode und ein pH-Meter mit Soda (Natriumhydroxid) auf 7,2 eingestellt. Der Niederschlag, der sich bildet, wird abfiltriert und verworfen. Ein Volumen 95%iges Ethanol wird dann bei -20 ºC zu dem geklärten Filtrat gegeben. Das Gemisch wird 48 Stunden lang bei -20 ºC stehengelassen. Der Niederschlag wird durch Filtrieren bei -20 ºC gesammelt. Der Niederschlag wird in einem 0,03 M Phosphatpuffer bei pH 6 aufgelöst und an Carboxymethylcellulose (CMC) adsorbiert und mit demselben Puffer eluiert, der Natriumchlorid in einer Konzentration von 0,3 M enthält. Die Ausbeute dieser Stufe beträgt 22,5 g pro 1 kg des zuvor genannten Extraktes.
- Das Produkt wird nun durch Chromatographie über Sephadex G 25 in 0,2 M Essigsäurepuffer in mehrere Fraktionen aufgetrennt. Das Produkt wird durch Natriumchlorid ausgefällt, das bis zu Sättigung hinzugegeben wird. Die gewonnene Menge in der aktiven Fraktion beträgt etwa 9 g.
- 2. Reinigungsstufen: Der in der vorhergehenden Stufe erhaltene Salzkuchen wird in Wasser mit einer Konzentration von 10 g auf 100 ml aufgelöst. Zwei Volumina 95%iges Ethanol werden hinzugegeben, und der pH wird mit Hilfe einer Lösung, die 1 Volumen 1 M NaOH und 2 Volumina 95%iges Ethanol enthält, auf 7,2 gebracht. Ein Volumen 95%iges Ethanol, welches mit dem neuen erhaltenen Gesamtvolumen identisch ist und auf eine Temperatur von -20 ºC gebracht worden ist, wird zu dem Gemisch gegeben, das 48 Stunden lang bei -20 ºC gehalten wird. Der Niederschlag wird durch Filtrieren gesammelt, dann durch Waschen mit reinem Ethanol und anschließend mit Ether getrocknet und schließlich mehrere Stunden lang im Vakuum getrocknet. Sein Gewicht beträgt etwa 5 g. Diese Stufe erlaubte das Trocknen des Produkts und das Entfernen eines Teils des Salzes.
- Das Produkt wird nun einer Chromatographie über Carboxymethylcellulose (CMC) unterzogen, nachdem es in 0,02 M Ammoniumbicarbonat aufgelöst worden ist. Es wird absorbiert, dann mit 0,04 M Ammoniumbicarbonat eluiert. Die so eluierte, aktive Fraktion beträgt 335 mg.
- Die erhaltene Fraktion wird wiederum in 0,03 M Ammoniumbicarbonat aufgelöst und einer erneuten Chromatographie auf CMC unterzogen. Die Aktivität wird in den Fraktionen gefunden, die zwischen dem 25- und 35fachen Gesamtvolumen der Säule eluiert werden. Das Gewicht der aktiven Fraktion beträgt nicht mehr als etwa 19,2 mg.
- Die folgende Stufe wird mit Hochdruckflüssigkeitschromatographie durchgeführt unter Verwendung eines Lösungsmittels A, bestehend aus Wasser mit 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA), und eines Lösungsmittels B, bestehend aus Acetonitril, enthaltend 0,1 % TFA. Das aktive Produkt wird eluiert über eine Mikro-Bondapak C&sub1;&sub8;-Säule von Waters (7,8 x 300 mm) mit einem Gradienten des Lösungsmittels B von 0 bis 20 % in 10 Minuten, dann von 20 bis 40 % in 40 Minuten und einer Durchflußgeschwindigkeit von 3 ml/Minute mit einer Retentionszeit von 37 bis 39 Minuten.
- Die folgende Stufe besteht in einer HPLC über eine Mikro- Bondapak CN-Säule von Waters (3,9 x 300 mm) mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 1,5 ml/Minute unter Verwendung eines Lösungsmittels A, bestehend aus Wasser und 0,1 % TFA, und eines Lösungsmittels B, enthaltend Acetonitril und 0,1 TFA. Das Lösungmittel B wird als Gradient im Verhältnis von 0 bis 20 % in 10 Minuten, dann von 20 bis 40 % in 40 Minuten zugegeben. Die aktive Fraktion wird mit einer Retentionszeit von 37 bis 41 Minuten eluiert.
- Die letzte Stufe besteht in einer HPLC über eine Mikro- Bondapak C&sub1;&sub8;-Säule von Waters (3,9 x 300 mm) mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 1,5 ml/Minute unter Verwendung eines Lösungsmittels A: 40 % Methanol + 0,1 % TFA, eines Lösungsmittels B: 80 % Methanol + 0,1 % TFA. Der Gradient von B beträgt 0 bis 75 % in 30 Minuten. Die Retentionszeit von Sorbin beträgt so 20 bis 22 Minuten.
- Die auf derselben Säule durchgeführte Reinheitskontrolle mit demselben Lösungsmittelsystem und einem Gradienten von 0 bis 100 % in 20 Minuten zeigt, daß ein einziger Peak erhalten wird, dessen Retentionszeit bei 15 bis 16 Minuten liegt. Es werden 0,462 mg Sorbin am Ende der Reinigung gewonnen, die mit 1 Tonne Eingeweide durchgeführt wird.
- Die Reinheit von Sorbin wurde dadurch gezeigt, daß im HPLC- Spektrum ein einziger Peak und bei der Acrylamid- Gelelektrophorese eine einzige Bande erhalten werden.
- Die Aminosäurenzusammensetzung wurde bestimmt nach der Hydrolyse des Moleküls mit 6 N Chlorwasserstoffsäure und 0,5 % Phenol bei 106 ºC während 24 Stunden und Analyse auf einem Beckman-Analysator. Es wurden zwei Chargen analysiert und die Ergebnisse mit denen verglichen, die durch eine Totalsequenzierung erhalten worden waren.
- Die Bestimmung wurde mit 2 verschiedenen Chargen, genannt 1 und II, durchgeführt, der Mittelwert M aus beiden Chargen ist angegeben. Diese Zusammensetzung wird mit der verglichen, die nach der Sequenz (Seq.) III berechnet worden ist, die unten angegeben ist. Charge gesamt
- Die Bestimmung des N-terminalen Endes gemäß dem Verfahren der klassischen Dansylierung erlaubte es nicht, die endständige Gruppe aufzuklären, was zeigt, daß die endständige Gruppe durch eine Gruppierung blockiert wird, entweder N-Acetyl oder N-Formyl, oder durch eine Gruppierung, die im allgemeinen weniger häufig angetroffen wird. Im Gegenteil zeigt die Anwesenheit der ε-Lysineinheit und der o-Tyrosineinheit im Molekül, daß die Umsetzung günstig verläuft, da bei diesen beiden Aminosäuren die Dansylierung an ihrer freien NH&sub2;- oder OH-Gruppierung und nicht in der endständigen Position verläuft.
- Die Bestimmung der Sorbinstruktur wurde mit Hilfe von Applied und Beckman Sequenziergeräten am Molekül durchgeführt, das zuvor durch 3 verschiedene Verfahren aufgespalten worden war, da eine direkte Sequenzierung aufgrund der Tatsache unmöglich ist, daß das N-terminale Ende durch ein Radikal blockiert ist.
- Unter Einwirkung von Cyanogenbromid wurde das Molekül an den Methioninresten (M oder MET) gespalten. Es wurden 5 Fragmente sequenziert.
- Die GLU-Protease erlaubte eine Spaltung des Moleküls nach dem Lysin- oder Argininrest: es wurden 30 Fragmente sequenziert.
- Die Überschneidung der verschiedenen erhaltenen Fragmente für jedes der Fragmente ermöglichte ein Wiederzusammensetzen des gesamten Sorbinmoleküls.
- Das Peptidfragment, das die 40 letzten Aminosäuren enthält und die Aktivität des gesamten Moleküls hinsichtlich der Absorption von Wasser und Elektrolyten einschließt, konnte durch nichtspezifische Spaltung mit 70%iger Ameisensäure nach 72 Stunden bei Labortemperatur erhalten und auf nicht spezifische Weise durch Spaltung mit Cyanogenbromid hergestellt werden. Die Spaltung mit Cyanogenbromid wird folgendermaßen durchgeführt: unter Verwendung eines 100 ml-Birnenkolben, der einen Schliff aufwies, der auf einen Rotationsverdampfer paßte (der Kolben war mit einem Kühlmittel bestückt, auf das das Vakuum angewendet wurde). Als sich die Probe an der gesamten Wandung verteilt hatte und vollständig getrocknet war, wurde das System geöffnet und 700 ul Ameisensäure, 300 ul Wasser und 0,2 g Cyanogenbromid hinzugegeben. Es wurde gerührt oder 24 Stunden lang bei normaler Temperatur stehengelassen. Am folgenden Tag wird die Probe wie zuvor mit Hilfe eines Rotationsverdampfers zur Trockene eingedampft. Wenn die Probe trocken ist, wird mit 0,5 ml Ameisensäure, 0,5 ml Wasser aufgenommen und wiederum zur Trockene eingedampft. Die durch Cyanogenbromid gespaltenen Produkte werden anschließend durch HPLC über eine Mikro-Bondapak C&sub1;&sub8;-Säule von Waters mit einem Gradienten getrennt, der die oben beschriebenen Lösungsmittel A und B enthielt.
- Mit einem Gradienten des Lösungsmittels B von 0 bis 40 % in 40 Minuten wurde das aktive Peptid bei einer Retentionszeit von 38 bis 40 Minuten abgetrennt und enthält danach die unten angegebenen Aminosäurengehalte:
- - Lysin 0,61 nmol
- - Histidin 0,18,
- - Arginin 0,72
- - Asparginsäure 0,36
- - Serin 0,72
- - Glutaminsäure 0,92
- - Prolin 0,95
- - Valin 0,32
- - Isoleucin 0,18
- - Leucin 0,20
- - Tyrosin 0,25
- - Phenylalanin 0,29
- Die für Sorbin codierende Nucleotidsequenz wird phasengleich eingebaut in die Mitte der Nucleotidsequenz (auf jeden Fall hinter der Anfangssequenz ATG) eines klonierten Gens mit seinem Promotor (oder an den stromaufwärts ein Fremdpromotor geknüpft ist). Die Verwendung von Adaptoren ("Linker") erlaubt je nach betrachtetem Promotor die Verwendung mehrerer verschiedener Typen von Expressionsvektoren: beispielsweise
- dies ist insbesondere der Fall bei Plasmiden, die die Promotor-Operator-Region des Lactoseoperons von E.Coli (lac-Operon) enthalten, gefolgt von der 5'-Region des β-Galactosidase-Gens. Diese Vektoren vom Typ pPC (Charnay und al., Nucleic Acid Research 1978, Band V, Seiten 4479- 4494) erlauben die Insertion eines Fragments, welches für Sorbin in der EcoRI-Region codiert, die 21 Nucleotide hinter der Anfangssequenz ATG der β-Galactosidase liegt. Das exprimierte Protein weist nun als N-terminalen Rest die sieben (oder acht) ersten Aminosäuren der bakteriellen β-Galactosidase auf, gefolgt von den Aminosäuren des Sorbin.
- Es handelt sich inbesondere um Plasmide, die die Promotor- Operator-Region des linken (PL) oder rechten Operons (PR) des λ-Phagen enthalten. Diese Vektoren vom Typ pKC30 (Rosenberg, Nature 1981 Vol. 292, S.128) bzw. pRL447 (Zabeau; Derivat von pRC5 und plG400, letzteres beschrieben in Cell, 1980, Band 20, Seiten 543-553) erlauben die Durchführung der Insertion des für Sorbin codierenden Fragmentes in die Nucleotidsequenzen, die für den N-terminalen Rest des Produkts des N-Gens bzw. für den des Produkts des cro-Gens codieren.
- Diese Vektorsysteme werden fortgepflanzt bei 30 ºC in Lyse- Bakterien durch ein λ-Phage mit wärmeempfindlichem Repressor (cI 857) oder in Gegenwart der Trägerplasmide desselben Gens (cI 857), das für einen wärmeempfindlichen Repressor codiert. Sie bleiben wegen des Repressors inaktiv, obwohl die Kultur bei 30 ºC gehalten wird. Nach Überführen der Kultur auf 42 ºC folgt durch Inaktivieren des Repressors des cI 857-Gens die Aktivierung der λ- Promotoren (PL oder PR) auf dem rekombinanten Plasmid.
- Es wird beispielsweise der SV40-Virus als Vektor verwendet. In diesem Falle wird der späte virale Promotor verwendet, und das für Sorbin codierende Fragment wird vollständig oder teilweise an der Stelle der für die späten SV40- Proteine codierenden Region inseriert. So werden substituierte SV40-Desoxynucleinsäuren gebildet, in denen die für die Capsidproteine codierenden Sequenzen dieses Virus durch die Sequenz ersetzt sind, die für Sorbin bei Bedingungen codieren, welche diese Sequenz unter die Kontrolle der genannten Promotoren stellt.
- Die erzeugten rekombinanten Vektoren können zur Transfomation von Säugerzellen verwendet werden, beispielsweise von CHO-Zellen, deren Polymerasen die SV40-Promotoren erkennen, und zwar unter den Bedingungen, die die Expression der für Sorbin codierenden Sequenz erlauben. Diese kann anschließend isoliert werden, ausgehend von Extrakten der transformierten Zellen, beispielsweise indem eine Lösung dieser Extrakte mit Antisorbin-Antikörpern in Kontakt gebracht wird, die auf einem unlöslichen Träger immobilisiert sind und das Sorbin gewonnen wird, ausgehend von dem auf dem Träger zurückgehaltenen Sorbin-Antisorbin- Komplex.
- Die geeigneten Plasmide tragen Promotoren des Tymidinkinase-Gens des Herpes-Virus (pAGO), des Gens des HBS-Antigens des Hepatitis B-Virus (pAC-2 oder pAC-14) oder von frühen oder späten Genen des Adenovirus 2 etc. Die Insertion des für Sorbin codierenden Fragmentes hinter die ATG-Sequenz des viralen klonierten Gens mit seinem Promotor erlaubt es, daß dessen Expression in der tierischen Zelle (nach Transfektion, Mikroinjektion oder Zellen- Protoplastenfusion) sichergestellt wird oder daß in vitro die Transcription durch einen Extrakt tierischer Zellen (Hela-Zellen) sichergestellt wird, was zur Synthese der entsprechenden m-RNA führt.
- Bei einer Ratte, die seit 45 Stunden ohne Nahrung war, jedoch nach Belieben Wasser erhielt, wird eine Narkose mit Natriumpentobarbital durchgeführt, ein Katheter wird in eine Halsader gelegt, drei Schlingen, dueodenal, jejunal und ileal, werden zwischen zwei Ligaturen angebracht. 1 ml Testlösung, enthaltend 70 mmol NaCl, 5,2 mmol KCl, 1,2 nmol CaCl&sub2;, 10 mmol Na&sub2;CO&sub3; und 136 mmol Mannit, wird in jede Schlinge gegeben, 3H-markiertes PEG 4000 wird als nichtabsorbierbarer Marker verwendet, ²²Na oder ³&sup6;Cl werden als Marker des bidirektionalen Natrium- oder Chloridflusses verwendet. Sorbin oder die Synthese-Peptide werden venös in 0,9 % NaCl mit einer Flußgeschwindigkeit von 3ml/h verabreicht. Nach einer Kontaktzeit von einer Stunde wird die Flüssigkeit, die in der Einflußöffnung der Schlinge zurückbleibt, gesammelt, das Volumen und die Konzentrationen von Na, Ca, K, Cl und HCO&sub3; sowie die Radioaktivität von Tritium, Chlorid oder Natrium werden gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle gezeigt: Dosis pmol/100g Wasser ml Kontrollen Heptapeptid Heptapeptid-Amid Decapeptid-Amid Icosapeptid-Amid Decapeptid-Glycocoll Sorbin Angiotensin II Metenkephalin-Amid
- Die Absorption wird mit einem (-)-Zeichen angedeutet, die Sekretion mit einem (+)-Zeichen. Die Ergebnisse beziehen sich auf Gruppen von 8 Tieren oder mehr.
- M ± SEM P < 0,05 P < 0,01
- Die Prüfung der in der Tabelle gezeigten Ergebnisse zeigt, daß Sorbin und die Synthese-Peptide die Absorption von Elektrolyten und Wasser im Duodenum und Jejunum der Ratte steigern. Es wird festgestellt, daß die Wirksamkeit im Bereich des Duodenum der verschiedenen erzeugten Peptide äquivalent ist mit der von vierfach höheren Dosen Angiotensin II und 500fach höheren Dosen Metenkephalinamid, die als Referenzpeptide dienen.
- Zweckmäßigerweise führen Sorbin und seine endständigen Peptide im Gegensatz zu Angiotensin II nicht zu einer Erhöhung der durch Kathederisierung der Carotide gemessenen arteriellen Spannung. Sorbin und seine C-terminalen Peptide führen im Gegensatz zu Metenkephalinamid nicht zu einer Hemmung der intestinalen, durch Stromstöße stimulierten Kontraktion. Es wird festgestellt, daß das Decapeptid, das in der C-terminalen Position eine zusätzliche Aminosäure, nämlich ein Glycocoll-Gruppierung besitzt, genauer gesagt eine, deren Amidradikal durch Glycocoll ersetzt ist, eine antagonistische Wirkung des Sorbin und der C-terminalen Peptide aufweist, indem eine Sekretion anstelle der Absorption bewirkt wird.
- Eine Meerschweinchen-Gallenblase wurde bereits vor dem Tod der Tiere durch cervicale Ruptur entnommen. Die Blase wurde mit einer Krebs-Lösung gefüllt und in ein Bad auf der Grundlage von Krebs-Lösung gegeben und aus Flaschen mit einem Gemisch aus 95 % Sauerstoff, 5 % Kohlensäuregas versorgt. Die Absorption wurde durch die Gewichtskurve der Blasen bestimmt, die alle 5 Minuten gewogen wurden, als Sorbin zu der Krebslösung gegeben wurde. Eine Beschleunigung des Gewichtsverlustes im Vergleich zur Kontrollzeit stellt eine Erhöhung der Absorption dar, die sich im Vergleich zu dem stündlichen Gewichtsverlust der Kontrolle durch eine Verringerung des Betrags des stündlichen Gewichtsverlustes bei Behandlung äußerte.
- Sorbin und die Synthesefragmente vom Heptapeptid bis zum Icosapeptid wurden mehrmals an Kaninchen injiziert bis spezifische Antikörper erhalten wurden. Eine radioimmunologische Dosis konnte deutlich abgegeben werden und erlaubte die Messung der Sorbinmenge in den Geweben. Diese ist in verringerten Mengen ziemlich breit verteilt, ist jedoch insbesondere im Bereich der Hypophyse, der Nebennieren, Bronchien und des Duodenum vorherrschend.
Claims (14)
1. Polypeptide und Peptidderivate, die insbesondere zur
Erhöhung der Absorptionsfähigkeit der Schleimhäute
befähigt sind, dadurch gekennzeichnet, daß sie die
nachstehende Aminosäuresequenz (1)
oder einen Teil dieser Sequenz umfassen, mit der
Maßgabe, daß die erhaltenen Polypeptide oder Peptide
insbesondere zur Erhöhung der Absorptionsfähigkeit der
Schleimhäute befähigt sind.
2. Polypeptide und Peptidderivate, dadurch gekennzeichnet,
daß sie mindestens einen Teil des Heptapeptids der
nachstehenden Sequenz (II) umfassen und insbesondere zur
Erhöhung der Absorptionsfähigkeit der Schleimhäute
befähigt sind:
P.V.T.K.P.Q.A - NH&sub2;
3. Polypeptide und Peptidderivate, dadurch gekennzeichnet,
daß sie mindestens einen Teil des Dekapeptids der
nachstehenden Aminosäuresequenz (III) umfassen und
insbesondere zur Erhöhung der Absorptionsfähigkeit der
Schleimhäute befähigt sind:
H.E.R.P.V.T.K.P.Q.A - NH&sub2;
4. Polypeptide und Peptidderivate, dadurch gekennzeichnet,
daß sie mindestens einen Teil der aus 40 Aminosäuren
bestehenden Sequenz (IV) umfassen und zur Erhöhung der
Absorptionsfähigkeit der Schleimhäute befähigt sind:
5. Sorbine mit hohem Reinheitsgrad nach einem der Ansprüche
1 bis 4, das insbesondere zur Erhöhung der
Absorptionsfähigkeit der Schleimhäute befähigt ist, und das bei der
HPLC mit einer micro-Bondapak C18-Säule, Waters (3,9 x
300 mm), und einem Durchfluß von 1,5 ml/Minute unter
Verwendung eines aus 40%igem Methanol und 0,1% TFA
bestehenden Lösungsmittels A und eines aus 80%igem
Methanol und 0,1% TFA bestehenden Lösungsmittels B, nur ein
Signal mit einer Retentionszeit von 20 bis 22 Minuten
aufweist, wobei der Gradient von B innerhalb von 30
Minuten von 0 bis 75% erhöht wird.
6. Sorbine mit hohem Reinheitsgrad nach einem der Ansprüche
1 bis 4, das insbesondere zur Erhöhung der
Absorptionsfähigkeit der Schleimhäute befähigt ist, das bei der
HPLC mit einer micro-Bondapak C18-Säule, Waters (3,9 x
300 mm), und einem Durchfluß von 1,5 ml/Minute unter
Verwendung eines aus 40%igem Methanol und 0,1% TFA
bestehenden Lösungsmittels A und eines aus 80%igem
Methanol und 0,1% TFA bestehenden Lösungsmittels B nur ein
Signal mit einer Retentionszeit von 15 bis 16 Minuten
aufweist, wobei der Gradient von B innerhalb von 20
Minuten von 0 bis 100% erhöht wird.
7. Sorbine nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet,
daß es der Sequenz (I) von Anspruch 1 entspricht.
8. Dekapeptid, entsprechend der Sequenz (III) von Anspruch
3.
9. Antikörper, der zur Erkennung eines spezifischen
Polypeptids oder Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 8
befähigt ist.
10. mRNA-Sequenzen, die den Polypeptiden und Peptidderivaten
nach einem der Ansprüche 1 bis 8 entsprechen.
11. DNA-Fragmente, die mindestens einen Teil der Polypeptide
und ihrer Derivate nach einem der Ansprüche 1 bis 8
kodieren, gekennzeichnet durch ihre Fähigkeit zur
Hybridisierung mit einem Gen, welches zur Expression von
mindestens einem Teil des Sorbines der Sequenz (I)
befähigt ist.
12. Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden nach einem
der Ansprüche 1 bis 8, wobei mit Hilfe einer Säure wie
Essigsäure Peptide aus Säugetierorganen extrahiert
werden, diese mit Hilfe eines Salzes wie Natriumchlorid
ausgesalzt und durch Ausfällen mittels eines Alkohols
gereinigt werden, dadurch gekennzeichnet, daß der
Niederschlag folgenden Schritten unterworfen wird:
- Reinigung durch Chromatographie über
Carboxymethylcellulose (CMC) mit Elution durch Ammoniumbicarbonat
0,04M,
Rückgewinnung der aktiven Fraktion und erneute
Chromatographie, über CMC mit Elution durch
Ammoniumbicarbonat 0,03M,
- Rückgewinnung der aktiven Fraktion, die mindestens
einem Reinigungsschritt durch HPLC unter Verwendung
eines aus Wasser und 0,1% Trifluoressigsäure
bestehenden Lösungsmittels A und eines aus Acetonitril
und 0,1% TFA bestehenden Lösungsmittels B unterworfen
wird.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß
die nachstehenden, aufeinanderfolgenden
Reinigungsschritte mit HPLC durchgeführt werden:
- Verwendung einer micro-Bondapak C18-Säule, Waters
(7,8 x 300 mm), und eines Gradienten für das
Lösungsmittel B von 0 bis 20% innerhalb von 10 Minuten und
von 20 bis 40% innerhalb von 40 Minuten bei einem
Durchfluß von 3 ml/Minute, wobei die aktive Substanz
mit einer Retentionszeit von 37 bis 39 Minuten eluiert
wird,
- Verwendung einer micro-Bondapak CN-Säule, Waters (3,9
x 300 mm), bei einem Durchfluß von 1,5 ml/Minute, mit
einem aus Wasser und 0,1% TFA bestehenden
Lösungsmittel A und einem aus Acetonitril und 0,1% TFA
bestehenden Lösungsmittel B, wobei das Lösungsmittel
B mit einem Gradienten von 0 bis 20% innerhalb von 10
Minuten und von 20 bis 40% innerhalb von 40 Minuten
zugegeben wird und die aktive Fraktion mit einer
Retentionszeit von 37 bis 41 Minuten eluiert wird,
- Verwendung einer micro-Bondapak C18-Säule, Waters 3,9
x 300 mm), bei einem Durchfluß von 1,5 ml/Minute, mit
einem aus 40%igem Methanol und 0,1% TFA bestehenden
Lösungsmittel A und einem aus 80%igem Methanol und
0,1% TFA bestehenden Lösungsmittel B, wobei der
Gradient von B innerhalb von 30 Minuten von 0 bis 75%
erhöht wird und die Retentionszeit des Sorbines 20 bis
22 Minuten beträgt.
14. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, daß es eine
wirksame Menge von mindestens einem Polypeptid oder
Peptidderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 8 umfaßt.
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