DE69230610T2

DE69230610T2 - Peptide mit zyklischen Hauptketten, deren Herstellung und diese enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen

Info

Publication number: DE69230610T2
Application number: DE69230610T
Authority: DE
Inventors: Gerardo Byk; Chaim Gilon; Zvi Zelinger
Original assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Current assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Priority date: 1991-10-02
Filing date: 1992-10-02
Publication date: 2000-12-28
Anticipated expiration: 2012-10-03
Also published as: JP3509029B2; US5723575A; EP0564739A3; ATE189228T1; IL99628A; DE69230610D1; JPH06263797A; EP0564739B1; EP0564739A2; IL99628A0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft biologisch aktive, in der Hauptkette cyclisierte Peptide, Verfahren zu deren Herstellung und pharmazeutische Zusammensetzungen, welche sie enthalten.
Insbesondere entsprechen die erfindungsgemäßen Peptide den allgemeinen Formeln (I) und (II):
worin die Substituenten und die Bogenlinie wie nachstehend hierin definiert sind.
Im Anschluß an die Pionierarbeit von R. Schwyzer [Ludecher, U., et al., Helv. Chim. Acta 54, 1637 (1971)] über Gramidicin S ist Konformationsrestriktion von Peptiden durch Cyclisierung im mittleren und langen Bereich extensiv angewandt worden. Zusätzlich zu anderen Arten von Konformationsrestriktion, wie etwa Konfigurations- und Strukturveränderung von Aminosäuren, werden lokale Modifizierungen in der Hauptkette, Cyclisierungen im kurzen Bereich etc., Cyclisierung im mittleren und langen Bereich [Hruby, V. J., Life Sci. 31, 189 (1982), Kessler, H., Angew. Chem. Int. Ed. Eng. 21, 512 (1982); Schiller, P. W., in "Peptides", Udenfriend, S., und Meienhofer, J., Hrsg., Volume 6, S. 254 (1984), Veber, D. F. und Freidinger, R. M., Trends in Neurosci. 8, 392 (1985), Milner-White, E. J., Trends in Pharm. Sci. 10, 70 (1989)] für die folgenden Zwecke verwendet: Biologisch aktive Peptide werden cyclisiert um metabolische Stabilität zu erreichen, Wirksamkeit zu erhöhen, Rezeptorselektivität zu vermitteln oder zu verbessern und Bioverfügbarkeit zu steuern. Die Möglichkeit, diese wichtigen pharmakologischen Eigenschaften durch Cyclisierung von linearen Peptiden zu steuern, regte an, Cyclisierung im mittleren und fangen Bereich zur Überführung von natürlichen bioaktiven Peptiden zu petidomimetischen Arzneimitteln zu verwenden. Cyclisierung bringt auch strukturelle Spannungen mit sich, welche die Konformationshomogenität verstärken und Konformationsanalyse vereinfachen [Kessler, H., Angew. Chem. Int. Ed. Eng., 21, 512 (1982)]. Darüber hinaus liefert die Kombination von Untersuchungen der Beziehung zwischen struktureller Steifigkeit und Aktivität und Konformationsanalyse Erkenntnisse bezüglich der biologisch aktiven Konformation von linearen Peptiden.
Zusätzlich zu anderen restriktiven Verfahren, wie etwa Templat-assoziierte synthetische Proteine [Mutter, M. und Vuilleumier, S., Angew. Chem. Int. Ed. Eng., 101, 551 (1982)], werden Cyclisierungen im mittleren und langen Bereich auch zur gesteuerten Stabilisierung von Sekundär- und Tertiärstrukturen von Proteinen verwendet.
Kleine, lineare, biologisch aktive Peptide liegen in Lösung üblicherweise in einem sich schnell einstellenden Gleichgewicht von ineinander überführbaren Konformationen vor [Kessler H., Angew. Chem. Int. Ed. Eng., 21, 512 (1982)], was zu einem Fehlen von Rezeptorselektivität und metabolischer Suszeptibilität führen kann [Veber, D. F. und Freidinger, R. M., Trends in Neurosci. 8, 392 (1985)]. Darüber hinaus behindert dieses sich schnell einstellende Gleichgewicht auch Versuche, ihre Konformationen in Lösung, einschließlich der biologisch aktiven Konformation, zu bestimmen. Beispielsweise kann ein gegebenenes lineares Peptid in Lösung in einem sich schnell einstellenden Gleichgewicht des Konformationsisomeren A, welches Rezeptor A aktiviert, des Konformationsisomeren B, welches Rezeptor B aktiviert, und in einer extendierten Konformation C, das in die aktive Stelle eines Abbauenzyms paßt, vorliegen. Strukturelle Modifikationen, die das sich schnell einstellende Gleichgewicht verlangsamen und den Konformationsraum einengen, üben Konformationsspannungen auf lineare Peptide aus [Kessler, H., Angew. Chem. Int. Ed. Eng., 21, 512 (1982)].
Die beste Modifikation unter einem biologischen Gesichtspunkt verlangsamt idealerweise die Gleichgewichtseinstellung oder verringert den Konformationsraum in einem solchen Ausmaß, so daß das Peptid nur mit Rezeptor A wechselwirkt und weder die Konformation, welche Rezeptor B aktiviert, oder die extendierte, abbaubare Konformation C annimmt. Bei einem Versuch die aktive Konformation zu bestimmen, können weitere Restriktionen erforderlich sein. Experimentelle Beweise für die Gültigkeit des vorstehend erläuterten Theorems können gefunden werden für Enkephaline, Somatostatin, Gonadotropin-freisetzendes Hormon (GnRH), Cholecystokinin (CCK), Melanocyten-stimulierendes Hormon (αMSH) und viele andere Peptide, bei denen eine Cyclisierung zu Rezeptorselektivität und metabolischer Stabilität führt [Hruby, V. J., Life Sci. 31, 189 (1982), Kessler, H., Angew. Chem. Int. Ed. Eng., 21, 512 (1982), Schiller, P. W., in "Peptides", Udenfried, S., und Meienhofer, J., Hrsg., Volume 6, S. 254 (1984), Veber, D. F. und Freidinger, R. M., Trends in Neurosci 8 392 (1985), Milner-White, E. J., Trends in Pharm.
Sci. 10, 70 (1989), Al-Obbeidi, F., et al., J. Med. Chem., 32, 2555 (1989), Charpentier, B., et al., J. Med. Chem., 32 1184 (1989), Rivier, J. E., et al., in "Peptides", Rivier, J. E. und Marshall, G. R. Hrsg., S. 33 (1990)], und in sehr wenigen Fällen sogar eine Konformationsanalyse der bioaktiven Konformation gestattete [Kessler, H., Angew. Chem., 25 997 (1986)].
Konformationsrestringierte Peptide, die Cyclisierungen im mittleren und langen Bereich umfassen, wurden hauptsächlich unter Befolgung der gleichen Cyclisierungsarten wie bei homodeten und heterodeten natürlichen Peptiden hergestellt. Diese umfassen: a Cyclisierung von Seitenkette zu Seitenkette (üblicherweise die Bildung eines Lactamrings und/oder einer -S-S-Bindung durch Cyclisierung von funktionellen Gruppen, welche bereits in der nativen Sequenz vorhanden sind, oder durch Substitution von anderen Aminosäuren mit Glu und Lys bzw. Cys), b Cyclisierung von Ende zu Ende (früher als Hauptkette-zu-Hauptkette-Cyclisierung bezeichnet) [Manesis, N. J. und Goodman, M., Org. Chem., 52, 5331 (1987)] und q Cyclisierung von Seitenkette zu Endgruppen.
Die letzte Cyclisierungsart umfaßt Cyclisierungen von einer Seitenkette zum Aminoende und von einer Seitenkette zum Carboxyende. Die genaue Position, Art und Größe des Rings (die auch durch "Abstandhalter (spacer)" [Manesis, N. J. und Goodman, M., Org. Chem., 52, 5331 (1987)] gesteuert werden kann) um maximale Selektivität und Aktivität zu erreichen, wird hauptsächlich durch Überlegungen in Bezug auf die Struktur-Aktivität-Beziehung (SAR, structureaktivity-relationship) in Verbindung mit Konformationsanalyse bestimmt.
Trotz des eindrucksvollen Erfolgs, der mit cyclischen Peptiden bisher erreicht worden ist, verursachte eine Cyclisierung gemäß den vorstehenden Arten manchmal den Verlust von biologischer Aktivität, insbesondere wenn sie im "aktiven Bereich" von bioaktiven Peptiden ausgeführt wurde. Ein typisches Beispiel für die Cyclisierung von Peptiden ist die von Substanz P (SP) und dessen verwandten Peptiden, den Säuger-Tachykininen Neurokinin A (NKA) und Neurokinin B (NKB). Die Tachykinine sind kurze lineare Peptide (zehn bis elf Aminosäurereste), welche die gemeinsame Carboxy-terminale Sequenz - Phe-X-Gly-Leu-Met-NH&sub2; (X = Phe oder Val) aufweisen. Die Aminosäuresequenz von Substanz P ist die folgende:
(die Positionen der Aminosäurereste in SP werden in der Beschreibung und den Beispielen hierin nachstehend verwendet werden).
SP und die anderen Tachykinine wurden mit einer Reihe von physiologischen Funktionen, einschließlich der Übertragung von Schmerzstimuli, Drüsensekretion, Darmmotilität, Gefäßerweiterung,
Entzündungsschmerzreaktion und einer Reihe von Wirkungen auf das Verhaften in Verbindung gebracht. Die Tachykinine aktivieren drei Rezeptoren, NK-1, NK-2 und NK-3 [Trends Pharm. Sci. Receptor Nomenclature Suppiement S. 25 (1990)]. Die Säuger-Tachykinine sind in dem Sinn nicht selektiv, daß jedes von ihnen mehr als einen Rezeptor aktiviert. So aktiviert beispielsweise NKB die Rezeptoren NK-1 und NK-3 mit vergleichbarer Wirksamkeit (EC50(nM) von 4,2 bzw. 1,3 [Papier-Kricheli, D., et al., Pain, 31, 263 (1987)]).
Zusätzlich zu ihrer fehlenden Selektivität werden die Säuger-Tachykinine insbesondere in in vivo Assays rasch abgebaut [Wormser U., et al., in "Peptides 1984" Ragnarsson, U., Hrsg., S. 359 (1985)].
Die jetzigen Erfinder haben zwei lineare Hexapeptid-Analoga der Carboxyterminalen Sequenz von SP mit gespannter Konformation hergestellt, die Nalkylierte Aminosäuren beinhalten und die Rezeptorselektivität zeigten. Das NK- 3 selektive Analogon Sektide [Laufer, R., et al., J. Biol. Chem., 22, 10257 (1986)] (succ[Asp&sup6;, N-Me Phe&sup8;]SP&sub6;&submin;&sub1;&sub1;, EC&sub5;&sub0; (nM) NK-3 : 0,5, NK-2: > 200.000, NK-1 : 35.000) und das NK-1 selektive Analogon WS Septide [Papir-Kricheli, D., et al., Pain, 31, 263 (1987)] (Ac[Arg&sup6;, Pro&sup9;]SP&sub6;&submin;&sub1;&sub1;, EC&sub5;&sub0;(nM) NK-1 : 3,0, NK-2: > 200.000, NK-3: > 100.000). Sektide ist metabolisch in allen untersuchten Geweben stabil, während WS Septide metabolisch instabil ist (Halbwertszeit von wenigen Minuten in Leber, Nieren und Parotis-Schnitten).
Die jetzigen Erfinder haben versucht, die zwei selektiven Analoga Sektide und WS Septide zu verwenden, um die konformationellen Anforderungen der Rezeptoren NK-3 bzw. NK-1 aufzuklären. Dazu bauten sie mutmaßliche, auf NMR-Studien [Levian-Teitelbaum, D., et al., Biopolymers, 28. 51 (1989)] beruhende Molekülmodelle von Sektide und WS Septide. Zur Korrelation der Molekülmodelle von Sektide und WS Septide mit der bioaktiven Konformation konnten zusätzliche Konformationsspannungen, wie etwa Cyclisierung, eingeführt werden. Vorausgesetzt, daß diese steiferen Analoga ihre Bioaktivität und Selektivität beibehalten würden, könnten sie weiterer Konformationsanalyse unterzogen werden. Versuche, die aktive Region von SP, nämlich das Cterminale Hexapeptid zu cyclisieren, führten zu biologisch inaktiven Verbindungen [Neubert, K., et al., Pharmazie 40, 617 (1985), Chassing, G., et al., in "Peptides 1984" Ragnarsson, U., Hrsg. S. 345 (1985), Sandberg, B. E. B., et al., in "Peptides 1984" Ragnarsson, U., Hrsg. S. 369 (1985); Theodoropoulos, D., et al., J. Med. Chem., 28. 1536 (1985), Drmen, P. S., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 127, 656 (1985), Mutulis, F., et al., Bioorg. Chim., 11, 1276 (1985)].
In einem theoretischen Artikel [Gilon, C., et al., Biopolymers, 31, 745 (1991), siehe auch Chem. Abstracs 114, Nr. 102801, Vol. 115, Nr. 208555, Vol. 117, Nr. 205809] stellten die Erfinder ein neues allgemeines Cyclisierungskonzept vor unter Verwendung von WS Septide als Modellpeptid. Das vorgeschlagene neue Cyclisierungsverfahren wurde als "Hauptkettencyclisierung" bezeichnet und wird in dem Artikel ausführlich diskutiert. Manche der cyclisierten Peptide, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, werden in dem Artikel in allgemeiner Form offenbart, der Artikel schlägt jedoch kein Verfahren zur Herstellung der vorliegenden Verbindungen vor.
Anschließende Arbeiten durch die Gruppe der jetzigen Erfinder führte zur Herstellung der vorliegenden neuen cyclisierten Peptide. Ungeachtet der Tatsache, daß die durch Cyclisierung zu erreichenden Ziele gut definiert waren, und obwohl die theoretischen SAR-Überlegungen berücksichtigt wurden, bedurfte es großer Anstrengungen, um zu den neuen, biologisch aktiven und selektiven Peptiden zu gelangen. Die SP-Analoga, welche hierin nachstehend spezifisch als Beispiele erläutert werden, sind als Modelle für die offenbarten universellen Cyclisierungsverfahren und die dadurch hergestellten cyclischen Peptide anzusehen.
Neuropeptide steuern einen breiten Bereich endokrinologischer, motorischer und verhaltensmäßiger Aktivitäten [Krieger, D. T., Science 222, 975-978 (1983), Snyder, S. H. Science 209, 976 (1980)]. Diese Substanzen vermitteln ein großes Spektrum physiologischer Funktionen, einschließlich Analgesie, Steuerung des Appetits, Durst, Körpertemperatur, Gemütsverfassung, Lernen, neurologisches Verhalten, Schmerz und Modulation der Immunantwort.
Derivate der natürlich vorkommenden Neuropeptide, sowohl als Agonisten als auch als Antagonisten, haben demnach ein großes Potential in der Verhinderung und Behandlung vieler neurologischer Störungen und Verhaltensstörungen.
Trotz vieler Versuche gibt es jedoch nur wenige Liganden, die therapeutisch verwendet werden. Die früheren Versuche waren hauptsächlich darauf gerichtet, die biologische Aktivität der natürlich vorkommenden Peptide zu imitieren. Um ein therapeutisches Mittel zu entwerfen und zu synthetisieren, das die Aktivität steuern und/oder modulieren würde, müssen viele Faktoren berücksichtigt werden. Information bezüglich der bioaktiven Konformation des Peptids ist von Bedeutung. Die Peptide können in unterschiedlichen Konformationen vorkommen, von denen jede für einen unterschiedlichen Rezeptor spezifisch ist. Zusätzlich zu der gewünschten biologischen Aktivität würde ein Fehlen von Konformationsstabilität zu Assoziation mit ungewünschten Rezeptoren, und zu unerwünschten Nebenwirkungen führen. Bisher wurde nur von sehr wenigen der vielen bekannten Neuropeptide die bioaktive Konformation bestimmt.
Neuropeptide unterliegen im Magen-Darm-Kanal, im Blut und in anderen Geweben einem schnellen proteolytischen Abbau. Die Pharmakokinetik von Neuropeptiden in der Synapse ist von der eines therapeutischen Peptids völlig verschieden. In der Synapse ist der erforderliche Zeitraum, damit die Neuropeptide ihre Funktion erfüllen, aufgrund des vorherrschenden kurzen Abstands sehr kurz. Die endogenen Proteasen, die für die Beendigung der Aktivität eines bestimmten Neuropeptids verantwortlich sind, sind die einzigen in der Umgebung vorhandenen, und sie bauen das Peptid ab, unmittelbar nachdem es seine Funktion erfüllt hat. Bei der Konstruktion eines therapeutischen Peptids sollte dessen Struktur gegen die für seinen Abbau verantwortlichen Proteasen sowie gegen andere Proteasen, die im Magen- Darm-Kanal, Blut und anderen Geweben vorhanden sind, stabilisiert werden.
Natürliche Peptide können die Magen-Darm/Blut-Schranke und die Blut/Hirn- Schranke nicht einfach passieren. Dieses Problem kann von dem einer metabolischen Stabilität nicht abgesondert werden. Eine Passage sowohl durch die Magen-Darm/Blut-Schranke als auch die Blut/Hirn-Schranke sind Schlüsselschritte bei Überlegungen hinsichtlich der Verwendung eines Peptids als ein Arzneimittel. Obwohl mehrere Peptide erfolgreich gegen Abbau stabilisiert worden sind, blieb ihre Bioverfügbarkeit, nämlich die Passage der BIut/Hirn-Schranke ein Mysterium. Zusätzlich induzieren verschiedene Rezeptoren verschiedene physiologische Aktivitäten, daher würde eine Aktivierung eines unerwünschten Rezeptors durch das Peptid unerwünschte Nebenwirkungen verursachen. Die allgemeine Hypothese ist, daß ein lineares Peptid in einem Zustand einer schnellen Gleichgewichtseinstellung zwischen einer großen Anzahl von Konformationen vorliegt, von denen manche ungewünschte Rezeptoren aktivieren würden. Das Peptid muß auch in der richtigen Konformation vorliegen, um enzymatischem Abbau zu unterliegen. Nur die gewünschte Konformation, bezeichnet als die bioaktive Konformation, würde den gewünschten Rezeptor aktivieren und ausschließlich zu der gewünschten spezifischen biologischen Aktivität führen.
Diese Probleme von natürlich vorkommenden Peptiden wie etwa beispielsweise Neuropeptiden sind von großer Bedeutung und stellen große Probleme dar, das Peptid als ein Arzneimittel einzusetzen sowie die pharmakologische und molekulare Wechselwirkung zwischen dem Peptid und seinem Rezeptor zu verstehen.
Erfolgreiche Ergebnisse aus dem bekannten Stand der Technik, beispielsweise die analgetischen peptidomimetischen Opiate, die "Imitationen" von endogenen Enkephalinen sind, wurden durch Arbeiten erreicht, die eher zufällig als rationell geplant waren und nicht alle der vorstehend beschriebenen Faktoren berücksichtigten.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig. 1 veranschaulicht das Konzept der Hauptketten-Cyclisierung,
Fig. 2 zeigt den Abbau von WS-Septide (Stand der Technik) und Peptid Ia durch Parotis-Schnitte, und
Fig. 3 zeigt die Dosis-Wirkung-Kurven von WS-Septide (Stand der Technik) und Peptid Ia.

ZUSAMMENFASSUNG UND BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von in der Hauptkette cyclisierten, biologisch aktiven Polypeptiden der allgemeinen Formel:
bereitgestellt, worin
n eine ganze Zahl von 1 bis 10 darstellt,
m eine ganze Zahl von 1 bis 10 darstellt,
[AA] einen natürlich vorkommenden oder synthetischen Aminosäurerest darstellt, wobei die Aminosäurereste, wenn n größer 1 ist, gleich oder verschieden sein können,
[A¹A¹] einen natürlich vorkommenden oder synthetischen Aminosäurerest darstellt, wobei die Aminosäurereste, wenn m größer 1 ist, gleich oder verschieden sein können,
R und R' eine natürlich vorkommende oder synthetische Aminosäure- Seitenkette darstellen,
E eine Hydroxylgruppe, oder eine Carboxylschutzgruppe, die in der Peptidsynthese Standard ist [z. B. Schroeder et al., "The Peptides", Vol. I, Academic Press, 1965, oder Bodanszky, "Principles of Peptide Synthesis", Springer-Verlag, 1984, oder Bodanszky et al., "The Practice of Peptide Synthesis", Springer-Verlag, 1984, oder McOmie (Hrsg.), "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, 1973, oder Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", Wiley-Interscience, 1981, oder Barany und Merrifield, in "The Peptides: Analysis, Synthesis and Biology", Vol. 2, Kapitel 1, Academic Press, 1980], ausgewählt aus Alkoxy, substituiertem Alkoxy oder Aryloxy, oder eine Blockiergruppe, die wie die Carboxylgruppe oder eine Amino- oder substituierte Aminogruppe sein kann, darstellt, wobei die Carboxylschutzgruppe oder Blockiergruppe gegebenenfalls kovalent an einen unlöslichen Polymerträger gebunden sein kann, und die Bogenlinie eine Abstandhaltegruppe der Formel:
darstellt, worin M aus der Gruppe, bestehend aus -S-S-, -CO-NH- und -Sausgewählt wird, und p und q, die gleich oder verschieden sein können, jeweils eine ganze Zahl von 2 bis 10 darstellen, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt
(a) Umsetzen einer Verbindung der Formel:
worin q eine ganze Zahl von 2 bis 10 darstellt, G und L, die gleich oder verschieden sein können, jeweils eine der in Peptidsynthese gebräuchliche Schutzgruppe [z. B. Schroeder et al., "The Peptides", Vol. I, Academic Press, 1965, oder Bodanszky, "Principles of Peptide Synthesis", Springer-Verlag, 1984, oder Bodanszky et al., "the Practice of Peptide Synthesis", Springer- Verlag, 1984, oder McOmie (Hrsg.), "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, 1973; oder Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", Wiley-Interscience, 1981, oder Barany und Merrifield, in "The Peptides: Analysis, Synthesis and Biology", Vol. 2, Kapitel 1, Academic Press, 1980], darstellen, mit einer Aminosäure oder einem Polypeptid der Formel H&sub2; N-[AA]m- CO-E, worin m eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist und AA einen natürlich vorkommenden oder synthetischen Aminosäurerest darstellt, wobei die Aminosäurereste, wenn m größer 1 ist, gleich oder verschieden sein können, und E eine Carboxylschutzgruppe, ausgewählt aus Alkoxy, substituiertem Alkoxy oder Aryloxy, oder eine Blockiergruppe, die die gleiche oder eine Amin- oder substituierte Amingruppe sein kann, darstellt, wobei die Carboxylschutzgruppe oder Blockiergruppe gegebenenfalls kovalent an einen unlöslichen Polymerträger gebunden sein kann, wobei eine Verbindung der Formel:
erhalten wird,
(b) selektives Entfernen der Schutzgruppe L von der Verbindung nach Formel VIa, wobei eine Verbindung der Formel:
erhalten wird,
(c) Umsetzen der Verbindung nach Formel Vlla mit einer Aminosäure oder einem Peptid der Formel:
worin n eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist, [AA] einen natürlich vorkommenden oder synthetischen Aminosäurerest darstellt, wobei die Aminosäurereste, wenn n größer 1 ist, gleich oder verschieden sein können, und J eine in der Peptidsynthese gebräuchliche Schutzgruppe darstellt, wobei eine Verbindung der Formel:
erhalten wird,
(d) selektives Entfernen der Schutzgruppe J, wobei eine Verbindung der Formel:
erhalten wird,
(e) Umsetzen der Verbindung nach Formel Xa mit einer Verbindung der Formel:
worin p wie vorstehend definiert ist, wobei eine Verbindung der Formel:
erhalten wird,
(f) selektives Entfernen der Schutzgruppe G von der Verbindung XIIa, wobei eine Verbindung der Formel:
erhalten wird,
(g) Umsetzen der Verbindung nach Formel XIIIa mit einem geeigneten Kopplungsmittel, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Dicyclohexylcarbodümid (DCC), Bis(2-oxo-3-oxazolidinyl)phosphinchlorid (BOP- Cl), Benzotriazolyl-Noxytrisdimethylaminophosphoniumhexafluorophosphat (BOP), 1-Oxo-1-chlorphospholan (Cpt-Cl) und einem Gemisch aus DCC und Hydroxybenzotriazol (HOBT), und Entfernen anderer Seitenketten- Schutzgruppen, wobei eine Verbindung der allgemeinen Formel I, worin m eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist, erhalten wird.
Die Erfindung umfaßt weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von in der Hauptkette cyclisierten, biologisch aktiven Polypeptiden der allgemeinen Formel:
worin
d 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist und e eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist,
[AA] einen natürlich vorkommenden oder synthetischen Aminosäurerest darstellt, wobei die Aminosäurereste, wenn e größer 1 ist, gleich oder verschieden sein können,
[A'A'] einen natürlich vorkommenden oder synthetischen Aminosäurerest darstellt, wobei die Aminosäurereste, wenn d größer 1 ist, gleich oder verschieden sein können,
R eine natürlich vorkommende oder synthetische Aminosäure-Seitenkette darstellt,
E eine Hydroxylgruppe oder eine Carboxylschutzgruppe, die in der Peptidsynthese Standard ist, bevorzugt ausgewählt aus Alkoxy, substituiertem Alkoxy oder Aryloxy, oder eine Blockiergruppe, die wie die Carboxylgruppe oder eine Amino- oder substituierte Aminogruppe sein kann, darstellt, wobei die Carboxylschutzgruppe oder Blockiergruppe gegebenenfalls kovalent an einen unlöslichen Polymerträger gebunden sein kann, und die Bogenlinie eine Abstandhaltegruppe der Formel:
-(CH&sub2;)p-(M)X-Y (IV)
darstellt, worin p wie vorstehend definiert ist und M eine Amino- oder eine Carboxylgruppe oder ein Schwefelatom ist, x gleich 0 oder 1 ist, und Y die Seitenkette einer Hauptkettenaminosäure darstellt.
In den Verbindungen nach Formel I ist M, wie in Formel III definiert, bevorzugt eine Amid- oder -S-S-Gruppe.
In den Verbindungen nach Formel 11 ist Y, wie in Formel IV definiert, bevorzugt die Seitenkette von Homocystein, x wie in Formel IV definiert ist bevorzugt 0, und wenn · 1 ist, ist M bevorzugt ein Schwefelatom, wobei das Verfahren umfaßt:
a) Umsetzen einer Verbindung der Formel:
worin E und e wie vorstehend definiert sind, (A¹A¹] einen natürlich vorkommenden oder synthetischen Aminosäurerest darstellt und Y eine Seitenkette einer natürlich vorkommenden oder synthetischen Aminosäure darstellt und Q eine für die Peptidsynthese gebräuchliche Schutzgruppe darstellt, mit einer Verbindung nach Formel Va, wobei eine Verbindung der Formel:
erhalten wird,
b) selektives Entfernen der Schutzgruppe L aus der Verbindung nach Formel XV, wobei eine Verbindung der Formel:
erhalten wird,
c) Umsetzen der Verbindung nach Formel XVI mit einer Aminosäure oder einem Peptid der Formel:
worin d eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist und [AAJ einen natürlich vorkommenden oder synthetischen Aminosäurerest darstellt, wobei die Aminosäurereste, wenn d größer 1 ist, gleich oder verschieden sein können, und P eine in der Peptidsynthese gebräuchliche Schutzgruppe darstellt, wobei eine Verbindung der Formel:
erhalten wird,
d) (i) wenn Y eine Seitenkette mit einer Carboxylgruppe ist, selektives Entfernen der Schutzgruppen G und Q von der Verbindung XVIII, wobei eine Verbindung der Formel:
erhalten wird, Cyclisieren der Verbindung XIX, indem sie mit dem Kopplungsmittel gemäß dem obigen Schritt g) umgesetzt wird, und Entfernen der Schutzgruppe P und anderer Seitenketten-Schutzgruppen, wobei eine Verbindung der allgemeinen Formel erhalten wird, oder (ii) wenn Y eine Seitenkette mit einer von Carboxyl verschiedenen nukleophilen funktionellen Gruppe ist, selektives Entfernen der Schutzgruppe G, Umsetzen der resultierenden Verbindung mit einer Verbindung der Formel:
HOOC-{CH2)z (XX)
worin z eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist und W eine funktionelle Gruppe ist, die zur Reaktion mit der nukleophilen Gruppe geeignet ist, wobei eine Verbindung der Formel:
erhalten wird, selektives Entfernen der Schutzgruppe Q, woraufhin die Cyclisierung stattfindet, und Entfernen der Schutzgruppe P und anderer Seitenketten-Schutzgruppen von Verbindung XXI, wobei eine Verbindung der allgemeinen Formel II erhalten wird.
In den Verbindungen sowohl der allgemeinen Formel I als auch II ist E bevorzugt eine Aminogruppe.
In dieser Anmeldung stellen die verschiedenen Gruppen
-[AA)y-
einen Aminosäurerest dar, wenn y gleich 1 ist, oder eine Peptidkette, wenn y größer 1 ist. Es ist zu verstehen, daß wenn y als null definiert ist, die gesamte Gruppe nicht vorhanden ist.
Bevorzugte spezifische cyclisierte Peptide, die hierin als ein Modell für die vorliegenden Cyclopeptide und die Verfahren für deren Herstellung dienen, sind Homologa von Neuropeptiden, genauer ausgedrückt von Substanz P.
Bevorzugte Peptide gemäße Formel I sind:
R = (CH&sub2;)&sub3;NH-C( = NH)NH&sub2;, n = 3, [AA]n-1, = Phe-Phe, m = 2, [A'A']m = Leu-Met- NH&sub2;, Bogenlinie = CO-(CH)&sub3;-CO-NH-(CH&sub2;)&sub3;.
R' = CH&sub2; COOH, n = 3, [AA]n-1 = Phe-Phe, m = 2, [A'A']m = Leu-Met-NH&sub2;, Bogenlinie = CO-(CH&sub2;)&sub3;-CO-NH-(CH&sub2;)&sub3;.
Hauptkettencyclisierung gemäß der vorliegenden Erfindung beinhaltet die Verknüpfung der N- (und/oder der C)-Atome in der Peptidhauptkette. Das Konzept der N-Hauptkettencyclisierung ist in Fig. 1 gezeigt. Somit werden beispielsweise, um eine N-Hauptkettencyclisierung zu erreichen, Wasserstoffe der Peptidbindung durch (-funktionalisierte Alkylenketten, die entweder mit Seitenketten oder Enden oder untereinander verknüpft werden können, um das gewünschte cyclische Peptid zu bilden, ersetzt.
Verbindungen der allgemeinen Formel Va und Vb können hergestellt werden:
worin die Substituenten wie vorstehend definiert sind. Diese Verbindungen sind Zwischenverbindungen in dem Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen cyclisierten Peptide.
Verfahren zur Herstellung der Verbindungen Va und Vb liegen ebenfalls im Umfang der Erfindung.
Gemäß einer Ausführungsform können Verbindungen der allgemeinen Formel Va wie folgt hergestellt werden:
(a) eine α-Halogencarbonsäure der Formel:
worin R wie vorstehend definiert ist und Hal Chlor, Brom oder Jod ist, wird mit einem Alkylendiamin der Formel:
H&sub2;N(CH&sub2;)q-NH&sub2; (XXIII)
worin q wie vorstehend definiert ist, umgesetzt, wobei eine Verbindung der Formel:
erhalten wird.
(b) (I) Umsetzen der Verbindung nach Formel XXIV mit einem geeigneten, die Gruppe G enthaltenden Reagenz durch Peptidsynthese-Standardverfahren, wobei G wie vorstehend definiert ist, wobei eine Verbindung der Formel:
erhalten wird, und Umsetzen der Verbindung nach Formel (XXVI) mit einem L enthaltenden Reagenz durch Peptidsynthese-Standardverfahren, wobei L wie vorstehend definiert ist, wobei eine Verbindung der Formel Va erhalten wird, oder
(ii) Umsetzen der Verbindung nach Formel XXIV mit einem geeigneten, G enthaltenden Reagenz durch Peptidsynthese-Standardverfahren, wobei G wie vorstehend definiert ist, wobei eine Verbindung der Formel:
erhalten wird, selektives Entfernen der Schutzgruppe G von der sekundären Aminfunktion, wobei eine Verbindung der allgemeinen Formel XXVI erhalten wird.
Verbindungen der allgemeinen Formel Vb, wie hierin definiert, worin q eine ganze Zahl von 2 bis 10 darstellt, G und L, die gleich oder verschieden sein können, jeweils Wasserstoff und/oder eine in der Peptidsynthese gebräuchliche Schutzgruppe darstellen, und E eine Hydroxylgruppe oder eine Carboxylschutzgruppe, die in der Peptidsynthese Standard ist, bevorzugt ausgewählt aus Alkoxy, substituiertem Alkoxy oder Aryloxy, oder eine Blockiergruppe, die wie die Carboxylgruppe oder eine Amino- oder substituierte Aminogruppe sein kann, darstellt, wobei die Carboxylschutzgruppe oder Blockiergruppe gegebenenfalls kovalent an einen unlöslichen Polymerträger gebunden sein kann, können hergestellt werden durch
(i) Umsetzen der freien Säure Va wie hierin definiert mit dem entsprechenden, die Gruppe E enthaltenden Reagenz durch Peptidsynthese-Standardverfahren, worin E wie vorstehend definiert ist, wobei der Ester, das Amid, oder die kovalente Bindung mit dem Polymerträger erhalten wird, oder
(ii) aus Verbindungen der Formel VIb wie hierin definiert, durch Umsetzen dieser freien Säure mit dem entsprechenden, die Gruppe E enthaltenden Reagenz durch Peptidsynthese-Standardverfahren, wobei E wie vorstehend definiert ist, wobei der Ester, das Amid oder die kovalente Bindung mit dem Polymerträger erhalten wird, wobei die Verbindung nach Formel Vlb aus Verbindung XXVI erhalten wird durch Umsetzen dieser freien Säure mit dem geeigneten, die Gruppe E enthaltenden Reagenz, wie vorstehend definiert, wobei der Ester, das Amid oder die kovalente Bindung mit dem Polymerträger erhalten wird.
In den vorstehend beschriebenen Verbindungen der Formeln V bis XXVIII sind die Schutzgruppen G, L oder J bevorzugt Boc, Fmoc oder Z, und die Schutzgruppe Q ist bevorzugt zusätzlich zu den obigen, Bzl, ACM oder t-Butyl.
In den vorstehend beschriebenen Verfahren sind die Kopplungsmittel bevorzugt Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), Bis(2-oxo-3-oxazolidinyl)phosphinchlorid (BOP- Cl), Benzotriazolyl-N-oxytrisdimethylaminophosphoniumhexafluorphosphat (BOP), 1-Oxo-1-chlorphospholan (Cpt-C1) und ein Gemisch aus DCC und Hydroxybenzotriazol (HOBT).
Die Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die als Wirkstoffe die erfindungsgemäßen cyclisierten Peptide enthalten, welche verwendet werden können, wenn eine selektive Biowirkung der Peptide erforderlich ist. Die erfindungsgemäßen cyclischen Peptide können als stabile und selektive Agonisten von natürlichen Peptiden, beispielsweise Neuropeptiden, wie etwa humanen Tachykininen verwendet werden. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können zur Behandlung von diversen Erkrankungszuständen, bei denen auf eine Beteiligung von Tachykininen geschlossen werden kann, verwendet werden. Sie können als solche beispielsweise zur Behandlung von verschiedenen Entzündungskrankheiten, Psoriasis, rheumatoider Arthritis, und neurologischen Störungen, wie etwa familiärer Dysautonomie, Parkinsonismus, Alzheimer- Krankheit und retardiver Dyskinesie eingesetzt werden. Die vorliegenden Präparationen können auch als Analgetika geeignet sein. Die Präparationen können auch als blutdrucksenkende Mittel und Atmungsstimulantien verwendet werden.
Zusätzlich zu dem Wirkstoff enthalten die neuen Zusammensetzungen herkömmliche pharmazeutisch akzeptable Träger, Verdünnungsmittel u. dgl. Zusammensetzungen in fester Form zur oralen Verabreichung, wie etwa Tabletten, Pillen, Kapseln o. dgl. können hergestellt werden durch Mischen des Wirkstoffs mit herkömmlichen, pharmazeutisch akzeptablen Bestandteilen, wie etwa Maisstärke, Lactose, Sucrose, Sorbit, Talk, Stearinsäure, Magnesiumstearat, Dicalciumphosphat und Gummi, mit pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmitteln. Die Tabletten oder Pillen können überzogen werden oder auf andere Weise mit pharmazeutisch akzeptablen, in der Technik bekannten Materialien vermischt werden, um Dosierungsformen bereitzustellen, welche eine verlängerte Wirkung oder eine lang anhaltende Freisetzung bieten. Andere feste Zusammensetzungen können als Zäpfchen hergestellt werden, für eine rektale Verabreichung. Flüssige Formen können zur oralen Verabreichung oder zur Injektion, wobei der Begriff subkutane, perkutane, intravenöse, intrathekale Verabreichung etc. umfaßt, hergestellt werden. Die flüssigen Zusammensetzungen umfassen wässrige Lösungen, aromatisierte Sirups, wässrige und ölige Suspensionen, aromatisierte Emulsionen mit eßbaren Ölen sowie Elixiere und ähnliche pharmazeutische Vehikel. Zusätzlich können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen als Aerosole hergestellt werden, für intranasale Verabreichung u. dgl.
Die aktive Dosis für Menschen liegt im allgemeinen im Bereich von 0,05 mg bis etwa 50 mg pro kg Körpergewicht, bei einem Dosierungsschema von 1 bis 4 mal pro Tag. Eine Verabreichung alle zwei Tage oder in längeren Abständen ist jedoch ebenfalls möglich. Spezifische Dosierungen würden vom behandelnden Arzt entsprechend der zu behandelnden Erkrankung, der Verabreichungsmethode, dem Alter des Patienten, dem Gewicht, Gegenindikationen u. dgl. bestimmt werden.

BEISPIELE

SNYTHESE

ALLGEMEINES - MATERIALIEN UND METHODEN

Alkylendiamine wurden von Merck Schuchatdt bezogen und wurden ohne weitere Reinigung verwendet. α-Chlorcarbonsäuren wurden aus den entsprechenden Aminosäuren synthetisiert [Kopepenhoefer, B., Schurig, V., Organic Synthesis, 66, 151 (1987), Heathcock, C., H., Hrsg., Organic Synthesis Inc. USA]. α-Bromcarbonsäuren wurden nach einem modifizierten Verfahren hergestellt [Kopepenhoefer, B., Schurig, V., Organic Synthesis, 66, 151 (1987), Heathcock, C. H., Hrsg., Organic Synthesis Inc. USA] (5N HBr wurde anstelle von 5 N HOI verwendet). Benzyl-p-nitrophenylcarbonat und BOP-C1 wurden von Aldrich bezogen. BOP-Cl wurde nach dem bekannten Verfahren gereinigt [Van der Awers, C. und Anteumis, M. J. O., lnt. J. Peptide Protein Res., 29, 574 (1987)]. BOP-Reagenz wurde von Richelieu, Kanada bezogen. Thionylchlorid wurde unter Rückfluß erwärmt und über Flachssamenöl destilliert. Alle Lösungsmittel hatten Analysereinheit und wurden ohne weitere Reinigung verwendet. HPLC wurde auf einem mit einer LC-5000 Gradientenpumpe und einem UV-VIS-Detektor mit abstimmbarer Wellenlänge, eingestellt auf 220 nm, ausgestatteten Merck Hitachi 655A ausgeführt. Der Durchfluß wurde auf 1 mllmin festgesetzt und die Eluenten waren Wasser (+ 0,05% TFA), MeOH und MeCN. Die Säulen waren Lichrosphere RP-18 oder RP-8, 15 cm · 4,2 mm ID von Merck. Optische Reinheit wurde auf einer ChiraSpher®-Säule von Merck (5 m, 25 cm · 4 mm ID) überprüft. Der Durchfluß wurde auf 1 ml/min festgesetzt und der Eluent war ein Gemisch aus n-Hexan-Dioxan-i-Propanol 50/44/5. Der Detektor war auf 254 nm eingestellt. Schmelzpunkte wurden auf einer Thomas Hoover Kapillarvorrichtung gemessen und optische Aktivität wurde auf einem Perkin Elmer-141 Pofarimeter in einer 10 cm langen Zelle mit einer Natriumiampe bei 25ºC gemessen. Mikroanalyse wurde an der mikroanalytischen Abteilung der The Hebrew University, Jerusalem ausgeführt. ¹H NMR Spektren von Baueinheiten und Dipeptiden wurden auf einem gepulsten FT Spektrometer Bruker WP-200 aufgezeichnet. Proben wurden in CCDl&sub3; aufgelöst. Chemische Verschiebungen sind in ppm, bezogen auf internen Standard TMS. 1H NMR Spektren von Peptid Ib wurden auf Bruker Spektrometern AMX-500 und 600 aufgenommen, die bei 500 und 600 MHz Protonenresonanzfrequenz betrieben wurden. Daten wurden unter Verwendung des UXNMR-Programms auf einem Bruker X32 Arbeitsplatz verarbeitet. 31 mg Peptid wurden in einem 5 mm NMR-Röhrchen in DMSO-d&sub6; von Aldrich aufgelöst. Spektren wurden bei 303 K aufgezeichnet. Die Zuordnung der Protonenresonanzen wurde nach Standardprozeduren ausgeführt [Wutrich, K., NMR of Proteins and Nucleic Acids, John Wiley, NY, 1986], unter Verwendung der homonuklearen NOESY, ROESY, TOCSY UND E. COSY Techniken. FAB- MS wurde auf einem ZAB-3HF FABlTandemmassenspektrometer oder einem API/// LC/MS/MS ausgeführt.

SYNTHESE VON BAUEINHEITEN UND DIPEPTIDEN

Verfahren A Herstellung von N-(ω-Aminoalkylen)aminosäuren

Das entsprechende Alkylendiamin (15,8 Mol) wurde bei 4ºC rasch gerührt (wenn das Alkylendiamin fest war, wurde es in 500 ml CH&sub2;Cl&sub2; aufgelöst) während die α-Halogencarbonsäure (1,6 Mol) portionsweise zugegeben wurde, um sicherzustellen, daß jede Zugabemenge sich gelöst hatte. Die Reaktion wurde danach 48 h bei 25ºC gerührt und unter Vakuum (60ºC) eingedampft. Zu der entstandenen Paste wurden 500 ml einer Lösung aus DMSO/Ether/Ethanol (3 : 1 : 1) zugegeben und das Gemisch wurde über Nacht im Gefrierschrank gelassen. Die präzipitierten Zwitterionen wurden durch Filtration auf Glasfritten gesammelt und mit Ethanol und Ether gewaschen. In manchen Fällen wurden die Produkte in Form der Dihydrochlorid-Salze anstatt in Form der Zwitterionen erhalten (Strukturen und chemische Daten siehe Tabelle I). Die optische Reinheit der Verbindungen F und 7 wurde an ihren vollständig geschützten Derivaten 14 und 15 überprüft (siehe Methode C und Tabelle II). Methode B Selektiver Schutz von N-(ω-Aminoalkylen)aminosäuren Eine Lösung von Benzyl-p-nitrophenylcarbonat (0,605 Mol) in Dioxan (1,3 l) wurde zu einer gerührten Lösung der N-(ω-Aminoalkylen)aminosäure (0,4 Mol) in 50% wässrigem Dioxan (2,6 l) zugetropft. Das Gemisch wurde (mit 2 N NaOH in einer automatischen Titriervorrichtung) bei pH = 11 gehalten. Nach 24 stündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde das Gemisch zur Trockene eingedampft, in H&sub2;O (1,2 l) aufgelöst und filtriert. Das Filtrat wurde mit EtOAc (2 x 1 l) extrahiert und die wäßrige Phase wurde in einem Wasser-Eis-Bad gekühlt und mit 6 N HCl auf pH = 5,5 angesäuert. Nach Extraktion mit Ether (2 · 1 l) wurde die wäßrige Phase angesäuert (pH = 1 mit konzentrierter HOI), zur Trockene eingedampft und aus i-POH erneut eingedampft. In einem Fall (Ausgangsmaterial 1, Tabelle I) ergab Kristallisation aus i-PrOH die Säure 8 (Tabelle II). Bei Anwendung dieser Vorgehensweise auf die Materialien 2 bis 7 waren die Prödukte Öle oder wurden in geringer Ausbeute erhalten. In diesen Fällen wurden die rohen, einfach geschützten N-(Z-ω- Aminoalkylen)aminosäuren gemäß der nachstehenden Methode C verestert. Diese Vorgehensweise erhöhte die Gesamtausbeuten der zweifach geschützten N-(ω-Aminoalkylen)aminosäuren erheblich. Alternativ konnten die rohen, einfach geschützten N-(ω-Aminoalkylen)aminosäuren mit Boc am geschützt werden (Methode H, nachstehend), danach am N~ -Z gespalten werden (Methode K, nachstehend) und der Nt mit Fmoc geschützt werden (Methode J) (Strukturen und chemische Daten siehe Tabelle II).
Methode C Veresterung von einfach geschützten N-(ω- Aminoalkylen)aminosäuren.
Rohe N-(Z-ω-Aminoalkyfen)aminosäuren (40 mmol) wurden suspendiert und in wasserfreiem MeOH (600 ml) gerührt, und trockene HOI (H&sub2;SO&sub4;-Falle) wurde 1 h eingeleitet. Das Rühren wurde 1 h bei Raumtemperatur fortgesetzt und der MeOH wurde unter Vakuum verdampft. Das Rohprodukt wurde in Wasser (500 ml) aufgelöst und mit EtOAc (2 · 500 ml) gewaschen. Der pH-Wert des Wassers wurde auf 8 erhöht (gesättigte NaHCO&sub3;) und es wurde mit EtOAc (3 · 300 ml) extrahiert. Die organische Phase wurde über MgSO&sub4; getrocknet und unter Vakuum zur Trockene eingedampft. (Strukturen und chemische Daten siehe Tabellen II und III). Die optische Reinheit der zwei Enantiomere 14 und 15 wurde auf einer ChiraSpher®-Säule überprüft. Jede Verbindung ergab nur einen Peak bei verschiedenen k', während ein Gemisch zwei Peaks mit den gleichen, den der reinen Verbindungen entsprechenden k' ergab.
Methode D Herstellung von N-(ω-Boc-Aminoalkylen) Gly.

1. Herstellung von Boc-Alkylendiamin

Das entsprechende Alkylendiamin (1 Mol) wurde in CHCl3 (1 l) aufgelöst. Die gerührte Lösung wurde in einem Eisbad gekühlt und (Boc)20 (0,1 Mol in 0,5 l CHCl&sub3;) wurde zugetropft. Die Lösung wurde weitere 24 h bei Raumtemperatur gerührt und das Lösungsmittel unter Vakuum bis zur Trockene abgezogen. Das entstandene Öl wurde in Ether (0,5 l) aufgelöst und mit Salzlösung (6 · 200 ml) gewaschen. Die Etherphase wurde über MgSO&sub4; getrocknet und unter Vakuum zur Trockene eingedampft. Das entstandene Öl wurde unter Vakuum über P&sub2;O&sub5; getrocknet.
2. Das entsprechende Mono-Boc-Alkylendiamin (1 Mol) wurde rasch bei 0ºC gerührt, während α-Chloressigsäure (0,1 Mol) in Teilmengen zugegeben wurde, um sicherzustellen, daß jede Zugabemenge sich aufgelöst hatte. Das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gelassen, danach wurde Ether zugegeben (50 ml) und das Präzipitat wurde durch Filtration gesammelt, mit Ether (3 · 50 ml) gewaschen und über P&sub2;O&sub5; getrocknet. Der Feststoff wurde in Wasser (pH = 10) gelöst und lyophilisiert. Der Feststoff wurde in Wasser (80 ml) gelöst und der N< mit Fmoc (Methode J) geschützt, wobei die Produkte 16 und 17 erhalten wurden (siehe Tabellen II und III).
Methode E Selektive Entfernung des Schutzes von Z-N-(Z-ω- Aminoalkylen)aminosäuren
N-(ω-Aminoalkylen)aminosäuren wurden gemäß Methode L mit zwei Äquivalenten Z-Cl umgesetzt. Die di-Z-Produkte (30 mmol) wurden in sauberem SOCl&sub2; (50 ml) aufgelöst und es wurde 0,5 h auf 60ºC erwärmt. Die Lösung wurde unter Vakuum eingedampft und zu der entstandenen Paste wurde 2 N HCl (100 ml) zugegeben. Das Gemisch wurde 3 h gerührt und mit Ether (3 · 100 ml) gewaschen. Der pH-Wert der Lösung wurde auf 9 eingestellt und die N< Aminogruppe in situ mit Boc geschützt (Methode H). Die N< -Z-Schutzgruppe wurde durch katalytische Hydrierung (Methode K) entfernt und es wurde erneut mit Fmoc geschützt (Methode J) (siehe Tabellen II und III). Alternativ wurde anstelle von HCl MeOH zu der Paste zugegeben, wobei nach Eindampfen unter Vakuum die Ester 9-15 (Schema 2 und Tabelle II) erhalten wurden.

Methode F Kopplung mit BOP-Cl.

BOP-Cl (1,1 mmol) wurde zu einer gerührten Lösung der zweifach geschützten N-(ω-Aminoalkylen)aminosäuren (1 mmol) zugegeben, gefolgt von 1,2 mmol DIEA in 10 ml MeCN bei -15ºC. Die Lösung wurde 20 Minuten bei -15ºC gerührt und das Aminosäureestersalz (1 mmol) wurde zu 210 ml MeCN mit 1,1 mmol DIEA zugegeben. Das Rühren wurde über Nacht bei 0ºC fortgesetzt. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum verdampft und das Rohprodukt in EtOAc aufgelöst und mit gesättigten Lösungen von KHSO&sub4; (2 · 300 ml), NaHCO&sub3; (2 · 300 ml) und Salzlösung (2 · 300 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über MgSO&sub4; getrocknet und unter Vakuum zur Trockene eingedampft. (Siehe Tabelle IV).
Methode G Kopplung mit BOP.
Zu einer gerührten Lösung der Aminosäureester-Komponente (1 mmol) in CH&sub2;Cl&sub2; (10 ml) wurde BOP-Reagenz (1,1 mmol) und die zweifach geschützten N-(ω-Aminoalkylen)aminosäuren (1,1 mmol) und DIEA (3 mmol) bei Raumtemperatur zugegeben. Nach 15 min wurde der pH-Wert auf Basizität überprüft (in Fällen, bei denen der pH-Wert niedriger als pH = 9 war, wurde mehr DIEA zugegeben), und das Reaktionsgemisch wurde 1 h bei Raumtemperatur gelassen. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum verdampft und das Rohprodukt in EtOAc (100 ml) aufgelöst und wie in Methode F vorstehend beschrieben gewaschen (siehe Tabelle IV).
Methode H Herstellung von Boc-Aminosäuren [Nagasawa et al., Bull. Chem. Soc. Jap., 46, 1269 (1973)].
Aminosäure (0,1 mol) wurde in NaOH (1 N, 200 ml) aufgelöst und Dioxan (200 ml) wurde zugegeben. Das Gemisch wurde in einem Eisbad gerührt und eine Lösung von (Boc)20 (0,14 Mol) in Dioxan (200 ml) wurde zugetropft, während der pH-Wert bei 9 gehalten wurde. Das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur rührengelassen. Das Dioxan wurde unter Vakuum verdampft und die Wasserlösung mit Ether (3 · 150 ml) gewaschen, gekühlt und mit gesättigter KHSO&sub4; Lösung auf pH 3 angesäuert. Das Präzipitat wurde durch Filtration gesammelt, mit kaltem Wasser gewaschen und unter Vakuum über P&sub2;O&sub5; zur Gewichtskonstanz getrocknet. Wenn sich bei Ansäuerung ein Öl bildete, wurde es mit EtOAc (3 · 150 ml) extrahiert, das mit gesättigter NaCl gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet und zur Trockene eingedampft wurde.
Nach Trocknen über P&sub2;O&sub5; wurde der Rückstand aus EtOAc/Petrolether kristallisiert.
Methode J Herstellung von Fmoc-Aminosäuren [Sivanandaiah, K. M.; Rangaragn, M. S., Ind. J. Chem., 25 (B, 1045 (1986)].
Eine Lösung von Fmoc-OSu (0,024 Mol) in MeCN (25 ml) wurde auf einmal zu einer gerührten, mit TEA auf pH 9 eingestellten wäßrigen Lösung von Aminosäure (0,025 Mol) zugegeben. Der pH-Wert wurde mit TEA bei 8,5 bis 9 gehalten. Nach 15 Minuten stabilisierte sich der pH-Wert und das Reaktionsgemisch wurde weitere 15 Minuten stehengelassen. Das MeCN wurde unter Vakuum verdampft, der pH-Wert mit gesättigter KHSO&sub4; auf 3 eingestellt, und das Präzipitat durch Filtration gesammelt, mit kaltem Wasser gewaschen und über P&sub2;O&sub5; zur Gewichtskonstanz getrocknet. Wenn sich bei Ansäuerung ein Öl bildete, wurde es wie in Methode H behandelt.
Methode K Entfernung der Z-Schutzgruppe [Anwer, M. K., Spatola, A. F., Synthesis, 929 (1980)].
Zu einer Lösung von Z-Aminosäure (1 g), aufgelöst in MeOH (5 ml) wurden unter Rühren Pd/C 10% (0,1 g) und Ammoniumformiat (1 g) zugegeben. Der Reaktionsverlauf wurde mittels HPLC verfolgt. Nach Vollendung (~ 2 h) wurde der Katalysator durch Filtration entfernt und das Filtrat unter Vakuum zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in Wasser aufgelöst und lyophilisiert.
Methode L Herstellung von Z-Aminosäuren [Bergman, M., Zervas, L., Ber. 65, 1192 (1932)].
Z-Aminosäuren wurden gemäß Methode H hergestellt, aber anstelle von (Boc)20 wurde Z-Cl verwendet. Tabelle I. Daten für Verbindungen der Struktur Va [G = H, L = H]
(a) als Dihydrochlorid (b) D-Enantiomer, c 0,3, 6 N HCl,
(c) L-Enantiomer, c 0,32, 6 N HCl
(d) C, H, N deuten darauf hin, daß die experimentell erhaltenen Werte innerhalb einer Toleranz von 0,3% mit der berechneten Analyse übereinstimmt. Tabelle II. Daten für Verbindungen der Struktur Vb
(a) RP-18 Säule, 70% MeOH, (b) c 1, MeOH, (c) als Hydrochlorid, (d) einschließlich 1/3 H&sub2;O, (e) D-Enantiomer, (f) L-Enantiomer Tabelle III. ¹H NMR-Daten der Verbindungen 9 bis 21 Tabelle IV. Daten für Verbindungen der Struktur VIIIb [E = OMe, n = 1, G = Z, J = Boc]

PEPTIDSYNTHESE

Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung der Peptide dieser Erfindung ist gemäß der Festphasenpeptidsynthese-Methodik unter Verwendung einer Kombination von Boc- und Fmoc-Chemien [z. B. Bodanszky, "Principles of Peptide Synthesis", Springer-Verlag, 1984, oder Bodanszky et al., "the Practice of Peptide Synthesis", Springer-Verlag, 1984, oder Barany und Merrifield, in "The Peptides: Analysis, Synthesis and Biology", Vol. 2, Kapitel 1, Academic Press, 1980, oder Atherton et al., Bioorg. Chem., 8, 1979]. Im Verfahren der vorliegenden Erfindung wurde ein bevorzugtes p- Methylbenzhydrilaminpolystyrol-1%-Divinylbenzolpolymer (MBHA-Harz, Substitutionsgrad betrug 0,9 eq. NH&sub2;/g, 1 g (0,9 mmol)), mit 2,4 mmol Boc-Met gekoppelt. Die Kopplung wurde mit BOP (2,4 mmol) und DIEA (5,6 mmol) in DMF durchgeführt. Nach 3 h wurde das Harz mit Ac&sub2;O (8 mmol) und DMAP (0,5 mmol) während 3 h umgesetzt und das Harz wurde fünfmal mit DCM gewaschen.

Methode M Boc-Festphasensynthese

Jeder Synthesezyklus bestand aus (i) einer 1-minütigen, gefolgt von 20 minütigen Entfernung des Schutzes mit TFA : DCM (1 : 2), (ii) 5 DCM-Wasch- Schritten, (iii) 2 · 5 min Neutralisation mit 5% DIEA in DMF, (iv) 5 DMF-Wasch- Schritten, (v) 60 min Kopplung mit 2,4 mmol Boc-AA unter Verwendung von BOP (2,4 mmol) und DIEA (5,6 mmol) in DMF, (vi) Überprüfung auf Vollständigkeit mittels dem Kaiser-Test [Kaiser, E., et al., Anal. Biochem. 34, 595 (1970)], (vii) 5 DCM-Wasch-Schritten.

Methode N Fmoc-Festphasensynthese

Jeder Synthesezyklus bestand aus (i) einer 17 minütigen Entfernung des Schutzes mit 20% Piperidin in DMF, (ii) 6 DMF-Wasch-Schritten, (iii) 60 min Kopplung mit 2,4 mmol Fmoc-AA unter Verwendung von BOP (2,4 mmol) und DIEA (5,6 mmol) in DMF, (iv) 6 DMF-Wasch-Schritten, und (v) Kaiser-Test.
Seitenketten-Schutz: Arg(Tos), Asp(OBzl), N(Mercaptopropylen)Gly(SBzl), 5- Mercaptovaleriansäure(SBzl), N(g-Boc-Aminopropylen)Gly.

Methode P Entfernung des Peptids vom Harz und anschließende Entfernung von Schutzgruppen

1 g Harz, Magnetrührer und 2 ml Anisol wurden in ein Kel-F-Gefäß gegeben. Das Gefäß war an dem Reaktor befestigt [Typ I, hergestellt von der Peptide Institute Inc. Osaka, Japan]. Nach Entfernung von Luft durch Vakuum wurde das Reaktionsgefäß mittels flüssigem Stickstoff gefroren und es wurden 20 ml flüssige HF eingebracht. Das Gefäß wurde 1,5 h unter Rühren bei -7ºC gehalten. HF wurde verdampft bis zur Trockene, und Hexan (50 ml) wurde zu dem Reaktionsgefäß zugegeben. Nach Mischen wurde das Hexan dekantiert und das Reaktionsgemisch wurde mit Ether (3 · 50 ml) gewaschen, der dekantiert wurde. Das Gemisch wurde mit 30% AcOH (3 · 50 ml) behandelt und über eine Glasfilterfritte filtriert. Das Lösungsmittel wurde lyophilisiert. Die Ausbeuten der Rohpeptide betrugen 50 bis 80%.

Methode O Cyclisierung der Peptide Ia-Ic am Harz

Nach Synthese der Hauptkette wurde die Boc-Schutzgruppe von N(g- Aminopropylen)Gly mittels TFA entfernt und das Harz wurde gewaschen und neutralisiert wie für die Boc-Festphasensynthese (i) bis (iv) beschrieben. Cyclisierung [Felix, A. M., et al., in "Peptides", Marshall, G. B., Hrsg., S. 465 (1988)] wurde mit BOP (2,4 mmol) und DIEA (3,6 mmol) während 24 h durchgeführt. Nach 24 h wurde, wenn der Kaiser-Test negativ verlief, das Harz mit MeOH gewaschen und unter Vakuum über P&sub2;O&sub5; getrocknet. Wenn der Kaiser-Test positiv verlief, wurden eine weitere Teilmenge von BOP (1,2 mmol) und DIEA (1,8 mmol) zugegeben. Nach der Cyclisierung wurden Peptide von dem Harz entfernt wie vorstehend beschrieben.

Synthese von Peptid Ic

Peptid Ic wurde gemäß dem nachfolgenden Schema unter Verwendung der allgemeinen Methoden M, N, P und Q synthetisiert.
Das Rohpeptid wurde durch semipräparative HPLC über eine HIBAR RP-8 Säule mit einem Gradienten von A = H&sub2;O (0,1% TFA), B = MeCN (0,1% TFA) gereinigt. t = 0, A = 70, B = 30, t = 10, A = 70, B = 30, t = 50, A = 20, B = 80, t = 60, A = 0, B = 100, Rt = 20,3 min. MW = 880,06, FAB-MS gefunden [MH]&spplus; = 881,14, API-MS gefunden [MH]+ = 881,60, AAA gefunden Asp = 0,9, Phe = 1,95, Met = 0,95, Leu = 1,0.

Synthese von Peptid 1a

Das Peptid wurde nach dem vorstehenden Schema von Peptid Ic unter Verwendung der allgemeinen Methoden M, N, P und Q synthetisiert. Anstelle von Fmoc-Asp(OBzl) wurde Fmoc-Arg(Tos) gekoppelt und anstelle von Glutarsäureanhydrid wurde das Peptid mit Adipinsäure umgesetzt.
Das Rohpeptid wurde durch semipräparative HPLC über eine HIBAR RP-8 Säule mit einem Gradienten von A = H&sub2;O (0,1% TFA), B = MeCN (0,1% TFA) gereinigt. t = 0, A = 70, B = 30, t = 10, A = 70, B = 30, t = 50, A = 20, B = 80, t = 60, A = 0, B = 100, Rt = 20,3 min. MW = 880,06, FAB-MS gefunden [MH]&spplus; = 881,14, API-MS gefunden [MH]+ = 881,60, AAA gefunden Asp = 0,9, Phe = 1,95, Met = 0,95, Leu = 1,0.

Synthese von Peptid Ib

Peptid Ib wurde nach dem vorstehenden Schema von Peptid Ic unter Verwendung der allgemeinen Methoden M, N, P und Q synthetisiert. Anstelle von Fmoc-Asp(OBzl) wurde Fmoc-Arg(Tos) gekoppelt.
Das Rohpeptid wurde mittels semipräparativer HPLC über eine HIBAR RP-8- Säule mit einem Gradienten von A = H&sub2;O (0,1% TFA), B = MeCN (0,1% TFA) gereinigt. t = 0, A = 60, B = 40, t = 10, A = 60, B = 40, t = 40, A = 20, B = 80, t = 50, A = 0, B = 100, R, = 24 min. MW = 962,25, FAB-MS gefunden [MH]&spplus; = 963,1, APl-MS gefunden [MH]+ = 963,2, AAA gefunden Arg = 0,9, Phe = 2,05, Met = 0,85, Leu = 0,95. Die Zuordnung von Protonen-NMR-Peaks ist in Tabelle V gezeigt.

Synthese von Peptid Id

Peptid Id wurde nach dem vorstehenden Schema von Peptid lc unter Verwendung der allgemeinen Methoden M, N, P und Q synthetisiert. Anstelle von Fmoc-Asp(OBzl) wurde Fmoc-Arg(Tos) gekoppelt. Anstelle von Fmoc-N(g- Boc-aminopropylen)Gly wurde Fmoc-N-(g-mercapto(SBzl)propylen)Gly verwendet und anstelle von Glutarsäureanhydrid wurde d- Mercapto(SBzl)valeriansäure verwendet.

Cyclisierung von Peptid Id

Peptid Id wurde durch HF von dem Harz entfernt, wobei die reduzierte Form erhalten wurde. Nach Lyophilisierung wurde das Rohpeptid in MeOH (1 l) aufgelöst und 12 (0,8 mmol) wurde zugegeben. Die Lösung wurde 72 h unter Rühren bei Raumtemperatur gehalten. Der Verlauf der Oxidationsreaktion wurde mittels HPLC verfolgt. Restliche SH-Gruppen wurden durch den Ellman- Test bestimmt [Ellman, G. L., Biochem. Biophys. 82, 70 (1959)]. Nach vollständigem Ablauf der Reaktion wurde das Lösungsmittel unter Vakuum verdampft und das Peptid wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Tabelle V. Chemische Verschiebungen von Protonen von Peptid Ib in DMSO bei 303 Ka.
a Die chemischen Verschiebungen des in geringerer Menge vorhandenem Isomers (welches 18% ausmacht) mit einer cis-Konfiguration der Phe³-NGly&sup4;- Peptidbindung sind in Klammern angegeben. Die prochiralen Zuordnungen der β-Protonen der Phe-Reste ist angegeben.
Synthese von Peptid IIa.
Peptid IIa wurde nach dem vorstehenden Schema von Peptid Ic unter Verwendung der allgemeinen Methoden M, N, P und Q synthetisiert. Anstelle von Boc-Met wurde Boc-Hcys(SBzl) an das PMBHA-Harz gekoppelt. Anstelle von Fmoc-Asp(OBzl) wurde Fmoc-Arg(Tos) gekoppelt und das Peptid wurde mit Essigsäureanhydrid anstatt mit Glutarsäureanhydrid umgesetzt.

Cyclisierung von Peptid IIa

Peptid IIa wurde in der reduzierten Form von dem Harz entfernt. Nach Lyophilisierung wurde das Rohpeptid in einer gesättigten NH&sub3;/MeOH-Lösung (1 l) bei 0ºC aufgelöst. Die Lösung wurde 72 h unter Rühren bei Raumtemperatur gehalten. Der Verlauf der Reaktion wurde mittels HPLC verfolgt. Restliche SHGruppen wurden durch den Ellman-Test bestimmt [Ellman, G. L., Biochem. Biophys. 82, 70 (1959)]. Nach vollständigem Ablauf der Reaktion wurde das Lösungsmittel unter Vakuum eingedampft und das Peptid mittels semipräparativer HPLC über eine RP-18 HIBAR Säule mit einem Gradienten von A = H&sub2;O (0,1% TFA), B = MeCN (0,1% TFA) gereinigt. t = 0, A = 60, B = 40, t = 10, A = 60, B 40, t = 40, A = 20, B = 80, t = 50, A = 0, B = 100, Rt = 25 min.
MW = 893,7, FAB-MS gefunden [MH]&spplus; = 894,9, API-MS gefunden [MH]&spplus; = 894,8, AAA gefunden Arg = 0,9, Phe = 1,95, Hcys = 0,75, Leu = 1,0.

Synthese von Peptid IIIb

Peptid IIIb wurde nach dem nachfolgenden Schema unter Verwendung der allgemeinen Methoden M, N und P synthetisiert. Das Rohpeptid wurde mittels semipräparativer HPLC über eine HIBAR RP-8 Säule mit einem Gradienten von A = H&sub2;O (0,1% TFA), B = MeCN (0,1% TFA) gereinigt. t = 0, A = 70, B = 30, t = 5, A = 70, B = 30, t = 40, A = 20, B = 80, t = 50, A = 0, B = 100, R, = 22,7 min. MW = 995,3,. FAB-MS gefunden [M]&spplus; = 995,4, API-MS gefunden [MH]&spplus; = 996,0, AAA gefunden Arg = 1,0, Phe = 2,0, Met = 0,8, Leu = 0,95.

Synthese von Peptid lila

Peptid IIIa wurde nach dem vorstehenden Schema von Peptid IIIb unter Verwendung der allgemeinen Methoden M, N und P synthetisiert. Anstelle von Glutarsäureanhydrid wurde das Peptid mit Essigsäureanhydrid umgesetzt. Nach Acetylierung wurde das Peptid mittels HF von dem Harz entfernt. Das Rohpeptid wurde mittels semipräparativer HPLC über eine HIBAR RP-18 Säule mit einem Gradienten von A = H&sub2;O (0,1% TFA), B = MeOH (0,1% TFA) gereinigt. t = 0, A = 60, B = 40, t = 30, A = 0, B = 100, R, = 24 min. MW = 854,5, FAB-MS gefunden [MH]&spplus; = 855,6, APi-MS gefunden [MH]&spplus; = 855,6, AAA gefunden Arg = 0,8, Phe = 1,95, Met = 0,85, Leu = 0,95.

BEISPIELE ZUR BIOLOGISCHEN AKTIVITÄT

Allgemeines

Die biologische Aktivität der cyclischen Peptide (und linearen Vergleichspeptide) wurde in verschiedenen Systemen von glattem Muskel getestet: Duktus Deferens aus Ratte (RVD, Vas Deferens Rat), Ileum aus Meerschweinchen (GPi, Guinea Pig Ileum) und Pfortader aus Ratte (RPV, Rat Portal Vein).
Ein Assay der Aktivität der verschiedenen Analoga in diesen Systemen ermöglicht die Bestimmung ihrer Selektivität gegenüber Tachykinin-Rezeptoren, die in diesen Geweben vorhanden sind, nämlich den Rezeptoren NK-1 und NK- 3 in GPI, NK-3 in RPV und NK-2 in RVD. Die Gegenwart der zwei Tachykinin- Rezeptoren im GPI-System verhindert einen direkten und selektiven Assay für jeden einzelnen separat, und daher mußte ein Rezeptor blockiert werden, wenn die Aktivität des Analogon hinsichtlich des zweiten Rezeptors getestet wurde. Eine Blockierung des NK-3 Rezeptors im GPI-System durch Blockieren der Acetylcholin-Rezeptoren mit Atropin ermöglichte es, den NK-1 Rezeptor separat zu untersuchen.

Verfahren

Ein Assay der Beständigkeit der analogen Peptide gegenüber einem Verdau durch Proteasen wurde durchgeführt durch Inkubation des Peptids mit Schnitten, Homogenaten oder Membranen von verschiedenen Geweben, wie etwa Hirn, Leber, Niere, Parotis- bzw. Ohrspeicheldrüse, etc. und Bestimmen der Restaktivität nach Inkubation mittels des GPI-Assays.
(a) Meerschweinchen-Ileum-Assay (GPI)
Der Assay wurde nach den in Wormser, U., et al., EMBO J. fr 2805 (1986) beschriebenen Verfahren durchgeführt.
(b) Ratte-Duktus Deferens-Assay (RVD)
Der Assay wurde nach den in Chorev et al., Eur. J. Pharmacol., 127, 187 (1986) beschriebenen Verfahren durchgeführt.
(c) Ratte-Pfort-Ader-Assay (RPV)
Ratten wurden durch Enthauptung geopfert. Der Bauch wurde aufgeschnitten und alle inneren Organe zur Seite geschoben. Die Pfortader wurde, während sie noch innerhalb des Tieres war, an beiden Enden abgebunden und von allen umgebenden Geweben gereinigt, um ein sauberes Gewebe zu erhalten. Das gereinigte Gewebe wurde in ein Tyrode-Lösung enthaltendes Bad, das mit einem Gemisch von CO&sub2; : 02 (95 : 5%) belüftet wurde, getaucht. Eines der abgebundenen Enden wurde an einem Glashaken, und das andere Ende an einem Aufnehmerhebel befestigt, um die Kontraktionen zu messen. Die Spannung betrug etwa 0,5 g. Das Gewebe wurde 1 Stunde bei 37ºC in dem Bad gelassen, danach wurden die Peptide in Intervallen von 20 min zugegeben, um eine Desensibilisierung des Rezeptors zu verhindern.
(d) Beständigkeit gegenüber Verdau durch Proteasen
Der Assay wurde nach den in Chorev et al., Eur. J. Pharmacol., 127, 187 (1986) beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Die nachfolgenden spezifischen Beispiele zeigen die Aktivität der Peptide Ia, Ib, Ic, Id und IIa, manche im Vergleich mit dem linearen WS-Septide aus dem bekannten Stand der Technik. A. Biologische Aktivität von cyclisierten Peptiden
Alle der Analoga waren in hohen Maße selektiv für den NK-1 Sub-Rezeptor, wie das lineare Analogon WS-Septide aus dem bekannten Stand der Technik.
Fig. 3 zeigt die Dosis-Antwort-Kurve von WS-Septide und Peptid Ia.
Um zu beweisen, daß die hohe biologische Aktivität und Selektivität tatsächlich aus der Cyclisierung der Peptide resultierte, wurden lineare Analoga lila und IIIb hergestellt. Analogon IIIa enthält N-(b-Aminoethyl)glycin&sup9; (9. Position von Substanz P), wobei die b-Aminfunktion frei ist. Analogon IIIb ist die am nächsten kommende lineare Imitation von Peptid Ia, und enthält die Gruppen CH&sub3; NH-Glur-Arg&sup6; (6. Position von Substanz P) und Ac-NH-[(CH&sub2;)&sub3;]-Gly&sup9; (9. Position von Substanz P). Um einen Einfluß von elektrischer Ladung auf die Aktivität zu vermeiden, wurde der N-Terminus durch Acylierung blockiert und das Glutarsäure-Ende durch N-Methylierung.
Die niedrige Aktivität und das Fehlen von Selektivität für die von Peptid 1a abgeleiteten linearen Peptide zeigen die Wichtigkeit der Cyclisierung, um die Konformationsrestriktion, die für erhöhte Aktivität und Selektivität erforderlich ist, zu erhalten.

B. Beständigkeit gegenüber Proteasen

Fig. 2 zeigt den Abbau von WS-Septide (linear) und Peptid Ia in Ohrspeicheldrüsengewebe. Obwohl das lineare WS-Septide in hohem Maße aktiv und gegenüber dem Rezeptor NK-1 selektiv ist, ist es metabolisch instabil und bereits nach wenigen Minuten ging Aktivität verloren (Halbwertszeit = 6 min). Peptid Ia behält sogar nach 120 min Inkubation mit Ohrspeicheldrüsenschnitten eine 80% Aktivität bei.
Das gleiche Verhaltensmuster kann bei Inkubation mit Leberschnitten beobachtet werden. Nach 30 minütiger Inkubation mit diesem Gewebe blieben 50% der biologischen Aktivität des Peptids Ia erhalten.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von cyclischen, biologisch aktiven Polypeptiden der allgemeinen Formel (I):

worin

n eine ganze Zahl von 1 bis 10 darstellt,

m eine ganze Zahl von 1 bis 10 darstellt,

[AA] einen natürlich vorkommenden oder synthetischen Aminosäurerest darstellt, wobei die Aminosäurereste, wenn n größer 1 ist, gleich oder verschieden sein können,

[A' A'] einen natürlich vorkommenden oder synthetischen Aminosäurerest darstellt, wobei die Aminosäurereste, wenn m größer 1 ist, gleich oder verschieden sein können,

R und R' eine natürlich vorkommende oder synthetische Aminosäure- Seitenkette darstellen,

E eine Hydroxylgruppe, oder eine Carboxylschutzgruppe, die in der Peptidsynthese Standard ist, ausgewählt aus Alkoxy, substituiertem Alkoxy oder Aryloxy, oder eine Blockiergruppe, die wie die Carboxylgruppe oder eine Amino- oder substituierte Aminogruppe sein kann, darstellt, wobei die Carboxylschutzgruppe oder Blockiergruppe gegebenenfalls kovalent an einen unlöslichen Polymerträger gebunden sein kann, und die Bogenlinie eine Abstandhaltegruppe der Formel:

darstellt, worin M aus der Gruppe, bestehend aus -S-S-, -CO-NH- und -Sausgewählt wird, und p und q, die gleich oder verschieden sein können, jeweils eine ganze Zahl von 2 bis 10 darstellen, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt

(a) Umsetzen einer Verbindung der Formel:

worin q eine ganze Zahl von 2 bis 10 darstellt, G und L, die gleich oder verschieden sein können, jeweils eine in der Peptidsynthese gebräuchliche Schutzgruppe darstellen, mit einer Aminosäure oder einem Polypeptid der Formel H&sub2; N-[AA]m-CO-E, worin m eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist und AA einen natürlich vorkommenden oder synthetischen Aminosäurerest darstellt, wobei die Aminosäurereste, wenn m größer 1 ist, gleich oder verschieden sein können, und E eine Carboxylschutzgruppe, ausgewählt aus Alkoxy, substituiertem Alkoxy oder Aryloxy, oder eine Blockiergruppe, die die gleiche oder eine Amin- oder substituierte Amingruppe sein kann, darstellt, wobei die Carboxylschutzgruppe oder Blockiergruppe gegebenenfalls kovalent an einen unlöslichen Polymerträger gebunden sein kann, wobei eine Verbindung der Formel:

erhalten wird,

(b) selektives Entfernen der Schutzgruppe L von der Verbindung nach Formel VIa, wobei eine Verbindung der Formel:

erhalten wird,

(c) Umsetzen der Verbindung nach Formel Vlla mit einer Aminosäure oder einem Peptid der Formel:

worin n eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist, [AA] einen natürlich vorkommenden oder synthetischen Aminosäurerest darstellt, wobei die Aminosäurereste, wenn n größer 1 ist, gleich oder verschieden sein können, und J eine in der Peptidsynthese gebräuchliche Schutzgruppe darstellt, wobei eine Verbindung der Formel:

erhalten wird,

(d) selektives Entfernen der Schutzgruppe J, wobei eine Verbindung der Formel:

erhalten wird,

(e) Umsetzen der Verbindung nach Formel Xa mit einer Verbindung der Formel:

worin p wie vorstehend definiert ist, wobei eine Verbindung der Formel:

erhalten wird,

(f) selektives Entfernen der Schutzgruppe G von der Verbindung XIIa, wobei eine Verbindung der Formei:

erhalten wird,

(g) Umsetzen der Verbindung nach Formel XIIIa mit einem geeigneten Kopplungsmittel, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Dicyclohexylcarbodümid (DCC), Bis(2-oxo-3-oxazolidinyl)phosphinchlorid (BOP-Cl), Benzotriazolyl-N- oxytrisdimethylaminophosphoniumhexafluorophosphat (BOP), 1-Oxo-1 - chlorphospholan (Cpt-Cl) und einem Gemisch aus DCC und

Hydroxybenzotriazol (HOBT), und Entfernen anderer Seitenketten- Schutzgruppen, wobei eine Verbindung der allgemeinen Formel I, worin m eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist, erhalten wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Schritt (a) G aus der Gruppe, bestehend aus Z, Boc und Fmoc ausgewählt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Schritt (a) L aus der Gruppe, bestehend aus Z, Boc und Fmoc ausgewählt wird.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 2 und 3, worin G Boc ist und L Fmoc ist.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 2 und 3, worin G Fmoc ist und L Boc ist.

6. Verfahren zur Herstellung von biologisch aktiven cyclisierten Polypeptiden der allgemeinen Formel (II):

worin

d 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist und e eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist,

[AA] einen natürlich vorkommenden oder synthetischen Aminosäurerest darstellt, wobei die Aminosäurereste, wenn e größer 1 ist, gleich oder verschieden sein können,

[A'A'] einen natürlich vorkommenden oder synthetischen Aminosäurerest darstellt, wobei die Aminosäurereste, wenn d größer 1 ist, gleich oder verschieden sein können,

R eine natürlich vorkommende oder synthetische Aminosäure-Seitenkette darstellt,

E eine Hydroxylgruppe oder eine Carboxylschutzgruppe, die in der Peptidsynthese Standard ist, bevorzugt ausgewählt aus Alkoxy, substituiertem Alkoxy oder Aryloxy, oder eine Blockiergruppe, die wie die Carboxylgruppe oder eine Amino- oder substituierte Aminogruppe sein kann, darstellt, wobei die Carboxylschutzgruppe oder Blockiergruppe gegebenenfalls kovalent an einen unlöslichen Polymerträger gebunden sein kann, und die Bogenlinie eine Abstandhaltegruppe der Formel:

-(CH&sub2;)p-(M)x- Y (IV)

darstellt, worin p wie vorstehend definiert ist und M eine Amino- oder eine Carboxylgruppe oder ein Schwefelatom ist, x gleich 0 oder 1 ist, und Y die Seitenkette einer Hauptkettenaminosäure darstellt, wobei das Verfahren umfaßt:

a) Umsetzen einer Verbindung der Formel:

worin E und e wie vorstehend definiert sind, [A¹A¹] einen natürlich vorkommenden oder synthetischen Aminosäurerest darstellt und Y eine Seitenkette einer natürlich vorkommenden oder synthetischen Aminosäure darstellt und Q eine für die Peptidsynthese gebräuchliche Schutzgruppe darstellt, mit einer Verbindung nach Formel Va, nach Anspruch 1, wobei eine Verbindung der Formel:

erhalten wird,

b) selektives Entfernen der Schutzgruppe L von der Verbindung nach Formel XV, wobei eine Verbindung der Formel:

erhalten wird,

c) Umsetzen der Verbindung nach Formel XVI mit einer Aminosäure oder einem Peptid der Formel:

P-[AA]d-OH (XVII)

worin d eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist und [AA] einen natürlich vorkommenden oder synthetischen Aminosäurerest darstellt, wobei die Aminosäurereste, wenn d größer 1 ist, gleich oder verschieden sein können, und P eine in der Peptidsynthese gebräuchliche Schutzgruppe darstellt, wobei eine Verbindung der Formel:

erhalten wird,

d) (i) wenn Y eine Seitenkette mit einer Carboxylgruppe ist, selektives Entfernen der Schutzgruppen G und Q von der Verbindung XVIII, wobei eine Verbindung der Formel:

erhalten wird, Cyclisieren der Verbindung XIX, indem sie mit dem Kopplungsmittel gemäß Schritt g) nach Anspruch 1 umgesetzt wird, und Entfernen der Schutzgruppe P und anderer Seitenketten-Schutzgruppen, wobei eine Verbindung der allgemeinen Formel II erhalten wird, oder (ii) wenn Y eine Seitenkette mit einer von Carboxyl verschiedenen nukleophilen funktionellen Gruppe ist, selektives Entfernen der Schutzgruppe G, Umsetzen der resultierenden Verbindung mit einer Verbindung der Formel:

HOOC-(CH&sub2;)z W (XX)

worin z eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist und W eine funktionelle Gruppe ist, die zur Reaktion mit der nukleophilen Gruppe geeignet ist, wobei eine Verbindung der Formel:

erhalten wird, selektives Entfernen der Schutzgruppe Q, woraufhin die Cyclisierung stattfindet, und Entfernen der Schutzgruppe P und anderer Seitenketten-Schutzgruppen von Verbindung XXI, wobei eine Verbindung der allgemeinen Formel II erhalten wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei Y die Seitenkette von Homocystein oder Cystein darstellt, Q Benzyl ist und E ein Amid ist.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, worin G aus der Gruppe, bestehend aus Z, Boc und Fmoc ausgewählt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei L aus der Gruppe, bestehend aus Z, Boc und Fmoc ausgewählt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei G Boc ist und L Fmoc ist.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 10, wobei in Schritt (c) P Acetyl ist.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 10, wobei E ein Amid ist.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 11, wobei in Schritt (d) (ii) W aus der Gruppe, bestehend aus Halogenatomen, O-p-Toluolsulfonyl, O- Methansulfonyl und O-Trifluormethansulfonyl ausgewählt wird.

14. Cyclisches, biologisch aktives Polypeptid mit der Formel:

15. Cyclisches, biologisch aktives Polypeptid mit der Formel:

16. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel Vb:

worin q eine ganze Zahl von 2 bis 10 darstellt, G und L, die gleich oder verschieden sein können, jeweils Wasserstoff und/oder eine in der Peptidsynthese gebräuchliche Schutzgruppe darstellen, und E eine Hydroxylgruppe oder eine Carboxylschutzgruppe, die in der Peptidsynthese Standard ist, bevorzugt ausgewählt aus Alkoxy, substituiertem Alkoxy oder Aryloxy, oder eine Blockiergruppe, die wie die Carboxylgruppe oder eine Amino- oder substituierte Aminogruppe sein kann, darstellt, wobei die Carboxylschutzgruppe oder Blockiergruppe gegebenenfalls kovalent an einen unlöslichen Polymerträger gebunden sein kann, durch

(i) Umsetzen der freien Säure Va gemäß Anspruch 1 mit dem entsprechenden, die Gruppe E enthaltenden Reagenz, wobei der Ester, das Amid oder die kovalente Bindung mit dem polymeren Träger erhalten wird, oder

(ii) aus Verbindungen der Formel VIb:

durch Umsetzen dieser freien Säure mit dem entsprechenden, die Gruppe E enthaltenden Reagenz, wobei der Ester, das Amid oder die kovalente Bindung mit dem polymeren Träger erhalten wird, wobei die Verbindung der Formel VIb aus Verbindung XXVI gemäß Anspruch 17 erhalten wird durch Umsetzen dieser freien Säure mit den geeigneten, die Gruppe E enthaltenden Reagenz, wie vorstehend definiert, wobei der Ester, das Amid oder die kovalente Bindung mit dem polymeren Träger erhalten wird.

17. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel Va gemäß Anspruch 1, wobei das Verfahren umfaßt (a) Umsetzen einer α- Halogencarbonsäure der Formel:

worin R wie in Anspruch 1 definiert ist und Hal Chlor, Brom oder Jod ist, mit einem Alkylendiamin der Formel:

H&sub2; N-(CH&sub2;)q-NH&sub2; (XXIII)

worin q wie in Anspruch 1 definiert ist, wobei eine Verbindung der Formel:

erhalten wird,

(b) (I) Umsetzen der Verbindung nach Formel XXIV mit dem geeigneten, die Gruppe G enthaltenden Reagenz durch Peptidsynthese- Standardverfahren, wobei G gemäß Anspruch 1 ist, wobei eine Verbindung der Formel

erhalten wird, und Umsetzen der Verbindung nach Formel (XXVI) mit einem L enthaltenden Reagenz durch Peptidsynthese-Standardverfahren, wobei L in Anspruch 1 definiert ist, wobei eine Verbindung der Formel Va erhalten wird, oder

(ii) Umsetzen der Verbindung nach Formel XXIV mit einem geeigneten, G enthaltenden Reagenz durch Peptidsynthese-Standardverfahren, wobei G wie vorstehend definiert ist, wobei eine Verbindung nach Formel:

erhalten wird, selektives Entfernen der Schutzgruppe G von der sekundären Aminfunktion, wobei eine Verbindung der allgemeinen Formel XXVI erhälten wird.

18. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend das Hauptkettencyclisierte Polypeptid gemäß den Ansprüchen 14 oder 15, welche eine beliebige der Verbindungen nach Formel Id oder IIa umfaßt.

19. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 18 zur Behandlung von Schmerz, Entzündung, Alzheimer-Krankheit, familiärer Dysautonomie, Parkinson-Krankheit und retardiver Dyskinesie.