DE68923572T2

DE68923572T2 - Peptide.

Info

Publication number: DE68923572T2
Application number: DE68923572T
Authority: DE
Inventors: Adrian Francis Bristow; Sergio Henriques Fac Ferreira; Stephen Poole
Original assignee: British Technology Group Ltd
Current assignee: BTG International Ltd
Priority date: 1988-03-28
Filing date: 1989-03-28
Publication date: 1996-01-18
Anticipated expiration: 2009-03-29
Also published as: IE61222B1; NO894720D0; GB8906972D0; GB2217331B; WO1989009226A1; EP0335662A1; FI95273C; HK45895A; EP0335662B1; GB2217331A; NO300978B1; DE68923572D1; JPH09165400A; NO894720L; IE890998L; GB2217331C; FI895675A0; CA1340186C; AU629826B2; ATE125548T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Peptide, ihre Herstellung und ihre Verwendung.
Der Begriff Interleukin-1 (IL-1) beschreibt zwei pluripotente Entzündungsproteine, welche durch aktivierte Makrophagen und andere Zelltypen erzeugt werden. Zwei Gene codieren die zwei Formen von IL-1, IL-1α und IL1β, welche Aminosäuresequenzen mit nur 26% Homologie aufweisen. Nichtsdestotrotz heißt es, daß IL-1α und IL-1β ähnliche biologische Aktivitäten mit wenigen Ausnahmen besitzen. Tatsächlich scheinen beide Moleküle am gleichen Rezeptor zu wirken. Es ist gut feststellbar, daß beide eine Rolle als ein hämopoetischer Wachstumsfaktor und in der Pathologie einer Anzahl von entzündlichen Erkrankungen spielen. Auch besitzt IL-1 Antitumoraktivität.
Da IL-1 Prostaglandine freisetzt, welche beim Menschen und bei Versuchstieren Schmerzrezeptoren sensibilisieren, wurden IL-1α und IL-1β auf hyperalgesische bzw. Schmerzüberempfindlichkeitsaktivität untersucht. Es wurde festgestellt, daß IL-1β ein äußerst potentes hyperalgesisches Mittel mit etwa der 3.000fachen Aktivität von IL-1α ist. Des weiteren wurde eine Familie von Peptiden entdeckt, welche durch IL-1β und durch andere Entzündungsmittel hervorgeruf ene Hyperalgesie bzw. Schmerzüberempfindlichkeit sehr wirksam antagonisieren. Diese Peptide können daher als Analgetika verwendet werden.
Biologisch aktive Peptide sind bekannt. Beispielsweise beschreibt die EP-A-0026640 Peptide, einschließlich dem Tripeptid Arg-Pro-GlyNH&sub2;, welche LHRH-Agonist- und -Antagonistaktivität besitzen und bei der Förderung und Verminderung der Fruchtbarkeit nützlich sind. Die FR-A-2118134 beschreibt eine Klasse von Polypeptiden mit die Phagocytose oder Pinocytose stimulierender oder inhibierender Aktivität. Unter den speziell erwähnten Polypeptiden befindet sich eine Reihe von Tripeptiden, einschließlich Lys-Pro-Lys, Lys-Pro- Arg, Lys-Pro-Orn, Lys-Pro-His, Arg-Pro-Arg, Arg-Pro-Lys, Arg-Pro-Orn und Arg-Pro-His.
Die GB-A-2058085 offenbart ein neues cyclisches Analogon eines natürlich vorkommenden Phagocytose stimulierenden Peptids, welches die Tripeptidsequenz Lys-Pro-Arg beinhaltet. Die GB-A-2163166 betrifft eine Klasse von anti-hypotonen Mitteln, welche Peptide aus zwei oder vier Aminosäuren in der Länge sind, und die Dipeptidsequenzen Arg-Pro und Lys- Pro beinhalten. Die JP-53/101365 (zusammengefaßt in Chemical Abstracts 90, 104363v (1979)) offenbart ein Peptid, das die Sequenz Arg-Pro-Lys beinhaltet und welches Nervenzellen aktiviert, eine Zunahme der Adenylcyclaseaktivität verursacht und die intrazelluläre Konzentration an 3',5'-cyclischem AMP erhöht.
Es wurden einige biologisch aktive Peptide aus dem Stand der Technik auf analgetische bzw. schmerzstillende Wirkung überprüft. Beispielsweise beschreiben Nicolaides et al. in Int.J.Peptide Protein Res. 25 (1985), S. 435-441 die Untersuchung des Tripeptids Lys-Pro-Arg auf analgetische Wirkung. Furuta et al. beschreiben in J.Pharmacol. 83(1), S. 43-48 (1984) Struktur- und Anti-Schmerzaktivitätsstudien an Neurotensin, einem Tridecapeptid, das die Sequenz Arg-Pro-(Tyr beinhaltet. In Naturwissenschaften 72(2), S. 85-86 (1985) wird von Herman et al. festgestellt, daß das Dipeptid Lys-Pro, eine Teilsequenz des analgetischen Tetrapeptids Tuftsin, eine hervorgehobene Anti-Schmerzwirkung in einem Heißplattenversuch besitzt, wenn es in das Gehirn eingespritzt wird. Smolders et al. beschreiben in Can.J.Biochem. 58(11), 1241-6 (1980) ¹³C-NMR-Studien an analgetischen Peptiden, einschließlich dem Dipeptid Arg-Pro.
Goerne et al. offenbaren in Pharmazie 37(4), 299-300 (1982), daß für die Dipeptide Arg-Pro und Lys-Pro beobachtet wurde, daß sie Hyperalgesie hervorrufen, wenn sie Mäusen verabreicht werden.
Andere Druckschriften beschreiben spezifische Peptide, welche unter die folgende allgemeine Formel (I) fallen, aber nicht im Zusammenhang mit der Schmerzprophylaxe oder -behandlung.
Die vorliegende Erfindung liefert nun die Verwendung eines Peptids der Formel (I)
in der X H&sub2;N-[CH&sub2;]&sub4;-CH(NH&sub2;)-C(=O)- oder H&sub2;N-C(=NH)-NH-[CH&sub2;]&sub3;-CH(NH&sub2;)-C(=O)- ist und Y eine Hydroxygruppe oder ein Aminosäurerest ist, mit der Maßgabe, daß der zwischen X und Y liegende Prolinrest D-Pro ist, wenn X Lys oder Arg ist. Das Peptid der Formel (I) kann in Form seines C-terminalen Amids vorliegen. Es kann ein pharmazeutisch annehmbares Salz des Peptids der Formel (I) oder seines C-terminalen Amids verwendet werden.
Ein Artikel von D.B. Richards und J.M. Lipton in Peptides 5 (1984), 815-817 offenbart die antipyretische Wirkung des Tripeptids Lys-Pro-Val in fiebrigen Kaninchen. Einige andere Peptide der Formel (I) sind bekannt, aber einige sind neu. Dementsprechend liefert die vorliegende Erfindung ein Peptid der Formel (I), ein C-terminales Amid oder pharmazeutisch annehmbares Salz wie oben definiert, mit der weiteren Maßgabe, daß das Peptid der Formel (I) nicht Arg-D-Pro-Pro, Arg- D-Pro-Lys, D-Lys-D-Pro-D-Arg, D-Lys-Pro, Arg-D,L-Pro, Lys-D- Pro-Val, D-Lys-Pro-Val oder D-Lys-D-Pro-D-Val ist.
Die Erfindung liefert auch ein Verfahren für die Herstellung der neuen Peptide der Formel (I), ihrer C-terminalen Amide und den pharmazeutisch annahmbaren Salzen dieser Peptide und Amide, wobei das Verfahren die chemische Synthese eines solchen Peptids, wahlweise als ein C-terminales Amid und, falls gewünscht, die Umwandlung der resultierenden Verbindung in ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon umfaßt.
Jeder der bestandteilbildenden Aminosäurereste des Peptids der Formel (I), welcher chiral ist, kann entweder als optisches D- oder L-Isomer vorliegen. Das D-Isomer ist besonders bevorzugt im Falle des zentralen Prolinrestes. Unter Verwendung des Drei-Buchstaben-Systems zur Bezeichnung von Aminosäuren, in welchem die Symbole die L-Konfiguration der chiralen Aminosäure bezeichnen, wenn nichts anderes angegeben ist, kann X Lys, D-Lys, Arg oder D-Arg sein. Tatsächlich kann ein Peptid der Formel (I) als racemisches Gemisch oder als ein optisch reines Isomer vorliegen. Bevorzugt ist X Lys oder D-Lys.
Wenn Y eine Hydroxygruppe ist, ist das Peptid der Formel (I) ein Dipeptid. Tripeptide sind jedoch bevorzugt. Y ist typischerweise ein α-Aininosäurerest. Insbesondere ist Y im allgemeinen ein natürlich vorkommender Aminosäurerest.
Bevorzugt ist Y ein neutraler Aminosäurerest. Ein aliphatischer Aminosäurerest wird einem aromatischen Aminosäurerest vorgezogen und ein neutraler Aminosäurerest einem sauren Aminosäurerest. Insbesondere kann Y ein Threonin- oder Valinrest sein. Wenn Y ein Threoninrest ist, ist eine Ausführungsform des Peptides der Formel (I) ein Peptid der folgenden Formel (II):
Y kann auch ein von Glycin abgeleiteter Rest sein. Y kann ein Alanin- oder Serinrest oder bevorzugt ein Leucin- oder Isoleucinrest sein. Y kann auch in geeigneter Weise ein saurer Aminosäurerest sein. Y ist dann typischerweise ein Rest von Asparaginsäure oder Asparagin.
Besonders bevorzugte Peptide der Formel (I) sind Lys-D-Pro- Thr und Lys-D-Pro-Val. Auch bevorzugt sind D-Lys-Pro-Thr, D- Arg-Pro-Val, Arg-D-Pro-Val, D-Arg-D-Pro-Val, D-Arg-Pro-Thr, Arg-D-Pro-Thr und D-Arg-D-Pro-Thr. Ein Dipeptid kann Lys-D- Pro oder Arg-D-Pro sein. Lys-D-Pro-Asn ist ein weiteres bevorzugtes Peptid. Ein bevorzugtes Peptid der Formel (II) ist Lys-Pro-Thr.
Die Peptide der Formel (I), sowohl neue als auch alte, können durch chemische Synthese hergestellt werden. Ein Peptid wird durch Kondensation der bestandteilbildenden Aminosäuren in der Reihenfolge, in welcher sie in Formel (I) vorkommen, aufgebaut. Das Peptid kann mit einer freien Carboxyl- oder Amid(-CONH&sub2;)-Gruppe an seinem C-terminalen Ende erhalten werden. Es können Festphasen- oder Lösungsverfahren verwendet werden. Das resultierende Peptid kann, falls erwünscht, in ein pharmazeutisch annehmbares Salz umgewandelt werden.
Bei einer Festphasen-Synthese wird die Aminosäuresequenz der Formel (I) aufeinanderfolgend von der C-terminalen Aminosäure aus, welche an ein unlösliches Harz gebunden ist, aufgebaut. Wenn das gewünschte Peptid erzeugt worden ist, wird es vom Harz abgespalten. Wenn eine Lösungsphasen-Synthese verwendet wird, kann das Peptid wieder von der C-terminalen Aminosäure aus aufgebaut werden. Die Carboxylgruppe dieser Säure bleibt durchgehend durch eine geeignete Schutzgruppe blockiert, welche am Ende der Synthese entfernt wird.
Welche Technik auch immer, Festphase oder Lösungsphase, verwendet wird, besitzt jede dem Reaktionssystem zugesetzte Aminosäure nypischerweise eine geschützte Aminogruppe und eine aktivierte Carboxylgruppe. Eine Aminogruppe kann durch die Fluoren-9-ylmethoxycarbonyl (Fmoc) - oder t-Butoxycarbonyl(Boc)-Gruppe geschützt sein. Eine Carboxylgruppe kann als Pentafluorphenyl- oder 1-Oxo-2 -hydroxy-dihydrobenztriazinester aktiviert sein. Jeder Kondensationsschritt kann in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid oder 1-Hydroxybenztriazol durchgeführt werden. Die Seitenkettenaminogruppe von Lysin und die Seitenkettenhydroxylgruppe von Threonin können als ihre Butylether (im Fall von Serin und Threonin), Butylester (im Fall von Asparaginsäure), Butyloxycarbonylderivate (Lysin) und 4,4'-Dimethoxybenzydrylgruppe (Asparagin) geschützt sein. Nach jedem Schritt in der Synthese wird die α- Aminoschutzgruppe entfernt. Jegliche Seitenkettenschutzgruppen werden im allgemeinen am Ende der Synthese entfernt.
Die Peptide können entweder mit einer C-terminalen Carboxylgruppe oder einer C-terminalen Amidgruppe hergestellt werden. Bei der Peptidsynthese in der Festphase kann dies dadurch bestimmt werden, wie die C-terminale Aminosäure mit dem Harzträger verbunden ist und/oder wie das Endpeptid vom Harzträger abgespalten wird. Tvpischerweise ist das Harz ein Styrol- und/oder Divinylbenzolpolvmer. Die C-terminale Aminosäure kann an das Harz mittels einer Esterbindung gebunden sein, welche durch eine starke Säure, wie HBr in Trifluoressigsäure oder HF gespalten werden kann, um das Peptid mit einer C-terminalen Carboxylgruppe zu ergeben. Eine Ammonolyse kann anstelle dessen das entsprechende Amid ergeben.
Um ein Peptidamid durch Festphasensynthese zu erhalten, besteht ein alternatives Verfahren darin, es einzurichten, daß die C-terminale Aminosäure des Peptides an das Harz über eine Peptid-Aminobenzhydryl-Bindung gebunden ist. Diese kann durch Kuppeln mit Dicyclohexylcarbodiimid gebildet werden und kann mit HF, tvpischerweise in der Kälte, gespalten werden. Ob eine C-terminale Carboxyl- oder Amidgruppe vorliegt, kann bei der Lösungsphasensynthese davon abhängen, wie die Carboxylgruppe der C-terminalen Aminosäure blockiert ist und am Ende der Synthese entblockiert wird. Ein Peptid mit einer C-terminalen Carboxylgruppe kann in eines mit einer C-terminalen Amidgruppe umgewandelt werden und vice versa.
Das resultierende Peptid kann in ein pharmazeutisch annehmbares Salz umgewandelt werden. Es kann mit einer organischen oder anorganischen Säure in ein Säureadditionssalz umgewandelt werden. Geeignete Säuren schließen Essigsäure, Bernsteinsäure und Chlorwasserstoffsäure ein. Alternativ dazu kann das Peptid in ein Carbonsäuresalz, wie das Ammoniumsalz, oder ein Alkalimetallsalz, wie das Natrium- oder Kaliumsalz, umgewandelt werden.
Die Peptide der Formel (I) und ihre Amide und Salze sind Analgetika bzw. Schmerzmittel. Schmerz kann daher beim Menschen oder Tier durch Verabreichung einer wirksamen Menge eines Peptides der Formel (I) oder eines C-terminalen Amides oder pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon behandelt oder verhindern werden. Schmerz kann daher gelindert werden. Dementsprechend liefert die vorliegende Erfindung ein wie oben definiertes Peptid der Formel (I), das C-terminale Amid davon oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz dieses Peptides oder Amides, mit der weiteren Maßgabe, daß das Peptid nicht Arg-D-Pro-Pro, Arg-D-Pro-Lys, D-Lys-D-Pro-D-Arg, D-Lys-Pro, Arg-D,L-Pro, Lys-D-Pro-Val, D-Lys-Pro-Val oder D-Lys-D-Pro- D-Val ist, zur Verwendung als ein Analgetikum.
Eines der bevorzugten Tripeptide der Erfindung, Lys-Pro-Thr, bildet einen Teil der Sequenz von IL-1β. Sowohl es selbst als auch sein D-Pro-Racemat antagonisieren durch IL-1β hervorgerufene Hyperalgesie bzw. Schmerzüberempfindlichkeit. Jedoch wurde für die Gesamt-L-Verbindung auch gefunden, daß sie bei bestimmten Konzentrationen als ein Agonist wirkt; Dosen in Ratten von ≥ 50 ug/150 g Ratte rufen Schmerzüberempfindlichkeit hervor. Die D-Pro-Verbindung zeigte diese Agonistwirkung nicht und wird daher der Gesamt-L-Verbindung vorgezogen, obwohl ihre schmerzstillende Wirkung geringer ist als die der L-Verbindung. Die ED&sub5;&sub0;-Werte in Ratten von Lys-Pro-Thr und Lys-D-Pro-Thr wurden zu etwa 25 bzw. 85 ug/150 g Ratte berechnet. Es wurde auch gefunden, daß die Tripeptide Lys-Pro-Val und Lys-D-Pro-Val potentere bzw. stärkere Antagonisten von durch IL-1β hervorgerufener Hvperalgesie sind, als Lys-D-Pro-Thr.
Ein weiterer Beweis für die stärkere Antagonistwirkung der Tripeptide mit einem C-terminalen Valinrest im Vergleich zu jenen mit einem C-terminalen Threoninrest beruht auf der Tatsache, daß sowohl Lys-Pro-Val als auch Lys-D-Pro-Val durch PGE&sub2; hervorgerufene Hyperalgesie antagonisieren. Diese Wirkung wird von Lys-Pro-Thr oder Lys-D-Pro-Thr nicht gezeigt. Lys-Pro-Val und sein D-Pro-Racemat antagonisieren tatsächlich durch PGE&sub2; hervorgerufene Hyperalgesie bei höheren Dosismengen, als jenen, bei welchen sie durch IL-1β hervorgerufene Hyperalgesie antagonisieren. Die ED&sub5;&sub0;-Werte in Ratten betragen etwa 170 ug/150 g Ratte bzw. 140 ug/150 g Ratte für Lys-Pro-Val und Lys-D-Pro-Val, die durch PGE&sub2; hervorgerufene Hyperalgesie antagonisieren. Bei von IL-1β hervorgerufener Hyperalgesie betragen die relevanten ED&sub5;&sub0;-Werte 70 ug/150 g Ratte bzw. 40 ug/150 g Ratte.
Keine der Tripeptide der vorliegenden Erfindung sind Antagonisten auf Hyperalgesie, welche durch Dibutyl-cyclisches Adenosinmonophosphat (DBCAMP) hervorgerufen ist. Der Mangel jeglichen solchen Effekts steht stark mit Morphin in Gegensatz, das ein sehr wirksamer Antagonist auf durch DbcAMP hervorgerufene Hyperalgesie ist. Dies liefert daher eine Anzeige dafür, daß die Peptide der Formel (I) in ihrer Aktivität bzw. Wirksamkeit Morphin nicht ähnlich sind.
Ein Vorteil der Peptide Lys-Pro-Thr und Lys-D-Pro-Thr ist, daß sie anders als sowohl steroide als auch nicht-steroide (aspirinähnliche) analgetische Arzneimittel wie oben erwähnt Prostaglandinproduktion nicht hemmen, was eine schützende Wirkung im Magen besitzt. Steroide und nicht-steroide (aspirinähnliche) Arzneimittel verursachen Läsionen bzw. Verletzungen im Magen, welche ihre Nützlichkeit, insbesondere bei der Behandlung von Svmptomen rheumatoider Arthritis, wofür IL-1β teilweise verantwortlich sein kann. Dieses Problem der Magenläsionen bzw. -verletzungen kann daher durch Verwendung der Peptide der Formel (I) und ihrer Salze verhindert werden.
Ein Peptid der Formel (I) und sein C-terminales Amid und seine Salze können oral oder parenteral, beispielsweise subkutan, intravenös, intramuskulär, intraperitoneal, intranasal oder durch bukkale Verabreichung, gegeben werden. Typischerweise wird eine Verbindung einem Menschen oder Tier in einer Menge von 0,2 bis 2 mg/kg pro Dosis entweder auf oralem Wege oder parenteralem Wege verabreicht.
Zur Verwendung ist ein Peptid der Formel (I) oder ein C-terminales Amid oder Salz davon gewöhnlich zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungs- oder Streckmittel formuliert. Herkömmliche Formulierungen, Träger, Hilfsmittel und Verdünnungsmittel bzw. Streckmittel können verwendet werden. Dies wird im allgemeinen durch den Weg der Verabreichung bestimmt werden.
Die folgenden Beispiele 1 bis 19 veranschaulichen die Erfindung. Ein Referenzbeispiel, welches zeigt daß IL-1β ein potentes hyperalgesisches Mittel ist, wird ebenfalls geliefert. In den Beispielen und dem Referenzbeispiel in bezug genommenene Figuren zeigen:
Fig. 1 die Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) -Spur des gereinigten Peptids Lys-D-Pro-Thr (Beispiel 3);
Fig. 2 die HPLC-Spur von gereinigtem KPV (Beispiel 4);
Fig. 3 die HPLC-Spur von gereinigtem K(D)PV (Beispiel 5);
Fig. 4 die hyperalgesische Wirkung von IL-1β und seiner Schwächung durch Vorbehandlung mit Indomethacin (Referenzbeispiel);
Fig. 5 die Wirkung von drei Peptiden auf durch IL-1β hervorgerufene Hyperalgesie (Beispiel 6);
Fig. 6 die hyperalgesische Antwort auf IL-1α und IL-1β und die Wirkung von Peptid K(D)PT auf diese Antworten (Beispiel 7);
Fig. 7 die Wirkung von K(D)PT auf die durch PGE&sub2;, Carrageen und IL-1β hervorgerufene Hvperalgesie (Beispiel 8);
Fig. 8 die HPLC-Spur des Peptids von Beispiel 16 und
Fig. 9 die HPLC-Spur des Peptids von Beispiel 17.

Beispiel 1: Herstellung von Lys-Pro-Thr

Das Tripeptid Lys-Pro-Thr wurde unter Verwendung der Fmoc- Polyamid-Methode der Festphasen-Peptidsynthese (Dryland and Sheppard, Peptide Synthesis 8, "A system for solid phase synthesis under low pressur continuous flow conditions", J. Chem. Soc. Perkin. Trans. 1, 125, 1986) synthetisiert. Der Festphasen-Träger war ein Polydimethylacrylamidpolymer, das aus den drei Monomeren Dimethylacrylamid (Gerüstmonomer), Bis-acryloylethylendiamin (Verzweiger) und Acryloylsarcosaminmethylester (funktionalisierendes Mittel) zusammengesetzt ist. Das verwendete von Harz spaltbare, gebundene Mittel an Peptid war das säurelabile 4-Hydroxymethyl-phenoxyessigsäurederivat.
Alle Aminosäurederivate wurden als ihre vorher gebildeten symmetrischen Anhydridderivate zugefügt. Vorübergehende Na-Aminogruppenschützung wurde durch die Fmoc-Gruppe bewirkt. Eine wiederholte Abspaltung dieser Gruppe wurde unter Verwendung von 20% Piperidin in N,N-Dimethylformamid bewirkt. Seitenkettenfunktionalitäten wurden als Butylester (Threonin) und Butyloxycarbonylderivat (Lysin) geschützt.
Nach Vervollständigung der Synthese wurde das resultierende Peptid vom Harzträger mit 95%iger Trifluoressigsäure (TFA), welche eine 5%ige Radikalfängermischung enthält, abgespalten. Das Peptid wurde durch HPLC gereinigt. Eine Reinheit wurde durch Aminosäureanalyse und durch Massenspektroskopie mit schnellen Atomstrahlen (FAB-MS) festgestellt: Aminosäureanalyse - berechnet gefunden
FAB-MS: ein Positivionenspektrum ergab M + H&spplus; bei m/z 345 (Molekulargewicht beträgt 344,415 (344)).
Die Reinheit betrug über 80%. Eine Reinigung auf über 95% wurde durch Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung einer Hvpersil (Warenzeichen) WP 300 Butylsäule (150 x 4,6 mm) durchgeführt. Die Puffer waren: A = 0,25% TFA und B = 0,25% TFA in CH&sub3;CN. Die Feststellung wurde durch UV bei 225 nm durchgeführt, und die präparative Beschickung betrug 0,5 mg.

Beispiel 2: Herstellung von Lys-D-Pro-Thr (1)

Das Tripeptid Lys-D-Pro-Thr wurde synthetisiert und in Übereinstimmung mit der in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrensweise gereinigt. Eine Reinheit wurde durch Aminosäureanalyse, FAB-MS und HPLC bestimmt: Aminosäureanalyse - berechnet gefunden
FAB-MS: ein Positivionenspektrum ergab M + H&spplus; bei m/z 345 (Molekulargewicht beträgt 344,415 (344)).
HPLC: Säule: uBondapak C&sub1;&sub8; 3,8 mm x 30 cm Lösungsmittel: Lineargradient 5 bis 95% B während 20 Minuten; A = 0,1% TFA/H&sub2;O und B = 0,1% TFA/CH&sub3;CN, Fließgeschwindigkeit 1,5 cm³ min&supmin;¹
Aufzeichnung: UV bei 230 nm.
Die Reinheit betrug über 80%. Diese wurde auf > 95% wie in Beispiel 1 beschrieben erhöht.

Beispiel 3: Herstellung von Lys-D-Pro-Thr (2)

Das Tripeptid Lys-D-Pro-Thr wurde ebenfalls durch Festphasensynthese unter Verwendung der Boc-Aminoschutzgruppe hergestellt. Das Ausgangsharz war Boc-Thr-(benzyl (Bzl))-O- Harz. Nach Entschützung bzw. Freilegung mit 20% TFA/DCM (DCM = Dichlormethan), gefolgt durch Neutralisierung mit 10% Triethylamin, wurde das Boc-D-Pro unter Verwendung von DCC (DCC = Dicyclohexylharnstoff)/DCM gekuppelt. Eine erfolgreiche Kupplung wurde mittels des Kaiser-Tests festgestellt. Folgend der Entschützung bzw. Abspaltung der Schutzgruppe und Neutralisierung des Boc-D-Pro-Restes wurde der Endrest als das Boc-Lys-(Benzyloxycarbonyl(Z))-Derivat gekuppelt, um das Peptidharz zu ergeben.
Das Peptidharz wurde einer HF-Abspaltung bei 0ºC während 45 Minuten unterworfen, um das rohe Peptid zu ergeben. Anisol wurde während der Abspaltung als Radikalfänger verwendet. Das rohe Peptid wurde unter Verwendung einer mobilen Phase von Butanol:Pyridin:Essigsäure:H&sub2;O (B:P:A:W) von 90:90:18:72 auf "Kieselgel 60"-Siliciumdioxid gereinigt. Nach Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum wurde die Probe aus Wasser lyophilisiert, um das reine Peptid zu ergeben. Aminosäureanalyse - berechnet gefunden

Dünnschichtchromatoaraphie:

1. B:P:A:W bei 60:20:6:24 ergab einen einzelnen Punkt, Ninhydrin-Positiv, Rf 0,21
2. B:A:W bei 3:1:1 ergabe einen einzelnen Punkt, Ninhydrin- Positiv, Rf 0,24.
HPLC: Die erhaltene Spur ist in Fig. 1 gezeigt, worin I die Lösungsmittelfront bezeichnet. HPLC-Modus: Gilson. Säule:
Vydac C.18. Lösungsmittel: A 0,05 M NaH&sub2;PO&sub4; und B 60% CH&sub3;CN in A.
Gradient: Linear 0 bis 100% B in 40 Minuten.
Aufzeichnungsgerät: 2 mm/min, Auf zeichner: 210 mm AUFS.

Beispiel 4: Herstellung von Lys-D-Pro-Val

Das Tripeptid wurde synthetisiert und hergestellt in Übereinstimmung mit der Vorgehensweise in Beispiel 1. Analysenergebnisse sind die folgenden: Aminosäureanalyse Lys Pro Val Berechnet: Gefunden:

HPLC

Die HPLC-Spur des gereinigten Tripeptids ist in Fig. 3 gezeigt.
Säule: Vydac C&sub1;&sub8; 4,6 mm x 25 cm
Lösungsmittel: Lineargradient 0 bis 30% B während 30 min
Fließgeschwindigkeit: 1,5 cm³ min&supmin;¹
A = 0,1% TFA/H&sub2;O
B = 0,1% TFA/CH&sub3;CN
Aufzeichnung: UV bei 230 nm.

Referenzbeispiel: Hyperalgesische Aktivität von IL-1β

Die hyperalgesische Aktivität von IL-1β wurde durch einen modifizierten Rattenpfoten-Druckversuch von Randall-Sellito untersucht (Ferreira et al., Eur. J. Pharacol. 53, 39-48, 1978). Das IL-1β (und das IL-1α, das in Beispiel 6 verwendet wurde) waren menschliche, rekombinante Proteine, die von Genzyme Ltd. geliefert werden und gegen Interim-Referenzreagenzien kalibriert sind. (Diese sind temporäre biologische Standards vom National Institute for Biological Standards and Control, Potters Bar, GB: für IL-1α 1 Einheit = 10 pg und für IL-1β 1 Einheit = 10 pg).
Die Entwicklung zweiseitiger Hyperalgesie bzw. Schmerzüberempfindlichkeit (Schmerzempfindung) nach Injektion von IL-1β in eine Pfote von Ratten und ihre Abschwächung durch vorherige Behandlung mit Indomethacin (INDO) wurde untersucht. Das IL-1β wurde entweder intraplantar (ipl, Injektionsvolumen = 0,1 ml) oder intraperitoneal (ip, Injektionsvolumen = 0,3 ml) verabreicht. Indomethacin wurde ipl verabreicht, 100 ug in 0,1 ml.
Eine Hyperalgesie bzw. Schmerzüberempfindlichkeit wurde unter Anwendung eines konstanten Druckes von 20 mm Hg auf die Hinterpfoten von Ratten (Wistar-Rasse, männlich, Gewicht 135 bis 170 g) bewertet, welcher unterbrochen wurde, wenn Tiere eine charakteristische Gefrierreaktion zeigten (Reaktionszeit). Die Intensität der Schmerzüberempfindlichkeit wurde als Variation der Reaktionszeit (Δ Reaktionszeit, s) bewertet, welche durch Abzug des Wertes von der Vorinjektions- Kontrollreaktionszeit (Nullzeit) erhalten wurde, der nach 1, 2, 3 oder 4 h nach der Verabreichung des hyperalgesischen Mittels gemessen wurde. Der Experimentator wußte nichts von den Gruppenbehandlungen.
Die Ergebnisse sind in Fig. 4 gezeigt. In Feld A wurde das IL-1β ipl gegeben. Die hyperalgesische Wirkung von IL-1β in die injizierten Pfoten (gefüllte Symbole und dicke Linien) und kontralaterale Pfoten (ungefüllte Symbole und gepunktete Linien) wurde bestimmt.
In den Feldern B und C werden die Ergebnisse als "Bereiche unter Kurven" dargestellt, ausgedrückt in willkürlichen Einheiten und berechnet aus Daten, welche durch Messung der Hyperalgesie in Intervallen von 0, 1, 2, 3 und 4 h nach der Schmerzstimulierung (Ferreira et al., 1978), erhalten wurden. Die senkrechten Balken sind Standardfehler der Mittel (s.e.m's) der Werte, welche Gruppen in von 5 Ratten erhalten werden.
Die Felder B und C zeigen die hyperalgesische Wirkung von 0,05 Einheiten IL-1β, welche ipl bzw. ip verabreicht werden, und die Wirkung der Vorbehandlung mit Indomethacin 30 Minuten vorher. Die Vorbehandlung verminderte bemerkenswert die hyperalgesische Antwort nur in behandelten Pfoten (I). Es ergab sich keine Wirkung in kontralateralen Pfoten (CL), was nahelegt, daß IL-1β Hyperalgesie durch Freisetzung prostaglandinähnlicher Substanzen in der Nachbarschaft von Schmerzempfindungsrezeptoren verursacht.

Beispiel 5: Wirkung von Peptiden auf durch IL-1β hervorgerufene Hyperalgesie

Die Wirkung dreier Tripeptide auf die in Gruppen von Ratten durch IL-1β hervorgerufene Hyperalgesie wurde untersucht. Die drei Tripeptide waren Lys-Pro-Thr (KPT), Lys-D-Pro-Thr (K(D)PT) und ein Peptid Lys-Asp-Asp (KDD), das außerhalb des Umfangs der Erfindung liegt. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 gezeigt.
In Fig. 5 zeigt Feld A die Wirkung der Vorbehandlung mit KPT, K(D)PT und KDD, alle subkutan (sc) verabreicht, auf die hvperalgesischen Antworten auf die ip-Injektion von IL-1β, 30 Minuten später. Feld B zeigt den dosisabhängigen Antagonismus durch K(D)PT der hvperalgesischen Antwort auf IL-1β (0,05 U/150 g), das 30 min später ip verabreicht wurde. Jedes Symbol oder Histogramm stellt die gemittelte Antwort von 5 Tieren pro Behandlungsgruppe dar. Senkrechte Balken sind s.e.m's.

Beispiel 6: Wirkung des Peptids K(D)PT bei durch IL-1α und IL-1β hervorgerufener Hyperalgesie

Die hyperalgesischen Antworten auf IL-1α und IL-1β wurden in Ratten bewertet. Die Wirkung von K(D)PT auf diese Antworten wurde bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 6 gezeigt. Die Daten bedeuten Mittelwerte ± s.e.m's von 5 Tieren pro Behandlungsgruppe. Das K(D)PT (200 ug/150 g Rattengewicht) wurde sc 30 min vor der ip-Injektion von IL-1 verabreicht.
Fig. 6 zeigt, daß eine Inhibierung der zweiseitigen hyperalgesischen Wirkung von IL-1β durch Erhöhung der Dosis von IL- 1β überwunden werden konnte, was mit einem kompetitiven Antagonismus übereinstimmt. Aus Fig. 6 kann auch gesehen werden, daß IL-1β etwa 3000mal stärker als IL-1α als ein hyperalgesisches Mittel war, und daß IL-1α, das die Sequenz Lys-Pro-Thr nicht aufweist, nur schwach durch K(D)PT antagonisiert wurde.

Beispiel 7: Wirkung des Peptids K(D)PT auf durch PGE&sub2;, Carrageen und IL-1β hervorgerufene Hyperalgesie

Die Wirkung von K(D)PT auf durch PGE&sub2;, Carrageen und IL-1β hervorgerufene Hyperalgesie wurde in Ratten bewertet. Die Ergebnisse sind in Fig. 7 gezeigt. Die Felder zeigen die zeitliche Entwicklung hyperalgesischer Antworten auf A: PGE&sub2; (100 ng/Pfote), B: Carrageen (100 ug/Pfote) und C: IL-1β (0,05 U/Pfote). K(D)PT (200 ug/150 g) wurde 30 min vor den ipl-Injektionen ip verabreicht. Jedes Symbol stellt die gemittelte Antwort von 5 Tieren pro Behandlungsgruppe dar. Senkrechte Balken sind s.e.m's.
Das Ödem, das sich nach Injektion von Carrageen entwickelte, wurde plethysmographisch (Ferreira, J. Pharm. Pharmacol., 31, 648, 1979) 4 h nach der Erregung gemessen. Das Ödem wurde durch vorherige Behandlung mit K(D)PT (Daten nicht gezeigt) nicht vermindert. 2 Stunden nach der IL-1β- oder Carrageengabe verabreichtes K(D)PT besaß keine Wirkung auf die induzierte Hyperalgesie, wohingegen zentral wirkende Analgetika, z.B. Morphin und Dipyron, und das Peripheranalgetikum BW 443C eine bestehende bzw. verlaufende Hyperalgesie antagonisieren können. Zusammengenommen mit der Feststellung, daß K(D)PT keine Wirkung auf durch PGE&sub2; hervorgerufene Hyperalgesie besaß, zeigen diese Ergebnisse, daß die analgetische Wirkung von K(D)PT weder zentral noch nichtspezifisch war.

Beispiel 8: Wirkung des Peptids K(D)PT auf durch Essigsäure und Iloprost hervorgerufene Hyperalgesie

Die Wirkung von K(D)PT auf die in Gruppen von 5 Mäusen durch Essigsäure und Iloprost hervorgerufene Hyperalgesie wurde bestimmt. Iloprost ist ein stabiles Analogon von Prostacyclin und besitzt die Formel:
K(D)PT wurde sc vor den ip-Injektionen von 0,6% Essigsäure oder Iloprost (10 ug/kg) verabreicht, welche Verzerrungen (Krümmen des Körpers) verursachten. Die prozentuale Inhibierung dieser Antwort nach Vorbehandlung mit K(D)PT ist in Tabelle 1 gezeigt: TABELLE 1 % Inhibierung der Antwort auf Essigsäure (0,6%) % Inhibierung der Antwort auf Iloprost (10 ug/kg)

Beispiel 9: Vergleich der Wirkung des Peptids K(D)PT und von Indomethacin auf durch Essigsäure und Iloprost hervorgerufene Hyperalgesie

Beispiel 8 wurde wiederholt, wobei einigen Gruppen von Mäusen Indomethacin in verschiedenen Dosen statt des Peptids K(D)PT verabreicht wurden. Eine Kontrollgruppe von Mäusen erhielt weder Indomethacin noch K(D)PT. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Die Daten sind die Gesamtzahl der Krümmungen, welche 20 Minuten nach der ip-Erregung gemessen wurden. TABELLE 2 Behandlung ip-Injektion Kontrolle Indomethacin (mg/kg) Essigsäure Iloprost
K(D)PT war daher bei der Verminderung von Krümmungen wirksam, welche in Mäusen durch die ip-Injektion von Essigsäure und von Iloprost hervorgerufen wurden. Eine Dosis von 8 mg/kg K(D)PT erzeugte eine maximale Analgesie bzw. Schmerz freiheit (kein Unterschied zwischen 8 und 32 mg/kg) in der Größenordnung von 45%, was der Wirkung von Dosen von 5 und 20 mg/kg Indomethacin entsprach. Jedoch verursachte Indomethacin Magenläsionen bei den Mäusen, während dies das Peptid K(D)PT nicht tat. Bei einer Dosis von 20 mg/kg Indomethacin wurden bei 100% der Mäuse Magenerosionen bzw. Magenschleimhautdefekte verursacht. Keine Läsionen wurden mit einer Dosis von 32 mg/kg K(D)PT beobachtet.

Beispiel 10: K(D)PT ist kein zentral wirkendes. morphinähnliches Analgetikum

Ein Standard-Heißplattentest (55ºC) wurde durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Die Ergebnisse sind die gemittelten Standardfehlermittel der Reaktionszeit, wobei durch Subtrahieren von der Reaktionszeit vor der Behandlung die Werte erhalten werden, welche 1 Stunde nach Verabreichung der zwei Arzneimittel beobachtet werden. Die Tabelle zeigt, daß K(D)PT nicht morphinähnlich ist. TABELLE 3 Kochsalzlösung sc-Injetion Morphin (mg/kg)

Beispiel 11: K(D)PT ist nicht aspirinähnlich (d.h. ein Cyclooxigenaseinhibitor)

Die Wirkung von K(D)PT und Indomethacin auf eine PGE&sub2;-Freisetzung durch einkernige Blutzellen vom Menschen (mononuclear cells MNC) wurde untersucht. Die MNC (einkernigen Zellen) wurden aus Leukozytenmanschettenresten durch Dichtegradientzentrifugation (Ficoll-hypaque, Sigma) isoliert und in RPMI 1640 Kulturmedium (Gibco) + 2% inaktiviertem fötalem Kälberserum (Imperial Laboratories) suspendiert. Dem Inkubationsmedium wurden Materialien zugegeben, wie in Tabelle 4 gezeigt. K(D)PT und Indomethacin wurden 45 min vor IL-1β oder Endotoxin zugegeben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Die Werte sind Mittelwerte aus viermaligen Wiederholungen ± s.e.m's. PGE&sub2;-Konzentrationen wurden durch ein Radioimmunassay (NEN Research Products) gemessen. TABELLE 4 Den Inkubationsmedien zugegebene Materialien PGE&sub2;-Freisetzung (ng/ml) durch MNC (5x10&sup6; Zellen/ml), 4 h inkubiert mit: Kochsalzlösung Kontrolle (0,9% w/v) E.coli Endotoxina (25 pg/mlb) 0,1% v/v Dimethylsulfoxid (Kontrolle für K(D)PT) 0,012% v/v Ethanol (Kontrolle für Indomethacin) Indomethacin (2ug/ml, 5,9 umol/l) a: E.coli 0113:H10:K(-) Endotoxin; b: 25 pg/ml = 0,18 IU/ml
K(D)PT besaß keine Wirkung auf eine PGE&sub2;-Erzeugung durch MNC, wohingegen eine 100fach niedrigere Dosis des potenten aspirinähnlichen Arzneimittels Indomethacin die PGE&sub2;-Produktion durch diese Zellen beseitigte.

Beispiel 12: Wirkung von Peptiden auf durch IL-1β hervorgerufene Hyperalgesie

Die Wirkung der Tripeptide Lys-D-Pro-Val (K(D)PV) und Lys-D- Pro-Thr (K(D)PT) auf in Ratten durch IL-1β hervorgerufene Hyperalgesie wurde untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5, welche folgt, wiedergegeben. Behandlungen wurden ip 1 h Stunde vor ebenfalls ip verabreichtem IL-1β gegeben. Jede Behandlungsgruppe enthielt 5 Tiere. Die Reaktionszeitdifferenz wurde 3 h nach einer IL-1β-Verabreichung gemessen.
Die Kontrolle war ip verabreichtes IL-1β (0,05 U). Das Ergebnis für die Kontrollgruppe betrug 23,9±0,5 (= 100%). TABELLE 5 BEHANDLUNG REAKTIONSZEITDIFFERENZ (s) Rattengewicht Nicht geprüft

Beispiel 13: Wirkung von Peptiden auf durch PGE&sub2; hervorgerufene Hyperalgesie

Die Wirkung des Tripeptids K(D)PT auf in Ratten durch PGE&sub2; hervorgerufene Hyperalgesie wurde untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 unten gezeigt. Behandlungen wurden ip 1 h Stunde bevor PGE2 in die Pfote (ipl) injiziert wurde, gegeben. Jede Behandlungsgruppe enthielt 5 Tiere. Reaktionszeitdifferenzen wurden 3 h nach PGE&sub2;-Verabreichung gemessen. Morphin (0,6 mg/150 g) verminderte die Reaktionszeitdifferenz auf 6,1±0,8 s (-63,7%). Die Kontrolle war PGE&sub2; (100 mg/Pfote). Die Ergebnisse für die Kontrollgruppe betrugen 16,8±0,3 (= 100%). NT = Nicht überprüft. TABELLE 6 BEHANDLUNG REAKTIONSZEITDIFFERENZ (s) PEPTID DOSIS ug/150 g Rattengewicht

Beispiel 14: Wirkung von Peptiden auf durch DbcAMP (Kontrolle) hervorgerufene Hyperalgesie

Die Wirkung der Tripeptide KPV und K(D)PV auf in Ratten durch DbcAMP hervorgerufene Hyperalgesie wurde untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 unten gezeigt. Behandlungen wurden ip 1 h bevor DbcAMP in die Pfote (ipl) injiziert wurde gegeben. Jede Behandlungsgruppe enthielt 5 Tiere. Reaktionszeitdifferenzen wurden 3 h nach DbcAMP gemessen. Morphin (0,6 mg/150 g) verminderte die Reaktionszeitdifferenz auf 6,2±0,4 s (-64,0%). Die Kontrolle war DbcAMP (100 ug/Pfote). Die Ergebnisse für die Kontrollgruppe betrugen 17,2±6,4 s (= 100%) TABELLE 7 BEHANDLUNG REAKTIONSZEITDIFFERENZ (s) PEPTID 200 ug/150 g Rattengewicht

Beispiel 15: Herstellung von D-Lys-Pro-Thr

Das Tripeptid D-Lys-Pro-Thr wurde in Übereinstimmung mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren synthetisiert und gereinigt. Die Reinheit wurde durch Aminosäureanalyse, FAB-MS und HPLC festgestellt: Aminosäureanalyse berechnet gefunden
FAB-MS: Positivionenspektrum ergab M + H&spplus; bei m/z 345 (Molekulargewicht beträgt 344,415 (344)).
HPLC: Säule: Vydac C18 4,6 mm x 25 cm
Lösungsmittel: Lineargradient 0 bis 30% B über 30 Minuten;
A = 0,1% TFA/H&sub2;O und B = 0,1% TFA/CH&sub3;CN,
Fließgeschwindigkeit 1,5 cm³ min&supmin;¹
Die erhaltene Spur ist in Fig. 8 gezeigt.

Beispiel 16: Herstellung von Lys-D-Pro

Das Dipeptid Lys-D-Pro wurde in Übereinstimmung mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren synthetisiert und gereinigt. Die Reinheit wurde durch Aminosäureanalyse und HPLC festgestellt. Aminosäureanalyse berechnet gefunden
HPLC: Säule: Vydac C&sub1;&sub8; 4,6 mm x 25 cm Lösungsmittel: Lineargradient 0 bis 10% B über 30 Minuten;
A = 0,1% TFA/H&sub2;O und 10% B = 0,1% TFA/CH&sub3;CN,
Fließgeschwindigkeit 1,5 ml min&supmin;¹, Papiervorschub = 5 mm min&supmin;¹
Die erhaltene Spur ist in Fig. 9 gezeigt.

Beispiel 17: Herstellung von Lys-D-Pro-Asn

Das Tripeptid Lys-D-Pro-Asn wurde in Übereinstimmung mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren synthetisiert und gereinigt. Die Reinheit wurde durch HPLC unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 16, Aminosäureanalyse und FAB-MS festgestellt. Aminosäureanalyse berechnet gefunden
FAB-MS: Positivionenspektrum ergab M + H&spplus; bei m/z 358 (Molekulargewicht beträgt 357,413).

Beispiel 18: Wirkung von Peptiden auf durch Essigsäure hervorgerufene Hyperalgesie

Die Wirkung von Peptiden auf durch Essigsäure hervorgerufene Hvperalgesie in Gruppen von Mäusen (LACA, männlich, 25-359, 6≤N≤9), welche mit einer Dosis eines Peptides oder mit Morphin, Indomethacin oder (physiologischer) Kochsalzlösung (0,1 ml/10 g) behandelt waren, wurde bestimmt. Die Arzneimittel wurden intraperitoneal (ip) oder oral (po) 30 min vor der ip-Injektion von Essigsäure (0,6% v/v, 0,1 ml/10 g) verabreicht. Die Anzahl von Verzerrungen (abdominale Zusammenziehungen oder Krümmungen) wurden im Zeitraum zwischen 10 und 20 min nach einer ip-Anregung durch Essigsäure durch einen Beobachter, dem die Arzneimittelbehandlung nicht bewußt war, gezählt. Die Mittelwerte wurden berechnet und umfassen die in den Tabellen 8 bis 11 angegebenen Daten. Die Zahlen in Klammern sind die % Verminderungen aus Kontrollwerten von Mäusen, welchen Kochsalzlösung als Kontrolle injiziert wurde.
¹: Morphin 2,5 mg/kg ip; 2: Morphin 1,25 mg/kg ip.
Aus den Tabellen 8 bis 11 kann gesehen werden, daß die Tripeptide K(D)PV (Beispiel 4), (D)KPT (Beispiel 15), KPT (Beispiel 1) und K(D)PT (Beispiele 2 und 3), welche zu 2 bis 100 mg/kg ip verabreicht wurden, alle eine dosisbezogene analgetische Wirksamkeit gegen durch Essigsäure in Mäusen hervorgerufene Hyperalgesie besaßen. Bei diesem Test schienen 30 mg/kg ip jedes Peptids etwa so wirksam zu sein, wie eine Dosis von 1,25 mg/kg ip Morphin oder 5 mg/kg Indomethacin (ip) (Tabellen 8 und 10) Des weiteren besaßen die vier Tripeptide eine analgetische Wirksamkeit, wenn sie oral (po) verabreicht wurden (Tabelle 11). Auch das Dipeptid K(D)P war ein wirksames Analgetikum, ob es ip (Tabelle 9) oder po (Tabelle 11) verabreicht wurde. TABELLE 8 Arzneimitteldosis (mg/kg, ip) Arzneimittel Morphin TABELLE 9 Arzneimitteldosis (mg/kg, ip) Arzneimittel TABELLE 10 Arzneimitteldosis (mg/kg, ip) Arzneimittel Indomethacin TABELLE 11 Arzneimitteldosis (mg/kg, po) Arzneimittel

Claims

1. Verwendung

(a) eines Peptides der Formel (I):

in der X

H&sub2;N-(CH&sub2;)&sub4;-CH(NH&sub2;)-C(=0)- oder

H&sub2;N-C(=NH)-NH-(CH&sub2;)&sub3;-CH(NH&sub2;)-C(=0)- ist und Y

eine Hydroxygruppe oder ein Aminosäure-Rest ist,

(b) des C-terminalen Amides davon, oder

(c) eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes dieses Peptides oder Amides,

zur Herstellung eines Medikamentes zur Verwendung bei der Schmerzprophylaxe oder -behandlung, mit der Maßgabe, daß der zwischen X und Y liegende Prolin-Rest D-Pro ist, wenn X Lys oder Arg ist,

2. Verwendung nach Anspruch 1, worin der zwischen X und Y liegende prolin-Rest in Formel (I) D-Pro ist, wenn X D-Lys oder D-Arg ist.

3. Verwendung nach Anspruch 1, worin Y ein Threonin- oder Valin-Rest ist.

4. Verwendung nach Anspruch 1, worin das Peptid der Formel (I) Lys-D-Pro-Thr, Lys-D-Pro-Val, D-Lys-Pro-Thr, D-Arg-Pro-Val, Arg- D-Pro-Val, D-Arg-D-Pro-Val, D-Arg-Pro-Thr, Arg-D-Pro-Thr oder D- Arg-D-Pro-Thr ist.

5. Verwendung nach Anspruch 1, worin das Peptid der Formel (I) Lys-D-Pro-Asn, Lys-D-Pro oder Arg-D-Pro ist.

6. Verwendung eines Peptides der Formel (II):

oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon, zur Herstellung eines Medikamentes zur Schmerzbehandlung.

7. Ein wie in Anspruch 1, 2 oder 3 definiertes Peptid der Formel (I), C-terminales Amid davon oder pharmazeutisch annehmbare Salz, mit der weiteren Maßgabe, daß das Peptid der Formel (I) nicht Arg-D-Pro-Pro, Arg-D-Pro-Lys, D-Lys-D-Pro-D-Arg, D- Lys-Pro, Arg-D,L-Pro, Lys-D-Pro-Val, D-Lys-Pro-Val oder D-Lys-D- Pro-D-Val ist.

8. Ein Peptid, ein C-terminales Amid davon oder ein Salz nach Anspruch 7, worin das Peptid der Formel (I) Lys-D-Pro-Thr, D- Lys-Pro-Thr, D-Arg-Pro-Val, Arg-D-Pro-Val, D-Arg-D-Pro-Val, D- Arg-Pro-Thr, Arg-D-Pro-Thr oder D-Arg-D-Pro-Thr ist.

9. Ein Peptid, ein C-terminales Amid davon oder ein Salz nach Anspruch 7, worin das Peptid der Formel (I) Lys-D-Pro-Asn, Lys- D-Pro oder Arg-D-Pro ist.

10. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche ein wie in jedem der Ansprüche 7 bis 9 definiertes Peptid der Formel (I), C-terminales Amid davon oder pharmazeutisch annehmbares Salz und einen pharinazeutisch annehmbaren Träger oder ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel umfaßt.

11. Ein wie in jedem der Ansprüche 7 bis 9 definiertes Peptid der Formel (I), C-terminales Amid davon oder pharmazeutisch annehmbares salz zur Verwendung als ein Analgetikum.

12. Ein Peptid der Formel (II):

oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.

13. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche ein wie in Anspruch 12 definiertes Peptid der Formel (II) oder pharmazeutisch annehmbares Salz und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel um-

14. Ein Peptid der Formel (II) oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz, wie in Anspruch 12 definiert, zur Verwendung als ein Analgetikum.

15. Eine Verbindung, die

(a) ein Peptid der Formel (A):

in der Y³ ein Threonin-, Valin-, Alanin-, Serin-, Leucin-, 150leucin-, Asparaginsäure- oder Asparagin-Rest ist, mit der Maßgabe, daß

(i) der Prolin-Rest D-Pro ist, wenn der Lysin-Rest Lys ist; und

(ii) das Peptid nicht Lys-D-Pro-Val, D-Lys-Pro-Val oder D-Lys-D- Pro-D-Val ist,

(b) ein Peptid der Formel (B)

worin Y³ ein Threonin-, Valin-, Alanin-, Serin-, Leucin-, lsoleucin-, Asparaginsäure- oder Asparagin-Rest ist, mit der Maßgabe, daß der prolin-Rest D-Pro ist, wenn der Arginin-Rest Arg ist,

(c) Lys-D-Pro oder Arg-D-Pro,

(d) ein wie oben unter (a), (b) oder (c) definiertes C-terminales Amid eines Peptides, oder

(e) ein wie oben jeweils unter (a) bis (d) definiertes pharmazeutisch annehmbares Salz eines Peptides oder Amides ist.

16. Einem pharmazeutische Zusammensetzung, welche ein wie in Anspruch 15 definiertes Peptid, C-terminales Amid davon oder pharmazeutisch annehmbares Salz und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel umfaßt.

17. Ein wie in Anspruch 15 definiertes Peptid, ein C-terminales Amid davon oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz zur Verwendung als ein Analgetikum.

18. Ein Verfahren zur Herstellung eines wie in Anspruch 7, 8, 9, 12 oder 15 definierten Peptides, C-terminalen Amides davon oder pharmazeutisch annehmbaren Salzes, welches Verfahren das chemische synthetisieren dieses Peptides, wahlweise als ein C- terminales Amid und, falls erwünscht, das Umwandeln der resultierenden Verbindung in ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon umfaßt.