JP2633369B2 - ペプチド - Google Patents
ペプチドInfo
- Publication number
- JP2633369B2 JP2633369B2 JP1503798A JP50379889A JP2633369B2 JP 2633369 B2 JP2633369 B2 JP 2633369B2 JP 1503798 A JP1503798 A JP 1503798A JP 50379889 A JP50379889 A JP 50379889A JP 2633369 B2 JP2633369 B2 JP 2633369B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- pro
- peptide
- lys
- formula
- thr
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
- C07K5/0815—Tripeptides with the first amino acid being basic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Neurology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、ペプチドとその製造及び使用に係わる。
インターロイキン−１（IL−１）という語は、活性化
したマクロファージ及び他の種類の細胞が産生する２種
の多能性の炎症性タンパク質を指す。２種の遺伝子がIL
−１の２種の形態IL−１α及びIL−１βをコードし、こ
れら２形態のアミノ酸配列は26％しか相同でない。それ
にもかかわらず、IL−１α及びIL−１βは、僅かな例外
を除き同様の生物活性を有すると報告されている。実
際、両分子は同じレセプターにおいて働くように見え
る。両者が造血成長因子として、また幾つかの炎症疾患
の病理学において役割を有することは十分に証明されて
いる。IL−１は抗腫瘍活性も有する。
したマクロファージ及び他の種類の細胞が産生する２種
の多能性の炎症性タンパク質を指す。２種の遺伝子がIL
−１の２種の形態IL−１α及びIL−１βをコードし、こ
れら２形態のアミノ酸配列は26％しか相同でない。それ
にもかかわらず、IL−１α及びIL−１βは、僅かな例外
を除き同様の生物活性を有すると報告されている。実
際、両分子は同じレセプターにおいて働くように見え
る。両者が造血成長因子として、また幾つかの炎症疾患
の病理学において役割を有することは十分に証明されて
いる。IL−１は抗腫瘍活性も有する。
IL−１は人間及び実験動物の痛みレセプターを感作す
るプロスタグランジンを放出するので、IL−１α及びIL
−１βの痛覚過敏化活性についての試験を行なった。IL
−１βがIL−１αの約3000倍の活性を有するきわめて強
力な痛覚過敏化物質であることが判明した。更に、IL−
１β及び他の炎症性物質によって誘発された痛覚過敏に
非常に有効に拮抗する一群のペプチドが発見された。即
ち、それらのペプチドは鎮痛薬として用い得る。
るプロスタグランジンを放出するので、IL−１α及びIL
−１βの痛覚過敏化活性についての試験を行なった。IL
−１βがIL−１αの約3000倍の活性を有するきわめて強
力な痛覚過敏化物質であることが判明した。更に、IL−
１β及び他の炎症性物質によって誘発された痛覚過敏に
非常に有効に拮抗する一群のペプチドが発見された。即
ち、それらのペプチドは鎮痛薬として用い得る。
従って本発明は、（ａ）式（Ｉ） ［式中Ｘは H2N−（CH2）４−CH（NH2）−Ｃ（＝Ｏ）−または H2N−Ｃ（＝NH）−NH−（CH2）３−CH（NH2）−Ｃ（＝
Ｏ）− であり、Ｙは天然に生じるアミノ酸残基である］のペプ
チド、（ｂ）前記ペプチドのＣ末端アミド又は（ｃ）前
記ペプチド又はアミドの医薬に許容可能な塩からなる
が、ＸとＹの間に位置するプロリン残基はＤ−Proであ
る鎮痛薬剤を提供する。
Ｏ）− であり、Ｙは天然に生じるアミノ酸残基である］のペプ
チド、（ｂ）前記ペプチドのＣ末端アミド又は（ｃ）前
記ペプチド又はアミドの医薬に許容可能な塩からなる
が、ＸとＹの間に位置するプロリン残基はＤ−Proであ
る鎮痛薬剤を提供する。
Peptides ５ （1984）815−817に掲載されたD.B.Ri
chards及びJ.M.Liptonの論文には、発熱したウサギにお
けるトリペプチドLys−Pro−Valの解熱効果が開示され
ている。その他の式（Ｉ）ペプチドは、幾つかは公知で
あるが幾つかは新規である。
chards及びJ.M.Liptonの論文には、発熱したウサギにお
けるトリペプチドLys−Pro−Valの解熱効果が開示され
ている。その他の式（Ｉ）ペプチドは、幾つかは公知で
あるが幾つかは新規である。
式（Ｉ）のペプチドのキラルな各アミノ酸残基Ｘ及び
Ｙは、Ｄ型かまたはＬ型の光学異性体として存在し得
る。特に断らなければ記号はキラルアミノ酸のＬ型構造
を表すアミノ酸三文字表記法を用いると、ＸはLys、Ｄ
−Lys、ArgまたはＤ−Argであり得る。実際、式（Ｉ）
のペプチドはラセミ混合物として、または光学的に純粋
な異性体として存在し得る。好ましくは、ＸはLysまた
はＤ−Lysである。
Ｙは、Ｄ型かまたはＬ型の光学異性体として存在し得
る。特に断らなければ記号はキラルアミノ酸のＬ型構造
を表すアミノ酸三文字表記法を用いると、ＸはLys、Ｄ
−Lys、ArgまたはＤ−Argであり得る。実際、式（Ｉ）
のペプチドはラセミ混合物として、または光学的に純粋
な異性体として存在し得る。好ましくは、ＸはLysまた
はＤ−Lysである。
Ｙは天然に生じるアミノ酸残基である。好ましくは、
Ｙは中性のアミノ酸残基である。芳香族アミノ酸残基よ
りも脂肪族アミノ酸残基の方が、また酸性アミノ酸残基
よりも中性アミノ酸残基の方が好ましい。特に、Ｙはト
レオニンまたはバリン残基であり得る。Ｙがトレオニン
残基である場合、式（Ｉ）のペプチドは例えば次の式
（II） のペプチドである。
Ｙは中性のアミノ酸残基である。芳香族アミノ酸残基よ
りも脂肪族アミノ酸残基の方が、また酸性アミノ酸残基
よりも中性アミノ酸残基の方が好ましい。特に、Ｙはト
レオニンまたはバリン残基であり得る。Ｙがトレオニン
残基である場合、式（Ｉ）のペプチドは例えば次の式
（II） のペプチドである。
Ｙはまた、グリシンから派生する残基であってもよ
い。Ｙはアラニンもしくはセリン残基、または好ましく
はロイシンもしくはイソロイシン残基であり得る。Ｙは
酸性アミノ酸残基であることが適当な場合も有る。その
場合、Ｙは一般的には、アスパラギン酸またはアスパラ
ギンの残基である。
い。Ｙはアラニンもしくはセリン残基、または好ましく
はロイシンもしくはイソロイシン残基であり得る。Ｙは
酸性アミノ酸残基であることが適当な場合も有る。その
場合、Ｙは一般的には、アスパラギン酸またはアスパラ
ギンの残基である。
特に好ましい式（Ｉ）のペプチドは、Lys−Ｄ−Pro−
Thr及びLys−Ｄ−Pro−Valである。Arg−Ｄ−Pro−Va
l、Ｄ−Arg−Ｄ−Pro−Val、Arg−Ｄ−Pro−Thr及びＤ
−Arg−Ｄ−Pro−Thrも好ましい。
Thr及びLys−Ｄ−Pro−Valである。Arg−Ｄ−Pro−Va
l、Ｄ−Arg−Ｄ−Pro−Val、Arg−Ｄ−Pro−Thr及びＤ
−Arg−Ｄ−Pro−Thrも好ましい。
式（Ｉ）のペプチドは、化学的合成によって製造する
ことができる。構成アミノ酸を式（Ｉ）中に出来する順
序で縮合させるとによってペプチドを製造する。ペプチ
ド、そのＣ末端に遊離カルボキシルまたはアミド（−CO
NH2）基を有するものを得ることができる。固相法また
は溶液法を用い得る。所望であれば、得られたペプチド
を医薬に許容可能なその塩に変換してもよい。
ことができる。構成アミノ酸を式（Ｉ）中に出来する順
序で縮合させるとによってペプチドを製造する。ペプチ
ド、そのＣ末端に遊離カルボキシルまたはアミド（−CO
NH2）基を有するものを得ることができる。固相法また
は溶液法を用い得る。所望であれば、得られたペプチド
を医薬に許容可能なその塩に変換してもよい。
固相合成では、式（Ｉ）のアミノ酸配列を、不溶性樹
脂に結合したＣ末端アミノ酸から連続的に成長させる。
所望のペプチドが完成したら樹脂から開裂させる。液相
合成を用いる場合も、ペプチドはＣ末端アミノ酸から成
長させ得る。Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル基は、合成
終了時に除去する適当な保護基で完全にブロックしたま
まとする。
脂に結合したＣ末端アミノ酸から連続的に成長させる。
所望のペプチドが完成したら樹脂から開裂させる。液相
合成を用いる場合も、ペプチドはＣ末端アミノ酸から成
長させ得る。Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル基は、合成
終了時に除去する適当な保護基で完全にブロックしたま
まとする。
固相法または液相法いずれの技術を用いる場合も一般
に、反応系に添加する各アミノ酸のアミノ基は保護し、
カルボキシル基は活性化する。アミノ基は、フルオレン
−９−イルメトキシカルボニル（Fmoc）またはｔ−ブト
キシカルボニル（Boc）基で保護し得る。カルボキシル
基は、ペンタフルオロフェニルまたは１−オキソ−２−
ヒドロキシ−ジヒドロベンゾトリアジンエステルとして
活性化できる。各縮合段階はジシクロヘキシルカルボジ
イミドまたは１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの存在
下に実現し得る。リシンの側鎖アミノ基及びトレオニン
の側鎖ヒドロキシル基は、それのブチルエーテル（セリ
ン及びトレオニンの場合）、ブチルエステル（アスパラ
ギン酸の場合）、ブチルオキシカルボニル誘導体（リシ
ン）、及び4,4′−ジメトキシベンズヒドリル基（アス
パラギン）として保護し得る。合成の各段階後に、α−
アキノ保護基を除去する。側鎖保護基はいずれも通常、
合成終了時に除去する。
に、反応系に添加する各アミノ酸のアミノ基は保護し、
カルボキシル基は活性化する。アミノ基は、フルオレン
−９−イルメトキシカルボニル（Fmoc）またはｔ−ブト
キシカルボニル（Boc）基で保護し得る。カルボキシル
基は、ペンタフルオロフェニルまたは１−オキソ−２−
ヒドロキシ−ジヒドロベンゾトリアジンエステルとして
活性化できる。各縮合段階はジシクロヘキシルカルボジ
イミドまたは１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの存在
下に実現し得る。リシンの側鎖アミノ基及びトレオニン
の側鎖ヒドロキシル基は、それのブチルエーテル（セリ
ン及びトレオニンの場合）、ブチルエステル（アスパラ
ギン酸の場合）、ブチルオキシカルボニル誘導体（リシ
ン）、及び4,4′−ジメトキシベンズヒドリル基（アス
パラギン）として保護し得る。合成の各段階後に、α−
アキノ保護基を除去する。側鎖保護基はいずれも通常、
合成終了時に除去する。
ペプチドは、Ｃ末端カルボキシル基かまたはＣ末端ア
ミド基を用いて製造し得る。固相ペプチド合成ではこの
選択は、Ｃ末端アミノ酸と樹脂支持体との結合、及び／
または最終ペプチドの樹脂支持体からの開裂をどのよう
に実現するかによって決定する。一般的には、樹脂はス
チレン及び／またはジビニルベンゼンポリマーである。
Ｃ末端アミノ酸と樹脂とはエステル結合を介して結合し
得、このエステル結合はトリフルオロ酢酸中のHBr、ま
たはHFのような強酸によって開裂して、Ｃ末端カルボキ
シル基を有するペプチドをもたらし得る。アンモノリシ
スを行なえば、替わりに対応するアミドを得ることがで
きる。
ミド基を用いて製造し得る。固相ペプチド合成ではこの
選択は、Ｃ末端アミノ酸と樹脂支持体との結合、及び／
または最終ペプチドの樹脂支持体からの開裂をどのよう
に実現するかによって決定する。一般的には、樹脂はス
チレン及び／またはジビニルベンゼンポリマーである。
Ｃ末端アミノ酸と樹脂とはエステル結合を介して結合し
得、このエステル結合はトリフルオロ酢酸中のHBr、ま
たはHFのような強酸によって開裂して、Ｃ末端カルボキ
シル基を有するペプチドをもたらし得る。アンモノリシ
スを行なえば、替わりに対応するアミドを得ることがで
きる。
固相合成によってペプチドアミドを得る別の方法で
は、ペプチドのＣ末端アミノ酸と樹脂とをペプチドアミ
ノベンズヒドリル結合を介して結合する。この結合はジ
シクロヘキシルカルボジイミドとの結合によって実現で
き、かつ一般的には冷気中でHFで開列させ得る。液相合
成の場合は、Ｃ末端カルボキシル基とＣ末端アミド基と
のいずれが存在するかは、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシ
ル基のブロック及び合成終了時のブロック解消をどのよ
うに行なうかに従属し得る。Ｃ末端カルボキシル基を有
するペプチドとＣ末端アミド基を有するペプチドとは相
互に変換可能である。
は、ペプチドのＣ末端アミノ酸と樹脂とをペプチドアミ
ノベンズヒドリル結合を介して結合する。この結合はジ
シクロヘキシルカルボジイミドとの結合によって実現で
き、かつ一般的には冷気中でHFで開列させ得る。液相合
成の場合は、Ｃ末端カルボキシル基とＣ末端アミド基と
のいずれが存在するかは、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシ
ル基のブロック及び合成終了時のブロック解消をどのよ
うに行なうかに従属し得る。Ｃ末端カルボキシル基を有
するペプチドとＣ末端アミド基を有するペプチドとは相
互に変換可能である。
得られたペプチドを医薬に許容可能な塩に変換するこ
とができる。有機または無機酸での酸添加塩への変換が
可能である。適当な酸には酢酸、琥珀酸及び塩酸が含ま
れる。あるいは他の場合には、ペプチドをアンモニウム
塩のようなカルボン酸塩、またはナトリウムもしくはカ
リウム塩のようなアルカリ金属塩に変換することも可能
である。
とができる。有機または無機酸での酸添加塩への変換が
可能である。適当な酸には酢酸、琥珀酸及び塩酸が含ま
れる。あるいは他の場合には、ペプチドをアンモニウム
塩のようなカルボン酸塩、またはナトリウムもしくはカ
リウム塩のようなアルカリ金属塩に変換することも可能
である。
式（Ｉ）のペプチドとそのアミド及び塩は鎮痛薬であ
る。即ち、式（Ｉ）のペプチドまたは該ペプチドのＣ末
端アミドもしくは医薬に許容可能な塩を有効量投与する
ことによってヒトまたは動物の痛みを治療または予防す
ることができる。即ち、痛みの軽減が可能となる。
る。即ち、式（Ｉ）のペプチドまたは該ペプチドのＣ末
端アミドもしくは医薬に許容可能な塩を有効量投与する
ことによってヒトまたは動物の痛みを治療または予防す
ることができる。即ち、痛みの軽減が可能となる。
トリペプチドLys−Pro−ThrはIL−１βの配列の一部
を成す。このトリペプチドも該トリペプチドのＤ−Pro
ラセメートも、IL−１βによって惹起される痛覚過敏に
拮抗する。しかし、総てのＬ型化合物は或る一定の濃度
で作用薬として働くことも判明しており、ラットにラッ
ト150g当たり50μｇ以上の用量で投与すれば痛覚過敏が
起こる。Ｄ−Pro化合物は、上記の作用薬活性を呈しな
かったのでいずれのＬ型化合物よりも、たとえその鎮痛
薬活性が当該Ｌ型化合物に劣るとしても好ましい。Lys
−Pro−Thr及びLys−Ｄ−Pro−ThrのラットでのED50値
を、ラット150g当たり約25及び85μｇとそれぞれ算出し
た。更に、トリペプチドLys−Pro−Val及びLys−Ｄ−Pr
o−ValはIL−１βによって惹起される痛覚過敏への、Ly
s−Ｄ−Pro−Thrより強力な拮抗薬であることが判明し
た。
を成す。このトリペプチドも該トリペプチドのＤ−Pro
ラセメートも、IL−１βによって惹起される痛覚過敏に
拮抗する。しかし、総てのＬ型化合物は或る一定の濃度
で作用薬として働くことも判明しており、ラットにラッ
ト150g当たり50μｇ以上の用量で投与すれば痛覚過敏が
起こる。Ｄ−Pro化合物は、上記の作用薬活性を呈しな
かったのでいずれのＬ型化合物よりも、たとえその鎮痛
薬活性が当該Ｌ型化合物に劣るとしても好ましい。Lys
−Pro−Thr及びLys−Ｄ−Pro−ThrのラットでのED50値
を、ラット150g当たり約25及び85μｇとそれぞれ算出し
た。更に、トリペプチドLys−Pro−Val及びLys−Ｄ−Pr
o−ValはIL−１βによって惹起される痛覚過敏への、Ly
s−Ｄ−Pro−Thrより強力な拮抗薬であることが判明し
た。
Ｃ末端バリン残基を有するトリペプチドの拮抗薬活性
がＣ末端トレオニン残基を有するトリペプチドに比較し
てより強力であることは、PGE2によって惹起される痛覚
過敏にLys−Pro−ValとLys−Ｄ−Pro−Valとの両方が拮
抗するとからも明らかである。この活性は、Lys−Pro−
Thr及びLys−Ｄ−Pro−Thrは呈しない。実際のところLy
s−Pro−ValとそのＤ−ProラセメートはPGE2によって惹
起される痛覚過敏に、IL−１βによって惹起される痛覚
過敏に拮抗する際の投与レベルより高い投与レベルで拮
抗する。PGE2によって惹起される痛覚過敏に拮抗するLy
s−Pro−Val及びLys−Ｄ−Pro−ValのラットでのED50値
は、それぞれ約170μg/ラット150g及び140μg/ラット15
0gである。IL−１βによって惹起される痛覚過敏に拮抗
する場合のED50値はそれぞれ70μg/ラット150g及び40μ
g/ラット150gである。
がＣ末端トレオニン残基を有するトリペプチドに比較し
てより強力であることは、PGE2によって惹起される痛覚
過敏にLys−Pro−ValとLys−Ｄ−Pro−Valとの両方が拮
抗するとからも明らかである。この活性は、Lys−Pro−
Thr及びLys−Ｄ−Pro−Thrは呈しない。実際のところLy
s−Pro−ValとそのＤ−ProラセメートはPGE2によって惹
起される痛覚過敏に、IL−１βによって惹起される痛覚
過敏に拮抗する際の投与レベルより高い投与レベルで拮
抗する。PGE2によって惹起される痛覚過敏に拮抗するLy
s−Pro−Val及びLys−Ｄ−Pro−ValのラットでのED50値
は、それぞれ約170μg/ラット150g及び140μg/ラット15
0gである。IL−１βによって惹起される痛覚過敏に拮抗
する場合のED50値はそれぞれ70μg/ラット150g及び40μ
g/ラット150gである。
本発明のトリペプチドはいずれも、ジブチルサイクリ
ックアデニル酸（DbcAMP）によって惹起される痛覚過敏
に対する拮抗薬ではない。そのような効果に一切欠ける
点は、DbcAMPによって惹起される痛覚過敏に対する有効
な拮抗薬であるモルヒネと強い対照を成す。即ちこのこ
とは、式（Ｉ）のペプチドがその活性においてモルヒネ
様でないことを示す一事実である。
ックアデニル酸（DbcAMP）によって惹起される痛覚過敏
に対する拮抗薬ではない。そのような効果に一切欠ける
点は、DbcAMPによって惹起される痛覚過敏に対する有効
な拮抗薬であるモルヒネと強い対照を成す。即ちこのこ
とは、式（Ｉ）のペプチドがその活性においてモルヒネ
様でないことを示す一事実である。
ペプチドLys−Ｄ−Pro−Thrの利点は、ステロイド系
の鎮痛剤とも非ステロイド系（アスピリン様）の鎮痛剤
とも異なり、上述のように胃の中で保護的役割を有する
プロスタグランジンの産生を阻害しないことである。ス
テロイド系及び非ステロイド系（アスピリン様）薬剤は
胃を損傷し、このことはそれらの薬剤の、特にIL−１β
が部分的に関与し得る慢性関節リチウムの症状の治療に
おける有用性を制限する。即ち、この胃損傷の問題は式
（Ｉ）のペプチドとその塩を用いることによって除去す
ることができる。
の鎮痛剤とも非ステロイド系（アスピリン様）の鎮痛剤
とも異なり、上述のように胃の中で保護的役割を有する
プロスタグランジンの産生を阻害しないことである。ス
テロイド系及び非ステロイド系（アスピリン様）薬剤は
胃を損傷し、このことはそれらの薬剤の、特にIL−１β
が部分的に関与し得る慢性関節リチウムの症状の治療に
おける有用性を制限する。即ち、この胃損傷の問題は式
（Ｉ）のペプチドとその塩を用いることによって除去す
ることができる。
式（Ｉ）のペプチドとそのＣ末端アミド及び塩は経口
で投与しても、非経口で、即ち例えば皮下、静脈内、筋
内、腹腔内、鼻腔内に投与してもよく、あるいはまた頬
側投与も可能である。一般に、化合物はヒトまたは動物
に、経口または非経口投与１回につき0.2〜2mg/kgの量
で投与する。
で投与しても、非経口で、即ち例えば皮下、静脈内、筋
内、腹腔内、鼻腔内に投与してもよく、あるいはまた頬
側投与も可能である。一般に、化合物はヒトまたは動物
に、経口または非経口投与１回につき0.2〜2mg/kgの量
で投与する。
使用のために普通、式（Ｉ）のペプチドまたはそのＣ
末端アミドもしくは塩を医薬に許容可能なキャリヤまた
は稀釈剤と調合する。通常の調合法、キャリヤ、アジュ
バント及び稀釈剤を用い得る。これらの選択は普通、投
与経路に基づいて決定する。
末端アミドもしくは塩を医薬に許容可能なキャリヤまた
は稀釈剤と調合する。通常の調合法、キャリヤ、アジュ
バント及び稀釈剤を用い得る。これらの選択は普通、投
与経路に基づいて決定する。
本発明を、以下の実施例１〜15によって説明する。IL
−１βが強力な痛覚過敏化物質であることを示す参考例
も提示する。
−１βが強力な痛覚過敏化物質であることを示す参考例
も提示する。
参考例1:Lys−Pro−Thrの製造 固相ペプチド合成のFmocポリアミド法を用いてトリペ
プチドLys−Pro−Thrを合成した（Dryland and Sheppar
d,Pep−tide Synthesis ８“A system for solid phase
synthesis under low pressure continuous flow cond
itions"J.Chem.Soc.Perkin.Trans.１,125,1986）。固相
支持体は３種のモノマー、即ちジメチルアクリルアミド
（主鎖モノマー）、ビス−アクリロイル−エチレンジア
ミン（架橋剤）及びアクリロイルサルコサミンメチルエ
ステル（官能化剤）から成るポリジメチルアクリルアミ
ドポリマーであった。ペプチドを樹脂に開裂可能に結合
させるのに用いた物質は、不安定な酸である４−ヒドロ
キシメチル−フェノキシ酢酸の誘導体であった。
プチドLys−Pro−Thrを合成した（Dryland and Sheppar
d,Pep−tide Synthesis ８“A system for solid phase
synthesis under low pressure continuous flow cond
itions"J.Chem.Soc.Perkin.Trans.１,125,1986）。固相
支持体は３種のモノマー、即ちジメチルアクリルアミド
（主鎖モノマー）、ビス−アクリロイル−エチレンジア
ミン（架橋剤）及びアクリロイルサルコサミンメチルエ
ステル（官能化剤）から成るポリジメチルアクリルアミ
ドポリマーであった。ペプチドを樹脂に開裂可能に結合
させるのに用いた物質は、不安定な酸である４−ヒドロ
キシメチル−フェノキシ酢酸の誘導体であった。
総てのアミノ酸誘導体を、予め生成した対称無水物誘
導体として添加した。一時的なＮα−アミノ基保護をFm
oc基で実現した。この基は、N,N−ジメチルホルムアミ
ド中の20％ピペリジンを用いて繰り返し開裂させた。側
鎖官能基はブチルエステル（トレオニン）及びブチルオ
キシカルボニル誘導体（リシン）として保護した。
導体として添加した。一時的なＮα−アミノ基保護をFm
oc基で実現した。この基は、N,N−ジメチルホルムアミ
ド中の20％ピペリジンを用いて繰り返し開裂させた。側
鎖官能基はブチルエステル（トレオニン）及びブチルオ
キシカルボニル誘導体（リシン）として保護した。
合成完了後、得られたペプチドを、５％の捕捉剤混合
物を含有する95％トリフルオロ酢酸（TFA）で樹脂支持
体から開裂させた。ペプチドをHPLCで精製した。純度
を、アミノ酸分析及び高速原子衝撃質量分析（FAB−M
S）によって確定した。
物を含有する95％トリフルオロ酢酸（TFA）で樹脂支持
体から開裂させた。ペプチドをHPLCで精製した。純度
を、アミノ酸分析及び高速原子衝撃質量分析（FAB−M
S）によって確定した。
アミノ酸分析：計算値 実測値 １ 1.00 Lys １ 0.95 Pro １ 0.98 Thr FAB−MS:正イオンスペクトルはm/z 345でＭ＋H+であっ
た［分子量は344.415（344）］。
た［分子量は344.415（344）］。
純度は＞80％であった。＞95％への精製を逆相HPLC
で、Hypersil（商標）WP 300ブチルカラム（150×4.6m
m）を用いて行なった。緩衝液はＡ＝0.25％TFAと、Ｂ＝
CH3CN中の0.25％TFAとであった。検出は225nmのUVで行
ない、予備負荷は0.5mgであった。
で、Hypersil（商標）WP 300ブチルカラム（150×4.6m
m）を用いて行なった。緩衝液はＡ＝0.25％TFAと、Ｂ＝
CH3CN中の0.25％TFAとであった。検出は225nmのUVで行
ない、予備負荷は0.5mgであった。
実施例1:Lys−Ｄ−Pro−Thrの製造（１） トリペプチドLys−Ｄ−Pro−Thrを、参考例１に述べ
た手順で合成及び精製した。純度を、アミノ酸分析、FA
B−MS及びHPLCで確定した。
た手順で合成及び精製した。純度を、アミノ酸分析、FA
B−MS及びHPLCで確定した。
アミノ酸分析：計算値 実測値 １ 1.03 Lys １ 1.05 Pro １ 0.91 Thr FAB−MS:正イオンスペクトルはm/z 345でＭ＋H+であっ
た［分子量は344.415（344）］。
た［分子量は344.415（344）］。
HPLC: カラム：μBondapak C18 3.8mm×30cm 溶剤:20分にわたり５〜95％ Bで線形勾配;A＝0.1％ TFA/H2O及びＢ＝0.1％TFA/CH3CN;流量1.5cm3・min-1 検出:230nmのUV 純度は＞80％であった。この純度を、参考例１に述べ
たようにして＞95％に高めた。
たようにして＞95％に高めた。
実施例2:Lys−Ｄ−Pro−Thrの製造（２） トリペプチドLys−Ｄ−Pro−Thrを、Bocアミノ保護基
を用いる固相合成によっても製造した。開始樹脂はBoc
−Thr−［ベンジル（Bzl）］−Ｏ樹脂であった。20％ T
FA/DCM（DCM＝ジクロロメタン）での保護解消と、続く1
0％トリエチルアミンでの中和とにおいてBoc−Ｄ−Pro
を、DCC（DCC＝ジシクロヘキシルウレア）/DCMを用いて
結合した。結合の成功をKaiser試験で確認した。Boc−
Ｄ−Pro残基の保護解消及び中和に続いて、最終残基をB
oc−Lys−［ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）］誘導体
として結合し、ペプチド樹脂を得た。
を用いる固相合成によっても製造した。開始樹脂はBoc
−Thr−［ベンジル（Bzl）］−Ｏ樹脂であった。20％ T
FA/DCM（DCM＝ジクロロメタン）での保護解消と、続く1
0％トリエチルアミンでの中和とにおいてBoc−Ｄ−Pro
を、DCC（DCC＝ジシクロヘキシルウレア）/DCMを用いて
結合した。結合の成功をKaiser試験で確認した。Boc−
Ｄ−Pro残基の保護解消及び中和に続いて、最終残基をB
oc−Lys−［ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）］誘導体
として結合し、ペプチド樹脂を得た。
ペプチド樹脂を０℃で45分間HF開裂させて、粗ペプチ
ドを得た。開裂時にはアニソールを捕捉剤として用い
た。粗ペプチドを“Kieselgel 60"シリカ上で、90:90:1
8:72のブタノール：ピリジン：酢酸、H2O（B:P:A:W）の
可動相を用いて精製した。溶剤をin vacuoで除去した
後、試料を凍結乾燥して水分を除去し、純粋なペプチド
を得た。
ドを得た。開裂時にはアニソールを捕捉剤として用い
た。粗ペプチドを“Kieselgel 60"シリカ上で、90:90:1
8:72のブタノール：ピリジン：酢酸、H2O（B:P:A:W）の
可動相を用いて精製した。溶剤をin vacuoで除去した
後、試料を凍結乾燥して水分を除去し、純粋なペプチド
を得た。
アミノ酸分析：計算値 実測値 １ 1.04 Lys １ 0.95 Pro １ 0.89 Thr 薄層クロマトグラフィー： 1.60:20:6:24のB:P:A:Wでは、単一スポット、ニンヒド
リン陽性、Rf0.21であった。
リン陽性、Rf0.21であった。
2.3:1:1のB:A:Wでは、単一スポット、ニンヒドリン陽
性、Rf0.24であった。
性、Rf0.24であった。
HPLC:得られた記録を第１図に示す。図中、記号Ｉは溶
剤フロントを示す。
剤フロントを示す。
HPLCモード:Gilson カラム:Vydac C.18 溶剤:A＝0.05M NaH2PO4及びＢ＝Ａ中の60％CH3CN 勾配:40分で０〜100％ Bで線形 レコーダー:2mm/min. 検出器:210mm AUFS 参考例2:Lys−Pro−Valの製造 トリペプチドLys−Pro−Val（KPV）を、参考例１に述
べた手順で合成及び精製した。純度をアミノ酸分析及び
HPLCで確定した。
べた手順で合成及び精製した。純度をアミノ酸分析及び
HPLCで確定した。
アミノ酸分析： Lys Pro Val 計算値 1.00 1.00 1.00 実測値 0.87 1.15 0.98 HPLC:精製トリペプチドのHPLC記録を第２図に示す。
カラム:Vydac C18 4.6mm×25cm 溶剤:30分にわたり０〜30％ Bで線形勾配 流量:1.5cm3・min-1 Ａ＝0.1％TFA/H2O Ｂ＝0.1％TFA/CH3CN 検出:230nmのUV 実施例3:Lys−Ｄ−Pro−Valの製造 このトリペプチドは、参考例２に述べたようにして合
成及び精製した。分析結果は次のとおりである。
成及び精製した。分析結果は次のとおりである。
アミノ酸分析： Lys Pro Val 計算値 1.00 1.00 1.00 実測値 1.25 1.00 0.75 HPLC:精製トリペプチドのHPLC記録を第３図に示す。
カラム:Vydac C18 4.6mm×25cm 溶剤:30分にわたり０〜30％ Bで線形勾配 流量:1.5cm3・min-1 Ａ＝0.1％TFA/H2O Ｂ＝0.1％TFA/CH3CN 検出:230nmのUV 参考例3:IL−１βの痛覚過敏化活性 IL−１βの痛覚過敏化活性を、改良したRandall−Sel
litoラット足加圧試験で調べた（Ferreira et al,Eur.
J.Phamacol.53,39−48,1978）。IL−１β（及び実施例
５で用いたIL−１α）はGenzyme Ltdから購入したヒト
組み換え体タンパク質で、暫定基準試薬に対して校正し
たものであった。（これらはNational Institute for B
iological Standardsand Control,Potters Bar,GBから
提示された一時的な生物学的基準であり、IL−１αでは
１単位＝10pg、IL−１βでも１単位＝10pgである。） IL−１βをラットの１本の足に注射した後の両側痛覚
過敏（侵害受容）の進展と、インドメタシン（INDO）で
の前処理によるその弱化とを調べた。IL−１βは、足底
内（ipl、注射量0.1ml）にかまたは腹腔内（ip、注射量
0.3ml）に投与した。インドメタシンは、0.1ml中に100
μｇの量でipl投与した。
litoラット足加圧試験で調べた（Ferreira et al,Eur.
J.Phamacol.53,39−48,1978）。IL−１β（及び実施例
５で用いたIL−１α）はGenzyme Ltdから購入したヒト
組み換え体タンパク質で、暫定基準試薬に対して校正し
たものであった。（これらはNational Institute for B
iological Standardsand Control,Potters Bar,GBから
提示された一時的な生物学的基準であり、IL−１αでは
１単位＝10pg、IL−１βでも１単位＝10pgである。） IL−１βをラットの１本の足に注射した後の両側痛覚
過敏（侵害受容）の進展と、インドメタシン（INDO）で
の前処理によるその弱化とを調べた。IL−１βは、足底
内（ipl、注射量0.1ml）にかまたは腹腔内（ip、注射量
0.3ml）に投与した。インドメタシンは、0.1ml中に100
μｇの量でipl投与した。
ラット（Wistar系、雄、体重135〜170g）の後足に20m
mHgの一定圧力を付与し、動物が特徴的な震撼反応を呈
したら圧力付与を中断することによって痛覚過敏を評価
した（反応時間）。痛覚過敏の強度を、痛覚過敏化物質
投与の１、２、３または４時間後に測定した値を注射前
の対照反応時間（ゼロ時間）から減算することによって
得られる反応時間の変分（Δ反応時間、秒）として求め
た。実験者はグループ処理を知らなかった。
mHgの一定圧力を付与し、動物が特徴的な震撼反応を呈
したら圧力付与を中断することによって痛覚過敏を評価
した（反応時間）。痛覚過敏の強度を、痛覚過敏化物質
投与の１、２、３または４時間後に測定した値を注射前
の対照反応時間（ゼロ時間）から減算することによって
得られる反応時間の変分（Δ反応時間、秒）として求め
た。実験者はグループ処理を知らなかった。
結果を第４図に示す。パネルＡの場合、IL−１βはip
l投与した。IL−１βの、注射した足での痛覚過敏化作
用（塗り潰したマーク及び実線）及び対側足での痛覚過
敏化作用（白抜きマーク及び点線）を決定した。
l投与した。IL−１βの、注射した足での痛覚過敏化作
用（塗り潰したマーク及び実線）及び対側足での痛覚過
敏化作用（白抜きマーク及び点線）を決定した。
パネルＢ及びＣでは結果を、侵害受容刺激後０、１、
２、３及び４時間の間隔で行なった痛覚過敏測定によっ
て得られたデータから算出して任意単位で表した“曲線
下面積”として示す（Ferreira et al,1978）。頂部の
横線は、ラット５匹のグループで得た値の平均値の標準
誤差（s.e.m.）である。
２、３及び４時間の間隔で行なった痛覚過敏測定によっ
て得られたデータから算出して任意単位で表した“曲線
下面積”として示す（Ferreira et al,1978）。頂部の
横線は、ラット５匹のグループで得た値の平均値の標準
誤差（s.e.m.）である。
パネルＢ及びＣは、ipl及びip投与した0.05UのIL−１
βそれぞれの痛覚過敏化作用と、30分前にインドメタシ
ンで行なった前処理の効果とを示す。前処理は、処理し
た足（Ｉ）でのみ痛覚過敏応答を著しく弱化させた。対
側足（CL）では効果が認められず、このことは、IL−１
βが侵害受容器近傍でプロスタグランジン様物質を放出
することにより痛覚過敏を惹起することを示唆してい
る。
βそれぞれの痛覚過敏化作用と、30分前にインドメタシ
ンで行なった前処理の効果とを示す。前処理は、処理し
た足（Ｉ）でのみ痛覚過敏応答を著しく弱化させた。対
側足（CL）では効果が認められず、このことは、IL−１
βが侵害受容器近傍でプロスタグランジン様物質を放出
することにより痛覚過敏を惹起することを示唆してい
る。
実施例4:IL−１βによって惹起される痛覚過敏に対する
ペプチドの効果 ３種のトリペプチドの、IL−１βによって幾グループ
かのラットに惹起される痛覚過敏に対する効果を調べ
た。３種のトリペプチドはLys−Ｄ−Pro−Thr［Ｋ
（Ｄ）PT］と、本発明の範囲外であるLys−Pro−Thr（K
PT）とLys−Asp−Asp（KDD）とであった。結果を第５図
に示す。
ペプチドの効果 ３種のトリペプチドの、IL−１βによって幾グループ
かのラットに惹起される痛覚過敏に対する効果を調べ
た。３種のトリペプチドはLys−Ｄ−Pro−Thr［Ｋ
（Ｄ）PT］と、本発明の範囲外であるLys−Pro−Thr（K
PT）とLys−Asp−Asp（KDD）とであった。結果を第５図
に示す。
第５図のパネルＡは、総て皮下（sc）投与したKPT、
Ｋ（Ｄ）PT及びKDDでの前処理が30分後に行なったIL−
１βのip注射への痛覚過敏応答に対して有する効果を示
す。パネルＢは、30分後にip投与したIL−１β（0.05U/
150g）への痛覚過敏応答に対するＫ（Ｄ）PTの、用量に
従属する拮抗を示す。グラフの各マークまたはヒストグ
ラムは１処理グループ当たり５匹の動物の平均応答を表
す。頂部の横線はs.e.m.である。
Ｋ（Ｄ）PT及びKDDでの前処理が30分後に行なったIL−
１βのip注射への痛覚過敏応答に対して有する効果を示
す。パネルＢは、30分後にip投与したIL−１β（0.05U/
150g）への痛覚過敏応答に対するＫ（Ｄ）PTの、用量に
従属する拮抗を示す。グラフの各マークまたはヒストグ
ラムは１処理グループ当たり５匹の動物の平均応答を表
す。頂部の横線はs.e.m.である。
実施例5:IL−１α及びIL−１βによって惹起される痛覚
過敏に対するペプチドＫ（Ｄ）PTの効果 IL−１α及びIL−１βへの痛覚過敏応答をラットにお
いて評価した。上記応答に対するＫ（Ｄ）PTの効果を決
定した。結果を第６図に示す。データは、１処理グルー
プ当たり５低の動物の平均値±s.e.m.である。Ｋ（Ｄ）
PT（200μg/ラット重量150g）を、IL−１のip注射の30
分前にsc投与した。
過敏に対するペプチドＫ（Ｄ）PTの効果 IL−１α及びIL−１βへの痛覚過敏応答をラットにお
いて評価した。上記応答に対するＫ（Ｄ）PTの効果を決
定した。結果を第６図に示す。データは、１処理グルー
プ当たり５低の動物の平均値±s.e.m.である。Ｋ（Ｄ）
PT（200μg/ラット重量150g）を、IL−１のip注射の30
分前にsc投与した。
第６図は、IL−１βの両側痛覚過敏化作用の抑制がIL
−１βの用量を増大することによって克服され得ること
を示し、このことは競合的拮抗作用と矛盾しない。第６
図からは、IL−１βが痛覚過敏化物質としてIL−１αの
約3000倍強力であったこと、及び配列Lys−Pro−Thrを
欠くIL−１αにＫ（Ｄ）PTが微弱にしか拮抗しなかった
ことも知見される。
−１βの用量を増大することによって克服され得ること
を示し、このことは競合的拮抗作用と矛盾しない。第６
図からは、IL−１βが痛覚過敏化物質としてIL−１αの
約3000倍強力であったこと、及び配列Lys−Pro−Thrを
欠くIL−１αにＫ（Ｄ）PTが微弱にしか拮抗しなかった
ことも知見される。
実施例6:PGE2、カラゲナン及びIL−１βによって惹起さ
れる痛覚過敏に対するペプチドＫ（Ｄ）PTの効果 PGE2、カラゲナン及びIL−１βによって惹起される痛
覚過敏に対するＫ（Ｄ）PTの効果をラットで評価した。
結果を第７図に示す。この図のパネルは、A;PGE2（100n
g/足）、B:カラゲナン（100μg/足）及びC:IL−１β
（0.05U/足）への痛覚過敏応答の経時進展を示す。Ｋ
（Ｄ）PT（200μg/150g）を、ipl注射30分前にip注射し
た。各マークは１処理グループ当たり５匹の動物の平均
応答を表す。頂部の横線はs.e.m.である。
れる痛覚過敏に対するペプチドＫ（Ｄ）PTの効果 PGE2、カラゲナン及びIL−１βによって惹起される痛
覚過敏に対するＫ（Ｄ）PTの効果をラットで評価した。
結果を第７図に示す。この図のパネルは、A;PGE2（100n
g/足）、B:カラゲナン（100μg/足）及びC:IL−１β
（0.05U/足）への痛覚過敏応答の経時進展を示す。Ｋ
（Ｄ）PT（200μg/150g）を、ipl注射30分前にip注射し
た。各マークは１処理グループ当たり５匹の動物の平均
応答を表す。頂部の横線はs.e.m.である。
カラゲナン注射後に発生した水腫を、原因物質投与４
時間後にプレチスモグラフィーで測定した（Ferreira,
J.Pharm.Pharmacol.,31,648,1979）。水腫は、Ｋ（Ｄ）
PTでの前処理によって減少しなかった（データ示さ
ず）。IL−１βまたはカラゲナン投与の２時間後に投与
したＫ（Ｄ）PTは惹起された痛覚過敏に対して効果が無
く、一方中枢に作用する鎮痛薬、例えばモルヒネ及びピ
ロン並びに末梢性鎮痛薬BW 443Cは、既に生起している
痛覚過敏に拮抗し得る。Ｋ（Ｄ）PTがPGE2によって惹起
される痛覚過敏に対して効果を有しないという発見と併
せ、これらの結果は、Ｋ（Ｄ）PTの鎮痛作用が中枢性で
も非特異的でもないことを示している。
時間後にプレチスモグラフィーで測定した（Ferreira,
J.Pharm.Pharmacol.,31,648,1979）。水腫は、Ｋ（Ｄ）
PTでの前処理によって減少しなかった（データ示さ
ず）。IL−１βまたはカラゲナン投与の２時間後に投与
したＫ（Ｄ）PTは惹起された痛覚過敏に対して効果が無
く、一方中枢に作用する鎮痛薬、例えばモルヒネ及びピ
ロン並びに末梢性鎮痛薬BW 443Cは、既に生起している
痛覚過敏に拮抗し得る。Ｋ（Ｄ）PTがPGE2によって惹起
される痛覚過敏に対して効果を有しないという発見と併
せ、これらの結果は、Ｋ（Ｄ）PTの鎮痛作用が中枢性で
も非特異的でもないことを示している。
実施例7:酢酸及びIloprostによって惹起される痛覚過敏
に対するペプチドＫ（Ｄ）PTの効果 酢酸及びIloprostによってマウス５匹のグループに惹
起される痛覚過敏に対するＫ（Ｄ）PTの効果を決定し
た。Ilo−prostはプロスタシクリンの安定な類似体で、
式 を有する。
に対するペプチドＫ（Ｄ）PTの効果 酢酸及びIloprostによってマウス５匹のグループに惹
起される痛覚過敏に対するＫ（Ｄ）PTの効果を決定し
た。Ilo−prostはプロスタシクリンの安定な類似体で、
式 を有する。
Ｋ（Ｄ）PTを、捻転（身悶え）をもたらす0.6％酢酸
またはIloprost（10μg/kg）のip注射の前にsc投与し
た。Ｋ（Ｄ）PTで前処理を行なった後の上記応答の抑制
パーセンテージを表１に示す。
またはIloprost（10μg/kg）のip注射の前にsc投与し
た。Ｋ（Ｄ）PTで前処理を行なった後の上記応答の抑制
パーセンテージを表１に示す。
実施例8:酢酸及びIloprostによって惹起される痛覚過敏
に対するペプチドＫ（Ｄ）PT及びインドメタシンの効果
の比較 実施例７を繰り返し、その際幾つかのグループのマウ
スにはペプチドＫ（Ｄ）PTではなくインドメタシンを様
々な用量で投与した。対照グループのマウスにはインド
メタシンもＫ（Ｄ）PTも投与しなかった。結果を表２に
示す。データは、原因物質のip投与後20分間に測定した
捻転の総回数である。
に対するペプチドＫ（Ｄ）PT及びインドメタシンの効果
の比較 実施例７を繰り返し、その際幾つかのグループのマウ
スにはペプチドＫ（Ｄ）PTではなくインドメタシンを様
々な用量で投与した。対照グループのマウスにはインド
メタシンもＫ（Ｄ）PTも投与しなかった。結果を表２に
示す。データは、原因物質のip投与後20分間に測定した
捻転の総回数である。
即ち、Ｋ（Ｄ）PTは、酢酸及びIloprostのip注射によ
ってマウスに誘発される捻転を減少するのに有効であっ
た。Ｋ（Ｄ）PTの用量8mg/kgは約45％の最大痛覚脱失を
実現し（8mg/kgと32mg/kgとの間に差異無し）、このこ
とはインドメタシンの用量５及び20mg/kgの効果に対応
する。しかし、インドメタシンはマウスの胃を損傷した
が、ペプチドＫ（Ｄ）PTは損傷しなかった。インドメタ
シンの用量20mg/kgでは、100％のマウスで胃の糜爛が起
こった。Ｋ（Ｄ）PTの用量32mg/kgでは損傷を観察しな
かった。
ってマウスに誘発される捻転を減少するのに有効であっ
た。Ｋ（Ｄ）PTの用量8mg/kgは約45％の最大痛覚脱失を
実現し（8mg/kgと32mg/kgとの間に差異無し）、このこ
とはインドメタシンの用量５及び20mg/kgの効果に対応
する。しかし、インドメタシンはマウスの胃を損傷した
が、ペプチドＫ（Ｄ）PTは損傷しなかった。インドメタ
シンの用量20mg/kgでは、100％のマウスで胃の糜爛が起
こった。Ｋ（Ｄ）PTの用量32mg/kgでは損傷を観察しな
かった。
実施例9:K（Ｄ）PTは中枢に作用するモルヒネ様鎮痛薬
ではない 標準的なホットプレート（55℃）試験を実施した。結
果を表３に示す。示した結果は、２種の薬剤の投与の１
時間後に観察した値を処理前の反応時間から減算するこ
とによって得られた反応時間の平均s.e.m.である。表３
はＫ（Ｄ）PTがモルヒネ様でないことを示している。
ではない 標準的なホットプレート（55℃）試験を実施した。結
果を表３に示す。示した結果は、２種の薬剤の投与の１
時間後に観察した値を処理前の反応時間から減算するこ
とによって得られた反応時間の平均s.e.m.である。表３
はＫ（Ｄ）PTがモルヒネ様でないことを示している。
実施例10:K（Ｄ）PTはアスピリン様（即ちシクロオキシ
ゲナーゼの阻害物質）ではない ヒト血液単核細胞（MNC）によるPGE2放出へのＫ
（Ｄ）PT及びインドメタシンの影響を調べた。MNCを、
密度勾配遠心方（Ficoll−hypaque,Sigma）によって被
膜残留物から単離し、RPMI 1640培地（Gibco）＋２％不
活性ウシ胎児血清（ImperialLaboratories）に再懸濁さ
せた。インキュベーション培地に諸物質を、表４に示し
たようにして添加した。Ｋ（Ｄ）PT及びインドメタシン
は、IL−１βまたはエンドトキシン添加の45分間に添加
した。結果を表４に示す。値は、４例それぞれの平均値
±s.e.m.である。PGE2濃度はワジオイムノアッセイ（NE
N Research Products）で測定した。
ゲナーゼの阻害物質）ではない ヒト血液単核細胞（MNC）によるPGE2放出へのＫ
（Ｄ）PT及びインドメタシンの影響を調べた。MNCを、
密度勾配遠心方（Ficoll−hypaque,Sigma）によって被
膜残留物から単離し、RPMI 1640培地（Gibco）＋２％不
活性ウシ胎児血清（ImperialLaboratories）に再懸濁さ
せた。インキュベーション培地に諸物質を、表４に示し
たようにして添加した。Ｋ（Ｄ）PT及びインドメタシン
は、IL−１βまたはエンドトキシン添加の45分間に添加
した。結果を表４に示す。値は、４例それぞれの平均値
±s.e.m.である。PGE2濃度はワジオイムノアッセイ（NE
N Research Products）で測定した。
Ｋ（Ｄ）PTはMNCによるPGE2産生に影響を及ぼさなか
ったが、強力なアスピリン様薬剤であるインドメタシン
は100倍低い用量でMNCによるPGE2産生を阻止した。
ったが、強力なアスピリン様薬剤であるインドメタシン
は100倍低い用量でMNCによるPGE2産生を阻止した。
実施例11:IL−１βによって惹起される痛覚過敏に対す
るペプチドの効果 IL−１βによってラットに惹起される痛覚過敏に対す
るトリペプチドLys−Ｄ−Pro−Val［Ｋ（Ｄ）PT］及びL
ys−Ｄ−Pro−Thr［Ｋ（Ｄ）PT］の効果を調べた。結果
を次の表５に示す。処理物質を、IL−１βをやはりip投
与する１時間前にip投与した。１処理グループ当たり５
匹の動物を用いた。IL−１β投与の３時間後にΔ反応時
間を測定した。対照はip投与したIL−１β（0.05U）で
あった。対照グループに関する結果は、23.9±0.5（＝1
00％）であった。
るペプチドの効果 IL−１βによってラットに惹起される痛覚過敏に対す
るトリペプチドLys−Ｄ−Pro−Val［Ｋ（Ｄ）PT］及びL
ys−Ｄ−Pro−Thr［Ｋ（Ｄ）PT］の効果を調べた。結果
を次の表５に示す。処理物質を、IL−１βをやはりip投
与する１時間前にip投与した。１処理グループ当たり５
匹の動物を用いた。IL−１β投与の３時間後にΔ反応時
間を測定した。対照はip投与したIL−１β（0.05U）で
あった。対照グループに関する結果は、23.9±0.5（＝1
00％）であった。
実施例12:PGE2によって惹起される痛覚過敏に対するペ
プチドの効果 PGE2によってラットに惹起される痛覚過敏に対するト
リペプチドＫ（Ｄ）PTの効果を調べた。結果を下の表６
に示す。処理物質は、PGE2を足に（ipl）注射する１時
間前にip投与した。１処理グループ当たり５匹の動物を
用いた。PGE2投与の３時間後にΔ反応時間を測定した。
モルヒネ（0.6mg/150g）はΔ反応時間を6.1±0.8秒（−
63.7％）に短縮した。対照はPGE2（100mg/足）であっ
た。対照グループに関する結果は、16.8±0.3（＝100
％）であった。NT＝試験せず。
プチドの効果 PGE2によってラットに惹起される痛覚過敏に対するト
リペプチドＫ（Ｄ）PTの効果を調べた。結果を下の表６
に示す。処理物質は、PGE2を足に（ipl）注射する１時
間前にip投与した。１処理グループ当たり５匹の動物を
用いた。PGE2投与の３時間後にΔ反応時間を測定した。
モルヒネ（0.6mg/150g）はΔ反応時間を6.1±0.8秒（−
63.7％）に短縮した。対照はPGE2（100mg/足）であっ
た。対照グループに関する結果は、16.8±0.3（＝100
％）であった。NT＝試験せず。
実施例13:DbcAMP（対照）によって惹起される痛覚過敏
に対するペプチドの効果 DbcAMPによってラットに惹起される痛覚過敏に対する
トリペプチドKPV及びＫ（Ｄ）PVの効果を調べた。結果
を下の表７に示す。処理物質は、DbcAMPを足に（ipl）
注射する１時間前にip投与した。１処理グループ当たり
５匹の動物を用いた。DbcAMP投与の３時間後にΔ反応時
間を測定した。モルヒネ（0.6mg/150g）はΔ反応時間を
6.2±0.4秒（−64.0％）に短縮した。対照はDbcAMP（10
0μg/足）であった。対照グループに関する結果は、17.
2±6.4秒（＝100％）であった。
に対するペプチドの効果 DbcAMPによってラットに惹起される痛覚過敏に対する
トリペプチドKPV及びＫ（Ｄ）PVの効果を調べた。結果
を下の表７に示す。処理物質は、DbcAMPを足に（ipl）
注射する１時間前にip投与した。１処理グループ当たり
５匹の動物を用いた。DbcAMP投与の３時間後にΔ反応時
間を測定した。モルヒネ（0.6mg/150g）はΔ反応時間を
6.2±0.4秒（−64.0％）に短縮した。対照はDbcAMP（10
0μg/足）であった。対照グループに関する結果は、17.
2±6.4秒（＝100％）であった。
実施例14:Lys−Ｄ−Pro−Asnの製造 トリペプチドLys−Ｄ−Pro−Asnを、参考例１に述べ
た手順で合成及び精製した。純度を、次の条件の下での
HPLC、アミノ酸分析及びFAB−MSで確定した。
た手順で合成及び精製した。純度を、次の条件の下での
HPLC、アミノ酸分析及びFAB−MSで確定した。
HPLC: カラム:Vydac C18 4.6mm×25cm 溶剤:30分間０〜10％ Bで線形勾配;A＝0.1％TFA/H2O及
びＢ＝0.1％TFA/CH3CN;流量＝1.5ml・min-1;チャート速
度＝5mm・min-1 アミノ酸分析：計算値 実測値 １ 1.00 Lys １ 0.90 Pro １ 1.03 Asn FAB−MS:正イオンスペクトルはm/z 358でＭ＋H+であっ
た（分子量は357.413）。
びＢ＝0.1％TFA/CH3CN;流量＝1.5ml・min-1;チャート速
度＝5mm・min-1 アミノ酸分析：計算値 実測値 １ 1.00 Lys １ 0.90 Pro １ 1.03 Asn FAB−MS:正イオンスペクトルはm/z 358でＭ＋H+であっ
た（分子量は357.413）。
実施例15:酢酸によって惹起される痛覚過敏に対するペ
プチドの効果 或る用量の或るペプチドで、またモルヒネ、インドメ
タシンもしくは生理食塩水（0.1ml/10g）で処理した幾
グループかのマウス（LACA、雄、25〜35g、６≦ｎ≦
９）に酢酸によって惹起される痛覚過敏に対するペプチ
ドの効果を決定した。薬剤を、酢酸（0.6％ v/v,0.1ml/
10g）のip注射の30分前に腹腔内（ip）注射し、または
経口（po）投与した。原因物質である酢酸のip投与後10
〜20分間の捻転（腹部絞窄または身悶え）の回数を、薬
剤処理を知らない観察者が数えた。表８〜10に掲げたデ
ータを含むメジアン値を算出した。括弧内の数字は、生
理食塩水対照を注射したマウスにおける対照値からの減
少パーセンテージである。1 :モルヒネ2.5mg/kg ip2 :モルヒネ1.25mg/kg ip 表８〜10から、２〜100mg/kgでip投与したトリペプチ
ドＫ（Ｄ）PV（実施例３）及びＫ（Ｄ）PT（実施例１及
び２）がマウスにおいて酢酸により惹起される痛覚過敏
に対し用量に関連する鎮痛活性を有することが知見され
得る。この試験において、ip投与量30mg/kgの各ペプチ
ドが用量1.25mg/kgのip投与モルヒネまたは用量5mg/kg
のインドメタシン（ip投与）とほぼ同程度に有効である
と考えられた（表８及び９）。更に、上記２種のトリペ
プチドは経口（po）投与した場合も鎮痛活性を有した
（表10）。
プチドの効果 或る用量の或るペプチドで、またモルヒネ、インドメ
タシンもしくは生理食塩水（0.1ml/10g）で処理した幾
グループかのマウス（LACA、雄、25〜35g、６≦ｎ≦
９）に酢酸によって惹起される痛覚過敏に対するペプチ
ドの効果を決定した。薬剤を、酢酸（0.6％ v/v,0.1ml/
10g）のip注射の30分前に腹腔内（ip）注射し、または
経口（po）投与した。原因物質である酢酸のip投与後10
〜20分間の捻転（腹部絞窄または身悶え）の回数を、薬
剤処理を知らない観察者が数えた。表８〜10に掲げたデ
ータを含むメジアン値を算出した。括弧内の数字は、生
理食塩水対照を注射したマウスにおける対照値からの減
少パーセンテージである。1 :モルヒネ2.5mg/kg ip2 :モルヒネ1.25mg/kg ip 表８〜10から、２〜100mg/kgでip投与したトリペプチ
ドＫ（Ｄ）PV（実施例３）及びＫ（Ｄ）PT（実施例１及
び２）がマウスにおいて酢酸により惹起される痛覚過敏
に対し用量に関連する鎮痛活性を有することが知見され
得る。この試験において、ip投与量30mg/kgの各ペプチ
ドが用量1.25mg/kgのip投与モルヒネまたは用量5mg/kg
のインドメタシン（ip投与）とほぼ同程度に有効である
と考えられた（表８及び９）。更に、上記２種のトリペ
プチドは経口（po）投与した場合も鎮痛活性を有した
（表10）。
図面の簡単な説明 第１図は精製ペプチドLys−Ｄ−Pro−Thrの高速液体
クロマトグラフィー（HPLC）記録を示し（実施例１）、
第２図は精製KPVのHPLC記録を示し（参考例２）、第３
図は精製Ｋ（Ｄ）PVのHPLC記録を示し（実施例３）、第
４図はIL−１βの痛覚過敏化作用と、インドメタシンで
の前処理によるその弱化とを示し（参考例３）、第５図
はIL−１βによって惹起される痛覚過敏に対する３種の
ペプチドの効果を示し（実施例４）、第６図はIL−１α
及びIL−１βへの痛覚過敏応答と、該応答に対するペプ
チドＫ（Ｄ）PTの効果とを示し（実施例５）、第７図は
PGE2、カラゲナン及びIL−１βによって惹起される痛覚
過敏に対するＫ（Ｄ）PTの効果を示し（実施例６）。
クロマトグラフィー（HPLC）記録を示し（実施例１）、
第２図は精製KPVのHPLC記録を示し（参考例２）、第３
図は精製Ｋ（Ｄ）PVのHPLC記録を示し（実施例３）、第
４図はIL−１βの痛覚過敏化作用と、インドメタシンで
の前処理によるその弱化とを示し（参考例３）、第５図
はIL−１βによって惹起される痛覚過敏に対する３種の
ペプチドの効果を示し（実施例４）、第６図はIL−１α
及びIL−１βへの痛覚過敏応答と、該応答に対するペプ
チドＫ（Ｄ）PTの効果とを示し（実施例５）、第７図は
PGE2、カラゲナン及びIL−１βによって惹起される痛覚
過敏に対するＫ（Ｄ）PTの効果を示し（実施例６）。
フロントページの続き (72)発明者 ブリストウ，エイドリアン・フランシス イギリス国、ハートフオードシヤー、セ ント・アルバンス、バーンフイールド・ ロード・30 (72)発明者 プール，ステイーブン イギリス国、ロンドン・エス・ダブリ ユ・19・３・デイー・エツクス、グラス ミア・アベニユー・72 (56)参考文献 特開 昭56−108750（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−115753（ＪＰ，Ａ) 特表 平２−504280（ＪＰ，Ａ) 米国特許3778426（ＵＳ，Ａ) Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔ ｓ 102：126303（1985)
Claims (8)
- 【請求項１】（ａ） 式（Ｉ）： ［式中Ｘは H2N−（CH2）４−CH（NH2）−Ｃ（＝Ｏ）−または H2N−Ｃ（＝NH）−NH−（CH2）３−CH（NH2）−Ｃ（＝
Ｏ）− であり、Ｙは天然に生じるアミノ酸残基である］のペプ
チド、 （ｂ） 前記ペプチドのＣ末端アミド、または （ｃ） 前記ペプチドまたはアミドの医薬に許容可能な
塩 からなるが、ＸとＹの間のプロリン残基はＤ−Proであ
ることを特徴とする鎮痛薬剤。 - 【請求項２】Ｙがトレオニン残基またはバリン残基であ
ることを特徴とする請求項１に記載の鎮痛薬剤。 - 【請求項３】式（Ｉ）のペプチドが Lys−Ｄ−Pro−Thr、Lys−Ｄ−Pro−Val、Arg−Ｄ−Pro
−Val、Ｄ−Arg−Ｄ−Pro−Val、Arg−Ｄ−Pro−Thrま
たはＤ−Arg−Ｄ−Pro−Thr であることを特徴とする請求項１に記載の鎮痛薬剤。 - 【請求項４】式（Ｉ）のペプチドがLys−Ｄ−Pro−Asn
であることを特徴とする請求項１に記載の鎮痛薬剤。 - 【請求項５】式（II）： のペプチドまたは該ペプチドの医薬に許容可能な塩から
なる鎮痛薬剤。 - 【請求項６】式（II）のペプチドがLys−Ｄ−Pro−Thr
であることを特徴とする請求項５に記載の鎮痛薬剤。 - 【請求項７】請求項１に規定した式（Ｉ）のペプチド、
Ｃ末端アミドまたは医薬に許容可能な塩及び医薬に許容
可能なキャリヤまたは稀釈剤を含有する鎮痛剤としての
医薬組成物。 - 【請求項８】請求項５に規定した式（II）のペプチドま
たは該ペプチドの医薬に許容可能な塩及び医薬に許容可
能なキャリヤまたは稀釈剤を含有する鎮痛剤としての医
薬組成物。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8807427 | 1988-03-28 | ||
| GB888807427A GB8807427D0 (en) | 1988-03-28 | 1988-03-28 | Peptides |
| GB8828833.7 | 1988-12-09 | ||
| GB828833.7 | 1988-12-09 | ||
| GB888828833A GB8828833D0 (en) | 1988-03-28 | 1988-12-09 | Peptides |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8193524A Division JP2781782B2 (ja) | 1988-03-28 | 1996-07-23 | 新規ペプチド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02504280A JPH02504280A (ja) | 1990-12-06 |
| JP2633369B2 true JP2633369B2 (ja) | 1997-07-23 |
Family
ID=26293705
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1503798A Expired - Lifetime JP2633369B2 (ja) | 1988-03-28 | 1989-03-28 | ペプチド |
| JP8193524A Expired - Lifetime JP2781782B2 (ja) | 1988-03-28 | 1996-07-23 | 新規ペプチド |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8193524A Expired - Lifetime JP2781782B2 (ja) | 1988-03-28 | 1996-07-23 | 新規ペプチド |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0335662B1 (ja) |
| JP (2) | JP2633369B2 (ja) |
| AT (1) | ATE125548T1 (ja) |
| CA (1) | CA1340186C (ja) |
| DE (1) | DE68923572T2 (ja) |
| FI (1) | FI95273C (ja) |
| GB (1) | GB2217331C (ja) |
| HK (1) | HK45895A (ja) |
| IE (1) | IE61222B1 (ja) |
| IL (1) | IL89770A (ja) |
| NO (1) | NO300978B1 (ja) |
| WO (1) | WO1989009226A1 (ja) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL99527A (en) * | 1990-09-28 | 1997-08-14 | Lilly Co Eli | Tripeptide antithrombotic agents |
| IT1277841B1 (it) * | 1995-04-19 | 1997-11-12 | Molteni & C Dei Fratelli Alitt | Ammine dotate di attivita' analgesica, loro preparazione e uso |
| FR2738746B1 (fr) * | 1995-09-19 | 1997-11-14 | Oreal | Utilisation d'au moins un peptide dans une composition cosmetique ou pour la preparation d'un medicament |
| EP1191939B1 (en) * | 1999-03-24 | 2007-10-17 | Zengen, Inc. | Antimicrobial amino acid sequences derived from alpha-melanocyte-stimulating hormone |
| US7402559B2 (en) | 1999-03-24 | 2008-07-22 | Msh Pharma, Incorporated | Composition and method of treatment for urogenital conditions |
| DE10106852A1 (de) * | 2001-02-14 | 2002-09-05 | T Luger | Entzündungshemmende Verbindungen |
| CA2922239A1 (en) * | 2013-09-23 | 2015-03-26 | Dr. August Wolff Gmbh & Co. Kg Arzneimittel | Anti-inflammatory tripeptides |
| SG11201603440SA (en) | 2013-11-07 | 2016-05-30 | Wolff August Gmbh & Co Kg Arzneimittel Dr | Storage stable lyophilized tripeptide formulations |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3778426A (en) | 1970-12-16 | 1973-12-11 | Research Corp | Therapeutically useful polypeptides |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT8021120A0 (it) * | 1979-04-02 | 1980-04-01 | Inst Organicheskogo Sinteza Ak | Analogo ciclico del peptide naturale stimolante la fagocitosi: treonile-ciclo (n-lisile-prolile-arginile). |
| US4377515A (en) * | 1979-10-01 | 1983-03-22 | Merck & Co., Inc. | Long lasting agonists and antagonists of LH-RH |
| US4585757A (en) * | 1984-07-27 | 1986-04-29 | Texas Tech University Health Sciences Center | Hypotensive active peptides |
| AU602483B2 (en) * | 1985-01-18 | 1990-10-18 | Immunetech Pharmaceuticals | Immunoregulatory peptides |
-
1989
- 1989-03-28 DE DE68923572T patent/DE68923572T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-03-28 JP JP1503798A patent/JP2633369B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-03-28 AT AT89303054T patent/ATE125548T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-03-28 GB GB8906972A patent/GB2217331C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-03-28 IL IL8977089A patent/IL89770A/en not_active IP Right Cessation
- 1989-03-28 EP EP89303054A patent/EP0335662B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-03-28 CA CA000594884A patent/CA1340186C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-03-28 WO PCT/GB1989/000319 patent/WO1989009226A1/en active IP Right Grant
- 1989-03-29 IE IE99889A patent/IE61222B1/en not_active IP Right Cessation
- 1989-11-27 NO NO894720A patent/NO300978B1/no not_active IP Right Cessation
- 1989-11-27 FI FI895675A patent/FI95273C/fi not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-03-30 HK HK45895A patent/HK45895A/xx not_active IP Right Cessation
-
1996
- 1996-07-23 JP JP8193524A patent/JP2781782B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3778426A (en) | 1970-12-16 | 1973-12-11 | Research Corp | Therapeutically useful polypeptides |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ １０２：１２６３０３（１９８５） |
| CHEMICAL ABSTRACTS=1985 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1989009226A1 (en) | 1989-10-05 |
| IE890998L (en) | 1989-09-28 |
| DE68923572D1 (de) | 1995-08-31 |
| DE68923572T2 (de) | 1996-01-18 |
| JPH02504280A (ja) | 1990-12-06 |
| JPH09165400A (ja) | 1997-06-24 |
| GB2217331B (en) | 1991-12-11 |
| ATE125548T1 (de) | 1995-08-15 |
| FI95273B (fi) | 1995-09-29 |
| NO894720D0 (no) | 1989-11-27 |
| AU3363789A (en) | 1989-10-16 |
| GB2217331C (en) | 1994-11-16 |
| EP0335662B1 (en) | 1995-07-26 |
| IL89770A (en) | 1994-12-29 |
| GB2217331A (en) | 1989-10-25 |
| AU629826B2 (en) | 1992-10-15 |
| NO894720L (no) | 1990-01-29 |
| JP2781782B2 (ja) | 1998-07-30 |
| FI895675A0 (fi) | 1989-11-27 |
| NO300978B1 (no) | 1997-08-25 |
| CA1340186C (en) | 1998-12-15 |
| IE61222B1 (en) | 1994-10-19 |
| HK45895A (en) | 1995-04-07 |
| GB8906972D0 (en) | 1989-05-10 |
| FI95273C (fi) | 1996-01-10 |
| EP0335662A1 (en) | 1989-10-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AP508A (en) | Novel opioid analogs that are 9 (delta) opioid receptor antagonists, their syntheis and their use as analgesic and immunosupressive compounds. | |
| JP2633369B2 (ja) | ペプチド | |
| JPH0753591A (ja) | 胃腸運動活性を抑制するモチリン類似ポリペプチド | |
| KR0137467B1 (ko) | 펩티드 | |
| JP2949129B2 (ja) | 胃腸運動刺激活性を有するモチリン類似ポリペプチド | |
| AU684511B2 (en) | Oligopeptides derived from C-reactive protein fragments | |
| HU185229B (en) | Process for preparing pharmaceutically active peptides and acetates thereof | |
| US4468383A (en) | Dimeric enkephalins | |
| EP0755942B1 (en) | N-amidino dermorphin derivative | |
| HU190915B (en) | Process for preparing new tripeptide derivatives | |
| US5733881A (en) | Opioid peptide antagonists | |
| EP0741743B1 (en) | Cyclic neurokinin a antagonists | |
| JPH1160598A (ja) | オピオイド様ペプチド | |
| AU629826C (en) | Peptides | |
| Ogawa et al. | Structure–Activity Relationships (SAR) of [D-Arg2] Dermorphin (1—4) Analogues, Nα-Amidino-Tyr-D-Arg-Phe-X | |
| US4587233A (en) | Use of Arg-Phe-amide derivatives | |
| JPH06509571A (ja) | タキキニン拮抗薬としての環状ヘキサペプチドの製法およびその薬学的化合物 | |
| WO1992019644A1 (en) | Vasorelaxant peptide |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20041013 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20041207 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Effective date: 20050405 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 |