KR0137467B1

KR0137467B1 - 펩티드

Info

Publication number: KR0137467B1
Application number: KR1019890702247A
Authority: KR
Inventors: 헨리퀘스 패레이라 세르지오; 프란시스 브리스토우 아드리안; 푸울 스티븐
Original assignee: 말콤 카터; 브리티쉬 테크놀로지 구룹 리미티드
Priority date: 1988-03-28
Filing date: 1989-03-28
Publication date: 1998-04-30
Also published as: US5389615A; US5580855A; GB8828833D0; GB8807427D0; KR900700503A; ZA892269B

Abstract

내용없음

Description

펩티드

제1도는 정제된 펩티드(Lys-D-Pro-Thr(실시예 3)의 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)의 기록을 보여주고;

제2도는 정제된 KPV(실시예 4)의 HPLC 기록을 보여주고;

제3도는 정제된 KPV(실시예 5)의 HPLC 기록을 보여주고'

제4도는 IL-1β의 통각과민 효과 및 인도메타신으로의 예비치료에 의한 효과 감소(참고 실시예)를 보여주고;

제5도는 IL-1β에 의해 유발된 통각과민에 대한 세개 펩티드의 효과(실시예 6)를 보여주고;

제6도는 IL-1α 및 IL-1β에 대한 통각과민 반응 및 이러한 반응에 대한 펩티드 K(D)PT의 효과(실시예 7)를 보여주고;

제7도는 PGE₂, 카라게난 및 IL-1β에 의해 유발된 통각과민에 대한 K(D)PT의 효과(실시예 8)를 보여주고;

제8도는 실시예 16의 펩티드 HPLC 기록을 보여주고;

제9도는 실시예 17의 펩티드의 HPLC 기록을 보여준다.

펩티드

본 발명은 펩티드, 그의 제조 및 사용에 관한 것이다.

용어 인터루킨-1(Interleukin-1 ; IL-1)은 활성 거대 식세포(macrophages) 및 기타 세포 유형에 의해 생성되는 두가지의 다능성 염증단백질을 나타낸다. 두가지의 유전자는 단지 26%만이 상동성(homology)인 아미노산 서열을 갖는 두가지 형태의 IL-1, 즉 IL-1α 및 IL-1β을 암호화한다. 그럼에도 불구하고, IL-1α 및 IL-1β는 거의 예외없이 유사한 생물학적 활성을 가짐이 보고되었다. 실제로 두가지 분자 모두가 동일한 수용기에 작용하는 것으로 보인다.

두가지 모두 다양한 염증성 질병의 병리학에서 조혈성장인자로서 역할한다는 것이 좋은 증거이다. 또한 IL-1은 항종양 작용을 가진다.

IL-1이 인간과 실험동물 내의 통증 수용기를 민감하게 하는 프로스타글란딘을 방출하기 때문에, IL-1α 및 IL-1β는 통각과민 활성에 대하여 시험되었다. IL-1β가 IL-1α에 비해 약 3000배 정도의 활성을 갖는 상당히 강력한 통각과민제임이 밝혀졌다. 또한 IL-1β 및 다른 염증제에 의해 유도되는 통각과민에 대해 매우 효과적으로 길항작용을 하는 펩티드족이 발견되었다.

따라서 이들 펩티드는 진통제로서 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 통증의 예방 또는 치료에 사용되는 약물 제조에 있어서, Lys-Pro-Arg, Arg-Pro-Tyr, Arg-Pro 및 Lys-Pro를 제외한 하기 일반식(I)의 펩티드를 사용하는 것을 제공한다 :

(상기 식에서, X는 H₂N-(CH₂)₄-CH(NH₂)-C(=O)- 또는 H₂N-C(=NH)-NH-(CH₂)₃-CH(NH₂) -C(=O)- 이고, Y는 히드록시기 또는 아미노산 잔기이다). 일반식(I)의 펩티드는 그의 C-말단 아미드 형태일 수 있다. 일반식(I)의 펩티드 또는 그의 C-말단 아미드의 제약학적으로 허용가능한 염이 사용될 수 있다.

디. 비. 리챠드 및 제이. 엠. 립톤(D. B. Richards and J. M. Lipton)에 의한 논문(Peptides 5(1984) 815-817)은 열병 토끼에 있어서 트리펩티드 Lys-Pro-Val의 해열 효과를 기술한다. 일반식(I)의 일부 다른 펩티드는 공지되어 있지만 일부는 신규한 것이다. 따라서, 본 발명은 일반식(I)의 펩티드가

(i) 일반식 Lys-Pro-Y¹(Ⅲ) (여기서, Y¹은 Val, Phe, Pro, Gly, Thr, Lys 또는 Glu이다) 의 펩티드 ;

(ii) 일반식 Arg-Pro-Y²(IV) (여기서, Y²는 Val, Phe, D-Pro, Pro, Gln, Gly, Lys, Arg 또는 Glu이다)의 펩티드 ; 또는

(iii) Arg-D-Pro-Pro, Arg-D-Pro-Lys, D-Lys-Pro또는 Arg-D, L-Pro이 아닌 것을 추가의 조건으로 하는, 상기한 바와 같은 일반식(I)의 펩티드, C-말단 아미드 또는 제약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.

또한 본 발명은 일반식(I)의 신규 펩티드, 그들의 C-말단 아미드 및 이들 펩티드와 아미드의 제약학적으로 허용가능한 염의 제조방법을 제공하는데, 이 방법은 선택적으로 C-말단 아미드로서 일반식(I)의 펩티드를 화학적으로 합성하고, 원한다면 그 결과 화합물을 그들의 제약학적으로 허용가능한 염으로 전환시키는 것으로 구성된다.

키랄(chiral)인 일반식(I)의 펩티드를 구성하는 각 아미노산 잔기는 D 또는 L 광학 이성체로서 존재할 수 있다. 중앙의 프롤린 잔기의 경우에는 D 이성체가 특히 바람직하다. 아미노산을 표시하는 세 개의 문자 시스템을 사용할 경우 다른 언급이 없는 한 기호들은 키랄 아미노산의 L형을 의미하고, X는 Lys, D-Lys, Arg 또는 D-Arg일 수 있다. 실제로 일반식(I)의 펩티드는 라세미 혼합물 또는 광학적으로 순수한 이성체로서 존재할 수 있다. 바람직하게 X는 Lys 또는 D-Lys이다.

Y가 히드록시기일 때, 일반식(I)의 펩티드는 디펩티드이다. 그러나, 트리펩티드가 바람직하다. Y는 전형적으로 α-아미노산 잔기이다. 좀 더 구체적으로는, Y는 일반적으로 자연적으로 발생하는 아미노산 잔기이다. 바람직하게 Y는 중성 아미노산 잔기이다. 지방족 아미노산 잔기가 방향족 아미노산 잔기보다 바람직하고, 중성 아미노산 잔기가 산성 아미노산 잔기보다 바람직하다. 특히 Y는 트레오닌 또는 발린 잔기일 수 있다. Y가 트레오닌 잔기일 경우 일반식(I)의 펩티드의 한가지 실시양태는 하기 일반식(II)의 펩티드이다:

Y는 또한 글리신으로부터 유도된 잔기일 수 있다. Y는 알라닌 또는 세린 잔기, 또는 바람직하게 로이신 또는 이소로이신 잔기일 수 있다. Y는 또한 적절하게 산성 아미노산 잔기일 수 있다. 이 때 Y는 전형적으로 아스파르트산 또는 아스파라긴의 잔기이다.

특히 바람직한 일반식(I)의 펩티드는 Lys-Pro-Thr, Lys-D-Pro-Thr, Lys-Pro-Val 및 Lys-D-Pro-Val이다. 또한 바람직한 것은 D-Lys-Pro-Thr, Arg-Pro-Val, D-Arg-Pro-Val, Arg-D-Pro-Val, D-Arg-D-Pro-Val, Arg-Pro-Thr, D-Arg--Pro-Thr, Arg-D-Pro-Thr 및 D-Arg-D-Pro-Thr이다. 디펩티드는 Lys-D-Pro 또는 Arg-D-Pro일 수 있다.

일반식(I)의 펩티드는 신규한 것이든 공지된 것이든 화학 조성에 의해 제조될 수 있다. 펩티드는 일반식 (I)에 나타나는 순서로 구성 아미노산들의 축합에 의해 제조된다. 펩티드는 그의 C-말단에 유리 카르복시 또는 아미드(-CONH₂)기를 가진 형태로 얻어질 수 있다. 고체상 또는 용액법이 적용될 수 있다. 원한다면 결과 펩티드를 제약학적으로 허용가능한 염으로 전환할 수 있다.

고체상 합성에서, 일반식(I)의 아미노산 서열은 불용성 수지에 결합된 C-말단 아미노산으로부터 연속적으로 제조된다. 원하는 펩티드가 제조되면 수지로부터 분리된다(cleaved). 용액상 합성을 이용할 경우, 펩티드는 C-말단 아미노산으로부터 제조될 수 있다. 이러한 아미노산의 카르복시기는 적절한 보호기에 의해 처음부터 끝까지 블록된(blocked) 상태로 있으며, 이러한 보호기는 합성 후에 제거된다.

고체상법이든 용액상법이든, 반응 시스템에 첨가되는 각 아미노산은 전형적으로 보호된 아미노기 및 활성화된 카르복시기를 갖는다. 아미노기는 플루오렌-9-일메톡시카르보닐(Fmoc)또는 t-부톡시카르보닐(Boc)기에 의해 보호될 수 있다. 카르복시기는 펜타플루오로페닐 또는 1-옥소-2-히드록시-디히드로벤조트리아진 에스테르로서 활성화될 수 있다. 각 축합단계는 디시클로헥실카르보디이미드 또는 1-히드록시벤조트리아졸의 존재하에 수행될 수 있다. 리신의 측쇄 아미노기 및 트레오닌의 측쇄 히드록시기는 그들의 부틸에테르(세린과 트레오닌의 경우), 부틸에스테르(아스파르트산의 경우), 부틸옥시카르보닐 유도체(리신) 및 4, 4'-디매톡시벤즈히드릴기(아스파라긴)로서 보호될 수 있다. 합성의 각 단계를 거친 후, α-아미노 보호기는 제거된다. 어떤 측쇄 보호기도 합성 후에는 일반적으로 제거된다.

펩티드는 C-말단 카르복시 또는 C-말단 아미드기를 가지도록 제조될 수 있다. 고체상 펩티드 합성에서, 이는 C-말단 아미노산이 어떻게 수지 지지체에 결합되는지 및/또는 최종 펩티드가 어떻게 수지 지지체로부터 분리되는지에 의해 결정될 수 있다. 전형적으로 수지는 스티렌 및/또는 디비닐벤젠 중합체이다. C-말단 아미노산은 에스테르 결합을 통해 수지에 결합될 수 있는데, 에스테르 결합은 트리플루오로아세트산 내의 HBr 또는 HF와 같은 강산에 의해 분리되어 C-말단 카르복시기를 가지는 펩티드가 생성되도록 한다.

대신 암모니아분해(ammonolysis)는 대응하는 아미드를 제공할 수 있다.

고체상 합성에 의해 펩티드 아미드를 얻는 대안적인 방법은 펩티드의 C-말단 아미노산을 펩티드 아미노벤즈히드릴 결합을 통하여 수지에 결합되도록 배열하는 것이다. 이는 디시클로헥실카르보디이미드와의 커플링에 의해 형성되고, 전형적으로 찬 상태에서 HF에 의해 분리될 수 있다. 용액상 합성의 경우, C-말단 카르복시 또는 아미드기가 존재하는지 여부는 어떻게 C-말단 아미노산의 카르복시기가 블록되는지, 그리고 합성 후에는 어떻게 탈블록되는지에 의해 결정될 수 있다. C-말단 카르복시기를 갖는 펩티드는 C-말단 아미드기를 가진 것으로 전환될 수 있고, 그 반대도 가능하다.

결과적으로 얻어지는 펩티드는 제약학적으로 허용가능한 염으로 전환될 수 있다. 이는 유기산 또는 무기산을 가진 산부가염으로 전환될 수 있다. 적절한 산은 아세트산, 숙신산 및 염산을 포함한다. 또는, 펩티드는 암모늄염과 같은 카르복실산염 또는 나트륨 또는 칼륨염과 같은 알칼리 금속염으로 전환될 수 있다.

일반식(I)의 펩티드 및 그들의 아미드 및 염은 진통제이다. 그러므로 유효량의 일반식(I)의 펩티드 또는 C-말단 아미드 또는 그들의 제약학적으로 허용가능한 염을 투여하여 인간 또는 동물의 통증이 치료 또는 예방될 수 있다. 따라서 통증은 경감될 수 있다.

따라서 본 발명은 진통제로서 사용되는, Lys-Pro-Arg, Arg-Pro-Tyr, Arg-Pro 및 Lys-Pro는 제외한 하기 일반식(I)의 펩티드:

(상기 식에서, X는 H₂N-(CH₂)₄-CH(NH₂)-C(=O)- 또는 H₂N-C(=NH)-NH-(CH₂)₃-CH(NH₂) -C(=O)-이고, Y는 히드록시기 또는 아미노산 잔기이다); 일반식(I)의 펩티드의 C-말단 아미드 ; 및 상기 일반식(I) 펩티드 및 그들의 C-말단 아미드의 제약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.

본 발명의 바람직한 트리펩티드 중 하나인 Lys-Pro-Thr은 IL-1β 서열의 일부분을 이룬다. Lys-Pro-Thr 및 그의 D-Pro 라세미화합물은 IL-1β에 의해 유발되는 통각과민에 대하여 길항작용을 한다. 그러나, 모두 L 형태인 화합물은 또한 특정 농도에서는 작용물질(agonist)로서 작용함이 밝혀졌는데, 예를 들어 ≥50μg/50g 쥐의 투여량에 의해 통각과민을 유발한다. D-Pro 화합물은 상기와 같은 작용물질의 작용을 나타내지 않으며, 따라서 비록 그것의 진통작용이 L 화합물보다 적지만 모두 L 형태인 화합물보다 바람직하다. 쥐에서의 Lys-Pro-Thr 및 Lys-D-Pro-Thr의 ED₅₀값은 각각 약25 및 85μg/150g 쥐로 계산되었다. 트리펩티드 Lys-Pro-Val 및 Lys-D-Pro-Val이 Lys-D-Pro-Thr보다 IL-1β-유발된 통각과민에 대하여 더 강력한 길항물질임이 또한 밝혀졌다.

C-말단 트레오닌 잔기를 갖는 트리펩티드에 비해 C-말단 발린 잔기를 갖는 트리펩티드가 더욱 효능있는 길항물질 작용을 가진다는 부가적인 증거는 Lys-Pro-Val 및 Lys-D-Pro-Val 모두가 PGE₂에 의해 유발된 통각과민에 대해 길항작용 한다는 사실로부터 나왔다. 상기 작용은 Lys-Pro-Thr 또는 Lys-D-Pro-Thr에 의해서는 나타나지 않는다. Lys-Pro-Val 및 그의 D-Pro 라세미화합물은 사실, IL-1β 유발된 통각과민에 대해 길항작용을 하는 투여량 수준보다 더 높은 투여량 수준에서 PGE₂유발된 통각과민에 대해 길항작용을 한다. 쥐에 있어서, PGE₂유발된 통각과민에 대해 길항작용을 하는 Lys-Pro-Val 및 Lys-D-Pro-Val 각각에 대한 ED₅₀값은 약 170μg/150g 쥐 및 140μg/150g 쥐이다. IL-1β 유발된 통각과민에 대한 ED₅₀값은 각각 70μg/150g 쥐 및 40μg/150g 쥐이다.

본 발명의 트리펩티드 중 어느 것도 디부트릴 시클릭 아데노신 모노포스페이트(dibutryl cyclic adenosine monophosphate ; DbcAMP)에 의해 유발된 통각과민에 대하여 길항물질이 아니다. 상기와 같은 효과의 부족은 DbcAMP에 의해 유발된 통각과민에 대하여 효과적인 길항물질인 모르핀과 강하게 대조를 이룬다. 그러므로, 이는 일반식(I)의 펩티드가 그 작용에 있어서 모르핀성은 아니라는 것을 지시해 준다.

펩티드 Lys-Pro-Thr 및 Lys-D-Pro-Thr의 장점은, 스테로이드계 및 비-스테로이드계(아스피린형) 진통약과는 달리, 상기한 바와 같이 이들 펩티드가 위에서의 보호 역할을 가지는 프로스타글란딘의 생성을 저지하지 않는다는 것이다. 스테로이드계 및 비-스테로이드계(아스피린형)약은, 특히 IL-1β가 부분적으로 원인이 될 수 있는 류머티스성 관절염 증상치료에 있어서, 그들의 유용성을 제한하는 위병변(gastric lesions)을 일으킨다. 그러므로, 상기와 같은 위병변의 문제는 일반식(I)의 펩티드와 그 염을 사용하여 제거될 수 있다.

일반식(I)의 펩티드 및 그의 C-말단 아미드 및 염은 예컨대 피하, 정맥내, 근육내, 복강내, 비내 또는 구강투여와 같이 경구적으로나 비경구적으로 투여될 수 있다. 전형적으로, 화합물은 경구적 또는 비경구적인 방법에 의해 1회 투여당 0.2-2mg/kg으로 인간이나 동물에 투여된다.

사용하기 위해서, 일반식(I)의 펩티드 또는 그들의 C-말단 아미드 또는 염은 제약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 일반적으로 배합된다. 통상적인 배합물, 담체, 보조제 및 희석제가 적용될 수 있다. 이들은 일반적으로 투여경로에 의해 결정될 것이다.

하기 실시예 1-19는 본 발명을 예증한다. IL-1β가 강력한 통각과민제임을 보여주는 참고 실시예도 또한 제시된다. 실시예 및 참고 실시예에서 언급되는 도면들:

Lys-Pro-Thr의 제조

고체상 펩티드 합성법 중 Fmoc-폴리아미드법을 사용하여 트리펩티드 Lys-Pro-Thr을 합성했다(드라이랜드 및 쉐파드, 펩티드 합성 8 저압 연속유동 조건하에서의 고체상 합성 시스템(Dryland and Sheppard, Peptide Synthesis 8 A system for solid phase synthesis under low pressure continuous flow conditions J. Chem. Soc. Perkin. Trans. 1. 125. 1986). 고체상 지지체는 디메틸아크릴아미드(골격 단량체), 비스-아크릴로일-에틸렌 디아민(가교제) 및 아크릴로일사르코스아민(acryloylsarcosamine) 메틸에스테르(관능제)의 세개 단량체로 구성된 폴리디메틸아크릴아미드 중합체이다. 수지에 대한 펩티드의 분리 가능한 결합제로서는 산에 불안정한 4-히드록시메틸-페녹시아세트산 유도체가 사용되었다.

모든 아미노산 유도체는 그들의 예비형성된 대칭 무수물 유도체로서 첨가되었다. Fmoc기에 의해 일시적인 Nα-아미노기 보호가 얻어졌다. N, N-디메틸포름아미드 내 20% 피페리딘을 사용하여 Fmoc기의 반복적인 쪼개짐을 수행했다. 측쇄 관능기는 부틸에스테르(트레오닌) 및 부틸옥시카르보닐 유도체(리신)로서 보호되었다.

합성을 완료시킨 후, 5% 포착제(scavenger) 혼합물을 함유하는 95% 트리플루오로아세트산(TFA)으로 결과로서 얻어진 펩티드를 수지 지지체로부터 분리시켰다. 펩티드를 HPLC로 정제시켰다. 아미노산 분석과 빠른 원자 충격 질량 분석법(FAB-MS)으로 순도를 확인했다:

FAB-MS : 양이온 스펙트럼은 m/z 345에서 M+H⁺를 나타내었다.(분자량 344.415(344))

순도는 80%였다. 하이퍼실(Hypersil) (등록상표) WP 300 부틸 컬럼(150×4.6mm)를 사용하여 역상 HPLC에 의해 95%까지의 정제를 수행했다. 완충액은 A=0.25% TFA 및 B=1.25% TFA이 CH₃CN이었다. 225mm에서 UV로 검출했고, 예비충전은 0.5mg이었다.

[실시예 2]

Lys-D-Pro-Thr의 제조(1)

트리펩티드 Lys-D-Pro-Thr이 실시예 1에서 기술한 방법에 따라 합성 및 정제되었다. 아미노산 분석, FAB-MS 및 HPLC로 순도를 확인했다.

FAB-MS : 양이온 스펙트럼은 m/z 345에서 M+H⁺을 나타내었다(분자량 344.415(344))

HPLC : 컬럼 : μ본다팩(μBondapak) C₁₈3.8mm×30cm

용매 : 20분 동안 선 기울기 5-95% B ; A=0.1% TFA/H₂O 및 B=0.1% TFA/CH₃CN ; 흐름속도 1.5cm³min^-1

검출 : 230nm에서 UV

순도는 80%였다. 실시예 1에서 기술한 바와 같이 이를 95%까지 증가시켰다.

[실시예 3]

Lys-D-Pro-Thr의 제조(2)

Boc 아미노-보호기를 사용하여 고체상 합성에 의해 트리펩티드 Lys-D-Pro-Thr을 제조했다. 출발 수지는 Boc-Thr-(벤질(Bzl))-O-수지였다. 20% TFA/DCM(DCM=디크로로메탄)으로 탈보호시킨 뒤에 10% 트리에틸아민으로 중화시킨 다음, DCC(DCC=디시클로헥실우레아)/DCM을 사용하여 Boc-D-Pro를 커플링시켰다. 카이저(Kaiser) 시험에 의해 성공적인 커플링을 확인했다. Boc-D-Pro 잔기의 탈보호 및 중화를 거쳐 최종 잔기는 Boc-Lys-(벤질옥시카르보닐(Z)) 유도체로서 커플링되어, 펩티드 수지를 얻었다.

펩티드 수지를 0℃에서 45분간 HF로 분리(cleavage)하여 조(crude) 펩티드를 얻었다. 분리되는 동안 포착제로서 아니솔을 사용했다.

부탄올 : 피리딘 : 아세트산 : H₂O(B : P : A : W)가 90 : 90 : 18 : 72인 이동상을 사용하여 키젤겔 60(Kieselgel60)상에서 조 펩티드를 정제시켰다. 진공하에 용매를 제거시킨 후 샘플을 물로부터 동결건조시켜 순수한 펩티드를 얻었다.

박층 크로마토그래피 :

1. B : P : A : W(60 : 20 : 6 : 24)은 단일 점의 닌히드린 양성반응, R_f0.21을 나타내었다.

2. B : A : W(3 : 1 : 1)은 단일 점의 닌히드린 양성반응, R_f0.24를 나타내었다.

HPLC : 얻은 기록은 제1도에 도시되었고, 여기서 I은 용매선을 지칭한다.

HPLC형 : 길슨(Gilson).

컬럼 : 비닥(Vydac) C. 18.

용매 : A 0.05M NaH₂PO₄및 A 내에서 B 60% CH₃CN.

기울기 : 40분내에 선 0-100% B.

기록기 : 2mm/min.

검출기 : 210mm AUFS.

[실시예 4]

Lys-Pro-Val의 제조

실시예 1에서 기술한 방법에 따라 트리펩티드 Lys-Pro-Val(KPV)을 합성 및 정제했다. 아미노산 분석과 HPLC로 순도를 확인했다.

[아미노산 분석]

HPLC

정제된 트리펩티드의 HPLC 기록은 제2도에 보여진다.

컬럼 : 비닥 C₁₈4.6mm×25cm

용매 : 30분 동안 선 기울기 0-30% B

흐름 속도 : 1.5cm³min^-1

A=0.1% TFA/H₂O

B=0.1% TFA/CH₃CN

검출 : 230nm에서 UV

[실시예 5]

Lys-D-Pro-Val의 제조

실시예 4에서 기술한 바와 같이 상기 펩티드를 합성하고 정제시켰다. 분석 결과는 하기와 같다:

[아미노산 분석]

HPLC

정제된 트리펩티드의 HPLC 기록은 제3도에 보여진다.

컬럼 : 비닥 C₁₈4.6mm×25cm

용매 : 30분 동안 선 기울기 0-30% B

흐름 속도 : 1.5cm³min^-1

A=0.1% TFA/H₂O

B=0.1% TFA/CH₃CN

검출 : 230nm에서 UV

[참고 실시예 : IL-1β의 통각과민 작용]

IL-1β의 통각과민 작용을 변형된 란달-셀리토 쥐의 발 압력 시험(modified Randall-Sellito rat paw pressure test) (페레이라(Ferreira) 일행, Eur. J. Pharacol. 53, 39-48, 1978)으로 조사했다. IL-1β( 및 실시예 7에서 사용된 IL-1α)는 겐자임(Genzyme) 리밋팃드로부터 구입한 인간 재결합 단백질이었고, 임시기준시약(Interim Reference Reagents)에 대해 조정(calibration)되었다. (이들은 영국 포터스바(Potters Bar)에 있는 생물학적 표준 및 조절을 위한 국립기관으로부터의 임시 생물학적 표준이다 : IL-α 1단위=10pg 및 IL-1β단위=10pg)

쥐의 한쪽 발에 IL-1β를 주사한 후 양측의 통각과민(유해수용)의 발전 및 인도메타신(INDO)으로 예비 처리함에 의한 그의 감쇠를 조사했다. IL-1β를 발바닥 내로 (ipl, 주사부피 0.1ml) 또는 복강내로(ip, 주사부피 0.3ml) 가했다. 인도메타신은 0.1ml 내 ipl, 100μg 가해졌다.

쥐(위스타르 균주(Wistar strain), 숫컷, 중량 135-170g)의 뒷발에 20mmHg의 일정 압력을 적용하고, 동물이 특징적인 동결반응을 나타낼 때 중단함으로써(반응시간) 통각과민을 측정했다. 예비-주사 대조표준 반응시간(0시간)으로부터 통각과민제 투여 후 1, 2, 3 또는 4시간 후에 측정한 값을 뺌으로써 얻어지는 반응시간(ㅿ 반응시간, 초)의 변화량으로서의 통각과민의 강도를 정량하였다. 실험자는 군(group) 치료를 알지 못했다.

결과는 제4도에 보여진다. 판넬 A에서 IL-1β는 ipl로 주어졌다. 주사된 발(채워진 기호 및 실선) 및 반대편 발(채워지지 않은 기호 및 점선)에서의 IL-1β의 통각과민 효과를 측정했다.

판넬 B 및 C에서 결과는 임의 단위로 표시된 곡선 아래의 면적에 의해 나타내며, 유해수용적인 자극을 준 후 0, 1, 2, 3 및 4시간의 간격으로 통각과민을 측정하여 얻은 데이터로부터 계산된다(페레이라 일동, 1978). 수직 막대는 5마리 쥐로 구성된 군에서 얻은 값의 평균 표준오차(s. e. m's)이다.

판넬 B 및 C는 ipl 및 ip로 각각 주어진 IL-1β 0.05u의 통각과민 효과 및 30분 전에 행한 인도메타신으로의 예비처리에 의한 효과를 보여준다. 예비처리는 처리된 발(I)에서만 통각과민 반응을 뚜렷하게 감쇠시켰다. 반대편 발(CL)에서는 효과가 없었는데, 이는 IL-1β가 유해수용기 근처에서 프로스타글란딘-형 물질을 방출하여 통각과민을 일으킨다는 것을 제안한다.

[실시예 6]

IL-1β에 의해 유발된 통각과민에 대한 펩티드의 효과

쥐군에 IL-1β에 의해 유발된 통각과민에 대한 세가지 펩티드이 효과가 연구되었다. 세 개의 펩티드는 Lys-Pro-Thr(KPT), Lys-D-Pro-Thr(K(D)PT) 및 본 발명 범위 외에 있는 펩티드 Lys-Asp-Asp(KDD)였다. 결과는 제5도에 보여진다.

제5도에서, 판넬 A는 모두 피하로(sc) 주사되는 KPT, K(D)PT 및 KDD으로 예비처리하는 것이 30분후 IL-1β의 ip 주사에 대한 통각과민 반응에 미치는 효과를 보여준다. 판넬 B는 30분 후 ip로 주입되는 IL-1β(0.05u/150g)에 대한 통각과민 반응에 대하여 K(D)PT에 의한 길항작용의 투여량-의존성을 보여준다. 각 기호 또는 히스토그램은 처리군 당 5마리 동물의 평균 반응을 나타낸다. 수직 막대는 s. e. m's이다.

[실시예 7]

IL1α 및 IL-1β에 의해 유발된 통각과민에 대한 펩티드 K(D)PT의 효과

IL-1α 및 IL-1β에 대한 통각과민 반응을 쥐에서 평가했다. 이러한 반응에 대한 K(D)PT의 효과를 측정했다. 결과는 제6도에 보여진다. 데이터는 처리군당 5마리 동물의 평균±s. e. m's이다. IL-1을 ip로 주사하기 30분전에 K(D)PT(200μg/150g 쥐 중량)을 sc로 주입하였다.

제6도는 IL-1β의 투여량을 증가시킴으로써 극복될 수 있는 IL-1β의 양쪽 통각과민 효과의 억제를 보여주는데, 이는 경쟁적인 길항작용과 일치한다. 또한 제6도로부터 IL-1β의 통각과민제로서 IL-1α 보다 약 3000배 더 효능이 있고, 서열 Lys-Pro-Thr이 없는 IL-1α는 K(D)PT에 의해 단지 약하게 길항작용됨을 알 수 있다.

[실시예 8]

PGE₂, 카라게난 및 IL-1β에 의해 유발된 통각과민에 대한 펩티드 K(D)PT의 효과

PGE₂, 카라게난 및 IL-1β에 의해 유발된 통각과민에 대한 K(D)PT의 효과를 쥐에서 평가했다. 결과는 제7도에 보여진다. 제7도는 A : PGE₂(100mg/발), B :카라게난(100μg/발) 및 C : IL-1β(0.05U/발)에 대한 통각과민 반응의 일시적인 증가를 보여준다. ipl로서 주사하기 30분 전에 K(D)PT(200μg/150g)를 ip로 주사했다. 각 기호는 처리군 당 5마리 동물의 평균반응을 나타낸다. 수직 막대는 s. e. m's이다.

카라게난 주사 후 생긴 수종을 시도 후 4시간이 지난 후 플레티스모그래프(plethysmographically)로 측정하였다.(페레이라(Ferreira), J. Pharm. Pharmacol., 31, 648, 1979). 수종은 K(D)PT로의 예비처리에 의해서 감소되지 않았다(데이터는 도시되지 않음). IL-1β 또는 카라게난을 주사하고 나서 두시간 후 주입된 K(D)PT는 유발된 통각과민에 효과가 없었으나, 반면 모르핀과 디피론처럼 중앙에 작용하는 진통제 및 말초성 진통제 BW443C은 계속되는 통각과민에 대해 길항작용을 할 수 있다. K(D)PT가 PGE₂-유발된 통각과민에 효과가 없다는 발견과 함께, 이들 결과는 K(D)PT의 진통효과가 중심적이지 않거나, 비-특이적인지 않음을 지시한다.

[실시예 9]

아세트산 및 일로프로스트(Iloprost)에 의해 유발된 통각과민에 대한 펩티드 K(D)PT의 효과

아세트산 및 일로프로스트에 의해 5마리의 쥐군에 유발된 통각과민에 대한 K(D)PT의 효과를 측정했다.

일로프로스트는 프로스타시클린의 안정한 유사화합물이고, 하기 일반식을 가진다:

뒤틀림(몸부림)을 일으키는 0.6% 아세트산 또는 일로프로스트(10μg/kg)를 ip 주사하기 전에 K(D)PT를 sc로 가했다. K(D)PT로의 예비처리 후 상기 반응의 억제 %는 하기 표 1에 보여진다:

[표 1]

[실시예 10]

아세트산 및 일로프로스트에 의해 유발된 통각과민에 대한 펩티드 K(D)PT 및 인도메타신의 효과 비교

펩티드 K(D)PT보다 더 다양한 투여량으로 인도메타신의 주입진 몇 개의 쥐군으로 실시예 9를 반복했다.

쥐의 대조표준군은 인도메타신과 K(D)PT를 받지 않았다. 결과는 표 2에 주어진다. 데이터는 ip 시도 후 20분 동안 측정된 뒤틀림의 총수이다.

[표 2]

그러므로, 아세트산 및 일로프로스트의 ip 주사에 의해 쥐에 유발된 뒤틀림을 감소시키는데 K(D)PT는 효과적이었다. K(D)PT 투여량8mg/kg은 인도메타신 투여량 5 및 20mg/kg의 효과에 상응하는 45% 정도의 최대 진통(8 및 32mg/kg 사이의 차이는 없다) 효과를 낳았다. 그러나, 펩티드 K(D)PT와는 반대로 인도메타신은 쥐에서 위병변을 일으켰다. 인도메타신 투여량 20mg/kg에서 위병변은 쥐 100%에서 일어났다.

K(D)PT 투여량 32mg/kg에서 어떠한 병변도 관찰되지 않았다.

[실시예 11]

K(D)PT는 중앙에 작용하는 모르핀-유사 진통제가 아니다.

표준열판(55℃)시험을 수행했다. 결과는 표 3에 보여진다. 결과는 두가지 약을 투여한 1시간 후 관찰된 값들을 처리전의 반응시간으로부터 빼서 얻어진 반응시간의 평균 s. e. m이다. 표는 K(D)PT가 모르핀과 유사하지 않음을 보여준다.

[표 3]

[실시예 12]

K(D)PT는 아스피린형(즉, 시클로옥시제나아제의 방해물)이 아니다.

인간 혈액 단핵세표(MNC)에 의해 방출되는 PGE₂에 대한 K(D)PT 및 인도메타신의 효과를 관찰하였다.

밀도 기울기 원심분리(피콜-히파크, 시그마(Ficoll-hypaque, Sigma))에 의해 연층(buffy coat) 잔류물로부터 MNC를 분리시켰고, RPMI 1640 배양 매질(깁코(Gibco))+2% 불활성화 태아 송아지 혈청(임페리알 실험실(Imperial Laboratories))에 재현탁시켰다. 표 4에서 보여지는 바와 같이 물질을 배양매질에 첨가하였다. IL-1β 또는 엔도톡신을 첨가하기 45분 전에 K(D)PT와 인도메타신을 첨가했다. 결과는 표 4에 보여준다. 값은 4가지의 평균 ±s. e. m's이다. PGE₂농도는 방사선 면역분석(NEN 연구 생성물 ; NEN Research Products)에 의해 측정했다.

[표 4]

a : 대장균 0113 : H10 : K(-) 엔도톡신;

b : 25pg/ml=0.18IU/ml

K(D)PT는 MNC에 의한 PGE₂생성에 효과가 없는 반면, 100배 더 적은 투여량의 효능있는 아스피린-유사 약품 인도메타신은 이들 세포에 의한 PGE₂생성을 없앴다.

[실시예 13]

IL-1β에 의해 유발된 통각과민에 대한 펩티드의 효과

IL-1β에 의해 쥐에 유발된 통각과민에 대한 Lys-Pro-Val(KPV), Lys-D-Pro-Val(K(D)PT) 및 Lys-D-Pro-Thr(K(D)PT) 트리펩티드의 효과를 연구했다. 결과는 하기 표 5에 주어진다. IL-1β를 ip로 가하기 1시간 전에 ip로 처리했다. 치료군 당 5마리 동물이 있었다.

IL-1β를 투여하고 3시간 후 델타 반응시간을 측정했다.

대조표준은 ip로 투여된 IL-1β(0.05U)이었다. 대조표준의 결과는 23.9±0.5(=100%)였다.

[표 5]

[실시예 14]

PGE₂에 의해 유발된 통각과민에 대한 펩티드의 효과

쥐에서 PGE₂에 의해 유발된 통각과민에 대한 트리펩티드 K(D)PT의 효과를 연구했다. 결과는 하기 표 6에 보여진다. PGE₂를 발에 주사(ipl)하기 1시간 전에 ip로 처리했다. 처리군 당 5마리의 동물이 있었다.

PGE₂를 투여하고 3시간 후에 델타 반응시간을 측정했다. 모르핀(0.6mg/150g)은 델타 반응시간을 6.1±0.8초(-63.7%)로 감소시켰다. 대조표준은 PGE₂(100mg/발)였다. 대조표준군에 대한 결과는 16.8±0.3(=100%)이었다.

(NT=시험되지 않음.)

[표 6]

[실시예 15]

DbcAMP(대조표준)에 의해 유발된 통각과민에 대한 펩티드의 효과

DbcAMP에 의해 쥐에 유발된 통각과민에 대한 트리펩티드 KPV 및 K(D)PV의 효과를 연구했다. 결과는 하기 표 7에 주어진다. DbcAMP를 발에 주사(ipl)하기 1시간 전에 ip로 처리했다. 처리군 당 5마리의 동물이 있었다. DbcAMP를 투여하고 3시간 후에 델타 반응시간을 측정했다. 모르핀(0.6mg/150g)은 델타 반응 시간을 6.2±0.4초 (-64.0%)로 감소시켰다. 대조표준은 DbcAMP(100μg/발)이었다. 대조표준군에 대한 결과는 17.2±6.4초(=100%)였다.

[표 7]

[실시예 16]

D-Lys-Pro-Thr의 제조

실시예 1에 기술된 방법에 따라 트리펩티드 D-Lys-Pro-Thr을 합성하고 정제했다. 아미노산 분석, FAB-MS 및 HPLC로 순도를 확인했다;

FAB-MS : 양이온 스펙트럼은 m/z 345에서 M+H⁺을 나타내었다.(분자량 344.415(344))

HPLC : 컬럼 : 비닥 C₁₈4.6mm×25cm

용매 : 30분 동안 선 기울기 0-30% B : A=0.1%TFA/H₂0 및 B=0.1% TFA/CH₃CN ; 흐름속도=1.5cm³min^-1

얻은 기록은 제 8도에 보여진다.

[실시예 17]

Lys-D-Pro의 제조

실시예 1에서 기술한 방법에 따라 디펩티드 Lys-D-Pro를 합성하고 정제했다. 아미노산 분석 및 HPLC로 순도를 확인했다.

HPLC : 컬럼 : 비닥 C₁₈4.6mm×15cm

용매 : 30분 동안 선 기울기 0-30% B ; A=0.1% TFA/H₂O 및 0.1% TFA/CH₃CN ; 흐름속도=1.5cm³min^-1; 도표 속도=5mm min^-1

얻은 기록은 제 9도에 보여진다.

[실시예 18]

Lys-D-Pro-Asn의 제조

실시예 1에서 기술한 방법에 따라 트리펩티드 Lys-D-Pro-Asn을 합성하고 정제했다. 실시예 17과 동일한 조건하에 HPLC, 아미노산 분석 및 FAB-MS로 순도를 확인했다.

FAB-MS : 양이온 스펙트럼은 m/z 358에서 M+H⁺를 나타내었다.(분자량357.413)

[실시예 19]

아세트산에 의해 유발된 통각과민에 대한 펩티드 효과

펩티드 중 하나의 일회 투여로 또는 모르핀, 인도메타신 또는 염수로 처리한 쥐의 군(LACA, 숫컷, 25-35g, 6≤n≤9)에서 아세트산에 의해 유발된 통각과민에 대한 펩티드의 효과를 측정했다. 아세트산(0.6%v/v, 0.1ml/10g)을 ip 주사하기 30분 전에 약을 복강내(ip)로 또는 경구적(po)으로 주사했다. 약물 처리를 모르는 관찰자에 의해 아세트산으로 ip 투여하고 난 후 10-20분 간격으로 뒤틀림(복부 수축 또는 몸부림)의 수를 세었다. 평균값을 계산했고, 평균값은 표 8-11에 주어진 데이터로 구성된다. 괄호안의 수는 염수 대조표준으로 주사된 쥐의 대조표준 값으로부터의 감소 %이다.(¹: 모르핀 2.5mg/kg ip ;²: 모르핀 1.25mg/kg ip.)

2-100mg/kg으로 ip 투여된 트리펩티드 K(D)PV(실시예 5), (D)DPT(실시예 16), KPT(실시예 1) 및 K(D)PT(실시예 2 및 3) 모두가 아세트산에 의해 쥐에 유발된 통각과민과 관련된 진통작용을 가짐을 표 8-11에서 알 수 있다. 이런 시험에서, 각 펩티드의 ip 투여량 30mg/kg는 모르핀의 ip 투여량 1.25mg/kg또는 인도케타신(ip) 투여량 5mg/kg 만큼의 효과를 갖는 것으로 보였다(표 8 및 10). 또한, 4가지 트리펩티드는 경구적으로(po) 투여되었을 때 진통작용을 가졌다(표 11). 또한 ip(표 9)로 투여되든지 po(표 11)로 투여되든 디펩티드K(D)P는 효과적인 진통작용을 가졌다.

[표 8]

[표 9]

[표 10]

[표 11]

Claims

(a) Lys-Pro-Arg, arg-Pro-Tyr, Arg-Pro- 또는 Lys-Pro가 아닌 것을 조건으로 하는 하기 일반식(I)의 펩티드:

상기 식에서, X는 H₂N-(CH₂)₄-CH(NH₂)-C(=O)- 또는 H₂N-C(=NH)-NH-(CH₂)₃-CH(NH₂)-

C(=O)-이고, Y는 히드록시기 또는 아미노산 잔기이다.

(b)는 상기 펩티드의 C- 말단 아미드, 또는 (c) 상기 펩티드 또는 아미드의 제약학적으로 허용가능한 염인 화합물로 이루어지는, 통증의 예방 또는 치료용 약제.
제1항에 있어서, 일반식(I)에서 X와 Y 사이에 위치하는 프롤린 잔기가 D-Pro인 통증의 예방 또는 치료용 약제.
제1항에 있어서, Y가 트레오닌 또는 발린 잔기인 통증의 예방 또는 치료용 약제.
제1항에 있어서, 일반식(I)의 펩티드가 Lys-Pro-Thr, Lys-D-Pro-Thr, Lys-Pro-Val, Lys-D-Pro-Val, D-Lys-Pro-Thr, Arg-Pro-Val, D-Arg-Pro-Val, Arg-D-Pro-Val, D-Arg-D-Pro-Val, Arg-Pro-Thr, D-Arg-Pro-Thr, Arg-D-Pro-Thr, 또는 D-Arg-D-Pro-Thr인 통증의 예방 또는 치료용 약제.
제1항에 있어서, 일반식(I)의 펩티드가 Lys-D-Pro-Asn, Lys-D-Pro 또는 Arg-D-Pro인 통증의 예방 또는 치료용 약제.
하기 일반식(II)의 펩티드:

또는 제약학적으로 허용가능한 이의 염으로 이루어지는, 통증의 예방 또는 치료용 약제.
제6항에 있어서, 일반식(II)의 펩티드가 Lys-D-Pro-Thr인 통증의 예방 또는 치료용 약제.
제1항에 있어서 정의된 일반식(I)의 핍티드, C-말단 아미드 또는 제약학적으로 허용가능한 염으로서, 상기 일반식(I)의 펩티드가 하기 (i)-(iii)이 아닌 것을 추가의 조건으로 하는 펩티드, C-말단 아미드 또는 제약학적으로 허용가능한 염:

(i) 하기 일반식(Ⅲ)의 펩티드;

Lys-Pro-Y¹(Ⅲ)

(상기 식에서, Y¹은 Val, Phe, Pro, Gly, Lys, Orn, His 또는 Glu이다)

(ii) 하기 일반식(Ⅳ)의 펩티드

Arg-Pro-Y²(Ⅳ)

상기 식에서, Y²는 Val, Phe, D-Pro, Pro, Gln, Gly, Lys, Arg, Orn, His, Thr 또는 Glu이다); 또는

(iii) Arg-D-Pro-Pro, Arg-D-Pro-Lys, D-Lys-D-Pro-D-Arg, Lys-D-Pro-Val, D-Lys-Pro-Val, D-Lys-D-Pro-D-Val, D-Lys-Pro 또는 Arg-D, L-Pro.
제8항에 있어서, 일반식(I)의 펩티드가 Lys-Pro-Thr, Lys-D-Pro-Thr, Lys-D-Pro-Val, D-Lys-Pro-Thr, D-Arg-Pro-Val, Arg-D-Pro-Val, D-Arg-D-Pro-Val, D-Arg-Pro-Thr, Arg-D-Pro-Thr 또는 D-Arg-D-Pro-Thr인 펩티드, C-말단 아미드 또는 염.
제8항에 있어서, 일반식(I)의 펩티드가 Lys-D-Pro-Asn, Lys-D-Pro 또는 Arg-D-Pro인 펩티드, C-말단 아미드 또는 염.
제8항에 정의된 바와 같은 일반식(I)의 펩티드, C-말단 아미드 또는 제약학적으로 허용가능한 염 및 제약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제로 구성되는 진통제용 조성물.
하기 일반식(II)의 펩티드:

또는 그의 제약학적으로 허용가능한 염.
제12항에 정의된 일반식(II)의 펩티드, C-말단 아미드 또는 제약학적으로 허용가능한 염 및 제약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제로 구성되는 진통제용 조성물.
하기 (a) 내지 (e)중의 어느 하나인 화합물:

(a) Lys-Pro-Val, Lys-D-Pro-Val, D-Lys-Pro-Val 또는 D-Lys-D-Pro-D-Val이 아닌 것을 조건으로 하는 하기 일반식(A)의 펩티드:

(상기 식에서, Y³는 트레오닌, 발린, 알라닌, 세린, 로이신, 이소로이신, 아스파르트산 또는 아스파라긴 잔기이다):

(b) Arg-Pro-Thr 또는 Arg-Pro-Val이 아닌 것을 조건으로 하는 하기 일반식(B)의 펩티드:

(상기 식에서, Y³는 (a)에 정의된 바와 같다):

(c) Lys-D-Pro 또는 Arg-D-Pro;

(d) 상기 (a), (b) 또는 (c)에 정의된 펩티드의 C-말단 아미드; 또는

(e) 상기 (a), (b), (c) 또는 (d)에 정의된 펩티드 또는 아미드의 제약학적으로 허용가능한 염.
제14항에 정의한 바와 같은 펩티드, C-말단 아미드 또는 제약학적으로 허용가능한 염 및 제약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제로 구성되는 진통제용 조성물.