JP2553506B2

JP2553506B2 - ポリペプチド

Info

Publication number: JP2553506B2
Application number: JP60252315A
Authority: JP
Inventors: 博吉野; 裕土屋; 武稔金子; 隆弘中澤; 伸荒木; 清實山津; 真郎橘; 義弘荒川
Original assignee: Eisai Co Ltd
Current assignee: Eisai Co Ltd
Priority date: 1985-11-11
Filing date: 1985-11-11
Publication date: 1996-11-13
Anticipated expiration: 2011-11-13
Also published as: JPS62111997A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、医薬として優れた作用を有する新規なポリ
ペプチドに関する。更に詳しく述べれば、次の一般式｛式中、ＡはＤ−Ala,CH₃Ala,Ile,Asp,D−Leu,D−Glu,C
H₃Ile,Sar又はβ−Alaを意味し、ＢはOH,Asp−OH,Phe−
OH又はArg−Ｄ−Glu−OHを意味する。但し、ＡがＤ−Le
uでＢがOHであるものは除く｝。

で表わされるポリペプチド又はその薬理学的に許容でき
る塩及びその製造方法；並びにそれを含有する医薬に関
する。

本明細書においては、ペプチドを構成するアミノ酸は
一般にＤ−体、Ｌ−体が存在するが、特にＤ−体と指示
しないかぎりはＬ−体である。また本明細書において
は、ペプチド化学の分野で通常用いられている略号を用
いるが、念の為列記すれば次の通りである。

Tyr;チロシン Gly;グリシン Sar;ザルコシン Cys;システィン Phe;フェニルアラニン Arg;アルギニン Leu;ロイシン Ile;イソロイシン Nle;ノルロイシン Met;メチオニン Ser;セリン Val;バリン homo−Arg;ホモアルギニン Orn;オルニチン Glu;グルタミン酸 Trp;トリプトファン Asp;アスパラギン酸 Ala;アラニン β−Ala;β−アラニン Pro;プロリン Gln;グルタミン AiB;2−アミノイソ酪酸 Boc;第３ブトキシカルボニル Z;ベンジルオキシカルボニル Cl₂Bzl;2,6−ジクロルベンジル Tos;パラトルエンスルホニル Bzl;ベンジル Bu^t;第３ブチル〔従来の技術〕モルフィンの鎮痛作用メカニズムの研究から、生体内
には痛覚をはじめ種々の生体感覚や精神作用を調節する
いわゆる内因性モルヒネ様物質が存在することが推定さ
れ、この一連の研究からオピオイドペプチドとして、エ
ンケファリン、エンドルフィンが単離され、構造が確認
された。その後、この分野での研究が精力的になされ、
β−Neoendorphin、β−Casomorphin、Dermorphin、Dyn
orphinなど次々と新しいオピオイドペプチドが発見され
てきた。

これらのうち、ダイノルフィン（Dynorphin）は、本
発明者の一部の者が発見した下記の構造式を有するオピ
オイドペプチドである。

Ｈ−Tyr−Gly−Gly−Phe−Leu−Arg−Arg−Ile−Arg−P
ro−Lys−Leu−Lys−Trp−Asp−Asn−Gln−OH このダイノルフィンは、Ｋ−レセプターに特異的な天
然由来のオピオイドペプチドであるため、耐性、依存性
等の副作用のない鎮痛薬としての可能性が期待されてい
る。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、ダイノルフィンは血中で不安定なた
め、そのままでは静注で鎮痛作用を示さないという欠点
がある。

またダイノルフィンは比較的長鎖のペプチドであるた
め、更に短鎖のペプチドで活性の高いペプチドが求めら
れている。

〔発明の開示〕

そこで、本発明者等は、ダイノルフィンより短い鎖の
ペプチドで、しかも静注、皮下注でも鎮痛作用を示す誘
導体について長年鋭意検討を重ねてきたが、漸くアミノ
酸８〜10個からなる次の構造式（Ｉ）を有する新規ペプ
チドが所期を目的を達することを見出した。

即ち次の一般式｛式中、ＡはＤ−Ala,CH₃Ala,Ile,Asp,D−Leu,D−Glu,C
H₃Ile,Sar又はβ−Alaを意味し、ＢはOH,Asp−OH,Phe−
OH又はArg−Ｄ−Glu−OHを意味する。但し、ＡがＤ−Le
uでＢがOHであるものは除く。｝で表わされるポリペプチド又は薬理学的に許容できる塩
である。

本発明において、薬理学的に許容できる塩とは、塩
酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸などの無機酸、及
びマレイン酸、フマール酸、コハク酸、酢酸、マロン
酸、クエン酸、安息香酸などの有機酸を挙げることがで
きる。

従って、本発明の目的は、医薬、鎮痛剤として有用な
新規ペプチドを提供するにある。

更に本発明の目的は、医薬として有用な新規ペプチド
を製造する方法を提供するにある。

更に本発明の目的は、新規な鎮痛剤を提供するにあ
る。

本発明化合物は、構成アミノ酸のいずれか一つ以上を
α−Ｎ−メチルアミノ酸若しくはＤ−アミノ酸としたこ
とにより、構成アミノ酸のすべてがＬ−アミノ酸である
ダイノルフィン若しくはその関連誘導体が血中で不安定
なためそのままでは静注で鎮痛作用を示さないという大
きな欠点を解決したもので、本発明化合物は、生体内で
極めて安定であり、鎮痛剤として実用に供しうる価値の
高い化合物である。

本発明のペプチドは任意の好都合な方法で合成するこ
とができる。保護ペプチドの合成は通常の液相法、固相
法のいずれの方法によっても可能である。一般にアミノ
酸の側鎖官能基は保護されている方が好ましく、最終工
程で全保護基の除去が行われる。アミノ酸の側鎖官能基
の保護基としては今までに報告されているすべての保護
基を利用することができるが、代表的なものを例示する
とトシル（Tos）基、ニトロ（NO₂）基、ベンジル（Bz
l）基、第３ブチル（Bu^t）基、ベンジルオキシカルボニ
ル（Ｚ）基、第３ブトキシカルボニル（Boc）基などが
ある。

アミノ酸のα−アミノ保護基としては、今までに報告
されているすべての保護基を利用することができるが、
側鎖官能基の保護基に影響を与えず、α−アミノ保護基
だけを選択的に除去できるように組み合わせることが望
ましい。例えば、α−アミノ保護基として第３ブトキシ
カルボニル基を用いた場合は側鎖官能基の保護基にはベ
ンジル基やベンジルオキシカルボニル基などが都合がよ
く、α−アミノ保護基としてベンジルオキシカルボニル
基を用いた場合には側鎖官能基の保護基には第３ブチル
基や第３ブトキシカルボニル基などの組み合わせが好都
合である。保護ペプチドの合成経路としては、合成中の
ラセミ化を抑えるため、全アミノ酸をＣ未満から１個ず
つつないでいくステップワイズ法かGlyの位置でフラグ
メント縮合を行う方法が好ましいが、フラグメント縮合
を任意の位置で行うことも可能である。

本発明のペプチドは、固相法、液相法のいずれの場合
でもまず次の一般式で示される反応を繰り返すことによ
り得られた保護ペプチドを脱保護、精製することにより
合成される。そこで、液相法の場合を例にして各工程を
次に説明する。

（上記構造式において、X¹,X²はＨ又はアルキル基を、Y
¹,Y²はアミノ酸側鎖を、Ｒ′,R″は保護基又はペプチド
残基をそれぞれ意味する）（１）ペプチド結合の形成反応ペプチド結合の形成方法としては今までに報告されて
いるすべての縮合方法を利用することができる。通常
は、一般式で示される酸コンポーネントのカルボニル基を常法によ
り、例えばアジド法、ジシクロヘキシルカルボジイミド
（DCC）法、混合酸無水物法、活性エステル法などによ
り活性化して、一般式で示されるアミンコンポーネントと反応させる方法がと
られる。この際の反応条件（例えば反応溶媒や反応温度
等）はカルボキシル基の活性化法によって異なる。次に
代表的な縮合法の一つである混合酸無水物法の操作を一
つの例として示す。まず一般式で示される酸コンポーネントをジメチルホルムアミド、
テトラヒドロフラン、酢酸エチル等の非プロトン性溶媒
に溶解し、約−20℃に冷却後、等モルのＮ−メチルモル
ホリンとクロル炭酸エチルを順次加える。５分後に一般
式で示されるアミンコンポーネントを等モル加え、−15〜
０℃で２〜５時間撹拌し、常法に従い処理すると一般式で示される保護ペプチドが得られる。

（２） α−アミノ保護基の除去この反応は接触還元法、酸を使用する方法、塩基を用
いる方法、ヒドラジンを用いる方法等の通常の方法を適
用して行われる。これらの方法のうち、好ましい方法は
α−アミノ保護基の種類によって選択される。代表的な
ものとしては、ベンジルオキシカルボニル基の接触還元
による除去、第３ブトキシカルボニル基のトリフルオロ
酢酸による除去等が挙げられる。次にトリフルオロ酢酸
による第３ブトキシカルボニル基の除去法の例を示す。

一般式で示されるα−Ｎ−ブトキシカルボニルペプチド1gに氷
冷下アニソール0.25mlとトリフルオロ酢酸5mlを加えて6
0分間撹拌後エーテルを加えて処理すると、一般式で示されるペプチドのトリフルオロ酢酸塩が得られる。
これを溶媒に溶かして、トリエチルアミン等のアミンで
中和すると次の反応に使用することができる。

（３）全保護基の除去上記の縮合、α−アミノ保護基の除去を繰り返して、
ペプチドの鎖長を延ばした後全保護基を除去すると目的
とするペプチドの粗成物が得られる。保護基の脱離は、
接触還元法、液体アンモニア−アルカリ金属を用いる方
法、酸を使用する方法、塩基を用いる方法、ヒドラジン
を用いる方法等の通常の方法を適用して行われる。これ
らの方法のうち、好ましい方法は保護基の種類によって
選択される。通常よく使われる方法の一つの例としてフ
ッ化水素（HF）による脱離反応操作を次に示す。

保護ペプチド1gをアニソール0.5ml存在下、密閉系のH
F反応装置内で−15〜０℃にて約30mlのHFに溶かし、60
分撹拌後HFを反応系より留去する。残渣をエーテルで洗
浄後水に溶解し、アンバーライトIRA−93（酢酸型）で
処理し凍結乾燥を行うと保護基が除去されたペプチド粗
成物が得られる。

（４）ペプチド粗成物の精製ペプチド粗成物の精製は、イオン交換クロマトグラフ
ィー、ゲル濾過、分配クロマトグラフィー、向流分配、
高速液体クロマトグラフィー等、通常の方法で行われ
る。次に精製法の一つの例として高速液体クロマトグラ
フィーによる精製法を示す。Nucleosil 5C18を担体とし
た20φ×250mmのカラムに、ペプチド粗成物100mgをチャ
ージし、0.05％HCl（H₂O−CH₃CN）で溶出する。UV 210n
mで検出しながら、目的物ピーク部分を集め、凍結乾燥
すると、目的とする高純度のペプチドが得られる。

次に、本発明化合物の医薬としての効果を詳細に説明
するために、動物実験の結果を示す。

実験例１鎮痛実験雄性ddy系マウス（体重20〜27g）を用い、１群８匹前
後とし、生理食塩水に溶解した試験化合物を静注或いは
皮下注し、経時的に鎮痛作用をtail pinch法により測定
した。

tail pinch法（注１）とはマウスの尾根部を動脈クレ
ンメ（300g定圧）で挟んだ時に誘発されるかみつき反応
（biting response）を指標として反応潜時を測定し
た。この検定法においては、あらかじめ潜時が３秒以内
の動物のみを選び、薬物投与後に潜時が６秒以上延びた
動物を鎮痛陽性と判定した。

ED₅₀値（50％鎮痛作用量）をLitchfield−Wilcoxonの
方法（注２）により算出した。結果を表１及び表２に示
す。表１は静注、表２は皮下注における結果を示す。

表１及び表２において、試験化合物の欄に記載されて
いる数字は、本明細書で後記するそれぞれの実施例にお
いて製造される最終化合物を示す。

（注１）次の文献記載の方法に従った。

Takagi H.,et al;Jap.J.Pharmacol,Vol.16,287〜294（1
966）（注２）次の文献記載の方法に従った。

Litchfield J.T.and F.Wilcoxon;J.Pharmacol,Exp.The
r.,Vol.96,99〜113（1949）実験例２オピオイド活性岡らのウサギ輸精管（RVD）法〔T.Oka,K.Negishi,M.S
uda,T.Matsumiya,T.Inaza,M.Ueki;Europ.J.Pharmacol,V
ol.73,235（1980）〕を用いて、本発明化合物のオピオ
イド活性を調べた。成熟した雄ウサギを耳静脈より空気
を注入して致死させ、直ちに開腹し、左右輸精管を摘出
した。リンゲル液中で管内につまっている精液を押し出
し、前立腺側端より2.5cmずつ、左右各２本切り取っ
た。これらの摘出輸精管の両端に糸をつけて、内容量6m
lの恒温ガラスセルに入れ懸垂した。白金電極を装置し
て電気刺激装置を用いて、0.1Hz,1ms,90Voltの条件で電
気刺激した。電気刺激により収縮はトランスデューサー
を介して記録した。

電気刺激による収縮に対する抑制を指標にオピオイド
活性を測定した。

得られた結果を表２に、50％抑制濃度（IC₅₀）として
示す。

なお、本発明化合物は、モルモット回陽縦走筋或いは
マウス輸精管の電気刺激による収縮に対しても強い抑制
活性を示す。

以上の薬理実験結果から、本発明によって得られるペ
プチド化合物は、ダイノルフィンと同質のオピオイド活
性を有し、その効力は極めて強力であり、且つ静注、皮
下注で著しい鎮痛作用を有することが明らかとなった。

ダイノルフィン及びその関連誘導体が血中で不安定な
ため、静注で鎮痛作用を殆ど示さないのに対し、本発明
化合物が静注や皮下注など全身投与によって強力な鎮痛
効果を示すことは、極めて価値の高いものである。

また、本発明で得られるペプチド化合物のマウス皮下
注での毒性（最小致死量）と有効量の関係について、実
施例１、実施例２及び実施例６の化合物について述べれ
ば以下の表３の如くである。

本発明によって得られたペプチド化合物は、著しい鎮
痛効果を有し、あらゆる医薬としての鎮痛分野に有用で
ある。

本発明化合物を鎮痛剤として使用する場合は、経口投
与若しくは非経口投与により投与されるが、通常は静脈
内、皮下、筋肉内など注射剤、坐薬若しくは舌下錠など
非経口投与により投与される。投与量は、症状の程度；
患者の年令、性別、体重、感受性差；投与方法；投与の
時期・間隔、医薬製剤の性質・調剤・種類；有効成分の
種類などによって異なり、特に限定されないが、通常成
人１日あたり約0.1〜1,000mg、好ましくは約１〜300mg
である。

本発明化合物を製剤化するためには、製剤の技術分野
における通常の方法で注射剤、坐薬、舌下錠、錠剤、カ
プセル剤などの剤型とする。

注射剤を調製する場合には、主薬に必要によるpH調整
剤、緩衝剤、懸濁化剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化
剤、保存剤などを添加し、常法により静脈、皮下、筋肉
内注射剤とする。その際必要により常法により凍結乾燥
物とすることも可能である。

懸濁剤としての例を挙げれば、例えばメチルセルロー
ス、ポリソルベート80、ヒドロキシエチルセルロース、
アラビアゴム、トラガント末、カルボキシメチルセルロ
ースナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノラ
ウレートなどを挙げることができる。

溶解補助剤としては、例えばポリオキシエチレン硬化
ヒマシ油、ポリソルベート80、ニコチン酸アミド、ポチ
オシキエチレンソルビタンモノウラレート、マグロゴー
ル、ヒマシ油脂肪酸エチルエステルなどを挙げることが
できる。

また安定化剤としては、例えば、亜硫酸ナトリウム、
メタ亜硫酸ナトリウム、エーテル等が、保存剤として
は、例えばパラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息
香酸エチル、ソルビン酸、フェノール、クレゾール、ク
ロロクレゾールなどを挙げることができる。

次に本発明の代表的な実施例を掲げるが、本発明がこ
れらのみに限定されることがないことはいうまでもな
い。

実施例１ CH₃Tyr−Gly−Gly−Phe−Leu−Arg−CH₃Arg−Ｄ−Ala−
OHの合成１）Ｚ−CH₃Arg（Tos）−Ｄ−Ala−OBu^tの合成Ｚ−CH₃Arg（Tos）OH 3.336gをテトラヒドロフラン20
mlに溶解し、−30℃に冷却後、Ｎ−メチルモルホリン0.
77mlとクロル炭酸エチル0.669mlを加える。５分後、HCl
・Ｈ−Ｄ−Ala−OBu^t1.272gとＮ−メチルモルホリン1.1
6mlのテトラヒドロフラン（20ml）溶液を加えて約−５
℃で２時間撹拌する。濃縮後、残渣を酢酸エチルに溶解
し、NaHCO₃水、水で順次洗浄し、濃縮乾固するとガラス
状のＺ−CH₃Arg（Tos）−Ｄ−Ala−OBu^t4.16gが得られ
る。

TLC:Rf値0.69（メタノール：クロロホルム、1:7）旋光度：〔α〕_Ｄ＝−15.5゜（ｃ＝１、メタノール）元素分析値:C₂₉H₄₁N₅O₇SとしてＣＨＮ理論値（％） 57.70 6.85 11.60 実測値（％） 57.54 6.59 11.31 ２）Ｚ−Arg（Tos）−CH₃Arg（Tos）−Ｄ−Ala−OBu^t
の合成Ｚ−CH₃Arg（Tos）−Ｄ−Ala−OBu^tをPd−Ｃの存在下
接触還元して得たCH₃Arg（Tos）−Ｄ−Ala−OBu^t2.87
g、Ｚ−Arg（Tos）−OH 3.392g、Ｎ−ヒドロキシベンゾ
トリアゾール1.188gをジメチルホルムアミド10mlに溶解
する。氷冷下ジシクロヘキシルカルボジイミド1.662gを
加え、冷蔵室で２日間撹拌する。沈澱を濾別後濃縮し、
残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（メタノー
ル／クロロホルム＝1/20で溶出）で精製することによ
り、ガラス状のＺ−Arg（Tos）−CH₃Arg（Tos）−Ｄ−A
la−OBu^t2.04gが得られる。

TLC:Rf値0.57（メタノール：クロロホルム、1:7）旋光度：〔α〕_Ｄ＝−31.6゜（ｃ＝１、メタノール）元素分析値:C₄₂H₅₉N₉O₁₀S₂・1/2 H₂OとしてＣＨＮ理論値（％） 54.65 6.62 13.66 実測値（％） 54.64 6.48 13.72 ３）Ｚ−Leu−Arg（Tos）−CH₃Arg（Tos）−Ｄ−Ala
−OBu^tの合成Ｚ−Leu−OH 0.629gをジメチルホルムアミド15mlに溶
解し、−20℃に冷却後Ｎ−メチルモルホリン0.261mlと
クロル炭酸エチル0.227mlを加える。５分後、HCl・Ｈ−
Arg（Tos）−CH₃Arg（Tos）−Ｄ−Ala−OBu^t〔Ｚ−Arg
（Tos）−CH₃Arg（Tos）−Ｄ−Ala−OBu^tをPd−Ｃの存
在下接触還元して合成したもの〕1.76gとＮ−メチルモ
ルホリン0.356mlのジメチルホルムアミド（15ml）溶液
を加えて約−５℃で２時間撹拌する。濃縮後、残渣を酢
酸エチルに溶解し、NaHCO₃水、水で順次洗浄し、濃縮乾
固するとガラス状のＺ−Leu−Arg（Tos）−CH₃Arg（To
s）−Ｄ−Ala−OBu^t2.11gが得られる。

TLC:Rf値0.57（メタノール：クロロホルム、1:7）旋光度：〔α〕_Ｄ＝−36.2゜（ｃ＝１、メタノール）元素分析値:C₄₈H₇₀N₁₀O₁₁S₂・1/2 CH₃COOC₂H₅としてＣＨＮ理論値（％） 56.06 6.96 13.07 実測値（％） 56.02 6.85 13.08 ４）Ｚ−Phe−Leu−Arg（Tos）−CH₃Arg（Tos）−Ｄ
−Ala−OBu^tの合成Ｚ−Phe−OH595mgをジメチルホルムアミド15mlに溶解
し、−20℃に冷却後Ｎ−メチルモルホリン0.219mlとク
ロル炭酸エチル0.190mlを加える。５分後HCl・Ｈ−Leu
−Arg（Tos）−CH₃Arg（Tos）−Ｄ−Ala−OBu^t〔Ｚ−Le
u−Arg（Tos）−CH₃Arg（Tos）−Ｄ−Ala−OBu^tをPd−
Ｃ存在下接触還元して合成したもの〕1.68gとＮ−メチ
ルモルホリン0.299mlのジメチルホルムアミド（15ml）
溶液を加えて約−５℃で２時間撹拌する。濃縮後、残渣
を酢酸エチルに溶解し、NaHCO₃水、水で順次洗浄する。
溶媒を留去後エーテルを加えてデカントし、濃縮乾固す
るとガラス状のＺ−Phe−Leu−Arg（Tos）−CH₃Arg（To
s）−Ｄ−Ala−OBu^t1.87gが得られる。

TLC:Rf値0.61（メタノール：クロロホルム、1:7）旋光度：〔α〕_Ｄ＝−34.7゜（ｃ＝１、メタノール）元素分析値:C₅₇H₇₉N₁₁O₁₂S₂・C₂H₅OC₂H₅としてＣＨＮ理論値（％） 58.68 7.19 12.34 実測値（％） 58.66 6.83 12.42 ５） Boc−CH₃Tyr（Cl₂Bzl）−Gly−Gly−Phe−Leu−A
rg（Tos）−CH₃Arg（Tos）−Ｄ−Ala−OBu^tの合成 Boc−CH₃Tyr（Cl₂Bzl）−Gly−Gly−OH 969mgをジメ
チルホルムアミド12mlに溶解し、−20℃に冷却後、Ｎ−
メチルモルホリン0.188mlとクロル炭酸エチル0.163mlを
加える。５分後、HCl・Ｈ−Phe−Leu−Arg（Tos）−CH₃
Arg（Tos）−Ｄ−Ala−OBu^t〔Ｚ−Phe−Leu−Arg（To
s）−CH₃Arg（Tos）−Ｄ−Ala−OBu^tをPd−Ｃの存在下
接触還元して合成したもの〕1.67gとＮ−メチルモルホ
リン0.256mlのジメチルホルムアミド（15ml）溶液を加
え、約−５℃で２時間撹拌する。濃縮後、残渣を酢酸エ
チルに溶解し、NaHCO₃水、水で順次洗浄する。溶媒を減
圧留去後、残渣をメタノール−エーテルで固化させる
と、Boc−CH₃Tyr（Cl₂Bzl）−Gly−Gly−Phe−Leu−Arg
（Tos）−CH₃Arg（Tos）−Ｄ−Ala−OBu^t2.196gが得ら
れる。

融点:130〜135℃（dec） TLC:Rf値0.61（メタノール：クロロホルム、1:7）旋光度：〔α〕_Ｄ＝−40.7゜（ｃ＝１、メタノール）元素分析値:C₇₅H₁₀₂N₁₄O₁₆S₂Cl₂・2CH₃OHとしてＣＨＮ理論値（％） 55.89 6.70 11.85 実測値（％） 55.95 6.42 11.78 ６） CH₃Tyr−Gly−Gly−Phe−Leu−Arg−CH₃Arg−Ｄ
−Ala−OHの合成 Boc−CH₃Tyr（Cl₂Bzl）−Gly−Gly−Phe−Leu−Arg
（Tos）−CH₃Arg（Tos）−Ｄ−Ala−OBu^t200mgをアニソ
ール0.2ml存在下密閉系のフッ化水素（HF）反応装置内
で−５℃にてHF10mlに溶かし、１時間撹拌後HFを反応系
より留去する。残渣をエーテルで洗浄した後、水に溶解
し、アンバーライトIRA−93（酢酸型）で処理、凍結乾
燥する。凍結乾燥した粗ペプチド120mgを高速液体クロ
マトグラフィー〔Nucleosil5C18、２φ×25cm、0.05％H
Cl（H₂O−CH₃CN、92:8）で溶出〕で精製し、凍結乾燥す
るとCH₃Tyr−Gly−Gly−Phe−Leu−Arg−CH₃Arg−Ｄ−A
la−OH 60mgが得られる。

TLC:Rf値0.54（ブタノール：酢酸：ピリジン：水＝15:
5:5:8）旋光度：〔α〕_D ²⁰＝−35.1゜（ｃ＝0.4,0.01N−HCl）質量分析（FAB）:967（〔Ｍ＋Ｈ〕^＋）アミノ酸分析： Gly1.95（２）,Leu1.00（１）,Phe1.00（１）,Arg0.99
（１）,Ala1.01（１）（CH₃Tyr,CH₃Argのピークは計算していない）実施例２ CH₃Tyr−Gly−Gly−Phe−Leu−Arg−CH₃Arg−CH₃Ala−O
Hの合成１）Ｚ−CH₃Arg（Tos）−CH₃Ala−OBu^tの合成Ｚ−CH₃Arg（Tos）OH4.508g、HCl・CH₃Ala−OBu^t1.68
3g、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール1.533gとＮ−メ
チルモルホリン1.04mlをジメチルホルムアミド10mlに溶
解する。氷冷下ジシクロヘキシルカルボジイミド2.144g
を加え冷蔵室で一夜撹拌する。沈澱を濾別後濃縮し、残
渣を酢酸エチルに溶解し、クエン酸水、NaHCO₃水、水で
順次洗浄する。濃縮乾固するとガラス状のＺ−CH₃Arg
（Tos）−CH₃Ala−OBu^t4.24gが得られる。

TLC:Rf値0.61（メタノール：クロロホルム、1:7）旋光度：〔α〕_Ｄ＝−57.8゜（ｃ＝１、メタノール）元素分析値:C₃₀H₄₃N₅O₇SとしてＣＨＮ理論値（％） 58.33 7.02 11.33 実測値（％） 58.11 6.88 11.41 ２）Ｚ−Arg（Tos）−CH₃Arg（Tos）−CH₃Ala−OBu^t
の合成Ｚ−CH₃Arg（Tos）−CH₃Ala−OBu^tをPd−Ｃの存在
下、接触還元して得たCH₃Arg（Tos）−CH₃Ala−OBu^t2.9
0g、Ｚ−Arg（Tos）OH3.329g、Ｎ−ヒドロキシベンゾト
リアゾール1.166gをジメチルホルムアミド10mlに溶解す
る。氷冷下ジシクロヘキシルカルボジイミド1.359gを加
え、冷蔵室で２日間撹拌する。沈澱を濾別後濃縮し、残
渣をシリカゲルカラマクロマトグラフィー（MeOH/CHCl₃
＝1/15で溶出）で精製することにより、ガラス状のＺ−
Arg（Tos）−CH₃Arg（Tos）−CH₃Ala−OBu^t2.1gが得ら
れる。

TLC:Rf値0.46（メタノール：クロロホルム、1:7）旋光度：〔α〕_Ｄ＝−57.1゜（ｃ＝１、メタノール）元素分析値:C₄₃H₆₁N₉O₁₀S₂・3/2 H₂OとしてＣＨＮ理論値（％） 54.07 6.75 13.20 実測値（％） 54.10 6.35 13.18 ３）Ｚ−Leu−Arg（Tos）−CH₃Arg（Tos）−CH₃Ala−
OBu^tの合成Ｚ−Leu−OH247mgをジメチルホルムアミド10mlに溶解
し、−20℃に冷却後Ｎ−メチルモルホリン0.102mlとク
ロル炭酸エチル0.089mlを加える。５分後、HCl・Ｈ−Ar
g（Tos）−CH₃Arg（Tos）−CH₃Ala−OBu^t〔Ｚ−Arg（To
s）−CH₃Arg（Tos）−CH₃Ala−OBu^tをPd−Ｃ存在下接触
還元して合成したもの〕700mgとＮ−メチルモルホリン
0.139mlのジメチルホルムアミド（10ml）溶液を加えて
約−５℃で２時間撹拌する。濃縮後、残渣を酢酸エチル
に溶解し、NaHCO₃水、水で順次洗浄する。溶媒を留去後
エーテルを加えてデカントし、濃縮乾固するとガラス状
のＺ−Leu−Arg（Tos）−CH₃Arg（Tos）−CH₃Ala−OBu^t
0.86gが得られる。

TLC:Rf値0.48（メタノール：クロロホルム、1:7）旋光度：〔α〕_Ｄ＝−60.3゜（ｃ＝１、メタノール）元素分析値:C₄₉H₇₂N₁₀O₁₁S₂・C₂H₅OC₂H₅としてＣＨＮ理論値（％） 57.07 7.41 12.55 実測値（％） 56.83 7.02 12.64 ４）Ｚ−Phe−Leu−Arg（Tos）−CH₃Arg（Tos）−CH₃
Ala−OBu^tの合成Ｚ−Phe−OH224mgをジメチルホルムアミド7mlに溶解
し、−20℃に冷却後Ｎ−メチルモルホリン0.082mlとク
ロル炭酸エチル0.071mlを加える。５分後、HCl・Ｈ−Le
u−Arg（Tos）−CH₃Arg（Tos）−CH₃Ala−OBu^t〔Ｚ−Le
u−Arg（Tos）−CH₃Arg（Tos）−CH₃Ala−OBu^tをPd−Ｃ
存在下接触還元して合成したもの〕640mgとＮ−メチル
モルホリン0.112mlのジメチルホルムアミド（7ml）溶液
を加えて、約−５℃で２時間撹拌する。濃縮後、残渣を
酢酸エチルに溶解し、NaHCO₃水、水で順次洗浄する。溶
媒を留去後エーテルを加えてデカントし、濃縮乾固する
とガラス状のＺ−Phe−Leu−Arg（Tos）−CH₃Arg（To
s）−CH₃Ala−OBu^t770mgが得られる。

TLC:Rf値0.54（メタノール：クロロホルム、1:7）旋光度：〔α〕_Ｄ＝−59.6゜（ｃ＝１、メタノール）元素分析値:C₅₈H₈₁N₁₁O₁₂S₂・C₂H₅OC₂H₅としてＣＨＮ理論値（％） 58.98 7.26 12.20 実測値（％） 58.68 6.91 12.24 ５） Boc−CH₃Tyr（Cl₂Bzl）−Gly−Gly−Phe−Leu−A
rg（Tos）−CH₃Arg（Tos）−CH₃Ala−OBu^tの合成 Boc−CH₃Tyr（Cl₂Bzl）−Gly−Gly−OH350mgをジメチ
ルホルムアミド5mlに溶解し、−20℃に冷却後Ｎ−メチ
ルモルホリン0.068mlとクロル炭酸エチル0.059mlを加え
る。５分後HCl・Ｈ−Phe−Leu−Arg（Tos）−CH₃Arg（T
os）−CH₃Ala−OBu^t〔Ｚ−Phe−Leu−Arg（Tos）−CH₃A
rg（Tos）−CH₃Ala−OBu^tをPd−Ｃ存在下接触還元して
合成したもの〕610mgとＮ−メチルモルホリン0.092mlの
ジメチルホルムアミド（6ml）溶液を加えて約−５℃で
２時間撹拌する。濃縮後、残渣を酢酸エチルに溶解し、
NaHCO₃水、水で順次洗浄する。濃縮後メタノール−エー
テルで固化させるとBoc−CH₃Tyr（Cl₂Bzl）−Gly−Gly
−Phe−Leu−Arg（Tos）−CH₃Arg（Tos）−CH₃Ala−OBu
^t760mgが得られる。

融点:125〜133℃（dec） TLC:Rf値0.55（メタノール：クロロホルム、1:7）旋光度：〔α〕_Ｄ＝−56.4゜（ｃ＝１、メタノール）元素分析値:C₇₆H₁₀₄N₁₄O₁₆S₂Cl₂・1/2 C₂H₅OC₂H₅としてＣＨＮ理論値（％） 57.06 6.69 11.94 実測値（％） 56.71 6.46 11.49 ６） CH₃Tyr−Gly−Gly−Phe−Leu−Arg−CH₃Arg−CH₃
Ala−OHの合成 Boc−CH₃Tyr（Cl₂Bzl）−Gly−Gly−Phe−Leu−Arg
（Tos）−CH₃Arg（Tos）−CH₃Ala−OBu^t210mgをアニソ
ール0.2mlの存在下密閉系のフッ化水素（HF）反応装置
内で−５℃にてHF10mlに溶かし、１時間撹拌後HFを反応
系より留去する。残渣をエーテルで洗浄した後、水に溶
解し、アンバーライトIRA−93（酢酸型）で処理、凍結
乾燥する。凍結乾燥した粗ペプチド130mgを高速液体ク
ロマトグラフィー〔Nucleosil 5C18、２φ×25cm、0.05
％HCl（H₂O−CH₃CN、91:9）で溶出〕で精製し、凍結乾
燥するとCH₃Tyr−Gly−Gly−Phe−Leu−Arg−CH₃Arg−C
H₃Ala−OH50mgが得られる。

TLC:Rf値0.54（ブタノール：酢酸：ピリジン：水＝15:
5:5:8）旋光度：〔α〕_D ²⁰＝−64.7゜（ｃ＝0.4,0.01N−HCl）質量分析（FAB）:981〔Ｍ＋Ｈ〕^＋）アミノ酸分析： Gly1.92（２）,Leu1.04（１）,Phe1.00（１）,Arg0.986
（１）（CH₃Tyr,CH₃Arg,CH₃Alaのピークは計算していない）実施例３〜11 実施例１、２と同様に通常の液相法で表４の化合物を
合成した。即ち、ダイノルフィンの１−３位（Tyr−Gly
−Gly）の誘導体、４−８位（Phe−Leu−Arg−Arg−Il
e）の誘導体、４−９位（Phe−Leu−Arg−Arg−Ile−Ar
g）の誘導体、４−10位（Phe−Leu−Arg−Arg−Ile−Ar
g−Pro）の誘導体をまず各ペプチドのＣ未端から順にス
テップワイズ法で合成し、次に１−３位の誘導体と４−
８、４−９、４−10位の誘導体をDCC−HOBt法又は混合
酸無水物法で縮合した後、フッ化水素（HF）で全保護基
を除去し、逆相系の担体を用いたプレパラティブ高速液
体クロマトグラフィーで精製した。各保護ペプチドの合
成経路の概要を図式１〜３に示す。

得られた目的物質であるペプチドの旋光度
〔α〕_D ²⁰、TLC Rf値及びアミノ酸分析結果を表５に示
す。

アミノ酸分析では、Gly,Leu,Phe,Arg,Ile,Asp,Gluの
アミノ酸についてだけその構成比を分析した。

〔α〕_D ²⁰の測定;C＝0.4,0.01N−HCl TLC・Rf値の測定；ブタノール：酢酸：ピリジン：水＝1
5:5:5:8

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者荒木伸茨城県筑波郡谷田部町春日４―19―13 紫山寮 (72)発明者山津清實鎌倉市今泉台７−23―７ (72)発明者橘真郎柏市布施新町４−７―10 (72)発明者荒川義弘茨城県新治郡桜村梅園２―33―８ (56)参考文献特開昭60−36499（ＪＰ，Ａ) 特開昭59−141547（ＪＰ，Ａ) 特開昭59−141546（ＪＰ，Ａ) 特開昭59−25365（ＪＰ，Ａ) 特開昭58−118550（ＪＰ，Ａ) 特開昭57−134451（ＪＰ，Ａ) 特開昭56−81550（ＪＰ，Ａ) 特開昭61−115097（ＪＰ，Ａ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】次の一般式｛式中、ＡはＤ−Ala,CH₃Ala,Ile,Asp,D−Leu,D−Glu,C
H₃Ile,Sar又はβ−Alaを意味し、ＢはOH,Asp−OH,Phe−
OH又はArg−Ｄ−Glu−OHを意味する。但し、ＡがＤ−Le
uでＢがOHであるものは除く。｝で表わされるポリペプチド又は薬理学的に許容できる
塩。
【請求項２】次の一般式｛式中、ＡはＤ−Ala,CH₃Ala,Ile,Asp,D−Leu,D−Glu,C
H₃Ile,Sar又はβ−Alaを意味し、ＢはOH,Asp−OH,Phe−
OH又はArg−Ｄ−Glu−OHを意味する。但し、ＡがＤ−Le
uでＢがOHであるものは除く。｝で表わされるポリペプチドの保護体を製造し、次いでこ
れを脱保護し、上記の構造式で示されるポリペプチドを
得、必要により常法により薬理学的に許容できる塩とす
ることを特徴とする上記構造を有するポリペプチド又は
その薬理学的に許容できる塩の製造方法。
【請求項３】次の一般式｛式中、ＡはＤ−Ala,CH₃Ala,Ile,Asp,D−Leu,D−Glu,C
H₃Ile,Sar又はβ−Alaを意味し、ＢはOH,Asp−OH,Phe−
OH又はArg−Ｄ−Glu−OHを意味する。但し、ＡがＤ−Le
uでＢがOHであるものは除く。｝で表わされるポリペプチド又は薬理学的に許容できる塩
を有効成分とする鎮痛剤。