JP2949129B2 - 胃腸運動刺激活性を有するモチリン類似ポリペプチド - Google Patents
胃腸運動刺激活性を有するモチリン類似ポリペプチドInfo
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Description
麻痺性腸閉塞、及び術後性腸閉塞等の胃腸運動活性の基
礎レベルの低下を特徴とする症状の治療に有用な、有効
な胃腸運動刺激活性及び高い代謝安定性を有する新規な
ポリペプチドに関する。
を刺激する、胃腸線状ポリペプチドホルモンである。モ
チリンの効果は完全には知られていないが、胃の運動性
を高め、ペプシン放出を刺激する役割を果たし、また更
に消化間(interdigestive)筋電気性複合体の調節におい
ても重要であると考えられる。ヒトモチリンは未だ精製
されていないが、その免疫特性からブタモチリンに非常
に類似することが強く示唆される。ブタモチリンは22の
アミノ酸残基を含み、次式で表される: 10 H-Phe-Val-Pro-Ile-Phe-Thr-Tyr-Gly-Glu-Leu-Gln-Arg-Met-Gln-Glu-Lys-Glu-Ar 20 g-Asn-Lys-Gly-Gln-OH ブタモチリンは位置1〜5に疎水性領域を、位置11〜22
に親水性領域を、及び位置6〜10に連結領域を有する。
ブタモチリンはまた、一次配列の残基9〜20にαヘリッ
クス二次構造を有する(カーンら、Biochemistry 29, 5
743-5751 (1990))。健康な被験者に対してモチリンを投
与すると、腸過渡時間が加速し、胃内容排出が増進され
る。試験管内(in vitro)では、モチリンは、ヒト及びウ
サギの十二指腸平滑筋細片及び単離した胃腸平滑筋細胞
の収縮を刺激する。更に、モチリン及びいくつかのモチ
リン誘導体は、放射線標識したモチリンとヒト及びウサ
ギ腔細胞上の結合部について競合し、このことは、胃腸
管中の特定の受容体の刺激がホルモンの生理学的効果の
原因となることを示唆している。モチリンの注入により
糖尿病性胃不全麻痺患者の固体及び液体の内容排出が刺
激されることが報告されている(ピータースら、Gastro
enterology 100, A480 (1991))。更に、モチリンは、胃
腸管の癌により引き起こされる麻痺性イレウスを患う患
者の治療に使用されている(メイヤーら、Med. Klin. 8
6, 515-517 (1991))。モチリンに関する最大の問題点
は、その半減期(t1/2)が人体中では4.5 分と比較的短い
ことにある(クリストフィデスら、Gastroenterology 7
6, 903-907 (1979) )。半減期が短いことにより、治療
効果をもたらすためには該ホルモンを連続注入により投
与することが必要となる。モチリンの中央部のN-末端ア
ミノ酸配列及び特定の残基が、収縮作用には必須である
(マシーラグら、Peptides 13, 565-569;ピータース
ら、Peptides 13, 1103-1107 (1992) ;ポイトラスら、
Biochem. Biophys. Res. Commun. 183, 36-40 (1992))
。更に短いC-末端を有し、位置12に結合した3〜5個
の塩基性アミノ酸を含み、かつ位置1〜11に様々なアミ
ノ酸置換を有するモチリン類似ポリペプチドが、モチリ
ンよりも低いか又は同等の活性を有することが報告され
ている。代謝安定性を増進するモチリン類似ポリペプチ
ドについての報告はない(日本国特許第2-311,495 )。
従って、有効な胃腸運動刺激活性及び高い代謝安定性を
有するモチリン類似ポリペプチドは、胃腸運動活性の基
礎レベルの低下の治療に有用であることが考えられる。
性な異性体構造を含む胃腸運動刺激活性を有するポリペ
プチドであって、次の一般式:
ミノ酸のL-構造異性体であり;B はL-プロリン又はL-ア
ラニンであり;D は親油性の脂肪族又は脂環式アミノ酸
のL-構造異性体であり;E は芳香族、親油性の脂肪族又
は脂環式アミノ酸のL-構造異性体であり;F は芳香族又
は複素芳香族アミノ酸のL-構造異性体であり;G はグリ
シン又はD-アラニンであり;H はL-グルタミン酸又はL-
グルタミンであり;I はL-グルタミン、L-グルタミン
酸、又はL-アラニンであり;J はI と-NH-基との間の直
接結合であるか、又はZ 、Z-Leu 、Z-Leu-Gln 、Z-Leu-
Gln-Glu 、Z-Leu-Gln-Glu-Lys 、Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Gl
u 、Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg 、Z-Leu-Gln-Glu-Lys-
Glu-Arg-Asn 、Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn-Lys 、
及びZ-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn-Lys-Gly (但しZ
はアルギニン、D-アルギニン、D-ホモアルギニン、D-リ
シン、D-オルニチン、D-2,4-ジアミノ酪酸、D-グルタミ
ン、D-アスパラギン、及びD-アラニンからなる群から選
ばれる)からなる群から選ばれ;R1は低級アルキル又は
アリルであり;R2は水素、低級アルキル、プロパルギ
ル、及びアリルからなる群から選ばれ;R3は水素、低級
アルキル、及びアリルからなる群から選ばれ;R4は低級
アルキル、シクロアルキル、置換又は未置換アリール、
及びヘテロアリール(但し、該アリール基はハロゲン、
水酸基、及び低級アルコキシ基からなる群から選ばれる
1種以上の置換基で置換されていてもよい)からなる群
から選ばれ;R5は-CO2CONH2 、1〜3個の炭素原子を含
むアミノアルキル基、及び2〜3個の炭素原子を含むグ
アニジノアルキル基からなる群から選ばれ;R6は-COOH
又は-CONH2であり;及びm は0又は1であり、記号* は
D 又はL 配置にあってよい不斉炭素原子を表し、各低級
アルキル基は1〜4個の炭素原子を含むが、次の条件に
従う: (a) m が0、R2及びR3が水素、かつJ が直接結合である
場合、-NH-* CH(CH2R5)R6 基はD-配置であり; (b) J がZ-Leu 又はZ-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn-Ly
s-Gly の場合にのみR5は-CO2CONH2 であり、 (c) m =0、R2及びR3が水素、かつJ がZ 、Z-Leu 、Z-
Leu-Gln 、Z-Leu-Gln-Glu 、Z-Leu-Gln-Glu-Lys 、Z-Le
u-Gln-Glu-Lys-Glu 、Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg 、Z-
Leu-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn 、Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Gl
u-Arg-Asn-Lys 、及びZ-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn-
Lys-Gly である場合、Z はD-配置であり;及び (d) 該ポリペプチドはモチリン以外のものである)で表
される前記ポリペプチド又はその薬学上許容されうる酸
付加塩に関する。
チドは、高い親和性をもってモチリン受容体と結合し、
胃腸細胞に対してモチリンのような蠕動的効果をもたら
す。該新規ペプチドはまた、関連器官細胞ホモジェネー
ト中の生物分解に対する高い安定性を示すことから、生
体内で更に有効なプロキネティック(prokinetic)剤で
ある。該モチリン類似ポリペプチドは、位置13にメチオ
ニンの代わりに化学的に更に安定なロイシン残基を含
み、位置12にL-アルギニンの代わりに更に有効で安定な
D-アルギニン残基を含み、かつ位置1に生物分解に対し
高い安定性を有するアルキル化フェニルアラニン残基を
含む。従って、本発明のポリペプチドは、糖尿病性胃不
全麻痺、麻痺性腸閉塞、及び術後性腸閉塞等の胃腸運動
活性の基礎レベルの低下を特徴とする症状の治療に有用
である。本発明は、胃腸運動刺激活性を有し得る新規な
ポリペプチドに関し、並びに哺乳動物、好ましくはヒト
における胃腸運動活性の基礎レベルの低下の症状の治療
方法に関する。該方法は、前記のような症状を緩和する
治療に有効な量の、次の一般式(1) :
性な異性体構造及び薬学上許容されうる酸付加塩を含
む)の、哺乳動物への投与を含む。式(1) において、m
は0又は1の整数であり、記号* はD 又はL 配置にあっ
てよい不斉炭素原子を表し、各低級アルキル基は1〜4
個の炭素原子を含むが、次の条件に従う:(a) m が0、
R2及びR3が水素、かつJ が直接結合である場合、-NH-*
CH(CH2R5)R6 基はD-配置であり;(b) J がZ-Leu 又はZ-
Leu-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn-Lys-Gly の場合にのみR5
は-CO2CONH2 であり、(c) m =0、R2及びR3が水素、か
つJ がZ 、Z-Leu 、Z-Leu-Gln 、Z-Leu-Gln-Glu 、Z-Le
u-Gln-Glu-Lys 、Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu 、Z-Leu-Gln-
Glu-Lys-Glu-Arg 、Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn 、
Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn-Lys 、及びZ-Leu-Gln-
Glu-Lys-Glu-Arg-Asn-Lys-Gly である場合、Z はD-配置
であり;及び(d) 該ポリペプチドはモチリン以外のもの
である。A 〜J 及びR1〜R6の基は、以下の記載の通り定
義する。式(1) で定義される本発明の新規化合物はアミ
ノ酸長さが12〜22、好ましくはアミノ酸長さが12、14、
16、18、20又は22であってよいポリペプチドである。該
新規ポリペプチドの成分アミノ酸の立体化学が、本発明
の本質的な特徴である。L 又はD であってよい位置1
(アミノ末端アミノ酸、(R1)m (R2)(R3)N-* CH(CH2R4)C
O-)、グリシン又はD-アラニンであってよい位置8(G
基)、L 又はD であってよい位置12、及びL 又はD であ
ってよいC-末端アミノ酸位置、-NH * CH(CH2R5)-R6を除
いて、他に示さない限り、各アミノ酸の絶対的立体化学
はL である。本願明細書を通して用いられる略語を下記
の通り定義する: Phe −フェニルアラニン Tyr −チロシン Nle −ノルロイシン Leu −ロイシン Cha −β- シクロヘキシルアラニン Val −バリン Ile −イソロイシン Gly −グリシン Ala −アラニン Glu −グルタミン酸 Gln −グルタミン Arg −アルギニン h-Arg −ホモアルギニン Orn −オルニチン Dab −2,4-ジアミノ酪酸 Lys −リシン Asn −アスパラギン Me−メチル Boc −t-ブチルオキシカルボニル Cbz −ベンジルオキシカルボニル Dhbt−3,4-ジヒドロ-4- オキソベンゾトリアジン-3- イ
ル Fmoc−フルオレニルメチルオキシカルボニル Mbh −4,4'- ジメトキシベンズヒドリル Mtr −4-メトキシ-2,3,6- トリメチルベンゼンスルホニ
ル Pfp −ペンタフルオロフェニル Trt −トリチル Bop −ベンゾトリアゾリルオキシ- トリスジメチルアミ
ノホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート DCC −N,N'- ジシクロヘキシルカルボジイミド DCM −ジクロロメタン DIC −ジイソプロピルカルボジイミド DIEA−ジイソプロピルエチルアミン EDCC−N-ジエチルアミノプロピル-N'-シクロヘキシルカ
ルボジイミド HBTU−2-(1H-ベンゾトリアゾール-1- イル)-1,1,3,3-テ
トラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート HEPES −(N-[2-ヒドロキシエチル] ピペラジン-N'-[2-
エタンスルホン酸]) HMPA−ヒドロキシメチルフェノキシアセトキシ HOBt−1-ヒドロキシベンゾトリアゾール MBHA−4-メチルベンズヒドリルアミノ PAM −ヒドロキシメチルフェニルアセトアミドメチル PyBrOP−ブロモ- トリス- ピロリジノ- ホスホニウム
ヘキサフルオロホスフェート DMF −N,N-ジメチルホルムアミド NMM −N-メチルモルホリン NMP −N-メチルピロリジノン TCA −トリクロロ酢酸 TEA −トリエチルアミン TFA −トリフルオロ酢酸 TFMSA −トリフルオロメタンスルホン酸
(R1)m(R2)(R3)N- * CH(CH2R4)CO-は、L 又はD 配置をと
りうる。R1は低級アルキル又はアリルであり;R2は水
素、低級アルキル、プロパルギル、及びアリルからなる
群から選ばれてよく;R3は水素、低級アルキル、及びア
リルからなる群から選ばれてよい。“低級アルキル”と
いう用語は、ここでは1〜4個の炭素原子を含む直鎖又
は枝分かれ鎖の炭化水素基を意味する。R1、R2及びR3に
適切な低級アルキル基の例としてはメチル、エチル、プ
ロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、及びsec-
ブチルがあり、メチルが好ましい。整数m は0又は1で
あり、好ましくは0である。m が0の場合、前記アミノ
残基はR2及びR3が水素である第一アミンであってよい。
該アミノ残基は、1〜4個の炭素原子を有する低級アル
キル基、好ましくはメチル又はエチルを、各々1、2又
は3個有する第二アミン、第三アミン、又は第四アンモ
ニウム塩(m は1)であってもよい。該アミノ残基は更
に、1個のプロパルギル基で置換されて、例えばN-プロ
パルギル、N-メチル-N- プロパルギル、N,N-ジメチル-N
- プロパルギルとなってもよく、又は3個以下のアリル
基で置換されてもよい。好ましくは、該アミノ末端アミ
ノ酸はN-置換されたものであり、好ましい置換基は3個
のメチル基である。R4は低級アルキル、シクロアルキ
ル、置換又は未置換アリール、及びヘテロアリール(但
し、該アリール基はハロゲン、水酸基、及び低級アルコ
キシ基からなる群から選ばれる1種以上の置換基で置換
されていてもよい)からなる群から選ばれる。好ましい
置換及び未置換アリール基はフェニル、p-フルオロフェ
ニル、p-クロロフェニル、p-ブロモフェニル、p-ヨード
フェニル、p-ヒドロキシフェニル、p-メトキシフェニ
ル、1-ナフチル、及び2-ナフチルである。好ましいヘテ
ロアリール基は3-インドリル、2-チエニル、及び3-ピリ
ジルである。好ましいシクロアルキル基はシクロペンチ
ル、シクロヘキシル、及びシクロヘプチルである。好ま
しくは、R4はメチル、エチル、n-プロピル、イソプロピ
ル、n-ブチル、シクロヘキシル、フェニル、p-フルオロ
フェニル、p-クロロフェニル、p-ブロモフェニル、p-ヨ
ードフェニル、p-ヒドロキシフェニル、p-メトキシフェ
ニル、1-ナフチル、2-ナフチル、3-インドリル、2-チエ
ニル、及び3-ピリジルからなる群から選ばれる。更に好
ましくは、R4はフェニル及びシクロヘキシルからなる群
から選ばれる。(R1)m(R2)(R3)N- * CH(CH2R4)CO-を誘導
しうるアミノ酸残基の例としては、フェニルアラニン、
p-フルオロフェニルアラニン、p-クロロフェニルアラニ
ン、p-ブロモフェニルアラニン、p-ヨードフェニルアラ
ニン、チロシン、p-メトキシフェニルアラニン、1-ナフ
チルアラニン、2-ナフチルアラニン、トリプトファン、
β-2- チエニルアラニン、β-3- ピリジルアラニン、α
- アミノ酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、ロイシン、
及びシクロヘキシルアラニンがある。高レベルの胃腸の
蠕動性活性を有する化合物については、好ましいアミノ
末端アミノ酸はL-フェニルアラニン、D-フェニルアラニ
ン、L-シクロヘキシルアラニン、及びD-シクロヘキシル
アラニンである。
は脂環式アミノ酸のL-構造異性体であるアミノ酸であ
る。L-親油性脂肪族及び脂環式アミノ酸の例としては、
L-バリン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-ノルバリ
ン、L-ノルロイシン、及びL-シクロヘキシルアラニンが
ある。好ましいA 基アミノ酸は、L-バリン、L-ロイシ
ン、及びL-イソロイシンである。位置3、B 基 前記ポリペプチドの位置3のB 基は、L-プロリン又はL-
アラニンであるアミノ酸である。高レベルのモチリン受
容体拮抗体活性を有する化合物については、好ましいB
基アミノ酸はL-プロリンである。
は脂環式アミノ酸のL-構造異性体であるアミノ酸であ
る。L-親油性脂肪族及び脂環式アミノ酸の例としては、
L-イソロイシン、L-バリン、L-ロイシン、L-ノルバリ
ン、L-ノルロイシン、及びL-シクロヘキシルアラニンが
ある。好ましいD 基アミノ酸は、L-イソロイシン、L-ロ
イシン、及びL-シクロヘキシルアラニンである。位置5、E 基 前記ポリペプチドの位置5のE 基は、芳香族、親油性の
脂肪族又は脂環式アミノ酸のL-構造異性体であるアミノ
酸である。L-芳香族、親油性脂肪族又は脂環式アミノ酸
の例としては、フェニルアラニン、p-フルオロフェニル
アラニン、p-クロロフェニルアラニン、p-ブロモフェニ
ルアラニン、p-ヨードフェニルアラニン、チロシン、p-
メトキシフェニルアラニン、1-ナフチルアラニン、2-ナ
フチルアラニン、ロイシン、及びシクロヘキシルアラニ
ンから誘導した残基がある。好ましいE 基アミノ酸はL-
フェニルアラニン及びL-シクロヘキシルアラニンであ
る。 位置6、L-トレオニン 前記ポリペプチドの位置6のアミノ酸はL-トレオニンで
ある。位置7、F 基 前記ポリペプチドの位置7のF 基は、芳香族又は複素芳
香族アミノ酸のL-構造異性体であるアミノ酸である。芳
香族又は複素芳香族アミノ酸の例としては、チロシン、
フェニルアラニン、p-メトキシフェニルアラニン、ヒス
チジン、トリプトファン、β-2- チエニルアラニン、及
びβ-3- ピリジルアラニンがある。好ましいF 基アミノ
酸はL-チロシン、L-ヒスチジン、及びL-フェニルアラニ
ンである。位置8、G 基 前記ポリペプチドの位置8のG 基は、グリシン又はD-ア
ラニンであるアミノ酸であり、好ましくはグリシンであ
る。位置9、H 基 前記ポリペプチドの位置9のH 基は、L-グルタミン酸又
はL-グルタミンであるアミノ酸であり、好ましくはL-グ
ルタミン酸である。位置10、L-ロイシン 前記ポリペプチドの位置10のアミノ酸はL-ロイシンであ
る。位置11、I 基 前記ポリペプチドの位置11のI 基は、L-グルタミン、L-
グルタミン酸、又はL-アラニンであるアミノ酸である。
好ましいI 基アミノ酸はL-グルタミン及びL-アラニンで
ある。
結合であるか、又はZ、Z-Leu 、Z-Leu-Gln 、Z-Leu-Gln
-Glu 、Z-Leu-Gln-Glu-Lys 、Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu
、Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg 、Z-Leu-Gln-Glu-Lys-G
lu-Arg-Asn 、Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn-Lys 、
及びZ-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn-Lys-Gly からなる
群から選ばれてよく、好ましくはZ-Leu 、Z-Leu-Gln-Gl
u 、Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu 、Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu-
Arg-Asn 、及びZ-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn-Lys-Gl
y からなる群から選ばれてよい。Z 基はアルギニン、D-
アルギニン、D-ホモアルギニン、D-リシン、D-オルニチ
ン、D-2,4-ジアミノ酪酸、D-グルタミン、D-アスパラギ
ン、及びD-アラニンからなる群から選ばれ、好ましくは
アルギニン、D-アルギニン、D-グルタミン、及びD-アラ
ニンからなる群から選ばれる。位置12 J 基がI と-NH-基との間の直接結合である場合、該ポリ
ペプチドはドデカペプチドであり、位置12のアミノ酸は
該ポリペプチドのC-末端アミノ酸部分、-NH-*CH(CH2R5)
-R6である。J 基が直接結合であり、かつR2及びR3が水
素である場合、位置12のアミノ酸はD-配置を有する。R5
基は1〜3個の炭素原子を含むアミノアルキル基又は2
又は3個の炭素原子を含むグアニジノアルキル基であっ
て、好ましくは2又は3個の炭素原子を含むグアニジノ
アルキル基からなる群から選ばれる。好ましいアミノア
ルキル基はアミノメチル、2-アミノエチル、及び3-アミ
ノ-n- プロピルである。好ましいグアニジノアルキル基
はN-2-グアニジノエチル及びN-3-グアニジノ-n- プロピ
ルである。R6基は-COOH 又は-CONH2であり、好ましくは
-CONH2である。好ましくは、本態様における該ポリペプ
チドのC-末端アミノ酸部分、-NH-* CH(CH2R5)-R6の該ア
ミノ酸は、アルギニン、D-アルギニン、リシン、D-リシ
ン、D-オルニチン、D-2,4-ジアミノ酪酸、及びD-ホモア
ルギニンからなる群から選ばれ、更に好ましくはアルギ
ニン、D-アルギニン、及びリシンからなる群から選ばれ
る。J 基がI と-NH-基との間の直接結合でない場合、位
置12のアミノ酸はZ 基である。上記のように、Z 基はア
ルギニン、D-アルギニン、D-ホモアルギニン、D-リシ
ン、D-オルニチン、D-2,4-ジアミノ酪酸、D-グルタミ
ン、D-アスパラギン、及びD-アラニンからなる群から選
ばれるアミノ酸である。好ましくは、Z 基はアルギニ
ン、D-アルギニン、D-グルタミン、及びD-アラニンから
なる群から選ばれ、更に好ましくはZ 基はD-アルギニン
である。前記ポリペプチドの位置1のR2基及びR3基が水
素である場合、Z 基はD-配置を有する。
位置13のアミノ酸はポリペプチドのC-末端部分、-NH-*
CH(CH2R5)-R6であり、L-又はD-配置であってよく、リシ
ン、オルニチン、2,4-ジアミノ酪酸、アルギニン、及び
ホモアルギニンからなる群から選ばれてよく、好ましく
はL-リシン又はD-リシンである。本発明のポリペプチド
がトリデカペプチドよりも大きい場合、位置13のアミノ
酸はL-ロイシンである。位置14 本発明のポリペプチドがテトラデカペプチドである場
合、位置14のアミノ酸はポリペプチドのC-末端部分、-N
H-* CH(CH2R5)-R6であり、L-又はD-配置であってよく、
グルタミン、リシン、オルニチン、2,4-ジアミノ酪酸、
アルギニン、及びホモアルギニンからなる群から選ばれ
てよく、好ましくはL-リシン、D-リシン、L-グルタミ
ン、及びD-グルタミンからなる群から選ばれる。本発明
のポリペプチドがテトラデカペプチドよりも大きい場
合、前記ポリペプチドの位置14のアミノ酸はL-グルタミ
ンである。位置15 本発明のポリペプチドがペンタデカペプチドである場
合、位置15のアミノ酸はポリペプチドのC-末端部分、-N
H-* CH(CH2R5)-R6であり、L-又はD-配置であってよく、
リシン、オルニチン、2,4-ジアミノ酪酸、アルギニン、
及びホモアルギニンからなる群から選ばれてよく、好ま
しくはL-リシン又はD-リシンである。 本発明のポリペ
プチドがペンタデカペプチドよりも大きい場合、位置15
のアミノ酸はL-グルタミン酸である。位置16 本発明のポリペプチドがヘキサデカペプチドである場
合、位置16のアミノ酸はポリペプチドのC-末端部分、-N
H-* CH(CH2R5)-R6であり、L-又はD-配置であってよく、
リシン、オルニチン、2,4-ジアミノ酪酸、アルギニン、
及びホモアルギニンからなる群から選ばれてよく、好ま
しくはL-リシン又はD-リシンである。 本発明のポリペ
プチドがヘキサデカペプチドよりも大きい場合、前記ポ
リペプチドの位置16のアミノ酸はL-リシンである。位置17 本発明のポリペプチドがヘプタデカペプチドである場
合、位置17のアミノ酸はポリペプチドのC-末端部分、-N
H-* CH(CH2R5)-R6であり、L-又はD-配置であってよく、
リシン、オルニチン、2,4-ジアミノ酪酸、アルギニン、
及びホモアルギニンからなる群から選ばれてよく、好ま
しくはL-リシン又はD-リシンである。 本発明のポリペ
プチドがヘプタデカペプチドよりも大きい場合、位置17
のアミノ酸はL-グルタミンである。位置18 本発明のポリペプチドがオクタデカペプチドである場
合、位置18のアミノ酸はポリペプチドのC-末端部分、-N
H-* CH(CH2R5)-R6であり、L-又はD-配置であってよく、
リシン、オルニチン、2,4-ジアミノ酪酸、アルギニン、
及びホモアルギニンからなる群から選ばれてよく、好ま
しくはL-リシン、D-リシン、L-アルギニン、及びD-アル
ギニンからなる群から選ばれる。本発明のポリペプチド
がオクタデカペプチドよりも大きい場合、位置18のアミ
ノ酸はL-アルギニンである。位置19 本発明のポリペプチドがノナデカペプチドである場合、
位置19のアミノ酸はポリペプチドのC-末端部分、-NH-*
CH(CH2R5)-R6であり、L-又はD-配置であってよく、リシ
ン、オルニチン、2,4-ジアミノ酪酸、アルギニン、及び
ホモアルギニンからなる群から選ばれてよく、好ましく
はL-リシン又はD-リシンである。本発明のポリペプチド
がノナデカペプチドよりも大きい場合、位置19のアミノ
酸はL-アスパラギンである。
位置20のアミノ酸はポリペプチドのC-末端部分、-NH-*
CH(CH2R5)-R6であり、L-又はD-配置であってよく、リシ
ン、オルニチン、2,4-ジアミノ酪酸、アルギニン、及び
ホモアルギニンからなる群から選ばれてよく、好ましく
はL-リシン又はD-リシンである。本発明のポリペプチド
が20個以上のアミノ酸からなる場合、位置20のアミノ酸
はL-リシンである。位置21 本発明のポリペプチドが21個のアミノ酸からなる場合、
位置21のアミノ酸はポリペプチドのC-末端部分、-NH-*
CH(CH2R5)-R6であり、L-又はD-配置であってよく、リシ
ン、オルニチン、2,4-ジアミノ酪酸、アルギニン、及び
ホモアルギニンからなる群から選ばれてよく、好ましく
はL-リシン又はD-リシンである。本発明のポリペプチド
が21個以上のアミノ酸からなる場合、位置21のアミノ酸
はグリシンである。位置22 本発明のポリペプチドのうちあるものの位置22のアミノ
酸は、ポリペプチドのC-末端部分、-NH-* CH(CH2R5)-R6
であり、L-又はD-配置であってよく、グルタミン、リシ
ン、オルニチン、2,4-ジアミノ酪酸、アルギニン、及び
ホモアルギニンからなる群から選ばれてよく、好ましく
はL-リシン、D-リシン、L-グルタミン、及びD-グルタミ
ンからなる群から選ばれる。
R6に存在する残基は、C-末端カルボン酸誘導体R6を伴う
アミノ酸であって、R6は-COOH 又は-CONH2であり、好ま
しくは-CONH2である。R5は上記で定義した通りである。
“シクロアルキル”という用語は、ここでは5〜7個の
炭素原子を含む環状の炭化水素基を意味する。“ハロゲ
ン”という用語は、ここでは4つの全てのハロゲンを含
むが、塩素が好ましい。好ましい態様においては、本発
明の化合物は以下のもの及びそれらの薬学上許容されう
る酸付加塩からなる群から選ばれる:
酸はL-配置をとる。更に好ましい態様においては、本発
明の化合物は以下のもの及びそれらの薬学上許容されう
る酸付加塩からなる群から選ばれる:
合物は以下のもの及びそれらの薬学上許容されうる酸付
加塩からなる群から選ばれる:
の当業界で公知の様々な方法により、本発明の化合物を
調製することができる。固相法においては、一般にはポ
リスチレンベース、ポリハイプ(polyhipe)ベース、又は
ポリアクリルアミド/多孔質珪藻土複合材料の樹脂であ
る樹脂支持体を用いて、ペプチド鎖を連続的に構築する
ことができる。ヒドロキシメチルフェニルアセトアミド
メチル(PAM) 、4-メチルベンズヒドリルアミノ(MBHA)、
又はヒドロキシメチルフェノキシアセトキシ(HMPA)部分
等の、酸で変化し易い適切な分子リンカーによって、成
長ペプチド鎖は樹脂支持体に結合される。フッ化水素、
トリフルオロ酢酸(TFA) 、トリフルオロメタンスルホン
酸(TFMSA) 等を用いた酸加水分解によって、該ペプチド
鎖を該リンカーから、従って該樹脂支持体から分離する
ことができる。本発明の胃腸運動刺激ポリペプチドを固
相であれ液相であれ調製する場合、ある適切に保護され
たアミノ酸又はペプチドフラグメントのカルボキシ部分
と、他の適切に保護されたアミノ酸又はペプチドフラグ
メントとの反応により、アミノ酸サブユニットをカップ
リングして新たなアミド結合を形成することが、基本的
合成方法に含まれる。カップリング反応を有効とするた
め、該カルボキシ部分は活性化されていなければならな
い。活性化は、DCC 、DIC 、EDCC、BOP 、HBTU、又はPy
BrOP等の通常のカップリング剤を用いることによって行
いうる。PyBrOPの場合を除いて、当モル量のHOBtを添加
して、活性化したアミノ酸成分のラセミ化を刺激しても
よい。対応するアミノ酸のカルボン酸塩を活性化のため
に用いる必要がある場合には、NMM 、DIEA、又はTEA 等
の塩基を用いてもよい。あるいは、成分アミノ酸の活性
エステルのカップリングにより、本発明のペプチドを合
成することも可能である。そのような活性エステルに
は、例えばペンタクロロフェニルエステル、ペンタフル
オロフェニルエステル、p-ニトロフェニルエステル等が
含まれる。
護基を用いて、アミノ酸成分の他の反応性官能基を遮断
しなければならない。一般に、どのような種類の側鎖保
護基を使用すべきかは、α- アミノ保護基の同一性によ
り決定される。例えば、α-アミノ基がそのBOC 誘導体
として保護される場合、側鎖保護は通常ベンジルアルコ
ールのエステル、エーテル、又はウレタン誘導体を用い
て行われる。シクロヘキサノールのエステル及びエーテ
ル誘導体を使用して成功する場合もある。一方、α- ア
ミノ基がそのFmoc誘導体として保護される場合、側鎖官
能基は通常t-ブタノールのエステル、エーテル、又はウ
レタン誘導体として保護される。もちろん、特に本発明
のペプチドを液相法により合成する場合には、替わりの
保護基の組合わせを用いてもよい。Fmocα- アミノ保護
基の除去は、塩基、一般にはピペリジンを用いて容易に
行い得る。ペプチドのC-末端と樹脂リンカーとの間の結
合を切断することも可能な適切なカルボニウムイオンス
カベンジャーの存在下で、TFA で処理することにより、
側鎖保護基を除去し得る。Boc 保護基は一般に希釈TFA
での処理により除去される。但し、TFA 切断の後に、α
- アミノ基がそのTFA 塩として存在する。成長ペプチド
鎖のα- アミノ基を次のアミノ酸誘導体に対して活性と
するため、樹脂結合(resin-bound) ペプチドをTEA 又は
DIEA等の塩基を用いて中和する。次に、適切なスカベン
ジャーを含むフッ化水素酸又はTFMSA 等の強酸を用い
て、アミノ酸側鎖を脱保護(deprotect) し、ペプチドを
樹脂支持体から切断する。本発明では、アミノ末端部
分、(R1)m(R2)(R3)N- を含むペプチドの調製方法を与え
る。M =0、R2が水素又は低級アルキル、R3が低級アル
キルである場合、該方法は、適切なリンカーを通じて不
溶性支持体に結合していてもよい適切に保護されたペプ
チドのN-末端アミノ基(NH2-(AA)n-)を、適切なアルデヒ
ド又はケトン及びアルカリ金属水素化物還元剤と反応さ
せることを含む。該アルデヒド又はケトンは、例えば、
ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、又はアセトンで
あってよい。該アルカリ金属水素化物は、例えば、シア
ノボロ水素化ナトリウム(sodium cyanoborohydride )
等のボロ水素化アルカリ金属であってよい。該方法は、
周囲温度において、DMF 、NMP 等の適切な溶媒中で、場
合により酢酸又は1-ヒドロキシエチルピペラジンエタン
スルホン酸(HEPES )を併用して、都合よく行い得る。
該方法は米国特許第4,421,744 号明細書に更に完全に記
載されており、そこでの記載は本明細書に含まれるもの
とする。M =1、R1及びR3が独立に低級アルキル又はア
リル、かつR2が低級アルキル、アリル、及びプロパルギ
ルからなる群から選ばれる場合、該方法は、適切なリン
カーを通じて不溶性支持体に結合していてもよい適切に
保護されたペプチドのN-末端アミノ基(NR2R3-(AA)n-)
を、式R1Hal (但し、R1は上記定義の通りであり、Hal
はハロゲン原子である)で表される化合物と反応させる
ことを含む。該方法は、DMF 、NMP 等の適切な溶媒中
で、炭酸ナトリウム又は炭酸カリウム等の適切な酸結合
剤の存在下で行い得る。該方法はベノイトン−チェンに
よるProced. 14th Europ. Pept. Symp. p.149 (1969)に
更に完全に記載されており、そこでの記載は本明細書に
含まれるものとする。
であるが、安定性、結晶化の都合、溶解性の増大等の目
的で薬学上許容されうる酸付加塩の形態に配合し、投与
することができる。これらの酸付加塩は、塩酸、硫酸、
スルホン酸、酒石酸、フマル酸、臭素化水素酸、グリコ
ール酸、クエン酸、マレイン酸、リン酸、琥珀酸、酢
酸、硝酸、安息香酸、アスコルビン酸、p-トルエンスル
ホン酸、ベンゼンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、
プロピオン酸等の適切な無機又は有機酸から、従来の手
法により形成される。好ましくは、酸付加塩は塩酸、酢
酸、又は琥珀酸から調製したものである。本発明の化合
物を薬学上許容されうる担体と組合わせて、医薬組成物
を提供することができる。遊離塩基としての目的化合物
(subject compound)に適切な担体には、プロピレングリ
コール−アルコール−水、等張水、注射用無菌水(USP)
、エマルフォールTM−アルコール−水、クレモフォー
ル−ELTM又は当業者に公知のその他の適切な担体が含ま
れる。目的化合物の酸付加塩用に適切な担体には、等張
水、注射用無菌水(USP) 単独、又はエタノール、プロピ
レングリコール、又は当業者に公知のその他の従来の可
溶化剤との組合わせが含まれる。好ましい担体は発明化
合物の等張水溶液である。
胃腸運動刺激活性を提供するのに有効な量で本発明の化
合物を投与することができる。化合物の活性及び望まし
い治療効果は変化し得るので、採用する化合物の投与量
もまた変化し得る。実際の投与量はまた、患者の体重及
び特定の患者の個別の過敏性等の一般に認識し得る要因
によっても決定される。従って、特定の患者(男性)に
ついての単位投与量は、実施者が所望の効果に滴定し得
る体重1kg当たり0.1 μg程度を下限として変化し得
る。滴定に好ましい最少投与量は体重1kg当たり1μg
である。本発明の化合物は、前記の担体中の無菌溶液又
は懸濁液の形状で、公知の非経口経路により投与し得
る。これらの調製物は少なくとも約0.1 重量%の本発明
の化合物を包含すべきであるが、この本発明の化合物の
量は約0.1 重量%〜約50重量%の間で変化し得る。本発
明の化合物は好ましくは静脈から投与し、投与量は体重
70kg当たり一般に約0.1 μg〜約500 mgの範囲、好まし
くは約1μg〜約50mgの範囲となるであろう。投与は日
に1〜4回行ってよい。前記無菌溶液又は懸濁液は更に
次の補助物質を含んでいてよい:即ち、注射用水、食塩
水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリ
ン、プロピレングリコール、又はその他の合成溶媒等の
無菌希釈剤;ベンジルアルコール又はメチルパラベン等
の抗バクテリア剤;アスコルビン酸又はピロ亜硫酸ナト
リウム等の酸化防止剤;エチレンジアミン四酢酸(EDTA)
等のキレート化剤;酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩等
の緩衝剤;及び塩化ナトリウム又はブドウ糖等の張度調
節剤である。該非経口用調製物はアンプル、使い捨てシ
リンジ、又はガラス又はプラスチック製の多数回投与バ
イアル中に封入してよい。本明細書を通して、様々な刊
行物を参照している。当業界の状況を更に完全に記載す
るために、これら刊行物に開示されている事項は本明細
書に含まれるものとする。本発明について次の実施例に
よって更に説明するが、本発明の化合物及び組成物の調
製を示すことを目的とするものであって、制限を加える
ものではない。
ペプチド(ブタ)、ビス−トリフルオロ酢酸塩 H-Phe-Val-Pro-Ile-Phe-Thr-Tyr-Gly-Glu-Leu-Gln-D-Ar
g-Leu-Gln-OH ミリジェン・モデル9050ペプチド合成装置を用いた固相
連続フロー手法により、2.0 gのFmoc-L-Gln(Mbh)PepSy
n KA樹脂(0.097 ミリグラム当量/g)上に該ペプチド
を合成した。ODhbt エステルであるThr を除いて、全て
の残基をHOBtの存在下でFmocアミノ酸のPfp エステルと
してカップリングした。側鎖保護は次の通り:即ち、D-
Arg(Mtr)、Glu(OtBu) 、Tyr(tBu)、及びThr(tBu)とし
た。Gln は保護しないままとした。カップリングには、
4倍モル過剰のFmocアミノ酸OPfp/HOBt のDMF 溶液を使
用した。カイザー試験によりカップリング効率を監視し
た。カップリング時間は1〜4時間の範囲とした。各カ
ップリングサイクルの後に、ピペリジンの20%DMF 溶液
を用いて、Fmoc- α- アミノ保護基の除去を行った。合
成に続いて、樹脂結合ペプチドをDCM で洗浄し、真空下
で一晩乾燥した。5%のチオアニソール、3%のエタン
ジチオール、及び2%のアニソールを含む無水TFA (合
計20ミリリットル)と伴に室温で8時間震盪して、樹脂
からのペプチドの脱ブロック化及び切断を行った。次に
該切断溶液を250 ミリリットルの冷エーテルに滴下し、
沈殿したペプチドを濾過により収集して、320 mg(85
%)の表題のペプチドを白色粉体として得た。2本の連
続したC-18カラム(250 ×20mm、15μ、Vydac )を用い
たウォーターズ・デルタ−プレップ3000 HPLC を使用し
て、3回の試行(一般的負荷=1回の試行当たり107 m
g)によりペプチドの精製を行った。溶媒システムは0.1
%のTFA に60%アセトニトリル/40%TFA (0.1 %)
となるまで毎分20ミリリットルで30分間のグラジエント
をかけ、220 nmのUV検出器を用いた。分析HPLC(グラジ
エント30分間、100 %TFA (0.1 %)〜100 %アセトニ
トリル、毎分1ミリリットル、214 nm、R t =17.37
分)及び毛細管ゾーン電気泳動により、各分画の純度を
評価した。純粋な分画(>95%)をプールし、凍結乾燥
して、107 mg(28%)の表題のペプチドを蛍光白色粉体
として得た。 AAA: Thr 0.87(1)、Glx 3.02(3) 、Gly 1.04(1) 、Val
1.02(1) 、Ile 0.92(1) 、Leu 2.14(2) 、Tyr 1.00(1)
、Phe 1.93(2) 、Arg 0.93(1) FAB-MS: (M+H) + 計算値1712、測定値1712
ニン,12-D- アルギニン,13- ロイシン,14-D- リシ
ン] モチリン-(1-14)-ペプチドアミド(ブタ)トリス−
トリフルオロ酢酸塩 (N-Me)-Phe-Val-Ala-Ile-Phe-Thr-Tyr-Gly-Glu-Leu-Ala
-D-Arg-Leu-D-Lys-NH2 ミリジェン・モデル9050ペプチド合成装置を用いた固相
連続フロー手法により、0.85gのPAL 樹脂(0.27ミリグ
ラム当量/g)上に該ペプチドを合成した。該樹脂を3.
4 gのガラスビーズ(酸洗浄したもの、150-212 ミクロ
ン)と混合し、連続フローカラム中に乾燥充填して、使
用前にDMF で1時間膨潤させた。NMM の0.6MのDMF 溶液
の存在下でFmoc-MePhe-OH をBOP 及びHOBtを用いて(1:
1:1 )予備活性化してカップリングした。HOBtの存在下
でFmoc-L-Thr-OH をそのODhbt エステルとしてカップリ
ングした。他の全ての残基をHOBtの存在下でFmocアミノ
酸のPfp エステルとしてカップリングした。側鎖保護は
次の通り:即ち、D-Arg(Mtr)、Glu(OtBu) 、Tyr(tBu)、
Thr(tBu)、D-Lys(Boc)、及びGln(Trt)とした。カップリ
ングには、4倍モル過剰のFmocアミノ酸誘導体のDMF 溶
液を使用した。カイザー試験によりカップリング効率を
監視した。カップリング時間は一般的に1〜4時間の範
囲とした。各サイクルの後に、ピペリジンの20%DMF 溶
液を用いて、Fmoc- α- アミノ保護基の除去を行った。
合成に続いて、樹脂結合ペプチドをDCM で洗浄し、真空
下で一晩乾燥した。5%のチオアニソール、3%のエタ
ンジチオール、及び2%のアニソールを含む無水TFA
(合計20ミリリットル)と伴に室温で8時間震盪して、
樹脂からのペプチドの脱ブロック化及び切断を行った。
次に該切断溶液を250 ミリリットルの冷エーテルに滴下
し、沈殿したペプチドを濾過により収集して、210 mg
(91%)の表題のペプチドを白色粉体として得た。2本
の連続したC-18カラム(250 ×20mm、15μ、Vydac )を
用いたウォーターズ・デルタ−プレップ3000 HPLC を使
用して、3回の試行(一般的負荷=1回の試行当たり70
mg)によりペプチドの精製を行った。溶媒システムは0.
1 %のTFA に60%アセトニトリル/40%TFA (0.1 %)
となるまで毎分20ミリリットルで30分間のグラジエント
をかけ、220 nmのUV検出器を用いた。分析HPLC(グラジ
エント30分間、100 %TFA (0.1 %)〜100 %アセトニ
トリル、毎分1ミリリットル、214 nm、R t =17.06
分)及び毛細管ゾーン電気泳動により、各分画の純度を
評価した。純粋な分画(>95%)をプールし、凍結乾燥
して、82mg(36%)の表題のペプチドを蛍光白色粉体と
して得た。 AAA: Thr 0.95(1)、Glx 1.04(1) 、Gly 1.04(1) 、Val
0.74(1) 、Ile 0.99(1) 、Leu 2.11(2) 、Tyr 1.01(1)
、Phe 1.01(1) 、Lys 1.03(1) 、Arg 1.05(1) FAB-MS: (M+H) + 計算値1641、測定値1641
チリン-(1-14)-ペプチド(ブタ)、ビス- トリフルオロ
酢酸塩 (Me2N)-Phe-Val-Pro-Ile-Phe-Thr-Tyr-Gly-Glu-Leu-Gln
-Arg-Leu-Gln-NH2 ミリジェン・モデル9050ペプチド合成装置を用いた固相
連続フロー手法により、0.2 ミリモルのスケールでNova
SynPR 500 樹脂上に該ペプチドを合成した。ODhbt エス
テルであるThr を除いて、全ての残基をHOBtの存在下で
Fmocアミノ酸のPfp エステルとしてカップリングした。
側鎖保護は次の通り:即ち、Arg(Mtr)、Gln(Trt)、 Glu
(OtBu)、Tyr(tBu)、及びThr(tBu)とした。カップリング
には、4倍モル過剰のFmocアミノ酸OPfp/HOBt のDMF 溶
液を使用した。カイザー試験によりカップリング効率を
監視した。カップリング時間は1〜4時間の範囲とし
た。各カップリングサイクルの後に、ピペリジンの20%
DMF 溶液を用いて、Fmoc- α- アミノ保護基の除去を行
った。合成に続いて、樹脂結合ペプチドをDCM で洗浄
し、真空下で一晩乾燥した。完全に配列したペプチドを
含む樹脂を、20ミリリットルのNMP の入ったフラスコに
移した。この懸濁液に、連続的に37%のホルムアルデヒ
ド水溶液を5ミリリットル(300 当量)、シアノボロ水
素化ナトリウムを126 mg(10当量)、及び氷酢酸を200
マイクロリットル添加した。該混合物を7時間攪拌し
た。該樹脂を濾過し、DMF (5×50ミリリットル)、DC
M (5×50ミリリットル)で洗浄し、真空下で乾燥し
た。5%のチオアニソール、3%のエタンジチオール、
及び2%のアニソールを含む無水TFA (合計20ミリリッ
トル)と伴に室温で8時間震盪して、樹脂からのペプチ
ドの脱ブロック化及び切断を行った。次に該切断溶液を
250 ミリリットルの冷エーテルに滴下し、沈殿したペプ
チドを濾過により収集して、表題のペプチドを白色粉体
として得た。2本の連続したC-18カラム(250 ×20mm、
15μ、Vydac )を用いたウォーターズ・デルタ−プレッ
プ3000 HPLC を使用して、3回の試行(一般的負荷=1
回の試行当たり70mg)によりペプチドの精製を行った。
溶媒システムは0.1 %のTFA に60%アセトニトリル/40
%TFA (0.1 %)となるまで毎分20ミリリットルで30分
間のグラジエントをかけ、220 nmのUV検出器を用いた。
純粋な分画(>95%)をプールし、凍結乾燥して、111
mgの表題のペプチドを蛍光白色粉体として得た。 AAA: Thr 0.84(1)、Glx 2.88(3) 、Pro 1.03(1) 、Gly
1.04(1) 、Val 0.47(1) 、Ile 0.87(1) 、Leu 1.88(2)
、Tyr 0.90(1) 、Phe 0.97(1) 、Arg 0.86(1) FAB-MS: (M+H) + 計算値1738、測定値1738
モチリン-(1-14)-ペプチド(ブタ)、ビス- トリフル
オロ酢酸塩 (Me3N + )-Phe-Val-Pro-Ile-Phe-Thr-Tyr-Gly-Glu-Leu-
Gln-Arg-Leu-Gln-OH ミリジェン・モデル9050ペプチド合成装置を用いた固相
連続フロー手法により、0.2 ミリモルのスケールでFMOC
-L-Gln-(Mbh) PepSynKA 樹脂上に該ペプチドを合成し
た。ODhbt エステルであるThr を除いて、全ての残基を
HOBtの存在下でFmocアミノ酸のPfp エステルとしてカッ
プリングした。側鎖保護は次の通り:即ち、Arg(Mtr)、
Gln(Trt)、 Glu(OtBu)、Tyr(tBu)、及びThr(tBu)とし
た。カップリングには、4倍モル過剰のFmocアミノ酸OP
fp/HOBt のDMF 溶液を使用した。カイザー試験によりカ
ップリング効率を監視した。カップリング時間は1〜4
時間の範囲とした。各カップリングサイクルの後に、ピ
ペリジンの20%DMF 溶液を用いて、Fmoc- α- アミノ保
護基の除去を行った。合成に続いて、樹脂結合ペプチド
をDCM で洗浄し、真空下で一晩乾燥した。完全に配列し
たペプチドを含む樹脂を、20ミリリットルのDMF の入っ
たフラスコに移した。この懸濁液に、沃化メチルを5ミ
リリットル(400 当量)、続いて炭酸カリウムを500 mg
(18当量)添加した。該混合物を12時間攪拌した。該樹
脂を濾過し、DMF (5×50ミリリットル)、水(2×25
ミリリットル)DMF (5×50ミリリットル)で洗浄し、
真空下で乾燥した。5%のチオアニソール、3%のエタ
ンジチオール、及び2%のアニソールを含む無水TFA
(合計20ミリリットル)と伴に室温で8時間震盪して、
樹脂からのペプチドの脱ブロック化及び切断を行った。
次に該切断溶液を250 ミリリットルの冷エーテルに滴下
し、沈殿したペプチドを濾過により収集して、表題のペ
プチドを白色粉体として得た。2本の連続したC-18カラ
ム(250 ×20mm、15μ、Vydac )を用いたウォーターズ
・デルタ−プレップ3000 HPLC を使用して、3回の試行
(一般的負荷=1回の試行当たり70mg)によりペプチド
の精製を行った。溶媒システムは0.1 %のTFA に60%ア
セトニトリル/40%TFA (0.1 %)となるまで毎分20ミ
リリットルで30分間のグラジエントをかけ、220 nmのUV
検出器を用いた。純粋な分画(>95%)をプールし、凍
結乾燥して、71mgの表題のペプチドを蛍光白色粉体とし
て得た。 AAA: Thr 0.88(1)、Glx 3.25(3) 、Pro 1.00(1) 、Gly
1.00(1) 、Val 0.30(1) 、Ile 1.01(1) 、Leu 2.30(2)
、Tyr 1.10(1) 、Phe 1.10(1) 、Arg 1.10(1) FAB-MS: (M+H) + 計算値1753、測定値1753
腎臓の刷子縁細胞により代謝されると考えられる。そこ
で、本発明のペプチドの相対的な生体内生物安定性評価
のためのモデルシステムとして、腎臓ホモジェネートを
選択した。試験対象である全てのペプチドをブタ腎臓
(Pel Freeze社、Rogers, Arkansas)(2%w/v 、最終
体積=4ミリリットル、緩衝液=HEPES pH 7.0)中に、
25℃で温置した。初期基質濃度及び内部標準(Fmoc-Gl
y)は共に0.5 mg/ミリリットルとした。適切な温置時
間及びサンプリング間隔を決定するため、各ポリペプチ
ドについて2回の実験を行った。第1回目の試行は、ペ
プチドの安定性を大まかに見積もるために行った。全て
のサンプリングは複数回行った。サンプルの体積は180
マイクロリットルとした。100 %のTCA を20マイクロリ
ットル添加することにより、サンプルを清浄化した(最
終体積=200 マイクロリットル、最終TCA 濃度=10
%)。サンプルは5〜10秒間かき混ぜて(vortex)確実
に平衡にした後に、遠心分離により沈殿したタンパク質
を飛散(spin out)させた。分析はWISPオートインジェ
クター、5マイクロリットルのVydac C-18分析カラム、
及びウォーターズ481 UV検出器を装備したウォーターズ
HPLCシステムにより行った。注入体積は80マイクロリッ
トルとした。初期溶媒条件は80%アセトニトリル/20%
(0.1 %)TFA ミリQ水溶液であり、63%アセトニトリ
ル/37%(0.1 %)TFA まで毎分1ミリリットルで35分
間のグラジエントをかけて操作した。ポリペプチド基質
及び代謝産物ピークの内部標準に対する比をとり、複数
のサンプルでの比を平均化した。ペプチド基質について
の該平均比率を百分率で表現して、時間に対してプロッ
トした。データ処理については一次反応速度(first-or
der kinetics)を仮定した。Enzfitter プログラム(Bi
osoft )を用いて、該基質の消失速度を算出した。比半
減期は次の関係から決定した: t1/2 =0.693/k
l. Pept. 15, 143-153(1986) に記載の一般的手法を用
いて、本発明のペプチドのモチリン受容体結合親和性を
決定した。ウサギの腔平滑筋細胞に結合した [125I-Tyr
7,Nle13]モチリン(ブタ)を置換するペプチドの能力
を、濃度範囲10-11 〜10-4Mにおいて、各回に複数回ず
つ2回の試験により決定した。ラベル(IC50)の50%置
換の濃度を、ラベル付けしたモチリン及びラベル付けし
ていないモチリンに、等しい親和性で非共同的に結合す
る1分類のモチリン受容体を仮定し、置換を表す式にデ
ータをフィッティングして決定した。フィッティングは
SAS-ソフトウェア・パッケージ(SAS Institute 社、Ca
ry, NC, USA )の反復最小自乗法を用いて行った。大量
の一連の対照実験から、モチリンそのものの解離定数が
0.75nM(pKd=9.12)であると計算され、この値を全ての計
算に使用した。ラベルの50%置換の濃度は、その負の対
数を用いて表現される(pIC50) 。
150-159 (1989)に記載の方法に従い、ウサギ十二指腸の
切片の収縮反応を細胞浴中で等張的に決定した。実験プ
ロトコルは、1時間の平衡期間、10-4Mアセチルコリン
による誘発に続く洗浄期間、最終的には10-7Mのモチリ
ンを添加する化合物の累積的投与−反応曲線、及び最終
段階の10-4Mアセチルコリンによる誘発からなる。10-4
Mアセチルコリンに対する最終反応と初期反応との差異
が5%を越える場合には、その結果を放棄した。該化合
物については10-11 〜10-4Mの濃度範囲で試験を行っ
た。モチリンに対する最高反応(Emax)の50%に該当す
る点を、データ点を通る式E=E max (1+EC50/[L])をフィ
ッティングすることにより決定した。活性の弱い化合物
については、10-7Mのモチリンに対する反応の90%をEm
axとして用いた。反応の50%を与える投与量は、その負
の対数を用いて表現される(pEC50) 。
て、雌雄の雑種犬を麻酔した。腹部を正中線切開した。
十二指腸部位を捜し出し、該部位への終動脈を特定し、
適切な大きさの最近接の使用可能な動脈の脂肪及び筋膜
を擦り取った。適切な直径の針をある角度で曲げ、その
先端を清浄にした動脈に挿入した。該針を血管痙攣が緩
和するまで約30秒間動脈の該位置に保持し、次にカテー
テル器具を該動脈中に挿入して、000 絹縫合糸で該位置
に固定した。細いポリエチレンカテーテル(10〜15cm)
の一端を切断し、他端に針を挿入した。該針の中心を三
方止めコックで固定し、前記カテーテル器具を10mMのグ
ルコースを含むヘパリン化したクレブズリンゲル重炭酸
塩で満たした。(脱気した)クレブズ塊を動脈カテーテ
ルに注入し、前記部位の白色化分布に注目した。領域が
広すぎる場合、該領域への循環が維持される限り側副動
脈を結紮してよい。次に、バス型歪みゲージを漿膜に縫
合し、円形筋肉収縮がベックマンR611ディノグラフに記
録され得る向きにした。歪みゲージのいずれかの側の漿
膜下に銀線電極を挿入し、刺激遮断ユニットをを通して
グラスS88 電気刺激器に接続した。40V 、0.5ms 、及び
5ppsの電場刺激を印加し、収縮応答が収まるようにペン
レコーダーの記録範囲を調整した。注入されるべき全て
のペプチドをクレブズの溶解し、いかなる濃度について
も注入する最大体積が1ミリリットルとなるように、一
連の希釈物を調製した。クレブス原液以外の全ての溶液
を、実験日の間氷上に保持し、その日の終わりに廃棄し
た。投与−反応曲線を決定するため、最初に前記部位に
約1ミリリットルのヘパリン化クレブズの塊を注入し、
コントロールによる洗浄を行った。(1ミリリットルの
クレブズで洗浄した体積1ミリリットルの)ペプチド拮
抗物質を、最大強度の応答が得られるまで対数間隔で注
入した。次に、0.1 %のBSA を含有するクレブズで該注
入部位を洗浄し、動脈線中に残存する全てのペプチドを
除去した。モチリン受容体において作用するペプチドに
ついては、タキフィラキシーをもたらさないために、最
高量を超えて注入しないよう注意を払った。従って、応
答が明確になった時点で、0.3 〜0.5 対数間隔を採用す
ることとした。投与−応答決定に関する1部位の使用
は、0.5 〜1時間毎のみとした。各部位での領域刺激に
対するキャリブレーション応答強度を測定し、その部位
についての100 %として用いた。各投与での拮抗物質に
対する応答強度を決定し、濃度に対してプロットした。
応答のED50は、キャリブレーション応答の50%をもたら
すのに要する拮抗物質の量を表す。これは応答の有効性
と効力の両方を反映するものであって、実際に両者を区
別するものではない。
構成を替えて、本発明の精神及び範囲を逸脱することな
く本発明を利用する他の態様を与えうることは明らかで
ある。そのような全ての改良及び変更は、例として示し
た具体的態様というよりむしろ、特許請求の範囲に記載
した発明の範囲に含まれることを意図するものである。
Claims (2)
- 【請求項1】 光学的に活性な異性体構造を含む胃腸運
動刺激活性を有するポリペプチドであって、次の一般式
で表される前記ポリペプチド又はその薬学上許容されう
る酸付加塩。 【化1】 (式中、AはL-バリン、L-イソロイシン、L-ロイシン、
L-ノルバリンおよびL-ノルロイシンからなる群から選ば
れる親油性の脂肪族アミノ酸であり;BはL-プロリン又
はL-アラニンであり;Dは、L-イソロイシン、L-バリ
ン、L-ロイシン、L-ノルバリンおよびL-ノルロイシンか
らなる群から選ばれる親油性の脂肪族アミノ酸であり;
Eは、フェニルアラニン、p-フルオロフェニルアラニ
ン、p-クロロフェニルアラニン、p-ブロモフェニルアラ
ニン、p-ヨードフェニルアラニン、チロシン、p-メトキ
シフェニルアラニン、1-ナフチルアラニン、2-ナフチル
アラニン、ロイシン、およびシクロヘキシルアラニンか
らなる群から選ばれる芳香族、親油性の脂肪族又は脂環
式アミノ酸のL-構造異性体であり;Fは、チロシン、フ
ェニルアラニン、p-メトキシフェニルアラニン、ヒスチ
ジン、トリプトファン、β-2- チエニルアラニン、およ
びβ-3- ピリジルアラニンからなる群から選ばれる芳香
族又は複素芳香族アミノ酸のL-構造異性体であり;Gは
グリシン又はD-アラニンであり;HはL-グルタミン酸又
はL-グルタミンであり;IはL-グルタミン、L-グルタミ
ン酸、又はL-アラニンであり;JはD-Arg-Leu 、D-Arg-
Leu-Gln-Glu、D-Arg-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu 、D-Arg-Leu
-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn 、およびD-Arg-Leu-Gln-Glu
-Lys-Glu-Arg-Asn-Lys-Gly からなる群から選ばれ、R1
は低級アルキル又はアリルであり;R2は水素、低級アル
キル、およびプロパルギルからなる群から選ばれ;R3は
水素および低級アルキルからなる群から選ばれ;R4はメ
チル、エチル、n-プロピル、イソ- プロピル、n-ブチ
ル、シクロヘキシル、フェニル、p-フルオロフェニル、
p-クロロフェニル、p-ブロモフェニル、p-ヨードフェニ
ル、p-ヒドロキシフェニル、p-メトキシフェニル、1-ナ
フチルおよび2-ナフチルからなる群から選ばれる低級ア
ルキル、シクロアルキル、置換又は未置換アリール、お
よびヘテロアリールからなる群から選ばれ;R5は-CH2CO
NH2 および1〜3個の炭素原子を含むアミノアルキル基
からなる群から選ばれ;R6は-COOH 又は-CONH2であり;
およびmは0又は1であり、記号* はD 又はL 配置にあ
ってよい不斉炭素原子を表し、各低級アルキル基は1〜
4個の炭素原子を含み、次の条件に従う: (a)JがD-Arg-Leu またはD-Arg-Leu-Gln-Glu-Lys-Gl
u-Arg-Asn-Lys-Gly の場合にのみR5は-CH2CONH2 であ
り; (b)該ペプチドはモチリン以外のものである) - 【請求項2】 前記(R1)m (R2)(R3)N- *CH(CH2R4)CO-が
L-フェニルアラニン、D-フェニルアラニン、L-シクロヘ
キシルアラニン、及びD-シクロヘキシルアラニンからな
る群から選ばれ、及び-NH * CH(CH2R5)-R6がアルギニ
ン、D-アルギニン、リシン、D-リシン、グルタミン、D-
グルタミン、D-オルニチン、D-2,4-ジアミノ酪酸、及び
D-ホモアルギニンからなる群から選ばれる、請求項1記
載のポリペプチド。
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