JPH0676437B2

JPH0676437B2 - Ｇｒｆ類似体

Info

Publication number: JPH0676437B2
Application number: JP59178188A
Authority: JP
Inventors: ペーター・ボーレン; ポール・アーネスト・ブラゼオー; フレデリツク・ステイーヴン・エシユ; ニコラス・チヤイークワン・リング; ウイリアム・バシー・ウエーレンバーグ; ロジヤー・チヤールズ・ルイス・グイルミン
Original assignee: Salk Institute for Biological Studies
Current assignee: Salk Institute for Biological Studies
Priority date: 1983-08-29
Filing date: 1984-08-27
Publication date: 1994-09-28
Anticipated expiration: 2009-09-28
Also published as: HU190973B; IE57730B1; FI81589C; DK161835C; DK413084A; JPS6072900A; EP0137689B1; FI81589B; CS251085B2; AR248284A1; DK413084D0; AU577542B2; DE3461641D1; NO167867C; HUT35000A; ES8606401A1; FI843355A0; SU1423000A3; YU148884A; KR850001536A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は哺乳動物の脳下垂体の機能に影響を及ぼすペプ
チドに関する。更に詳細には、本発明は脳下垂体による
生長ホルモンの放出を促進して特定の種にとって特に有
用なペプチドに関する。

1982年に、脳下垂体生長ホルモンまたはソマトトロピン
の視床下部放出因子はヒト島細胞腫瘍から単離され、精
製、同定および合成された。試験したところ、これは、
脳下垂体による生長ホルモン（GH）の放出を促進するこ
とが発見された。このペプチドは次の配列を有する。

Ｈ−Tyr−Ala−Asp−Ala−Ile− Phe−Thr−Asn−Ser−Tyr− Arg−Lys−Val−Leu−Gly− Gln−Leu−Ser−Ala−Arg− Lys−Leu−Leu−Gln−Asp− Ile−Met−Ser−Arg−Gln− Gln−Gly−Glu−Ser−Asn− Gln−Glu−Arg−Gly−Ala −Arg−Ala−Arg−Leu−NH₂ ヒト視床下部生長ホルモン放出因子（hGRF）は同じ構造
を有することがボーエン（Bohlen）らによって発見され
た。Biochem.and Biophs.Res.Comm.,114,3,930〜936
（1983）。

今度、44−残基ペプチド類がブタ、ウシ、ヤギおよびヒ
ツジ視床下部の精製抽出物から単離され、そして同定さ
れた。これらは後記のhGRFの構造と数個のアミノ酸残基
が異なる構造を各々有することが発見された。

hGRFの組成からみれば、ブタGRF（pGRF）は類似体［Arg
³⁴，Gln³⁸，Val⁴²］−hGRF（１−44）−NH₂として表す
ことができる。これはpGRFが次の構造を有することを意
味する。

Tyr−Ala−Asp−Ala−Ile− Phe−Thr−Asn−Ser−Tyr− Arg−Lys−Val−Leu−Gly− Gln−Leu−Ser−Ala−Arg− Lys−Leu−Leu−Gln−Asp− Ile−Met−Ser−Arg−Gln− Gln−Gly−Glu−Arg−Asn− Gln−Glu−Gln−Gly−Ala− Arg−Val−Arg−Leu これは以下、pGRFまたはブタソマトクリニンと呼ぶ。こ
のペプチドは温血動物（特に、ブタ）の生長、冷血動物
の生長および水生動物養殖における生長を促進するのに
使用できる。

hGRFの組成からみれば、ウシGRF（bGRF）は類似体［Asn
²⁸，Arg³⁴，Gln³⁸，Lys⁴¹，Val⁴²］−hGRF（１−44）−
NH₂として表すことができる。これはbGRFが次の構造を
有することを意味する。

Tyr−Ala−Asp−Ala−Ile− Phe−Thr−Asn−Ser−Tyr− Arg−Lys−Val−Leu−Gly− Gln−Leu−Ser−Ala−Arg− Lys−Leu−Leu−Gln−Asp− Ile−Met−Asn−Arg−Gln− Gln−Gly−Glu−Arg−Asn− Gln−Glu−Gln−Gly−Ala− Lys−Val−Arg−Leu これは、以下bGRFまたはウシソマトクリニンと呼ぶ。ヤ
ギGRFは同じ構造を有しており、そして、温血動物（特
にウシ）の生長、冷血動物の生長および水生動物養殖に
おける生長を促進させるのに使用できる。これはまた、
特製チーズ製造用のミルクを得るために、ウシおよびヤ
ギのミルク産生量を増加させるためにも使用できる。

hGRFの組成からみれば、ヒツジGRF（oGRF）は類似体［I
le¹³，Asn²⁸，Arg³⁴，Gln³⁸，Lys⁴¹，Val⁴²］−hGRF
（１−44）−NH₂として表すことができる。これはoGRF
が次の構造を有することを意味する。

Tyr−Ala−Asp−Ala−Ile− Phe−Thr−Asn−Ser−Tyr− Arg−Lys−Ile−Leu−Gly− Gln−Leu−Ser−Ala−Arg− Lys−Leu−Leu−Gln−Asp− Ile−Met−Asn−Arg−Gln− Gln−Gly−Glu−Arg−Asn− Gln−Glu−Gln−Gly−Ala− Lys−Val−Arg−Leu これは以下、oGRFまたはヒツジソマトクリニンと呼ぶ。
このペプチドは温血動物（特にヒツジ）の生長、冷血動
物の生長および水生動物養殖における生長を促進させる
のに使用できる。このペプチドはまた特製チーズ製造用
のミルクを得るために、牝ヒツジのミルク産生量を増加
させるためにも使用できる。

本発明による獣医薬および医療薬組成物は医療薬または
獣医薬の使用できる液状または固形状担体中に分散され
た、pGRF、bGRF、oGRF、またはこれらの非毒性塩のいず
れかを含有する。このような組成物は診断または治療の
目的で短期あるいは長期投与用の臨床薬（ヒトおよびヒ
ト以外の動物の両方）として使用できる。さらに、この
ような組成物はブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジまたはその他
の動物において、筋肉塊の生長および／またはミルク産
生を促進するのにも使用できる。

ペプチドの定義のために使用される命名法は、シュロダ
ー（Schroder）およびルブク（Lubke）による“The Pep
tides",アカデミックプレス（1965年）に定められたも
のであり、ここでは慣用的な表示法にしたがってＮ−末
端のアミノ基は左に、そしてＣ−末端のカルボキシル基
は右に示される。アミノ酸残基が異性体を有する場合、
もし他に指定されなければそれは表示されたアミノ酸の
Ｌ−体である。

本発明は下記の配列（ａ）または（ｂ）：（ａ）Tyr−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Asn−Ser
−Tyr−Arg−Lys−Val−Leu−Gly−Gln−Leu−Ser−Ala
−Arg−Lys−Leu−Leu−Gln−Asp−Ile−Met−R₂₈−Arg
−Gln−Gln−Gly−Glu−Arg−Asn−Gln−Glu−Gln−Gly
−Ala−R₄₁−Val−Arg−Leu ［式中、R₂₈はSerまたはAsnであり；R₄₁はArgまたはLys
である］；（ｂ）Tyr−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe− Thr−Asn−Ser−Tyr−Arg−Lys−Ile−Leu− Gly−Gln−Leu−Ser−Ala−Arg−Lys−Leu− Leu−Gln−Asp−Ile−Met−Asn−Arg−Gln− Gln−Gly−Glu−Arg−Asn−Gln−Glu−Gln− Gly−Ala−Lys−Val−Arg−Leu を有する合成GRFペプチドを提供する。

ペプチドはいかなる適当な方法、例えば固相法、部分固
相法、断片縮合、古典的な溶液カップリング、または最
近開発された組み換えDNA法の使用などにより合成され
る。例えば、固相法のみの合成法はStewartおよびYoung
による“Solid-Phases Synthesis"、フリーマン社、サ
ンフランシスコ（1969年）に説明されており、またVale
らによる1978年８月８日付米国特許第4105603号明細書
に開示されている。断片縮合法による合成は1676年８月
３日付米国特許第3972859号明細書に例示されている。
他の利用しうる合成法は米国特許第3842067号（1974年1
0月15日付）および同第3862925号（1975年１月28日付）
の各明細書に例示される。組み換えDNA法による合成ペ
プチドの製造は大量生産も可能であろう。

本出願のための組み換えDNA法を使用する合成法は、意
図する形のGRF断片をコードする構造遺伝子の適切な使
用を包含すると理解すべきである。合成GRFはこのよう
な構造遺伝子と共にプロモーターおよびオペレーターを
含む発現ベクターを使用して微生物を形質転換し、そし
て形質転換されたその微生物にGRFを発現せしめること
により得ることができる。ヒト以外の動物もまた、この
ような構造遺伝子ならびに米国特許第4286282号明細書
（1981年６月30日付）に記載の一般方法を使用する遺伝
子操作により、あるいは1983年５月26日発行のWO83/017
83および1982年12月23日発行のWO82/04443に開示される
胚の顕微注入を使用する遺伝子操作により、GRFを産生
するのに使用される。合成GRFはまた、上記の２冊のWO
刊行物に記載の方法により成長促進が予定される動物に
おいて直接産生される。

化学合成法またはカップリング合成法では、各種のアミ
ノ酸部分の不安定な側鎖基を適当な保護基（最終的にそ
の保護基が除去されるまでその部位での化学反応の発生
を阻止する基）で保護することが通常行われる。また、
アミノ酸やペプチド断片がカルボキシル基の部位で反応
する間それらのα−アミノ基を保護し、続いてα−アミ
ノ基の部位で反応を行わせるためにα−アミノ保護基を
選択的に除去することも通常行われる。従って、合成法
の一段階として、ペプチド鎖中の意図した配列に適当な
側鎖保護基をもつアミノ酸残基を含む中間体化合物が製
造されることは一般的なことである。

以下に本発明のペプチドの合成中間体を示す。

X¹−Tyr（X²）−Ala−Asp（X³）− Ala−Ile−Phe−Thr（X⁴）− Asn−Ser（X⁵）−Tyr（X²）− Arg（X⁶）−Lys（X⁷）−R₁₃ −Leu−Gly−Gln−Leu−Ser（X⁵）− Ala−Arg（X⁶）−Lys（X⁷）− Leu−Leu−Gln−Asp（X³）− Ile−Met−R₂₈（X⁵）−Arg（X⁶）− Gln−Gln−Gly−Glu（X³）− Arg（X⁶）−Asn−Gln−Glu（X³）− Gln−Gly−Ala−R₄₁（X⁶またはX⁷）− Val−Arg（X⁶）−Leu−（X⁸）ここでX¹は水素原子またはα−アミノ保護基である。X¹
に含まれるα−アミノ保護基は、ポリペプチドの段階合
成法の技術分野で有用であると知られているものであ
る。そのようなα−アミノ保護基には（１）アシル型保
護基、例えばホルミル基、トリフルオロアセチル基、フ
タリル基、トルエンスルホニル基（Tos）、ベンゼンス
ルホニル基、ニトロフェニルスルフェニル基、トルチル
スルフェニル基、ｏ−ニトロフェノキシアセチル基、ク
ロロアセチル基、アセチル基、およびγ−クロロブチリ
ル基；（２）芳香族ウレタン型保護基、例えばベンジル
オキシカルボニル基（Ｚ）、およびｐ−クロロベンジル
オキシカルボニル基、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボ
ニル基、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル基または
ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル基などの置換さ
れたZ;（３）脂肪族ウレタン型保護基、例えばｔ−ブチ
ルオキシカルボニル基（BOC）、ジイソプロピルメチル
オキシカルボニル基、イソプロピルオキシカルボニル
基、エトキシカルボミル基、およびアリルオキシカルボ
ン基；（４）シロクアルキルウレタン型保護基、例えば
シクロペンチルオキシカルボニル基、アダマンチルオキ
シカルボニル基、およびシクロヘキシルオキシカルボニ
ル基；（５）チオウレタン型保護基、例えばフェニルチ
オカルボニル基；（６）アルキル型保護基、例えばトリ
フェニルメチル基（トリチル基）およびベンジル基：
（７）トリアルキルシラン基、例えばトリメチルシラン
基；が含まれる。好適なα−アミノ保護基はBOCであ
る。

X²はTyrのフェノール性水酸基のための保護基であり、
テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基、トリチル基、
Bzl、CBZ、4Br−CBZおよび2,6−ジクロロベンジル基（D
CB）よりなる群から選択される。好適な保護基は2,6−
ジクロロベンジル基である。X²は水素原子であることも
でき、この場合は水酸基に保護基が存在しないことを意
味する。

X³は水素原子であるか、あるいはAspまたはGluのカルボ
キシル基のためのエステル形成性保護基であってBzl、
2,6−ジクロロベンジル基、メチル基およびエチル基よ
りなる群から選択される。

X⁴およびX⁵はThrまたはSerの水酸基のための保護基であ
り、アセチル基、ベンゾイル基、ｔ−ブチル基、トリチ
ル基、テトラヒドロピラニル基、Bzl、2,6−ジクロロベ
ンジル基およびCBZよりなる群から選択される。好適な
保護基Bzlである。X⁴および／またはX⁵は水素原子であ
ることもでき、それは水酸基に保護基が存在しないこと
を意味する。

X⁶はArgのグアニジノ基のための保護基であって、ニト
ロ基、Tos、CBZ、アダマンチルオキシカルボニル基およ
びBOCよりなる群から選択されるか、あるいは水素原子
である。

X⁷は水素原子であるか、あるいはLysの側鎖アミノ基の
ための保護基である。適当な側鎖アミノ保護基の例は２
−クロロベンジルオキシカルボニル基（2Cl−Ｚ）、To
s、ｔ−アミルオキシカルボニル基およびBOCである。

側鎖アミノ保護基の選択は特に限定的なものではない
が、それは合成中にα−アミノ保護基を除去する際に除
去されないものでなければならない。それ故、α−アミ
ノ保護基と側鎖アミノ保護基とは同じものであってはな
らない。

Glnおよび／またはAsnの側鎖アミド基はキサンチル（Xa
n）によるように適当に任意に保護することができる。

X⁸はOH、OCH₃、エステル類、アミド類、ヒドラジド類、
−Ｏ−CH₂−樹脂支持体、および−NH−樹脂支持体から
なる群から選択され、OHおよびアミド以外の基は広義に
は保護基と考えられる。

中間体の構造式において、X¹、X²、X³、X⁴、X⁵、X⁶、X⁷
およびX⁸のうちの少なくとも１つは保護基である。

ペプチド合成で使用する特定の側鎖保護基を選択する場
合には次の規則に従う：（ａ）保護基は、合成の各工程
でα−アミノ保護基を除去するために選択された試薬に
対して、また、その反応条件下で安定でなければならな
い；（ｂ）保護基はカップリング条件下でその保護特性
を維持し、脱離されるものであってはならない；および
（ｃ）側鎖保護基は、意図したアミノ酸配列を含む合成
の完了時点で、ペプチド鎖を変成させない反応条件下に
除去できなければならない。

ペプチドは例えばMerrifieldによるJ.Am.Chem.Soc.,8
5、2149ページ（1963年）に記載されるような固相合成
法を使用して有利に製造されるが、当該技術分野で知ら
れる他の同様な化学合成法もまた先に述べたごとく使用
することができる。固相合成法は保護したα−アミノ酸
を適当な樹脂にカップリングさせることによりペプチド
のＣ−末端から開始される。のような出発物質は、α−
アミノ保護Leuをエステル結合でクロロメチル化樹脂ま
たはヒドロキシメチル樹脂へ結合させるか、あるいはア
ミド結合でBHA樹脂またはMBHA樹脂は結合させることに
より製造される。ヒドロキシメチル樹脂の製造はBoda-n
skyらによってChem.Ind.（ロンドン）38、1597〜98（19
66）に開示されている。クロルメチル化樹脂はカリフォ
ルニア州、リッチモンドに所在するBio Rad Laforatori
es社から、また、Lab.Systems,Inc.社から市販されてい
る。このような樹脂の製造はStewartらにより“固相ペ
プチド合成”（Freeman＆Co.,社、サンフランシスコ、1
969）に開示されている。BHAおよびMBHA樹脂支持体は市
販されており、そして一般にこれらは意図した合成ポリ
ペプチドがＣ−末端に非置換アミドを有する場合のみ使
用される。

例えば、遊離カルボキシ末端を有する44−アミノ酸ペプ
チドを合成しようとする場合、BOCで保護したLeuはMona
hanおよびGilonによるBiopolymer、12、2513〜2519ペー
ジ（1973年）に記載の方法に従ってクロロメチル化樹脂
にカップリングされる。BOC−Alaのカップリング後に、
そのα−アミノ保護基は例えば塩化メチレン中のトリフ
ルオロ酢酸（TFA）、TFA単独またはジオキサン中のHCl
を用いることにより除去される。この保護基除去反応は
約０℃ないし室温で実施される。特定のα−アミノ保護
基を除去するための他の標準的な開裂試薬ならびに条件
は、SchroderおよびLubkeによる“The Peptides",1、72
〜75ページ、アカデミックプレス（1965年）に記載のご
とく使用される。

Leuからα−アミノ保護基を除去した後、残りのα−ア
ミノ保護−および側鎖保護−アミノ酸は意図した順序で
段階的にカップリングされて先に定義した中間体化合物
を得るか、あるいは合成において各アミノ酸を別々に加
える代わりに、それらのうちのいくつかを固相反応器に
添加する前に互いにカップリングさせてもよい。適当な
カップリング剤の選択は当業者の知るところである。N,
N'−ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCCI）はカップ
リング剤として特に適している。

ペプチドの固相合成法で使用される活性化試薬はペプチ
ドの技術分野で周知である。適当な活性化試薬は例えば
（１）カルボジイミド類（例えば、N,N'−ジイソプロピ
ルカルボジイミド、N,N'−ジシクロヘキソルカルボジイ
ミド（DCCI）；（２）シアナミド類（例えば、N,N'−ジ
ベンジルシアナミド）；（３）ケティミン類；（４）イ
ソオキサゾリウム塩類（例えば、Ｎ−エチル−５−フェ
ニルイソオキサゾリウム−3'−スルホネート）；（５）
環中に１〜４個のチッ素原子を含む芳香族性単環式チッ
素含有複素環式アミド類（例えば、イミダゾリド類、ピ
ラゾリド類、および1,2,4−トリアゾリド類。特に有用
な複素環式アミド類はN,N'−カルボニルジイミダゾー
ル、N,N′−カルボニル−ジ−1,2,4−トリアゾールであ
る。）；（６）アルコキシル化アセチレン（例えば、エ
トキシアセチレン）；（７）アミノ酸のカルボキシル部
分と混合無水物を形成する試薬類（例えば、エチルクロ
ロホルメートおよびイソブチルクロロホルメート）；お
よび（８）アミノ酸のカルボキシル部分と活性エステル
を形成する試薬類（例えば、１個のチッ素原子上にヒド
ロキシル基を有するチッ素含有複素環式化合物類、例え
ば、Ｎ−ヒドロキシフタイルイミド、Ｎ−ヒドロキシス
クシンイミドおよび１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
（HOBT））などである。他の活性化試薬ならびにペプチ
ドカップリングにおけるそれらの使用は、Schroderおよ
びLubkeによる同書、第III章およびKapoorによるJ.Pha
r.Sci.、59、１〜27ページ（1970年）に記載されてい
る。

各保護アミノ酸またはアミノ酸配列は約２倍もしくはそ
れ以上の過剰量で固相反応器に導入され、そしてそのカ
ップリングはジメチルホルムアミド（DMF）：CH₂Cl
₂（1:1）の媒体中またはDMF中、もしくはCH₂Cl₂中で実
施される。不完全なカップリングが生ずる場合に、その
カップリング法は次のアミノ酸のカップリングに先立つ
α−アミノ保護基の除去前に繰り返し行われる。各合成
段階におけるカップリング反応の完了は、E.Kaiserらに
よるAnal.Biochem.、34、595ページ（1970年）に記載の
ごとく、ニンヒドリン反応により監視される。

意図したアミノ酸配列が完了した後に、その中間体ペプ
チドは液状弗化水素のような試薬で処理することにより
樹脂支持体から切り離すことができ、その液状弗化水素
はペプチドを樹脂から開裂させるばかりでなく、残存す
る全ての側鎖保護基X²、X³、X⁴、X⁵、X⁶、X⁷およびX⁸、
ならびにα−アミノ保護基X¹を開裂させて、ペプチドを
与える。

別の合成経路として、中間体ペプチドはアルコール分解
によって樹脂支持体から分離させることができ、その
後、回収Ｃ−末端アルキルエステルは加水分解により酸
に転化される。次いで側鎖保護器は前記のようにして、
あるいは、その他の公知の方法（例えば、Pd/BaSO₄によ
る接触還元）により除去することができる。開裂にフッ
化水素を使用する場合、掃去用にアニソールおよび硫化
メチレンを反応容器中に含める。

下記の実施例を固相技法による本発明のGRFの好ましい
合成方法を例証するものである。

実施例１次式Ｈ−Tyr−Ala−Asp−Ala−Ile− Phe−Thr−Asn−Ser−Tyr− Arg−Lys−Val−Leu−Gly− Gln−Leu−Ser−Ala−Arg− Lys−Leu−Leu−Gln−Asp− Ile−Met−Ser−Arg−Gln− Gln−Gly−Glu−Arg−Asn− Gln−Glu−Gln−Gly−Ala− Arg−Val−Arg−Leu−OH で示されるpGRF（１−44）遊離酸の合成は、Beckman990
ペプチド合成機を用いてLab Systems,Inc.、社から市販
されているようなクロルメチル化樹脂（1gあたり0.9ミ
リ当量のClを含有）上で段階法によりおこなわれた。

BOC−Leuの樹脂へのカップリングはMonahanらがBiopoly
mers、第12巻（1973）pp.2513〜2519に開示した一般的
方法により行った。斯くして、樹脂1gあたり約0.22ミリ
モルのLeuの置換が生じた。使用される全ての溶剤はMet
残基の硫黄を酸化する恐れのある酸素を排除するため
に、好ましくはヘリウムのような不活性ガスを吹き込む
ことによりガス抜きした。

保護基の除去ならびに中和後、ペプチド鎖を樹脂上に段
階的に形成させた。保護基の除去、中和および各アミノ
酸の添加は、Guilleminらによる米国特許第3904594号明
細書に詳細に説明される方法に従って一般的に行われ
た。カップリングは特に下記のスケジュールＡに述べた
ようにして行った。

要するに、このカップリング反応のために、２時間の間
に樹脂1gあたり、BOC−保護アミノ酸の塩化メチレン溶
液１ミリモルプラス１当量の0.5モルDCCI塩化メチレン
溶液または30％DMF塩化メチレン溶液を使用した。Argを
カップリングする場合、10％DMFと塩化メチレンの混合
物を使用した。SerおよびThr用のヒドロキシ側鎖保護基
としとBzlを使用した。Lys側鎖用の保護基として２−ク
ロロ−ベンジルオキシカルボニル（2Cl−Ｚ）を使用し
た。Argのグアニジノ基を保護するためにTosを使用し
た。また、GluまたはAspカルボキシル基はBzlエステル
として保護した。Tyrのフェノール性ヒドロキシル基は
2,6−ジクロロベンジルで保護した。合成の最後の時点
で、下記の組成が得られた。

X¹−Tyr（X²）−Ala−Asp（X³）− Ala−Ile−Phe−Thr（X⁴）− Asn−Ser（X⁵）−Tyr（X²）− Arg（X⁶）−Lys（X⁷）−Val− Leu−Gly−Gln−Leu−Ser（X⁵）− Ala−Arg（X⁶）−Lys（X⁷）− Leu−Leu−Gln−Asp（X³）− Ile−Met−Ser（X⁵）−Arg（X⁶）− Gln−Gln−Gly−Glu（X³）− Arg（X⁶）−Asn−Gln−Glu（X³）− Gln−Gly−Ala−Arg（X⁸）− Val−Arg（X⁶）−Leu−（X⁸）（式中、X¹はBOSである；X²は2,6−ジクロロベンジルで
ある；X³はベンジルエステルである；X⁴はBzlである；X
⁵はBzlである；X⁶はTosである；X⁷は2Cl−Ｚである；そ
してX⁸は−Ｏ−CH₂−ベンゼン−ポリスチレン樹脂支持
体である。）最後のTyr残基が樹脂へカップリングされた後、BOCはCH
₂Cl₂中の45％TFAを用いて除去した。ペプチド鎖の残り
の保護基を除去するために、それはペプチド−樹脂1gあ
たりアニソール1.5ml、メチルエチルスルフィド0.25ml
およびHF10mlを用いて−20℃で1/2時間および０℃で1/2
時間処理した。高真空下にHFを排除した後、ペプチド−
樹脂残留物を乾燥ジエチルエーテルおよびクロロホルム
で交互に洗浄し、次いでそのペプチドをガス抜きした2N
酢酸水溶液で抽出した。酢酸抽出物を凍結乾燥させ白色
の毛羽だった物質が得られた。

その後、保護基を除去しかつ樹脂から切り離されたペプ
チドは30％酢酸に溶解し、Sephadex Ｇ−50微細ゲル濾
過を行った。

pH4.5の0.01M NH₄OAc 400mlの充てんされている混合フ
ラスコ中にpH6.5の0.4M NH₄OAc １を滴加することに
よって形成される下に向かって凸の濃度勾配を使用しCM
−32カルボキシメチルセルロース（ワットマン）カチオ
ン交換クロマトグラフィー（1.8×18cm、カラム容量＝5
0ml）することによってペプチドを更に精製した。最終
精製は、nBuOH/EtOH/ピリジン/0.2％NHOAc（4:1:1:7）
溶剤系により、Sephadex G−50微細支持体（ファルマシ
ア製）で分取クロマトグラフすることによって行った。
精製法の詳細はLingらによりBiochem Biophys.Res.Comm
un.95、945（1980）に開示されている。クロマトグラフ
分画はTLCにより入念にチェックし、純粋な画分のみを
プールした。LeuをMBHA樹脂に結合させる米国特許第429
2313号明細書に開示された方法に従って、MBHA樹脂を用
いて前記の合成を再度行い、アミド化Ｃ−末端を有する
同じペプチドを製造した。

合成したpGRF（１−44）遊離酸とpGRF（１−44）アミド
の比旋光度は、それぞれ−66.1゜±１および−64.0゜±
１であった（ｃ＝１、１％酢酸中）。

実施例２生長ホルモンの放出を促進させるペプチドの効力を測定
するために、合成hGRF（１−44）−NH₂を使用し、これ
をpGRF（１−44）−NH₂および脳下垂体細胞から生長ホ
ルモンの放出を促進させる公知の効力を有するGRF参照
標準と各構成アミノ酸ごとに比較対照することによって
試験管内試験を行った。GRF参照標準はBrazeauらにより
Endocrinology、110巻、A538（1982）に開示され、か
つ、定義されている。これは、脳下垂体細胞単層バイオ
アッセイにおいてGH放出に関する最大反応の半分をもた
らす量のラット視床下部の配合物である。４〜５日前に
除去したラットの脳下垂体細胞を含む培養物が使用され
た。規定された標準培地の培養物および成長ホルモンの
分泌が最適であると考えられる培養物の両方が、Bnazea
uらによるRegulatory Peptides,1、255ページ（1981
年）に記載の一般方法で比較試験のために使用された。
試験すべき物質とのインキュベーションは３〜４時間行
われ、そして培地のアリコートを採取して処理し、免疫
反応性GH（irGH）におけるそれらの含有量を放射線免疫
検定法で測定した。

この比較試験の結果から、等モル比においては、pGRF
（１−44）−NH₂は合成hGRFペプチドの完全な固有生物
学的活性とほぼ同じ力価を有していることが明らかにな
った。

実施例３次式、Ｈ−Tyr−Ala−Asp−Ala−Ile− Phe−Thr−Asn−Ser−Tyr− Arg−Lys−Val−Leu−Gly− Gln−Leu−Ser−Ala−Arg− Lys−Leu−Leu−Gln−Asp− Ile−Met−Asn−Arg−Gln− Gln−Gly−Glu−Arg−Asn− Gln−Glu−Gln−Gly−Ala− Lys−Val−Arg−Leu−NH₂ で示されるbGRF（１−44）アミドの合成をBeckman 990
ペプチド合成機およびMBHA樹脂を用いて段階的に行っ
た。BOC−Leuの樹脂へのカップリングは米国特許第4292
313号明細書に開示されているような一般的方法により
行った。斯くして、使用したNHBA樹脂の置換にもよる
が、樹脂1gあたり約0.2〜0.6ミリモルのLeuの置換がお
こなわれた。使用される全ての溶剤はMet残基の硫黄を
酸化する恐れのある酸素を排除するために、好ましくは
ヘリウムのような不活性ガスを吹き込むことによりガス
抜きした。

保護基の除去ならびに中和後、ペプチド鎖を樹脂上に段
階的に形成させた。保護基の除去、中和および各アミノ
酸の添加は、Guilleminらによる米国特許第3904594号明
細書に詳細に説明される方法に従って一般的に行われ
た。カップリングは実施例１のスケジュールＡに述べた
ようにして行った。

カップリング反応は実施例１に述べたようにして行っ
た。合成が終了した時点で、下記の組成の生成物が得ら
れた。

X¹−Tyr（X²）−Ala−Asp（X³）− Ala−Ile−Phe−Thr（X⁴）− Asn−Ser（X⁵）−Tyr（X²）− Arg（X⁶）−Lys（X⁷）−Val− Leu−Gly−Gln−Leu−Ser（X⁵）− Ala−Arg（X⁶）−Lys（X⁷）− Leu−Leu−Gln−Asp（X³）− Ile−Met−Asn−Arg（X⁶） −Gln−Gln−Gly−Glu（X³）− Arg（X⁶）−Asn−Gln−Glu（X³）−Gln−Gly−Ala−Lys
（X⁷）− Val−Arg（X⁶）−Leu−（X⁸）（式中、X¹はBOSである；X²は2,6−ジクロロベンジルで
ある；X³はベンジルエーテルである；X⁴はBzlである；X
⁵はBzlである；X⁶はTosである；X⁷は2Cl−Ｚである；そ
してX⁸は−NH−MBHA樹脂支持体である。）最後のTyr残基が樹脂へカップリングされた後、BOCはCH
₂Cl₂中の45％TFAを用いて除去した。ペプチド鎖の残り
の保護基を除去するために、それはペプチド−樹脂1gあ
たりアニソール1.5ml、メチルエチルスルフィド0.25ml
およびHF10mlを用いて−20℃で1/2時間及び０℃で1/2時
間処理した。高真空下にHFを排除した後、ペプチド−樹
脂残留物を乾燥ジエチルエーテルおよびクロロホルムで
交互に洗浄し、次いでそのペプチドをガス抜きした2N酢
酸水溶液で抽出した。酢酸抽出物を凍結乾燥させ白色の
毛羽だった物質が得られた。

その後、保護基を除去しかつ樹脂から切り離されたペプ
チドは30％酢酸に溶解し、Sephadex G−50微細ゲル濾過
をおこなった。

次いで、実施例１に述べたように、カチオン交換クロマ
トグラフィー、次いで、分取クロマトグラフィーを行う
ことによってペプチドを更に精製した。

クロルメチル化樹脂を使用してこの合成を再度行ない、
遊離酸Ｃ−末端を有する同じペプチドを生成した。合成
は一般的に、Biopolymers,12、2513〜19（1973）に開示
されたLeuをクロルメチル化樹脂に結合させる方法によ
り行った。

クロルメチル化樹脂を使用し、この合成を再度行い、実
施例１の方法どおりに実施し、遊離酸Ｃ−末端を有する
同じペプチドを生成した。

合成したbGRF（１−44）遊離酸とbGRF（１−44）アミド
の比旋光度は、ともに−64゜±１であった（ｃ＝１、１
％酢酸中）。

実施例４このペプチドの生長ホルモン放出促進効力を測定するた
めに、実施例２に述べたように、合成hGRF（１−44）−
NH₂を使用し、等モル濃度のbGRF（１−44）−NH₂と各構
成アミノ酸ごとに比較対照することによって試験管内試
験を行った。

この比較試験の結果から、等モル比においては、bGRF
（１−44）−NH₂は合成ペプチドの完全固有生物学的活
性およびほぼ同じ力価を有することが明らかになった。
倍量投与因数仕様試験では、bGRFはhGRF（１−44）−NH
₂と同じ固有活性と、54〜93％の信頼限界でhGRF（１−4
4）−NH₂の約70％相当の比活性を有することが示され
た。

実施例５次式、Ｈ−Tyr−Ala−Asp−Ala−Ile− Phe−Thr−Asn−Ser−Tyr− Arg−Lys−Ile−Leu−Gly− Gln−Leu−Ser−Ala−Arg− Lys−Leu−Leu−Gln−Asp− Ile−Met−Asn−Arg−Gln− Gln−Gly−Glu−Arg−Asn− Gln−Glu−Gln−Gly−Ala− Lys−Val−Arg−Leu−NH₂ で示されるoGRF（１−44）アミドの合成をBeckman 990
ペプチド合成機およびMBHA樹脂を使用し、実施例３に述
べたように段階的方法によって行った。合成の終了時点
で次の組成を有する生成物が得られた。

X¹−Tyr（X²）−Ala−Asp（X³）− Ala−Ile−Phe−Thr（X⁴）− Asn−Ser（X⁵）−Tyr（X²）− Arg（X⁶）−Lys（X⁷）−Ile− Leu−Gly−Gln−Leu−Ser（X⁵）− Ala−Arg（X⁶）−Lys（X⁷）−Leu− Leu−Gln−Asp（X³）−Ile− Met−Asn−Arg（X⁶）−Gln− Gln−Gly−Glu（X³）−Arg（X⁶）− Asn−Gln−Glu（X³）−Gln− Gly−Ala−Lys（X⁷）−Val− Arg（X⁶）−Leu−（X⁸）（式中、X¹はBOSである；X²は2,6−ジクロロベンジルで
ある；X³はベンジルエステルである；X⁴はBzlである；X
⁵はBzlである；X⁶はTosである；X⁷は2Cl−Ｚである；X⁸
は−NH−MBHA樹脂支持体である。）最後のTyr残基が樹脂へカップリングされた後、BOC基は
CH₂Cl₂中の45％TFAを用いて除去した。残りの保護ペプ
チド樹脂の開裂および脱保護は実施例３に述べたように
しておこなった。開裂および脱保護したペプチドは30％
酢酸に溶解させ、Sephadex G−50微細ゲル濾過、カチオ
ン交換クロマトグラフィーおよび最後に分取クロマトグ
ラフィーを実施例１に述べたようにして行った。

クロルメチル化樹脂を使用し、実施例１に述べたように
してこの合成を再度行い、遊離酸Ｃ−末端を有する同じ
ペプチドを生成した。

合成したoGRF（１−44）遊離酸とoGRF（１−44）アミド
の比旋光度は、それぞれ−64.1゜±１および−62.0゜±
１であった（ｃ＝１、１％酢酸中）。

実施例６このペプチドの生長ホルモン放出促進効力を測定するた
めに、実施例２に述べたように、合成hGRF（１−44）−
NH₂を使用し、等モル濃度のoGRF（１−44）−NH₂（実施
例５）と各構成アミノ酸ごとに比較対照することによっ
て試験管内試験を行った。

この比較試験の結果から、等モル比においては、oGRF
（１−44）−NH₂は合成ペプチドの完全固有生物学的活
性およびほぼ同じ力価を有することが明らかになった。
倍量投与因数様式試験では、oGRFはhGRF（１−44）−NH
₂と同じ固有活性と、hGRF（１−44）−NH₂の約70％相当
の比活性を有することが示された。

実施例７実施例３において製造したペプチドbGRF（１−44）−NH
₂を用いて、インビボ試験を行った。

29頭のホルスタイン牛（体重646±14kg）を６群に分
け、それぞれ１頭あたり０（プラセボ）、3.125、6.2
5、12.5、25.0および50.0mgのbGRF（１−44）−NH₂を投
与した。投与は、ペプチドを12.8mlの滅菌蒸留水に溶解
し、頚静脈カニューレを通じて24時間かけて行った。20
分ごとに血液を採取して、血清中のGHレベルを測定し
た。試験中、牛の挙動に異常は認められなかった。

次に長期間のインビボ試験を行った。15頭のホルスタイ
ン牛（体重556±17kg）を３群に分け、20日間にわた
り、それぞれ１頭あたり０（プラセボ）、１および3mg/
24時間のbGRF（１−44）−NH₂を投与した。投与は上述
の方法と同様に行った。毎日乳を搾り、その量を測定す
るとともに、組成の分析を行った。試験期間中、牛の挙
動に異常は認められず、試験終了から10日間経過後にお
いても、牛はすべて生存した。

以上の結果から、bGRFは牛に対して毒性を有していない
ことが示された。また、この結果から、pGRFおよびoGRF
も同様に、動物に対して毒性を有してないものと考えら
れた。

合成pGRF、bGRFおよびoGRFペプチドを飼育動物、特に、
ブタ、ウシ、ヤギおよびヒツジあるいはその他の温血動
物に長期投与すると、同化作用を促進し、その結果、筋
肉塊に関し、体重が増加することが期待される。GRFを
その対応する動物種用の獣医薬として使用すること、即
ち、oGRFはヒツジに、bGRFはウシまたはヤギに使用する
ことは理想的な使用形態である。なぜなら、注射あるい
はその他の方法により投与された分子は、処置される動
物の種と同じ種の分子なので抗原性がないからである。
また、このような動物種の牝においてはミルク産生量を
増加させる。養魚およびその他の冷血棲動物の水産養殖
で使用し、生長を促進させることも重要である。約５％
程度の低純度で動物に投与することも可能であろう。一
般的に、このペプチドを獣医薬用の固体または液体担体
と併用し、この使用目的に関し、広く医薬組成物と呼ば
れるものを製造することにより投与が行われる。

医薬組成物を形成するために薬学的に受容される担体と
組合わされた合成GRFペプチドまたはその無毒性塩は、
ヒトを含む哺乳動物へ静脈内、皮下、筋肉内、鼻腔内ま
たは経口的に投与することができる。

治療を受ける患者がGH放出の治療処理を必要とする場
合、そのGH放出を刺激するための投与は医師により行わ
れる。必要とされる投与量は治療すべき個々の症状、そ
の症状の程度および希望する治療存続期間によって変化
するだろう。

このようなペプチドは酸付加塩または金属錯体（例えば
亜鉛や鉄との錯体、本出願においてはこれらを塩と考え
る）などの薬学的に受容される無毒性塩の形でしばしば
投与される。このような酸付加塩の例には塩酸塩、臭化
水素酸塩、硫酸塩、燐酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、ク
エン酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、アス
コルビン酸塩および酒石酸塩などがある。活性成分が錠
剤の形で経口的に投与される場合に、その錠剤はトラガ
カント、トウモロコシデンプンまたはゼラチンなどの結
合剤；アルギン酸のような崩壊剤；およびステアリン酸
マグネシウムのような滑沢剤を含むことができる。液体
での投与が望まれる場合に、甘味剤および／またはフレ
ーバー剤が用いられ、そして、等張食塩液または燐酸緩
衝液での静脈内投与が行われる。

ペプチドは医師の指導のもとで投与されるべきであり、
そして医薬組成物は通常薬学的に受容される担体と共に
ペプチドを含有するだろう。一般的に、非経口投与量は
患者の体重1kgあたり約20ナノグラムないし約2000ナノ
グラムのペプチドであるだろう。

本発明者らが現在知っている最良の様態を構成する好ま
しい実施例態様について本発明を説明してきたが、当該
技術分野において通常の知識を有する者には明らかなよ
うに、各種の変更や修正が特許請求の範囲で説明される
本発明の範囲から逸脱することなく行われうることは理
解されるだろう。

フロントページの続き (72)発明者フレデリツク・ステイーヴン・エシユアメリカ合衆国カリフオルニア州92054, オーシヤンサイド，フアイアー・マウンテイン・ドライブ 2929・ナンバー 69 (72)発明者ニコラス・チヤイークワン・リングアメリカ合衆国カリフオルニア州92122, サン・デイエゴ，ブローチ・ストリート 5324 (72)発明者ウイリアム・バシー・ウエーレンバーグアメリカ合衆国カリフオルニア州92122, サン・デイエゴ，チユーレイン・ストリート 5811 (72)発明者ロジヤー・チヤールズ・ルイス・グイルミンアメリカ合衆国カリフオルニア州92037, ラ・ホーラ，エンセリア・ドライブ 7316 (56)参考文献「Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．］117（３），772− 779（1983) 「Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．］116（２），726− 734（1983)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の（ａ）または（ｂ）：（ａ）Tyr−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe− Thr−Asn−Ser−Tyr−Arg−Lys−Val−Leu− Gly−Gln−Leu−Ser−Ala−Arg−Lys−Leu− Leu−Gln−Asp−Ile−Met−R₂₈−Arg−Gln− Gln−Gly−Glu−Arg−Asn−Gln−Glu−Gln −Gly−Ala−R₄₁−Val−Arg−Leu ［式中、R₂₈はSerまたはAsnであり；R₄₁はArgまたはLys
である］；（ｂ）Tyr−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe− Thr−Asn−Ser−Tyr−Arg−Lys−Ile−Leu− Gly−Gln−Leu−Ser−Ala−Arg−Lys−Leu− Leu−Gln−Asp−Ile−Met−Asn−Arg−Gln− Gln−Gly−Glu−Arg−Asn−Gln−Glu−Gln− Gly−Ala−Lys−Val−Arg−Leu のいずれかの配列を有する合成ペプチドまたはその非毒
性塩。
【請求項２】R₂₈がAsnであり、R₄₁がLysである、特許請
求の範囲第１項記載のペプチド。
【請求項３】R₂₈がSerであり、R₄₁がArgである、特許請
求の範囲第１項記載のペプチド。
【請求項４】下記の配列： Tyr−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Asn− Ser−Tyr−Arg−Lys−Ile−Leu−Gly−Gln− Leu−Ser−Ala−Arg−Lys−Leu−Leu−Gln− Asp−Ile−Met−Asn−Arg−Gln−Gln−Gly− Glu−Arg−Asn−Gln−Glu−Gln−Gly−Ala− Lys−Val−Arg−Leu を有する請求項１記載のペプチド。
【請求項５】Ｃ末端がアミド化されている、特許請求の
範囲第１項〜第４項のいずれかに記載のペプチド。
【請求項６】下記の（ａ）または（ｂ）：（ａ）Tyr−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe− Thr−Asn−Ser−Tyr−Arg−Lys−Val−Leu− Gly−Gln−Leu−Ser−Ala−Arg−Lys−Leu− Leu−Gln−Asp−Ile−Met−R₂₈−Arg−Gln− Gln−Gly−Glu−Arg−Asn−Gln−Glu−Gln− Gly−Ala−R₄₁−Val−Arg−Leu ［式中、R₂₈はSerまたはAsnであり；R₄₁はArgまたはLys
である］；（ｂ）Tyr−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe− Thr−Asn−Ser−Tyr−Arg−Lys−Ile−Leu− Gly−Gln−Leu−Ser−Ala−Arg−Lys−Leu− Leu−Gln−Asp−Ile−Met−Asn−Arg−Gln− Gln−Gly−Glu−Arg−Asn−Gln−Glu−Gln− Gly−Ala−Lys−Val−Arg−Leu のいずれかの配列を有する合成ペプチドまたはその非毒
性塩および獣医薬用の固形状または液状担体からなる、
ヒト以外の動物の生長を促進させる組成物。
【請求項７】ヒト以外の動物が温血動物である特許請求
の範囲第６項記載の組成物。
【請求項８】下記の配列： Tyr−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Asn− Ser−Tyr−Arg−Lys−Val−Leu−Gly−Gln− Leu−Ser−Ala−Arg−Lys−Leu−Leu−Gln− Asp−Ile−Met−Asn−Arg−Gln−Gln−Gly− Glu−Arg−Asn−Gln−Glu−Gln−Gly−Ala− Lys−Val−Arg−Leu を有する合成ペプチドおよび獣医薬用担体からなる、ウ
シまたはヤギの生長を促進させるために使用される特許
請求の範囲第６項記載の組成物。
【請求項９】下記の配列： Tyr−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Asn− Ser−Tyr−Arg−Lys−Val−Leu−Gly−Gln− Leu−Ser−Ala−Arg−Lys−Leu−Leu−Gln− Asp−Ile−Met−Ser−Arg−Gln−Gln−Gly− Glu−Arg−Asn−Gln−Glu−Gln−Gly−Ala− Arg−Val−Arg−Leu を有する合成ペプチドおよび獣医薬用担体からなる、ブ
タの生長を促進させるために使用される特許請求の範囲
第６項記載の組成物。
【請求項１０】下記の配列： Tyr−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe−Thr−Asn− Ser−Tyr−Arg−Lys−Ile−Leu−Gly−Gln− Leu−Ser−Ala−Arg−Lys−Leu−Leu−Gln− Asp−Ile−Met−Asn−Arg−Gln−Gln−Gly− Glu−Arg−Asn−Gln−Glu−Gln−Gly−Ala− Lys−Val−Arg−Leu を有する合成ペプチドおよび獣医薬用担体からなる、ヒ
ツジの生長を促進させるために使用される特許請求の範
囲第６項記載の組成物。
【請求項１１】冷血動物の生長を促進させるために養殖
で使用される特許請求の範囲第６項記載の組成物。
【請求項１２】下記の（ａ）または（ｂ）：（ａ）Tyr−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe− Thr−Asn−Ser−Tyr−Arg−Lys−Val−Leu− Gly−Gln−Leu−Ser−Ala−Arg−Lys−Leu− Leu−Gln−Asp−Ile−Met−R₂₈−Arg−Gln− Gln−Gly−Glu−Arg−Asn−Gln−Glu−Gln− Gly−Ala−R₄₁−Val−Arg−Leu ［式中、R₂₈はSerまたはAsnであり；R₄₁はArgまたはLys
である］；（ｂ）Tyr−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe− Thr−Asn−Ser−Tyr−Arg−Lys−Ile−Leu− Gly−Gln−Leu−Ser−Ala−Arg−Lys−Leu− Leu−Gln−Asp−Ile−Met−Asn−Arg−Gln− Gln−Gly−Glu−Arg−Asn−Gln−Glu−Gln− Gly−Ala−Lys−Val−Arg−Leu のいずれかの配列を有する合成ペプチドを有効量投与す
ることからなる、ヒト以外の動物においてGH放出をおこ
させる方法。
【請求項１３】下記の（ａ）または（ｂ）：（ａ）Tyr−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe− Thr−Asn−Ser−Tyr−Arg−Lys−Val−Leu− Gly−Gln−Leu−Ser−Ala−Arg−Lys−Leu− Leu−Gln−Asp−Ile−Met−R₂₈−Arg−Gln− Gln−Gly−Glu−Arg−Asn−Gln−Glu−Gln− Gly−Ala−R₄₁−Val−Arg−Leu ［式中、R₂₈はSerまたはAsnであり；R₄₁はArgまたはLys
である］；（ｂ）Tyr−Ala−Asp−Ala−Ile−Phe− Thr−Asn−Ser−Tyr−Arg−Lys−Ile−Leu− Gly−Gln−Leu−Ser−Ala−Arg−Lys−Leu− Leu−Gln−Asp−Ile−Met−Asn−Arg−Gln− Gln−Gly−Glu−Arg−Asn−Gln−Glu−Gln− Gly−Ala−Lys−Val−Arg−Leu のいずれかの配列を有する合成ペプチドを冷血動物の生
長を促進させるために有効量投与して養殖を促進する特
許請求の範囲第12項記載の方法。