JPS6072900A - Ｇｒｆ類似体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は哺乳動物の脳下垂体の機能に影響を及ぼすペプ
チドに関する。更に詳細には本発明は脳下垂体による生
長ホルモンの放出を促進し、そＩ７（６） て、特定の種に関して特に有用なペプチドに関する。

１９８２年に、脳下垂体生長ホルモンまたはソマトスタ
チンの視床下部放出因子はヒト島細胞腫瘍から単離され
、精製、同定および合成された。

試験したところ、これは、脳下垂体による生長ホルモン
Ｃ，Ｇ　ＩＩ　）の成田全促進することが発見された。

このペプチドは次の配列を有する。

Ｈ−Ｔｙ　ｒ−Ａｌ　ａ−Ａｓ　ｐ　−Ａ　ｌ　ａ−Ｉ
　ｌ　ｅ−Ｐｈ　ｅ−Ｔｈ　ｒ　−Ａｓ　ｎ−３ｅ　ｒ
−Ｔ？／ｒ−４７ｇ−Ｌｙ　５−Ｖａ　１−Ｌｅ　ｕ−
Ｃｒｙ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ａ、ｌ　ａ　〜Ａｒ
ｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｌｔ、−Ｉｔｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−
ＩＩ　ｅ−Ａｌａ　ｔ−８ｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｉｎ−Ｇｉ
ｎ、−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−８ｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｉｎ−Ｇｌ
ｕ−Ａ　ｒ　ｇ−Ｇ　ｌ　ｙ　−Ａ　ｌ　ａ　−Ａ、ｒ
　ｇ　−Ａ　ｌ　ａ−Ａｒ　ｇ−Ｌｅｕ−ＮＨ２ヒト視
床下部生長ホルモン放出因子（ｈＧｌｌＦ）は同じ構造
を有することが１ｌｏｈｌｅｎらによって発見された。

Ｂｉ　ｏｃｈｅｍ、　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｓ　、　Ｒｅ
ｓ　、　Ｃｏｍｒｎ、。

１１４．３、ｐｐ、　９３０〜’１）３６（１９８３）
。

今度、４４−残基ペプチド類がブタ、ウシ、ヤギ、およ
びヒツジ視床下部の精製抽出物から単離（７） され、そして、同定された。これらは後記のｈＧＲＦの
構造と数個のアミノ酸残基が異なる構造を各々有するこ
とが発見された。

ｈＧＲＦの組成からみれば、ブタＧＲＦ（Ｊ）ＧＲＦ）
は類似体ＣＡｒｇ’、　Ｇ１ｎ３８．　Ｖａ１４２〕−
ｈＧＲＦ　（１−４４）−ＮＪＩ２として表わすことが
できる。これはｐ　Ｇ　ＲＦが次の構造を有することを
意味する。

ＩＩ−Ｔｙ　ｒ　−Ａ　ｌ　ａ−Ａｓ　ｐ−ＡＬ　ａ−
Ｉ　ｌ　ｅ−Ｐｈ　ｅ−Ｔｈ　ｒ−Ａｓｎ−８ｅｒ−Ｔ
ｙｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｒｂ　−Ｇ　Ｌ　
ｙ　−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｌｅ　ｕ−８ｅ　ｒ　−Ａ　Ｌａ　
−Ａｒ　ｇ−Ｌｙ　５−Ｌｅｒｂ−Ｌａｘ−Ｇｉｎ−Ａ
、５ｐ−ＩＩ　ｅ−Ｍｅ　ｔ−３ｅｒ−Ａｒｇ　−Ｇ　
ｌ　？Ｌ−Ｇ　１．　ｎ　−Ｇ　ｌ　ｙ　−Ｇ　Ｌ　ｕ
−Ａｒ　ｇ　−Ａ　ｓ　ｎ−Ｇ　ｌ　ｎ−（Ｊ　ｕ−Ｇ
　ｌ　ｎ　−Ｇ　ｌ　ｙ　−Ａ　ｌ　ａ　−Ａ、ｒ　ｇ
　−Ｖ　ａ　Ｌ　−Ａ　ｒ　ｇ　−Ｌｅ　ｕ　−ＮＩＩ
２これは以下、ｐ　Ｇ　ＲＦまた（はブタソマトクリニ
ンと呼ぶ。このペプチドは温血動物（特に、ブタ）の生
長、冷血動物の生長および水生動物養殖における生長を
促進させるのに使用できる。

ｈ　Ｇ　ＲＦの組成からみれば、ウシＧＲＦ　（ｂ　Ｇ
ＲＦ　）は類似体（Ａｓｎ２８．　Ａｒｇ”＋　Ｇｉｎ
”８．　Ｌｙｓ”’、Ｖａｎ４２’：］−ｈＧｌイＦ　
（１−４４，）−Ｎ−ｒｉ’２として表わすことかで（
８） きる。これはｂＧＲＦが次の構造を有することを意味す
る。

ＩＩ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ　−Ｉ　ｌ　ｅ
−Ｐｈ、ｅ−Ｔｈｒ　−Ａｓｎ−８ｅ　ｒ−Ｔｑ）ｒ−
Ａｒｇ−Ｌｌｌｓ−Ｖａ　１−Ｌｅｖ、−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｎ−Ｌｅｒｔ、−８ｅｒ−ＡＬ　ａ−Ａ、ｒｇ−Ｌｙｓ
−Ｌｅｒｂ　−Ｌｅ　ｕ　−Ｇ　ｌ　ｎ−Ａｓ　ｐ−Ｉ
　ｌ　ｅ　−Ｍ　ｅ　ｔ−Ａｓ　ｎ−Ａｒ　ｇ−Ｇｉｎ
−Ｇ　ｌ　ｎ　−Ｇ　１．　ｙ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ａｒ、ｇ
　−Ａ　ｓ　ｎ　−Ｇ　Ｌ　ｎ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｇ　ｌ　
ｎ　−Ｇ　Ｌ　ｙ　−Ａ　ｌ　ａ−Ｌｙ　５−Ｖａ　ｌ
　−Ａ　ｒ　ｇ−−Ｌｅｕ　−ＮＩｉ２これは以下、ｂ
　Ｇ　）ｔ　Ｆ’またはウシソマトクリニンと呼ぶ。ヤ
ギＧ　１１　Ｆ’は同じ構造を有しており、そ（〜て、
温血動物（特にウシ）の生長、冷血動物の生長および水
生動物養殖をこおける生長を促進させるのに使用できる
。これは１だ、特製チーズ製造用のミルクを得るために
、ウシおよびヤギのミルク産生量を増加させるためにも
使用できる。

ｈ　Ｇ　ＲＦの組成からみれば、ヒツジＧＲＦ（ｏＧｌ
ｌＦ）は類似体（Ｉｌｅ”、　１１．ｓＭ、”、　、１
４．ｒｇ３′。

Ｇ１ｎ３８．　Ｌｙｓ４１．　Ｖａ１４２〕−ｈＧＪイ
Ｆ（１゜−４４，）−ＮＨ２として表わすことができる
。これはＯ（、ＲＦが次の構造を有することを意味する
。

（９） Ｈ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａ−ｓ　ｐ−Ａｌ　ａ−Ｉｔ　ｅ
−Ｐｈｅ−Ｔｈ、ｒ　−Ａｓ　ｎ　−８ｅ　ｒ−Ｔｙ　
ｒ−Ａ　ｒ　ｇ−Ｌｙ　ｓ−Ｉ　ｌ　ｅ　−Ｌ　ａ　ｕ
−にｌ　ｙ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ａｌａ−Ａ、ｒ
ｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌａ　ｕ　−Ｇ　ｌ　ｎ−Ａｓ　
ｐ−Ｉ　ｌ　ｅ　−Ｍ　ｅ　ｔ−Ａｓ　ｎ−Ａｒ　ｇ−
Ｇｌｎ−Ｇｌ　ｎ−Ｇ１　ｙ−Ｇｌ　ｕ−Ａｒ　ｇ−Ａ
、ｓｔｒ、−Ｇｌ　ｎ−Ｇ１　ｕ　−Ｇ　ｌ　ｎ　−Ｇ
　ｌ　ｙ　−Ａ　ｌ　ａ−Ｌｙ　５−Ｖａ、　Ｌ　−Ａ
ｒ　ｇ−Ｌｅｕ−、Ｎｌ１２これは以下、ｏ　Ｇ　ＲＦ
　またはヒツジソマトクリニンと呼ぶ。このペプチドは
温血動物（特にヒツジ）の生長、冷血動物の生長および
水生動物養殖における生長を促進させるのに使用できる
。このペプチドはまた特製チーズの製造用ミルクを得る
ために、牝ヒツジのミルク産生−Ｉを増加させることに
も使用できる。

本発明による獣医薬および医療薬組成物は医療薬または
獣医薬の製造に使用できる液状でたけ固形状担体中に分
散された、ｐＧＲＦ、ｂＧＲＦ、またはｏ　Ｇ　Ｘ　Ｆ
、これらの類似体、これらの生物学的に活性な断片ある
いは前記のもののうちのいずれかの非青性塩のいずれか
を含有する。このような組成物は診断または治療の目的
で短期あるいは（１０） 長期投与用の臨床薬（ヒトおよびヒト以外の動物の両方
）として使用できる。更にこ、このようなＴｉ１ｌ成物
はブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジまたはその他の動物におい
て、筋肉塊の生長および／捷たはミルタ産生を促進する
のにも使用できる。

ペプチドの定義のために使用される命名法は５ｃｈｒｏ
ｒｌｅｒおよびＬ７ｂ　ｂ　ｋ　ｅによる”　Ｔｈｅ　
Ｐｅｐｔｉｄ−ｅｓ”、アカデミツクプレス（、１，９
６５年）に定められたものであり、ここでは慣用的な表
示法（・こ従ってＮ−末端のアミノ基は左に、そしてＣ
−末端のカルボキシル基は右に示される。アミノ酸残基
が異性体を有する場合、もし他に指定されなければそれ
は表示されたアミノ酸のＬ一体である。

本発明は次式で表わされる合成ＧＲＦペプチドを提供す
る。

Ｈ−Ｔｙｒ−Ａｌ　ａ−Ａ−ｓｐ−Ａ、ｌａ、−１１ｅ
−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａ　ｓ　ｎ　−８ｅ　ｒ　−Ｔ　２
／　ｒ−Ａ−ｒ　ｇ−Ｌｙ　ｓ−Ｒ，、、−Ｌ　ｅ　ｕ
−Ｇｌ　３ｌ−Ｇｉｎ−Ｌｅｒｂ−８ｅｒ−Ａ、ｌ　ａ
−Ａ、ｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ　−Ｌ　ｅ　ｕ−Ｇ　ｌ　
ｎ−Ａ　ｓ　ｐ−Ｉ　ｌ　ｅ　−Ａ／ｅ　ｔ　−Ｒ２８
−Ａ、ｒ　ｇ−Ｇｉｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａ、
ｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇ　ｌ　？Ｚ−Ｇ　ｌ
　ｙ　−Ａ　ｌ　ａ、−ＪＲ，Ｈ−Ｖａ　ｌ　−Ａ、ｒ
　ｇ−Ｌ　ｅ　ｕ−Ｙ（式中、Ｒ１３はＶａｌまたはＩ
ｌｅである；Ｒ２３はＳｅｒまたはＡ　ｓ　ｎ、である
；Ｒ２１ばＡｒｇｉたはＬｕｓである；そして、ＹＩ′
ｒ、ｌ：０ＩＩ−またはＮｌＩ２である。）また、Ｎ−
末端から少なくとも約第２８残基（あるいは、ｐ　Ｇ　
ＲＦの約第３４残基）−まで伸びた生物学的）こ活＋ｉ
（な断片（Ｙは０１１寸たはＮＨ２である）も含まれる
。

ペプチドはいかなる適当な方法、例えば同相法、部分同
相法、断片縮合、古典的な溶液カップリング、寸たは最
近開発された組み換えＤＮＡ法の使用などにより合成さ
れる。例えば、固相法のみの合成法はＳ　ｔ　ｅｗｔｙ
　ｔおよびＹｏｕｎｇによる”５ｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ
　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　”、フリーマン社、ｔ　７７７
ンシスコ（１９６９年）に説明されており、またＶａ　
ｌ　ｅらによる１９７８年８月８日付米国特許第４、１
０５６０３号明細１に開示されている。断片縮合法によ
る合成は１９７６年８月３日句米国特許第３９７２８５
９号明細書に例示される。他の利用しつる合成法は米国
特許第３８．４２０６７号（１９７４年１０月１５日付
）および同第３８６２９２５号（１９７５年１月２８日
句）の各明細ｌに例示される。組み換えＤＮＡ法による
合成ペプチドの製造は大量生産も可能であろう。

本出願のための組み換えＤＨ，４法を使用する合成法は
、意図する形のＧＲＦ断片をコードする構造遺伝子の適
切な使用を包含すると理解すべきでアル。合成ＧＲＦは
このような構ひ遺伝子と共にプロモーターおよびオペレ
ーターを含む発現ベクターを使用【７て微生物を形質転
換し、そして形質転換されたその微生物にＧ　ＲＦを発
現せしめることにより得ることができる。ヒト以外の動
物もまた、このような構造遺伝子ならびに米国特許第４
２７６２８２号明細書（１，９８１年６月３０日付）に
記載の一般方法を使用する遺伝子操作により、あるいは
１９８３年５月２６日発行のＷＯ３３１０１，７８３お
よび１９８２年１２月２３日発行のＷＯ３２１０・１４
４３に開示される胚の顕微注入を使用する遺伝子操作に
よシ、ＧＲＦを産生するのに使用される。合成ＧＲＦは
また、上記（１３） の２冊のＷＯ刊行物に記載の方法により成長促進が手足
される動物（・こおいて直接産生される。

化学合成法またはカップリング合成法では、各種のアミ
ノ酸部分の不安定な側鎖基を適当な保護基（最終的にそ
の保護基が除去される壕でその部位での化学反応の発生
を阻止する基）で保護することが通常行われる。また、
アミノ酸やペプチド断片がカルボキシル基の部位で反応
する間それらのα−アミノ基を保護し、続いてα−アミ
ン基の部位で反応を行わせるためにα−アミン保護基を
選択的に除去することも通常行われる。従って、合成法
の一段階として、ペプチド鎖中の意図した配列に適当な
側鎖保護基をもつアミノ酸残基金倉む中間体化合物が製
造てれることは一般的なことである。

次式で表わされる中間体は本発明の範囲内に含まれると
考えられる。

Ｘ’−Ｔｙｒ　（Ｘ２）−Ａｌ　ａ−ＡＳｐ　（、Ｙリ
−Ａ、１ａ−１１ｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（、、Ｙ’）−Ａ
ｓｎ−８ｅｒ　（Ｘ”）−ＴＶｒ　（Ｘ”）−Ａｒ　ｇ
　（、Ｙ６）−Ｌｙ　ｓ　（、Ｙ７）−Ｒｒｓ−Ｌｅ　
ｕ−ＧＡ　ｙ　−Ｇ　ｌ　ｎ　−（１４） Ｌｅｕ−８ｅｒ（Ｘ′）　−Ａｌａ−Ａｒｇ（Ｘ６）−
Ｌｙｓ（Ｘ７）−Ｌｅｕ−Ｌａｗ−Ｇｌ　ｎ−Ａｓ　ｐ
　（Ｘ３）　−１１ｅ−Ｍｅ　ｔ　−＃、。

（Ｘ”）−Ａｒ　ｇ　（、Ｙ６）　−Ｇ　ｌ　ｎ　−Ｇ
　ｌ　ｎ　−Ｇ　ｌ　ｙ　−Ｇ　ｌ　ｕ　（Ｘ”）−Ａ
ｒｇ　（Ｘ６）−Ａ、５ｎ−Ｇｌ　ｎ−Ｇ１　ｕ　（Ｘ
３）　−Ｇｌ　ｎ　−Ｇ　ｌ　￥−Ａ　ｌ　ａ−１１４
，（Ｘ６または、Ｙ７）　−Ｖａｌ　Ａ’Ｊ７（Ｘ’）
−ＬｅｌＬ−Ｘ８ ここでＸｌは水素原子またはα−アミン保護基である。

Ｘｌに含まれるα−アミノ保護基は、ポリペプチドの段
階合成法の技術分野で有用であると知られているもので
ある。そのようなα−アミノ保護基には（］）アシル型
保護基、例えばホルミル基、トリフルオロアセチル基、
フタリル基、トルエンスルホニル基ＣＴｏ　ｓ　）、ベ
ンゼンスルホニル基、ニトロフェニルスルフェニル基、
トリチルスルフェニル基、０−ニトロフェノキシアセチ
ル基、タロロアセチル基、アセチル基、およびγ−タロ
ロブチリル基、（２）芳香族ウレタン型保護基、例えば
ベンジルオキシカルボニル基ＣＺ）、およびｐ−クロロ
ベンジルオキシカルボニル基、ｐ−二！・ロベンジルオ
キシ力ルポニル基、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニ
ル基またはｐ−７トキシベンジルオキシカルボニル基な
どの置換されたＺ　；　（３）脂肪族ウレタン型保護基
、例えばｔ−ブチルオキシカルボニル基ＣＢＯＣ）　、
ジイソプロビルメチルオキシカルボニル基、イソプロピ
ルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、および
アミルオキシカルボニル基；　（４）シクロアルキルウ
レタン型保護基、例えばシクロペンチルオキシカルボニ
ル基、アダマンチルオキシカルボニル基、およびシクロ
へキシルオキシカルボニル基；　（５）チオウレタン型
保護基、例えばフェニルチオカルボニル基；（６）アル
キル型保護基、例えばトリフェニルメチル基（トリチル
基）およびベンジル基：　（７）　）　ＩＪアルキルシ
ラン基、例えばトリメチルシラン基：が含まれる。

好適なα−アミノ保護基はＢＯＣである。

Ｘ′はＴｙｒのフェノール１生水酸基のための保護基で
あジ、テトラヒドロピラニル基、Ｌ−ブチル基、トリチ
ル基、ＢｚＬ　ＣＢＺ１４Ｂｒ−ＣＢＺおよび２，６−
ジクロロベンジル基ＣＤＣＢ）よりなる群から選択され
る。好適な保護基は２，６−ジクロロベンジル基である
。Ｘ′は水素原子であることもでき、この場合は水酸基
に保護基が存在し７ないことを意味する。

Ｘ３は水素原子であるか、あるいはＡｓｐまたはＧｌｒ
ｂのカルボキシル基のためのエステル形成性保護基であ
ってＢｚｌｌ、２，６−ジクロロベンジル基、メチル基
およびエチル基よりなる群から選択される。

Ｘ４およびＸ５はＴｈｒ￥１：たはＳｅｒの水酸基のた
めの保護基であり、アセチル基、ベンゾイル基、ｔ−ブ
チル基、トリチル基、テトラヒドロピラニル基、Ｂｚｌ
ｌ、２．６−ジクロロベンジル基おヨヒＣＢＺよりなる
群から選択される。好適な保護基はＢｚｌｊである。Ｘ
′および／またはＸ５は水素原子であることもでき、そ
れは水酸基に保護基が存在しないことを意味する。

Ｘ６はＡｒｇのグアニジノ基のための保護基であって、
ニトロ基、Ｔｏｓ、ＣＢＺ、アダマンチルオキシカルボ
ニル基およびＢＯＣよりなる群から選択されるか、ある
いは水素原子である。

（１７） Ｘ７は水素原子であるか、あるいはＬｙｓの側鎖アミノ
基のための保護基である。適当な側鎖アミノ保護基の例
（址２−タロロベンジルオキシ力ルボニル基＜２ＣＩ！
−Ｚ）、Ｔｏｓ、ｔ−アミルオキシカルボニル基および
ＢＯＣである。

側鎖アミン保護基の選択は特に限定的なものではないが
、それは合成中にα−アミノ保護基を除去する際に除去
されないものでなければならない。

それ故、α−アミン保護基と側鎖アミン保護基とは同じ
ものであってはならない。

Ｇｉｎおよび／またはＡｓｎの側鎖アミド基はキサンチ
ル（Ｘαｎ）によるようζこ適当に任意に保護すること
ができる。

Ｘ８は０Ｈ１０ＣＨ９、エステル類、アミド類、ヒドラ
ジド類、−Ｑ−ＣＨ２−樹脂支持体、および−ＮＨ−樹
脂支持体からなる群から選択され、ＯＨおよびアミド以
外の基は広義には保護基と考えられる。

中間体の構造式ζこおいて、Ｘｌ、Ｘ′、Ｘ３、Ｘ４、
Ｘ５１．￥　６１．Ｙ　７およびＸ８のうちの少なくと
も１つは（１８） 保護基である。

ペプチド合成で使用する！特定の側鎖保護基を選択する
場合には次の規則に従う：（α）保護基は、合成の各工
程でα−アミン保護基を除去するために選定された試薬
に対して、また、その反応条件下で安定でなければなら
ない；（ｂ）保護基はカップリング条件下でその保護特
性を維持し、脱離されるものであってはなら々い：およ
び（、ｃ）側鎖保護基は、意図したアミノ酸配列を含む
合成の完了時点で、ペプチド鎖を変性させない反応条件
下に除去できなければならない。

ペプチドは例えばＭｅｒｒｉｆｉｅｌｃｌ　ｌこよるＪ
　、　Ａｍ、。

Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、、８５．２１４９ページ（１，９
６３年）に記載されるような同相合成法を使用して有利
に製造されるが、当該技術分野で知られる他の同様な化
学合成法もまた先に述べたごとく使用することができる
。同相合成法は保護したα−アミノ酸を適当な樹脂にカ
ップリングさせることによりペブテ１−′のＣ−末端か
ら開始される。このような出発物質は、α−アミノ保護
Ｌｅｒｂをエステル結合でクロロメチル化樹脂またはヒ
ドロキシメチル樹脂へ結合させるか、あるいはアミド結
合でＢ　ＨＡ樹脂捷たはＭ　Ｂ　ＩＩ　Ａ樹脂へ結合さ
せることにより製造される。ヒドロキシメチル樹脂の製
造はＢｏｄａ−ｎｓｌｃｙらによってＣｈｅｍ、　Ｉｎ
ｃｌ、　（口ｙトン）３８．１５９７〜９８　（１，９
６６）に開示されている。

タロルメチル化樹脂はカリフォルニア州、リッチモンド
に所在するＢｉｏ　Ｒａｄ　Ｌａｆｏｒａｔｏｒｉｅｓ
社から、凍た、Ｌａｂ　、　Ｓｙｓ　ｔ　ｅｍｓ　、　
ｌ’ｎｃ　、社から市販されている。このような樹脂の
製造はＳｔｅｗａｒｔらにより゛固相ペプチド合成”　
ＣＦｒｅｅｒｎ、ａｎ　＆　Ｃｏ、　、社、サンフラン
シスコ、１．９６９Ｈこ開示されている。

Ｂ　Ｊ−Ｉ　ＡおよびＭＢＨＡ樹脂支持体は市販されて
おり、そして一般にこれらは意図した合成ポリペプチド
がＣ−末端に非置換アミド分有する場合のみ使用される
。

例えば、遊離カルボキシ末端を有する４４−アミノ酸ペ
プチドを合成しようとする場合、ＢＯＣで保護したＬｅ
ｕはＭｏｎａノｔａｎおよびＧ１１ｏｎｉこよるＢｉｏ
ｐｏｌｙｍｅｒ、］、　２．２５１３〜２５１９ページ
（１９７３年）に記載の方法に従ってクロロメチル化樹
脂にカップリングされる。ＢＯ’Ｃ−ＡＬａのカップリ
ング後に、そのα−アミノ保護基は例えば塩化メチレン
中のトリフルオロ酸ｅ（、ＴＦＡ）、ＴＦＡ単独または
ジオキサン中のｌＩＣ１を用いることにより除去される
。この保護基除去反応は約０℃ないし室温で実施される
。特定のα−アミン保護基を除去するたｙ）の他の標準
的な開裂試薬ならびに条件は、５ｃｈｒｏｄ、ｅｒお、
Ｊ：びＬｕｂｋｅによる”　Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｃｌｅ
ｓ”、■１７２〜７５ページ、アカデミツクプレス（１
，９６５年）Ｉこ記載のごとく使用される。

Ｌ８ｕからα−アミノ保護基を除去した後、残りのα−
アミノ保護−および側鎖保護−アミノ酸は意図した順序
で段階的にカップリングされて先に定義した中間体化合
物を得るか、あるいは合成において各アミノ酸を別々Ｏ
こ加える代わりに、それらのうちのいくつかを同相反応
器に添加する前に互いにカップリングさせてもよい。適
当なカップリング剤の選択は当業者の知るところである
。

（２１） Ｎ、Ｎ’−ジシクロ−＼キシルカルボジイミド（ＤＣＣ
Ｉ）はカップリング剤として特に適している。

ペプチドの固相合成法で使用される活性化試薬はペプチ
ドの技術分野で周知である。適当な活性化試薬は例えば
（１）カルボジイミド類（例えば、＃、Ａ７’−ジイソ
プロピルカルボジイミド、Ｎ、Ｎ’−ジシタロへキシル
カルボジイミド（１）ＣＣＩ）：（２）シアナミド類（
例えば、Ｎ　、　Ｎ’−ジベンジルシアナミド）；（３
）ケチイミン類；（４）イソオキサゾリウムｔｌｆＩ（
例えば、Ｎ−エチル−５−フェニルイソオキサゾリウム
−３′−スルホネート）；（５１ｉ中に１〜４個のチッ
素原子を含む芳香族性単環式テラ累含有複素項式アミド
類（レリえば、イミダゾリド類、ビラゾリド類、および
１　、２　、４−１−リアゾリド類。特に有用な複素環
式アミド類はＮ　、　Ｎ’−カルボニルジイミダゾール
、Ｎ、Ｎ′−カルボニル−ジー１　、２　、４−１−リ
アゾールである）；（６）アルコキシル化アセチレン（
例えは、エトキシアセチレン）；（７）アミノ酸のカル
ボキシル部分と混（２２） 台無水物を形成する試薬類（例えば、エチルクロロホル
メートおよびイソブチルクロロホルメート）。

およヒ（８）アミノ酸のカルボキシル部分と活性エステ
ルを形成する試薬類（例えば、１個のカッ素原子上にヒ
ドロキシル基を有するチッ素含有複素環式化合物類、例
えば、Ｎ−ヒ１−ロキシフタルイミト、Ｎ−ヒドロキシ
スタシンイミ１クオよび１−ヒドロキシベンゾトリアゾ
ール（ＨＯＢＴ））。などである。他の活性化試薬なら
びにペプチドカップリングにおけるそれらの使用は、Ｓ
ｃ、ｈｒｏｒｌｅｒおよびｌｓ、ｂｋｅによる同書、第
■章およびＫａｐｏｏγによるＪ、　Ｐｈａｒ、　Ｓｃ
ｉ、、　５９．１〜２７ページ（１９７０年）に記載さ
れている。

各保護アミノ酸またはアミノ酸配列は約２倍も１〜くは
それ以」二の過剰量で同相反応器に導入さ肚、そしてそ
のカップリングはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）　：
ＣＨ２Ｃｌ１２（１：　１　）の媒体中またはＤＭＦ中
、もしくはＣＨ，、（＃２中で実施される。不完全なカ
ップリングが生ずる場合に、そのカップリング法は次の
アミノ酸のカップリングくこ先立つα−アミノ保護基の
除去前に繰つ返し行われる。

各合成段階におけるカップリング反応の完了は、Ｅ−Ｋ
ａｉｓｅｒらに↓るＡｎａｌ　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　
＋　３４．５９５ベージ（１９７０年月こ記載のごとく
、ニンヒドリン反応により監視される。

意図したアミノ酸配列が完了した後に、その中間体ペプ
チドは液状弗化水素のような試薬で処理することにより
樹脂支持体から切シ離すことができ、その液状弗化水素
はペプチドを樹脂から開裂させるばかシでなく、残存す
る全ての側鎖保護基Ｘ２　、Ｘ　３　、Ｘ　４　、Ｘ　
ｆｆｉ　、Ｘ　６　、Ｘ　７およびＸ８、ならびにα−
アミノ保獲基Ｘ１を開裂させて、ペプチドを与える。

別の合成経路として、中間体ペプチドはアルコール分解
によって樹脂支持体から分離させることができ、その後
、回収Ｃ−末端アルキルエステルは加水分解により酸に
転化される。次いで側鎖保護基は前記のようにして、あ
るいは、その他の公知の方法（例えば、Ｐ　ｄ／Ｂ　ａ
　Ｓ　Ｏ４による接触還元）により除去することができ
る。開裂にフッ化水素を使用する場合、掃去用にアニソ
ールおよび硫化メチレンを反応容器中に含める。

下記の実施例は同相技法によるＧＲＦの好ま］−い合成
方法を例証するものである。対応するより短いペプチド
断片の合成は、ペプチド鎖の両端で必要な数のアミノ酸
を単に除外することにより同じ方法で行われると当然理
解されるだろう。しかしながら、生物学的に活性な断片
はＮ−末端に表示した配列を含むべきであると目下のと
ころ考えられる。

次式 ％式％ で示されるｐＧＺ＜Ｆ（１−４４）遊離酸の合成ば、Ｂ
ｅＣｋｍａｎ　９９０ペプチド合成機を用いてＬａ　ｂ
（２５） Ｓｙｓ　ｔ　ｅｍｓ　、　Ｉｎｃ　、　、社から市販さ
れているようなりロルメテル化樹脂（１ｇあたり０．９
ミリ当量のＣ１ｌを含有）上で段階法にＪ：、！ｌｌお
こなわれた。ＢＯＣ−Ｌｅｑｂの樹脂へのカップリング
はＭｏｎａｈａｎらがＢｉｏｐｏｌｙｍ、ｅｒｓ　、第
１２巻（１９７３）ｐ７）。

２５１３〜２５１９ζこ開示した一般的方法により行な
った。斯り１７て、樹脂１ｇあたＱ約０．２２　ミリモ
ルのＬｅｑｂの置換が生じた。使用される全ての溶剤は
Ｍｅｔ残基の硫黄を酸化する恐れのある酸素を排除する
ために、好ましくはヘリウムのような不活性ガスを吹き
込むことにＪニジガス抜きしだ。

保護基の除去ならびに中和後、ペプチド鎖を樹脂上に段
階的に形成させた。保護基の除去、中和および各アミノ
酸の添加は、Ｇｕ　ｉ　ｌ　ｌ　ｅｍｉ　ｎらによる米
国特許第３．９０４，５９４号明細書に詳細に説明され
る方法に従って一般に行われた。カップリングは特に下
記のスケジュールＡに述べたようにして行なった。

（２６） スケジュール 工程　試薬および操作　（分） ＩＣＨ２Ｃ１２洗浄（２回）０．５ ４　Ｃ１１２Ｃ１ｋ洗浄（３回）０．５５　Ｃ１１ｓＯ
Ｉｉ洗浄（２回）０．５７　ＣＨ３０Ｈ洗浄（２回）０
．５ ９　ＣＨ３０Ｈ洗浄（２回）０．５ １０　Ｃｄ２ＣＴｏ洗浄（２回）０．５１２　ＣＨ２Ｃ
ｌ３２洗浄（１回）０．５１５　ＣＨｓＯＩｉ洗浄（２
回）０．５１６　Ｃ１１２Ｃ１１２洗浄（２回）０．５
ｉ８　ＣＨｔＣ１１２洗浄（２回）０．５１９　ＣＨ３
０１１洗浄（２回）０．５骨（注）　ＡｓｎおよびＧｉ
ｎのカップリングのために、この工程で１．１３６モル
過剰量の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨｏＢｔ
、）を加えた。

要するに、このカップリング反応のために、２時間の間
に樹脂ＩＩあた９、ＢＯＣ−保護アミノ酸の塩化メチレ
ン溶液１ミリモルプラス１当量の０．５モルＤＣＣＩ塩
化メチレン溶液または３０％ＤＭＦ塩化メチレン溶液を
使用した。Ａｒｇをカップリングする場合、１ｅ％ＤＡ
ｉＦと塩化メチレンの混合物を使用した。Ｓｅｒおよび
Ｔｈｒ用のヒドロキシ側鎖保護基としてＢｚｌを使用し
た。Ｌｙｓ側鎖用の保護基として２−タロローベンジル
オキシカルボニル（２Ｃｌ−Ｚ）′ｆ：使用した。Ａｒ
ｇのグアニジノ基を保護するためにＴｏｓを使用した。

また、ＧｌｒｂｉたはＡｓｐカルボキシル基はＢｚｌエ
ステルとして保護した。Ｔｙｒのフェノール性ヒドロキ
シル基は２，６−ジクロロベンジルで保護した。合成の
最後の時点で、下記の組成が得られた。

、Ｙ’−Ｔｙｒ　（Ｘ２）−Ａｌ　ａ−Ａｓ　ｐ　（Ｘ
３）−Ａｌ　ａ・−Ｉ　ｌ　ｅ　−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（Ｘ
’）−Ａｓｎ−８ｅｒ（Ｘリ−Ｔ’Ｊ／　ｒ（Ｙ２）−
Ａｒｇ　ＣＸ６）　−Ｌｙｓ　ＣＸ７）−Ｖａｌ−Ｌｅ
ｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−８ｅｒ（Ｘ”）−Ａｌａ
−ＡｒｇＣＸ６）−Ｌｙｓ　（Ｙ７）−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ
−Ｇｌｎ−Ａｓｐ　（Ｘ３）　−１１ｅ−Ｍ’ｅ　ｔ　
−８ｅ　ｒ　（、Ｙ’）　−Ａｒ　ｇ　（、Ｙ’）−Ｇ
ｌ　ｎ−Ｇ１　ｎ−−Ｇ１　ｙ−Ｇｌ　ｕ（Ｘ３）　−
Ａｒｇ　（Ｘ６）　−Ａｓ　ｎ−Ｇｌｎ−Ｇ１　ｕ　（
Ｍ３）−Ｇｉｎ−−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ（Ｘ８）−
Ｖａｔ−ＡｒｇＣＸ”）　−Ｌ　ｅ　ｕ−Ｘ８ （式中、ＸｌはＢＯＣである；Ｘ２は２，６−ジクロロ
ベンジルである；Ｘ３はベンジルエステル（２９） である；Ｘ′はＢｚｌである；Ｘ５はＢｚｌである；Ｘ
６はＴｏｓである：Ｘ７は２ＣＩｌ−Ｚである：そして
、Ｘ８は−ＯＣＨ２”ンゼンーボリスチレン樹脂支持体
である。） 最後のＴｙｒ残基が樹脂へカップリングされた後、ＢＯ
ＣはＣＨ２Ｃｅ２中の４５％ＴＦＡｆ用いて除去した。

ペプチド鎖の残りの保護基を除去するために、それはペ
プチド−樹脂１ｇあたシアニソール１．５１ｎｌ、メチ
ルエチルスルフィド０．２５ｍｊ！およびＨＦ１０ｍ１
を用いて一２０℃で３時間および０℃で％時間処理した
。高真空下にＩＩＦを排除した後、ペプチド−樹脂残留
物を乾燥ジエチルエーテルおよびクロロホルムで交互に
洗浄し、次いでそのペプチドをガス抜きした２Ｎ酢酸水
溶液で抽出した。酢酸抽出物を凍結乾燥させ白色の毛羽
だった物質が得られた。

その後、保護基を除去しかつ樹脂から切勺離されたペプ
チドは３０５’ｆ；酢酸に溶解し、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ
−ｓｏｇ、細ゲル諷過を行なった。

ｐｌｉ’４．５のＯｌＯＩ　Ｍ　ＮＨａＯＡｃ　４００
　ｖｔの充て（３０） んされている混合フラスコ中にｐＩＩ６．５の０．４Ｍ
Ｎ１１＜ＯＡｃ　１１１　ｋ滴加することによって形成
てれる下に向って凸の濃度勾配を使用しＣＭ−３２カル
ボキシノテルセルロース（ワットマン）カチオン交換ク
ロマトグラフィー（１，８Ｘ　１８ｃｍ、、カラム容量
＝５０７）することに工ってペプチドを更ζこ精製１７
た。最終精製ばｎ　Ｂ　ｕ　Ｏ，Ｉｉ／Ｅ　ｔ　ＯＨ／
ピリジン１０８２％Ｎｌｌ０Ａｃ（４：１：１：’？）
イ谷剤系により、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−５０’＠に
’ｆＢ支持体（ファルマシア製）で分取りロマトグラフ
することによって行なった。精製法の詳細は７．ｉｎｇ
らに工す魚（！　ｃ　ｈｅｙｎＢｉｏｐｈｙｓ、　１ｔ
ｅｓ、　Ｃｏｗｎｕｎ、　９５．９４．５　（１９８０
）に開示されている。クロマトグラフ分画はＴ　Ｌ　Ｃ
により入念にチェックし、純粋な両分のみをブールした
。

ＬｅｒｂをＭ　Ｂ　Ｉｉ　Ａ樹脂に結合させる米国特許
第４．２９２，３１３号明細書に開示されブこ方法に従
って、ＭＢＨＡ樹脂を用いて前記の合成を再度行ない、
アミド化Ｃ−末端を有する同じペプチドを製ｊ告した。

実施例２゜ 生長ホルモンの放出を促進させるペプチドの効力を測定
するために、合成ｈＧＲＦ（１−４４）−ＮＨ２を使用
し、これをｐＧｌｔＦ（１４４）Ｎ私および脳下垂体細
胞から生長ホルモンの放出を促進させる公知の効力を有
するＧ　ｌ＜　Ｆ参照標準と各構成アミノ酸ごとに比較
対照ノーることによって試験管内試験を行なつ１こ。Ｇ
ＲＦ参照標準はＢｒａ−ＺｅｒＬｕらによりｈ’ｎｄｏ
ｃｒｉｎｏｌｏｇｙ＋　１１０巻、Ａ３３８（１９８２
）に開示され、かつ、定義されている。これは、脳下垂
体細胞単層バイオアラ七イにおいてＧｌｌ放出に関する
最大反応の半分をもたらす童のラット況床下部の配合物
である。４〜５日前に除去したラットの脳下垂体細胞を
含む培養物が使用された。規定された標準培地の培養物
および成長ホルモンの分泌が最適であると考えられる培
養物の両方が、ＢｎａｚｅａｕらによるＲｅｇ−ｕｌａ
ｔｏｒｙ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ＋　１．２５５ページ（１
９８１年月こ記載の一般方法で比較試験のために使用さ
れた。試験すべき物質とのインキュベーションは３〜４
時間行われ、そして培地のアリコートヲ採取して処理し
、免疫反応性ＧＨ（ｉｒ　ＧＨ）におけるそれらの含有
量を放射線免疫検定法で測定した。

この比較試験の結果から、等モル比においてば、ｐ（’
ｚＲＦ′（１４４）ＮＨ２は合成ノＬ　Ｇ　ＲＦペプチ
ドの完全な固有生物学的活性とほぼ同じ力価を有してい
ることが明らかになった。

実施例ａ 次式、 Ｈ−Ｔｙ　ｒ−Ａｌ　ａ−Ａｓ　ｐ　−Ａ　ｌ　ａ−Ｉ
　ｌ　ｅ−Ｐｈ　ｅ−Ｔｈ　ｒ　−Ａｓｎ−８ｅｒ−Ｔ
ｙｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｎ−Ｌｅｒｂ−８ｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅ
ｕ−Ｌｅ　ｗ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ａｓ　ｐ−１１ｅ−Ｍｅ　
ｔ　−Ａｓ　ｎ−Ａｒ　ｇ−Ｇｌｒｒ。

−ＧＬｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｑｂ−Ａｒｇ−Ａｓ−ｎ−Ｇｌ
ｎ−Ｇｌｒｂ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｇ　ｌ　１／−Ａ　ｌ　ａ
−Ｌｙ　５−Ｖａ　ｌ　−Ａｒ　ｇ−Ｌｅｕ−ＮＨ２で
示されるｂＧＲＦｃｌ−４４）アミドの合成をＢｅｃｋ
ｓαｎ９９０ペプチド合成機およびＭＢＨＡ樹脂を用い
て段階的に行なった。ＢＯＣ−Ｌｅｕの樹脂へのカップ
リングは米国特許第４，２９２，３１３号明細書に開示
てれているような一般的方法によ（３３） ９行なった。斯くして、使用したＮＨＢＡ樹脂の置換に
も３【るが、樹脂ＩＩあたシ約０．２〜Ｏ，Ｓミリモル
のＬｅａの置換がおこなわれた。使用される全ての溶剤
はＭｅｔ残基の硫黄を酸化する恐れのある酸素を排除す
るために、好ましくはヘリウムのような不活性ガスを吹
き込むことによりガス抜きしだ。

保護基の除去ならびに中和後、ペプチド鎖を樹脂上に段
階的に形成させた。保護基の除去、中和および各アミノ
酸の添加は、Ｇｕｉ　ｌ　ｌ　ｅｍｉｎらによる米国特
許第３，９０４，５９４号明細書に詳細に説明される方
法に従って一般に行われた。カップリングは実施例１の
スケジュールＡに述べたようにして行なった。

カップリング反応は実施例１に述べたようにして行なっ
た。合成が終了した時点で、下記の組成の生成物が得ら
れた。

Ｘ’−Ｔｙｒ　（、Ｙ２）−ＡＸ　ａ−Ａｓ　ｐ　（Ｊ
３）−Ａｌ　ａ−１ｌ　ｅ　−Ｐｈ、　ｇ−Ｔｈ　ｒ　
（Ｘ’）−Ａｓ　ｎ　−８ｅ　ｒ　（Ｘ’　）−Ｔｙ　
ｒ　（、￥２）　−Ａｒｇ（Ｘ”片−Ｌｙ　ｓ　（Ｘ７
）　−Ｖａ　１−Ｌｅ　ｕ、−Ｇ　ｌ　ｙ　−Ｇ　Ｌ　
７１（３４） −Ｌｅｒｂ−８ｅｒ　（、Ｙ’）　−Ａｌａ−Ａｒｇ　
（Ｘ”）−Ｌｙｓ　（、Ｙ７）−Ｌｅｒｂ−Ｌｅｒｂ−
Ｇｌｎ−Ａｓｐ（Ｘ３片−Ｉ　ｌ　ｅ　−Ｍｅ　ｔ　−
Ａ、ｓｎ−Ａｒｇ（、Ｙ６）−Ｇｉｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ
−Ｇｌｕ（Ｘ３）−Ａｒｇ（、￥’）−Ａｓｎ−Ｇｌｎ
−Ｇｌｕ（Ｘ′）Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−ＬｙｓＬＹ
７）　−Ｖａｌ−Ａｒｇ　（Ｘ”）−Ｌｅｑｔ、−Ｘ８
（式中、ＸｌばＢ　ＯＣである。Ｘ′は２，６−ジクロ
ロベンジルである；Ｘ３はベンジルエーテルである。Ｘ
４ばＢｚｌである；Ｘ５はＢｚｌ　である；Ｘ６はＴｏ
ｓである；Ｘ′は２ｃｉ−ｚである；そしてＸ８は−Ｎ
Ｈ−Ｍ　Ｂ　ＨＡ、　ｉ次面支持体である。）最後のＴ
ｙｒ残基が樹脂へカップリングされた後、ＢＯＣはＣＨ
２Ｃｌ２中の４５％ＴＦＡを用いて除去した。ペプチド
鎖の残シの保護基を除去するために、それはペプチド−
樹脂１ｇあたｐアニソール１．５＋ｎｌ、メチルエチル
スルフィド０−２５ｍ１およびＨＦ１０ηｒ１を用いて
一２０℃で％時間および０℃で％時間処理した。高真空
下にＪｉＦを排除した後、ペプチド−樹脂残留物を乾燥
ジエナルエーテルおよびクロロホルムで交互に洗浄し、
次いでそのペプチドをガス抜きした２Ｎ酢酸水溶液で抽
出した。

酢酸抽出物を凍結乾燥させ白色の毛羽だった物質が得ら
れた。

その後、保護基を除去しかつ樹脂から切り離されたペプ
チド（は３０％ｉ！ｌＴ［ｉ２に溶解し、３ｅｐｈ、ａ
ｄｅｘＧ−５０微細ゲルと過を行なった。

次いで、実施例１に述べたように、カチオン交換クロマ
トグラフィー、続いて、分取タロマＩ・グラフィー　を
行なうことによってペプチドを更に精製した。

クロルメチル化樹脂を使用してこの合成を再度行ない、
遊離酸Ｃ−末端を有する同じペプチドを生成した。合成
は一般的に、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ　＋　１２．２５
１３〜１９（１９７３）に開示されたＬｅｖ、をクロル
メチル化樹脂に結合させる方法により行なった。

クロルメチル化樹脂を使用し、この合成を再度行ない、
実施例１の方法どおりに芙施し、遊離酸Ｃ−末端を有す
る同じペプチドを生成した。

実施倒毛 このペプチドの生長ホルモン放出促進効力を測定するた
めに、実施例２に述べたように、合成ｈａＲＦ（ｌ−４
４）−＃Ｈ２を使用し、等モル濃度のｂ　ＧＩＩＦ　（
１−４，４）−ＮＨ２と各構成アミノ酸ごとに比較対照
することによって試験管内試験を行なった。

この比較試験の結果から、等モル比においては、ｂ　Ｇ
ＲＦ　（１−４４）−ＮＨ２は合成ペプチドの完全固有
生物学的活性およびほぼ同じ力価を有することが明らか
になった。倍量投与因数仕様試験では、ｂＧＲＦはｈ　
ＧＲＦ　（１４４）　ＮＨ２と同じ固有活性と、５４〜
９３％の信頼限界でｈＧＲＦ（１−４４）−ＮＨ２の約
７０％相当の比活性を有することが示された。

実施例＆ 次式、 Ｈ＝Ｔｙｒ−Ａｌ　ａ−Ａｓ　ｐ−ＡＸ　ａ−Ｉ’ｌ　
ｅ−Ｐｈ　ｅ−Ｔｈｒ　−Ａ　ｓ　ｎ−８ｅ　ｒ−Ｔｙ
　ｒ−Ａｒ　ｇ−Ｌｙ　ｓ−Ｉ　ｌ　ｅ−Ｌｅ　ｕ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｉｎ−Ｌａｔｈ−８ｅｒ”Ａｌ　ａ−Ａｒｇ−
Ｌｙｓ−Ｌｅｒｂ　−Ｌ　ｅ　ｕ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ａ　ｓ
　ｐ−Ｉ　ｌ　’ｅ　−Ｍ　ｅ　ｔ−Ａｓ　ｎ−Ａｒ　
ｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌ　ｎ−Ｇ１　ｙ−Ｇｌ　ｕ−Ａｒ　ｇ
−Ａｓｎ−Ｇｌ　ｎ−Ｇ１　ｕ−（３７） Ｇ　ｌ　ｎ−Ｇ　ｌ　ｙ　−Ａ　ｌ　ａ−Ｌｙ　ｓ　−
Ｖａ　ｌ　−Ａｒ　ｇ−Ｌｅｒｂ　−ＮＨ２で示される
ｏＧＲＦ（１−４４，）アミドの合成をＢｅｃｋｔｎａ
ｓｎ　９９０　ペプチド合成機およびＭＢ　ＩＩ　Ａ樹
脂を使用し、実施例３に述べたように段階的方法によシ
行なった。合成の終了時点で、次の組成を有する生成物
が得られた。

Ｘ’−Ｔｙｒ　（、Ｙ２）−Ａｌ　ａ−Ａｓ　ｐ　（Ｘ
３）−Ａｌ　ａ−Ｉ　ｌ　ｅ　−Ｐｌｂ　ｅ−Ｔｌｂｒ
　（Ｘ’）　−Ａｓ　ｎ−８ｅ　ｒ　（Ｘ町−Ｔｙｒ　
（Ｘ′）−Ａｒ　ｇ　（、Ｙ’）　Ｌｙ　ｓ　（、Ｘ′
）　−Ｉ　ｌ　ｅ−Ｌｅ　ｕ　−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｇｌｎ−
Ｌｅｒｂ　−８ｅ　ｒ　（Ｘ”）　−Ａ　ｌ　ａ−Ａｒ
　ｇ　（Ｘ’　）−Ｌｙ　ｓ　（Ｘ′）−Ｌｅｕ−Ｌｅ
ｒｂ−Ｇｌ　ｎ−Ａｓ　ｐ　（Ｘ３）　−Ｉ　ｌ　ｅ−
Ｍｅ　ｔ　−Ａｓｎ−Ａｒｇ　（Ｘ’）　−〇１ｎ−Ｇ
ｉｎ−Ｇｌ　ｙ−Ｇｌｕ（Ｘ３）−Ａｒｇ（Ｘ６）−Ａ
ｓｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ　（Ｘ３）−Ｇｉｎ−Ｇｌ　ｙ−
Ａｌａ−Ｌｙ　ｓ　Ｃ，Ｘ’　）　−Ｖａ　ｌ　−Ａｒ
　ｇ　（Ｘ６）　−Ｌｅ　ｕ−Ｘ８（式中、ＸｌはＢ　
ＯＣである；Ｘ′は２，６−ジクロロベンジルである；
Ｘ３はベンジルエステルである；Ｘ４はＢｚｌである；
Ｘ′′はＢｚｌである：Ｘ６はＴｏＳである；Ｘ′は２
Ｃ１３−Ｚである；Ｘ８は−ＮＨ−Ｍ　Ｂ　１１’　Ａ
樹脂支持体である。）最後のＴｌγ残基が樹脂へカップ
リングされた後、（３日） ＢＯＣ基はＣＨ２Ｃｌ！２中の４５％ＴＦＡを用いて除
去した。残りの保護ペプチド樹脂の開裂および脱保護は
実施例３に述〈たようにして行なった。開裂および脱保
護したペプチドは３０５’ｏＷｉ′ｌ：酸に溶解させ、
５ｅｐｈａｃｌｅｘ　Ｇ−５０微細ゲル濾過、カチオン
交換クロマトグラフィーおよび最後に分取タロマドグラ
フィーを実施例１に述べたようｌこして行なった。

タロルメチル化樹脂を使用し、実施例１に述べたように
してこの合成を再度行ない、遊離酸Ｃ−末端を有する同
じペプチドを生成した。

実施例Ｇ このペプチドの生長ホルモン放出促進効力を測定するた
めに、実施例２に述べγこように、合成ｈＧＲＦＣ１，
−４４）−ＮＩＩ２を使用し、等モル出産のｏ　ＧＲＦ
　（１４４）　Ｎ１ｆ２（実施例５）と各構成アミノ酸
ごとに比較対照すること０こよって試験管内試験を行な
った。

この比較試験の結果から、等モル比ζこおいては、ｏ　
Ｇ　ＲＦ　（１−４４）−ＮＨ２は合成ペプチドの完全
固有生物学的活性およびほぼ同じ力価を有することが明
らかになった。倍量投与因数様式試験では、０ＧＲＦは
ｈ　ＧＲＦ　（１−４４）−ＮＨ２と同じ固有活性と、
ｈＧＲＦ　（１，４４）　Ｎ１ｆｔの約７０％相当の比
活性を有することが示された。

合成ｐＧＩＩＦ、ｂＧｉイＦおよびｏＧＲＦペプチドを
飼育動物、特に、ブタ、ウシ、ヤギおよびヒツジあるい
はその池の温血動物に長期投与すると、同化作用を促進
１〜、その結果、筋肉塊に関し、体重が増加することが
期待される。ＧＲＦをその対応する動物種用の獣医薬と
して使用すること、即ち、ｏＧＲＦはヒツジに、ｂＧＲ
Ｆはウシまたはヤギに使用することは理想的な使用形態
である。なぜなら、注射あるいはその他の方法により投
与された分子は、処置される動物の種と同じ種の分子な
ので抗原性がないからである。また、このような動物種
の牝０こおいてはミルク産生量を増加させる。

養魚およびその他の〜血水棲動物の水産養殖で使用し、
生長を促進させることも重要である。約５％程度の低純
度で動物に投与することも可能であろう。一般的に、こ
のペプチドを獣医薬用の固体捷たは液体担体と併用し、
この使用日的に関し、広く医薬組成物と呼ばれるものを
製造することにより投与が行なわれる。

医薬組成物を形成するために薬学的に受容される４′ｑ
体と組合わされた合成ＧＲＦペプチド葦たはその無毒性
塩は、ヒトを含む哺乳動物へ静脈内、皮下、筋肉内、鼻
腔内または経口的に投与することができる。

治療を受ける患者がＧＩｉ放出の治療処置を必要とする
場合、そのＧ１−１放出を刺激するための投与は医師に
より行われる。必要とされる投与量は治療すべき個々の
症状、その症状の程度および希望する治療存続期間によ
って変化するだろう。

このようなペプチドは酸付加塩または金属錯体（例えば
亜鉛や鉄との錯体、本出願においてはこれらを塩と考え
る）などの薬学的に受容される無毒性塩の形でしはしは
投与される。このような酸付加塩の例には塩酸塩、臭化
水素酸塩、硫酸塩、燐酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、ク
エン酸塩、安（４１） 息香酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩
および酒石酸塩などがある。活性成分が錠剤の形で経口
的に投与される場合に、その錠剤はトラガカント、トウ
モロコシデンプンまたはゼラチンなどの結合剤、アルギ
ン酸のような崩壊剤：およびステアリン酸マグネシウム
のような滑沢剤を含むことができる。液体での投与が望
まれる場合に、甘味剤および／またはフレーバー剤が用
いられ、そして等張食塩液または燐酸緩衝液での静脈内
投与が行われる。

ペプチドは医師の指導のもとで投与されるべきであり、
そして医薬組成物は通常薬学的に受容される担体と共に
ペプチドを含有するだろう。一般的に、非経口投与量は
患者の体重１ｋｇあたり約２０ナノグラムないし約２０
００ナノグラムのペプチドであるだろう。

本発明者らが現在知っている最良の態様を構成する好ま
しい実施態様について本発明を説明してきたが、当該技
術分野において通常の知識を有する者には明らかなよう
に、各種の変更や修正がこ（４２） こに添付の請求の範囲で説明される本発明の範囲から逸
脱することなく行われうろことは理解されるだろう。例
えば、４４員鎖における変更、特（・こ、ペプチドのカ
ルボキシル末端で始まる削除は、ｈＧＲＦで既に得られ
た公知の実験上の証拠に従い、また、長さが３４〜４３
残基の断片（例えば、ｐＧＲＦ（１〜３４）、ｂＧＲＦ
（１〜３５）、ｏ　ＧＲＦ（１〜４０）およびｏ　ＧＲ
Ｆ　（１〜３７　）あるいはもつと短い断片（即ち、ｏ
　ＧＲＦ　（１−３２）、ｂ　ＧＲＦ’（１〜２９）お
よび０ＧＲＦ（１〜２７　））　（これらの断片はＣ−
末端にＮＨ２−１，たＩｄ−ＯＨのいずれかを有する。

また、ペプチド本来の生物活性を保持（−でおり、そし
て、このような短鎖ペプチドは本発明の範囲内に含まれ
る）を製造するための現在のプラクティスに従って行な
うことができる。さらに、付加が一方の末端で、または
両方の末端で可能であり、そして／またペプチド化学の
分野において周知であるごとく、天然に存在するアミノ
酸残基の代りにほぼ同等のアミノ酸残基を使用して、天
然ペプチドの効力の少なくとも実質的部分を有する類似
体を本発明の範囲から逸脱することなく製造することも
可能である。

第１頁の続き ■Ｉｎｔ、Ｃ１，’　識別記号　庁内盤用／／　Ｃ１２
Ｐ　２１１０２　７２３５優先権主張　［相］１９昭年
１０月１２日［相］米国（ＵＳ）［株］［相］１９８群
３月２日［相］米国（Ｕ　５）０５８５８＠発　明　者
　フレデリック・ステイ　アメリカ合［−ヴン・エシュ
　ドウファイ ６９ ０発　明　者　ニコラス・チャイーク　アメリカ合；ワ
ン・リング　ゴヤブロー ０発　明　者　ウィリアム・バシー・　アメリカ合；ウ
エーレンバーグ　ゴヤチュー ０発　明　者　ロジャー・チャール　アメリカ合［ズφ
ルイス・グイルミ　ンセリア・ ン １０２８− ４ 殺国カリフォルニア州９２０５４．オーシャンサイγ−
・マウンテイン・ドライブ　２９２９・ナンバζ国カリ
フォルニア州９２１２２．サン・デイエチ・ストリート
　５３２４ 毅国カリフォルニア州９２１２２．サン・ディニレイン
・ストリート　５８１１ 艇国カリフォルニア州９２０３７．　ラ・ホーラ、ニド
ライブ　７３１６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）下記の配列を有する合成ペプチドまたはその生物
   学的に活性な断片あるいは非毒性塩。 Ｔｙｒ−Ａｌ　ａ−Ａｓｐ−Ａｌ’ａ−Ｉ　ｌ　ｅ−Ｐ
   ｈｅ−Ｔｈｒ　−Ａ　ｓ−ｎ、−８ｅ　ｒ−Ｔｙ　ｒ−
   Ａｒ　ｇ−Ｌｙ　ｓ　−Ｒ＋ｓ−Ｌ　ｅ　ｕ−Ｇ　ｌ　
   ｙ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ
   −Ｌｅｒｂ　−Ｉｒ　ｅ　ｕ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ａｓ　ｐ−
   Ｉ　ｌ　ｅ−Ｍｅ　ｔ−Ｒ，８−Ａｒ　ｇ　−Ｇ　ｌ　
   ｎ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ａｒ　ｇ−
   Ａｓ　Ｒ５−Ｇ　ｌ　ｎ　−Ｇ　ｌ　ｕ　−Ｇｉｎ−Ｇ
   　ｌ　’ｙ　−Ａ　ｌ　ａ　−Ｒ，Ｂ−Ｖａ　ｌ　−Ａ
   ｒ　ｇ　−Ｌ　ｅ　ｕ（式中Ｒ７３はＶａｌまたはＩｌ
   ｅである：Ｒ２８はＳｅｒまたはＡ　、ｑ　ｎであるニ
   ア７４．はＡｒｇまたはＬｙｓである。） （２）　Ｅ２ｓがＡｓｎであり、そして、ＬｌがＬｙｓ
   　である特許請求の範囲第１項記載のペプチド。 （３）　Ｒ１３がＩｌｅである特許請求の範囲第２項記
   載のペプチド。 （４）　Ｒ２８がＳｅｒであり、そして、Ｒ４１がＡｒ
   ｇで（１） る特許請求の範囲第１項記載のペプチド。 （５）　Ｒ＋３がＶａｌである特許請求の範囲第２項ま
   たは４項記載のペプチド。 （６）Ｃ−末端がアミド化されている特許請求の範囲第
   １項〜５項のいずれかに記載の配列を有する合成ペプチ
   ド。 （７〕　次式 ％式％ で示される特許請求の範囲第１項記載のベプチ「または
   そのＮ−末端から少なくとも第３４残基にまで伸びた生
   物学的に活性な断片。 （８）次式 ％式％ （２） −Ｇｌ　ｎ−Ｌｅ　ｕ−８ｏ　ｒ−Ａｌ　ａ−Ａ、ｒ　
   ｇ−Ｌｙ　８−Ｌｅ　ｕ　−Ｌｅ　ｕ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ａ
   ｓ　ｐ−Ｉ　ｌ　ｅ−Ｍｅ　ｔ−Ａｓ　７＋、−Ａｒ　
   ｇ−Ｇｌｎ−Ｇｉｎ−Ｇｌｙ−ＧｌｒＬ−Ａｒｇ−Ａｓ
   ｎ−Ｇｉｎ−Ｇｌｒｂ−Ｇｌｎ＝Ｇｌ　ｙ−Ａ、ｌ　ａ
   −Ｌｙｓ　−Ｖａ　ｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｒｂ　−ＮＩｆ２
   で示される特許請求の範囲第１項記載のペプチドまたは
   そのＮ−末端から少なくとも第２８残基にまで伸びた生
   物学的に活性な断片。 （９）次式 ％式％ で示される特許請求の範囲第１項記載のペプチドまたは
   そのＮ−末端から少なくとも第２８残基にまで伸びた生
   物学的に活性な断片。 （（財）特許請求の範囲第１項記載のペプチドおよび獣
   医薬の製造に使用できる固形状または液状担体からなる
   、ヒト以外の温血動物の生長を促進させ（３） る組成物。 （１υ特許請求の範囲第８項記載の合成ペプチドおよび
   獣医薬の製造に使用できる担体からなる、ウシまたはヤ
   ギの生長および／またはミルタ産生を促進させるのに使
   用される組成物。 （１２、特許請求の範囲第７項記載の合成ペプチドおよ
   び獣医薬の製造に使用できる担体からなる、ブタの生長
   を促進させるのに使用される組成物。 （２）特許請求の範囲第９項記載の合成ペプチドおよび
   獣医薬用担体からなる、ヒツジの生長および／捷たはミ
   ルタ産生を促進させるのに使用される組成物。 （１４）冷血動物の生長を促進させるために養殖で使用
   される特許請求の範囲第１項記載の組成物。 （］Ｉ５特許請求の範囲第１項記載の化合物を有効量投
   与することからなる、ヒト以外の温血動物においてＧＰ
   Ｉ放出をおこさせる方法。 （１６）特許請求の範囲第７項記載のペプチドをブタに
   有効量投与することからなる、筋肉腕の増加方法０ （４） ０７）特許請求の範囲第８項記載のペプチドをウシに有
   効量膜力することからなる、筋肉腕の増加方法。 （ト）特許請求の範囲第９項記載のペプチドをヒツジに
   有効量投与することからなる、筋肉腕の増加方法。 （］Ｉ９特許請求の範囲第１項記載の化合物をｔ）血動
   物の生長を促進させるのに有効な量投与することからな
   る養殖の促進方法。 Ｇ２０）次の配列 Ｔｙ　ｒ　−Ａ　ｌ　ａ−Ａ、ｓ　ｐ−Ａ　ｌ　ａ−Ｉ
   　ｌ　ｅ−Ｐｈ、　ｅ−Ｔｈ　ｒ　−ＡＳ？Ｌ−８ｅ　
   ｒ−Ｔｙｒ−Ａｒ　ｇ−Ｌｙ　５−ＲＩ３−Ｌｅｕ、−
   ＧＬ　ｙ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
   Ｌｙｓ−Ｌｅｕ　−Ｌｅｒｂ−Ｇｉｎ−Ａ−ｓｐ−１ｌ
   　ｅ−Ｍｅ　ｔ−Ｒ２５−Ａｒｃ）Ｇｉｎ−Ｇ　ｌ　ｎ
   　−Ｇ　ｌ　ｙ　−Ｇ　ｌ　ｕ−Ａｒ　ｇ−Ａｓ　ｎ−
   Ｇ　ｌ　？？−Ｇ　ｌ　ｕ　−Ｇｌｎ−Ｇｌ　ｙ−Ａ、
   ｌ　ａ−Ｒｈ−Ｖａ　ｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｒｂ（式中、Ｒ
   ＋ｓはＶａｌ’！たはＩｌｅである：Ｒ２８はＳｅｒま
   たはＡｓｎである；Ｒ４、はＡ、ｒｇまたはＬｙｓであ
   る。）を有するペプチドまたはＮ−末端セグメントを含
   有するその生物学的に活性な断片ある（５） いは非毒性塩および獣医薬用の固形状または液状担体か
   らなる、ヒト以外の温血動物の生長を促進させるのに使
   用される組成物。 Ｉ２１）次の配列 Ｔｙ　ｒ　−Ａ　ｌ　ａ−Ａｓ　ｐ　−Ａ　ｌ　ａ−１
   ｌ　ｅ　−Ｐｈ、　ｅ　−Ｔｈ　ｒ　−Ａｓ　ｎ−８ｅ
   　ｒ−Ｔｙ　ｒ−Ａ、ｒ　ｇ−Ｌｙ　５−ＲＩ３−Ｌ　
   ｅ　ｕ　−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｇｌ　ｎ−Ｌｅ　ｕ−８ｅ　ｒ
   −Ａｌ　ａ−Ａｒ　ｇ−Ｌｙ　５−Ｌｅ　ｕ　−Ｌｅｒ
   ｂ−Ｇｉｎ−Ａ、５ｐ−Ｉ　ｌ　ｅ−１１ｒｆｅ　ｔ−
   Ｒ２Ｈ−Ａｒ（７−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｒｂ
   −Ａ、ｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｉｎ−Ｇｌｕ　−Ｇｌ　ｎ−Ｇ
   １　ｙ−Ａｌ　ａ−Ｒ４，−Ｖａ　ｌ　−Ａｒ　ｇ−Ｌ
   ｅｕ（式中、ＲＩ３はＶａｌ’ｌたはＩｒｅである；Ｒ
   ２８は５ｅｒｉたはＡ　ｓ　ｎである：　Ｒ，ｕはＡｒ
   　ｇｉたはＬｙｓである。）を有するペプチドまたはＮ
   −末端セグメントを含有するその生物学的に活性な断片
   あるいは非毒性塩を有効量投与することからなる、ヒト
   以外の動物の生長を促進させる方法。