KR900006560B1 - Grf 유사체의 제법 - Google Patents
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Abstract
내용 없음.
Description
[발명의 명칭]
GRF 유사체의 제법
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 포유동물의 뇌하수체선의 기능에 영향을 주는 펩티드 제조에 관한 것이다. 특히 본 발명은 뇌하수체선에 의한 성장호르몬 방출을 촉진시키는 특정종에 대해 특히 유용한 펩티드 제조에 관한 것이다.
1982년 인간 췌장세포 종양으로 부터 뇌하수체 성장호르몬의 시상하부성방출인자 또는 소마토트로핀이 단리되어 정제되고 특성화되고 합성화되었다. 시험해본 결과 이것은 뇌하수체에 의해 성장호르몬(GH)방출을촉진시키는 것으로 밝혀졌다. 이 펩티드는 하기 서열을 갖는다 : H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr -Asn - Ser - Tyr -Arg - Lys - Val - Leu -Gly -Gln - Leu - Ser -Ala - Arg - Lys - Leu - Leu -Gln -Asp -Ile - Met - Ser - Arg -Gln -Gln -GIy -Glu - Ser -Asn -Gln -Glu -Arg -Gly -Ala -Arg -Ala -Arg-Leu-NH2. 인간 시상하부성장호르몬 방출인자(hGRF)가 동일한 구조를 갖고 있는 것으로 밝혀졌다.[Bohlen일행,Biochem. and Biophs. Res. Comm.,114, 3,pp.930-936(1983).]
이제 돼지, 소, 산양 및 양의 시상하부정제 추출물로 부터 44-잔기 폴리펩티드 가단리되어 특성화되었다. 이들은 이후 설명되는 바와 같이 hGRF 구조와는 몇개의 아미노산잔기가 다른 것으로 나타났다.
hGRF 조성으로 표현 할때, 돼지 GRF(pGRF) 는 유사체 [Arg34, Gln38, Val42]-hGRF(1-44) -NH2로 표시할 수 있으며, 이것은 이것이 하기구조를 가지고 있음을 뜻한다. H-Tyr-Ala-Asp-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly -Glu-Arg -Asn-Gln -Glu-Gln-Gly-Ala-Arg-Val-Arg-Leu-NH2. 이후 이것을 pGRF 또는 돼지의 소마토크리닌으로 칭한다. 이 펩티드는 온혈동물 특히돼지 및 냉혈동물과 수중양식에서 성장을 촉진시키는데 사용될 수 있다.
hGRF 조성으로 표현할때 소의 GRF(bGRF)는 유사체 [Asn28, Arg34, Gln38, Lys41, Val42]-hGRF(1-44) -NH2로 나타낼 수 있으며 이것은 이것이 하기 구조를 가지고 있음을 의미한다. H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg- Lys-Val-Leu-Gly -Gln -Leu-Ser-Ala-Arg -Lys-Leu-Leu-Gln-Asp- Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-Val-Arg-Leu-NH2. 이후 이것을 bGRF 또는 소의 소마토크리닌으로 칭한다. 산양 GRF는동일구조를 가지고 있으며 온혈동물 특히 소 및 냉혈동물과 수중양식에 성장을 촉진시키는데 사용될 수 있다. 이것은 또한 특질의 치이즈를 만드는 밀크를 얻기위해 소 및 염소에서 밀크 생성을 증가시키는데도 사용될 수 있다.
hGRF 조성으로 볼때 양의 GRF(oGFR) 은 유사체 [Ile13, Asn28, Arg34, Gln38, Lys41, Val42]-hGRF(1-44) -NH2로 나타낼 수 있으며 이것은 하기구조를 가짐을 뜻한다. H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys- Ile-Leu-Gly -Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-Val-Arg-Leu-NH2. 이후 이것을 oGRF 또는 양의 소마토크리닌으로 칭한다. 이 펩티드는 온혈동물 특히 양과, 냉혈동물 및 수중양식시 성장촉진에 사용될 수 있다. 또한 이것은 특질의 치이즈를 만드는 밀크를 얻기위해암양에서 밀크생성을 증가시키는데 사용될 수도 있다.
본 발명에 따른 수의용 및 의악용 조성물은 pGRF, bGRF 또는 oGRF나 그의 유사체 또는 생물학적으로활성인 그의 분절이나 상기한 것들중 어떤 것의 무독성염이 제약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 액체 또는 고체담체에 분산되어 있는 것을 포함한다. 이런 조성물들은 임상의학에 인간 및 동물 모두에 진단또는 치료 목적을 위해 급성 또는 만성투여에 사용될 수 있다. 또한 이들은 돼지, 소, 염소, 양 또는 기타동물에서 근육질 성장 및/또는 밀크 생성을 촉진시키는데 사용될 수 있다.
펩티드를 정의하는데 사용된 명명법은 슈로더 및 루브크의 "The Peptides", Academic Press(1965)에 의해 정해진 것으로, 통상적인 표현법에 따르면, N-말단에 있는 아미노기를 좌측에, C-말단에 있는 카복실기를 우측에 나타냈다. 아미노산 잔기가 이성체인 경우 따로 언급이 없으면 L-형의 아미노산을 나타낸다.
본 발명은 하기 구조를 가진 합성 GRF 펩티드를 제공한다. H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-R13-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-R28-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-R41-Val-Arg-Leu-Y여기서 R13는 Val 또는 Ile이며; R28은 Ser 또는 Asn이며 . R41은 Arg 또는 Lys이며 , Y는 OH또는 NH2이다.
N-말단으로 부터 적어도 잔기-28까지(또는 pGRF에서 적어도 잔기-34까지)뻗어나간 생물학적으로 활성인 분절도 포함된다(이때 Y는 OH 또는 NH2일 수 있다).
펩티드는 어떤 적당한 방법 예컨대 고상법, 부분고상법, 분절축합법, 전통적인 용액커플링법, 또는 근래개발된 재조합 DNA법을 사용하여 합성될 수 있다. 예컨대 고상합성법은 문헌에 소개되어 있으며 1978.8월8일 특허된 미합중국 특허 번호 4,105,603을 예로 들 수 있다(textbook"Solid-Phase Peptide Synthesis",Stewart ＆ Young,Freeman ＆ Co.,San Francisco,1969). 분절 축합법은 1976년 8월 3일 특허된 미합중국 특허번호 3,972,859호에 예시되어 있다. 다른 이용 가능한 합성법으로 미국 특허 번호 3,842,067(1974.10.15) 및 미국특허 번호 3,862,925(1975.1.28)을 예로 들 수 있다. 재조합 DNA법을 사용한 합성 펩티드의 생성은 대규모의 상업적요구를 만족시키는데 사용될 수 있을 것 같다.
본 출원 목적을 위한 재조합 DNA법을 이용한 합성은 일정 형태의 GRF를 암호하는 구조 유전자의 적절한 사용을 포함하고 있음을 알아야 한다. 합성 GRF는 이런 구조유전자와 함께 프로모터 및 오퍼레이터를포함한 발현벡터를 사용하여 미생물을 형질전환시킨다음 이런 형질전환된 미생물로 하여금 GRF를 표현하게 만들므로써 얻을 수 있다. 인간이외의 동물 또한 이런 구조 유전자와 미국특허 4,276,282(1981.6.30일특허됨)에 기술된 일반법을 이용하거나 또는 1983년 5될 26일 공고된 WO83/01783과 1982년 12월 23일 공고된 WO82/04443에 언급된 바와같은 배아의 현미주사법을 이용한 유전자-배양법에 의해 GRF를 생성하는데 사용될 수도 있다. 합성 GRF는 또한 상기 두개의 WO 공보에 언급된 기술에 의해 촉진된 성장을 목적으로 하는 동물에서 직접 생성될 수도 있다.
각종 아미노산 부분의 불안정한 측쇄기들을 기가 궁극적으로 제거될때까지 그 부위에 화학반응이 일어나는 것을 방지해주는 적당한 보호기로 보호해주는 것은 커플링형 합성법에서 공통된 일이다. 카복실기에서 반응이 일어나는 동안 아미노산이나 분절상에 α-아미노기를 보호해준후 뒤이어 α-아미노보호기를 선택적으로 제거해주어 그 부위에서 뒤이은 반응이 일어나게 하는 것 또한 공통적으로 볼 수 있는 일이다. 따라서 합성의 한단계로서 적당한 잔기에 결합된 측쇄 보호기를 함유한 펩티드쇄의 바라는 서열에 위치한 아미노산 잔기 각각을 포함한 중간체 화합물을 생성시키는 것이 통례이다.
하기 구조식의 중간체 또한 본 발명의 범주내에 속하는 것으로 간주한다. X1-Thr(X2)-Ala-Asp(X3)-Ala-Ile-Phe-Thr(X4)-Asn-Ser(X5)-Thr(X2)-Arg(X6)-Lys(X7)-R13-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser(X5)-Ala-Arg(X6)-Lys(X7)-Leu-Leu-Gln-Asp(X3)-Ile-Met-R28(X5)-Arg(X6)-Gln-Gln-Gly-Glu(X3)-Arg(X6)-Asn-Gln-Glu(X3)-Gln-Gly-Ala-R41(X6또는 X7)-Val-Arg(X6) -Leu-X8
여기서 X1은 수소 또는 α-아미노보호기이다. X1으로 표시된 α-아미노보호기를 폴리펩티드의 단계적합성법에 유용한 것으로 알려진 것들이다. X1으로 표시된 α-아미노기보호기 부류중에서 하기 (1)-(7)의 것들이 있다.(1) 아실형보호기, 예컨대 포르밀, 트리플루오로아세틸, 프탈릴, 톨루엔설포닐(Tos), 벤젠설포닐, 니트로페닐설페닐, 트리틸설페닐,O-니트로펜옥시아세틸, 클로로아세틸,α-클로부티릴,(2) 방향족우레탄형 보호기 예컨데 벤질옥시카보닐(Z) 및 치환된 Z, 예컨대 P-클로로벤질옥시카보닐, P-니트로벤질옥시카보닐, P-브로모벤질옥시카보닐, P-메톡시벤질옥시카보닐,(3) 지방족 우레탄보호기, 예컨대 t-부틸옥시카보닐 (BOC), 디이소프로필메틸옥시카보닐, 이소프로필옥시카보닐, 에톡시카보닐, 알릴옥시카보닐,(4)사이클로알킬 우레탄형보호기, 예컨대 사이클로펜틸옥시카보닐, 이다만틸옥시카보닐 및 사이클로헥실옥시카보닐,(5) 티오우레탄형 보호기, 예컨대 페닐티오카보닐,(6) 알킬형 보호기, 예컨대 트리페닐메틸(트리틸), 벤질,(7)트리알킬실란기, 예컨대 트리메틸실란, 바람직한α-아미노 보호기를BOC이다.
X2는 테트라하이드로피라닐, t-부틸, 트리틸, Bzl, CBZ,4Br-CBZ 및 2,6-디클로로벤질로 구성된 군으로 부터 선택된 Tyr의 페놀성하이드록실기의 보호기이다. 바람직한 보호기는 2,6-디클로로벤질이다. X2는 수소일 수 있으며 이는 하이드록실기상에 어떤 보호기도 없음을 의미한다.
X3는 수소 또는 Asp 또는 Glu의 카복실기의 에스테르형성 보호기이며 Bzl,2,6-디클로로벤질, 메틸 및에틸로 구성된 군으로 부터 선택된다.
X4와 X5는 Thr과 Ser의 하이드록실기 보호기이며 아세틸, 벤조일, t-부틸, 트리틸, 테트라하이드로피라닐, Bzl,2,6-디클로로벤질 및 CBZ으로 구성된 군으로 부터 선택된다. 바람직한 보호기는 Bzl이다. X4및/또는 X5는 수소일 수 있으며 이는 하이드록실기상에 보호기가 없음을 의미한다. X6는 니트로, Tos,CBZ, 아다만틸옥시카보닐 및 BOC로 구성된 군으로 부터 선택된 Arg의 구아니디노기의 보호기이거나 수소이다. X7은 수소이거나 Lys의 측쇄아미노 치환분의 보호기이다. 적당한 측쇄아미노보호기에는 예컨대 2-클로로 벤질옥시카보닐(2-Cl-Z) Tos, CBZ, t-아릴옥시카보닐 및 BOC가 있다.
측쇄아미노 보호기의 선택은 임계적인 것은 아니나 단 합성중 α-아미노기 탈보호중 제거되지 않는 것이어야 한다. 따라서 α-아미노보호기와 측쇄 아미노보호기는 동일할 수 없다.
Gln 및/또는 Asn의 측쇄아미노기는 크산틸(Xan)에서와 같이 적당히 보호될 수 있다.
X8은 OH,OCH3, 에스테르, 아미드, 하이드라지드,-O-CH2-수지지지체 및 -NH-수지지지체로 구성된 군으로 부터 선택되며 OH 이외의 기들 및 아미드는 넓게 보호기로 간주된다.
중간체 구조에서 X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7및 X8중 적어도 하나는 보호기이다.
펩티드 합성에 사용되는 특정 측쇄 보호기를 선택하는데 있어 하기 규칙을 따른다.(a) 보호기는 합성각단계중 α-아미노보호기를 제거하기 위해 선택된 반응조건하에 그리고 시약에 대해 안정해야 한다.(b)보호기는 그 보호 기능을 유지해야 하며 커플링 상태하에서 분리되어서는 안된다.(c) 측쇄보호기는 바라는아미노산 서열을 함유하는 합성이 완결되었을때 펩티드쇄를 변경시키지 않는 반응조건하에서 제거될 수 있어야 한다.
펩티드는 비록 앞서 언급한 바와 같이 이 분야에 공지된 다른 대응한 화학합성법을 사용할 수도 있으나메리필드에 의해 설명된 것과 같은 고상합성법을 사용하여 제조하는 것이 바람직하다.(J.Am.Chem.Soc.,85,p2149(1963))고상합성법은 보호된 α-아미노산을 적당한 수지에 커플링시킴으로써 펩티드의 C-말단으로 부터 시작된다. 이런 출발물질은 α-아미노보호 Leu을 에스테르 결합으로 클로로메틸화 수지나 하이드록시메틸수지에 부착시키거나 또는 아미드 결합으로 BHA 수지 또는 MBHA 수지에 부착시켜 제조할 수있다. 하이드록시메틸수지의 제조는 문헌에 설명되어 있다[Bodansky 일행의 Chem.Ind.(London)38,1597-98(1966)].클로로메틸화 수지는 바이오 래보라토리스(켈리포니아주 리치몬드시) 및 랩시스템 인코포레이팃드로 부터 상품으로 이용이 가능하다. 이런 수지의 합성법이 스튜어트 등에 의해 "펩티트 고상합성법"(Freeman 및 Co.,San Francisco 1969), Chapter l,pp1-6에 설명되어 있다. BHA와 MBHA 수지지지체는 상업적으로 구입 가능하며 바라는 합성된 폴리펩티드가 C-말단에 α-카복사미드를 가지고 있을때만 일반적으로 사용된다.
BOC에 의해 보호된 Leu는, 예를들어 유리카복시말단을 가진 44-아미노산펩티드를 합성하는 것이 바람직한 경우 문헌(Monahan 및 Gilon,Biopolymer 12,pp2513-19,1973)에 기재된 방법에 따라 클로로메틸화수지에 결합된다.
BOC-Leu의 커플링에 이어 α-아미노보호기를 염화메틸렌중 트리플루오로아세트산(TFA)이나 또는TFA 단독이나 또는 디옥산중 HCl을 사용함으로써 제거한다. 탈보호는 약 0°-실온에서 수행된다. 특정α-아미노보호기를 제거하기 위한 다른 표준분해시약 및 조건들은(Schroder 및 Lubke의 문헌,"ThePeptides",1pp71-75(Academic Press 1965))에 설명된 바와같이 사용될 수 있다.
Leu의 α-아미노보호기를 제거한 후 남아있는 α-아미노-및 측쇄-보호아미노산을 바라는 서열로 단계적으로 커플링시켜 상기한 바와같은 중간체학합물을 얻거나 또는 각 아미노산을 따로 합성에 첨가하여 수행하며 이들중 몇몇은 고상반응기내 첨가되기에 앞서 서로 커플링될 수도 있다. 적당한 커플링 시약의 선택은당 기술분야 범위내이다. 특히 적합한 커플링시약은 N, N'-디사이클로헥실카보디이미드(DCCI) 이다.
펩티드 고상합성법에서 사용되는 활성화시약은 펩티드 분야에 잘 알려져 있다. 적당한 활성화 시약에는하기(1)-(8)이 있다:(1) 카보디이미드류, 예컨대 N,N'-디이소프로필 카보디이미드 N,N'-디사이클로헥실카보디이미드(DCCI): (2) 시안아미드류, 예컨대 N,N'-디벤질시안아미드: (3) 케트이민류; (4)이속사졸리윰염, 예컨대 N-에틸-5-페닐-이솟사졸리움-3'-설포네이트; (5) 환중에 질소 1-4개를 함유하는 방향족 특성의 단일고리 질소 함유 헤테로 사이클아미드, 예컨대 아미다졸리드, 피라졸리드 및 1,2,4-트리아졸리드 같은 것, 유용한 특정 헤테로고리아미드에는 N, N'-카보닐디이미다졸, N, N'-카보닐-디-1,2,4-트리아졸이 포함된다.(6) 알콕실화 아세틸렌, 예컨대 에톡시아세틸렌 같은 것,(7) 아미노산의카복실부분과 혼합무수물을 형성하는 시약들 예컨대 에틸클로로포르메트 및이소부틸클로로포르메이트같은 것,(8) 아미노산의 카복실부분과 활성에스테르를 형성하는 시약들, 하나의 환질소상에 하이드록실기를 함유하는 질소함유 헤테로고리 화합물 같은 것으로 예컨대 N-하이드록시프탈이미드, N-하이드록시석신이미드와 1-하이드록시벤조트리아졸(HOBT) 기타 활성화시약 및 펩티드 커플링에서 이들의 사용이 문헌에 설명되어 있다[Schroder와 Lubke의 상기 문헌 Chapter III 및 Kapoor의 J.Phar.Sci,59.pp1-27(1970) ] .
각 보호된 아미노산 또는 아미노산 서열을 2배 또는 그 이상 과량으로 고상반응기에 도입시키고 디메틸포름아미드:CH2Cl2(1:1) 매체중이나 DMF 또는 CH2Cl2단일 매체중에서 커플링을 수행할 수 있다. 불완전커플링이 일어나는 경우 다음아미노산의 커플링에 앞서 α-아미노보호기를 제거하기 전에 커플링과정을반복한다. 각 합성단계에서 커플링반응의 성공 여부는 E.Kaiser 일행의, Anal.Biochem.34,595(1970)에기재되어 있는 닌히드린 반응으로 관찰한다.
바라는 아미노산 서열이 만들어진후 수지로 부터 펩티드를 분리시킬뿐 아니라 모든 남아있는 측쇄보호기 X2, X3, X4, X5, X6, X7및 X8과 α-아미노보호기를 분리시켜 펩티드를 생성케하는 액체 불화수소 같은시약으로 처리하여 수지지지체로부더 중간펩티드를 제거한다.
대안적인 경로로서 중간체 펩티드는 가알콜분해로 수지지지체로 부터 분리시킬 수 있으며 그런 다음 회수된 C-말단알킬 에스테르를 가수분해하여 산으로 전환시킬 수 있다. 이어 존재하는 측쇄 보호기가 있으면이를 촉매환원(예:BaSO4상의 pd)같은 공지된 방법으로 또는 앞서 언급한 바와 같이 분리시킬 수 있다.분리를 위해 불화수소를 사용할 경우 소거작용을 위해 반응용기내 아니솔과 메틸에틸설파이드를 포함시킨다.
하기 실시예는 고상법으로 GRF를 합성하는 바람직한 방법을 나타낸 것이다.
[실시예 1]
하기 구조를 가진 pCRF(l-44) 유리산의 합성은 0.9Meq Cl/g을 함유하는 클로로메틸화수지(LabSystems,Inc.,으로부터 이용가능)상에서 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적인 방법으로 수행한다: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser - Ala - Arg - Lys - Leu - Leu -Gln -Asp - Ile - Met - Ser - Arg -Gln -Gln -Gly -Glu -Arg-Asn -Gln -Glu -Gln -Gly - Ala - Arg - Val-Arg - Leu -OH .
BOC-Leu을 수지에 커플링시키는 것은 문헌(Monahan 일행의 Biopolymers, Vol. 12(1973) pp.2513-2519)에 기재된 일반법으로 수행하며 그 결과 수지 g당 약 0.22m몰의 Leu가 치환된다. 사용되는 모든 용매는 불활성기체 바람직하게는 헬륨으로 스파징(sparging)시켜 기체를 제거하여 Met 잔기의 황을 바람직하지 못하게도 산화시킬지도 모르는 산소가 없게끔 한다.
탈보호 및 중화후에 수지상에 펩티드쇄를 단계적으로 만들어나간다. 각 아미노산의 탈보호, 중화 및 첨가는 문헌에 기재된 일반적 방법에 따라 보통 수행한다(Guillemin일행의 미합중국 특허 제3,904,594호). 커플링은 하기 스케쥴 A에 나타난 바와같이 특수하게 수행된다.
(스케쥴)
*Asn과 Gln의 커플링의 경우, 이 단계에 1.136몰 과량의 1-하이드록시벤조트리아졸(HOBt)가 포함된다.
요약하면 커플링반응에서 수지 당 염화메틸렌중 BOC-보호아미노산 1m몰이 염화메틸렌중 0.5몰 DCCI1당량 또는 염화메틸렌중 30% DMF와 함께 2시간 동안 사용된다. Arg이 커플링되는 경우 10% DMF와염화메틸렌의 혼합물이 사용된다. Ser과 Thr의 하이드록실 측쇄보호기로는 Bzl이 사용된다. Lys측쇄보호기로는 2-클로로-벤질옥시카보닐(2Cl-Z) 이 사용된다. Tos는 Arg의 구아니디노기를 보호하는데 사용되며 Glu 또는 Asp카복실기는 Bzl에스테르로서 보호된다.
Thr의 페놀성 하이드록실기는 2,6-디클로로벤질에 의해 보호된다. 합성마지막에 하기 조성이 얻어진다:X1-Thr(X2)-Ala-Asp(X3)-Ala-Ile-Phe-Thr(X4)-Asn-Ser(X5)-Tyr(X2)-Arg(X6)-Lys(X7)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser(X5)-Ala -Arg(X6)-Lys(X7)-Leu-Leu-Gln-Asp(X3)-Ile-Met-Ser(X5)-Arg(X6)-Gln-Gln-Gly-Glu(X3)-Arg(X6)-Asn-Gln-Glu(X3)-Gln-Gly-Ala-Arg(X6) -Val-Arg(X6)-Leu-X8.
여기서 X1은 BOC이며, X2는 2,6-디클로로벤질이며, X3는벤질에스테르이며, X4는Bzl,이며, X5는Bzl이며, X6는 Tos이며, X7은 2Cl-Z이며 X8은 -o-CH2-벤젠-폴리스티렌 수지 지지체이다.
최종 Tyr잔기를 수지에 커플링시킨후 BOC기는 CH2Cl2중 45% TFA로 제거한다. 남아있는 보호펩티드-수지를 분리하고 탈보호하기 위해 이것을 펩티드-수지 g당 1.5㎖아니솔,0.25㎖메틸에틸설파이드 및l0㎖불화수소(HF)로 -20℃에서 30분,0℃에서 30분 처리한다. 고진공하에 HF를 제거한 후 수지-펩티드잔여물을 건조디에틸에테르와 클로로포름으로 교대로 세척하고 이어 펩티드를 가스를 제거한 2N수성초산으로 추출한다. 초산추출물을 동결건조하여 백색의 보풀거리는 물질을 얻는다.
이 분리되고 탈보호된 펩티드를 30% 초산에 용해시킨 다음 세파덱스 G-50 미세겔여과를 받게한다.
pH 6.5의,0.4M NH4OAc,1L를 pH 4.5의 0.0lM NH4OAc,400ml를 함유하는 혼합플라스크에 적하하여 생성된 오목한 경사를 사용한 CM-32카복시메틸 셀룰로오즈(Whatman)양이온 교환 크로마토그라피(1.8×18Cm.,Vbed=50ml)를 이용하여 펩티드를 더 정제시킨다. 최종정제는 nBuOH:EtoH.피리딘:0.2% N HOAc(4:1:1:7) 용매계를 사용하는 세파덱스 G-50 미세지지체(Pharmacia)상 분배크로마토그라피를 이용하여 수행한다. 상세한 정제법은 문헌에 소개되어 있다(Ling일행의 Biochem. Biophys. Res. Commun. 95,945(1980)). 크로마토분획물을 TLC로 유의하여 관찰하여 거의 순수한 분획물만 모은다.
MBHA수지를 사용하고 Leu를 MBHA수지에 결합시키기 위해 미국특허 번호 4,292,313에 기재된 방법을 따라 합성을 반복해서 아미드화 G-말단을 가진 동일한 펩티드를 얻는다.
[실시예 II]
성장호르몬 방출을 촉진시키는 펩티드의 유효성을 평가하기 위해 합성 hGRF(1-44)-NH2를 사용하여,뇌하수체 세포로부터 성장호르몬 방출을 촉진시키는 알려진 효과를 갖고 있는 GRF 대조 표준품과 pGRF(1-44)-NH2와의 단계적인 비교로 시험관내 효력검정을 수행했다. GRF대조 표준품은 문헌에 설명되어있으며(Brazeau일행의 Endocrinology,Vol.110,A538(1982)) 뇌하수체세포 단층의 생물학적 검정에서 GH방출면에서
최대반응을 제공하는 쥐 시상하부 근원 제제의 양을 나타낸다.4-5일전 제거된 쥐 뇌하수체선의 세포를 함유하는 배양액이 사용된다. 비교시험을 위해 사용되는 성장호르몬 분비에 최적이라 생각되는배양물과 규정된 표준 배지 배양물이 모두 사용되며 일반적인 방법이 문헌에 소개되어 있다(Brazeau일행의Regulatory Peptides,1,255,1981.). 시험물질의 배양은 3-4시간 수행하며 배양 배지 일부를 취하여 처리하여 방사선 면역검정법으로 면역반응성 GH(ir GH)로 그 함량을 측정한다. 이 비교시험결과 pGRF(1-44)-NH2가 동몰비에서 합성 hGRF펩티드의 내부 생물학적 활성을 모두 가지고 있으며 거의 동일한 역가를 갖는 것으로 나타났다.
[실시예 Ⅲ]
하기 구조를 가진 bGRF(1-44) 아미드의 합성을 벡크만 990펩티드 합성기와 MBHA수지를 사용하여 단계적으로 수행했다.
H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-Val-Arg-Leu-NH2. BOC-Leu을 수지에 커플링시키는 것은 미국특허 제4,292,313호에 기재된 일반법으로 수행했으며, 그 결과 사용된 MHBA수지의 치환에 따라 수지 g당약 0.2-0.6m몰 Leu의 치환이 야기되었다. 사용되는 모든 용매는 불활성기체 바람직하게는 헬륨으로 스파징시켜 기체를 유의하여 제거하여 Met잔기의 유황을 바람직하지 못하게 산화시킬지도 모르는 산소를 제거했다.
탈보호와 중화에 이어 펩티드쇄를 단계적으로 수지상에 만들어 나간다. 각 아미노산의 탈보호, 중화 및첨가는 미국특허 제3,904,594호(Guillemin일행)에 상세히 설명된 일반법에 따라 수행한다. 커플링은 실시예 I 의 스케쥴 A에서와 같이 수행한다.
커플링 반응은 실시예 I에서와 같이 수행되며 합성마지막에 하기 조성을 얻었다.
X1-Tyr(X2)-Ala-Asp(X3)-Ala-Ile-Phe-Thr(X4)-Asn-Ser(X5)-Tyr(X2)-Arg(X6)-Lys(X7)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser(X5)-Ala-Arg(X6)-Lys(X7)-Leu-Leu-Gln-Asp(X3)-Ile-Met-Asn-Arg(X6)-Gln-Gln-Gly-Glu(X3)-Arg(X6)-Asn-Gln-Glu(X3)-Gln-Gly-Ala-Lys(X7)-Val-Arg(X6)-Leu-X8.
여기서 X1은 BOC, X2는 2,6-디클로로벤질, X3는 벤질에스테르, X4는 Bzl, X5는 Bzl, X6는 Tos, X7은 2Cl-Z이며, X8은 -NH-MBHA수지 지지체이다.
최종 Tyr잔기를 수지에 커플fld시킨 다음 CH2Cl2중 45% TFA로 BOC기를 제거한다. 잔류하는 보호된펩티드-수지를 분리하고 탈보호하기 위해 이것을 펩티드-수지 g당 1.5ml아니솔,0.25ml 메틸에틸설파이드 및 10ml불화수소(HF)로 -20℃에서 30분 0℃에서 30분 처리한다. 고진공하에 HF를 제거한 후 수지-펩티드 잔유물 건조디에틸에테르와 클로로포름으로 교대로 세척하고 이어 펩티드를 기체를 제거한 2N 수성초산으로 추출한다. 초산추출물을 동결건조하여 백색의 보풀거리는 물질을 얻는다.
이어 분리되고 탈보호된 펩티드를 30% 초산중에 용해시킨 다음 세파덱스 G-50미세 겔여과시킨다. 이어펩티드를 실시예 I에서와 같이 양이온교환 크로마토그라피 및 분배크로마토그라피로 더 정제해준다.
유리산 C-말단을 가진 동일한 펩티드를 제조하기 위해 클로로메틸화수지를 사용하고 Leu를 클로로메틸화수지에 결합시키기 위해 문헌(Biopolymers,12,2513-19(1973))에 기재된 방법을 따라 합성을 반복했다.
실시예 I의 방법을 사용하여 유리산 C-말단을 가진 동일한 펩티드를 제조하는데 클로로메틸화수지를사용하여 합성을 반복했다.
[실시예 IV]
성장호르몬 방출을 촉진시키는 펩티드의 유효성을 평가하기 위해 앞서 실시예 2에서와 같이 합성 hGRF(1-44)-NH2를 사용하여 동물농도의 bGRF(1-44)-NH2와의 단계적인 비교로 시험관내 효력검정을 수행했다.
이 비교시험결과 동몰비에서 bGRF(1-44)-NH2는 합성펩티드의 고유생물학적 활성을 전부 가지고 있었으며 역가가 거의 동일했다. 다용량 요인배치시험에서 bGRF는 hGRF(1-44)-NH2와 동일한 고유활성을갖는 것으로 나타났으며 신뢰한계 54-93%에서 hGRF(1-44)-NH2의 약 70%에 해당하는 특이활성을 갖는 것으로 나타났다.
[실시예 V]
하기 구조를 갖는 oGRF(1-44), 아미드의 합성을 벡크만 990펩티드 합성기와 MBHA수지를 사용하여실시예 Ⅲ에 역거된 바와같이 단계적 방법으로 수행했다.
H - Tyr - Ala - Asp - Ala - Ile - Phe - Thr - Asn - Ser - Tyr - Arg - Lys - Ile - Leu -Gly -Gln - Leu -Ser -Ala -Arg - Lys - Leu - Leu -Gln - Asp - Ile - Met - Asn - Arg - Gln - Gln -Gly -Glu - Arg - Asn -Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-Val-Arg-Leu-NH2. 합성 마지막에 하기 조성을 얻었다:
X1-Tyr(X2)-Ala-Asp(X3)-Ala-Ile-Phe-Thr(X4)-Asn-Ser(X5)-Tyr(X2)-Arg(X6)-Lys(X7)-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser(X5)-Ala-Arg(X6)-Lys(X7)-Leu-Leu-Gln-Asp(X3)-Ile-Met-Asn-Arg(X6)-Gln-Gln-Gly-Glu(X3)-Arg(X6)-Asn-Gln-Glu(X3)-Gln-Gly-Ala-Lys(X7)-Val-Arg(X6)-Leu-X8.
여기서 X1은 BOC, X2는 2,6-디클로로벤질, X3는 벤질에스테르, X4는 Bzl, X5는 Bzl, X6는 Tos, X7은 2Cl-Z이며, X8은 -NH-MBHA수지지지체이다.
최종 Tyr잔기를 수지에 커플링시킨후 BOC기를 CH2Cl2중 45% TFA로 제거한다. 남은 보호된 펩티드-수지의 분해 및 탈보호는 실시예 III에서와 같이 수행한다. 분리되고 탈보호된 펩티드는 실시예 I에서와 같이 세파덱스 G-50미세겔여과, 양이온교환 크로마토그라피 및 최종적으로 분배크로마토그라피를 받게한다.
실시예 I의 과정에 따라 유리산 G-말단을 가진 동일 펩티드를 제조하기 위해 클로로메틸화 수지를 사용하여 합성을 반복한다.
[실시예 VI]
성장호르몬 방출을 촉진시키는 펩티드의 유효성을 평가하기위해 앞서 실시예 2에서와같이 합성 hGRF(1-44)-NH2를 사용하여 등몰농도의 합성 oGRF(1-44)-NH2와의 비교로 시험관내 효력검정을 수행했다.
비교시험결과 동올비에서 oGRF(1-44)는 합성펩티드의 고유생물학적활성을 모두 가지고 있었으며, 역가가 거의 동일했다. 다용량 요인배치 시험에서 oGRF는 hGRF(1-44)-NH2와 거의 동일한 고유활성을 가지고 있는 것으로 나타났으며, 특이 활성은 hGRF(1-44)-NH2의 약 70%에 상당했다.
합성 pGRF, bGRF 및 oGRF펩티드를 가축 특히 돼지, 소, 염소 및 양이나 기타 온혈동물에 만성적으로투여했을때 동화작용이 촉진되어 근육질면에서 체중 증가가 기대된다. 동일종의 GRF 예컨대 양에서는oGRF, 소나 염소에서는 bGRF를 수의용 약품으로 사용하면 주사되거나 투여된 분자가 처리된 동물과 같은종류기 때문에 항원으로 작용하지 않아 이상적이다. 이것은 또한 이런 종의 암컷에서 밀크생성을 증가시킨다. 고기나 기타 냉혈수중동물의 수중양식에 성장을 촉진시키기 위해 사용하는 것 또한 중요하다. 동물에투여시 약 5% 정도로 순도가 낮은 것도 사용될 수 있으며, 일반적으로 펩티드와 수의용에 적합한 고체나액체담체와 혼합사용되어 넓게 약제조성물이라 불리우는 것을 생성시킨다.
합성 GRF 또는 그의 무독성염은 제약상 허용되는 담체와 함께 약제조성물을 형성하며, 이것은 인간을포함한 포유동물에 정맥내, 피하내, 근육내, 비강내 또는 경구투여될 수 있다. 치료받는 환자가 이런 치료법을 요구할 경우 성장호르몬 방출을 촉진시키기 위해 의사에 의해 투여될 수 있다. 필요량은 치료받는 특정상태의 심한정도, 원하는 치료기간에 따라 달라진다.
이런 펩티드는 아연, 철등과의 금속 착염(본 출원의 목적에 맞는 염으로 간주함)이나 산부가염 같은 제약상 허용되는 무독성염 형태로 자주 투여된다. 이런 산부가염에는 예컨대 염산염, 취화수소산염, 황산염, 인산염, 말레인산염, 초산염, 구연산염, 벤조산염, 호박산염, 말산영, 아스코르빈산염, 주석산염 같은 것이있다. 활성성분이 정제 형태로 투여되는 경우 정제는 트라가칸트, 옥수수전분 또논 젤라틴 같은 결합제;알긴산 같은 붕해체 및 스테아린산 마그네슘 같은 윤활제를 함유할 수 있다. 액체형태로 투여되는 것이 바람직한 경우, 감미제 및/또는 향료를 사용할 수 있으며, 등장식염수, 인산연 완충액 같은 것으로 정맥내 투여할 수도 있다.
펩티드는 의사지시하에 투여되어야 하며 약제조성물은 통상적인 제약학적으로 허용가능한 담체와 함께 펩티드를 보통 함유한다. 일반적으로 투여량은 사용대상 체중 kg당 펩티드 약 20-2000나노그람이다.
비록 본 발명을 발명자에 가장 최상이라 생각되는 형태로 구성된 바람직한 구체예를 들어 설명하였으나이후 청구범위에 언급된 본 발명의 범위를 벗어나지 않는한 이 분야 숙련된 기술자라면 알 수 있는 각종 변경 및 수정이 가능하다. 예컨대 44-원소쇄의 수정, 특히 펩티드의 카복실말단에서부터 시작되는 탈락은hGRF에서 이미 얻어진 공지된 실험법에 따라 이루어질 수 있으며, 길이 34-43잔기를 가진 분절들 예컨대pGRF(1-34), bGRF(1-35),oGRF(1-40) 및 oGRF(1-37) 및 그보다 더 짧은 분절들 예컨대 oGRF(1-32), bGRF(1-29) 및 oGRF(1-27)을 생성시킬 수 있으며, 이들 분절들은 C-말단에 NH2또는 OH를 가질 수 있으며 펩티드의 고유 생물학적활성을 보지하고 있으며, 상기의 짧은 펩티드들도 본 발명의 범주내에 있는 것으로 간주한다. 또한 각 말단 또는 양쪽 말단모두에 부가가 이루어질 수도 있으며, 또는 본발명의 범주를 벗어남이 없이 천연 폴리펩티드 역가의 적어도 상당 부분을 갖고 있는 유사체를 생성하는 펩티드 화학분야에 잘 알려진 바와같은 등가의 잔기를 천연산 잔기 대신 치환해줄 수도 있다.
Claims (16)
- 하기 서열을 가지는 합성펩티드 또는 그의 생물학적으로 활성인 분절 또는 무독성염.Tyr - Ala - Asp -Ala - Ile - Phe - Thr - Asn - Ser - Tyr -Arg - Lys - R13- Leu - Gly - Gln - Leu - Ser -Ala - Arg - Lys - Leu - Leu -Gln - Asp - Ile - Met - R28- Arg - Gln - Gln - Gly - Glu -Arg -Asn -Gln -Glu -Gln -Gly -Ala - R41- Val- Arg - Leu여기서 R13은 Val 또는 Ile이며 , R28은 Ser 또는 Asn이며 , R41은 Arg 또는 Lys이다.
- 제1항에 있어서 R28이 Asn이며 R41이 Lys인 펩티드.
- 제2항에 있어서 Rl3이 Ile인 펩티드.
- 제1항에 있어서 R28이 Ser이고 R41이 Arg인 펩티드.
- 제2항에 있어서 R13이 Val인 펩티드.
- 제1항 내지 제 5 항중 어느 하나에 있어서 C-말단이 아미드화된 펩티드.
- 제1항에 있어서 하기 구조식을 가지는 펩티드 또는 N-말단으로부터 적어도 잔기-34까지 뻗는 그의 생물학적으로 활성인 분절.H -Tyr-Ala -Asp -Ala -Ile - Phe - Thr - Asn - Ser - Tyr - Arg - Lys - Val- Leu -Gly -Gln - Leu -Ser - Ala - Arg - Lys - Leu -Gln - Asp - Ile - Met - Ser - Arg -Gln -Gln -Gly -Glu - Arg - Asn - Gln -Glu -Gln -Gly -Ala -Arg -Val-Arg - Leu - NH2..
- 제1항에 있어서 하기 구조식을 가지는 펩티드 또는 N-말단으로부터 적어도 잔기-28까지 뻗는 그의 생물학적으로 활성인 분절.H - Tyr - Ala - Asp -Ala - Ile - Phe - Thr - Asn - Ser - Tyr - Arg - Lys - Val-Leu - Gly - Gln - Leu -Ser-Ala -Arg- Lys - Leu - Leu -Gln -Asp -Ile - Met -Asn - Arg -Gln -Gln -Gly -Glu -Arg -Asn -Gln -Glu -Gln -Gly -Ala - Lys - Val- Arg - Leu - NH2.
- 제1항에 있어서 하기 구조식을 가지는 펩티드 또는 N-말단으로부터 적어도 잔기-28까지 뻗는 그의 생물학적으로 활성인 분절.H -Tyr -Ala -Asp -Ala -Ile - Phe -Thr-Asn -Ser - Tyr - Arg - Lys - Ile - Leu -Gly -Gln _ Leu -Ser-Ala -Arg - Lys - Leu - Leu -Gln - Asp - Ile - Met - Asn - Arg - Gln -Gln -Gly -Glu - Arg - Asn -Gln -Glu -Gln -Gly -Ala - Lys -Val-Arg - Leu - NH2.
- 인간의 온혈동물 성장촉진용 조성물로서 제1항에 정의된 바와같은 펩티드와 수의과용으로 허용되는고체 또는 액체 담체를 조합하여 구성되는 조성물.
- 소나 염소과 동물의 성장 및/또는 밀크 생성 촉진용 조성물로서 제8항에 정의된 바와같은 펩티드와수의과용으로 허용되는 담체를 조합하여 구성되는 조성물.
- 돼지과 동물의 성장촉진용 조성물로서 제7항에 정의된 바와같은 펩티드와 수의과용으로 허용되는 담체를 조합하여 구성되는 조성물.
- 양과 동물의 성장 및/또는 밀크 생성 촉진용 조성물로서 제9항에 정의된 바와같은 펩티드와 수의과용으로 허용되는 담체를 조합하여 구성되는 조성물.
- 냉혈동물의 성장을 촉진하기 위하여 제1항에 정의된 펩티드를 함유하는 수중양식에 사용하기 위한조성물.
- 제4항에 있어서, R13이 Val인 펩티드.
- 제15항에 있어서, C-말단이 아미드화된 펩티드.
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