FI88402C - Foerfarande foer framstaellning av terapeutiskt anvaendbara grf-analoger - Google Patents

Description

1 88402

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten GRF-analogien valmistamiseksi

Esillä oleva keksintö kohdistuu peptideihin, joilla 5 on vaikutusta ihmisten ja muiden eläinten aivolisäkkeen toimintaan. Erityisesti esillä oleva keksintö kohdistuu peptideihin, jotka edistävät kasvuhormonin vapautumista aivoii säkkeestä.

Fysiologit ovat jo pitkään tienneet, että hypotala-10 mus säätelee adenohypofyysin eritystoimintaa hypotalamuksen tuottamilla erityisillä aineilla, jotka stimuloivat tai inhiboivat kunkin aivolisäkehormonin eritystä. 1982 eristettiin ihmisen haiman (kasvaimen) vapautumistekijöitä (hpGRF) ihmisen haimakasvainten uutteista, puhdistettiin, 15 karakterisoitiin, syntetisoitiin ja testattiin, ja näiden havaittiin edistävän GH:n vapautumista aivolisäkkeestä. Vastaavaa rotan hypotalamuksen GH:a vapauttavaa tekijää (rGRF) ja vastaava porsaan hypotalamuksen GH:a vapauttava tekijää (pGRF) on myös karakterisoitu ja syntetisoitu.

20 Nyt on syntetisoitu ja testattu synteettisiä poly- peptidejä, jotka vapauttavat GH:a viljellyistä aivolisäke-soluista Ja jotka voivat ainakin osoittein vastustaa entsy-maattista hajoamista elimistössä. Nämä peptidit täyttävät • ainakin yhden seuraavista kriteereistä: (a) jäännöksellä 1-25 asemassa on joko N°Me- tai C°Me-substituutio; (b) D-Leu on läsnä 17- ja/tai 23-asemassa; ja/tai (c) D-Glu on läsnä 25-asemassa. Peptidit voivat täyttää useamman kuin yhden tai jopa kaikki edellä mainituista ehdoista. Jäännös 1-asemassa . . voi olla Phe, pCl-Phe tai His (jossa jäänteessä voi olla '· 30 metyylisubstituentti joko alfa-hiilessä tai alfa-aminoryh- mässä). Peptideissä on myös edullisesti substituentti, kuten Nle Met:n asemasta 27-asemassa.

• Keksinnön mukaiset farmaseuttisesti valmisteet ovat analogeja, joiden pituus 29 - 32 jäännöstä, tai näiden ;:· 35 myrkyttömiä suoloja, dispergoituna farmaseuttisesti tai 2 88402 eläinlääketieteellisesti hyväksyttävään nestemäiseen tai kiinteään kantajaan. Tällaisia farmaseuttisia valmisteita voidaan käyttää kliinisessä lääketieteessä, sekä ihmisille että eläimille, annettuna terapeuttisissa tarkoituksissa ja 5 myös diagnostisesti. Lisäksi niitä voidaan käyttää edistämään kasvua lämminverisillä eläimillä, siipikarja mukaan lukien, ja vesitaloudessa kylmäverisille eläimille, kuten kaloille, ankeriaille jne.

Peptidien määrittelemiseksi on käytetty nimistöä, 10 jonka ovat esittäneet Schroder & Lubke, "The Peptides", Academic Press (1965), jossa tavanomaisen esitystavan mukaan aminoryhmä N-pääteasemassa on vasemmalla ja karboksyy-liryhmä C-pääteasemassa on oikealla. Luonnollisilla aminohapoilla tarkoitetaan tavallisia, luonnossa esiintyviä 15 aminohappoja, joita on tavattu proteiineissa ja joita ovat Gly, Ala, Vai, Leu, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp ja His. Nle tarkoittaa norleusiinia. Milloin aminohappojäänteellä on isomeerisiä muotoja, kyseessä on aminohapon L-muoto, ellei toisin ole 20 mainittu.

Keksintö kohdistuu menetelmään terapeuttisesti käyttökelpoisten peptidien valmistamiseksi, joilla on sekvenssi: R1-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-R8-Ser-Tyr-Arg-R12-R13-Leu-Gly-. 25 Gln-R17-R18-Ala-Arg-Lys-Leu-R23-R24-R25-Ile-R27-R28-Arg-Gln-Gln-

Gly-NH2, jossa R3 on N°MePhe, CaMePhe(4C1), pCl-Phe tai His; R8 on Ser tai Asn; R12 on Arg tai Lys; R13 on Ile tai Vai; R17 on Leu tai D-Leu; R18 on Tyr tai Ser; R23 on Leu tai D-Leu; R24 on His tai Gin; R25 on Glu, Asp tai D-Glu; R27 on 30 Met tai Nle; R28 on Asn tai Ser; edellyttäen kuitenkin, että joko (a) Ra:ssä on substituutio CaMe tai N°Me tai (b) R17 ja/tai R23 on D-Leu tai (c) R25 on D-Glu; edellyttäen myöskin, että korkeintaan kolme C-päätteen tähdettä saattaa puuttua.

3 88402

Kuten yllä on esitetty, fragmenteilla, jotka jatkuvat N-pääteasemasta suunnilleen jäänteeseen 29, on biologista vaikutusta, ja tällaisten biologisesti aktiivisten fragmenttien katsotaan kuuluvan keksinnön piiriin.

5 Keksinnön mukaiselle menetelmälle peptidien valmis tamiseksi on tunnusomaista, että a) muodostetaan välituote, jolla on vähintään yksi suojaryhmä ja jolla on kaava (II): X1-R1( X tai X2) -Ala-Asp( X3) -Ala-Ile-Phe-Thr (X*) -Re( X4 tai X5)-10 Ser(X4)-Tyr(X2)-Arg( X6)-R12( X6 tai X7)-R13-Leu-Gly-Gln(X5)-

Ri7"Ri8(X2) -Ala-Arg(X6) -Lys(X7) -Leu-R23-R24(X tai X5)-R25-( X3)-Ile-R27-R28(X4 tai X5)-Arg(X6)-Gln(X5)-Gln(X5)-Gly-X8, tai C-päätteestä tarkoituksen mukaisesti lyhennetty muunnos siitä, jossa kaavassa X on vety tai suojaryhmä tähteen His 15 imidatsolin typelie; X1 on vety tai α-aminon suojaryhmä; X2 on vety tai suojaryhmä tähteen Tyr fenoliselle hydroksyy-liryhmälle; X3 on vety tai suojaryhmä tähteen Asp tai Glu karboksyyliryhmälle; X* on vety tai suojaryhmä tähteen Thr tai Ser alkoholiselle hydroksyyliryhmälle; X5 on vety tai 20 suojaryhmä tähteen Asn tai Gin sivuketjun amidoryhmälle; X6 on vety tai suojaryhmä tähteen Arg guanidoryhmälle; X7 on vety tai suojaryhmä tähteen Lys sivuketjun aminoryhmälle ja X8 on -NH-hartsikantaja, kytkemällä suojatut aminohapot I järjestyksessä suhteessa noin yksi millimooli suojattua 25 aminohappoa yhtä grammaa sopivassa liuottimessa edullisesti metyleenikloridissa tai dimetyyliformamidissa tai niiden seoksessa olevaa hartsia kohti ja b) suojaryhmät poistetaan ja peptidi irrotetaan hartsikantajasta käyttämällä sopivassa liuottimessa edul- 30 lisesti CH2Cl2:ssa olevaa TFA:ta, minkä jälkeen käytetään v HF:ä alhaisessa lämpötilassa ja sitten peptidi liuotetaan sopivaan liuottimeen ja puhdistetaan tunnetuilla menetel-millä.

Esimerkiksi kiinteän faasin synteesitekniikat on ’·· 35 esitetty kirjassa "Solid-Phase Peptide Synthesis", Stewart 4 88402 & Young, Freeman & Co., San Fransisco, 1969, ja niistä on esimerkkejä julkaisussa US-patentti nro 4 105 603, julkaistu elokuun 8. 1978, Vale et ai.

Yhteistä tällaisille synteeseille on erilaisten 5 aminohappojen labiilien sivuketjuryhmien suojaaminen sopivilla suojausryhmillä, jotka estävät reaktiota tapahtumasta näissä paikoissa kunnes ryhmä lopullisesti poistetaan. Yleensä on myös tavallista, että aminohapon tai fragmentin alfa-aminoryhmä suojataan, kun karboksyyliryhmässä tapah-10 tuu reaktio, jonka jälkeen alfa-aminoryhmän suojaryhmä poistetaan selektiivisesti, jonka jälkeen voidaan suorittaa reaktio tässä paikassa. Niinpä on tavallista, että synteesivaiheessa muodostuu välituote, joka sisältää kunkin aminohappotähteen sijoittuneena haluttuun järjestyk-15 seen peptidiketjussa ja jossa on sivuketjun suojaryhmiä sopivissa tähteissä.

Keksinnön mukaisesti muodostetaan välituote, jolla on vähintään yksi suojaryhmä ja jolla on kaava (II): X1-R1(X tai X2)-Ala-Asp(X3)-Ala-Ile-Phe-Thr(X4)-R8(X4 tai X5)-20 Ser(X4)-Tyr(X2)-Arg(X6)-R12(X6 tai X7)-R13-Leu-Gly-Gln(X5)- R17-Rie(X2)-Ala-Arg(X6)-Lys(X7)-Leu-R23-R24(X tai X5)-R25(X3)-Ile-R27-R2a(X4 tai X5)-Arg(X6)-Gln(X5)-Gln(X5)-Gly-X8, tai C-päätteestä tarkoituksen mukaisesti lyhennetty muunnos siitä, jossa X1 on joko vety tai α-aminosuojaryhmä. a-Aminon . 25 suojaryhmät, joita X1 edustaa, ovat sellaisia, jotka tunnetaan alalla käytettävinä polypeptidin vaiheittain suoritettavassa synteesissä. Näitä α-amino-suojaryhmiä, joita voidaan käyttää ryhmänä X1, ovat (1) aromaattiset uretaani-tyyppiset suojaryhmät, kuten fluorenyylimetyylioksikarbo-30 nyyli (FMOC), bentsyylioksikarbonyyli (Z) ja substituoitu Z, kuten p-klooribentsyylioksikarbonyyli, p-nitrobentsyy-lioksikarbonyyli-, p-bromibentsyylioksikarbonyyli ja p-metoksibentsyylioksikarbonyyli; (2) alifaattisiet uretaani suojaryhmät, kuten t-butyylioksikarbonyyli (BOC), di-35 isopropyylimetyylioksikarbonyyli, isopropyylioksikarbo- 5 88402 nyyli, etoksikarbonyyli, allyylioksikarbonyyli; ja (3) sykloalkyyliuretaanityyppiset suojaryhmät, kuten syklo-pentyylioksikarbonyyli, adamantyylioksikarbonyyli ja syk-loheksyylioksikarbonyyli. Edullisin α-aminosuojaryhtnä on 5 BOC, myös kun asemassa 1 on NaMe-subsituoitu tähde.

X on vety tai suojaryhmä tähteen His imidatsolity-pelle, esimerkiksi Tos.

X2 voi olla suojaryhmä tähteen Tyr fenoliselle hyd-roksyyliryhmälle, kuten tetrahydropyranyyli, tert-butyyli, 10 trityyli, Bzl, CBZ, 4Br-CBZ ja 2,6-diklooribentsyyli (DCB).

Edullisin suojaryhmä on 2,6-diklooribentsyyli. X2 voi olla vety, joka tarkoittaa sitä, että tässä asemassa ei aminohappotähteessä ole sivuketjun suojaryhmää.

X3 on vety tai sopiva esterin muodostava suojaryhmä 15 tähteiden Asp tai Glu karboksyyliryhmälle, kuten bentsyyli (OBzl), 2,6-diklooribentsyyli, metyyli ja etyyli.

X4 voi olla sopiva suojaryhmä tähteiden Thr tai Ser hydroksyyliryhmälle, kuten asetyyli, bentsoyyli, tert-bu-tyyli, trityyli, tetrahydropyranyyli, Bzl, 2,6-dikloori-20 bentsyyli ja CBZ. Edullisin suojaryhmä on Bzl. X4 voi olla vety, Joka tarkoittaa, ettei hydroksyyliryhmässä ole suo-jaryhmää.

·*·.. X5 on vety tai sopiva suojaryhmä tähteiden Asn tai : .*. Gin sivuketjun amidoryhmälle. Se on edullisesti ksantyyli 25 (Xan).

X6 on sopiva suojaryhmä tähteen Arg guanidiiniryh-mälle, kuten nitro, Tos, CBZ, adamantyylioksikarbonyyli ja BOC, tai se on vety.

X7 on vety tai sopiva suojaryhmä tähteen Lys sivu-30 ketjun aminoryhmälle. Havainnollistavia esimerkkejä sivu- ketjun aminosuojaryhmille ovat 2-klooribentsyylioksikarbo-nyyli (2-C1-Z), Tos, t-amyylioksikarbonyyli ja BOC.

____: Met voi olla haluttaessa suojattu hapella, mutta on edullisesti suojaamaton.

6 88402

Sivuketjun aminosuojaryhmän valinta ei ole kriittinen, paitsi että yleensä valitaan sellainen, joka ei poistu a-aminoryhmien suojauksen poiston yhteydessä synteesin aikana. Kuitenkin joillakin aminohapoilla, esim. His, suo-5 jaus ei yleensä ole tarpeellinen sen jälkeen kun kytkentä on täydellinen, ja suojaryhmät voivat olla samoja.

X8 on -NH-hartsikantaja. Kun tällaista hartsiperus-taa käytetään, sitä laajasti katsoen pidetään suojaryhmänä ja se voi olla mikä tahansa alalla tunnettu, kuten: -NH-10 bentshydryyliamiini (BHA) hartsiperusta tai -NH-parametyy-libentshydryyliamiini (MBHA) hartsiperusta. Kun halutaan substituoimaton amidi, on edullista käyttää BHA- tai MBHA-hartsia, koska lohkaisulla saadaan suoraan amidi. Kun taas halutaan N-metyyliamidi, se voidaan muodostaa N-metyyli-15 BHA-hartsista. Jos halutaan muita substituoituja amideja tai halutaan muita ryhmiä kuin vapaa happo C-pääteasemaan, on edullista syntetisoida peptidi käyttäen klassisia menetelmiä, joita on esitetty edellä mainitussa Houben-Weil'in tekstissä.

20 Välituotteen kaavassa ainakin yksi X-ryhmistä on suojaryhmä tai X8 sisältää hartsiperustan. Keksinnön mukaisesti peptidi valmistetaan (a) muodostamalla kaavan (II) mukainen peptidivälituote, jossa on ainakin yksi suojaryhmä; (b) lohkaistaan suojaryhmä tai suojaryhmät tai kiin-- 25 nittävä sidos edellä mainitusta kaavan (li) mukaisesta peptidistä; (c) haluttaessa muutetaan saatu peptidi myrkyttömäksi suolaksi.

Valittaessa tiettyyn sivuketjuun suojaryhmä käytettäväksi peptidien synteesissä seurataan seuraavia yleisiä 30 sääntöjä; (a) suojaryhmä säilyttää edullisesti suojaavat ominaisuudet eikä pilkkoudu kytkentäolosuhteissa, (b) suo-jaryhmän tulee olla stabiili reagenssin suhteen ja, lukuun ottamatta ryhmää Xan, on edullisesti stabiili reaktio-olosuhteissa, jotka on valittu α-aminosuojaryhmän poistami-35 seksi kussakin synteesivaiheessa, ja (c) sivuketjun suoja- 7 88402 ryhmän tulee olla poistettavissa, sen jälkeen kun synteesissä on saatu haluttu aminohappojärjestys, reaktio-olosuhteissa, jotka eivät muuta epäedullisesti peptidiketjua.

Peptidejä valmistetaan edullisesti käyttäen kiin-5 teän faasin synteesiä, kuten Merrifield'in yleisesti kuvaamaa, J. Am. Chem. Soc., 85, s. 2149 (1963), vaikkakin muita vastaavia alalla tunnettuja kemiallisia synteesejä voidaan myös käyttää, kuten edellä on mainittu. Kiinteän faasin synteesi aloitetaan peptidin C-pääteasemasta kytke-10 mällä suojattu α-aminohappo sopivaan hartsiin. Tällainen lähtöaine voidaan valmistaa liittämällä α-aminosta suojattu aminohappo amidisidoksella BHA-hartsiin tai MBHA-hart-siin. BHA-ja MBHA-hartsiperustoja on kaupallisesti saatavissa, ja niitä käytetään yleensä vain, kun halutussa syn-15 tetisoitavassa polypeptidissä on substituoimaton amidi C-pääteasemassa.

C-terminaalinen aminohappo, esim. Asn, joka on suojattu ryhmillä BOC ja Xan, voidaan ensin kytkeä kloorime-tyloituun hartsiin noudattaen menetelmää, joka on esitetty 20 julkaisussa Chemistry Letters, K. Horiki et ai. 165-168 (1978), käyttäen KF:a DMF:ssa noin 60 eC:ssa 24 tuntia sekoittaen, kun halutaan valmistaa peptidiä. Kun BOC-suojattu aminohappo on kytketty hartsiperustaan, a-aminon : suojaryhmä poistetaan, käyttäen trifluorietikkahappoa :.-.25 (TFA) metyleeniklor idissä tai TFA:a yksin. Suojauksen poisto suoritetaan 0 °C:een ja huoneen lämpötilan välissä. Muita tavanomaisia poistoreagensseja, kuten HCl:a dioksaa-nissa, ja olosuhteita tiettyjen α-aminosuojaryhmien poistamiseksi voidaan käyttää, kuten ovat kuvanneet Schroder & ·: 30 Lubke, "The Peptides", 1 s. 72-75 (Academic Press 1965).

Kun α-aminosuojaryhmä on poistettu, jäljelle jää-.···. neet α-aminosta ja sivuketjusta suojatut aminohapot kyt- ____ ketään vuorotellen halutussa järjestyksessä, jolloin saadaan edellä määritelty välituote, tai vaihtoehtona kunkin ·.:.· 35 aminohapon lisäämiselle erikseen synteesiin, jotkut niistä 8 88402 voidaan kytkeä toisiinsa ennen lisäämistä kiinteän faasin reaktoriin. Sopivan kytkentäreagenssin valinta kuuluu alan ammattitaitoon. Erityisen sopiva kytkentäreagenssi on N,N'-disykloheksyylikarbodi-imidi (DCCI).

5 Peptidien kiinteän faasin synteesissä käytettävät aktivointireagenssit ovat peptidikemiassa hyvin tunnettuja. Esimerkkeinä sopivista aktivointireagensseista ovat karbodi-imidit, kuten N,N'-di-isopropyylikarbodi-imidi ja N-etyyli-N'-(3-dimetyyliaminopropyyli)karbodi-imidi.Muita 10 aktivointireagensseja ja niiden käyttöä peptidien kytkemisessä ovat kuvanneet Schroder & Lubke supra, osassa III ja Kapoor, J. Phar. Sei., 59, s. 1-27 (1970).

Kukin suojattu aminohappo tai aminohappoketjun pätkä tuodaan kiinteän faasin reaktoriin noin nelinkertaisena 15 tai suurempana ylimääränä, ja kytkentä voidaan suorittaa väliaineessa dimetyyliformamidi (DMF): CH2C12 (1:1) tai DMF tai CH2C12 sellaisenaan. Tapauksissa, joissa esiintyy epätäydellistä kytkeytymistä, kytkentä voidaan toistaa ennen α-aminon suojaryhmän poistamista ja seuraavan aminohapon 20 kytkemistä. Jos synteesi suoritetaan manuaalisesti, kunkin vaiheen kytkentäreaktion onnistumista seurataan edullisesti ninhydriinireaktiolla, kuten E. Kaiser et ai. ovat kuvanneet, Anal. Biochem. 34, 595 (1970). Kytkentäreaktiot voidaan suorittaa automaattisesti, esimerkiksi Beckman 990 25 automaattisella syntetisoijalla, käyttäen esimerkiksi ohjelmaa, jonka ovat kuvanneet Rivier et ai., Biopolymers, 1978, 17, s. 1927-1938.

Kun haluttu aminohappojärjestys on täydellinen, välituotepeptidi voidaan poistaa hartsiperustasta käsitte-: 30 lemällä reagenssilla, kuten nestemäisellä fluorivedyllä, joka ei ainoastaan vapauta peptidiä hartsista, vaan myös lohkaisee kaikki jäljellä olevat sivuketjujen suojaryhmät X, X2, X3, X4, X5, X6, ja X7 ja kiinnittävän sidoksen X8 ja myös α-aminosuojaryhmän X1, jos sellaista on käytetty, jol-35 loin saadaan peptidi vapaan hapon muodossa. Jos Met on 9 88402 läsnä ketjussa, BOC-suojaryhmä edullisesti poistetaan ensin käyttäen trifluorietikkahappoa (TFA)/etaaniditiolia ennen peptidin vapauttumista hartsista HF:lla mahdollisen S-alkylaation välttämiseksi. Kun käytetään fluorivetyä 5 lohkaisuun, anisolia ja metyylletyylisulfidia lisätään reaktioastiaan sltojiksi.

Seuraavassa esimerkissä esitetään edullinen menetelmä peptidien syntetisolmiseksi kiinteän faasin tekniikalla. On tietysti ymmärrettävää, että vastaavien lyhyem-10 pien peptidifragmenttien synteesi suoritetaan samalla tavalla vain jättämällä pois tarpeellinen määrä aminohappoja jommasta kummasta päästä ketjua; on kuitenkin havaittu, että biologisesti aktiivisissa fragmenteissa tulee olla esitetty järjestys N-pääteasemassa.

15 Viite-esimerkki

Peptidin [hFMeHis1] -rhGRF( 1-43)-OH, jolla on kaava N^IeHis-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-20 Phe-Asn-OH, synteesi suoritetaan vaiheittain käyttäen Beckman 990 peptidisyntetisoijaa ja kloorimetyloitua hartsia, jonka substituutioaste on noin 0,1 - 0,5 mmol/g hartsia. BOC-Asn(Xan):n kytkentä hartsiin suoritetaan yleisellä menetelmällä, joka on esitetty julkaisussa Chemistry 25 Letters, supra, käyttäen KF:a DMFrssa noin 60 °C:ssa 24 tunnissa sekoittaen, ja tuloksena on noin 0,35 mmoolin aminohappoa Asn korvautuminen grammassa hartsia.

Suojauksen poiston ja neutralisaation jälkeen pep-tidiketju rakennetaan vaiheittain hartsiin. Suojauksen 30 poisto, neutralisaation ja kunkin aminohapon lisäys suoritetaan menetelmällä, jonka on yksityiskohtaisesti esittänyt Rivier, J., J. Amer. Chem.Soc., 96, 2986-2992 (1974).

____ Kaikista käytettävistä liuottimista poistetaan kaasu huolellisesti johtamalla läpi inerttiä kaasua, esim. heliumia 35 tai typpeä, varmistamaan, ettei läsnä ole happea, joka voisi ei-toivotusti hapettaa rikin Met-tähteessä.

10 88402

Suojauksen poisto suoritetaan edullisesti seuraavan luettelon A mukaan seuraavasti:

Luettelo A

Reagenssi Sekoltusaika (min,) 5 1. 60 % TFA/2 % etaaniditioli 10 2. 60% TFA/2% etaaniditioli 15 3. IPA/1 % etaaniditioli 0,5 4. Et3N (10 %) CH2Cl2:ssa 0,5 5. MeOH 0,5 10 6. Et3N (10 %) CH2Cl2:ssa 0,5 7. MeOH (kahdesti) 0,5 8. CH2C12 (kahdesti) 0,5

Kytkennät suoritetaan edullisesti seuraavan luettelon B mukaisesti:

15 Luettelo B

Reagenssi Sekoitusaika (min.)

9. DCCI

10. Boc-aminohappo 50-90 11. MeOH (kahdesti) 0,5 20 12. CH2C12 (kahdesti) 0,5 13. Ac20 (3M) CH2Cl2:ssa 15,0 14. CH2C12 0,5 15. MeOH 0,5 16. CH2C12 (kahdesti) 0,5 . 25 Lyhyesti, 1-2 mmoolia BOC-suojattua aminohappoa metyleenikloridissa käytetään grammaa hartsia kohti, lisäksi yksi ekvivalentti 1,0 molaarlsta DCCI metyleenikloridissa kahden tunnin ajan. Kun BOC-Arg(TOS) kytketään, käytetään seosta, jossa on 50 % DMF:a ja metyleeniklori-30 dia. Bzl-eetteriä käytetään aminohappojen Ser ja Thr sivu-ketjun hydroksyyliryhmän suojaamiseen. Asn:n tai Gin: n amidoryhmä suojataan Xan:lla, kun käytetään DCC-kytkentää, kuten on edullista. p-Nitrofenyyliesteriä(ONp) voidaan myös käyttää aktivoimaan Asn:n ja Gin:n karboksyylipää, ja 35 esimerkiksi BOC-Asn(ONp) voidaan kytkeä yön yli käyttäen 11 88402 yhtä ekvivalenttia HOBt:a seoksessa, joka sisälsi 50 % DMF:a ja metyleenikloridia, jolloin mitään DCC:a ei lisätä. 2-Klooribentsyylioksikarbonyyliä (2C1-Z) käytetään suojaamaan Lys-sivuketju. Tos:a käytetään suojaamaan Arg:n 5 guanidinoryhmää ja His:n imidatsolityppeä, ja Glu- tai Asp-sivuketjun karboksyyliryhmä suojataan OBzl:lla. Tyr:n fenolinen hydroksyyliryhmä suojataan 2,6-diklooribentsyy-lillä (DCB). Synteesin lopuksi saadaan seuraava rakenne: BOC-N°MeHis (X) -Ala-Asp( X3) -Ala-Ile-Phe-Thr (X4) -Ser (X4) -Ser-10 (X4) -Tyr ( X2) -Arg( X6) -Arg( X6) -Ile-Leu-Gly-Gln( X5) -Leu-Tyr (X2) -

Ala-Arg( X6) -Lys( X7) -Leu-Leu-His( X )-Glu( X3) -Ile-Met-Asn( Xs) -Arg(X6) -Gln( X5) -Gln( X5 )-Gly-Glu( X3 )-Arg( X6) -Asn( X5) -Gln( X5) -Glu( X3) -Gln( X5) -Arg( X6) -Ser (X4) -Arg( X6) -Phe-Asn( X5) -X9, j ossa X on Tos, X2 on DCB, X3 on OBzl, X4 on Bzl, X5 on Xan, X6 on 15 Tos, X7 on 2C1-Z ja X9 on -0-CH2-hartsiperusta. Xan voidaan kokonaan tai osittain poistaa TFA-käsittelyllä, jota käytetään poistamaan α-aminon suojaryhmä.

Kun halutaan vapauttaa ja poistaa suojaus peptidi-hartsista, sitä käsitellään 1,5 ml:11a anisolia, 0,5 ml-20 :11a metyylietyylisulfidia ja 15 ml:lla fluorivetyä(HF) peptidihartsin grammaa kohden, -20 °C:ssa puolen tunnin ajan ja 0 °C:ssa puolen tunnin ajan. Kun HF on poistettu voimakkaassa vakuumissa, jäljelle jäänyttä hartsi-peptidiä pestään vuorotellen kuivalla dietyylieetterillä ja kloro-25 formilla, ja sitten peptidi uutetaan kaasutetulla 2N vesipitoisella etikkahapolla ja erotetaan hartsista suodattamalla.

Vapautettu ja suojauksesta poistettu peptidi liuo-. . tetaan sitten 0 - 5 % etikkahappoon ja puhdistetaan suo- 30 dattamalla Sephadex® G-50-geelin läpi.

Sitten peptidiä puhdistetaan edelleen preparatiivi-sella tai semipreparatiivisella HPLC:lla, kuten ovat esittäneet Rivier et ai. Peptides: Structure and Biological \ Function, (1979), s. 125-8 ja Marki et ai. J. Am. Chem.

;·· 35 Soc. 103, 3178 (1981). Patruunat, jotka sopivat Waters 12 88402

Associates prep LC-500:aan, pakataan 15 - 20 μ Cie-silikal-la, Vydac'ilta (300 A). Gradientti, jossa on CH3CN:a TEAP-:ssa, kehitetään alhaisen paineen Eldex-gradientinkehittä-jässä, kuten on kuvattu julkaisussa Rivier, J., j. Liq.

5 Chromatography 1, 343-367 (1978). Kromatografisia fraktioita seurataan huolellisesti HPLC:lla, ja vain ehdottoman puhtaat fraktiot otetaan talteen. Puhdistettujen fraktioiden, joiden puhtaus on tarkistettu yksitellen, suolanpois-to saadaan aikaan käyttäen gradienttia, jossa on CH3CN:a 10 0,1 % TFA:ssa. Keskijakeet lyofilisoidaan, jolloin saadaan haluttua peptidiä, jonka puhtaus voi olla suurempi kuin 98 %.

Synteesi toistetaan käyttäen MBHA-hartsia tuottamaan samaa peptidiä, jossa on amidoitu C-pääteasema, mene· 15 telmällä, jonka ovat yleisesti kuvanneet Vale et ai., US-patentti 4 292 313, liittämään Asn MBHA-hartsiin.

Esimerkki I

hpGRF-analogifragmentin, eli [C°MePhe( 4C1 )1] -hpGRF-(1-32)-NH2:n, jolla on kaava: H-CaMePhe(4Cl)-Ala-Asp-Ala-20 Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-

Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2, synteesi suoritettiin vaiheittain käyttäen Beckman 990 peptidisyntetisoijaa MBHA-hartsilla kuten viite-esimerkissä. Tämän analogin todettiin olevan käytännöllisesti : 25 katsoen puhdasta TLC:llä ja HPLC:llä. Optinen kierto määritettiin: [a]p° = -60,90,

Synteesi toistettiin, jolloin saatiin [4C1-Phe1]-hpGRF( 1-32 )-NH2 ja [N°MePhel]-hpGRF( 1-32 )-NH2, jonka optinen kierto oli [a,,] = -61,1°.

- 30 Esimerkki II

[D-Leu23, Nle27]-rGRF(l-29)-NH2:n, jolla on kaava: H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-D-Leu-His-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-NH2, synteesi suoritettiin vaiheittain käyttäen Beckman 35 990 peptidisyntetisoijaa MBHA-hartsilla kuten viite-esi merkissä.

13 88402

Peptidin todetaan olevan käytännöllisesi katsoen puhdasta TLC:n ja HPLC:n avulla. Optinen kierto määritettiin [a]1° = -53,3° .

Synteesi toistettiin, jolloin saatiin [D-Leu17, 5 Nle27]-rGRF( 1-29 )-NH2:a. Optinen kierto määritettiin [a]20 - -51,2°.

Esimerkki III

[D-Glu25, Nle27]-rGRF( 1-29 )-NH2:n, jolla on kaava: H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-10 Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-D-Glu-Ile-Nle-Asn-

Arg-NH2, synteesi suoritettiin vaiheittain käyttäen Beckman 990 peptidisyntetlsoijaa MBHA-hartsilla kuten viite-esimerkissä.

Peptidin todettiin olevan käytännöllisesti katsoen 15 puhdasta TLC:n ja HPLC:n avulla. Optinen kierto määritettiin: [a]20 - -50,6°.

Erilaisia esimerkeissä valmistettuja synteettisiä peptidejä verrattiin synteettiseen hpGRF(1-40)-OH:iin in vitro-kokeissa, ja kaikilla havaittiin olevan suurempi 20 teho GH:n eritykseen ja samanlaiset sisäiset vaikutukset.

Jotta saatiin määritetyksi useiden synteettisten peptidien tehokksuus edistää kasvuhormonin vapautumista, suoritettiin in vitro-kokeita käyttäen synteettistä hpGRF-(l-40)-OH:a standardina vierekkäin vertailussa muiden syn-25 tetisoitujen analogien ja fragmenttien ekvimolaaristen konsentraatioiden kanssa. Käytettiin viljelmiä, jotka si-sälsivät rotan aivolisäkkeen soluja, jotka oli siirretty noin 3-5 päivää aiemmin. Viljelmiä, jotka olivat opti-. . maalisia kasvuhormonin eritykseen, käytettiin vertailutes- • 30 teihin, joita yleisesti ovat kuvanneet Vale et ai., Endo- ' crinology, 91, 562-572 (1972) ja yksityiskohtaisemmin Vale et ai., Endocrinology (1983), painossa. Inkubointia testattavan yhdisteen kanssa suoritetaan 3-4 tuntia ja vil-jelyalustan neste poistettiin ja sitä käsiteltiin immuno-35 reaktiivisen GH(ir GH)-pitoisuuden määrittämiseksi hyvin karakterisoivalla radioimmunotestillä.

14 88 402 Tämän vertailutestin tulokset ekvivalenttisille pitoisuuksille on esitetty taulukossa I.

Taulukko I

Peptidi Vertallu-% 5 hpGRF(1-40)-OH (testin standardi) 100 % [D-G1u2S, Nle27] -rGRF( 1-29 ) -NH2 125 % [D-Leu23, Nle27]-rGRF( 1-29 )-NH2 160 % [D-Leu17, Nle27]-rGRF( 1-29 )-NH2 138 % [N°MePhel] -hpGRF( 1-32 )-NH2 12 % 10 [CaMePhe1(4C1)]-hpGRF( 1-32)-NH2 4,7 % [4C1-Phe1] -hpGRF( 1-32 )-NH2 2 % Näiden synteettisten peptidien in vitro-testaus osoittaa, että niillä kaikilla on hpGRF(l-40)-OH:n täydellinen luontainen biologinen aktiivisuus. Tehokas maksimi-15 konsentraatio [D-Leu23, Nle27]-hpGRF( 1-29 )NH2:lie on noin 1 nanomolaarisuus.

Kasvuhormonin erityksestä tehtyjen in vitro-test ien lisäksi suoritettiin in vivo-kokeita injektoimalla synteettisiä peptidejä kiinteän katetrin kautta vapaasti liik-20 kuviin normaaleihin urosrottiin sen jälkeen, kun niitä oli käsitelty FLA-63:lla, dopamiinihydroksylaasin inhibiittorilla, joka tukahduttaa spontaanin GH:n eritykseen vaikuttamatta eksogeenisen GRF:n vasteeseen. Verinäytteitä otettiin saman katetrin kautta välittömästi ennen injektiota .25 ja 5 ja 20 minuuttia injektion jälkeen. GH-pitoisuudet veressä, mitattuna radioimmunotestillä, osoittavat, että synteettiset [D-Leu23, Nle27]-rGRF( 1-29)-NH2, muut rGRF:n D-Leu17- ja D-Glu25-analogit ja yllä identifioidut hpGRF(l-32)-NH2:n lOle- ja C°Me-analogit ovat voimakkaita stimulaat-: 30 toreita aivolisäkkeen GH:n eritykselle ja että niillä on oleellisesti pidempi vaikutus kuin rGRF(1-29)-NH2:11a ja hpGRF( 1-32)-NH2:11a, vastaavasti. Muita tunnettuja GRF-ana-logeja in vivo-testeissä, joiden tiedetään olevan tehokkaita selvittämään GH:n eritys, käytetään varmistamaan 35 näitä tuloksia. Annoksi, jotka vaihtelevat välillä noin « 88402 100 nanogrammaa ja 50 mikrogrammaa peptidiä ruumiin painokiloa kohti, pidetään tehokkaina aikaansaamaan GH:n eritystä.

Tällaiset synteettiset hpGRF-analogit ovat tehok-5 kaita annettaessa ihmisille, milloin lääkäri haluaa nostaa GH:n eritystä. GH:n erityksen stimulointi tällaisilla analogeilla on mielenkiintoista potilailla, joilla on täydellistä tai osittaista GH:n puutosta, jonka aiheuttaa endogeenisen GRF:n vajaatuotanto. Edelleen on mahdollista, 10 että lisääntynyttä GH:n eritystä ja siitä johtuvaa kasvun lisääntymistä voidaan saada aikaan ihmisillä tai eläimillä, joilla on normaalit GH-pitoisuudet. Lisäksi annostelu voi muuttaa ruumiin rasvarakennetta ja modifioida muita GH-riippuvaisia metabolisia, immunologisia ja kehitykseen 15 liittyviä prosesseja. Esimerkiksi nämä analogit voivat olla hyödyllisiä haluttaessa stimuloida anabolisia prosesseja ihmisellä, joka on joutunut sellaisiin olosuhteisiin kuten esimerkiksi alttiiksi palovammoille. Toisena esimerkkinä, näitä voidaan antaa lämminverisille hyöty-20 eläimille, kuten kananpojille, kalkkunoille, sioille, vuohille, nautaeläimille ja lampaille, ja niitä voidaan käyttää vesitaloudessa nostamaan kalojen ja muiden kylmäveristen merieläinten, esim. merikilpikonnlen, ankeriaiden ja sammakoiden, kasvua, ja nostamaan proteiinien suhdetta 25 rasvaan, ja nämä saavutetaan syöttämällä tehokkaita määriä peptidejä.

Annettaessa ihmisille täytyy näiden synteettisten peptidien puhtauden olla ainakin 93 % ja edullisesti ainakin 98 %. Puhtaudella tässä tarkoitetaan halutun peptidi--30 koostumuksen määrää paino-% kaikista läsnä olevista peptideistä ja peptidifragmenteista. Annettaessa tällaisia synteettisiä peptidejä hyöty- ja muille eläimille tarkoituksena lisätä kasvua ja vähentää rasvapitoisuutta, niin alhainen puhtaus kuin 5 %, tai jopa 0,01 %, voi olla hy-35 väksyttävä.

« 88402 Näitä synteettisiä peptidejä tai niiden myrkyttömiä suoloja, yhdessä farmaseuttisesti tai eläinlääketieteessä hyväksyttävän kantajan kanssa, farmaseuttisen valmisteen muodostamiseksi, voidaan antaa eläimille, ihmiset mukaan 5 lukien, joko suonensisäisesti, ihonalaisesti, lihaksensisäisesti, ihonpäällisesti, esim. nenään, tai jopa oraalisesti. Annostelun määrää lääkäri stimuloimaan GH:n vapautumista, milloin hoidettava potilas tällaista terapeuttista käsittelyä kalpaa. Tarvittava annos vaihtelee hoidetta-10 van tilan, tilan vakavuuden ja halutun käsittelyn keston mukaan.

Tällaisia peptidejä annetaan usein myrkyttömien suolojen muodossa, kuten happoadditiosuoloina tai metalli-komplekseina, esim. sinkin, raudan tai vastaavan kanssa 15 (joita pidetään tämän hakemuksen tarkoituksessa suoloina). Esimerkkejä tällaisista suoloista ovat hydrokloridi, hyd-robromidi, sulfaatti, fosfaatti, maleaatti, asetaatti, sitraatti, bentsoaatti, sukkinaatti, malaatti, askorbaat-ti, tartraatti ja vastaavat. Jos aktiivinen aine on tar-20 koitus antaa oraalisesti tabletin muodossa, tabletti voi sisältää sitojan, kuten tragakanttia, maissitärkkelystä tai gelatiinia; dispergointiainetta kuten algiinihappoa; liukasteainetta, kuten magnesiumstearaattia. Jos halutaan annostella nestemäisessä muodossa, voidaan käyttää makeu-25 tus- ja/tai makuaineita, ja suonensisäinen annostelu voidaan tehdä isotonisessa suola-, fosfaattipuskuri- tai vastaavassa liuoksessa.

Peptidejä voidaan antaa ihmisille lääkärin valvonnassa, ja farmaseuttiset valmisteet sisältävät yleensä 30 peptidiä yhdessä tavanomaisen, kiinteä tai nestemäisen farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan kanssa. Tavallisesti parenteraalinen annos vaihtelee välillä noin 100 nanogrammaa - noin 50 mikrogrammaa peptidiä potilaan ruumiin painokiloa kohti.

17 88402

Vaikkakin keksintö on kuvattu sen edullisten suoritusmuotojen avulla sisältäen keksijöiden tällä hetkellä parhaan tunteman tavan, on ymmärrettävää, että erilaisia muutoksia ja modifikaatioita, jotka ovat ilmeisiä alan 5 ammattimiehille, voidaan tehdä poikkeamatta keksinnön piiristä, joka esitetään jäljempänä tulevissa vaatimuksissa. Esimerkiksi modifikaatioita peptidiketjussa, erityisesti jättämällä pois peptidin karboksyylipään alkua, voidaan tehdä nyt tunnetun käytännön tietämyksen mukaisesti sel-10 laisten peptidien tai peptidifragmenttien, joissa on säilynyt oleelliset osat peptidin biologisesta tehosta valmistamiseksi, ja tällaisten peptidien katsotaan kuuluvan keksinnön piiriin. Sen lisäksi voidaan tehdä lisäyksiä jompaan kumpaan päähän tai molempiin, ja/tai yleensä ekvi-15 valenttisia tähteitä voidaan substituoida luonnossa esiintyvillä tähteillä, kuten on tunnettua kaikkialla peptidi-kemiassa, jotta saadaan tuotettua muita analogeja, joilla on ainakin oleellinen osa esitetyn polypeptidin tehosta, poikkeamatta keksinnön hengestä.

Claims (4)

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten peptidien valmistamiseksi, joilla on sekvenssi:

5 R1-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-R8-Ser-Tyr-Arg-R12-R13-Leu-Gly-Gln-R17-R18-Ala-Arg-Lys-Leu-R23-R24-R25-Ile-R27-R28-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2, jossa Rx on N°MePhe, CaMePhe(4C1), pCl-Phe tai His; R8 on Ser tai Asn; R12 on Arg tai Lys; R13 on Ile tai Vai; R17 on Leu tai D-Leu; R1S on Tyr tai Ser; R23 on Leu tai D-10 Leu; R24 on His tai Gin; R25 on Glu, Asp tai D-Glu; R27 on Met tai Nle; R28 on Asn tai Ser; edellyttäen kuitenkin, että joko (a) R^ssä on substituutio CaMe tai N°Me tai (b) R17 ja/tai R23 on D-Leu tai (c) R25 on D-Glu; edellyttäen myöskin, että korkeintaan kolme C-päätteen tähdettä saat-15 taa puuttua, tunnettu siitä, että a) muodostetaan välituote, jolla on vähintään yksi suojaryhmä ja jolla on kaava (II): Xl-Rx(X tai X2)-Ala-Asp(X3)- Ala-Ile-Phe-Thr(X4)-Re(X4 tai X5)-Ser(X4)- Tyr(X2) -Arg(X6)-R12(X6 tai X7)-R13-Leu-Gly-Gln(X5)-20 R17-R18(X2)-Ala-Arg(X6)-Lys(X7)-Leu-R23-R24(X tai X5)-R25(X3)- Ile-R27-R28(X4 tai X5)-Arg(X6)-Gln(X5)-Gln( X5)-Gly-X8, tai C-päätteestä tarkoituksen mukaisesti lyhennetty muunnos siitä, jossa kaavassa X on vety tai suojaryhmä tähteen His imidatsolin typelle; X1 on vety tai α-aminon suojaryhmä; .25 X2 on vety tai suojaryhmä tähteen Tyr fenoliselle hydrok-syyliryhmälle; X3 on vety tai suojaryhmä tähteen Asp tai Glu karboksyyliryhmälle; X4 on vety tai suojaryhmä tähteen Thr tai Ser alkoholiselle hydroksyyliryhmälle; X5 on vety tai suojaryhmä tähteen Asn tai Gin sivuketjun amidoryhmäl-: 30 le; X6 on vety tai suojaryhmä tähteen Arg guanidoryhmälle; X7 on vety tai suojaryhmä tähteen Lys sivuketjun aminoryh-mälle ja X8 on -NH-hartsikantaja, kytkemällä suojatut aminohapot järjestyksessä suhteessa noin yksi millimooli suojattua aminohappoa yhtä grammaa sopivassa liuottimessa . 35 edullisesti metyleenikloridissa tai dimetyyliformamidissa 19 88402 tai niiden seoksessa olevaa hartsia kohti ja b) suojaryhmät poistetaan ja peptidi irrotetaan hartsikantajasta käyttämällä sopivassa liuottimessa edullisesti CH2Cl2:ssa olevaa TFA:ta, minkä jälkeen käytetään 5 HF:ä alhaisessa lämpötilassa ja sitten peptidi liuotetaan sopivaan liuottimeen ja puhdistetaan tunnetuilla menetelmillä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R23 on D-Leu ja R27 on Nle.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Rl7 on D-Leu ja R27 on Nle.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Ris on D-Glu ja R27 on Nle. 20 3 8 402