CZ3004U1 - Peptidy a farmaceutické prostředky s jejich obsahem - Google Patents

Description

uvolňující růstový hormon (rGRF) a odpovídající faktor <v.

cr,

- z Ví (pGRF )

Nyní byly syntetizovány nové polypeptidy, které uvolňují růstový hormon z buněk hypofýzy, pěstovaných v tkáňové kultuře, tyto peptidy alespoň částečně odolávají rozkladu enzymu v živočišném organismu. Uvedené peptidy splňují alespoň jeden z následujících požadavků:

o s. l· f s

a) zbytek v poloze 1 je substituován bud způsobem N Me , _alfa,. nebo C Me,

b) D-Leu je v poloze 17 a/nebo v poloze 23 a/nebo

c) D-Glu nebo D-Asp se nachází v poloze 25.

Peptidy mohou splňovat větší počst těchto požadavků, musí však splňovat alespoň jeden z nich. Zbytkem v poloze 1 může být Tyr, D-Tvr, Met, Phe, D-?he, pCl-Phe, Leu. His s D-His (tento zbytek může nést msthvlovou skucinu buď ooů:

by obvykle obsahují O-ALa vo:lozs 2 s/nsbc C-Aso v a/nebo D-Aro nebo D-S=r v poloze 3 a/nebo ϋ-Tyr v poloze a /'nebo D-Ala v poloze 15. Peptidy s výhodou jsou su:

ny s kuconar

D-Mst. Nis nebo iivs míst

V O'

ΩΚ

Farmaceutické prostředky mohou obsahovat berné dále uvedeným způsobem,3 délce 23 sž 44 zbytků aminokyselin, nebo netoxické soli těchto zbytků ve formě disperze v kapalině, přijatelná z farmaceutického nebo veterin hlediska nebo v pevném nosiči. Takto získaný prostředek je možno použít v klinickém lékařství, a to v lidském a veterinárním lékařství k léčebným účelům a také k účelům d i a ono s t i o kým. Sloučeniny je možno užít k urychlení růstu teplokre;oh živočichů včetně drůoeže a v zemědělství i k urychlení růstu studenokrevných živočichů, například ryb a pod.

Nomenklatura pro nové peptidy byla užita podle publikace Schroder a Lubke The Psptides, Academie Press (1965), tak, že v souladu s běžným názvoslovím se aminoskupina na N-terminálním zakončení nachází na levé straně a karboxylová skupina na C-terminálním zakončení se nachází na pravé -straně.

U přírodních aminokyselin se rozumí těmito kyselinami přirozeně se vyskytující látky, které se nacházejí v bílkovinách, a to Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp , Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp a His. Nle znamená norleucin a Nva znamená norvalin. V případě, že zbytek aminokyseliny má isomern.í formy, rozumí se vždy L-forma, není-li výslovněuvedenojinak.

	techn	lekán	r* <a o *.
	Předmětem ře	C ÍA **» t	jsou	peptidy obecného	vzorce I
σ _ ο ’Ί	-P - A s2 3	Ile-	2 a _ T	_ 3 _ C	~ - “ - ’ ' ~ ~ ' η -Ί ~ '	, , - r e . - - -
-Gin	17 13	,-A _ ~ ~	™ ’		C -2 -3 7 ' o _ 2 3 ''2- 25---	2 - - A 2 Γ 2 z
-Gin	-Gln-Gly-	Glu-	0 ;,3^	Asn-Gin	„,3 ,.i3	_ ~ 2
				' 7 X) . \ ·*· /
kde
R1	znamená His nebo NalfaMe	Tyr, 0-K nebo	D-Ty is, p bez	r, Met, Pne. O-Phe, pCl q 1 T n substituci typu C substituce,	-Pne, Leu 3Me nebo
r2	znamená	Ala	nebo	D-AIa, -
S3	znamená	Asp	nebo	□-Asp,
R3	znamená	Ser.	Asn,	D-Seo,	Π2 30 U A 5 Π .
riq	z n a ~ s n á	Tyo	nebo	G-Tyr,
R12	z n a m e n a	Are	nebo	1 ' AP
R13	Z ΓΊ Ξ ffi S Π 2	Ile	nebo	Val,
R15	znamená	Gly	nebo	D-Ala,
R17	znamená	Leu	nebo	D-Leu,
R13	znamená	Tyr	nebo	c~ - - J
R23	znamená	Leu	η e o o	D-Leu,
R24	znamená	His	nebo	Gin,
R25	znamená	Glu,	As ρ,	, O-Glu	nebo D-Asp,
R27	znamená	M 2 ΐ	. D-Met, Ala.	, tile, lis, Leu,	Hvs nebo
R23	znamená	Asn	nebo	Sec,
r34	znamená	Arg	nebo	Ser,
R38	znamená	Gin	nebo	Arg,

R39	znamená	Arg	nebo	Glv,
R40	znamená	Ser	nebo	Ala,
P72	znamená	Phe	, Ala	nebo Val
R , ,	znamená	Aen	nebo	\ -v ~
43
□ '1 A A	zmarněna	Val	nebo	L e j ;
~r τ
za p	recpokladu,	že b'j	£

S ) n fil £ SLlbSuitUCi u V p U C !-'s nebo

b) R,a./nsbo R_o, znamená D-Leu nebo ‘17 '23

R₂_ znamená D-Glu nebo D.-Asp, přičemž navíc je možno vynechat některý ze zbytků

V ^R49~^Rí

Arn-S - D _ O ³ ‘72 73 ''44’ ^R40“^Ar9_R42‘^R43^r'4í ’ ^R39^-R40^-Ar9_R42^-R43^_R44’ ^R38“^R39~^R40~^Ar9'^R42~^R43^{R Glu_R}38^R39^R40^Ar9'^R42“^R43^R4i’

Gln-Glu-R-jg-R^-R^-Arg-R^-R^-R^,

Asn-Gln-Glu-R-jg-R^-R^-Arg-R^-R^-R^, ^R34^_Asn_9^^n_9^^L!-R3g^_R39^-R70^-Ar3”^R42^R43'^R4A^{! G}^^U-R34~^A3n’'^G^^n-G^^u”^R33^R39~^R40^-Al'⁹”^R42^R43^-R44’

43~'7A

GLn-.Gly-Glu-R₅₄-A5n^Gln-Glu-R₅₃-R_jg-R₄₀-Arg-R_4?-R₄₃-R_4i,,

Gly-Glu-R₃₄-Asn-Gln-Glu-R_3g-R_;J9-R₄₀-Arg-R₄₇-R_Zl^-R_Zti,

Gin-Gin Gly-Gl'J-R,₄-45n-Gln-Glu-R_7Q-R D αγπ-° r

A4 33 39 ^K4o-Arg-‘'₄₂-K₄-₅5 £ τ' q r* τ'.

i e o o d r

Nové peptidy lze získat na pevné fázi, částečně na pevné fázi, kondenzací fragmentů nebo klasickým způsobem v roztoku. Je také možno užít techniky, užívající rekombinantní DNA k přípravě části analogu, který obsahuje pouze zbytky aminokyselin. Například technika pevné fáze ně popsána v publikaci Solid-Phase Peptide Synthesis, Stewart a Young, Freeman a Co., San Francisco, 1969, příkladem těchto způsobů mohou být postupy, které jsou popsány v US patentovém spisu č. 4’ 105 603 z 8. srpna 1978 (Vale a další) Klasická syntéza v roztoku je podrobně popsána v publikaci Methoden der Organischen Chemie (Nouben~Weyl): Synthese von Peptiden, E. Wunsch (vydavatel), 1974, Feorg Thieme vydavatelství, Stuttgart, NSR. Příkladem tohoto postupu může být způsob, popsaný v US patentovém spisu č. 3 972 859 z 3. srpn 1976, další způsoby tohoto 'typu jsou popsány také v US paten tovém spisu č. 3 842 067 z 15. října 1974 a č. 3 862 925 z 23. ledna 1975.

Společným znakem všech těchto způsobů je ochrana stabilních skupin na postranním řetězci různých zbytků aminokyselin vhodnými ochrannými skupinami, které brání chemické reakci v uvedeném místě až do odstranění příslušné ochranné skupiny. Je také běžné, že se v určitém stupni postupu získá meziprodukt, který obsahuje zbytky aminokyselin, umístěné v požadovaném sledu peptidového řetězce, avšak obsahuje ještě ochranné skupiny, vázané na příslušné zbytky.

Meziprodukt tohoto typu je možno vyjádřit obecným vzorcem:

X -4 (X nebo Xj-f^-R-jíX )-Ala-Ile-Phe-Thr(R⁴)-Rg(X⁴ nebo X⁵)-Ser(X⁴)-R1Q(X²)-Arg(X⁶)-R12(X⁶ nebo X⁷)-R13-Leu-R₁₅-Gln(X⁵)-R17-R18(X²)-Ala-Arg(X⁶)-Lys(X⁷)-Leu-R23-R_7/i(X nebo X⁵)-R25(X³)-Ile-R2--R_2g(x⁴ nebo X⁵)-Arg(X⁶)-Gln(X⁵)-Gln(X⁵)-Glv-Glu(X³)-R34(x⁴ nebo X^é)-Asn(X⁵)- Gin ( X⁵)-G1u(X³ )-R-g(X⁵ nebo X^é)-R}9(X⁶)-RΛQ(X⁴)-Arg(X^á )nebo X^-R^-UH-pryskyřice, χΐ znamená atom vodíku nebo ochrannou skupinu na alfaamincskupině. Běží o ochranné skupiny, které se běžně užívají při postupné syntéze polypeptidů. Ochranné skupiny ve významu je možno zařadit do několika skupin, a to

1) aromatické ochranné skupiny typu urethar.u, například fluorenylmethyloxykarbony1 (FMOC), benzyloxykarbcny 1 (2) a substituované Z, například p-chlorbenzyloxykarbonyl, p-nitrobenzyloxykarbony1, p-brombenzylcxykarbcnyl a p-methoxybenzyloxykanbonyl,

2) ochranné skupiny typu alifatického ureťnanu, například terč .butyloxykarbonyl (BOC), diisopropyimethy1oxykarbonyl, isopropyloxykarbcny1, ethoxykarbony 1, allyloxykarbonyl a

3) ochranné skupiny typu cykloalkyluretha.ru, například cyklopentyloxykarbonyl, adamantyloxykarbcny1 a cyklohexyloxykarbonyl.

Výhodnou ochrannou skupinou na a to i v případě, že v poloze 1 tuovaného zbytku.

alfa-aminoskupině je BOC se užije N‘ ile-substi znamená atom vodíku nebo ochrannou skupí levý dusíkový atom aminoskupiny His, nap íkla··

X je ochranná skupina pro fenolovou hydroxylovcu skupinu

Tyr, například tetrahydropyranyl, terc.butyl, trítyl, Bzl, CBZ, 4br~C3Z a 2,6-dichlorbenzyl (DC3). Výhodnou ochrannou skupinou je 2,6-dichlorbenzyl, X_? může také znamenat atom vodíku, což znamená, že se na zbytku aminokyseliny v této poloze nenachází žádná ochranná skupina.

*

X znamená atom vodíku nebo vhodnou ochranný skupinu, vytvářející ester s karboxylovou skupinou Asp nebo Glu, například benzyl(OSzl), 2,6-dichlorbenzyl, methyl a ethyl.

z

X ' je vhodná ochranná skupina pro hydroxylovcu sxupiuu

Thr nebo Ser, například acetyl, benzoyl, terc.butyl, trityl, tetrahydropyranyl, Bzl,' 2,6-dichlorbenzyl a 4

CBZ. Výhodnou ochrannou skupinou je Szl. X muže znamenat také atom vodíku, v tomto případě se na hydroxylové skupině nenachází žádná ochranná skupina.

X⁵ znamená atom vodíku nebo vhodnou ochrannou skupinu na postranním řetězci amidoskupiny Asn nebo Gin. S výhodou běží o xanthyl (Xan).

znamená vhodnou ochrannou skupinu pro guanidinovou skupinu Arg, například nitroskupínu, skupinu Tos, CBZ, adamantyloxykarbonyl a BOC, nebo znamená atom vodíku.

X znamená vodík nebo vhoonou ochrannou skupinu pro aminoskupinu Lys. Vhodnou aminoskupinu chránící ochrannou skupinou je například 2-chlorbenzyloxykarbonyl(2-C1-Z), Tos, t.amyloxykarbonyl a BOC.

Met může být popřípadě chráněn atomem kyslíku, s výhodou však chráněn není.

Volba ochranných skupin pro postranní řetězec není kritická, až na to, že je zapotřebí volit takovou skupinu, která není odstraněna v průběhu odstraňování ochranné skupiny na alfa-aminoskupině při syntéze. Pro některé aminokyseliny, například His, není zapotřebí obvykle užít po ukončeném navázání ochrannou skupinu nebo může jít o tutéž ochrannou skupinu.

Při volbě určité ochranné skupiny na postranním řetězci při syntéze peptidů je zapotřebí zachovávat následující všeobecná pravidla:

a) ochranná skupina si má uchovávat své ochranné vlastnosti a nemá být odštěpena při vazbě dalšího zbytku,

b) ochranná skupina má být stálá k užitým reakčním činidlům a s výjimkou Xan stálá za reakčních podmínek, zvolených pro odstranění ochranné skupiny na alfa-aminoskupině v každém stupni postupu a

c) postranní ochranné skupiny musí být možno odstranit po ukončení postupu za získání výsledného peptidu s obsahem požadovaného sledu aminokyselin tak, že v průběhu odstraňování nedojde k nežádoucím změnám v peptidovém řetězci.

V případě, že se peptidy nepřipravují technologií s použitím rekombinantní DNA, připravují se s výhodou při použití syntézy na pevné fázi, například způsobem podle publikace Merrifield, J. Am. Chem. Soc. , 85, str. 2145, 1963 přestože je možno užít také dalších ekvivalentních chemických způsobů, tak’jak byly svrchu uvedeny.

Syntéza na pevné fázi se začíná od C-terminálního zakončení peptidu tak, -že se naváže chráněná alfa-aminckyselina na vhodnou pryskyřici. Tento výchozí materiál je možno připravit tak, že se spojí chráněná alfa-aminokyselina esterovou vazbou s chlormeťnylovanou pryskyřicí nebo hydroxymethylovanou pryskyřicí nebo amidovou vazbou na pryskyřici BHA nebo na pryskyřici MBHA. Výroba hydroxymethylované pryskyřice je popsána v publikaci- Bodansky a další, Chem. Ind., (Londýn), 38, 1597 - 98, 1966. Chlormethylované pryskyřice se běžně dodávají (Bio Rad Laboratories, Richmcnd, Califcrnia, a Lab. Systems, lne.). Výroba pryskyřice tohoto typu je popsána v publikaci Stewart a další, Solid Phase Peptide Synthesis, Freeman a Co., San Francisco 1969, kapitola 1. str.

až 6. Pryskyřice BHA a MBHA se rovněž běžně dodávají a obvykle se užívají pouze v tom případě, že požadovaný peptic má být syntetizován jako nesubstituovaný amid na C-terminálním zakončení.

C-terminální aminokyselina, tj. Asn, chráněná 30C a Xan, může být nejprve navázána na chlormethylovanou pryskyřici způsobem podle publikace Chemistry Letters, K. Horiki a další, 165 - 168, 1978, při použití KP v dimethylformamidu při teplotě 60 °C po dobu 24 hodin za stálého míchání v případě, že má být získán peptid s 43 zbytky. Po navázání aminokyseliny, chráněné BOC na pryskyřici jako podložku, se odstraní ochranná skupina na alfa-aminoskupině, například po10 užitím kyseliny trifluoroctové (TFA) v methylenchloridu nebo samotné kyselině trifluoroctové. Odstranění ochranné skupiny se provádí při teplotě 0 °C až teplotě místnosti. K odštěpení je možno užít také jiných běžných činidel, například kyseliny chlorovodíkové v dioxanu, užívá se podmínek, specifických pro odstranění jednotlivých ochranných skupin na alfa-aminoskupině, tak jak byly popsány v publikaci Schroder a Lubke, The Peptides, 1, str. 72 - 75 (Academie Press 1965).

Po odstranění ochranné skupiny na alfa-aminoskupině se zbývající aminokyseliny, chráněné na alfa-aminoskupině a na postranním řetězci postupně navazují v požadovaném sledu za vzniku svrchu uvedeného meziproduktu, nebo je také možné postupovat tak, že se některé aminokyseliny naváží navzájem před přidáním celého kratšího řetězce k navázané části na pevné fázi. Volbu příslušného činidla může provést každý odborník. Zvláště vhodným reakčním činidlem pro toto použití je N,N -dicyklohexylkarbodiimid (DCCI).

Aktivační činidlo, užívané při syntéze na pevné fázi, je možno volit z dobře známých činidel v chemii peptidů. Příkladem vhodných aktivačních reakčních činidel jsou karbodiimidy, například N,N-diisopropylkarbodiimid a N-ethyl-N^,-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimid. Je možno užít také další aktivační reakční činidlo, tato činidla a jejich použití při vazbě peptidů byla popsána v publikaci Schroder a Lubke, tak jak byla svrchu uvedena, kapitola III a v publi kaci Kapoor, J. Phar. Sci., 59, str. 1 - 27, 1970.

Každá chráněná aminokyselina nebo sled aminokyselin se přivádí k vazbě na pevnou fázi, ve čtyřnásobném nebo ještě větším přebytku, vazbu je možno provést v prostředí směsi dimethylformamidu a methylendichloridu v poměru 1 : 1 nebo v samotném dimethylformamidu nebo methylendichloridu. V příη pádě, že dojde k neúplné vazbě, opakuje se postup před odstraněním ochranné skupiny na alfa-aminoskupině a před navázáním následující aminoskupiny. Úspěch vazby v každém stupni syntézy, provádí-li se manuálně, se s výhodou ověřuje ninnydrincvou reakcí, tak jak byla popsána v publikaci

Ξ. Kaiser a další, Anal. Biochem., 34, 595, 1970. Vazbu je možno také provádět automaticky, například automatickým syntetizátorem (Beckman 990), způsob byl popsán v publikaci Rivier a další, Biopolymery, 1978, 17, str. 1927 - 1938.

Pro získání úplného požadovaného sledu aminokyselin je možno peptid, získaný jako meziprodukt, odstranit z pryskyřice jako podložky působením činidla, například kapalného fluorovodíku, který nejen odštěpí peptid z pryskyřice, ale také odštěpí veškeré zbývající ochranné skupiny na postranním řetězci, jakož i ochrannou skupinu X¹ ma alfa-aminoskupině, v případě, že byla použita, čímž se získá výsledný peptid ve formě volné kyseliny. V.případě, že ve sledu se vyskytuje Met, odstraní se s výhodou nejprve ochranná skupina BOC použitím směsi kyseliny trifluoroctové a eťnandithiolu před odštěpením peptidu a pryskyřice kyselinou fluorovodíkovou k vyloučení potenciální S-alkylace. V případě, že se k odštěpení ušije fluorovodík, doplňuje se reakční směs anisolem a methylethylsulfidem jako látkami, které na sebe váží vedlejší produkty.

Řešení bude osvětleno následujícími příklady, které popisují provedení metody na pevné fázi za získání výsledného peptidu. je samozřejmé, že syntéza odpovídajícího kratšího fragmentu peptidu se provádí stejným způsobem tak, že &' pros tě vynechají příslušné aminokyseliny, je však pravděpodobné, že biologicky aktivní fragmenty by měly obsahovat svrchu uvedený sled přiléhající k N-terminálnímu zakončení.

Příklady provedení

Příklad 1

Systém peptidu vzí podrobněji vypsáno:

:e /H

TeHis /-rhC-RF-(1-43 )-OH , s í* s

N * MeHis-Ala-Asp-Ala-Ile-Pne-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Iie-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-P’ne-Asn-OH se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů (Beckman 990) na chlormethylované pryskyřici se substitucí přibližně 0,1 až 0,5 mmol/g pryskyřice. Navázání BOC-Asn(Xan) na pryskyřici se provádí způsobem, popsaným ve svrchu uvedené publikaci Chemistry Letters při použití fluoridu draselného v dimethy1formamidu při teplotě přibližně 60 °C po dobu 2- hodin za stálého míchání, výsledkem je substituce přibližně 0,35 mmol Asn na gram pryskyřice.

Po odstranění ochranných skupin, a po neutralizaci se postupně buduje na pryskyřici peptidový řetězec. Odstranění ochranných skupin, neutralizace a přidání každé další aminokyseliny se provádí způsobem, který byl podrobně popsán v publikaci Rivier J. J., Amer. Chem. Soc., 96, 2986 - 2992, 1974. Všechna použitá rozpouštědla se pečlivě zbaví plynů promytím inertním plynem, například heliem nebo dusíkem, aby byla jistá nepřítomnost kyslíku, při níž by mohlo dojít k nežádoucí oxidaci síry ve zbytku Met.

Odstranění ochranných skupin se s výhodou provádí podle následujícícho schématu A.

Schéma

Reakční činidla

1. 60% kyselina triílucroctová s 2 % ethandithiolu

2. 60% kyselina triílucroctová se 2 % ethandithic-lu

3. IPA s 1 % ethandithiolu

4. 10% Et^N v methylendichloridu

5. methanol

6. 10% Et^N v methylendichloridu

7. methanol (dvakrát).

8. methylendicnlorid (dvakrát)

Doba míšení(min)

0,5

0,5

0,5

Navázání dalších aminokyselin se provádí podle následujícího schématu B.

Reakční činidla	Schéma	B Doba míšení (mil
9. DCCI		-
10. Boc-aminokyselina		50 - 90
11. methanol (dvakrát)		0,5
12. methylenčichlorid	(dvakrát)	0,5
13. 3M Αθ£θ v methylendichloridu	15,0
14. methylendichlorid	-	0,5
15. methanol		0,5
15. methylendichlorid	(dvakrát)	0,5

Užívá se 1 až 2 mmol aminokyseliny, chráněné BOC v methylenchloridu na 1 g pryskyřice a mimoto ječen ekvivalent 1, OM DCCI v methylenchloridu podobu 2 hodin. Po navázání BOC-Arg (TOS) se užije směs 50 % dimethylformamidu a 50 % methylenchloridu. Bzl ve formě etheru se užije jako ochranná skupina pro hydroxylovou skupinu postranního řetězce Ser a Thr. Amidoskupina Asn nebo Gin se chrání Xan v případě, že se užije dicyklohexylkarbodiimidu jako činidla pro vazbu. Je také možno užít P-nitrofenylester (ONp) k aktivaci karboxylového zakončení Asn nebo Gin, a například je možno přes noc navázat BOC-Asn(ONp) při použití jednoho ekvivalentu HOBt v 50% směsi dimethylformamidu a methylenchloridu, v tomto případě není zapotřebí přidávat dicyklohexylkarbodiimid

2-chlorbenzyloxykarbonyl (2C1-Z) se užije jako ochranná skupina pro postranní řetězec Lys. Tos se užije k ochraně guanidinové skupiny Arg a k ochraně dusíkového atomu imidazclového zbytku His a karbcxylová skupina postranního řetězce Glu nebo Asp se chrání CBzl. Fenolová hydrcxylová skupina Tyr se chrání 2,6-dic'nlorbenzylovou skupinou (DC3) .

K odštěpení peptidu z pryskyřice a k odstranění ochrar ných skupin se'užije směsi 1,5 ml anisclu, 0,5 ml methyleth; sulfidu a 15 ml kyseliny fluorovodíkové na 1 g komplexu peptidu a pryskyřice při teplotě -20 °C po dobu 1/2 hodiny a pak při teplotě 0 °C 1/2 hodiny. Po odstranění fluorovodíku ve vysokém vakuu se zbytek pryskyřice a peptidu promývá stř: dave bezvodým diethyletherem a chloroformem a pak se peptid extrahuje 2N vodným roztokem kyseliny octové, zbaveným plyn; a oddělí se od pryskyřice filtrací.

Odštěpený peptid, zbavený ochranných skupin se pak rc: pustí v 0 až 5% kyselině četové a čistí se například filtrací na gelu Sephadex G-50.

Pak se peptid dále čistí preparativní nebo semi-preparativní vysokotlakou kapalinovou chromatografií způsobem podle publikace Rivier a další, Peptides: Structure and Biological Function, 1979, str. 125 - 128 a Marki a další. J. Am. Chem. Soc., 103, 3178, 1981. Sloupec (Waters Associa tes prep LC-500) se plní 15 - 20 C oxidem křemičitým (Vydac 300A). Gradient CH^CN v TEAP se vytvoří přístrojem (Eldex), tak jak bylo popsáno v publikaci Rivier J.,

J. Liq. Chromatography 1, 343 - 367, 1978. Chromatcgrafické frakce se pečlivě sledují vysokotlakou kapalinovou chromatografií a spojují se pouze frakce s dostatečnou čistotou. Odstranění solí z čištěných frakcí se dosahuje použitím gradientu CH^CN v 0,1% kyselině trifluoroctové. Střední část se pak lyofilizuje, čímž se získá požadovaný peptid, jehož čistota může být vyšší než 93 %.

Syntéza se opakuje při použití pryskyřice M3PA, čímž se získá stejný peptid s amidovaným C-terminálním zakončení; postupuje se způsobem, popsaným v publikaci Vale a další,

US patentový spis č. 4 292 313, čímž se naváže Asn na pryskyřici MBHA.

Příklad 2

Syntéza peptióů o 40 zbytcích o vzorci:

H-C^a'¹'^^aMeHis-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Me t-A.sn-Arg-Gln-Gln-Glu-Arg-Asn-Gln-C-ln-Arg-Ser-NH^ se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidu (3eckm 990) a pryskyřice M3HA způsobem, který byl obecně popsán Valem a dalšími v US patentovém spisu č. 4 292 313. Při provádění chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografi i bylo prokázáno, že se získá v podstatě čistý peptid.

Příklad 3

Syntéza analogu rhGRF, to jest:

/N^alfaMe-Met¹, Leu²⁷/-rhGRF(1-43)-OH vzorce a 1 f* a

N MeMet-Ala-Asp-Ale-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Leu-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-OH se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů (Beck man 990) a chlormethylované pryskyřice způsobem, který byl obecně popsán v příkladu 1. Podle výsledků chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografie se tím~o způsobem získá v podstatě čistý peptid.

Příklad 4

Syntéza fragmentu analogu hpGRF, tj.

I f 3 1 /C MePhe(4Cl) /-hpGRr(l-32)-NH₂ vzorce o *1 f' ra

H-C MePhe (4C1) -Ala-Asp'~Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH₂ se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů (Beckman 990) na pryskyřici MBRA způsobem, popsaným v příkladu 2. Podle výsledků chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografie je tento analog v podstatě Čistý.

Syntéza se ještě dvakrát opakuje, čímž je možno získá /4CL-Phe¹/-hpGRF(1-32)-NHg a /N^alfSMePhe¹/-hpGRF(1-32)-NH

Příklad 5

Syntéza fragmentu analogu hpGRF, tj.

o 1 f o I /N MeTyr /-hpGRF(l-29)-NH₂ vzorce:

N^^MeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Zhr-Asn-Ser-Tyr-Arg-LysVal-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH^ se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů (Beckman 990) na pryskyřici MBHA způsobem, popsaným v příkladu 2. Podle výsledků chromatografie na tenké vrstvě vysokotlaké kapalinové chromatografie se tímto způsobem získá v podstatě čistý peptid.

Příklad 6

Syntéza fragmentu řhGRF, tj.

o Ί fp ů /N I-lePhe /-rhGRF( 1-29 )-NH vzorce:

3.1- X* 3.

N MePhe-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu~Hi s-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-HH se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů (Beckman 990) na pryskyřici MBHA způsobem podle příkladu 2. Podle výsledků chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografie.se tímto způsobem získá v podstatě čistý peptid.

Příklad 7

Syntéza /N^alfaMeLeu¹, Ile²⁷/-hpGRF(1-32)-NHg vzorce:

T í* 3

N MeLeu-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Ile-Ser -Arg-Gln-Gln-Gly-NH₂ se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidu (Beckman 990) a pryskyřice MBHA způsobem podle příkladu 2.

Podle výsledků chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografie se tímto způsobem získá v podstatě čistý peptid.

Příklad 8

Systém fragmentu analogu rhGRF, tj. /C^alfaMe(4Cl)¹/-rbC-RF(l-29)-HH₂ vzorce:

elfa

H-C MePhe ( 4C1) -Ala-Asp—Ala-Ile-Pbe-Thr-Ser-Se r-Ty r-A.rg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-leu-His-C-lu-Ile-Met-Asn-Arg-NH₂ * .

se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů (Beckman 990) na pryskyřici MBHA způsobem, popsaným v příkladu 2. Podle výsledků chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografie se tímto způsobem zís ká v podstatě čistý peptid.

Příklad 9

Syntéza fragmentu analogu rhGRF, tj. /N^alfaMeTyr¹/-rhGRF(l-29)-NH₂ vzorce:

3.1 f* a.

H-N MeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-NH₂ se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů (Beckman 990) a pryskyřice MBHA způsobem, popsaným v příkladu 2. Podle výsledku chromatografie na tenké vrstvě a vysoké kapalinové chromatografie se tímto způsobem získá

V p O Č Ξ z a t ě čistý P 6 p ” i d.

Příklad 10

Syntéza /C^alfaMeLeu¹/-rhGRF-/Val⁴⁴-NH / vzorce:

Λ 1 f P

H-C MeLeu-Al a-Asp-Al a-Ile-Phe-Thr-Se r-Ser-Ty r-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-C-lu-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-Val-NH₂ se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů na pryskyřici MBHA způsobem, popsaným v příkladu 2. Podle výsledků chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografie se tímto způsobem získá v podstatě čistý peptid.

Příklad 11

Syntéza peptidů /N^a^^aMeTyr\ D-Leu^^/-rGRF(1-43)-OH vzorce:

N MeTy r-Ala-Asp-Al a-I le-Phe-Thr-Se r-Ser-Ty r-Arg-Arg-I le -Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-D-Leu-His-Glu-Ile-Met -Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-OH se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů (Beckman 990) na chlormethylované pryskyřici se substitucí přibližné 0,1 až 0,5 mmol/g pryskyřice způsobem, popsaným v příkladu 1.

Chráněný peptid se odštěpí, zbaví se ochranných skupin a čistí se obdobným způsobem jako v příkladu 1. Z čištěných frakcí je možno odstranit soli použitím gradientu CH^CN v 0,1% kyselině trifluoroctové. Střední část se pak lyofilizuje, čímž se získá výsledný peptid, jehož čistota je vyšší než 98 %.

Syntéza se opakuje při použití pryskyřice MBHA, čímž se získá týž peptid s amidovaným C-terminálním zakončením způsobem, který byl obecně popsán Valem a dalšími v US patentovém spisu č. 4 292 313 pro navázání Asn na pryskyřici MBHA.

Příklad 12

Syntéza amidovaného peptidu o 40 zbytcích o 1 fa IP?

/C MeHis , D-Leu /-hpGRF(l-40)-NH₂ vzorce:

S Ί í* 3

H-C MeHis-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-D-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Arg-Gly-Ala-NHg se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů (Beckman 930) na pryskyřici MBHA způsobem, popsaným Valem a dalšími v US patentovém spisu č. 4 292 313. Podle výsledků chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chro matografie se tímto způsobem získá v podstatě čistý peptid.

Příklad 13

Syntéza /N^a^^^aMe-Met^, D-Leu²³, Nle^Z-rGRF-(1-43 )-OH vzorce:

O 1 f O I

N MeMet-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-D-Leu-His-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-OH se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů (Beckman 990) na chlormethylované pryskyřici způsobem, který byl popsán v příkladu 1. Podle výsledků chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatigrafie se tímto způsobem získá v podstatě čistý peptid.

Příklad 14

3

Syntéza fragmentu analogu, tj. /D-Leu^ ^J /-hpC-RF ( 1-NH₂ vzorce:

H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-G.ly-Gln-Leu Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-D-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH₂ se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů (Beckman 990) na pryskyřici MBHA způsobem, popsaným v příkladu 2. Podle výsledků chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografie se tímto způsobem získá v podstatě .čistý analog.

Uvedený způsob se ještě dvakrát opakuje, čímž se získá /D-Leu²³,D-Glu²⁵/-hpGRF( l-32)-NH2 a /D-Leu²³ , Nle²⁷/-hpGRF-(l-32)-NH2.

Příklad 15

2^

Syntéza fragmentu analogu hpGRF, t j . /D-Leu ,D-Asp , N1e²⁷/-hpGRF(1-29)-NK? vzorce;

H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-D-Leu-Gln-D-Asp-Ile-ille-Ser-Arg-NH₂ se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů (Beckman 990) na pryskyřici MBKA způsobem, popsaným v příkladu 2. Podle výsledků chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografie se tímto způsobem získá v podstatě čistý peptid.

Příklad 16

Syntéza /D-Leu², Kle²⁷/-rGRF (1-29 ) vzorce;

H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-?’ne-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu~D-Leu-Kis-Gln-Ile-Mle-Asn-Arg-NHg se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů (Beckman 990) na pryskyřici MBHA způsobem, popsaným v příkladu 2. Podle výsledků chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografie se tímto způsobem zís ká v podstatě čistý peptid.

, 17 2 7

Syntéza se opakuje, čímž se získá /D-Leu ,Nle /-rGRF(l-29)-NH₂.

Příklad 17

Syntéza /D-Glu²⁵,Nle²⁷/-hpGRF(1-29)-NH₂ vzorce:

Η-Tyr-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-D-Glu-Ile-Nle-Ser-Arg-NH₂ se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů (Beckman 990) na pryskyřici MBHA způsobem, popsaným v příkladu 2. Podle výsledku chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografie se tímto způsobem získá v podstatě čistý peptid.

Příklad 18

Sybtéza /D-Glu²⁵ , Nle²⁷/-rC-RF( 1-29 )-NH₂ vzorce:

K-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Che-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Hus-D-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-NH₂ se provádí postupně při použití syntetizátoru .peptidů (Beckman 990) způsobem, popsaným v příkladu 2. Podle výsledků chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografie se tímto způsobem získá v podstatě čistý peptid.

Příklad 19

Syntéza /D-Tyr^,D-Leu^^/pGRF(1-44)-ΝΗ^ vzorce:

H-B-Tyr-Ala-Asp-Ala-Iie-?he-Thr-Asn-Ser-Iyr-Arg-Lys~Vai-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-D-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Sln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Arg-Val-Arg-Leu-NH₂ se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů (Beckman 990) na pryskyřici MBHA způsobem, obecně popsaným Valem a dalšími v US patentovém spisu č. 4 292 313. Podle výsledků chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografie se tímto způsobem získá v podstatě čistý peptid.

Příklad 20

Syntéza ,/D-His , D-Leu OH vzorce:

17 23 2 hís .n-T.au ’ , D-Glu ,Hle“ /rGPF(1-43)H-D-Kis-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-D-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-D-Leu-His-D-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg~Ser-Arg-Pbe-Asn-OH se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů (Beckman 990) na chlormethylované pryskyřice způsobem, který byl popsán v příkladu 1. Podle výsledků chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografie se tímto způsobem získá v podstatě čistý peptid.

Příklad 21 ? 17?? p c,

Syntéza /D-Ala ,D-Leu ’ ,D-Asp /-hpGRF(1-32)-NHg vzorce:

H-Tyr i-Ilť ⁵he-/ηr-Asn—Ser—.

yr i~Lys- v;

-Gly-Gln-D-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-D-Leu-Gln-D-Asp-I le-Me t-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH^ se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidu (Beckman 990) na pryskyřici MBHA způsobem, popsaným v příkladu 2. Podle výsledků chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografi6 se tímto způsobem zís ká v podstatě čistý analog.

Příklad 22

D-Leu

Syntéza /D-Tyr¹, D-Al.a² , D-Asp³ , D-Asn⁸ , D-Tyr¹⁰ , D-Ala¹⁰ ’^17,23,D-Asp²⁵,D-Mí /-hpGRF(1-29)-HH„ vzorce:

H-D-Tyr-D-Ala-D-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-D-Asn-Ser-D-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-D-Ala-Gln-D-Leu-Ser-AI a-Arg-Lys-Leu-D-Leu-Gln-D-Asp-Ile-D-Met-Ser-Arg-NH^ se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů (Beckman 990) a pryskyřice MBHA způsobem, popsaným v příkladu 2. Podle výsledku chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografiC se tímto způsobem zís ká v podstatě čistý analog.

Příklad 23

Syntéza /D-His¹,D-Ser⁸,D-Leu²³,Nle²⁷/-rGRF(1-43)-OH vzorce;

H-D-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-D-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr.Ala-Arg-Lys-Leu-D-Leu-His-Glu-Ile-Hle -Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-C-ln-Arg-Ser-Arg·

-Phe-Asn-OH se provádí pc ;·tupne při použití syntetizátoru peptidů (Beckman 990) na chlormethylované pryskyřici způsobem, popsaným v příkladu 1. Podle výsledku chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografi0 se tímto způsobem získá v podstatě čistý peptid.

Příklad 24

Syntéza fragmentu analogu rGRF -D-Glu²³/-rhGRF(1-29)-NH_O vzorce:

HeTv.

O O

N MeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-ArgIle

-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-bys-Leu-Leu-His-D-Glu-Ile-Met

-Asn-Arg-NH₂ se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů (Beckman 990) na pryskyřici MBH způsobem, popsaným v příkladu 2. Podle chromatografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografie se tímto způsobem získá v pod statě čistý peptid.

Příklad 25

Syntéza /C^alf/ieLeu¹,D-Leu²³,D-Glu²⁵,Nle²⁷/-rGRF-/Val^⁴/-NH2 vzorce:

H-C^ali MeLeu-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Se r-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-D-Leu-His-D-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-Val-NH^ se provádí postupně při použití syntetizátoru peptidů (Beckman 990) na pryskyřici MBHA způsobem, popsaným v příkladu 2. Podle chromatografie na tenké vrstvě a podle vysokotlaké kapalinové chromatografie se tímto způsobem

A .

získá v podstatě čistý peptid.

Různé syntetické peptidy připravené podle jednotlivých příkladů byly srovnávány se syntetickým hpGRF ( 1 -40 ')-OH in vitro a bylo prokázáno, že všechny měly větší schopnost podporovat sekreci růstového hormonu a další podobné účinky.

Aby bylo možno stanovit účinnost některých syntetických peptidů na uvolňování růstového hormonu, byly prováděny pokusy in vitro při použití syntetického hpGRF(1-40)-OH jako standardu a ekvimolárních koncentrací různých jiných analogů a fragmentů. Byly užity kultury krysích hypofyzálnich buněk ze žláz, odebraných před 3 až 5 dny. Kultury, které byly pro toto sledování optimální, byly užity pro srovnávací zkoušky způsobem, popsaným v publikaci Vale a další,

Endocrinology, 91, 552 - 572, 1972 a ještě podrobněji v publikaci Vale a další, Endocrinology, 1983 v tisku. Inkubace se sledovanými látkami se provádí.3 až 4 hodiny, načež se odeberou podíly živného prostředí a zpracovávají se tak, že se měří obsah imunoreaktivního růstového hormonu (in GH) běžnou radioimunolcgickou zkouškou s použitím cestiček.

Výsledky tohoto srovn pro ekvimolámí koncentrace

SOU UVť :eny v i S 1 S'

Peptid srovnání v %

hpC-RF (1-40)-OH
(standard)	100
/D-Glu25,Nle27/-rGRF(1-29)-NH	125
/D-Leu23 , Nle27/-rGRF( l-29')-KH2	150
/D-Leu17, Nle27/-rGRF(l-29)-NH2	12S
/M-MePhe1 2 * * * * /-hpC-RF ( 1 - 2 2 ) -NHj	ď 7

/0 Me?he¹(4Cl)/-hpGRF(l-3^-LH_? 4,7 /-01-rhe¹/’npGRF(1-32)-KH_? 2

In vitro pokusy s těmito syntetickými peptidy ukazují, že každý z nich má plnou biologickou účinnost ⁷ hpGRF(1-40)-OH. Maximální účinná koncentrace pro /D-Leu

7

Nle /-hpGRF(1-29)-KH₂ je přibližně 1 nanomol.

Kromě testů in vitro na sekreci růstového hormonu byly prováděny také pokusy in vivo tak, že byly syntetické peptidy podány injekčně krysím samcům po předběžném ošetření FLA-63, inhibitorem hydroxylózy dopaminu, který potlačuje samovolnou sekreci růstového hormonu, aniž by ovlivňoval odpověď na zevně přiváděný GRF. Krevní vzorky byly odebírány katetrem těsně před injekcí a 5 a 20 minut co inlekci. Hladiny růstového hormonu v krvi, měřeno racio2327 imunologicky ukazují, že syntetický /D-Leu ' ,Nle /-rGRF(1-29''-LH- další D-Leu ^ά alfa..

a D-Glu²⁵-analogy rGRF a svrchu . . aTfa..

i cen i i ± .·< o v aní _ jsou účinnými stimulátory sekrece hypofyzálního rusOv-..o hormonu a daleko delší dobu účinku než rGRF/1-29)-NH₂ a in vivo, které jsou účinpotvrdily tyto výsledky, nanogramú až 50 mikrogramú hpGRF(l-32)-NH₂. Další známé GRF né při sekreci růstového hormonu Dávky se pohybují v rozmezí 100 peptidu na 1 kg hmotnosti.

Syntetické analogy hpGRF a pravděpodobně také analogy rGRF a pGRF by měly být použitelné v lidské medicíně v případě, že je zapotřebí zVýšit produkci růstového hormonu. Stimulace sekrece růstového hormonu těmito analogy spadá v úvahu zejména u nemocných s úplným chyběním nebo nedostatečnou sekrecí růstového hormonu, a to v důsledku toho, že se tento hormon nevyrábí z toho důvodu, že chybí faktor, který jeho uvolňování podporuje. Mimo co je pravděpodobné, že zvýšená sekrece růstového hormonu a vliv této sekrece na rychlený růst může příznivě ovlivnit i vývoj lidí nebo zvířat s normálními hladinami růstového hormonu. Mimoto je možné, že by tímto způsobem bylo možno ovlivnit tukové buňky v těle a pozměnit další metabolické, imunologické a vývojové po chody, které závisí na produkci růstového hormonu. Tyto ana logy by tedy mohly být použitelné k podpoře anabolických pochodů u lidí například při těžkých popáleninách. Také by mohlo padat v úvahu podávání těchto analogů u hospodářských zvířat, například kuřat, krocanů, vepřů, koz, skotu a ovcí, a také u studenokrevných zvířat, například ryb a dalších mořských zvířat, například želv, popřípadě u obojživelníků k urychlení jejich růstu a ke zvýšení poměru bílkovin k tukům, což by současně mělo vést i k dokonalejšímu využití bílkovin, které jsou těmto živočichům podávány v krmivu.

t

Při podávání svrchu uvedených látek lidem by syntetické peptidy měly mít čistotu alespoň 93 %, s výhodou alespoň 93. %. Čistota v tomto případě znamená hmotnostní procento požadovaného peptidu ve směsi ostatních peptidu-a jejich fragmentů. Při podávání syntetických peptidů hospodářským zvířatům a jiným zvířatům k urychlení jejich růstu a ke snížení tuku stačí daleko nižší čistota, například pouze 5 %, v některých případech je přípustná čistota 0,01 %.

Syntetické peptidy nebo jejich nstoxické soli je možno zpracovávat na farmaceutické prostředky spolu s běžnými nosiči, přijatelnými z farmaceutického nebo veterinárního hlediska. Takto získané prostředky je možno podávat živočichům včetně lidí, obvyklým způsobem podání je podání nitrožilní, podkožní, nitrosvalové, kožní a popřípadě intranasální nebo perorální. K podání peptidů, vyrobených způsobem podle vynálezu, se může rozhodnout lékař v případě, že je zapotřebí zvýšit uvolňování růstového hormonu v zájmu jeho nemocného. Požadovaná dávka peptidu se může měnit podle podmínek, a to zejména v závislosti na závažnosti stavu nemocného a na Dožadované době léčení.

Peptidy podle technického řešení je často možno podávat ve formě jejich netoxických solí, například adičních solí s kyselinami nebo ve formě jejich komplexů s kovy, například zinkem, železem a podobně. Tyto komplexy se považují z hlediska přihlášky pro jednoduchost také za soli.

Jako příklad vhodných adičních solí s kyselinami je možno uvést hydrochloridy, hydrobromidy, sírany, fosforečnany, maleáty, citronany, octany, jantarany, jablečnany, benzoáty, soli kyseliny askorbové, kyseliny vinné a podobně. V případě, že účinná látka má být podávána perorálně ve formě tablet, může tableta obsahovat také pojivo, například tragakant, kukuřičný škrob nebo želatinu, dále plnidlo, které napomáhá rozpadu tablety, například kyselinu alginovou, kluznou látku, například stearan hořečnatý a podobně. V případě, že se požaduje podání v kapalné formě, může prostředek obsahovat sladidlo a/nebo chuťovou látku, při nitrožilním podání bude prostředek obsahovat zejména isotonický roztok chloridu sodného, fosfátový pufr a podobně.

Peptidy podle technického řešení je zapotřebí podávat lidem pod dohledem lékaře, farmaceutické prostředky budou obvykle obsahovat příslušný peptid spolu s běžným pevným nebo kapalným nosičem, přijatelným z farmaceutického hlediska. Při parenterálním podání se bude dávka účinné látky pohybovat obvykle v rozmezí 100 nanogramů až 50 mikrogramů peptidu na 1 kg tělesné hmotnosti.

Přestože řešení bylo popsáno v souvislosti s některými výhodnými provedeními, která představují v současné době nejlepší způsob provedení, který je znám, je samozřejmé, že bude možno provádět různé změny a modifikace, které může běžně provést každý odborník, aniž by přitom došlo k odchylkám od podstaty řešeníJe například možno provádět nejrůznější modifikace v základním peptidovém řetězci, a to zejména vynechat některé zbytky nebo skupiny zbytků od C-terminálního zakončení peptidového řetězce v souladu s běžnými způsoby, které se v současné době používají k získávání peptidů nebo peptidových fragmentů, které si uchovávají veškerou účinnost původní látky nebo podstatnou část biologické účinnosti základního peptidu. Mimoto je možno na obou koncích peptidu nebo na některém z těchto konců zbytky přidat a/nebo je možno užít místo přírodně se vyskytujících zbytků zbytky, které se obvykle pokládají za zbytky ekvivalentní, tak jak je to známo v chemii peptidů za vzniku analogů, které mají alespoň podstatnou část biologické účinnosti polypeptidů, aniž by přitom došlo k odchýlení od podstaty řešení.

Zastupuje :

j' ν' \/ —> / O

- 33 NÁROKY NA OCHRAN U

Claims (2)

1. Peptidy obecného v:

,orce

R. - R „ - R, - Αία - N = - Ph = - T - R - ^c a - R -A?·!-⁰ - i 2 3 ‘ 3 - 10 ^a 12 13 ^Gln-^R17-^R13-^U5“^Ar5-^Ly5-^Lsu-^?'23-°2<^R25-ⁿ⁵-^R27-^R23-^A;?3-Gl·-,Gln-Giy-Glu-R-,-Asn-Gln-Glu-R,_n-R

33 39 40 ''42“43^_,'41 / 7 \

V. i ,· kde

R-, znamená Tyr, D-Tyr, Met, Pne. D-Phe, pGl-Phs, Leu, His nebo D-His, při substituci typu D^a“‘^aMe nebo N^a-isMe nebo bez substituce, -·

^R2 znamená Ala, nebo D-Ala, ^S3 znamená Asp nebo D-Asp, 0 3 znamená Ser, Asn, D-Ser nebo D-Asn, ^R10 znamená Tyr nebo D-Tyr, Rj ₂ znamená Arg nebo Lys, ^R13 znamená I1ě nebo Val, ^R15 znamená Gly nebo' Q-Ala, ^R17 znamená Leu nebo D-Leu, ^Rí8 znamená Tyr nebo Ser, ^R23 znamená Leu nebo D-Leu, ^R24 znamená His nebo Gin, ^R25 znamená Glu , Asp, D-Glu nebo D-Asp, ^R27 znamená Met , D-Met, Ala , Nle , Ile, Leu, Nva mebo Val, ^R23 znamená Asn nebo Ser, ^R34 znamená Arg nebo Ser, ^R38 znamená Gin nebo Arg,

'39 ‘40 '42 '43

znamená Arg nebo Gly, znamená Ser nebo Ala, znamená Phe, , Ala nebo Val znamená Aen nebo Arg, znamená Val n e b 0 ¹ e u.

za předpokladu, že bud

a) Rmá substituci typu C' 'Me nebo M a i r a.

Me nebo

b) R^₇ a/nebo R₂₃ znamená D-Leu nebo

c) R,-,^ znamená D-Glu nebo D-Asp, přičemž navíc je možno vynechat některý ze zbytků ^R44’ ^R43^R44’ *42 43 44’

Atg-R42“^R43-^R44>

^R10^_Ar9_R42^R43“^R44 ’ ^R39“^R40^Ar9“^R42~^R43^R44’ ^R38^-R39^R40“^Ar9_R42^R43^R44’ ^{Ε1υ Κ}33^_Ρ'39^Κ40 ’^Ar9_R42~^R43'^R44’ Gln-Glu-R-jg-R-^-P^Q-Ai-Q-R^^-7' 43-^44 ’ Asn-Gln-Glu-R₃₈-R₃₉-R_4Q -Arg-R^-R^-R^, ^R34^-Asr'^-^'’^ri_^^^U_R38^-R39^-R40^-Al'^~^R42^-R43^-R44’ Glu-R,₄-Asn-Fln-Glu-R_3g-R_3g.R₄₀-Arg-R₄₂-R₄₃-R₄₄, Gly-Glu-R₃₄-Asn-Gln-Glu-R₃₈-R₃₉-R₄₀-Arg-R₄₂-R₄₃-R₄4,

Gln-Gly-Glu-R₃₄-Asn-Gln-Glu-R₃₈-R_3g-R₄Q-Arg-R₄₂-R₄₃-R44,

Gln-Gln-Gly-Glu-R₃₄-Asn-Gln-Glu-R₃₈-R₃₉-R_4Q-Arg-R₄₇-R4-₅

-R44·

-i

2. Peptidy