FI92210B - Menetelmä farmaseuttisesti käyttökelpoisten GRF-analogien valmistamiseksi - Google Patents

Description

92210

Menetelmä farmaseuttisesti käyttökelpoisten GRF-analogien valmistamiseksi

Keksinnön kohteena on menetelmä farmaseuttisesti . 5 käyttökelpoisten kasvuhormonia vapauttavan tekijän synteettisten peptidianalogien valmistamiseksi. Peptidit vaikuttavat ihmisen ja muiden eläinten aivolisäketoimintaan. Erityisesti tämän keksinnön kohteena on menetelmä peptidin valmistamiseksi, joka edistää aivolisäkkeen kasvuhormonin 10 vapauttamista.

Fysiologit ovat pitkään olleet perillä siitä, että alanäkökukkula säätelee aivolisäkkeen etulohkon eritystoimintoja, jolloin alanäkökukkula tuottaa erikoisaineita, jotka kiihottavat tai estävät jokaisen aivolisäkehormonin 15 erittymistä. Hypotalaaminen estotekijä luonnehdittiin 1972 somatostatiinin muodossa, joka estää kasvuhormonin (GH) erittymisen. 1982 eristettiin ihmisen haima(kasvain)vapau-tustekijöitä (hpGRF) ihmisen haimakasvainuutteista, ne puhdistettiin, luonnehdittiin, syntetisoitiin ja testat-20 tiin ja niiden havaittiin edistävän aivolisäkkeen GH:n va pauttamista. Kumpaakin näistä hypofysiotrooppisista tekijöistä on jäljennetty kokonaissynteesillä ja luonnon rakenteiden analogit on syntetisoitu. Uskotaan, että ihmisen . hypotalaamisella GH-vapautustekijällä on täsmälleen sama 25 rakenne; siten tämän jälkeen käytetään käsitettä hGRF.

Vastaava rotan hypotalaaminen GH-vapautustekijä (rGRF), vastaava sian hypotalaaminen GH-vapautustekijä (pGRF) ja vastaava naudan hypotalaaminen GH-vapautustekijä (bGRF) on myös luonnehdittu ja syntetisoitu.

30 Nyt on syntetisoitu ja testattu synteettisiä poly- peptidejä, jotka vapauttavat GH:ia viljellyistä aivolisä-kesoluista ja jotka kestävät ainakin osittain entsymaattista hajottamista kehossa ja joilla on hyvin olennaisesti lisääntynyt teho. Näillä peptideillä on NaCH3-D-Ala(D-NMA) 35 2-asemassa ja/tai D-Leu 14-asemassa ja/tai D-Arg 29-ase- 92210 2 massa sekä edullisesti myös Nle 27-asemassa. D-Leu voi olla läsnä 17- ja/tai 23-asemissa ja joko D-Glu tai D-Asp voi olla läsnä 25-asemassa. Näissä peptideissä voi olla myös joku seuraavista tähteistä 1-asemassa: Tyr, D-Tyr, 5 Met, Phe, D-Phe, pCl-Phe, Leu, His ja D-His, jossa täh-teessä voi valinnaisesti olla metyylisubstituointi joko alfa-hiilellä tai alfa-aminoryhmässä. Niissä voi valinnaisesti olla D-Asp 3-asemassa ja/tai joko D-Arg tai D-Ser 8-asemassa ja/tai D-Tyr 10-asemassa ja/tai D-Ala 15-asemas-10 sa. Niissä voi myös olla D-Met tai Nva joko Nle:n tai Met:n asemasta 27-asemassa.

Tässä esitetyt farmaseuttiset yhdistelmät sisältävät analogeja, jotka ovat pituudeltaan n. 27 - 29 tähdettä tai jonkin näistä ei-myrkyllisen suolan, dispergoituna 15 farmaseuttisesti tai eläinlääketieteellisesti hyväksyttävään nesteeseen tai kiinteään kantimeen. Tällaisia farmaseuttisia yhdistelmiä voidaan käyttää kliinisessä lääketieteessä sekä ihmis- että eläinlääketieteessä, antamista varten hoitotarkoituksissa ja myös diagnostisesti. Lisäksi 20 niitä voidaan käyttää edistämään lämminveristen eläinten, siipikarja mukaan lukien ja vesiviljelyssä kylmäveristen eläinten, esimerkiksi kalojen, ankeriaiden yms., kasvua.

Peptidien määrittelemiseen käytetty nimistö on Schroder'in & Lubke'n "The Peptides", Academic Press 25 (1965), määrittelemä, jossa tavanomaisen esitystavan mu kaisesti aminoryhmä N-päätteellä näkyy vasemmalla ja kar-boksyyliryhmä C-päätteellä oikealla. Luonnon aminohapoilla tarkoitetaan tavallisia, luonnossa esiintyviä aminohappoja, joita esiintyy proteiineissa ja joita ovat Gly, Ala, 30 Vai, Leu, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp ja His. Nle:llä tarkoitetaan norleusiinia ja Nva:11a tarkoitetaan norvaliinia. Kun amino-happotähteellä on isomeerisiä muotoja, esitetään aminohapon L-muoto, ellei toisin selvästi ole osoitettu. 35 D-NMA tarkoittaa alaniinin D-isomeeriä, jossa alfa-amino- 3 9221 0 ryhmä on substituoitu metyylillä.

Tämä keksintö kohdistuu menetelmään farmaseuttisesti käyttökelpoisten kasvuhormonia vapauttavan tekijän synteettisten peptidijohdannaisten valmistamiseksi, joilla on 5 sekvenssi: R1-R2-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Re-Ser-R10-Arg-R12-R13-R14-Gly-Gln-Leu-R18-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-R24-R25-Ile-Nle-R2B-R29 -NHR, jossa Rx on Tyr tai His; Rj on Ala tai D-NMA; R8 on Ser tai Asn; R10 on Tyr tai D-Tyr; R12 on Arg tai Lys; R13 on Ile tai 10 Vai; R14 on Leu tai D-Leu; R18 on Tyr tai Ser; R24 on His tai Gin; R25 on Glu tai Asp; R28 on Asn tai Ser; R29 on Arg tai D-Arg; ja R on H tai CH2CH3; edellyttäen kuitenkin, että R29 tai R28 - R29 voidaan jättää pois, ja edellyttäen myöskin, että R2 on D-NMA ja/tai R14 on D-Leu ja/tai R29 on D-Arg.

15 Peptidit syntetisoidaan jollakin sopivalla menetel mällä, kuten yksinomaisesti kiintofaasimenetelmillä, osittain kiintofaasimenetelmillä, osaskondensaatiolla tai klassisilla liuoskytkemisillä. Viime aikoina kehitettyjä yhdistelmä-DNA-menetelmiä voidaan käyttää osan analogista 20 valmistamiseksi, joka sisältää ainoastaan luonnon aminohappotähteitä, joka osa sitten voitaisiin kytkeä lyhyeen N-päätepeptidiin. Esimerkiksi menetelmiä yksinomaisesti kiintofaasisynteesiä varten on esitetty oppikirjassa "Solid-Phase Peptide Synthesis", Stewart & Yound, Freeman 25 & Co., San Francisco, 1969 ja esimerkkejä niistä on esitetty US-patentissa nro 4 105 603, myönnetty 8.8.1978

Vale et ai:lie. Klassista liuossynteesiä on selostettu yksityiskohtaisesti julkaisussa "Methoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl): Synthese von Peptiden", E. Wunsch 30 (toimittaja) (1974) Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Länsi-Saksa. Fragmenttikondensaatiosynteesimenetelmästä on esitetty esimerkkejä US-patentissa nro 3 972 859 (3.8.1976). Muista käytettävissä olevista synteeseistä on esitetty esimerkkejä US-patentissa nro 3 842 067 (15.10.1974) ja 35 US-patentissa nro 3 862 925 (28.1.1975).

« 92210 4

Yhteistä tällaisille synteeseille on eri aminohappo-osien epävakaisten sivuketjuryhmien suojaaminen sopivilla suojaryhmillä, jotka estävät kemiallisen reaktion tapahtumisen siinä kohdassa, kunnes ryhmä on lopullisesti 5 poistettu. Yhteistä on tavallisesti myös alfa-aminoryhmän suojaaminen aminohapolla tai osasella, samalla kun tämä kokonaisuus reagoi karboksyyliryhmällä, mitä seuraa alfa-aminosuojaryhmän selektiivinen poistaminen sallimaan myöhemmän reaktion tapahtuminen tässä paikassa. Siten on ta-10 vallista, että yhtenä vaiheena synteesissä valmistetaan välituoteyhdiste, joka sisältää jokaisen aminohappotähteistä sijoitettuna sen haluttuun sekvenssiin peptidiket-jussa sivuketjusuojaryhmät kytkettyinä sopiviin tähteisiin.

15 Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että (a) muodostetaan välituotepeptidi, jossa on ainakin yksi suojaryhmä ja jolla on kaava (II) tai sen tarkoituksenmukaisesti lyhennetty muunnos: X1-^(X tai X2) -R2-Asp( X3) -Ala-Ile-Phe-Thr (X4) -R8( X4 tai X5)-20 Ser(X4)-R10(X2)-Arg(X6)-R12(X6 tai X7 )-R13-R14-Gly-Gln(X5)-Leu- R18(X2 tai X4) -Ala-Arg( X6) -Lys( X7) -Leu-Leu-R24( X tai X5)-R25-(X3)- Ile-Nle-R28( X4 tai X5)-R29(X6)-X9, jossa: X, X1, X2, X3, X4, X5, X6 ja X7 ovat kukin joko vety tai suojaryhmä ja X9 on joko suojaryhmä tai kiinnittävä sidos hartsikantimeen 25 tai on des-X9, jossa tapauksessa C-pääte on NHR, (b) pilkotaan suojaryhmä tai -ryhmät tai kiinnittävä sidos kaavan (II) mukaisesta peptidistä; ja puhdistetaan saatu peptidi.

X1 on joko vety tai α-aminosuojaryhmä, X*:n tarkoittamat α-aminosuojaryhmät ovat niitä, joiden hyvin tiede-30 tään olevan käyttökelpoisia polypeptidien vaiheittaisen synteesin alalla, α-aminosuojaryhmien luokkia, joita voidaan käyttää X3:nä, ovat (1) aromaattiset uretaanityyppiset suojaryhmät, kuten fluorenyylimetyylioksikarbonyyli (FMOC), bentsyylioksikarbonyyli (Z) ja substituoitu Z, ku-35 ten p-klooribentsyylioksikarbonyyli, p-nitrobentsyyli- oksikarbonyyli, p-bromibentsyylioksikarbonyyli ja p-metok- 92210 5 sibentsyylioksikarbonyyli; (2) alifaattiset uretaanisuoja-ryhmät, kuten t-butyylioksikarbonyyli (BOC), di-isopropyy-limetyylioksikarbonyyli, isopropyylioksikarbonyyli, etok-sikarbonyyli, allyylioksikarbonyyli; sekä (3) sykloalkyy-5 li-uretaani-tyyppiset suojaryhmät, kuten syklopentyyliok-sikarbonyyli, adamantyylioksikarbonyyli ja sykloheksyyli-oksikarbonyyli. Edullinen α-aminosuojaryhmä on BOC, silloinkin kun N“Me-substituoitua tähdettä käytetään 1-asemas-sa.

10 X on vety tai suojaryhmä His:n imidatsolitypelle, kuten Tos.

X2 on sopiva suojaryhmä Tyr:n fenoli-hydroksyyliryh-mälle, kuten tetrahydropyranyyli, tert-butyyli, trityyli, Bzl, CBZ, 4Br-CBZ ja 2,6-diklooribentsyyli (DCB). Edulli-15 nen suojaryhmä on 2,6-diklooribentsyyli. X2 voi olla vety, mikä tarkoittaa, että aminohappotähteellä tässä asemassa ei ole sivuketjusuojaryhmää.

X3 on vety tai sopiva esterin muodostava suojaryhmä Asp:n tai Glu:n karboksyyliryhmälle, kuten bentsyyli 20 (OBzl), 2,6-diklooribentsyyli, metyyli ja etyyli.

X4 voi olla sopiva suojaryhmä Thr:n tai Ser:n hyd-roksyyliryhmälle kuten asetyyli, bentsoyyli, tert-butyyli, trityyli, tetrahydropyranyyli, Bzl, 2,6-diklooribentsyyli ja CBZ. Edullinen suojaryhmä on Bzl. X4 voi olla vety, mikä 25 tarkoittaa, että hydroksyyliryhmällä ei ole suojaryhmää.

X5 on vety tai sopiva suojaryhmä Asn:n tai Gin:n sivuket ju-amidoryhmäl le. Se on edullisesti ksantyyli (Xan).

X6 on sopiva suojaryhmä Arg:n guanidiiniryhmälle, kuten nitro, Tos, CBZ, adamantyylioksikarbonyyli ja BOC 30 tai vety.

X7 on vety tai sopiva suojaryhmä Lys:n sivuketju-aminoryhmälle. Kuvaavia sopivia sivuketju-aminosuojaryhmiä ovat 2-klooribentsyylioksikarbonyyli-(2-Cl-Z), Tos, t-amyylioksikarbonyyli ja BOC.

35 X8 on vety tai sopiva sivuketjusuojaryhmä, kuten 6 9221 0 edellä on yleisesti määritelty.

Met voi valinnaisesti olla suojattu hapella, mutta jätetään edullisesti suojaamatta.

Sivuketju-aminosuojaryhmän valinta ei ole ratkaise-5 va, paitsi että yleensä valitaan sellainen, joka ei poistu α-aminoryhmien suojausta purettaessa synteesin aikana. Toisille aminohapoille, esim. His:lle, suojaaminen ei kuitenkaan ole yleensä tarpeen sen jälkeen kun kytkeminen on loppuunsuoritettu ja suojaryhmät voivat olla samoja.

10 X9 on sopiva suojaryhmä C-pääte-karboksyyliryhmälle, kuten esterin muodostava ryhmä X3 tai se on kiinnittävä sidos, jota käytetään kiintofaasisynteesissä kiinnittämistä varten kiinteään hartsikantimeen tai on des-X9, jossa tapauksessa C-pääte on NHR. Kun käytetään kiinteää hartsi-15 kanninta, se voi olla joku tekniikan tasolla tunnetuista kuten kännin, jolla on kaava: -0-CH2-hartsikannin, -NH-bentshydryyliamiini(BHA)hartsikannin tai -NH-parametyyli-bentshydryyliamiini(MBHA)hartsikannin. Kun halutaan subs-tituoimaton amidi, on BHA- tai MBHA-hartsin käyttö edul-20 lista, koska pilkonta antaa suoraan amidin. Tapauksessa, jossa halutaan N-metyyliamidi, se voidaan kehittää N-metyyli-BHA-hartsista. Jos halutaan muita substituoituja amideja tai jos halutaan muita substituoituja amideja tai jos halutaan muita ryhmiä kuin vapaa happo C-päätteelle, 25 saattaa olla edullista syntetisoida peptidi käyttäen klassisia menetelmiä, kuten Houben-Weyl -julkaisussa esitetään.

Välituotteen kaavassa ainakin yksi X-ryhmistä on suojaryhmä tai X9 sisältää hartsikantimen. Siten keksintö 30 koskee menetelmää kiinnostavan peptidin valmistamiseksi (a) muodostelmalla peptidi, jossa on ainakin yksi suojaryhmä ja jolla on kaava (II), jossa: X, X1, X2, X3, X4, Xs, X6, X7 ja X8 ovat jokainen joko vety tai suojaryhmä ja X9 on joko suojaryhmä tai hartsikantimeen kiinnittävä sidos tai 35 des-X9, jossa tapauksessa tähteessä C-pääte on NHR; (b) 92210 7 pilkkomalla suojaryhmä tai -ryhmät tai kiinnittävä sidos pois kaavan (II) peptidistä; ja (c) jos halutaan, muuttamalla saatu sekvenssin (i) peptidi ei-myrkylliseksi suo-lakseen.

5 Valittaessa nimenomaista sivuket jusuojaryhmää, jota käytetään peptidien synteesissä, seurataan seuraavia yleisiä sääntöjä: (a) suojaryhmä säilyttää edullisesti suojaavat ominaisuutensa eikä pilkkoudu pois kytkentäolosuhteis-sa, (b) suojaryhmän tulisi olla kestävä reagenssille ja se 10 on, Xan:ia lukuunottamatta, edullisesti pysyvä reaktio- olosuhteissa, jotka valitaan α-aminosuojaryhmän poistamiseksi synteesin jokaisessa vaiheessa, ja (c) sivuketjusuo-jaryhmän täytyy olla poistettavissa kun synteesi, joka sisältää halutun aminohapposekvenssin, on suoritettu loppuun 15 reaktio-olosuhteissa, jotka eivät muuta peptidiketjua ei-toivotulla tavalla.

Kun peptidejä ei valmisteta yhdistelmä-DNA-teknolo-giaa käyttäen, ne valmistetaan edullisesti käyttäen kiin-tofaasisynteesiä kuten Merrifield'in, J. Am. Chem. Soc. 20 85, s. 2149 (1963) yleisesti selostamaa kiintofaasisyntee- siä, joskin myös muita samanarvoisia kemiallisia alalla tunnettuja synteesejä voidaan käyttää kuten edellä mainittiin. Kiintofaasisynteesi aloitetaan peptidin C-päätteen päästä kytkemällä suojattu α-aminohappo sopivaan hartsiin. 25 Tällainen lähtöaine voidaan valmistaa kiinnittämällä a-aminosuojattu aminohappo esterisidoksella kloorimetyloi-tuun hartsiin tai hydroksimetyylihartsiin tai amidisidok-sella BHA-hartsiin tai MBHA-hartsiin. Hydroksimetyylihart-sin valmistuksen ovat selostaneet Bodansky et ai., Chem. 30 Ind. (Lontoo) 38, 1597-98 (1966). Kloorimetyloituja hartseja on kaupallisesti saatavissa firmasta Bio Rad Laboratories, Richmond, Kalifornia ja firmasta Lab. Systems, Inc. Tällaisen hartsin valmistusta ovat selostaneet Stewart et ai., "Solid Phase Peptide Synthesis" (Freeman & 35 Co., San Francisco (1969), luku 1, sivut 1 - 6). BHA- ja 92210 8 MBHA-hartsikantimia on kaupallisesti saatavissa ja niitä käytetään yleisesti ainoastaan kun halutussa syntetisoitavassa polypeptidissä on substituoimaton amidi C-päätteel-lä.

5 C-pääteaminohappo, esim. Asn, joka on suojattu BOC: llä tai Xanrllä, voidaan ensin kytkeä kloorimetyloituun hartsiin menetelmän mukaisesti, joka on esitetty julkaisussa Chemistry Letters, K. Horiki et ai. 165 - 168 (1978), käyttäen KF DMFissa n. 60°C:ssa 24 tuntia sekoitit) taen, kun on syntetisoitava 43-tähteen peptidi. BOC-suoja-tun aminohapon kytkemisen jälkeen hartsikantimelie a-ami-nosuojaryhmä poistetaan esim. käyttäen trifluorietikkahap-poa (TFA) metyleenikloridissa tai TFA yksinään. Suojauksen purkaminen suoritetaan lämpötilassa 0°C:sta huoneen lämpö-15 tilaan. Muita standardipilkontareagensseja, kuten HC1 dioksaanissa ja olosuhteita spesifisten a-aminosuojaryh-mien poistamiseksi voidaan käyttää, kuten Schroder & Lubke, "The Peptides" 1, sivut 72 - 75 (Academic Press 1965), ovat selostaneet.

20 α-aminosuojaryhmän poistamisen jälkeen jäljelle jäävät α-amino- ja sivuketjusuojatut aminohapot kytketään vaiheittain halutussa järjestyksessä edellä määritellyn välituoteyhdisteen saamiseksi tai vaihtoehtona sille, että jokainen aminohappo yhdistetään erikseen tässä synteesis-25 sä, jotkut niistä voidaan kytkeä toisiinsa ennen lisäämistä kiintofaasireaktoriin. Sopivan kytkentäreagenssin valinta kuuluu alaan perehtyneen tietämykseen. Erityisen sopiva kytkentäreagenssiksi on N,N'-disykloheksyylikarbodi-imidi (DCCI).

30 Aktivoimisreagenssit, joita käytetään peptidien kiintofaasisynteesissä, ovat hyvin tunnettuja peptidien alalla. Esimerkkejä sopivista aktivoimisreagensseista ovat karbodi-imidit, kuten N,N'-di-isopropyylikarbodi-imidi ja N-etyyli-N' - (3-dimetyyliaminopropyyli)karbodi-imidi. Muita 35 aktivoimisreagensseja ja niiden käyttöä peptidien kytken- 92210 9 nässä, ovat selostaneet Schroder & Lubke, supra, luvussa III ja Kapoor, J. Phar. Sei., 59, sivut 1-27, (1970).

Jokainen suojattu aminohappo tai aminohapposekvenssi viedään kiintofaasireaktoriin n. 4-kertaisessa tai suu-5 remmassa ylimäärässä ja kytkeminen suoritetaan dimetyyli-formamidi(DMF):CH2C12 (1 s 1)-väliaineessa tai DMFissa tai CH2Cl2:ssa yksinään. Tapauksissa, joissa esiintyy epätäydellistä kytkeytymistä, kytkentäprosessi toistetaan ennen α-aminosuojaryhmän poistamista ennen seuraavan aminohapon 10 kytkemistä. Kytkentäreaktion tulosta synteesin jokaisessa vaiheessa, jos se suoritetaan käsin, tarkkaillaan edullisesti ninhydriinireaktiolla, kuten ovat selostaneet E. Kaiser et ai., Anal. Biochem. 34, 595 (1970). Kytkentä-reaktiot voidaan toteuttaa automaattisesti, esim. Beckman 15 990 automaattisella syntetisoimislaitteella käyttäen oh jelmaa, jollaisen ovat esittäneet Rivier et ai., Biopoly-mers, 1978, 17, sivut 1927 - 1938.

Sen jälkeen kun haluttu aminohapposekvenssi on saatu täydelliseksi, välituotepeptidi voidaan poistaa hartsi-20 kantimesta käsittelemällä reagenssilla, kuten nestemäisellä fluorivedyllä, joka ei ainoastaan lohkaise peptidiä hartsista, vaan pilkkoo myös kaikki jäljellä olevat sivu-ketjusuojaryhmät X, X2, X3, X4, X5, X6, X7 ja X8 ja kiinnittävät sidokset X9 sekä myös α-aminosuo jaryhmän X1, jos sel-25 laista käytetään, peptidin saamiseksi vapaan hapon muodossa. Jos Met on läsnä sekvenssissä, BOC-suojaryhmä poistetaan edullisesti ensin käyttäen trifluorietikkahappo (TFA)/etaaniditiolia ennen peptidin lohkaisua hartsista HF:llä mahdollisen S-alkyloinnin poistamiseksi. Kun pil-30 kontaan käytetään fluorivetyä, sisällytetään reaktioas- tiaan anisolia ja metyylietyylisulfidia happoa poistaviksi aineiksi.

Seuraavassa esimerkissä esitetään edullinen menetelmä peptidien syntetisoimiseksi kiintofaasimenetelmällä. 35 On tietenkin selvää, että vastaavasti lyhyemmän peptidi- 92210 10 osasen synteesi suoritetaan samalla tavalla pelkästään poistamalla tarvittava määrä aminohappoja ketjun jommasta-kummasta päästä; nykyään tuntuu kuitenkin siltä, että biologisesti aktiivisten osasten tulisi sisältää osoitettu 5 sekvenssi N-päätteellä.

Esimerkki I (Vertailuesimerkki)

Peptidin [ N“MeTyr1, D-NMA2, D-Leu23 ] -rGRF (1-43) -OH, jolla on kaava: N MeTyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-D-Leu-10 His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-

Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-OH synteesi suoritetaan vaiheittain käyttäen Beckman 990 -peptidisyntetisoijaa kloorime-tyloidulla hartsilla, jonka korvausalue on n. 0,1 - 0,5 mmoolia/g hartsia. BOC-Asn(Xan):n kytkeminen hartsiin suo-15 ritetaan yleisellä menetelmällä, joka on esitetty julkai sussa Chemistry Letters, supra, käyttäen KF:ia DMFsssa n. 60°C:ssa 24 tuntia sekoittaen, jonka seurauksena korvautuu n. 0,35 mmoolia Asn grammaa kohti hartsia.

Suojauksen poistamisen ja neutraloinnin jälkeen 20 peptidiketju rakennetaan vaihe vaiheelta hartsille. Jokai sen aminohapon suojauksen poistaminen, neutralointi ja lisääminen suoritetaan yleisesti yhdenmukaisesti menetelmän kanssa, jonka on yksityiskohtaisesti esittänyt Rivier, J., J. Amer. Chem. Soc., 96, 2986 - 2992 (1974). Kaikista 25 liuottimista, joita käytetään, poistetaan kaasut huolelli sesti suihkuttamalla inertillä kaasulla, esim. heliumilla tai typellä hapen, joka saattaisi ei-toivotulla tavalla hapettaa Met-tähteen rikin, poissaolon takaamiseksi.

Suojauksen poistaminen suoritetaan edullisesti seu-30 raavan ohjelman A mukaisesti:

Ohjelma A

Reagenssi Sekoittamisaika (min) 1. 60 % TFA/2 % etaaniditiolia 10 2. 60 % TFA/2 % etaaniditiolia 15 35 3. IPA/1 % etaaniditiolia 0,5

9221 O

11 4. EtjN (10 %) CH2Cl2:ssa 0,5 5. MeOH 0,5 6. Et3N (10 %) CH2Cl2:ssa 0,5 7. MeOH (kahdesti) 0,5 5 8. CH2C12 (kahdesti) 0,5

Kytkemiset suoritetaan edullisesti kuten seuraavas-sa ohjelmassa B esitetään:

Ohjelma B

Reagenssi Sekoittamisaika (min)

10 9. DCCI

10. Boc-aminohappo 50-90 11. MeOH (kahdesti) 0,5 12. CH2C12 (kahdesti) 0,5 13. Ac20 (3M) CH2Cl2:ssa 15,0 15 14. CH2C12 0,5 15. MeOH 0,5 16. CH2C12 (kahdesti) 0,5

Lyhyesti esitettynä käytetään yhdestä kahteen mmoo-lia BOC-suojattua aminohappoa metyleenikloridissa grammaa 20 kohti hartsia, plus yksi ekvivalentti 1,0 moolista DCCI metyleenikloridissa kahden tunnin aikana. Kun BOC-Arg(TOS) kytketään, käytetään seosta, jossa on 50 % DMF ja metylee-nikloridia. Bzl-eetteriä käytetään hydroksyyli-sivuketju-suojaryhmänä Serslle ja Thrslle. Asn:n tai Gln:n amidoryh-25 mä suojataan Xan:lla, kun käytetään DCC-kytkentää, mikä on edullista. P-nitrofenyyliesteriä (ONp) voidaan myös käyttää aktivoimaan Asn:n tai Gin:n karboksyylipää ja esimerkiksi BOC-Asn(ONp) voidaan kytkeä yli yön käyttäen yhtä ekvivalenttia HOBt DMF:n ja metyleenikloridin 50 %:sessa 30 seoksessa, jossa tapauksessa DCC:tä ei lisätä. 2-kloori-bentsyylioksikarbonyyli(2Cl-Z):tä käytetään suojaryhmänä Lys-sivuketjulle. Tos:ia käytetään suojaamaan Arg:n guani-diiniryhmä ja His:n imidatsolityppi ja Glu- tai Asp-sivu-ketju-karboksyyliryhmä suojataan OBzl:lla. Tyr:n fenoli-35 hydroksyyliryhmä suojataan 2,6-diklooribentsyylillä (DCB).

• 92210 12

Synteesin lopussa saadaan seuraava yhdistelmä: BOC-NaMeTyr (X2) -D-NMA-Asp (X3) -Ala-Ile-Phe-Thr (X4) -Ser (X4) -Ser (X4) -Tyr (X2) -Arg (X6) -Arg (X6) -Ile-Leu-Gly-Gln (X5) -Leu-Tyr (X2) -Ai a-Arg (X6) -Lys (X7) -Leu-D-Leu-His (X) -Glu (X3) -Ile-5 Met-Asn (Xs) -Arg (Xs) -Gin (X5) -Gly-Glu (X3) -Arg (X4) -Arg (Xs) -Phe-

Asn(X5)-X9, jossa X2 on DCB, X3 on OBzl, X4 on Bzl, Xs on Xan, X6 on Tos, X7 on 2Cl-z ja X9 on -0-CH2-hartsikannin. Xan on voitu osittain tai kokonaan poistaa TFA-käsittelyl-lä, jota käytettiin α-aminosuojaryhmän poistamiseen.

10 Suojatun peptidihartsin pilkkomiseksi ja suojauksen poistamiseksi sitä käsitellään 1,5 ml:11a anisolia, 0,5 ml:11a metyylietyylisulfidia ja 15 ml:11a fluorivetyä (HF) grammaa kohti peptidihartsia, -20°C:ssa puoli tuntia ja 0°C:ssa puoli tuntia. HF:n poistamisen jälkeen suurtyhjössä 15 hartsipeptidijäännös pestään vuorotellen kuivalla dietyy- lieetterillä ja kloroformilla ja peptidi uutetaan sitten 2N vesipitoisella etikkahapolla, josta kaasut on poistettu ja erotetaan hartsista suodattamalla. Pilkottu peptidi, josta suojaus on poistettu, liuotetaan sitten 0,5 %:seen 20 etikkahappoon ja puhdistetaan, mikä voi tapahtua Sephadex G-50 hienogeelisuodatuksella.

Peptidiä puhdistetaan sitten edelleen valmistavalla tai puolivalmistavalla HPLC:lla, kuten Rivier et ai., Peptides: Structure and Biological Function (1979), sivut 25 125-8 ja Marki et ai., J. Am. Chem. Soc. 103, 3178 (1981) ovat selostaneet. Hylsyjä, jotka sopivat Waters Associates prep LC-500:n, käytetään 15 - 20 u C18 Silicalla Vydacista (300 A). CH3CN:n gradientti TEAP:ssa kehitetään pienpaine Eldex-gradientin tekijällä, kuten on selostanut Rivier J., 30 J. Liq. Cromatography 1, 343 - 367 (1978). Kromatografija-keita tarkkaillaan huolellisesti HPLC:lla ja ainoastaan ne jakeet, jotka ovat olennaisen puhtaita, yhdistetään. Suolan poisto puhdistetuista jakeista, jotka on itsenäisesti tarkistettu puhtauden suhteen, suoritetaan CH3CN:n gradien-35 tiliä 0,1 %:sessa TFA:ssa. Keskijae lyofiloidaan sitten 92210 13 antamaan haluttu peptidi, jonka puhtaus voi olla yli 98 %.

Synteesi toistetaan käyttäen MBHA-hartsia antamaan sama peptidi, jolla on amidoitu C-pääte, käyttäen alkume-netelmää, jonka ovat yleisesti selostaneet Vale et ai. US-5 patentissa nro 4 292 313, Asn:n liittämiseksi MBHA-hart-siin.

Esimerkki II

hGRF-analogiosasen [D-NMA2, Nle27]-hGRF( l-29)-NH2:n, jolla on kaava: H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-10 Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-

Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-NH2, synteesi suoritetaan vaiheittain käyttäen Beckman 990 Peptide Synthesizeria MBHA-hart-silla, kuten ovat yleisesti selostaneet Vale et ai. US-patentissa nro 4 292 313. Peptidin arvostellaan olevan 15 pääasiallisesti puhdas käyttäen TLC:aa ja HPLC:aa.

Synteesi toistetaan [D-NMA2, Nle27]-hGRF(l-27)-NH2:n valmistamiseksi.

Esimerkki III

[D-NMA2, Nle27]-rGRF(l-29)-NH2:n, jolla on kaava: 20 H-His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-

Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-NH2, synteesi suoritetaan vaiheittain käyttäen Beckman 990 Peptide Synthesizeria MBHA-hartsilla kuten esimerkissä II. Peptidin arvostellaan olevan pääasialli-25 sesti puhdas käyttäen TLC:aa ja HPLC:aa.

Esimerkki IV

[D-NMA2, Nle27]-pGRF(1-29)-NH2:n, jolla on kaava: H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-30 Ser-Arg-NH2, synteesi suoritetaan vaiheittain käyttäen

Beckman 990 Peptide Synthesizeria MBHA-hartsilla, kuten ovat yleisesti selostaneet Vale et ai. US-patentissa nro 4 292 313. Peptidin arvostellaan olevan pääasiallisesti puhdas käyttäen TLC:aa ja HPLC:aa.

35 Esimerkki V

14 9221 0 [D-NMA2, Nle27]-bGRF(l-29)-NH2:n, jolla on kaava: H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Asn-Arg-NH2, synteesi suoritetaan vaiheittain käyttäen Beckman 5 990 Peptide Synthesizeria MBHA-hartsilla, kuten yleisesti ovat selostaneet Vale et ai. US-patentissa 4 292 313. Peptidin arvostellaan olevan pääasiallisesti puhdas käyttäen TLC:aa ja HPLC:aa.

Synteesi toistetaan [D-NMA2, Vai13, Ser18]-rGRF(Ι-ΙΟ 29)-NH2:n valmistamiseksi.

Esimerkki VI

[D-NMA2, Nle27, D-Arg29]-pGRF( 1-29)-NH2:n, jolla on kaava: H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-

Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-15 Ile-Nle-Ser-D-Arg-NH2, synteesi suoritetaan vaiheittain

käyttäen Beckman 990 Peptide Synthesizeria MBHA-hartsilla, kuten ovat yleisesti selostaneet Vale et ai. US-patentissa 4 292 313. Peptidin arvostellaan olevan pääasiallisesti puhdas käyttäen TLC:aa ja HPLC:aa. Asetaattisuola valmis-20 tetaan sitten liuottamalla peptidi veteen ja lisäämällä IN

etikkahappoa. Saatu liuos lyofiloidaan antamaan etikkahap-posuola.

Esimerkki VII

hGRF-analogin [D-NMA2, Nle27, D-Arg29 ]-hGRF( 1-29)-25 NH2:n, jolla on kaava: H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-

Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-D-Arg-NH2, synteesi suoritetaan vaiheittain käyttäen Beckman 990 Peptide Synthesizeria MBHA-hartsilla, kuten esimerkissä II. Tämän analogin ar-30 vostellaan olevan pääasiallisesti puhdas käyttäen TLC:aa ja HPLC:aa.

Esimerkki VIII

[D-Leu14, Nle27]-rGRF(l-29)-NH2:n, jolla on kaava: H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-D-35 Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Nle- il 92210 15

Asn-Arg-NH2, synteesi suoritetaan vaiheittain käyttäen Beckman 990 Peptide Synthesizeria MBHA-hartsilla, kuten esimerkissä II. Peptidin arvostellaan olevan pääasiallisesti puhdas käyttäen TLC:aa ja HPLCraa.

5 Synteesi toistetaan [D-NMA2, D-Leu14, Nle27]- rGRF(1-29 )-NH2:n valmistamiseksi.

Esimerkki IX

hGRF-analogin [D-NMA2, Nle27, Asn28] -hGRF( 1-29 )-NH2:n, jolla on kaava: H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-10 Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-

Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Asn-Arg-NH2, synteesi suoritetaan vaiheittain käyttäen Beckman 990 Peptide Synthesizeria MBHA-hartsilla, kuten esimerkissä II. Peptidin arvostellaan olevan pääasiallisesti puhdas käyttäen TLC:aa ja HPLC:aa. 15 Esimerkki X

[Nle27, D-Arg29] -rGRF( 1-29 )-NH2:n, jolla on kaava: H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Nle-Asn-D-Arg-NH2, synteesi suoritetaan vaiheittain käyttäen Beckman 20 990 Peptide Synthesizeria MBHA-hartsilla, kuten esimerkis sä II. Peptidin arvostellaan olevan pääasiallisesti puhdas käyttäen TLC:aa ja HPLC:aa.

Esimerkki XI

hGRF-analogiosasen [D-NMA2, D-Tyr10, Nle27]-hGRF-25 (1-29)-NH2:n, jolla on kaava: H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-

Thr-Asn-Ser-D-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-NH2, synteesi suoritetaan vaiheittain käyttäen Beckman 990 Peptide Synthesizeria MBHA-hartsilla, kuten esimerkissä II. Peptidin arvos-:* 30 teilaan olevan pääasiallisesti puhdas käyttäen TLC:aa ja HPLC:aa.

Esimerkki XII

hGRF-analogiosasen, D-NMA2, Nle27-hGRF( 1-29 )-NHEt:n, jolla on kaava: H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser- 35 Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu- • « « 16 92210

Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-NHCH2CH3, synteesi suoritetaan vaiheittain käyttäen Beckman 990 Peptide Synthesizeria kloo-rimetyloidulla hartsilla, kuten esimerkissä I. Peptidi pilkotaan hartsista ammonalyysillä käsittelemällä etyyli-5 amiinilla. Peptidin arvostellaan olevan pääasiallisesti puhdas käyttäen TLC:aa ja HPLC:aa.

Esimerkki XIII

[D-Leu14, Nle27]-rGRF( 1-29 )-NH2:n, jolla on kaava: H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-D-10 Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Nle-

Asn-Arg-NH2/ synteesi suoritetaan vaiheittain käyttäen Beckman 990 Peptide Synthesizeria MBHA-hartsilla, kuten esimerkissä II.

Peptidin arvostellaan olevan pääasiallisesti puhdas 15 käyttäen TLC:aa ja HPLCiaa.

Esimerkki XIV

hGRF-analogiosasen [His1, D-NMA2, Nle27]-hGRF( 1-29)-NH2:n, jolla on kaava: H-His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-20 Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-NH2, synteesi suoritetaan vai heittain käyttäen Beckman 990 Peptide Synthesizeria MBHA-hartsilla, kuten esimerkissä II. Peptidin arvostellaan olevan pääasiallisesti puhdas käyttäen TLC:aa ja HPLC:aa.

·· Synteesi toistetaan kahdesti [His1, Nle27, D-Arg29]- 25 hGRF(1-27)-NH2:n valmistamiseksi.

Esimerkeissä valmistettuja synteettisiä peptidejä verrataan synteettiseen hpGRF(l-40)-0H:hon in vitro-ana-lyyseissä ja niillä havaitaan yleensä olevan suuremmat tehot GH:n eritystä varten ja samanlaiset luontaiset ak- 30 tiivisuudet.

Kaikkien näiden synteettisten peptidien katsotaan olevan biologisesti aktiivisia ja tehokkaasti käyttökelpoisia aivolisäkkeen GH-vapauttamisen stimulointiin.

Tiettyjen edustavien synteettisten peptidien suh-35 teellisen tehokkuuden määrittämiseksi kasvuhormonin va- * 92210 17 pauttamisen edistämiseksi suoritetaan in vitro-määrityksiä käyttäen synteettistä hpGRF(l-40)-OH:ta standardina rinnakkaisessa vertailussa vastaavien analogien, jotka on syntetisoitu, ekvimolaaristen pitoisuuksien kanssa. Käyte-5 tään viljelyjä, jotka sisältävät soluja rotan aivolisäkkeistä, jotka on poistettu n. 3 - 5 päivää aikaisemmin. Tällaisia viljelyjä pidetään optimaalisina kasvuhormonin erittämistä varten ja niitä käytetään vertailevaan testaamiseen yleisellä tavalla, jonka ovat selostaneet Vale et 10 ai., Endocrinology, 91, 562 - 572 (1972) ja yksityiskohtaisemmin selostaneet Vale et ai., Endocrinology, 112, 1553 - 1555 (1983). Inkubointi testattavan aineen kanssa suoritetaan 3-4 tunnissa ja viljelyväliaineen tasaosia poistetaan ja käsitellään niiden immunoreaktiivisen GH:n 15 (irGH) mittaamiseksi hyvin luonnehditulla radioimmunoana-lyysillä.

Tulokset tästä vertailevasta testauksesta ekvimo-laarisille pitoisuuksille on esitetty taulukossa I, jossa myös on esitetty yhdisteiden optinen kierto.

20

Taulukko I

Peptidi In vitro-koe Optinen _ Vertailu-% kierto 25 _ [a]” c=l 1 % etikka-happoa

hGRF(1-40)-OH

30 (standardi tätä koetta varten) 100 % [D-NMA2, Nle27]-hGRF(l-29)-NH2 1330 % - 57,9° [D-NMA2, Nle27] -hGRF(1-27)-NH2 150 % - 56,8° [D-NMA2, N le27 ] -hGRF (1-29) -NHEt 1130 % - 57,0° [D-NMA2, Nle27, Asn2']-hGRF(1-29)-NH2 520 % - 57,6° 35 [D-Leu1*, Nle27]-rGRF(1-29)-NH2 120 % - 52,6° [Nle27, D-Arg2*]-rGRF(1-29)-NH2 386 % - 52,7° [D-NMA2, Nle27]-rGRF(1-29)-NH2 900 % - 51,9° [D-NMA2, D-Tyr10, Nle27]-hGRF-(1-29)-NH2 270% -56,7° [D-NMA2, Nle27, D-Arg”]-hGRF-(1-29)-NH2 580% -57,8° 40 [His1, D-NMA2, Nle27]-hGRF(1-29)-NH2 260 % - 57,3° 92210 18 Näiden synteettisten peptidien in vitro-testaus osoittaa, että niillä on yllättäen suurempi biologinen tehokkuus kuin hpGRF(l-40)-OH:lla, esimerkiksi pienin tehokas pitoisuus [D-NMA2, Nle27]-hGRF( l-29)-NH2: lie on n. 1 pi-5 komoolinen.

In vitro-testien kasvuhormonin erittämisen suhteen lisäksi in vivo-kokeissa ruiskutetaan näitä synteettisiä peptidejä laskimonsisäisesti uretaani-nukutettuihin urospuolisiin rottiin ja määritetään, että ne tukahduttavat 10 spontaanin GH-erityksen poistamatta vastetta oksegeenisel- le GRF:lie. Verinäytteitä otetaan välittömästi ennen ruiskeita ja 10, 30 ja 90 minuuttia ruiskeiden jälkeen. GH-tasot veressä, mitattuina radioimmunoanalyysillä osoittavat, että synteettinen [D-NMA2, Nle27]-hGRF(l-29)-NH2 on 15 noin kuusi kertaa tehokkaampi kuin hGRF(1-40)-OH aivo-lisäke-GH:n verotasojen suhteen mitattuina sekä 10 että 30 minuutin kuluttua IV:n ruiskeesta. Muita tunnettuja GRF in vivo-testejä, joiden tiedetään olevan tehokkaita havaitsemaan GH-eritys, käytetään näiden tulosten vahvistamiseksi. 20 Annoksia väliltä n. 50 nanogrammaa - n. 5 mikrogrammaa näitä peptidejä/kg kehon painoa pidetään tehokkaina aikaansaamaan GH-eritys. Jotkut peptidit, jotka osoittavat in vitro biologista tehoa, joka on yhtä suuri tai jopa pienempi kuin standardilla, osoittavat in vivo tehokkuut-25 ta, joka on paljon suurempi.

Tällaisten synteettisten hGRF-analogien ja mahdollisesti rGRF-, bGRF- ja pGRF-analogien tulisi olla hyödyllisiä ihmiskäyttöön, kun lääkäri haluaa lisätä GH-tuotan-toa. GH-erityksen kiihottaminen tällaisilla analogeilla on 30 kiinnostavaa potilailla, joilla on täydellinen tai suhteellinen GH-puutos, joka aiheutuu endogeenisen GRF:n ali-tuotannosta. Lisäksi on todennäköistä, että lisääntynyt GH-eritys ja siihen liittyvä lisäys kasvussa voitaisiin saavuttaa ihmisillä tai eläimillä, joilla on normaalit GH-35 tasot. Lisäksi antaminen muuttaisi kehon rasvasisältöä ja 92210 19 muuntelisi muita GH:sta riippuvia aineenvaihdunnallisia, immunologisia ja kehityksellisiä prosesseja. Esimerkiksi, nämä analogit voivat olla hyödyllisiä välineenä stimuloida anabolisia prosesseja ihmisissä olosuhteissa, jotka seu-.5 raavat palohaavojen saamista. Toisena esimerkkinä näitä analogeja voidaan antaa lämminverisille kotitalouseläimil-le kuten kananpojille, kalkkunoille, porsaille, vuohille, karjalle ja lampaille ja niitä voidaan käyttää vesivilje-lyksessä kalojen ja muiden kylmäveristen merieläinten, 10 esim. merikilpikonnien ja ankeriaiden sekä sammakkoeläinten kasvattamiseen, kiihdyttämään kasvua ja nostamaan pro-teiini/rasva-suhdetta, mihin päästään syöttämällä tehokkaita määriä peptidejä.

Ihmisille antamista varten näiden synteettisten 15 peptidien puhtauden tulisi olla vähintään n. 93 % ja edullisesti vähintään 98 %. Puhtaus tarkoittaa tämän hakemuksen tarkoituksia varten aiottua peptidiä, joka muodostaa todetun paino-%:n kaikista läsnä olevista peptideistä ja peptidiosasista. Tällaisten synteettisten peptidien anta-20 mistä varten kotitalous- ja muille eläimille niiden kasvun edistämiseksi ja rasvapitoisuuden pienentämiseksi voi niinkin pieni puhtaus kuin n. 5 % tai jopa niinkin pieni kuin 0,01 % olla hyväksyttävä.

Näitä synteettisiä peptidejä tai niiden ei-myrkyl-25 lisiä suoloja, yhdistettyinä farmaseuttisesti tai eläin lääketieteellisestä hyväksyttävän kantimen kanssa farmaseuttisen yhdistelmän muodostamiseksi, voidaan antaa eläimille, ihmiset mukaan lukien, joko laskimonsisäisesti, ihonalaisesti, lihaksensisäisesti, ihon kautta, esimerkik-30 si nenänsisäisesti tai myös suun kautta. Lääkäri voi käyttää tätä antamista kiihdyttämään GH:n vapautumista, kun käsiteltävä isäntä on tällaisen terapeuttisen käsittelyn tarpeessa. Tarvittava annos vaihtelee nimenomaisen käsiteltävän tilan, tilan vakavuuden ja halutun käsittelyn 35 kestoajan mukaan.

20

‘ίιΐ λ O

Tällaisia peptidejä annetaan usein ei-myrkyllisten suolojen kuten happoadditiosuolojen tai metallikompleksien muodossa, esim. sinkin, raudan yms. kanssa (joita pidetään suoloina tämän hakemuksen tarkoituksia varten). Kuvaavia 5 , tällaisia happoadditiosuoloja ovat hydrokloridi, hydrobro- midi, sulfaatti, fosfaatti, maleaatti, asetaatti, sitraat-ti, bentsoaatti, sukkinaatti, malaatti, askorbaatti, tart-raatti jne. Jos vaikuttava aineosa on annettava suun kautta tabletin muodossa, tabletti voi sisältää sideainetta, 10 kuten traganttia, maissitärkkelystä tai gelatiinia; hajo-tusainetta, kuten algiinihappoa; ja liukuainetta, kuten magnesiumstearaattia. Jos halutaan antamista nestemäisessä muodossa, voidaan käyttää makeuttamista ja/tai maustamista ja laskimonsisäinen antaminen tapahtuu isotonisessa suola-15 liuoksessa, fosfaattipuskuriliuoksissa tms.

Näitä peptidejä tulisi antaa ihmisille lääkärin ohjauksen alaisena ja farmaseuttiset yhdistelmät sisältävät tavallisesti peptidiä yhdessä jonkin tavanomaisen, kiinteän tai nestemäisen, farmaseuttisesti hyväksyttävän kan-20 timen kanssa. Tavallinen ruoansulatuskanavan ulkopuolinen annos on n. 0,01:stä n. 1 mikrogrammaan peptidiä/kg isännän kehon painoa.

Vaikka keksintöä on selostettu sen edullisten suoritusmuotojen suhteen, jotka muodostavat keksijöiden tällä 25 hetkellä tunteman parhaan tavan, on selvää, että erilaisia muutoksia ja muunnoksia, jotka olisivat ilmeisiä alaan perehtyneelle, voidaan tehdä poikkeamatta keksinnön piiristä, joka esitetään oheisissa patenttivaatimuksissa. Esimerkiksi muutoksia peptidiketjuun, erityisesti poisjättöjä 30 alkaen peptidin karboksyylipäätteestä ja ulottuen noin asemaan -27, voidaan tehdä nykyisin tunnetun kokeellisen käytännön mukaisesti peptidien tai peptidiosasten muodostamiseksi, jotka säilyttävät kaikki tai hyvin olennaiset osat peptidin biologisesta vaikutuksesta ja tällaisten 35 peptidien katsotaan kuuluvan keksinnön piiriin. Lisäksi

II

21 ^ j 0 jompaankumpaan päätteeseen tai kumpaankin päätteeseen voidaan tehdä lisäyksiä ja/tai yleisesti samanarvoiset tähteet voidaan korvata luonnossa esiintyvillä tähteillä, kuten peptidikemiassa yleisesti on hyvin tunnettua, muiden 5 analogien tuottamiseksi, joilla on ainakin olennainen osa vaaditun polypeptidin tehosta. Lisäksi muunnoksia voidaan tehdä edulliseen -NH2-ryhmään C-päätteellä nykytekniikan tason mukaisesti esimerkiksi aminohappotähteen C-päätteellä karboksyyliosa voi olla radikaali -COOR, -CRO, 10 -CONHNHR, -CON(R) (R') tai -CH2OR, jolloin R ja R' ovat alempi alkyyli, fluori-alempi alkyyli tai vety, sillä tällaisista muunnoksista on tuloksena samanarvoisia synteettisiä peptidejä.

Claims (6)

22 9. z I ϋ

1. Menetelmä farmaseuttisesti käyttökelpoisten kasvuhormonia vapauttavan tekijän synteettisten peptidianalo- 5 gien valmistamiseksi, joilla on sekvenssi: R1-R2-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-R8-Ser-R10-Arg-R12-R13-R14-Gly-Gln-Leu-R18-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-R24-R25-Ile-Nle-R28-R29 -NHR, jossa R3 on Tyr tai His; R2 on Ala tai D-NMA; R8 on Ser tai Asn; R10 on Tyr tai D-Tyr; R12 on Arg tai Lys; R13 on Ile tai 10 Vai; R14 on Leu tai D-Leu; R18 on Tyr tai Ser; R24 on His tai Gin; R25 on Glu tai Asp; R2B on Asn tai Ser; R29 on Arg tai D-Arg; ja R on H tai CH2CH3; edellyttäen kuitenkin, että R29 tai R28 - R29 voidaan jättää pois, ja edellyttäen myöskin, että R2 on D-NMA ja/tai R14 on D-Leu ja/tai R29 on D-Arg, 15 tunnettu siitä, että (a) muodostetaan välituote-peptidi, jossa on ainakin yksi suojaryhmä ja jolla on kaava (II) tai sen tarkoituksenmukaisesti lyhennetty muunnos: X1-R1 (X tai X2 )-R2-Asp( X3 ) -Ala-Ile-Phe-Thr( X4 )-R8( X4 tai X5)-Ser (X4 )-R10( X2 )-Arg( X6) -R12( X6 tai X7 )-R13-R14-Gly-Gln( X5 )-Leu-20 R18(X2 tai X4) -Ala-Arg( X6 )-Lys( X7 )-Leu-Leu-R24( X tai X5)-R25- (X3)-Ile-Nle-R28(X4 tai X5)-R29(X6)-X9 jossa: X, X1, X2, X3, X4, X5, X6 ja X7 ovat kukin joko vety tai suojaryhmä ja X9 on joko suojaryhmä tai kiinnittävä sidos hartsikantimeen tai on des-X9, jossa tapauksessa C-pääte on NHR, (b) pilkotaan 25 suojaryhmä tai -ryhmät tai kiinnittävä sidos kaavan (II) mukaisesta peptidistä; ja puhdistetaan saatu peptidi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R2 on D-NMA.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että R29 on D-Arg.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R14 on D-Leu.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R2 on D-NMA ja R28 on Asn. 92210 23

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan synteettinen peptidi, jolla on kaava: H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-

5 Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-NH2. 9 2 ? 1 O 24