FI89499C - Foerfarande foer framstaellning av terapeutiskt anvaendbar peptid - Google Patents
Foerfarande foer framstaellning av terapeutiskt anvaendbar peptid Download PDFInfo
- Publication number
- FI89499C FI89499C FI882305A FI882305A FI89499C FI 89499 C FI89499 C FI 89499C FI 882305 A FI882305 A FI 882305A FI 882305 A FI882305 A FI 882305A FI 89499 C FI89499 C FI 89499C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- arg
- leu
- ala
- lys
- ser
- Prior art date
Links
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 title description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 153
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 75
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 75
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims description 44
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 41
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 23
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 20
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 16
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 16
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 12
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 12
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 11
- KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N D-lysine Chemical compound NCCCC[C@@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N 0.000 claims description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 10
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 claims description 8
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 7
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 claims description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 57
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 54
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 42
- -1 Phe Chemical compound 0.000 description 30
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 24
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 24
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 24
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 21
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 13
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 12
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 10
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 10
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical group C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 7
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 7
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 7
- XKCWNEVAXQCMGP-RXMQYKEDSA-N (2R)-2-amino-5-[carbamimidoyl(methyl)amino]pentanoic acid Chemical compound CN(CCC[C@@H](N)C(O)=O)C(N)=N XKCWNEVAXQCMGP-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 6
- OUYCCCASQSFEME-MRVPVSSYSA-N D-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-MRVPVSSYSA-N 0.000 description 6
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 6
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 6
- SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 2-aminopentanoic acid Chemical compound CCCC(N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-SCSAIBSYSA-N D-arginine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 5
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 5
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 1,1-ethanedithiol Chemical compound CC(S)S DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N anisole Chemical compound COC1=CC=CC=C1 RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 4
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 4
- 229910000040 hydrogen fluoride Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N D-alanine Chemical compound C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-RXMQYKEDSA-N D-histidine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-SCSAIBSYSA-N D-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-MRVPVSSYSA-N D-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-MRVPVSSYSA-N 0.000 description 3
- SGCGMORCWLEJNZ-UWVGGRQHSA-N His-His Chemical compound C([C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C([O-])=O)C1=CN=CN1 SGCGMORCWLEJNZ-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 101100109397 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) arg-8 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 3
- 108010036509 somatotropin releasing factor 40 Proteins 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- WBIIPXYJAMICNU-AWEZNQCLSA-N (2s)-5-[amino-[(4-methylphenyl)sulfonylamino]methylidene]azaniumyl-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]pentanoate Chemical compound CC1=CC=C(S(=O)(=O)NC(N)=NCCC[C@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C(O)=O)C=C1 WBIIPXYJAMICNU-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- 241000252073 Anguilliformes Species 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N D-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- ULEBESPCVWBNIF-BYPYZUCNSA-N L-arginine amide Chemical compound NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N ULEBESPCVWBNIF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 125000000393 L-methionino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])C([H])([H])C(SC([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- KAESVJOAVNADME-UHFFFAOYSA-N Pyrrole Chemical compound C=1C=CNC=1 KAESVJOAVNADME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 101100187187 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) NMA2 gene Proteins 0.000 description 2
- 159000000021 acetate salts Chemical class 0.000 description 2
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 2
- 125000005076 adamantyloxycarbonyl group Chemical group C12(CC3CC(CC(C1)C3)C2)OC(=O)* 0.000 description 2
- 150000001370 alpha-amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 235000008206 alpha-amino acids Nutrition 0.000 description 2
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 2
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 2
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 2
- XYWDPYKBIRQXQS-UHFFFAOYSA-N di-isopropyl sulphide Natural products CC(C)SC(C)C XYWDPYKBIRQXQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 125000005519 fluorenylmethyloxycarbonyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000003709 fluoroalkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 2
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 2
- 230000002267 hypothalamic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000005461 lubrication Methods 0.000 description 2
- UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N methoxybenzene Substances CCCCOC=C UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WXEHBUMAEPOYKP-UHFFFAOYSA-N methylsulfanylethane Chemical compound CCSC WXEHBUMAEPOYKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 239000003488 releasing hormone Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 125000001412 tetrahydropyranyl group Chemical group 0.000 description 2
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004042 4-aminobutyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000416162 Astragalus gummifer Species 0.000 description 1
- 125000006847 BOC protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000270617 Cheloniidae Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- 125000002237 D-aspartyl group Chemical group [H]OC(=O)[C@]([H])(N([H])[H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 125000002849 D-tyrosine group Chemical group [H]N([H])[C@@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C1=C([H])C([H])=C(O[H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N Hydrogen bromide Chemical compound Br CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N L-2-aminopentanoic acid Chemical compound CCC[C@H](N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100170937 Mus musculus Dnmt1 gene Proteins 0.000 description 1
- SCIFESDRCALIIM-VIFPVBQESA-N N-methyl-L-phenylalanine Chemical compound C[NH2+][C@H](C([O-])=O)CC1=CC=CC=C1 SCIFESDRCALIIM-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 240000008881 Oenanthe javanica Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001615 Tragacanth Polymers 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940022663 acetate Drugs 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004453 alkoxycarbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001195 anabolic effect Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 229940072107 ascorbate Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 229940050390 benzoate Drugs 0.000 description 1
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 229940001468 citrate Drugs 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- UNXNGGMLCSMSLH-UHFFFAOYSA-N dihydrogen phosphate;triethylazanium Chemical compound OP(O)(O)=O.CCN(CC)CC UNXNGGMLCSMSLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 125000003754 ethoxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC)* 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- BEBCJVAWIBVWNZ-UHFFFAOYSA-N glycinamide Chemical compound NCC(N)=O BEBCJVAWIBVWNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002260 hypophysiotrophic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000960 hypophysis hormone Substances 0.000 description 1
- 230000037189 immune system physiology Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000005928 isopropyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(OC(*)=O)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940049920 malate Drugs 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N malic acid Chemical compound OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- MGJXBDMLVWIYOQ-UHFFFAOYSA-N methylazanide Chemical compound [NH-]C MGJXBDMLVWIYOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UPXAZUFKXWLNMF-UHFFFAOYSA-N n'-propan-2-ylmethanediimine Chemical compound CC(C)N=C=N UPXAZUFKXWLNMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N phenylmethyl ester of formic acid Natural products O=COCC1=CC=CC=C1 UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000011894 semi-preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N serine phosphoethanolamine Chemical compound [NH3+]CCOP([O-])(=O)OCC([NH3+])C([O-])=O UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 229940086735 succinate Drugs 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 229940095064 tartrate Drugs 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N urethane group Chemical group NC(=O)OCC JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/60—Growth hormone-releasing factor [GH-RF], i.e. somatoliberin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
1 89499
Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen peptidin valmistamiseksi
Esillä oleva keksintö koskee menetelmää terapeutti-5 sesti käyttökelpoisten peptidien valmistamiseksi, joilla peptideillä on vaikutusta aivolisäkkeen toimintaan ihmisillä ja muilla eläimillä. Erikoisesti valmistetaan peptidejä, jotka edistävät kasvuhormonin vapautumista aivolisäkkeestä.
10 Fysiologit ovat kauan tienneet, että hypotalamus säätelee aivolisäkkeen etulohkon erityistoimintoja hypotalamuksen tuottamilla erikoisaineilla, jotka stimuloivat tai inhiboivat kunkin aivolisäkehormonin eritystä. Hypotalamuksen inhibiittoritekijä tunnistettiin 1972 somatosta-15 tiiniksi, joka inhiboi kasvuhormonin (GH) eritystä. 1982 eristettiin ihmisen haimakasvainuutteista ihmisen haiman (kasvain) vapauttavat tekijät (hpGRF), ne puhdistettiin, karakterisoitiin, syntetisoitiin ja testattiin ja niiden havaittiin edistävän GH:n vapautumista aivolisäkkeestä. 20 Molempia näitä hypofysiotrooppisia tekijöitä on tuotettu ! täysin syntetisoimalla ja analogit luonnollisille raken teille on syntetisoitu. Ihmisen hypotalamuksen GH:ta va-pauttavalla tekijällä on tarkalleen sama rakenne; näin . . ; ollen termiä hGRF käytetään tästä eteenpäin.
25 Synteettisiä polypeptidejä, jotka vapauttavat GH:ta viljellyistä aivolisäkesoluista, jotka omaavat kohonneen vastustuskyvyn entsymaattiselle hajotukselle kehossa ja joilla on erittäin oleellisesti kohonnut aktiivisuus, on nyt syntetisoitu ja testattu. Uskotaan, että nämä edulli-30 set ominaisuudet johtuvat peptideistä, joilla on kohonneen stabiliteetin omaava alfa-helikaalinen muoto. Näillä pep-tideillä on edullisesti kohdissa 10, 13, 19 ja 22 ainakin yksi ryhmä, jonka alfa-hiiliatomi (C"Me) on substituoitu metyyliryhmällä, ja edullisimmin useat näistä ryhmistä - 35 ovat tällä tavoin substituoitu. D-Ala, N“CH3-D-Ala (D-NMA) 2 89499 tai NMA voivat olla substituoitu kohtaan 2. Kohdassa 21 on edullisesti joko D-Lys tai D-Arg, ja kohdassa 27 on edullisesti läsnä Nle. Kohtaan 8 on edullisimmin substituoitu Lys, mutta joko Arg, Ser, Glu tai Asp voi 5 myös olla substituoitu. Peptideillä voi myös olla yksi seuraavista ryhmistä kohdassa 1: Tyr, D-Tyr, Met, Phe, D-Phe, pCl-Phe, Leu, His ja D-His, jolla ryhmällä voi vaihtoehtoisesti olla metyylisubstituentti joko alfa-hiilessä tai alfa-aminoryhmässä, tai alfa-aminoryhmä voi olla pois-10 tettu (desamino); tämän ryhmän alfa-aminoryhmä voi myös olla asyloitu, edullisesti asetyylillä (Ac) tai formyylil-lä (For). Peptideillä voi vaihtoehtoisesti olla D-Asp kohdassa 3 ja/tai Arg kohdassa 12 ja/tai Phe tai D-Tyr kohdassa 10 ja/tai Ala kohdassa 15. Niillä voi myös olla D-15 Met tai Nva tai muita ryhmiä Met:n sijasta kohdassa 27 ja/tai Asn:n sijasta kohdassa 28. Ryhmä kohdissa 13 ja 22 voi olla mikä tahansa seuraavista: Leu, Ile, Ala ja Vai.
Analogeista, jotka sisältävät noin 29 - 44 ryhmää, tai mistä tahansa näiden myrkyttömistä suoloista, voidaan 20 muodostaa farmaseuttisia koostumuksia dispergoimalla ne farmaseuttisesti tai eläinlääketieteellisesti hyväksyttävään liuokseen tai kiinteään kantajaan. Farmaseuttisia koostumuksia voidaan käyttää kliinisessä lääketieteessä, sekä ihmisillä että eläimillä, terapeuttisiin tarkoituk-25 siin ja myös diagnostisesti. Lisäksi niitä voidaan käyttää edistämään lämminveristen eläinten kasvua, mukaan lukien siipikarja ja kylmäveristen eläinten kasvua, esim. kalojen, ankeriaiden jne., vesiviljelyssä.
Peptidien määrittelyssä käytetty nimistö on sama, 30 joka on esitetty teoksessa Schroeder & Lubke, "The Peptides", Academic Press (1965), jossa tavanomaisen esityksen mukaisesti N-päässä oleva aminoryhmä sijaitsee vasemmalla ja C-pään karboksyyliryhmä oikealla. Luonnollisella aminohapolla tarkoitetaan yhtä yleisistä, luonnollisesti esiin-35 tyvistä aminohapoista, joita löytyy proteiineista ja joi-
Il I
3 Λ 9 4 C· 9 hin kuuluvat aminohapot Gly, Ala, Vai, Leu, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp ja His. Nle tarkoittaa norleusiinia ja Nva tarkoittaa nor-valiinia. Jos aminohapporyhmällä on isomeerisiä muotoja, 5 aminohapon L-muoto on esitetty ellei erikoisesti toisin ole osoitettu. D-NMA tarkoittaa alaniinin D-isomeeriä, jossa alfa-aminoryhmä on substituoitu metyylillä.
Yleisesti kuvataan seuraavan sekvenssin omaavat synteettiset peptidit: (B) R!-R2-R3-Ala-I le-Phe-Thr-Rx-Ser- 10 (Qi) RK)-Arg-Rl2- (Q2) R13-Leu-Rl5-Gln-Leu-R1!(- (Q,) Ala-Arg-R21-(Q4) R22-Leu-R24-R25-Ile-R27-R2K-Arg-Gln-Gln-Glu-R34-Asn-Gln-Glu-R7X-Rw-R„,-Arg-R42-R4,-R44-, jossa R, on Tyr, D-Tyr, Met, D-Met, Phe, D-Phe, pCl-Phe, Leu, His, tai D-His; B on H, C"Me, N"Me, desamino, Ac tai For; R2 on Ala, D-Ala, NMA tai ΟΙ 5 NMA; R3 on Asp tai D-Asp; R8 on Ser, Asn, Lys, Arg, Asp tai
Glu; Rl0 on Tyr, D-Tyr tai Phe; R,2 on Arg tai Lys; Rn on Ile, Vai, Leu tai Ala; R1S on Gly tai Ala; R|s on Ser tai Tyr; R,, on Lys, D-Lys, Arg tai D-Arg; R22 on Leu, Ile, Ala tai Vai; R24 on Gin tai His; R25 on Asp tai Glu; R27 on Met, 20 D-Met, Ala, Nle, Ile, Leu, Nva tai Vai; R2ii on Asn tai Ser; R34 on Ser tai Arg; R3S on Arg tai Gin; Rw on Gly tai Arg; R4(l on Ala tai Ser; R42 on Phe, Ala tai Vai; R4, on Asn tai Arg; R*, on luonnollinen aminohappo; Q-Q4 on joko H tai C"Me, edellyttäen kuitenkin, että mikä tahansa tai kaikki 25 ryhmät välillä R^-R^, ne mukaan lukien, voi olla poistettu, ja edellyttäen myös, että ainakin yksi ryhmistä Q,-Q4 on C'Me ja/tai R„ on Lys tai Arg tai Asp tai Glu ja/tai R21 on D-Lys tai D-Arg.
Peptideillä tulisi edullisesti olla sekvenssi: 30 (B) R,-R2-R.,-Ala-Ile-Phe-Thr-R8-Ser- (Q) Rl0-Arg-R12- (Q) R13-Leu- R15-Gln-Leu-Ser-(Q3) Ala-Arg-R21- (Q4) R22-Leu-Gln-Asp-Ile-R27-R28-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-R^-R.,,-R.44, jossa R, on Tyr, D-Tyr, Met, Phe, D-Phe, pCl-Phe, Leu, His tai D-His; B on H, C^Me, N"Me, desamino, Ac tai For; R2 35 on Ala, D-Ala, NMA tai D-NMA; R3 on Asp tai D-Asp; Rx on ♦ 89499
Ser, Asn, Lys, Arg, Asp tai Glu; Rlo on Tyr, D-Tyr tai Phe; R,2 on Arg tai Lys; R13 on Ile, Val, Leu tai Ala; R1S on Gly tai Ala; R2l on Lys, D-lys, Arg tai D-Arg; R22 on Leu, lie, Ala tai Val; R27 on Met, D-Met, Ala, Nle, lie, Leu, Nva tai 5 Vai; R28 on Asn tai Ser; R« on Phe, Ala tai Val; R^ on Asn tai Arg; R^ on luonnollinen aminohappo; (2,-¾ on joko H tai C"Me, edellyttäen kuitenkin, että mikä tahansa tai kaikki ryhmät Rjq-r^, ne mukaan lukien, voi olla poistettu. Mieluummin ainakin yksi ryhmistä Q,-Q4 on C“Me; Rg on edulli-10 sesti Lys tai Asp tai Glu tai Arg; ja R21 on edullisesti D-Lys tai D-Arg. C-pään aminohapporyhmän karboksyyliosa voi olla mikä tahansa seuraavista radikaaleista: -COOR, -CR0, -CONHNHR, -CON(R)(R') tai -CH2OR, joissa R ja R' on alempi alkyyli, alempi fluorialkyyli tai vety; metyyli, etyyli ja 15 propyyli ovat edullisia alempia alkyyliryhmiä. Kun Met on kohdassa 1, voi olla suositeltavaa, että toinen ryhmä on kohdassa 27.
Fragmenteilla, jotka ulottuvat N-päästä ryhmän 29 kohdalle, on biologista tehoa GH:n vapautumiseen aivo-20 lisäkkeestä, ja 29 tai 32 ryhmän pituiset biologisesti aktiiviset fragmentit, joilla on C-pää, joka on amidi tai substituoitu amidi, ovat edullisia. Kun peptidillä on 40 ryhmää tai enemmän, ei C-pään rakenteelle ole mitään selvää suositusta.
25 Tämä keksintö koskee menetelmää edellä esitetyn kaavan piiriin sisältyvien terapeuttisesti käyttökelpoisten peptidien ja niiden myrkyttömien suolojen valmistamiseksi, joilla peptideillä on sekvenssi (I): (N"Me) Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Rg-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-3 0 Leu-R15-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-R21-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-R2g-
Arg-NH2, jossa RH on Asn, Lys tai Asp, R,j on Gly tai Ala, R21 on Lys tai D-Lys, R?K on Asn tai Ser, edellyttäen, että Rg on Lys tai Asp ja/tai R;i on D-Lys. Uudet kaavan (I) mukaiset pep-35 tidit eroavat tunnetuista yhdisteistä asemissa Rx ja R21 olevien aminohappojen osalta.
I; 5 89499
Keksinnön mukaiselle menetemälle kaavan (I) mukaisten peptidien ja niiden myrkyttömien suolojen valmistamiseksi on tunnusomaista että (i) yksittäiset aminohapot tai lyhyet peptidit kytketään ainakin osittain kiinteäfaasime-5 netelmällä yhdisteen muodostamiseksi, jolla on ainakin yksi suojaryhmä ja seuraava kaava (II): X1- (N"Me) Tyr (X2) -Ala-Asp (X3) -Ala-I le-Phe-Thr (X4) -Rg(X8) -Ser (X4) -Tyr (X2) -Arg(X6) -Lys(X7) -Val-Leu-R15-Gln (X5) -Leu-Ser (X2) -Ala-Arg (X6) -R21 (X7) -Leu-Leu-Gin (X5) -Asp(X3) -Ile-Nle-10 R^fX4 tai X5) -Arg (X6) -X9, jossa (X), (X1), (X2), (X3), (X4), (X5), (X6), (X7) ja (X8) ovat kukin joko vety tai suojaryhmä ja (X9) on ankkuroiva sidos hartsiin, (ii) käsitellään sopivalla reagenssilla suojaryhmän tai -ryhmien poistamiseksi kyseisestä kaavan 15 (II) mukaisesta yhdisteestä ja sen poistamiseksi ankkuroivasta sidoksesta, jolloin muodostuu sekvenssin (I) mukainen peptidi ja, jos halutaan, (iii) saatu peptidi saatetaan reagoimaan sopivalla hapolla tai vastaavalla peptidin myrkyttömän additiosuolan valmistamiseksi.
20 Peptidit syntetisoidaan sopivalla menetelmällä, kuten yksinomaan kiinteäfaasitekniikoilla, osittaisilla kiinteätaasitekniikoilla, fragmenttien kondensaatiolla tai klassisella sidosten valmistuksella liuoksessa. Äskettäin kehitettyjä yhdistelmä-DNA-tekniikoita voidaan käyttää hy-25 väksi vain luonnollisia aminohapporyhmiä sisältävän ana-logiosan valmistuksessa, joka sitten voidaan yhdistää lyhyeen N-pään peptidiin. Esimerkiksi yksinomaan kiinteä-faasitekniikat on esitetty teoksessa "Solid-Phase Peptide Synthesis", Stewart & Young, Freeman & Co., San Francisco, 30 1969, ja niitä on kuvattu US-patentin 4 105 603 esimer keissä, Vale et ai. Klassinen liuossynteesi on kuvattu yksityiskohtaisesti teoksessa "Methoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl): Synthese von Peptiden", E. Wunsch (toimittaja), (1974) Georg Thieme Verlag, Stuttgart, L-35 Saksa. Fragmenttien kondensaatio-synteesimenetelmä on esi- 6 89499 tetty US-patentin 3 972 859 esimerkeissä. Muut käyttökelpoiset synteesit on kuvattu US-patentissa 3 842 067 ja US-patentissa 3 862 925.
Yhteistä näille synteeseille on eri aminohappojen 5 labiilien sivuketjuryhmien suojaaminen sopivilla suojaryh-millä, jotka estävät kemiallisen reaktion tapahtumisen sillä kohdalla siihen asti, kunnes ryhmä lopulta poistetaan. Tavallisesti on myös yhteistä aminohapon tai fragmentin alfa-aminoryhmän suojaaminen sillä aikaa, kun kolo konaisuus reagoi karboksyyliryhmästään, jota seuraa alfa-aminosuojaryhmän poistaminen, mikä sallii seuraavan reaktion tapahtumisen siinä kohdassa. Niin ollen on yhteistä, että yhtenä askeleena synteesissä on väliyhdisteen tuottaminen, jossa väliyhdisteessä kukin aminohapporyhmä sijait-15 see halutussa kohdassa peptidiketjussa sivuketjusuojaryh-mien ollessa sidottuna sopiviin ryhmiin.
Tässä suhteessa esillä oleva keksintö tarjoaa kaavan (II) mukaisia välituotteita X1- (N"Me) Tyr (X2) -Ala-Asp (X3) -Ala-Ile-Phe-Thr (X4) -R* (X8) -20 Ser (X4) -Tyr (X2) -Arg(X6) -Lys (X7)-Val-Leu-R15-Gln (X5) -Leu-Ser-(X2) -Ala-Arg(X6) -R21 (X7) -Leu-Leu-Gin(X5) -Asp(X3) -Ile-Nle-R28(X4 tai X5)-Arg(X6)-X9, jossa (X), (X1), (X2), (X3), (X4), (X5), (X6), (X7) ja (X8) ovat kukin joko vety tai suojaryhmä sillä edellytyksellä, 25 että ainakin yksi niistä on suojaryhmä, ja (X9) on ankkuroiva sidos hartsiin. x':n esittämät a-aminosuojaryhmät ovat niitä, joiden hyvin tiedetään olevan käyttökelpoisia vaiheittaisessa polypeptidien synteesissä, a-aminosuoja-ryhmien joukossa, joita voidaan käyttää x':nä, ovat (1) 30 aromaattiset uretaanityyppiset suojaryhmät, kuten fluo-renyylimetyylioksikarbonyyli (FMOC), bentsyylioksikarbo-nyyli (Z) ja substituoitu Z, kuten p-klooribentsyylioksi-karbonyyli, p-nitrobentsyylioksikarbonyyli, p-bromibent-syylioksikarbonyyli ja p-metoksibentsyylioksikarbonyyli; 35 (2) alifaattiset uretaanisuojaryhmät, kuten t-butyylioksi- li 7 89499 karbonyyli (BOC), di-isopropyylimetyylioksikarbonyyli, isopropyylioksikarbonyyli, etoksikarbonyy1i, alkyylioksi-karbonyyli; ja (3) sykloalkyyli-uretaanityyppiset suoja-ryhmät, kuten syklopentyylioksikarbonyyli, adamantyyliok-5 sikarbonyyli ja sykloheksyylioksikarbonyyli. Edullinen a-aminosuojaryhmä on BOC, jopa silloin, kun kohdassa 1 on N"Me-substituoitu ryhmä.
X2 voi olla Tyr:in fenolisen hydroksyyliryhmän sopiva suojaryhmä, kuten tetrahydropyranyyli, tert-butyyli, 10 trityyli Bzl, CBZ, 4Br-CBZ ja 2,6-diklooribentsyyli (DCB). Edullinen suojaryhmä on 2,6-diklooribentsyyli. X2 voi olla vety, joka tarkoittaa, että tällä kohdalla olevassa amino-happoryhmässä ei ole sivuketjun suojaryhmää.
X3 on vety tai Aspiin karboksyyliryhmän sopiva este-15 rin muodostava suojaryhmä, kuten bentsyyli (OBzl), 2,6- diklooribentsyyli, metyyli tai etyyli.
X4 voi olla Thriin tai Seriin hydroksyyliryhmän sopiva suojaryhmä, kuten asetyyli, bentsoyyli, tert-butyyli, trityyli, tetrahydropyranyyli, Bzl, 2,6-diklooribentsyyli 20 ja CBZ. Suositeltava suojaryhmä on Bzl. X4 voi olla vety, joka tarkoittaa, että hydroksyyliryhmässä ei ole suojaryhmää .
X5 on vety tai Asn:in tai Giniin sivuketjuaminoryh-män sopiva suojaryhmä. Se on edullisesti ksantyyli (Xan). 25 X6 on Argiin guanidoryhmän sopiva suojaryhmä, kuten nitro, Tos, CBZ, adamantyylioksikarbonyyli ja BOC, tai se on vety.
X7 on vety tai Lysiin sivuketjuaminoryhmän sopiva suojaryhmä. Esimerkkeinä sopivista sivuketjuaminoryhmien 30 suojaryhmistä ovat 2-klooribentsyylioksikarbonyyli (2C1- Z), Tos, t-amyylioksikarbonyyli ja BOC.
X8 on vety tai edellä yleisesti esitetty sopiva sivuketjun suojausryhmä.
Met voidaan vaihtoehtoisesti suojata hapella, mutta 35 se jätetään edullisesti suojaamatta.
β 89499
Sivuketjun aminon suojaryhmän valinta ei ole kriittistä, paitsi että yleensä valitaan sellainen, jota ei poisteta a-aminoryhmien suojausta poistettaessa synteesin aikana. Kuitenkin joillekin aminohapoille, esim. Hisille, 5 suojaus ei yleensä ole välttämätöntä sen jälkeen, kun kytkeminen on suoritettu loppuun ja suojaryhmät voivat olla samoja.
X9 on C-pään ankkuroiva sidos, jota käytetään kiin-teäfaasisynteesissä kiinteään hartsikantajaan kiinnitet-10 täessä. Kun käytetään kiinteää hartsikantajaa, se voi olla mikä tahansa alalla tunnetuista, kuten sellainen, jolla on kaava: -0-CH2-hartsikantaja, -NH-bentshydryyliamiini (BHA)-hartsikantaja tai -NH-parametyylibentshydryyliamiini (MBHA)-hartsikantaja. Kun halutaan ei-substituoitu amidi, 15 BHA:n tai MBHA:n käyttö on suositeltavaa, koska katkaiseminen antaa suoraan amidin. Tapauksessa, jossa halutaan N-metyyliamidi, se voidaan muodostaa N-metyyli-BHA-hart-sista. Jos halutaan muita substituoituja amideja, voidaan käyttää US-patentin 4 569 967 neuvoja, tai jos C-päähän 20 halutaan vielä joitain muita ryhmiä kuin vapaata happoa, voi olla parempi syntetisoida peptidi klassisia menetelmiä käyttäen, kuten on esitetty Houben-Weyl' in artikkelissa. Välituotteessa ainakin yksi ryhmistä X on suojaryhmä tai X9 sisältää hartsikantajän.
25 Valittaessa peptidien synteesissä käytettävää tiet tyä sivuketjun suojaryhmää, käytetään seuraavia yleisiä sääntöjä: (a) suojaryhmä edullisesti säilyttää suojaavat ominaisuutensa eikä irtoa sitoutumisolosuhteissa, (b) suojaryhmän tulisi olla stabiili reagenssin suhteen ja, poik-30 keuksena Xan, olla edullisesti stabiili reaktio-olosuhteissa, jotka on valittu a-aminosuojaryhmien poistamiseksi kussakin synteesivaiheessa, ja (c) sivuketjun suojaryhmän täytyy olla poistettavissa halutun aminohapposekvenssin sisältävän synteesin valmistuttua reaktio-olosuhteissa, 35 jotka eivät muuta peptidiketjua ei-toivotusti.
li ; 9 39499
Kun peptidejä ei valmisteta yhdistelmä-DNA-tekniik-kaa käyttäen, ne valmistetaan edullisesti käyttäen kiin-teäfaasisynteesiä, kuten sellaista, jonka on yleisesti kuvannut Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85, 2149 (1963), 5 vaikka myös muita alalla tunnettuja vastaavia kemiallisia synteesejä voidaan käyttää, kuten on aiemmin mainittu. Kiinteäfaasisynteesi aloitetaan peptidin C-päästä liittämällä suojattu α-aminohappo sopivaan hartsiin. Lähtömateriaali voidaan valmistaa kiinnittämällä a-aminosuojattu 10 aminohappo esterisidoksella kloorimetyloituun hartsiin tai hydroksimetyylihartsiin, tai amidisidoksella BHA-hartsiin tai MBHA-hartsiin. Hydroksimetyylihartsin valmistuksen ovat kuvanneet Bodansky et ai., Chem. Ind., (London) 38, 1597-98 (1966). Kloorimetyloituja hartseja on kaupallises-15 ti saatavana yhtiöiltä Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifornia ja Lab. Systems, Inc. Tällaisen hartsin valmistuksen ovat kuvanneet Stewart et ai., "Solid-Phase Peptide Synthesis" (Freeman & Co., San Francisco, 1969), kappale 1, 1-6. BHA- ja MBHA-hartsikantajia on kaupallisesti saa-20 tavana ja käytetään yleisesti vain silloin, kun halutulla syntetisoitavalla polypeptidillä on C-päässä ei-substitu-oitu amidi.
BOCrlla tai Xanrlla suojattu C-pään aminohappo, esim. Asn, voidaan ensin sitoa kloorimetyloituun hartsiin 25 K. Horiki et ai., Chemistry Letters, 165-168 (1978) kuvaamaan menetelmän mukaan käyttäen KF:ää DMF:ssä noin 60 °C:-ssa 24 tuntia sekoittaen esimerkiksi silloin, kun syntetisoidaan 43 vapaan happoryhmän pituinen rotan GRF (rGRF)-analogi. Kun BOC-suojattu aminohappo on sidottu hartsikan-30 tajaan, α-aminon suojaryhmä poistetaan käyttäen trifluo-rietikkahappoa (TFA) metyleenikloridissä tai TFAtta yksinään. Suojaus poistetaan O °C:een ja huoneen lämpötilan välisessä lämpötilassa. Muita spesifisiä α-aminon suoja-ryhmien vakiopoistoreagensseja, kuten HC1 dioksaanissa, ja 35 poisto-olosuhteita voidaan käyttää, kuten on kuvattu teok- 10 89 4 99 sessa Schroder & Lubke, "The Peptides", 1, 72-75 (Academic Press, 1965).
α-aminon suojaryhmän poiston jälkeen jäljelle jääneet α-amino- ja sivuketjusuojatut aminohapot sidotaan 5 vaiheittain halutussa järjestyksessä aiemmin määritellyn välituotteen saamiseksi, tai vaihtoehtona kunkin aminohapon lisäämiselle erikseen, jotkin niistä voidaan kytkeä toisiinsa ennen lisäystä kiinteätaasireaktoriin. Sopivan sitomisreagenssin valinta kuuluu alan taitoihin. Erikoisen 10 sopiva sitomisreagenssi on N,N'disykloheksyylikarbodi-imi- di (DCCI).
Peptidien kiinteätaasisynteesissä käytetyt akti-vointireagenssit ovat peptidialalla hyvin tunnettuja. Esimerkkejä sopivista aktivointireagensseista ovat karbodi-15 imidit, kuten N,N'-isopropyylikarbodi-imidi ja N-etyyli-Nr-(3-dimetyyliaminopropyyli)karbodi-imidi. Muita akti-vointireagensseja ja niiden käyttöä peptidien sitomisessa ovat kuvanneet Schroder & Lubke, supra, kappaleessa III ja Kapoor, J. Phar. Sei., 59, 1-27 (1070).
20 Kukin suojattu aminohappo tai aminohapposekvenssi laitetaan kiinteäfaasireaktoriin noin nelinkertaisena tai suurempana ylimääränä ja sitominen voidaan suorittaa dime-tyyliformamidi (DMF): CH2C12 (1:1)-liuoksessa tai DMF:ssä tai CH2Cl2:ssa yksinään. Tapauksissa, jolloin tapahtuu epä-25 täydellistä sitomista, sitomismenetelmä toistetaan ennen seuraavan aminohapon sitomista tapahtuvaa a-aminohapon suojaryhmän poistamista. Sitomisreaktion onnistuminen kussakin synteesivaiheessa, jos se tehdään käsin, tarkastetaan edullisesti ninhydriinireaktiolla, kuten ovat kuvan-30 neet E. Kaiser et ai., Anal. Biochem. , 34, 595 (1970).
Sitomisreaktiot voidaan suorittaa automaattisesti, kuten tapahtuu automaattisessa Beckman 990 syntetisaattorissa, käyttäen sellaista ohjelmaa, jonka ovat esittäneet Rivier et ai., Biopolymers, 1978, 17, 1927-1938.
11 39499
Kun haluttu aminohapposekvenssi on saatu valmiiksi, peptidivälituote voidaan poistaa hartsikantajasta käsittelemällä se reagenssilla, kuten nestemäisellä vetyfluori-dilla, joka ei ainoastaan irroita peptidiä hartsista vaan 5 myös irroittaa kaikki jäljellä olevat sivuketjujen suoja-ryhmät X2, X1, X4, X5, X6, X7 ja Xs ja ankkuroivan sidoksen X9 ja myös α-aminon suojaryhmän X1, jos sitä on käytetty niin, että saadaan peptidi vapaan hapon muodossa. Jos Met:ia on läsnä sekvenssissä, poistetaan ensin edullisesti BOC-suo-10 jaryhmä käyttäen trifluorietikkahappoa (TFA)/ etaanidi-tiolia ennen peptidin irroittamista hartsista HF:llä mahdollisen S-alkylaation estämiseksi. Kun irroittamiseen käytetään vetyfluoridia, reaktioastiaan lisätään anisolia tai metyylietyylisulfidia puhdistajaksi.
15 Seuraava esimerkki I esittää edullisen menetelmän peptidien syntetisoimiseksi kiinteäfaasitekniikalla. On tietysti ymmärrettävä, että vastaavasti pitemmän peptidin synteesi tehdään samalla tavalla ainoastaan lisäämällä tarvittava määrä aminohappoja ketjun C-päähän. Tällä het-20 kellä oletetaan, että biologisesti aktiivisilla fragmenteilla pitäisi olla osoitettu sekvenssi N-päässä ja ryhmien lisäämistä N-päähän ei pidetä edullisena.
Esimerkki I
Peptidin (JTMeTyr1, Asp8, Ala15, Nle27, Asn28) -hGRF(1-25 29)-NH2, jolla on kaava: N“MeTyr-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-
Asp-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Asn-Arg-NHj, synteesi suoritettiin kaupallisesti saatavalla MBHA-hartsilla vaiheittain käyttäen Beckman 990 peptidisyntetisaattoria, kuten yleisesti 30 ovat kuvanneet Vale et ai. US-patentissa 4 292 313. BOC-Arg-(Tos):n sitominen hartsiin johtaa noin 0,35 mmol:in substituutioon Arg:ia grammaa kohti hartsia.
Suojauksen poiston ja neutraloinnin jälkeen pepti-diketju rakennettiin vaihe vaiheelta hartsille. Suojauksen 35 poisto, neutralointi ja kunkin aminohapon lisäys suoritet- 12 89499 tiin yleisesti menetelmän mukaan, jonka on yksityiskohtaisesti kuvannut Rivier, J., J. Amer. Chem. Soc., 96, 2986-2992 (1974) . Kaikista käytetyistä liuottimista poistettiin kaasu huolellisesti käsittelemällä inertillä kaasulla, 5 esim. heliumilla tai typellä, jotta varmistettiin hapen, joka voisi ei-toivotusti hapettaa Met-ryhmän rikin, poissaolo.
Suojauksen poisto suoritetaan edullisesti seuraavan taulukon A mukaisesti: 10
Taulukko A
Reaaenssi Sekoitusaika(min) 1. 60% TFA/2% etaaniditioli 10 15 2. 60% TFA/2% etaaniditioli 15 3. 1PA/1% etaaniditioli 0,5 4. Et3N (10%) CH2C12: ssa 0,5 5. MeOH 0,5 6. EtjN (10%) CH2C12: ssa 0,5 20 7. MeOH (kahdesti) 0,5 8. CH2C12 (kahdesti) 0,5
Sitomiset suoritetaan edullisesti seuraavan taulukon B mukaisesti: 25 Taulukko
Reaaenssi Sekoitusaika(min)
9. DCCI
10. BOC-aminohappo 50-90 30 II. MeOH (kahdesti) 0,5 12. CH2C12 (kahdesti) 0,5 13. Ac20 ( 3M) CH2C12: ssa 15,0 14. CH2C12 0,5 15. MeOH 0,5 3 5 16. CH.Cl, (kahdesti) 0,5 li ; 13 8 9 4 99
Lyhyesti, 1-2 mmol BOC-suojattua aminohappoa mety-leenikloridissa käytetään grammaa kohti hartsia sekä yksi ekvivalentti 1,0 molaarista DCCIitä metyleenikloridissa kahden tunnin ajan. Kun sidotaan BOC-Arg(Tos), käytetään 5 50 % DMF ja metyleenikloridi-seosta. Ser:in ja Thr:in hyd- roksyylisivuketjun suojaryhmänä käytetään Bzl-eetteriä. Asn:in ja Giniin amidoryhmä suojataan Xanilla käytettäessä suositeltavaa DCC-sitomista. P-nitrofenyyliesteriä (ONp) voidaan myös käyttää aktivoimaan Asm in ja Giniin voidaan 10 sitoa yön yli käyttäen yhtä ekvivalenttia HOBita 50 % DMFin ja metyleenikloridin seoksessa, missä tapauksessa yhtään DCCitä ei lisätä. Lysiin sivuketjun suojaryhmänä käytetään 2-klooribentsyylioksikarbonyyliä (2C1-Z) . Tosi ia käytetään suojaamaan Argiin guanidoryhmää ja Hisiin imi-15 datsolin typpeä, ja Gluiin tai Aspiin sivuketjun karbok-syyliryhmä suojataan OBzlillä. Tyriin fenolinen hydroksyy-liryhmä suojataan 2,6-diklooribentsyylillä (DCB). Synteesin lopussa saadaan seuraava koostumusi BOC-N“MeTyr (X2) -Ala-Asp (X3) -Ala-Ile-Phe-Thr (X4) -Asp(X3) -Ser (X4) -Tyr (X2) -20 Arg (X6) -Lys (X7) -Val-Leu-Ala-Gln (X5) -Leu-Ser (X4) -Ala-Arg (X6) -Lys (X7) -Leu-Leu-Gin (Xs) -Asp (X3) -Ile-Nle-Asn (X5) -Arg (X6) -X9, jossa X2 on DCB, X3 on OBzl, X4 on Bzl, X5 on Xan, X6 on Tos, X7 o 2C1-Z ja X9 on NH-MBHA-hartsikantaja. Xan voi olla osittain tai kokonaan poistettu a-aminoryhmän suojauksen 25 opistossa käytetyllä TFA-käsittelyllä.
Suojatun peptidi-hartsin irroittamiseksi ja suojan poistamiseksi sitä käsitellään 1,5 milliä anisolia, 0,5 milliä metyylietyylisulfidia ja 15 milliä vetyfluoridia (HF) grammaa kohti peptidi-hartsia -20 °Cissa puoli tuntia 30 ja 0 °Cissa puoli tuntia. HFin poistamisen jälkeen kor keassa vakuumissa, jäljelle jäänyt peptidi-hartsi pestään vuorotellen kuivalla dietyylieetterillä ja kloroformilla, ja sitten peptidi uutetaan 2N vesipitoisella etikkahapol-la, josta kaasut on poistettu, ja erotetaan hartsista suo-35 dattamalla.
14 89499
Irrotettu ja suojaamaton peptidi liuotetaan sitten 0-5 % etikkahappoon ja suoritetaan puhdistus, joka voi sisältää Sephadex G-50 geelisuodatuksen.
Peptidi puhdistetaan sitten edelleen preparatiivi-5 sella tai puolipreparatiivisella HPLC:llä, kuten ovat kuvanneet Rivier et ai., Peptides: Structure and Biological Function, (1979), 125-8 ja Marki et ai., J. Am. Chem. Soc. 103, 3178 (1981). Waters Associates'in prep LC-500 sopivat patruunat pakattiin Vydac'in (300A) 15-20 μπι C18-Silica:n 10 kanssa. Valmistettiin CH3CN gradientti TEAP:ssa matalanpai-neen Eldex-gradientintekolaitteella, kuten on kuvannut Rivier, J., J. Lig. Chromatography, 1, 343-367 (1978). Kromatografiset fraktiot tarkistettiin huolellisesti HPLCillä ja vain oleellisesti puhtaat fraktiot yhdistettiin. Suolo-15 jen poisto puhdistetuista fraktioista, joiden puhtaus on tarkastettu toisistaan riippumattomasti, saatiin aikaan käyttämällä 0,1 % TFA:ssa olevaa CH3-CN-gradienttia. Sitten huippu lyofilisoitiin, jotta saatiin haluttu peptidi, jonka puhtaus voi olla suurempi kuin 98 %.
20 Esimerkki II
40 ryhmän pituisen amidoidun peptidin (C^eHis1, D-NMA2, D—Ly s21) -hGRF (1-40) -NH2, jolla on kaava: H-C"MeHis-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-D-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-25 Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-NH2 synteesi suoritettiin MBHA-hartsilla vaiheittain käyttäen Beckman 990-peptidisyntetisaattoria, kuten yleisesti ovat kuvanneet Vale et ai. US-patentissa 4 292 313. Peptidin pääteltiin olevan oleellisesti puhdas käyttäen TLC:tä ja HPLC:-30 tä.
Esimerkki III
(D-NMA2, D-Lys21, Nle27) -rGRF(1-43) -OH, jolla on kaava H-His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-D-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Nle-35 Asn-Aro-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-
Il i is 8 9 4 99
Phe-Asn-OH synteesi suoritettiin vaiheittain käyttäen Beckman 990-peptidisyntetisaattoria, käyttäen kloorimety-loitua hartsia ja aloitus-sitomisreaktiota, kuten on kuvattu julkaisussa Chemistry Letters, supra, ja siitä läh-5 tien tavalla, joka on yleisesti kuvattu esimerkissä I. Peptidin pääteltiin olevan oleellisesti puhdas käyttäen TLC:tä ja HPLC:tä.
Esimerkki IV
hGRF-analogifragmentin (N"MeTyr‘, Lyss, Ala15, Nle27, 10 Asn28) -hGRF(1-29) -NH2, jolla on kaava: N“MeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Lys-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Asn-Arg-NH2 synteesi suoritettiin MBHA-hartsilla vaiheittain käyttäen Beckman 990-peptidisyntetisaattoria, kuten 15 esimerkissä I. Tämän anlogin pääteltiin olevan oleellisesti puhdas käyttäen TLC:tä ja HPLC:tä
Synteesi toistettiin vaihtaen N-pään ryhmä tuottaen peptidi (JTMeHis1) , Lys8, Ala15, Nle27, Asn:*) -hGRF(1-29) -NH2.
20 Esimerkki V
hGRF-analogifragmentin (N^eTyr1, D-Lys21, Nle27)-hGRF(l-29)NH2, jolla on kaava: N“MeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-D-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-NH2 synteesi suoritet-25 tiin MBHA-hartsilla vaiheittain käyttäen Beckman 990-peptidisyntetisaattoria, kuten esimerkissä I. Peptidin pääteltiin olevan oleellisesti puhdas käyttäen TLC:tä ja HPLC:tä.
Esimerkki VI
3 0 (N"MeHis‘, D-NMA2, Lys8, D-Arg21, Nle27)-rGRF( 1-29) NH2, jolla on kaava: N"Me-His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Lys-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-D-Arg-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-NH2 synteesi suoritettiin MBHA-hartsilla vaiheittain käyttäen Beckman 990-peptidisynte-35 tisaattoria, kuten esimerkissä I. Peptidin pääteltiin olevan oleellisesti puhdas käyttäen TLC:tä ja HPLC:tä.
16 <39499
Esimerkki VII
tTMeTyr1, D-Tyr'°, D-Lys21, Nle27) -hGRF(1-29) -NH2, jolla on kaava: N"MeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-D-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-D-Lys-Leu-Leu-5 Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-NH2 synteesi suoritettiin MBHA-hartsilla vaiheittain käyttäen Beckman 990-peptidisynte-tisaattoria, kuten esimerkissä I. Peptidin pääteltiin olevan oleellisesti puhdas käyttäen TLC:tä ja HPLCrtä.
Esimerkki VIII
10 (D-NMA2, Asp8, D-Lys21, Nva27) -rGRF (1-29) -NH2, jolla on kaava: H-His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Arg-
Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-D-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Nva-Asn-Arg-NH2 synteesi suoritettiin MBHA-hartsilla vaiheittain käyttäen Beckman 990-peptidisyntetisaattoria, 15 kuten esimerkissä I. Peptidin pääteltiin olevan oleellisesti puhdas käyttäen TLC:tä ja HPLC:tä.
Esimerkki IX
(D-Phe1, D-NMA2, Glu8, C“MeTyr10 Ile13, D-Lys21)-hGRF (1- 32)-NH2, jolla on kaava: H-D-Phe-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr- 2 0 Glu-Ser-C”MeTyr-Arg-Lys-I le-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-D-
Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2 synteesi suoritettiin MBHA-hartsilla vaiheittain käyttäen Beckman 990-peptidisyntetisaattoria, kuten yleisesti ovat kuvanneet Vale et ai. US-patentissa 4 292 313. Peptidin pää-25 teltiin olevan oleellisesti puhdas käyttäen TLC:tä ja HPLC:tä.
Esimerkki X
(pCl-Phe1, D-NMA2, D-Lys21, Vai22, Asp25, Ile27)-rGRF(1-29)-NH2, jolla on kaava: H-pCl-Phe-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe- 3 0 Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-D-
Lys-Val-Leu-His-Asp-Ile-Ile-Asn-Arg-NH2 synteesi suoritettiin MBHA-hartsilla vaiheittain käyttäen Beckman 990-peptidisyntetisaattoria, tavalla joka on yleisesti kuvattu esimerkissä I. Peptidin pääteltiin olevan oleellisesti 35 puhdas käyttäen TLC:tä ja HPLC:tä.
17 3 9 4 S 9
Esimerkki XI
(C^MeLeu1 D-NMA2, D-Asp3, Lys8, D-Lys21, Ala22) -hGRF(1-32)-NH2, jolla on kaava: H-C"MeLeu-D-NMA-D-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Lys-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-D-5 Lys-Ala-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2 syntee si suoritettiin MBHA-hartsilla vaiheittain käyttäen Beckman 990-peptidisyntetisaattoria, kuten esimerkissä I. Tämän analogin pääteltiin olevan oleellisesti puhdas käyttäen TLC:tä ja HPLC:tä.
10 Esimerkki XII
(D-Tyr1, D-NMA2, D-Asp3, C"Me-D-Tyr'°, Ala13, D-Arg21, CTMeVal22, D-Met27)-hGRF(1-29)-NH2/ jolla on kaava: H-D-Tyr-D-NMA-D-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-CMe-D-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-D-Arg-C“MeVal-Leu-Gln-Asp-Ile-15 D-Met-Ser-Arg-NH2 synteesi suoritettiin MBHA-hartsilla vai heittain käyttäen Beckman 990-peptidisyntetisaattoria, kuten esimerkissä I. Tämän analogin pääteltiin olevan oleellisesti puhdas käyttäen TLC:tä ja HPLC:tä.
Esimerkki XIII
20 (D-His1, D-NMA2 Lys8, Leu13, D-Lys21, Ala27)-rGRF (1-29) - NH2, jolla on kaava: H-D-His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Lys-Ser-Tyr-Arg-Arg-Leu-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-D-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Ala-Asn-Arg-NH2 synteesi suoritettiin MBHA-hartsilla vaiheittain käyttäen Beckman 990-peptidisynte-25 tisaattoria, tavalla, joka on yleisesti kuvattu esimerkissä I. Peptidin pääteltiin olevan oleellisesti puhdas käyttäen TLC:tä ja HPLC:tä.
Esimerkki XIV
rGRF-analogifragmentin, so. (N“MeTyr‘, D-NMA2, Glu8, 30 Ala13, D-Arg21, C"MeIle22) -rGRF(1-29) -NH2, jolla on kaava: N"MeTyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Glu-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-D-Arg-C“MeIle-Leu-His-Glu-lle-Met-Asn-Arg-NH2 synteesi suoritettiin MBHA-hartsilla vaiheittain käyttäen Beckman 990-peptidisyntetisaattoria, ku-35 ten esimerkissä I. Peptidin pääteltiin olevan oleellisesti puhdas käyttäen TLC:tä ja HPLC:tä.
is 89499
Esimerkki XV
(CTMeLeu1, D-NMA2, Leu13, (C"MeAla19, D-Lys21, CTMeAla22, Ala27)-rGRF( 1-29)-NH2, jolla on kaava: H-C"MeLeu-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-ArgLeu-Leu-Gly-Gln-Leu-5 Tyr-CTMeAla-Arg-D-Lys-CTMeAla-Leu-His-Glu-Ile-Ala-Asn-Arg- NH2 synteesi suoritettiin MBHA-hartsilla vaiheittain käyttäen Beckman 990-peptidisyntetisaattoria, kuten esimerkissä I. Peptidin pääteltiin olevan oleellisesti puhdas käyttäen TLC:tä ja HPLC:tä.
10 Esimerkki XVI
(CTMePhe1, NMA2, Ly s8, Arg12, Ile13, CTMeAla19, Ile27)-hGRF(1-29)-NH2, jolla on kaava: H-CTMePhe-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Lys-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-CTMeAla-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Ile-Ser-Arg-NH2syntee-15 si suoritetaan MBHA-hartsilla vaiheittain käyttäen Beckman 990-peptidisyntetisaattoria, kuten ovat yleisesti kuvanneet Vale et ai. US-patentissa 4 292 313. Peptidin pääteltiin olevan oleellisesti puhdas käyttäen TLC:tä ja HPLC:tä.
20 Esimerkki XVII
(desaminoD-Tyr1, D-NMA2, Arg8, Phe10, CTMeVal13,
Leu27, Asn28) -hGRF (1-29) -NH2, jolla on kaava: desNH2-D-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Arg-Ser-Phe-Arg-Lys-CaMeVal-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-25 Arg-NH2 synteesi suoritettiin MBHA-hartsilla vaiheittain käyttäen Beckman 990-peptidisyntetisaattoria, kuten yleisesti ovat kuvanneet Vale et ai. US-patentissa 4 292 313. Peptidin pääteltiin olevan oleellisesti puhdas käyttäen TLC:tä ja HPLC:tä.
30 Esimerkki XVIII
(D-NMA2, CTMeTyr10, CTMeVal13, CTMeLeu22, Nle27, Asn28)-hGRF(1-29)-NH2, jolla on kaava: H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-
Phe-Thr-Asn-Ser-CTMeTyr-Arg-Lys-CMeVal-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-C"MeLeu-Leu-Gln-Asp-lle-Nle-Asp-Arg-NH2 35 synteesi suoritettiin MBHA-hartsilla vaiheittain käyttäen
Beckman 990-peptidisyntetisaattoria, kuten yleisesti ovat li ; 19 3 9 4 9 9 kuvanneet Vale et ai. US-patentissa 4 292 313. Peptidin pääteltiin olevan oleellisesti puhdas käyttäen TLC:tä ja HPLC:tä.
Esimerkki XIX
5 (C^MePhe1, D-NMA2, C“MeTyr10, CTMelle13, Vai27) -rGRF(1- 29)-NH2, jolla on kaava: H-C"MePhe-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-
Thr-Ser-Ser-C"MeTyr-Arg-Arg-C"MeIle-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Val-Asn-Arg-NH2 synteesi suoritettiin MBHA-hartsilla vaiheittain käyttäen Beckman 10 990-peptidisyntetisaattoria, kuten esimerkissä I. Peptidin pääteltiin olevan oleellisesti puhdas käyttäen TLC:tä ja HPLCrtä.
Esimerkki XX
(desaminoD-Met1, D-NMA2, CTMeTyr10, C"MeVal13, C"Me-15 Ala19, Asn28)-hGRF(l-44)-NH2, jolla on kaava: desNH2-D-Met-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-C"MeTyr-Arg-Lys-C"MeVal-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-C^MeAla-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Asn-Arg-NH2 synteesi suoritettiin MBHA-hartsilla vaiheittain käyttäen Beckman 990-peptidisyntetisaattoria, 20 kuten yleisesti ovat kuvanneet Vale et ai. US-patentissa 4 292 313. Peptidin pääteltiin olevan oleellisesti puhdas käyttäen TLC:tä ja HPLC:tä.
Esimerkki XXI
(NTVIeHis1, D-NMA2, CTMeVal13, Nle27) -hGRF (1-2 9) —NH2, 25 jolla on kaava: N"MeHis-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-
Tyr-Arg-Lys-C"MeVal-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-NH2 synteesi suoritettiin MBHA-hartsilla vaiheittain käyttäen Beckman 990-peptidisyntetisaattoria, kuten yleisesti ovat kuvanneet Vale et ai. 30 US-patentissa 4 292 313. Peptidin pääteltiin olevan oleellisesti puhdas käyttäen TLC:tä ja HPLC:tä.
Esimerkki XXII
hGRF-analogifragmentin (For-Tyr1, D-NMA2, C"MeTyr10 Cr<MeAla19, Leu27, Asn28)-hGRF(1-32)-NH2, jolla on kaava: For-3 5 Tyr-D-NMA-Asp-Ala-I le-Phe-Thr-Asn-Ser-C"MeTyr-Arg-Lys-Val-
Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-C"MeAla-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile- 20 39499
Leu-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2 synteesi suoritettiin MBHA-hartsilla vaiheittain käyttäen Beckman 990-peptidisyntetisaattoria, kuten esimerkissä I. Tämän analogin pääteltiin olevan oleellisesti puhdas käyttäen TLC:tä ja HPLC:-5 tä.
Esimerkki XXIII
(D-NMA2, Lys12, edelle13, CMeAla19, Nle27)-rGRF (1-29)-NH2, jolla on kaava: H-His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-
Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Lys-C^Melle-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-10 C"MeAla-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-NH2 syn teesi suoritettiin MBHA-hartsilla vaiheittain käyttäen Beckman 990-peptidisyntetisaattoria, kuten esimerkissä I. Peptidin pääteltiin olevan oleellisesti puhdas käyttäen TLC:tä ja HPLC:tä.
15 Esimerkki XXIV
hGRF-analogifragmentin (D-NMA2, Arg12, C“MeLeu22, Ile27)-hGRF(l-29)-NH2, jolla on kaava: H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Arg-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-C"MeLeu-Leu-Gln-Asp-Ile-Ile-Ser-Arg-NH2 syn-20 teesi suoritettiin MBHA-hartsilla vaiheittain käyttäen
Beckman 990-peptidisyntetisaattoria, kuten esimerkissä I. Peptidin pääteltiin olevan oleellisesti puhdas käyttäen TLC:tä ja HPLC:tä.
Esimerkki XXV
25 (D-Phe1, D-NMA2, C“MeVal13, Ala15, CTMeLeu22, D-Met27) - hGRF(1-29)-NH2/ jolla on kaava: H-D-Phe-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-C“MeVal-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-C“MeLeu-Leu-Gln-Asp-Ile-D-Met-Ser-Arg-NH2 synteesi suoritettiin MBHA-hartsilla vaiheittain käyttäen 30 Beckman 990-peptidisyntetisaattoria, kuten esimerkissä I.
Analogin pääteltiin olevan oleellisesti puhdas käyttäen TLC:tä ja HPLCrtä.
Esimerkki XXVI
(D-NMA2, D-Arg21-C"MeLeu22) -hGRF(l-32) -NH2, jolla on 35 kaava: H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg- I;: 21 8 9 499
Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-D-Arg-CTMeLeu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2 synteesi suoritettiin MBHA-hartsilla vaiheittain käyttäen Beckman 990-peptidi-syntetisaattoria, kuten esimerkissä I. Analogin pääteltiin 5 olevan oleellisesti puhdas käyttäen TLC:tä ja HPLC:tä. Esimerkki XXVII
(desaminoHis1, D-NMA2, Lys8, Asp25)-rGRF (1-29)-NH2, jolla on kaava: desNH2His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Lys-
Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-10 Leu-His-Asp-Ile-Met-Asn-Arg-NH2synteesi suoritettiin MBHA-hartsilla vaiheittain käyttäen Beckman 990-peptidisynte-tisaattoria, kuten esimerkissä I. Peptidin pääteltiin olevan oleellisesti puhdas käyttäen TLC:tä ja HPLC:tä. Esimerkki XXVIII
15 (Ac-D-His1, D-NMA2, Arg8, C"MeTyr'°, Nle27)-rGRF (1- 29)-NH2, jolla on kaava: Ac-D-His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe
Thr-Arg-Ser-C^MeTyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-NH2 synteesi suoritettiin MBHA-hartsilla vaiheittain käyttäen Beckman 990-20 peptidisyntetisaattoria, tavalla, joka on yleisesti kuvattu esimerkissä 1. Peptidin pääteltiin olevan oleellisesti puhdas käyttäen TLC:tä ja HPLC:tä.
Esimerkki XXIX
(D-Ala2, D-Asp3, C"MeTyr10, C“MeAla19, C“MeLeu22, 2 5 Leu27)-hGRF (1-3 2)-NH2, jolla on kaava: H-Tyr-D-Ala-D-Asp
Ala-I le-Phe-Thr-Asn-Ser-C“MeTyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln Leu-Ser-C^MeAla-Arg-Lys-CTMeLeu-Leu-Gln-Asp-I le-Leu-Ser Arg-Gln-Gln-Gly-NH2 synteesi suoritettiin MBHA-hartsilla vaiheittain käyttäen Beckman 990-peptidisyntetisaattoria, 30 kuten esimerkissä I. Tämän analogin pääteltiin olevan oleellisesti puhdas käyttäen TLC:tä ja HPLC:tä.
Esimerkki XXX
(D-Tyr1, D-NMA2, D-Asp3, Lys8, C“Me-D-Tyr10, Ala15 D-Met27) -hGRF (1-29) -NH2, jolla on kaava: H-D-Tyr-D-NMA-D
3 5 Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Lys-Ser-C"Me-D-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala
Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-D-Met-Ser-Arg- 22 39 499 NH2 synteesi suoritettiin MBHA-hartsilla vaiheittain käyttäen Beckman 990-peptidisyntetisaattoria, kuten esimerkissä I. Tämän analogin pääteltiin olevan oleellisesti puhdas käyttäen TLC:tä ja HPLC:tä.
5 Esimerkki XXXI
(D-His1, D-NMA2, Arg\ Leu13, CTMeAla19, Nle27) rGRF(1-32)-NH2, jolla on kaava: H-D-His-D-NMA-Asp-Ala-Ile Phe-Thr-Arg-Ser-Tyr-Arg-Arg-Leu-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-C^MeAla-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-Gln-Gln Gly-NH2 syn-10 teesi suoritettiin MBHA-hartsilla vaiheittain käyttäen Beckman 990-peptidisyntetisaattoria tavalla, joka on yleisesti kuvattu esimerkissä I. Peptidin pääteltiin olevan oleellisesti puhdas käyttäen TLC:tä ja HPLC:tä.
Esimerkki XXXII
15 rGRF-analogifragmentin, so. (desaminoTyr1, C“MeLeu22) -rGRF(1-29)-NH2, jolla on kaava: desNH2Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-C"MeLeu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-NH2 synteesi suoritettiin MBHA-hartsilla vaiheittain käyttäen Beckman 20 990-peptidisyntetisaattoria, kuten esimerkissä I. Peptidin pääteltiin olevan oleellisesti puhdas käyttäen TLC:tä ja HPLC:tä.
Esimerkki XXXIII
(Ac-D-Tyr1, D-NMA2, C“MeTyr10, CTMeVal13, C“MeAla19, 25 CTMeLeu22, Nle27)-hGRF(1-2 9)-NH2, jolla on kaava: Ac-D-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-C“MeTyr-Arg-Lys-CaMeVal-Leu-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-C"MeAla-Arg-Lys-C“MeLeu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-NH2 synteesi suoritettiin MBHA-hartsilla vaiheittain käyttäen Beckman 990-peptidisyntetisaatto-30 ria, kuten yleisesti ovat kuvanneet Vale et ai., US-paten-tissa 4 292 313. Peptidin pääteltiin olevan oleellisesti puhdas käyttäen TLC:tä ja HPLC:tä.
Esimerkki XXXIV
(CTMeLeu1, D-NMA2, Glu8, CTMeAla19, Glu25, Ile27)-35 rGRF(1-29)-NH2, jolla on kaava: H-C“MeLeu-D-NMA-Asp-Ala- 23 Λί 9 4 S 9
Ile-Phe-Thr-Glu-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-C"MeAla-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Ile-Asn-Arg-NH2 synteesi suoritettiin MBHA-hartsilla vaiheittain käyttäen Beckman 990-peptidisyntetisaattoria, kuten esimerkissä I.
5 Peptidin pääteltiin olevan oleellisesti puhdas käyttäen TLCttä ja HPLCrtä.
Esimerkki XXXV
(For-D-Tyr1, D-NMA2, C^MeVal13, CTMeAla19, Arg21, C“MeLeu22, Asn3*) -hGRF(1-29) -NH2/ jolla on kaava: For-D-Tyr-10 D-NMA-Aso-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-CMeVal-Leu-
Gly-Gln-Leu-Ser-C"MeAla-Arg-Arg-C“MeLeu-Leu-Gln-Asp-I le-Met-Asn-Arg-NH2 synteesi suoritettiin MBHA-hartsilla vaiheittain käyttäen Beckman 990-peptidisyntetisaattoria, kuten yleisesti ovat kuvanneet Vale et ai. US-patentissa 15 4 292 313. Peptidin pääteltiin olevan oleellisesti puhdas käyttäen TLC:tä ja HPLC:tä.
Esimerkki XXXVI
(NMA2, C MeValn, Nle27) -hGRF (1-29) -NH2, jolla on kaava : H-Tyr-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-C"Me- 20 Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-I le-
Nle-Ser-Arg-NH2 synteesi suoritettiin MBHA-hartsilla vaiheittain käyttäen Beckman 990-peptidisyntetisaattoria, kuten yleisesti ovat kuvanneet Vale et ai. US-patentissa 4 292 313. Peptidin pääteltiin olevan oleellisesti puhdas 25 käyttäen TLC:tä ja HPLC:tä. Sitten valmistettiin asetaat- tisuola liuottamalla peptidi veteen ja lisäämällä IN etik-kahappoa. Tuloksena syntynyt liuos lyofilisoitiin, jotta saatiin asetaattisuola.
Esimerkki XXXVII
30 hGRF-analogin (D-NMA2, Arg8, C“MeAla19, C“MeLeu22,
Nle27)-hGRF(1-32)-NH2, jolla on kaava: H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Arg-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-C"MeAla-Arg-Lys-C'‘MeLeu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-Gln-Gly-NH2 synteesi suoritettiin MBHA-hartsilla vaiheittain 35 käyttäen Beckman 990-peptidisyntetisaattoria, kuten esi- 24 89499 merkissä I. Tämän analogin pääteltiin olevan oleellisesti puhdas käyttäen TLCrtä ja HPLCrtä.
Esimerkki XXXVIII
(Lys\ Arg21, Nle27) -rGRF(1-29) -NH2, jolla on kaava: 5 H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Lys-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-
Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Arg-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-NH2 synteesi suoritettiin MBHA-hartsilla vaiheittain käyttäen Beckman 990-peptidisyntetisaattoria, kuten esimerkissä I. Peptidin pääteltiin olevan oleellisesti puhdas 10 käyttäen TLCrtä ja HPLCrtä.
Esimerkki XXXIX
hGRF-analogin (D-NMA2, C"MeVal13, C"MeAla19, CTIeLeu22, Nle27, Asn2H) -hGRF (1-29) -NH2, jolla on kaava: H-Tyr-D-NMA-
Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-C^MeVal-Leu-Gly-15 Gln-Leu-Ser-C"MeAla-Arg-Lys-C"MeLeu-LeuGln-Asp-Ile-Nle-Asn-
Arg-NH2 synteesi suoritettiin MBHA-hartsilla vaiheittain käyttäen Beckman 990-peptidisyntetisaattoria, kuten esimerkissä I. Peptidin pääteltiin olevan oleellisesti puhdas käyttäen TLCrtä ja HPLCrtä.
20 Esimerkki XL
(D-Ala2, D-Lys21, Nle27)-hGRF(l-29)-NH2, jolla on kaava : H-Tyr-D-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-
Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-D-Lys-Leu-Leu-Gln-Glu-Ile-Nle-Ser-Arg-NH2 synteesi suoritettiin MBHA-hartsilla vai-25 heittain käyttäen Beckman 990-peptidisyntetisaattoria, ku ten esimerkissä I. Peptidin pääteltiin olevan oleellisesti puhdas käyttäen TLCrtä ja HPLCrtä.
Esimerkki XLI
(Met1, C"MeAla'\ Arg21, Nle27. ;-rGRF(1-29)-NH2, jolla 30 on kaava: H-Met-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-
Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-C“MeAla-Arg-Arg-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-NH2 synteesi suoritettiin MBHA-hartsilla vaiheittain käyttäen Beckman 990-peptidisyntetisaattoria, kuten esimerkissä I. Peptidin pääteltiin olevan 35 oleellisesti puhdas käyttäen TLCrtä ja HPLCrtä.
25 o 9 4 Γ 9
Esimerkki XLII
(pCl-Phe1, D-NMA2, C^MeTyr10, C^MeAla19, Arg21, Nle27) -rGRF(1-43)-OH, jolla on kaava: H-pCl-Phe-D-NMA-Asp-Ala-
Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-C^MeTyr-Arg-Arg-I le-Leu-Gly-Gln-Leu-5 Tyr-CMeAla-Arg-Arg-Leu-Leu-His-Asp-Ile-Nle-Asn-Arg-Gln-
Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-OH synteesi suoritettiin kloorimetyloidulla hartsilla vaiheittain käyttäen Beckman 990-peptidisyntetisaattoria, kuten esimerkissä III. Peptidin pääteltiin olevan oleelli-10 sesti puhdas käyttäen TLC:tä ja HPLC:tä.
Esimerkeissä valmistettuja synteettisiä peptidejä verrattiin synteettiseen hpGRF(1-40)-OH:hon in vitro kokeissa ja niiden havaittiin omaavan yleensä suurempi teho GH:n erityksen ja samanlaisten sisäisten aktiviteettien 15 suhteen. Kaikkia näitä synteettisiä peptidejä pidetään biologisesti aktiivisina ja potentiaalisesti käyttökelpoisina stimuloimaan GH:n vapautusta aivolisäkkeestä.
Jotta voitaisiin määrittää tiettyjen edustavien synteettisten peptidien suhteellinen tehokkuus kasvuhormo-20 nin vapautumisen edistämisessä, suoritettiin in vitro ko keet käyttäen synteettistä hpGRF(1-40)-OH:ta standardina vertailtaessa rinnakkain ekvimolaarisia määriä syntetisoituja edustavia analogeja. Käytettiin viljelmiä, jotka sisälsivät noin 3-5 päivää aiemmin poistettuja rotan aivoli-25 säkkeen soluja. Sellaisia viljelmiä pidetään optimaalisina kasvuhormonin eritykselle ja käytetään vertailukokeissa tavalla, jonka ovat yleisesti kuvanneet Vale et ai., Endocrinology, 91, 562-572 (1972) ja jonka ovat tarkemmin kuvanneet Vale et ai., Endocrinology, 112, 1553-1555 30 (1983). Testattavan aineen inkubointi suoritetaan 3-4 tun tia, otetaan viljelyalustasta pieniä nävtteitä ja käsitellään, jotta niiden immunoreaktiivisen GH:n (irGH) määrä voidaan mitata hyvin tunnetulla radioimmuunianalyysillä.
Tämän ekvimolaaristen konsentraatioiden vertailu-35 kokeen tulokset on esitetty taulukossa I.
26 .1 9 4 ; 9
Taulukko I
Optinen * 5 Peptidi Vertailu % rotaatioΓα1
hGRF(1-40)-OH
(testin standardi) 100 % [N'TOeTyr1, Asp8, Ala1', N le27,
Asn28] -hGRF (1-2 9) -NH3 192 % -54,5° 10 [N"MeTyr‘, Lys8, Ala1', Nle27,
Asn28]-hGRF (1-2 9)-NH3. 556 % -60,5° [ITMeTyr1, D-Lys21, Nle27] -hGRF(1-2 9)-NH2. 172 % -53,3° 15 * [α]|> mitattu 1 % etikkahapossa, c = 1
Kasvuhormonin erityksen in vitro-kokeiden lisäksi injektoitiin in vivo kokeissa synteettisiä peptidejä laskimonsisäisesti uretaanianestesoituihin urosrottiin ja havaittiin, että peptidit estävät spontaania GH:n eritystä 20 ilman, että vaste ulkopuoliselle GRF:lle hävisi. Verinäytteitä otettiin juuri ennen ja 10, 30 ja 60 minuuttia injektioiden jälkeen ja GH-tasot veressä määritettiin radi-oimmuunianalyysillä. Synteettisten peptidien in vivo-ko-keet osoittaa, että kullakin on yllättävästi paljon suu-25 rempi biologinen vaikutus kuin hpGRF(1-40)-OH:11a. Näiden synteettisten GRF-analogien teho kestää oleellisesti pitemmän ajan, minkä osoittaa aivolisäkkeen GH:n tasot veressä mitattuna sekä 30 että 60 minuuttia IV-injektion jälkeen. Muita tunnettuja GRF:n in vivo-kokeita, joiden 30 tiedetään olevan tehokkaita GH:n erityksen havaitsemisessa, käytettiin näiden tulosten varmistamiseen. 500 ng -noin 50 ^ig välillä olevia annoksia näitä peptidejä kg:a kohti ruumiinpainoa pidetään tehokkaina GH:n erityksen aiheuttamisessa.
35 Synteettiset hGRF-analogit ja mahdollisesti rGRF- analogit voivat olla käyttökelpoisia ihmisten hoidossa, 27 S 9 4 S' 9 jolloin lääkäri pyrki nostamaan nostamaan GH:n tuottoa. GH:n erityksen stimulaatio analogeilla on tärkeätä potilailla, joilla on sisäisen GRF:n liian vähäisen tuotannon aiheuttama täydellinen tai osittainen GH:n puutos. Lisäksi 5 on mahdollista, että lisääntynyt GH:n eritys ja siitä johtuva kasvun lisääntyminen voidaan saada aikaan ihmisissä tai eläimissä, joilla on normaalit GH-tasot. Lisäksi antamisen pitäisi muuttaa ruumiin rasvapitoisuutta ja modifioida muita GH:n riippuvaisia metabolisia, immunologisia 10 ja kehitysprosesseja. Nämä analogit voivat olla käyttökelpoisia esimerkiksi keinona stimuloida ihmisten anabolisia prosesseja sellaisissa olosuhteissa, joita seuraa palohaavojen saamisesta. Toisena esimerkkinä näitä analogeja voidaan antaa kaupallisesti hyödynnettäville lämminverisille 15 eläimille, kuten kanoille, kalkkunoille, sioille, vuohille, karjaeläimille ja lampaille, ja niitä voidaan käyttää vesiviljelyssä kalojen ja muiden kylmäveristen merieläinten esim. merikilpikonnien ja ankeriaiden, ja sammakkoeläinten kasvatuksessa kiihdyttämään kasvua ja lisäämään 20 proteiinin suhdetta rasvaan, jotka saavutetaan syöttämällä tehokkaita määriä peptidejä.
Ihmisille annettaessa synteettisten peptidien puhtausasteen pitää olla vähintään noin 93 % ja mieluummin vähintään 98 %. Puhtausaste, tähän tarkoitukseen käytetty-25 nä, viittaa mainitun peptidin muodostavan ilmoitetun pai-no-%:n kaikista läsnä olevista peptideistä ja peptidifrag-menteista. Annettaessa synteettisiä peptidejä kaupallisesti hyödynnettäville ja muille eläimille tarkoituksena kasvun parantaminen ja rasvapitoisuuden alentaminen, niinkin 30 alhainen puhtausaste kuin 5 %, tai jopa niin alhainen kuin 0,01 %, voi olla hyväksyttävissä.
Näitä synteettisiä peptidejä tai niiden myrkyttömiä suoloja yhdistettynä farmaseuttiseksi koostumukseksi farmaseuttisesti tai eläinlääketieteellisesti hyväksyttävän 35 kantajan kanssa, voidaan antaa eläimille, mukaanlukien 28 394:9 ihmiset, joko laskimonsisäisesti, ihonalaisesti, lihakseen, ihon kautta, esim. nenän kautta tai jopa suun kautta. Anto tapahtuu lääkärin toimesta stimuloimaan GH:n vapautumista hoidettavan potilaan tarvitessa sellaista 5 terapeuttista käsittelyä. Tarvittava annosmäärä vaihtelee tietysti hoidettavasta tilasta, tilan vakavuudesta ja halutun käsittelyn kestosta riippuen.
Kyseiset peptidit annetaan usein myrkyttömien suolojen muodossa, kuten happoadditiosuoloina tai metalli-10 komplekseina, esim. sinkin, raudan tai vastaavien kanssa (joita pidetään suoloina tähän tarkoitukseen käytettyinä). Kuvaavia esimerkkejä happoadditiosuoloista ovat suolahappo, vetybromidi, sulfaatti, fosfaatti, maleaatti, asetaat-ti, sitraatti, bentsoaatti, sukkinaatti, malaatti, askor-15 baatti, tartraatti ja vastaavat. Jos aktiivinen aine tarkoitetaan annettavaksi suun kautta tablettimuodossa, tabletti voi sisältää sitoja-ainetta, kuten traganttikumia, maissitärkkelystä tai gelatiinia; hajottavaa ainetta, kuten algiinihappoa; ja liukastusainetta, kuten magnesium 20 stearaattia. Jos ainetta halutaan antaa nestemäisessä muodossa, voidaan käyttää makeutus- ja/tai aromiaineita, ja laskimonsisäinen anto voidaan suorittaa isotonisessa suolaliuoksessa, fosfaattipuskurissa tai vastaavassa.
Peptidit pitää antaa ihmisille lääkärin valvonnassa 25 ja farmaseuttiset koostumukset sisältävät tavallisesti peptidin yhdessä tavanomaisen, kiinteän tai nestemäisen, farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan kanssa. Tavallisesti parenteraalinen annosmäärä on noin 0,01 - noin 1 pg peptidiä kilogrammaa kohti potilaan ruumiinpainoa.
30 Vaikka keksintö on kuvattu esittäen edulliset suo ritustavat, jotka muodostavat parhaan keksijöiden tällä hetkellä tunteman mallin, on ymmärrettävä, että erilaisia muutoksia ja modifikaatioita, jotka ovat ilmeisiä tämän alan ammattimiehille, voidaan tehdä poikkeamatta keksinnön 35 puitteista. Esimerkiksi modifikaatioita peptidiketjuun, l> 29 .? 9 4-9 erikoisesti peptidin karboksyyli päästä alkavia ja noin kohdalle 29 ulottuvia deleetioita voidaan tehdä nykyään tunnettujen koemenettelyjen mukaisesti luomaan peptidejä tai peptidifragmentteja, jotka säilyttävät kaiken tai hy-5 vin oleellisen osan peptidin biologisesta tehosta, ja sellaisia peptidejä pidetään keksinnön piiriin kuuluvina. Lisäksi lisäyksiä voidaan tehdä jompaan kumpaan päähän, tai molempiin päihin, ja/tai yleisesti ekvivalentit ryhmät voidaan substituoida luonnollisesti esiintyvillä ryhmillä 10 kuten on hyvin tunnettua peptidikemian alalla, tuottamaan toisia analogeja, joilla on ainakin oleellinen osa patenttivaatimuksissa esitetyn polypeptidin tehosta jäljellä poikkeamatta keksinnön puitteista. Lisäksi modifikaatioita voidaan tehdä suositeltuun -NH2-ryhmään C-päässä alan ny-15 kyisen tietämyksen mukaisesti, esimerkiksi C-pään amino-happoryhmän karboksyyliosa voi olla radikaali -COOR, -CRO, -CONHNHR, -C0N(R)(R') tai -CH20R, jossa R ja R' on alempi alkyyli, alempi fluorialkyyli tai vety, poikkeamatta keksinnöstä, koska sellaiset modifikaatiot johtavat ekviva-20 lenttien synteettisten peptidien muodostukseen.
Claims (8)
- 30 o 9 4 .. 9
- 1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen peptidin ja sen myrkyttömien suolojen valmistamiseksi, jolla 5 peptidillä on sekvenssi (I): (rTMe)Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-R8-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val- Leu-R,5-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-R21-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-R28- Arg-NH2, jossa R„ on Asn, Lys tai Asp, R15 on Gly tai Ala, R2i on Lys 10 tai D-Lys, R2x on Asn tai Ser, edellyttäen, että R„ on Lys tai Asp ja/tai R21 on D-Lys, tunnettu siitä, että (i) yksittäiset aminohapot tai lyhyet peptidit kytketään ainakin osittain kiinteäfaasimenetelmällä yhdisteen muodostamiseksi, jolla on ainakin yksi suojaryhmä ja seuraava 15 kaava (II): X1- (N"Me) Tyr (X2) -Ala-Asp(X3) -Ala-I le-Phe-Thr (X4) -R8(X8) -Ser (X4) -Tyr (X2) -Arg(X6) -Lys(X7) -Val-Leu-R15-Gln (Xs) -Leu-Ser (X2) -Ala-Arg (X6) -R21 (X7) -Leu-Leu-Gin (X5) -Asp (X3) -Ile-Nle-R28(X4 tai X5)-Arg(X6)-X9, 20 jossa (X), (X1), (X2), (X3), (X4), (X5), (X6), (X7) ja (X8) ovat kukin joko vety tai suojaryhmä ja (X9) on ankkuroiva sidos hartsiin, (ii) käsitellään sopivalla reagenssilla suojaryhmän tai -ryhmien poistamiseksi kyseisestä kaavan (II) mukaisesta yhdisteestä ja sen poistamiseksi ankku-25 roivasta sidoksesta, jolloin muodostuu sekvenssin (I) mukainen peptidi ja, jos halutaan, (iii) saatu peptidi saatetaan reagoimaan sopivalla hapolla tai vastaavalla peptidin myrkyttömän additiosuolan valmistamiseksi.
- 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että R8 on Asp.
- 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R2I on D-Lys.
- 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R8 on Lys. li 3i 3 9 4 > 9
- 5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R28 on Asn.
- 6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että peptidin kaavan on yksi seu- 5 raavista: [N'MeTyr1, Asp8, Ala15, Nle27, Asn38]-hGRF(1-2 9)-NH2, [NaMeTyr', Lys8, Ala15, Nle37, Asn28] -hGRF (1-29) -NH2 ja [NaMeTyr\ D-Lys21, Nle37]-hGRF (1-29)-NH,.
- 32 O 9 4 > 9
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/053,235 US5002931A (en) | 1987-05-22 | 1987-05-22 | GRF analogs VII |
| US5323587 | 1987-05-22 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI882305A0 FI882305A0 (fi) | 1988-05-17 |
| FI882305A FI882305A (fi) | 1988-11-23 |
| FI89499B FI89499B (fi) | 1993-06-30 |
| FI89499C true FI89499C (fi) | 1993-10-11 |
Family
ID=21982813
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI882305A FI89499C (fi) | 1987-05-22 | 1988-05-17 | Foerfarande foer framstaellning av terapeutiskt anvaendbar peptid |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5002931A (fi) |
| EP (1) | EP0292334A3 (fi) |
| JP (1) | JP2758901B2 (fi) |
| KR (1) | KR0143913B1 (fi) |
| AU (1) | AU1647788A (fi) |
| CA (1) | CA1312704C (fi) |
| DK (1) | DK280088A (fi) |
| FI (1) | FI89499C (fi) |
| HU (1) | HUT46932A (fi) |
| IL (1) | IL86166A0 (fi) |
| NO (1) | NO882184L (fi) |
| PT (1) | PT87529B (fi) |
| SU (1) | SU1598881A3 (fi) |
| ZA (1) | ZA882832B (fi) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4734399A (en) * | 1985-08-06 | 1988-03-29 | Hoffmann-La Roche Inc. | Growth hormone releasing factor analogs |
| US5098995A (en) * | 1987-05-22 | 1992-03-24 | The Salk Institute For Biological Studies | GRF Analogs VIIA |
| ATE106895T1 (de) * | 1987-09-18 | 1994-06-15 | Hoffmann La Roche | Zyklische grf-analoga. |
| WO1990008776A1 (en) * | 1989-01-27 | 1990-08-09 | The Upjohn Company | Stabilized, potent grf analogs |
| NZ238748A (en) * | 1990-06-29 | 1993-09-27 | Hoffmann La Roche | Growth hormone releasing factor (grf) analogues |
| DE69108192T2 (de) * | 1990-12-10 | 1995-07-20 | Hoffmann La Roche | Verfahren zur enzymatischen Herstellung von GRF(1-44)NH2. |
| EP0542937A1 (en) * | 1991-04-09 | 1993-05-26 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Growth hormone releasing factor analogs |
| US5262519A (en) * | 1991-05-15 | 1993-11-16 | The Salk Institute For Biological Studies | GRF analogs XI |
| CA2158782C (en) * | 1994-09-23 | 2010-01-12 | Pierrette Gaudreau | Marker for growth hormone-releasing factor receptors |
| JPH11503454A (ja) * | 1995-04-14 | 1999-03-26 | ジ アドミニストレイターズ オブ ザ チューレン エデュケイショナル ファンド | 成長ホルモン放出因子の類似体 |
| WO2005016735A1 (en) * | 2003-08-18 | 2005-02-24 | Canterprise Limited | A powered unicycle |
| US8800697B2 (en) | 2009-09-01 | 2014-08-12 | Ryno Motors, Inc. | Electric-powered self-balancing unicycle with steering linkage between handlebars and wheel forks |
| WO2014031904A2 (en) | 2012-08-22 | 2014-02-27 | Ryno Motors, Inc. | Electric-powered self-balancing unicycle |
| USD739307S1 (en) | 2013-04-30 | 2015-09-22 | Ryno Motors, Inc. | One-wheeled vehicle |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4595676A (en) * | 1983-04-26 | 1986-06-17 | The Salk Institute For Biological Studies | Rat hypothalamic GRF |
| US4518586A (en) * | 1983-01-13 | 1985-05-21 | The Salk Institute For Biological Studies | GRF Analogs III |
| AU575843B2 (en) * | 1983-08-10 | 1988-08-11 | The Administrators Of The Tulane Eductional Fund | Growth hormone releasing peptides |
| US4626523A (en) * | 1983-09-13 | 1986-12-02 | The Salk Institute For Biological Studies | GRF analogs II |
| US4528190A (en) * | 1983-10-25 | 1985-07-09 | The Salk Institute For Biological Studies | GRF Analogs IV |
| CA1271600A (en) * | 1985-01-07 | 1990-07-10 | David Howard Coy | Growth hormone-releasing peptides and method of treating mammals therewith |
| US4689318A (en) * | 1985-08-29 | 1987-08-25 | The Salk Institute For Biological Studies | GRF analogs |
| US4784987A (en) * | 1987-01-13 | 1988-11-15 | The Salk Institute For Biological Studies | GRF analogs VI |
| US4801456A (en) * | 1987-07-09 | 1989-01-31 | International Minerals & Chemical Corp. | Growth hormone-releasing factor analogs |
-
1987
- 1987-05-22 US US07/053,235 patent/US5002931A/en not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-04-21 ZA ZA882832A patent/ZA882832B/xx unknown
- 1988-04-25 IL IL86166A patent/IL86166A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1988-05-16 SU SU884355674A patent/SU1598881A3/ru active
- 1988-05-17 FI FI882305A patent/FI89499C/fi not_active IP Right Cessation
- 1988-05-19 PT PT87529A patent/PT87529B/pt not_active IP Right Cessation
- 1988-05-19 NO NO882184A patent/NO882184L/no unknown
- 1988-05-20 CA CA000567405A patent/CA1312704C/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-05-20 DK DK280088A patent/DK280088A/da not_active Application Discontinuation
- 1988-05-20 AU AU16477/88A patent/AU1647788A/en not_active Abandoned
- 1988-05-20 HU HU882610A patent/HUT46932A/hu unknown
- 1988-05-21 KR KR1019880006050A patent/KR0143913B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1988-05-23 EP EP88304663A patent/EP0292334A3/en not_active Withdrawn
- 1988-05-23 JP JP63125602A patent/JP2758901B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA1312704C (en) | 1993-01-12 |
| FI89499B (fi) | 1993-06-30 |
| PT87529B (pt) | 1992-09-30 |
| FI882305A0 (fi) | 1988-05-17 |
| EP0292334A2 (en) | 1988-11-23 |
| AU1647788A (en) | 1988-11-24 |
| PT87529A (pt) | 1989-05-31 |
| NO882184D0 (no) | 1988-05-19 |
| NO882184L (no) | 1988-11-23 |
| KR880013974A (ko) | 1988-12-22 |
| JPS649999A (en) | 1989-01-13 |
| DK280088A (da) | 1988-11-23 |
| JP2758901B2 (ja) | 1998-05-28 |
| ZA882832B (en) | 1988-11-11 |
| DK280088D0 (da) | 1988-05-20 |
| IL86166A0 (en) | 1988-11-15 |
| SU1598881A3 (ru) | 1990-10-07 |
| EP0292334A3 (en) | 1990-06-27 |
| FI882305A (fi) | 1988-11-23 |
| HUT46932A (en) | 1988-12-28 |
| KR0143913B1 (ko) | 1998-07-01 |
| US5002931A (en) | 1991-03-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI92210B (fi) | Menetelmä farmaseuttisesti käyttökelpoisten GRF-analogien valmistamiseksi | |
| FI88402C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av terapeutiskt anvaendbara grf-analoger | |
| CA1243016A (en) | Human grf peptide analogs | |
| US4529595A (en) | GRF Analogs | |
| US4626523A (en) | GRF analogs II | |
| FI87080C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av grf-analoger | |
| FI91074B (fi) | Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen rengasrakenteen sisältävän GRF-analogin valmistamiseksi | |
| US4595676A (en) | Rat hypothalamic GRF | |
| FI89499C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av terapeutiskt anvaendbar peptid | |
| US4728726A (en) | GRF analogs IIIb | |
| JP2974254B2 (ja) | Ｇｒｆ類似体ｖｉｉａ | |
| EP0107890B1 (en) | Mammalian pgrf |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB | Publication of examined application | ||
| MM | Patent lapsed | ||
| MM | Patent lapsed |
Owner name: THE SALK INSTITUTE FOR BIOLOGICAL |