KR0143913B1 - 합성 펩티드와 이를 포함하는 제약학적 조성물 - Google Patents
합성 펩티드와 이를 포함하는 제약학적 조성물Info
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Abstract
내용없음
Description
［발명의 명칭］
합성의 펩티드와 이를 포함하는 제약학적 종성물
［발명의 상세한 설명］
본 발명은 인간 및 기타 동물의 뇌하수체선(pituitary gland)의 기능에 영향을 미치는 펩티드에 관한 것이다. 특히, 발명은 뇌하수체선에 의해 성장호르몬의 방출을 촉진시키는 펩티드에 관한 것이다.
생리학자들은 시상하부가 각 뇌하수체 호르몬의 분비를 작극 또는 억제하는 특정 물질을 생성하는 시상하부로 뇌하수체선부(adenhypophysis)의 분비기능을 조절한다는 사실을 오랜동안 인정하고 있었다. 시상하부 억제인자는 성장호르몬(GH)의 분비를 억제한 소마토스타틴(somatostain)의 형태로 1972년에 규명되었다. 1982년에는 인간의 췌장(종양) 방출인자(hpGRF)가 인간의 췌장종야의 추출물로 분리되어 정제되고 합성 및 시험되었으며, 그 결과 상기 인자가 뇌하수체 의해 GH 방출을 촉진한다는 것이 밝혀졌다. 이러한 두가지 뇌하수체 자극인자는 전체 합성에 의해 재합성되었으며,본래 구조의 유사체들도 합성되었다. 인간의 시상하부 GH 방출인자는 엄밀히 동일한 구조를 갖는다; 따라서 hGRF 라는 용어를 여기서 사용한다.
이제, 배양된 뇌하수체 세포로부터 GH를 방출하고, 체내에서 효소 분해에 대한 증가되 저항성을 가지며, 매우 실질적으로 증가된 효능을 보이는 합성 폴리펩티드가 합성 및 시험되었다. 이러한 유리한 성질들은 증가된 안정성을 갖는 알파-나선형 형태의 펩티드로부터 유래하는 것으로 여겨진다. 이러한 펩티드는 바람직하게는 그것의 알파 탄소원자에 메틸기가 치환된 (Came) 잔기를 10, 13, 19 및 22 위치에 적어도 하나 가지며, 가장 바람직하게는 잔기들 중의 몇개가 이와 같이 치환되는 것이다. 2-위치에는 D-Ala, Nach3-D-Ala(D-NMa)또는 NMA가 치환된다. D_Lys 또는 D_Arg 는 21- 위치인 것이 바람직하며 Nle는 바람직하게 27-위치에 존재한다. Lys는 바람직하게는 8-위치에 치환되지만, Arg, Ser, Glu 또는 Asp도 치환될 수 있다. 펩티드는 또한 1-위치에 하기 잔기들 중의 하나를 가지며: Try, D-Try, Met, Phe, D_phe, pCl-Phe, Leu, His 및 D-His, 이러한 잔기는 알파 -탄소 상에 똔는 알파-아미노기 내에서 선택적으로 메틸치환이 될 수 있으며, 또는 알파-아미노기는 삭제될 수 있으며(데스아미노;desamino);이러한 잔기는 또한 바람직하게 아세틸(Ac) 또는 포르밀(For)에 의해 아실화된 알파-아미노기를 가질 수있다. 펩티드들은 선택적으로 3-위치에 D-Asp, 및/또는 12-위치에 Arg, 및/또는 10-위치에 Phe 또는 D-Try, 및/또는 15-위치에 Ala를 가질 수 있다. 이들은 또한 27-위치의 Met 및/또는 28-위치의 Asn 대신 D-Met 또는 Nva등의 기타 잔기를 가질 수 있다. 13- 및 22-위치의 잔기들은 하기의 어는 것일 수 있다: Leu, Ile, Ala 및 Val.
본 발명에 따를 제약학적 조성물은 제약학적 또는 수의학적으로 허용가능한 액체 또는 고형의 담체 내에 분산되어 있는, 약 29 내지 44 사이의 잔기를 가지는 유사체 또는 이들 중 어는 하나의 비독성 염을 포함한다. 그러한 제약학적 조성물은 치료적 목적 및 진단하기 위하여 투여되는 인간과 동물용 임상 약제로 사용될 수 있다. 또한, 가금을 포함한 온혈동물의 성장촉진 및 물고기, 뱀자어 등과 같은 냉혈동물에 대한 수중배양(apuiculture)에 사용될수 있다.
펩티드를 정의하는데 상용되는 명명법은 통상적인 표현에 따라서 N-말단의 아미노기는 왼쪽에 나타내고 C-말단의 카르복실기는 오른쪽에 나타내는 Schroder Lubke 의 The peptides에 의해 명시된 것이다. 천연 아미노산은 Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp 및 His을 포함하는 단백질에서 발견되는 보통의 천연발생 아미노산을 의미한다. Nle는 노르루이신을 의미하고 Nva는 노르발린을 의미한다. 아미노산 잔기가 이성질 형태를 가질 때 명백히 다른 언급이 없는 한 아미노산의 L-형을 나타낸다. D-NMA는 알파-아미노기가 메틸로 치환된 아라닌의 D-이성질체를 나타낸다.
본 발명은 일반적으로 하기 서열(I)을 갖는 합성펩치드를 제공한다:
(B)R1-R2-R3-Ala-Ile-Phe-Thr-R8-Ser-(Q1)R10-Arg-R12-(Q2)R13-Leu-R15-Gln-Leu-R18-(Q3)Ala-Arg-R21-(Q4)R22-Leu-R24-R25-Ile-R27-R28-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-R34-Asn-Gln-Glu-R38-R39-R40-Arg-R42-R43-R44여기서 R1은 Tyr, D-Tyr, Met, Phe, pCl-Phe, Leu, His 또는 D-His; B는 H,CaMe, NaMe, 데스아미노, Ac 또는 For; R2 는 Ala, D-Ala, NMa 또는 D-NMA; R3은 Asp 또는 D-Asp; R8 은 Ser, Asn, Lys, Arg, Asp 또는 Gln; R10은 Tyr, D-Tyr 또는 Phe; R12은 Arg 또는 Lys; R13은 Ile, Val, Leu 또는 Ala; R15은 Gly 또는 Ala; R18은 Ser 또는 Tyr; R21은 Lys, D-Lys, Arg 또는 D-Arg; R22은 Leu, ILe, Ala 또는 Val; R24은 Gln 또는 His; R25 은 Asp 또는 Ser; R34 은 Ser 또는 Arg; R38은 Arg 또는 Gln; R39 은 gly 또는 Arg; R40 is Ala 또는 Ser; R42은 Phe, Ala 또는 Val; R43은 Asn 또는 Arg; R44은 천연아미노산이며; Q1-Q4은 H 또는 CaMe이며,
단, R30 내지 R44의 일부 또는 모든 잔기는 제거될 수 있으며, 또한 Q1-Q4중 적어도 하나는 CaMe이며, 또는 R8은 Lys 또는 Arg 이며, 또는 R21은 D-Lys 또는 D-Arg이다.
바람직하게는 이 펩티드들은 하기 서열을 갖는다:
(B)R1-R2-R3-Ala-Ile-Phe-Thr-R8-Ser-(Q1)R10-Arg-R12-(Q2)R13-Leu-R15-Gln-Leu-R18-(Q3)Ala-Arg-R21-(Q4)R22-Leu-R24-R25-Ile-R27-R28-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-R34-Asn-Gln-Glu-R38-R39-R40-Arg-R42-R43-R44여기서 R1은 Tyr, D-Tyr, Met, Phe, pCl-Phe, Leu, His 또는 D-His; B는 H,CaMe, NaMe, 데스아미노, Ac 또는 For; R2 는 Ala, D-Ala, NMa 또는 D-NMA; R3은 Asp 또는 D-Asp; R8 은 Ser, Asn, Lys, Arg, Asp 또는 Gln; R10은 Tyr, D-Tyr 또는 Phe; R12은 Arg 또는 Lys; R13은 Ile, Val, Leu 또는 Ala; R15은 Gly 또는 Ala; R18은 Ser 또는 Tyr; R21은 Lys, D-Lys, Arg 또는 D-Arg; R22은 Leu, ILe, Ala 또는 Val; R24은 Gln 또는 His; R25 은 Asp 또는 Ser; R34 은 Ser 또는 Arg; R38은 Arg 또는 Gln; R39 은 gly 또는 Arg; R40 is Ala 또는 Ser; R42은 Phe, Ala 또는 Val; R43은 Asn 또는 Arg; R44은 천연아미노산이며; Q1-Q4은 H 또는 CaMe이며,
단, R30 내지 R44의 일부 또는 모든 잔기는 제거될 수 있으며, 또한 Q1-Q4중 적어도 하나는 CaMe이며, 또는 R8은 Lys 또는 Arg 이며, 또는 R21은 D-Lys 또는 D-Arg이다.
바람직하게는 이 펩티드들은 하기 서열을 갖는다:
(B)R1-R2-R3-Ala-Ile-Phe-Thr-R8-Ser-(Q1)R10-Arg-R12-(Q2)R13-Leu-R15-Gln-Leu-R18-(Q3)Ala-Arg-R21-(Q4)R22-Leu-R24-R25-Ile-R27-R28-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-R34-Asn-Gln-Glu-R38-R39-R40-Arg-R42-R43-R44여기서 R1은 Tyr, D-Tyr, Met, Phe, pCl-Phe, Leu, His 또는 D-His; B는 H,CaMe, NaMe, 데스아미노, Ac 또는 For; R2 는 Ala, D-Ala, NMa 또는 D-NMA; R3은 Asp 또는 D-Asp; R8 은 Ser, Asn, Lys, Arg, Asp 또는 Gln; R10은 Tyr, D-Tyr 또는 Phe; R12은 Arg 또는 Lys; R13은 Ile, Val, Leu 또는 Ala; R15은 Gly 또는 Ala; R18은 Ser 또는 Tyr; R21은 Lys, D-Lys, Arg 또는 D-Arg; R22은 Leu, ILe, Ala 또는 Val; R24은 Gln 또는 His; R25 은 Asp 또는 Ser; R34 은 Ser 또는 Arg; R38은 Arg 또는 Gln; R39 은 gly 또는 Arg; R40 is Ala 또는 Ser; R42은 Phe, Ala 또는 Val; R43은 Asn 또는 Arg; R44은 천연아미노산이며; Q1-Q4은 H 또는 CaMe이며,
단, R30 내지 R44의 일부 또는 모든 잔기는 제거될 수 있으며, 또한 Q1-Q4중 적어도 하나는 CaMe이며, 또는 R8은 Lys 또는 Arg 이며, 또는 R21은 D-Lys 또는 D-Arg이다.
바람직하게는 이 펩티드들은 하기 서열을 갖는다:
(B)R1-R2-R3-Ala-Ile-Phe-Thr-R8-Ser-(Q1)R10-Arg-R12-(Q2)R13-Leu-R15-Gln-Leu-R18-(Q3)Ala-Arg-R21-(Q4)R22-Leu-R24-R25-Ile-R27-R28-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-R34-Asn-Gln-Glu-R38-R39-R40-Arg-R42-R43-R44여기서 R1은 Tyr, D-Tyr, Met, Phe, pCl-Phe, Leu, His 또는 D-His; B는 H,CaMe, NaMe, 데스아미노, Ac 또는 For; R2 는 Ala, D-Ala, NMa 또는 D-NMA; R3은 Asp 또는 D-Asp; R8 은 Ser, Asn, Lys, Arg, Asp 또는 Gln; R10은 Tyr, D-Tyr 또는 Phe; R12은 Arg 또는 Lys; R13은 Ile, Val, Leu 또는 Ala; R15은 Gly 또는 Ala; R18은 Ser 또는 Tyr; R21은 Lys, D-Lys, Arg 또는 D-Arg; R22은 Leu, ILe, Ala 또는 Val; R24은 Gln 또는 His; R25 은 Asp 또는 Ser; R34 은 Ser 또는 Arg; R38은 Arg 또는 Gln; R39 은 gly 또는 Arg; R40 is Ala 또는 Ser; R42은 Phe, Ala 또는 Val; R43은 Asn 또는 Arg; R44은 천연아미노산이며; Q1-Q4은 H 또는 CaMe이며,
단, R30 내지 R44의 일부 또는 모든 잔기는 제거될 수 있으며, 또한 Q1-Q4중 적어도 하나는 CaMe이며, 또는 R8은 Lys 또는 Arg 이며, 또는 R21은 D-Lys 또는 D-Arg이다.
바람직하게는 이 펩티드들은 하기 서열을 갖는다:
(B)R1-R2-R3-Ala-Ile-Phe-Thr-R8-Ser-(Q1)R10-Arg-R12-(Q2)R13-Leu-R15-Gln-Leu-R18-(Q3)Ala-Arg-R21-(Q4)R22-Leu-R24-R25-Ile-R27-R28-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-R34-Asn-Gln-Glu-R38-R39-R40-Arg-R42-R43-R44여기서 R1은 Tyr, D-Tyr, Met, Phe, D-Phe, pCl-Phe, Leu, His 또는 D-His; B는 H,CaMe, NaMe, 데스아미노, Ac 또는 For; R2은 Ala, D-Ala, NMA 또는 D-NMA;R3은 Asp 또는 D-Asp; R8 은 Ser, ,Asn, Lys, Arg, Asp 또는 Gln; R10은 Tyr, D-Tyr 또는 Phe; R12은 Arg 또는 Lys; R13은 Ile, Val, Leu 또는 Ala; R15는 Gly 또는 Ala; R21은 Lys, D-Lys, Arg 또는 D-Arg; R22은 Leu, Ile, Ala 또는 Val; R27은 Met, D-Met, Ala, Nle, Ile, Leu, Nva 또는 Val; R28은 Asn 또는 Ser; R42은 Phe, Ala 또는 Val; R43은 Asn 또는 Arg; R44 은 천연아미노산; Q1-Q4은 H 또는 CaMe 이며, 단 R30과 R44 사이의 일부 또는 모든 잔기는 제거될수 있다. 바람직하게는 Q1-Q4중 적어도 하나는 CaMe이며; 바람직하게는 R8은 Lys 또는 Arg이며; 바람직하게는 R21은 D-Lys 또는 D-Arg이다. C-말단에 있는 아미노산 잔기의 카르복실산 부분은 하기 라디칼들 중의 어는 하나일 수 있다: -COOR, -CRO, -CONHNHR, -CON(R)(R')또는 -CH2OR (R과 R'는 저급알킬, 플루오로 저급알킬 또는 수소이며; 메틸,에틸 및 프로필이 바람직한 저급 알킬기임). Met 가 1위치에 나타날 때 27위치에는 다른 잔기를 갖는 것이 바람직할 것이다.
N-말단으로부터 잔기-29 까지 연장되어 있는 부분은 뇌하수체에 의한 GH의 방출에 영향을 주는 생물학적 효능을 가지며, 아미드 또는 치환된 아미드인 C-말단을 갖는 29 또는 32 잔기의 생물학적으로 활성인 부분이 가장 바람직하다. 펩티드가 40개 이상의 잔기를 가질 경우 C-말단 부분에 대하여 명백히 더 우세한 것은 없다.
전적으로 고체상 기술에 의해서만, 또는 부분적 고체상 시술, 단편 축합(frahment condensation) 또는 통상의 용액커플링 등이 적당한 방법에 의해서 펩티드들이 합성된다. 최근 개발된 재조합 DNA 기술이 천연 아미노산 잔기만을 함유하는 유사체의 일부를 제조하기 위하여 사용될 수 있는데, 이 경우 짧은 N-말단 펩티드에 연결될 수 있을 것이다. 예를들면, 전적으로 고체상의 합성기술은 고체상 펩티드 합성(스튜어트 영, Freeman Co., 샌프란시스코, 1969)에 기술되어 있으며, 베일 일해의 미합중국 특허 제 4,105,603호(1978. 8. 8 특허됨)의 기재에 의해 예시된다. 통상의 용액합성은 논문 Mothoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl) : Synthese von Peptiden(편집 E. Wunsch(1974) Georg Thieme Verlag, Stuttgart, W. Ger.)에 상세히 기재되어 있다. 합성의 단편 축합법은 미합중국 특허 제3,972,859호(1976. 8. 3)에 예시되어 있다. 다른 이용할 수 있는 합성법의 예는 미합중국 특허 제 3,842,067호(1974. 10. 5)와 미합중국 특허 제 3,862,925호(1975. 1. 28)이다
이러한 합성법에서의 공통점은 다양한 아미노산 부분의 불안정한 측쇄기를 적당한 보호기로 보호한다는 것인데, 이러한 보호기는 보호기가 최종적으로 제거될 때까지 호학반응이 그 위치에서 일어나는 것을 막는다. 또한 일반적으로 공통하는 것이 아미노산상의 알파-아니노기 또는 그 부분을 보호하는 것인데, 그것이 카르복실기에서 반응하고 난 다음, 알파-아미노 보호기만을 선택적으로 제거하면, 후속의 반응이 그 위치에서 일어나게 된다. 따라서, 합성에서의 일단계로서, 원하는 서열로 펩티드사슬에 위치하는 각 아미노산 잔기와 이러한 적당한 잔기에 연결된 측쇄 보호기를 포함하는 중간체 화합물이 생성되는 것은 통상적인 일이다.
이 점에서, 본 발명은 하기 일반식 (Ⅱ)의 중간체를 생성한다:
X1-(B)R1(X 또는 X2)-R2-R3(X3)-Ala-Ile-PhE-Thr(X4)R8(X8)-Ser(X4)-R10(X2)-Arg(X6)-R12(X6 또는 X7)-(Q2)R13-Leu-R15-Gln(X5)-Leu-R18(X2)-(Q3)Ala-Arg(X6)-R21(X6 또는 X7)-(Q4)R22-Leu-R24(X5 또는 X)-R25(X3)-Ile-R27-R28(X4 또는 X5)-Arg(X6)-Gln(X5)-Gln(X5)-Gly-Glu(X3)-R34(X4 또는 X6)-AsN(X5)-Glu(X3)-R38(X6 또는 X5)-R39(X6)-R40(X2)-Arg(X6)-R42-R43(X5 또는 X6)-R44(X8)-X9. 역에서 X1은 수소 또는 a-아미노 보호기이다. X1으로 예측되는 a-아미노 보호기는 플리펩티드의 단계식 합성에서 유용한 것으로 당업계에서 잘 알려진 것이다. X1으로서 사용될수 있는 a-아미노보호기들의 부류 중에는 (1) 방향족 우레탄형 보호기, 예컨대 플루오레닐메틸옥시카르보닐(FMOC),벤질옥시카르보닐(Z)및 치환된 Z, 예컨대 p-클로로벤질옥시카르보닐, p-니트로벤질옥시카르보닐, p-브로모벤질옥시카르보닐 및 p-메툭시벤질옥시카르보닐; (2)지방족 우레탄 보호기, 예컨대 t-부틸옥시카르보닐(BOC), 디이소프로필메틸옥시카르보닐, 이소프로필옥시카르보닐, 에톡시카르보닐, 알릴옥시카르보닐; 및 시클로헥실옥시카르보닐이 있다. NaMe-치환된 잔기가 1-위치에 사용되는 경우에도 바람직한 a-아미노 보호기는 BOC이며; 물론 B가 데스아미노인 경우 X1은 H이다.
X는 수소 또는 His, 예컨대 Tos의 이미다졸 질소에 대한 보호기이다.
X2는 테트라히드로피라닐, t-부틸, 트리틸(trityl), Bzl, CBZ, 4Br-CBZ 및 2,6-디클로로벤질(DCB)과 같은, Try의 페놀 히드록실기에 대하여 적합한 보호기일 수 있다. 바람작한 보호기는 2,6-디클로로벤질이다. X2 는 수소일수 있으며 이는 그 위치의 아미노산 잔기에 어떤 측쇄 보호기도 없다는 것을 의미한다.
X3는 수소 또는 Asp 또는 Glu 카르복실기에 대하여 적합한 에스테르-형성 보호기, 예컨대 벤질(OBzl), 2,6-디클로로벤질, 메틸 및 에틸이다.
X4는 Thr 또는 Ser의 히드록실기에 대한 적합한 보호기, 예컨대 아세틸, 벤조일. t-부틸, 트리틸, 테드라히드로피라닐, Bsl, 2,6-디클로로벤질 및 CBZ 일 수 있다. 바람직한 보호기는 Bzl이다. X4는 수소일 수 있는데, 이는 히드록실기에 어떤 보호기도 없다는 것을 의미한다.
X5는 수소 또는 Asn 또는 Gln의 측쇄 아미도기에 대한 적합한 보호기이다. 크산틸(Xan)이 바람직하다.
X6은 수소 니트로, Tos, CBZ, 아다멘틸옥시카르보닐 및 BOC와 같이 Arg의 구아니도(guanido)기에 대한 적합한 보호기이거나 또는 수소이다.
X7은 수소 또는 Lys의 측쇄 아미노기에 대하여 적합한 보호기이다. 적합한 측쇄 아미노 보호기의 예로는 2-클로로벤질옥시카르보닐(2-Cl-Z), Top, t-아밀옥시카르보닐 및 BOC가 있다.
X8은 수소 또는 일반적으로 상기한 바와 같은 적합한 측쇄 보호기이다
Met 는 선택적으로 산소에 의해 보호될 수 있지만,보호되지 않고 남아있는 것이 바람직하다.
합성 도중 a-아미노기가 탈보호(deprotection)되는 동안 제거되지 않는 것으로 선택된다는 점을 제외하고는 측쇄 아미노 보호기의 선택은 중요하지 않다. 그러나, His와 같은 몇몇 아미노산은 결합이 이루어진 후에는 보호가 일반적으로 필요하지 않으며, 보호기는 같을 수 있다.
X9은 에스테르-형성기 X3와 같은 C-말단 카르복실기에 대한 적합한 보호기이거나, 고체 수지 지지체에 결합하기 위하여 고체상 합성에서 사용되는 고정(anchoring) 결합이거나, 또는 des-X9이며, 이 경우 C-말단에서의 잔기는 상기와 같이 카르복실 부분 Y를 갖는다. 고체 수지 지지체가 사용되는 경우, 예컨데 다음 구조식을 갖는 당분야에 알려진 임의의 것일 수 있다: -O-CH2-수지 지지체, -NH-벤즈히드릴아민(BHA)수지 지지체 또는 -NH-파라메틸벤즈히드릴아민(MBHA)수지 지지체, 비치환된 아미드가 요구되는 경우, 분열(cleavage)이 직접 아미드를 제공하기 때문에, BHA 또는 MBHA 수지를 사용하는 것이 바람직하다. N-메탈아미드가 필요한 경우, 이는 N-메틸BHA 수지로부터 생성될 수 있다. 다른 치환된 아미드가 필요하다면, 미합중국 특허 제 4,569,967에 지시된 것을 사용할 수 있으며, 유리산이 아닌 다른기들이 C-말단에 필요하다면, 상기 Houben-Weyl의 문헌에 기재된 바와 같이 통상적인 방법을 사용하여 펩티드를 합성하는 것이 바람직할 수 있다.
중간체에 대한 일반식에서, X-기들 중 적어도 하나는 보호기이거나 X9은 수지 지지체를 포함한다. 따라서, 본 발명은 또한 (a)적어도 하나의 보호기 및 일반식(Ⅱ)(여기에서: X, X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7 및 X8은 각각 수소 또는 보호기이고, X9은 보호기 또는 수지 지지체에 대한 고정 결합 중의 하나 또는 des-X9이고, 이 겨우 C-말단의 잔기는 원하는 카르복시 부분을 가질 수 있다)를 갖는 펩티드 형성하고; (b) 일반식 (Ⅱ)의 펩티드로부터 보호기 또는 보호기들 또는 고정결합을 분리시키고; (c)원한다면, 결과 생성된 서열 (Ⅰ)의 펩티드를 그것의 비독성 염으로 전환시킴으로써, 소정의 펩티드를 제조하는 방법을 제공한다.
펩티드의 합성에 사용하기 위한 특정의 측쇄 보호기를 선택하는데 있어서, 하기 일반 법칙을 따른다: (a)보호기는 그 보호 성질을 보유하는 것이 바람직하며, 결합 조건하에서는 분리되지 않는다. (b)보호기는 시약에 안정해야만 하며, Xan을 제외하고는 합성의 각 단계에서 a-아미노 보호기를 제거시키기 위해 선택된 반응조건 하에서 안정한 것이 바람직하다. (c)측쇄 보호기는 원하는 아미노산 서열을 포함하는 합성이 완성됨에 따라, 펩티드 사슬을 바람직하지 않게 변경시키지 않는 반응저건 하에서 제거될 수 있어야만 한다.
제조합 DNA 기술을 이용하여 펩티드가 제조되지 않은 경우, 고체상합성, 예컨데 메리필드에 의한 J. Am. Chem. Soc., 85, 2419(1963)에 일반적으로 기재된 바와 같은 방법을 이용하여 펩티드가 제조되는 것이 바람직한데, 물론 당업계에 알려진 다른 균등한 화학합성도 상기와 같이 이용될 수 있다. 고체상 합성은 보호된 a-아미노기를 적당한 수지에 결합시킴으로써 펩티드의 C-말단으로부터 시작된다. 이러한 출발물질은 a-아미노-보호된 아미노산을 클로로메틸화된 수지 또는 히드록시메틸 수지에 에스테르 결합에 의해서 부착시키거나, 또는 BHA 수지 또는 MBHA 수지에 아미드 결합에 의해서 부착시킴으로써 제조될 수 있다. 히드록시메틸 수지의 제조는 보단스키 일동에 의한 Chem. Ind.(런던) 38, 1597-98 (1966)에 기재되어 있다. 클로로메틸화된 수지는 Bio Red 연구실, 리치몬드, 캘리포니아 및 Lab. Systems, Inc. 로부터 상업적으로 구입가능하다. 이러한 수지의 제조는 스튜어트 일동에 의한 고체상 펩티드 합성 (프리맨 Co. 샌프란시스코 1969),1장 pp 1-6에 기술되어 있다. BHA 및 MBHA 수지 지지체는 상업적으로 구입가능하며, 합성되는 원하는 폴리펩티드가 C-말단에서 비치환된 아미드를 갖는 경우에만 일반적으로 사용된다.
예컨대, ratGRF (rGRF)의 43-잔기 유리산 유사체가 합성될 경우 BOC 및 Xan 에 의해 보호되는 Asn 과 같은 C-말단 아미노산은 약 60℃에서 24시간 동안 휘저어 섞어주면서 DMF 내의 KF를 사용하여, 케이.호리키 일동에 의한 Chemistry Letters 165-168(1978)에 지재된 절차에 따라 클로로메틸화된 수지에 먼저 결합될 수 있다. 수지 지지체에 BOC-보호 아미노산이 결합됨에 따라, 염화메틸렌 내 트리플루오로아세트산(TFA) 또는 TFA만을 사용하여 a-아미노 보호기가 제거된다. 약℃-실온 사이의 온도에서 탈보호(deprotection)가 수행된다. 디옥산내의 HCl과 같은 다른 표준 분열시약 및 특정한 a-아미노 보호기의 제거를 조건이 쉬로더 루브케의 페티드,1 pp 72-75(아카데믹 프레스 1965)에 기술된 바와 같이 사용될 수 있다.
a-아미노 보호기가 제거된 다음, 남아있는 a-아미노-보호된 및 측쇄-보호된 아미노산들은 원하는 순수로 단계적으로 결합되어 상기 중간 화합물을 얻거나, 또는 합성시 별도로 각 아미노산 첨가하여, 고체상 반응기에 첨가시키기 전에 이들 중 일부를 서로 결합시킬 수 있다. 적절한 결합(커플링)시약의 선택은 당부야의 기술에 속한다. 결화ㅂ 시약으로서 특히 적합한 것은 N, N'-디시클로헤실카르보디이드(DOCI)이다.
펩티드의 고체상 합성에서 사용된 활성시약은 펩티드 분야에 잘 알려져 있다. 적합한 활성 시약의 예로는 N, N'-디이소프로필카르 보디이미드 및 N-,에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)카르보이미드와 같은 카르뫄 같은 카르보디이더,팹티드 결함에서 기타의 활성시약 및 이들의 사용은 쉬로더 루브케 수트라에 의한 Chapter Ⅲ 및 카포르에 의한 J. Phar. Sci., pp 1-27 (1970)에 기술되어 있다.
각각 보호된 아미노산 또는 아미노산 서열은 약 4배 이상으로 고체상반응기내로 도입되며, 결합은 디메틸포름아미드(DMF):CH2Cl2(1:1)의 매체 또는 DMF 또는 CH2Cl2각각에서 수행될 수 있다. 불안전한 결합이 일어나는 경우, 다음 순서의 아미노산이 결합하기에 앞서서 a-아미노 보호기를 제거하기 전에 결합절차가 반복된다. 만일 수동으로 수행되는 경우, 각 합성단계에서의 결합반응의 성공은 이. 카이저 일동에 의한 Anal. Biochem. 34, 595(1970)에 기술된 바와 같이 난히드린 반응에 의해 모니터되는 것이 바람직하다. 결합반응은 백크만 990 자동 합성기에서와 같이, Rivier 일동의 Biopolymers, 1978, 17, pp 1927-1938 에 보고된 바와 같은 프로그램을 사용하여 자동적으로 수행될 수 있다.
원하는 아미노산 서열이 완성된 후에, 액체 불화수소와 같은 시약으로처리하여 수지 지지체로부터 중간 펩티드가 제거될 수 있는데, 이 시약은 수지로부터 펩티드를 분리시킬 뿐만 아니라 모든 남아있는 측쇄 보호기들 X, X2, X3, X4, X5, X6, X7 및 X8 및 고정결합 X9을 분열시키며, 또한 이 중 하나만이 이용된다면 a-아미노 볼호기 X1을 분리시켜 유리산 형태의 펩티드를 얻을 수 있다. 만일 Met가 서열안에 존재하는 경우, 잠재적인 S-알킬화 반응을 없애기 위해 HF를 사용하여 수지로부터 펩티드를 분리시키기 전에, 트리플루오로아세트산(TFA)/에탄디티올을 사용하여 먼저 BOC 보호기를 제거하는 것이 바람직하다. 분리시키기 위해 불화수소를 사용하는 겨우, 반응 용기에는 스캐빈저로서 아니졸 및 메틸에틸설파이드가 포함된다.
하기 실시예 1은 고체상 기수에 의해 펩티드를 합성하는 바람직한 방법을 설명한다. 무론 상당히 긴 펩티드의 합성은 사슬의 C-마단에 필요한 수의 아미노사능 단순히 첨가시킴으로써 같은 방법으로 수행된다느 것을 인식할 수 있을 것이다. 생물학적으로 활성인 부분은 N-말단에 지시된 서열을 포함하여야 한다는 것이 현재 인식되며, N-말단에 대한 잔기의 첨가는 유리하지 않다고 생각된다.
[실시예 1］
NaMeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-
Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Asn-Arg-NH2의 식을 갖는 펩티드 ［NaMetyr1, Asp8, Ala15, Nle27, Aan28］-hGrf(1-29)-NH2의 합성은 베일 일동에 의한 미합중구 특허 제4,292,313 호에 일반적으로 기재된 바와 같이 상업적으로 구입가능한 MBHA수지상에서 백크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계식으로 수행된다. 수지에 대한 BOC-Arg(Tos)의 결합은 수지 g 당 약 0.35 mmol의 Arg의 치환을 초래한다.
탈블록킹(deblocking)및 중화 후에, 펩티드 사슬은 수지상에 단계적으로 만들어진다. 탈블록킹, 중화 및 각 아미노산의 첨가는 Rivier, J의 J. Amer. Chem. Soc., 96, 2986-2992(1974)에 자세하게 기재된 절차에 따라 일반적으로 수행된다. 사용된 모든 용매는 헬륨 또는 질소와 같은 불활성 기체로 스파징(sparging)시킴으로써 조심스럽게 탈기시켜, Met 잔기의 황을 바람직지 않게 산화시키는 산소를 확실히 없애준다.
탈블록킹 다음의 스케줄 A에 따라 수행하는 것이 바람직하다:
결합은 다음 스케줄 B에 기재된 대로 수행하는 것이 바람직하다:
요컨대 수지 g 당 염화메틸렌 내 BOC-보 아미노산 1-2 mmol.이 사용되며, 2시간 동안은 염화메틸렌 내 1.0 몰의 DCCI 1당량이 사용된다. BOC-Arg(Tos)가 결합된는 경우, 50% DMF 및 염화메틸렌의 혼합물을 사용한다. Bzl 에테를 Ser 및 Thr 에 대한 히드록실 측쇄 보호기로서 사용한다. Asn 또는 Gln의 아미도기는 DCC 결합이 바람직하게 사용된는 경우 Xan에 의해 보호된다. Asn 또는 Gln의 카르복실 말단을 활성화시키기 위하여 p-니크로페닐에스테르(ONp)가 또한 사용될 수 있으며, 예컨대 DMF 및 염화메틸렌의 50% 혼합물내의 HOBt 1당량을 사용하여 하룻밤 동안 BOC-Asn(ONp)을 결합시킬 수 있는데, 이 경우 DCC 는 첨가하지 않는다. Lys 측쇄에 대한 보호기로서 2-클로로-벤질옥시카르보닐(2Cl-z)을 사용한다. Arg의 구아니도기 및 His의 이미다졸 질소를 보호하기 위해서 Tos를 사용하며, Glu 또는 Asp 측쇄 카르복실기는 OBzl으로 보호된다. Tyr의 페놀 히드록실기는 2,6-디클로로-벤질(DCB)로 보호된다. 합성의 마지막에는 하기 조성이 얻어진다:
BOC-NaMeTyr(X2)-Ala-Asp(X3)-Ala-Ile-Phe-Thr(X4)-Asp(X3)-Ser(X4)-Tyr(X2)-Arg(X6)-Lys(X7)-Leu-Leu-Gln(X5)-Leu-Ser(X4)-Ala-Arg(X6)-Lys(X7)-Leu-Leu-Gln(X5)-Asp(X3)-Ile-Nle-Asn(X5)-Arg(X6)-X9(여기서 X2는 NH-MBHA-수지 지지체이다). a-아미노 보호기를 탈블록킹시키기 위해 사용되는 TFA 처리에 의해 Xan이 부분적 또는 진적으로 제거될수 있다.
보호된 펩티드-수지를 분리시키고 탈보호하기 위해서, -20℃ 에서 30분 동안, 0℃ 에서 30분 동안 펩티드-수지 g 당 아니졸 1.5ml, 메틸에틸술파이드 0.5ml 및 불화수소(HF) 15ml로 처리한다. 높은 진공하에 HF를 제거시킨후에, 수지-펩티드를 탈기시킨 2N 수성 아세트산으로 추출하고 여과에 의해 수지로부터 분리시긴다.
그 다음 분리시키고 탈보호기킨 펩티드를 0-5% 아세츠산에 용해기키고, Sephadex G-50 미세 겔여과를 포함하는 정제를 수행한다.
펩티드는 또한 Rivier 일동에 의한 J, Am. Chem. Soc. 103,3178(1981)에 기재된 바와 같이 예비 또는 반-예비 HPLC에 의해 더 정제된다. 워터스어소우시에이트 제조(Waters Assoiates Prep) LC-500을 갖춘 카트리지를 Vydac(300A)으로 부터의 15-20u C18실리카로 펙킹시킨다. Rivier, J의 J. Liq. Chromatography 1, 343-367(1978)에 기재된 바와 같이 저압력 Eldex 겨사도 제조기에 위해 TEAP 니의 CH3CN의 경사도가 생성된다. HPLC에 의해 크로마토그랙피 분류물이 조심스럽게 모니터도며, 실질적인 순도를 보여주는 분류물만을 수거하다. 0.1% TFA 내 CH3CN 경사도를 이용하여 순도에대해 독립적으로 조사된 정제된 분류물을 탈염(desalting)시킨다. 그런 다음 중앙부를 냉동 건조시켜 원하는 펩치드를 얻으며, 이것의 순도는 98% 이상일 수 있다.
[실시예 2］
H-CaMeHis-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-D-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Glu-Arg-Gly-Ala-NH240-잔기 아미드화된 펩티드［CaMeHis1, D-NMA2, D-Lys21］-hGRF(1-40)-NH2의 합성은 베일 일행의 미합중국 특허 제 4,292,313에서 일반적으로 기술된 바와 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990 펩치드 합성기를 사용하여 단계적 방법으로 수행된다. TLC 와 HPLC를 사용하여 펩티드가 실질적으로 순수한지를 판정한다.
[실시예 3］
H-His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-D-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-NLe-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Phe-Asn-OH 의 식을 갖는［D-NMA2, D-Lys21, Nle27］-rGRF(1-43)-OH 의 합성을 Chermistry Letter, supra 에 기술된 바와 같은 초기 결합으로 클로로메틸화된 수지를 사용하여 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적으로 수행한 다음, 실시예 1에서 일반적으로 지술된 방법으로 수행한다. TLC 와 HPLC 를 사용하여 펩티드가 실질적으로 순수한지 판단한다.
[실시예 4］
NaMetyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Lys-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Asn-Arg-NH2의 식을 갖는 ［NaMetyr1, Lys8, Ala15, Nle27, Asn28］-hGRF(1-29)-NH2인 hGRF 유사체 단편의 합성을 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지상에서 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적으로 수행한다. TLC 와 HPLC 를 사용하여 이 유사체가 실질적으로 순수한지를 판단한다.
N-말단 잔기를 바꾸어 합성을 반복하면 ［NaMeHis1, Lys8, Ala15, Nle27, Asn28］-hGRF(1-29)-NH2이 얻어진다.
[실시예 5］
NaMetyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-D-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-NH2의 식을 갖는 hGRG 유사체 단편 ［NaMetyr1, D-Lys21, Nle27］-hGRF(1-29)-NH2의 합성을 실시예 1과 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990 펩티드가 실질적으로 순수하지 판단한다.
[실시예 6］
NaMe-His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-D-Arg-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-NH2의 식을 갖는 ［NaMeHis1, D-NMA2, Lys8, D-Arg21, Nle］-rGRF(1-29)-NH2의 합성을 실시예 1과 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적 방법으로수행한다. TLC 와 HPLC 를 사용하여 펩티드가 실질적으로 순수한지 판단한다.
[실시예 7］
NaMetyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-D-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-D-Lys-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-NH2의 식을 갖는 ［NaMeHis1, D-Tyr10, D-Lys21, Nle27］-hGRF(1-29)-NH2의 합성을 실시예 1과 같이 MBHA 수지 사에서 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적 방법으로 수행한다. TLC 와 HPLC 를 사용하여 펩티드가 실질적으로 순수한지 판단한다.
[실시예 8］
His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-D-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Nva-Asn-Arg-NH2의 식을 갖는 ［D-NMA2, Asp8, D-Lys21, Nva27］-rGRF(1-29)-NH2의 합성을 실시예 1과 같이 MBHA 수지 상에서 벡큼만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적 방법으로 수행한다. TLC 와 HPLC를 사용하여 펩티드가 실질적으로 순수한지 판단한다.
[실시예 9］
H-D-Phe-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Glu-Ser-CaMetyr-Arg-Lys-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-D-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2의 식을 갖는 ［D-Phe1, D-NMA2, Glu8, CaMeTyr10, Ile13, D-Lys21］-rGRF(1-32)-NH2의 합성을 베일 일행의 미합중국 특허 제 4,292,313에 일반적으로 기술된 바와 같이 MBHA 수지상에서 벡크만 990 펩티드 합성기르 사용하여 단계적 방법으로 수행한다. TLC 와 HPLC 를 사용하여 펩티드가 실질적으로 순수한지 판단한다.
[실시예 10］
H-pCl-Phe-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-D-Lys-Val-Leu-His-Asp-Ile-Ile-Asn-Arg-NH2의 식을 갖는 ［pCl-Phe1, D-NMA2, D-Lys21, Val22, Asp25, Ile27］-rGRG(1-29)-NH2의 합성을 실시예 1에서 일반적으로 기술된 방법으로 MBHA 수지 상에서 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적 방법으로 수행한다. TLC 와 HPLC 를 사용하여 펩티드가 실질적으로 순수한지 판단한다.
[실시예 11］
H-CaMeLeu-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Lys-Ser-Tyr-Arg-Lys-Ile-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-D-Lys-Ala-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2의 식을 갖는 ［CaMeLeu1, D-NMA2, D-Asp3, Lys8, D-Lys21, Ala22］-hGRF(1-32)-NH2의 합성을 실시예 1 에서와 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적 방법으로 수행한다.TLC 와 HPLC 를 사용하여 펩티드가 실질적으로 순수한지 판단한다.
[실시예 12］
H-D-Tyr-D-NMA-D-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-CaMe-D-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-D-Arg-CaMeVal-Leu-Gln-Asp-Ile-D-Met-Ser-Arg-NH2의 식을 갖는 ［D-ty1, D-NMA2, D-Asp3, CaMe-D-Tyr10, Ala1, D-Arg21, CaMeVal22, D-Met27］-hGRF(1-29)-NH2의 합성을 실시예 1 에서와 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적 방법으로 수행한다.TLC 와 HPLC 를 사용하여 펩티드가 실질적으로 순수한지 판단한다.
[실시예 13］
H-D-His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Lys-Ser-Tyr-Arg-Leu-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-D-Lys-Leu-HIs-Glu-ILe-Ala-Asn-Arg-NH2의 식을 갖는 ［D-His1, D-NMA2, Lys8, Leu13, D-Lys21, Ala27］-hGRF(1-29)-NH2의 합성을 실시예 1 에서와 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적 방법으로 수행한다.TLC 와 HPLC 를 사용하여 펩티드가 실질적으로 순수한지 판단한다.
[실시예 14］
NaMeTyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Glu-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-D-Arg-CaMeIle-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-NH2의 식을 갖는 hGRG 유사체 단편, 즉 ［NaMetyr1, D-NMA2,Glu8, Ala13, D-Arg21, CaMeIle22］-hGRF(1-29)-NH2의 합성을 실시예 1 에서와 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적 방법으로 수행한다.TLC 와 HPLC 를 사용하여 펩티드가 실질적으로 순수한지 판단한다.
[실시예 15］
H-CaMeLeu-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Leu-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-CaMeAla--Arg-D-Lys-CaMeAla-Leu-His-Gln-Ile-Ala-Asn-Arg-NH2의 식을 갖는 ［CaMeLeu1, D-NMA2, Leu13, CaMeAla19, D-Lys21, CaMeal22, Ala27］-hGRF(1-32)-NH2의 합성을 실시예 1 에서와 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적 방법으로 수행한다. TLC 와 HPLC 를 사용하여 펩티드가 실질적으로 순수한지 판단한다.
[실시예 16］
H-CaMePhe-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-CaMeAla-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Ile-Arg-NH2의 식을 갖는 ［CaMePhe1, NMA2, Lys8, Alg12, Ile13, CaMeAla19, Ile27］-hGRF(1-29)-NH2의 합성을 베일 일행의 미합중국 특허 제 4,292,313호 에 일반적으로 기술된 바와 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적 방법으로 수행한다.TLC 와 HPLC 를 사용하여 펩티드가 실질적으로 순수한지 판단한다.
[실시예 17］
desNH2-D-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Arg-Ser-Phe-Arg-Lys-CaMeVal-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NH2의 식을 갖는 ［데스아미노D-Tyr1, D-NMA2, Arg8, Phe10, CaMeVal13, Leu27, Asn28］-hGRF(1-29)-NH2의 합성을 베일 일행의 미합중국 특허 제 4,292,313호 에 일반적으로 기술된 바와 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적 방법으로 수행한다. TLC 와 HPLC 를 사용하여 펩티드가 실질적으로 순수한지 판단한다.
[실시예 18]
H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-CaMeTyr-Arg-Lys-CaMeVal-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-CaMeLeu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Asn-Arg-NH2의 식을 갖는 ［D-NMA2, CaMeTyr, CaMeVal13, CaMeLeu22, Nle27, Asn28］-hGRF(1-29)-NH2의 합성을 베일 일행의 미합중국 특허 제 4,292,313호에 일반적으로 기술된 바와 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적 방법으로 수행한다. TLC 와 HPLC 를 사용하여 펩티드가 실질적으로 순수한지 판단한다.
[실시예 19］
H-CaMePhe-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-CaMeTyr-Arg-Arg-CaMeIle-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Ile-Val-Asn-Arg-NH2의 식을 갖는 ［CaMePhe1, NMA2, CaMeTLr10, CaMeIle13, Val27］-hGRF(1-29)-NH2의 합성을 실시예 1 에서와 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적 방법으로 수행한다.TLC 와 HPLC 를 사용하여 펩티드가 실질적으로 순수한지 판단한다.
[실시예 20］
desNH2-D-Met-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-CaMeTyr-Arg-Lys-CaMeVal-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-CaMeAla-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Asn-Arg-NH2의 식을 갖는 ［데스아미노D-Met1, D-NMA2, CaMeTyr10, CaMeVal13, CaMeAla19, Asn28］-hGRF(1-29)-NH2의 합성을 베일 일행의 미합중국 특허 제 4,292,313호 에 일반적으로 기술된 바와 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적 방법으로 수행한다. TLC 와 HPLC 를 사용하여 펩티드가 실질적으로 순수한지 판단한다.
[실시예 21］
NaMeHis-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-CaMeVal-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Arg-NH2의 식을 갖는 ［NaMeHis1, D-NMA2, CaMeTyr10, CaMeVal13, Nle27］-hGRF(1-29)-NH2의 합성을 베일 일행의 미합중국 특허 제 4,292,313호 에 일반적으로 기술된 바와 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적 방법으로 수행한다. TLC 와 HPLC 를 사용하여 펩티드가 실질적으로 순수한지 판단한다.
[실시예 22］
For-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-CaMeTyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-CaMeAla-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2의 식을 갖는 ［For-Tyr1, D-NMA2, CaMeTyr10, CaMeAla19, Leu27, Asn28］-hGRF(1-32)-NH2의 hGRF 유사체 부분의 합성을 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적 방법으로 수행한다. TLC 와 HPLC 를 사용하여 이 유사체가 실질적으로 순수한지 판단한다.
[실시예 23］
H-His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Lys-CaMeIle-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-CaMeAla-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-NH2의 식을 갖는 ［D-NMA2, Arg12, CaMeIle13, CaMeAla19, Nle27］-rGRF(1-29)-NH2의 합성을 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적 방법으로 수행한다. TLC 및 HPLC 를 사용하여 이 유사체가 실질적으로 순수한지 판단한다.
[실시예 24］
H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Arg-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-CaMeLeu-Leu-Gln-Asp-Ile-Ser-Arg-NH2의 식을 갖는 ［ D-NMA2, Arg12, CaMeTyr10, CaMeLeu22, Ile27］-hGRF(1-29)-NH2의 합성을 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적 방법으로 수행한다. TLC 와 HPLC 를 사용하여 이 유사체가 실질적으로 순수한지 판단한다.
[실시예 25］
H-D-Phe-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-CaMeVal-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-CaMeLeu-Leu-Gln-Asp-Ile-D-Met-Ser-Arg-NH2의 식을 갖는 ［ D-Phe1, D-NMA2, CaMeVal13, Ala15, CaMeLeu22, D-Met27］-hGRF(1-29)-NH2의 합성을 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적 방법으로 수행한다. TLC 와 HPLC 를 사용하여 이 유사체가 실질적으로 순수한지 판단한다.
[실시예 26］
H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-D-Arg-CaMeLeu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2의 식을 갖는 ［ D-NMA2, D-Arg21, CaMeLeu22］-hGRF(1-32)-NH2의 합성을 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적 방법으로 수행한다. TLC 와 HPLC 를 사용하여 이 유사체가 실질적으로 순수한지 판단한다.
[실시예 27］
desNH2His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Asp-Ile-Met-Asn-Arg-NH2의 식을 갖는 ［데스아미노His1, D-NMA2, Lya8, Asp25］-hGRF(1-29)-NH2의 합성을 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적 방법으로 수행한다. TLC 와 HPLC 를 사용하여 이 유사체가 실질적으로 순수한지 판단한다.
[실시예 28］
Ac-D-His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-CaMeTyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Asn-Arg-NH2의 식을 갖는 ［Ac-D-His1, D-NMA2, Arg8, CaMeTyr10, Nle27］-rGRF(1-29)-NH2의 합성을 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적 방법으로 수행한다. TLC 와 HPLC 를 사용하여 이 유사체가 실질적으로 순수한지 판단한다.
[실시예 29］
H-Tyr-D-Ala-D-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-CaMeTyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-CaMeAla-Arg-Lys-CaMeLeu-Gln-Asp-Ile-Leu-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2의 식을 갖는 ［D-Ala2, D-Asp3, CaMeTyr10, CaMeAla19, CaMeLeu22, Leu27］-rGRF(1-32)-NH2의 합성을 실시예 1 에서와 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적 방법으로 수행한다. TLC 와 HPLC 를 사용하여 이 유사체가 실질적으로 순수한지 판단한다
[실시예 30］
H-D-Tyr-D-NMA-D-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-CaMe-D-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-D-Met-Ser-Arg-NH2의 식을 갖는 ［D-tyr1, D-NMA2, D-Asp8, Lys8, CaMe-D-Ty10, Ala15, D-Met27］-rGRF(1-29)-NH2의 합성을 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적 방법으로 수행한다. TLC 와 HPLC 를 사용하여 이 유사체가 실질적으로 순수한지 판단한다.
[실시예 31］
H-D-His-D-NMA-D-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Tyr-Arg-Arg-Leu-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-CaMeAla-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Gln-Ile-Nle-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2의 식을 갖는 ［D-His1, D-NMA2, Arg8, Leu13, CaMeAla19, Nle27］-rGRF(1-32)-NH2의 합성을 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적 방법으로 수행한다. TLC 와 HPLC 를 사용하여 이 유사체가 실질적으로 순수한지 판단한다.
[실시예 32］
desNH2tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-CaMeLeu-Leu-His-Gln-Ile-Met-Asn-Arg-NH2의 식을 갖는 rGRF 유사체 단편, 즉 ［데스아미노Tyr1, CaMeLeu22］-rGRF(1-29)-NH2의 합성을 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지상에서 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적 방법으로 수행한다. TLC 와 HPLC 를 사용하여 이 유사체가 실질적으로 순수한지 판단한다.
[실시예 33］
Ac-D-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-CaMeTyr-Arg-Lys-CaMeVal-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-CaMeAla-Arg-Lys-CaMeLeu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-NH2의 식을 갖는 ［Ac-D-Tyr1, D-NMA2, CaMeTyr10, CaMeVal13, CaMeAla19, CaMeLeu22, Nle27］-rGRF(1-29)-NH2의 합성을 베일 일행의 미합중국 특허 제 4,292,313호에서 일반적으로 기술된 바와 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적 방법으로 수행한다. TLC 와 HPLC 를 사용하여 이 유사체가 실질적으로 순수한지 판단한다.
[실시예 34］
H-CaMeLeu-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-CaMeAla-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-IleAsn-Arg-NH2의 식을 갖는 ［ CaMeLeu1, D-NMA2, Glu8, CaMeAla19, Glu25, Ile27］-rGRF(1-29)-NH2의 합성을 실시예 1에서와 같이 MBHA 수지상에서 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적 방법으로 수행한다. TLC 와 HPLC 를 사용하여 이 유사체가 실질적으로 순수한지 판단한다.
[실시예 35］
For-D-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-CaMeVal-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-CaMeAla-Arg-Arg-CaMeLeu-Gln-Asp-Ile-Met-Asn-Arg-NH2의 식을 갖는 ［Fgr-D-Tyr1, D-NMA2, CaMeVal13, Arg21, CaMeLeu22, Asn28］-rGRF(1-29)-NH2의 합성을 베일 일행의 미합중국 특허 제 4,292,313호에서 일반적으로 기술된 바와 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적 방법으로 수행한다. TLC 와 HPLC 를 사용하여 이 유사체가 실질적으로 순수한지 판단한다.
[실시예 36］
H-Tyr-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-CaMeVal-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-NH2의 식을 갖는 ［NMA2, CaMeVal13, Nle27］-rGRF(1-29)-NH2의 합성을 베일 일행의 미합중국 특허 제 4,292,313호에서 일반적으로 기술된 바와 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적 방법으로 수행한다. TLC 와 HPLC 를 사용하여 이 유사체가 실질적으로 순수한지 판단한다. 그리고 나서 이 펩치드를 물에 용해시키고 1N 아세트산을 첨가함으로써 아세트산염을 제조한다. 결과 용액을 동결건조시켜 아세트산염을 얻는다.
[실시예 37］
H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Arg-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-CaMeAla-Arg-Lys-CaMeLeu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2을 갖는 hGRG 유사체, ［D-NMA2, Arg8, CaMeAla13, CaMeLeu22, Nle27］-rGRF(1-32)-NH2의 합성을 실시예 1과 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적 방법으로 수행한다. TLC 와 HPLC 를 사용하여 이 유사체가 실질적으로 순수한지 판단한다.
[실시예 38］
H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Lys-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Arg-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-NH2을 갖는 ［Lys8, Arg21, Nle27］-rGRF(1-29)-NH2의 합성을 실시예 1과 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적 방법으로 수행한다. TLC 와 HPLC 를 사용하여 이 유사체가 실질적으로 순수한지 판단한다.
[실시예 39］
H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-CaMeVal-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-CaMeAla-Arg-Lys-CaMeLeu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Asn-Arg-NH2을 갖는 hGRF 유사체 ［D-NMA2, CaMeAla19, CaMeLeu23, Nle27, Asn28］-rGRF(1-29)-NH2의 합성을 실시예 1과 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적 방법으로 수행한다. TLC 와 HPLC 를 사용하여 이 유사체가 실질적으로 순수한지 판단한다.
[실시예 40］
H-Tyr-D-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-D-Lys-Leu-Leu-Gln-Ile-Nle-Ser-Arg-NH2을 갖는 ［D-Ala2, D-Lys21, Nle27］-rGRF(1-29)-NH2의 합성을 실시예 1과 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적 방법으로 수행한다. TLC 와 HPLC 를 사용하여 이 유사체가 실질적으로 순수한지 판단한다.
[실시예 41］
H-Met-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Lys-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-CaMeAla-Arg-Arg-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-NH2을 갖는 ［Met1, CaMeAla19, Arg21, Nle27］-rGRF(1-29)-NH2의 합성을 실시예 1과 같이 MBHA 수지 상에서 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적 방법으로 수행한다. TLC 와 HPLC 를 사용하여 이 유사체가 실질적으로 순수한지 판단한다.
[실시예 42］
H-pCl-Phe-D-NMS-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-CaMeTyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-CaMeAla-Arg-Arg-Leu-Leu-His-Asp-Ile-Nle-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-OH을 갖는 ［pCl-Phe1, D-NMA2, CaMeTyr10, CaMeAla19, Arg21, Nle27］-rGRF(1-43)-OH 의 합성을 실시예 III 과 같이 클로로메틸화된 수지상에서 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적 방법으로 수행한다. TLC 와 HPLC 를 사용하여 이 유사체가 실질적으로 순수한지 판단한다.
실시예들에서 제조된 합성 펩티드를 시험관내 분석으로 합성 hpGRF(1-40)-OH 와 비교하면 GH의 분비 및 유사한 내재성 활성에 대해 일반적으로 보다 큰 효능을 나타내는 것으로 발견된다. 모든 이러한 합성 펩티드는 생물학적이며 뇌하수체에 의한 GH 의 방출을 촉진시키는데 잠재적으로 유용한 것으로 생각된다.
성장 호르몬의 방출을 촉진시키기 위한 특정의 대표적인 합성 펩티드의 상대적 유효성을 측정하기 위해, 표준으로서 합성 hpGRF(1-40)-OH 를 사용하여 동물 농도의 합성된 대표적 유사체와 나란히 비교하는 시험관내 분석을 수행한다. 3-5일 전에 제거된 쥐의 뇌하수체 세포선 세포를 포함하는 배양물을 사용한다. 이런 배양물은 성장 호르몬의 분비에 최적인 것으로 생각되며, 베일 일동에 의한 내분비학(Endocrinology), 91, 562-572(1972), 특히 베일 일동에 의한 내분비학, 112, 1553-1555(1983) 에 기술된 일반적인 방법으로 비교시험을 위해서 사용된다. 시험되는 물질을 3-4시간 동안 배양하고, 배양 배지의 분취량을 제거 및 처리하여, 특성이 잘 부여되는 방사 면역분석에 의해 면역반응적 GH(ir GH) 내에서 이들의 함량을 측정한다.
동물 농도에 대한 비교시험의 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
성장 호르모르몬의 분비에 대한 시험관내 시험에 덧붙여서, 생체내 실험에서느 합성 펩티드를 우레탄-마취된 숫쥐내로 정맥내 주사하여, 외부 GRF에 대한 반응을 없애지 않고도 이들이 자발적인 GH분비를 억제하는지를 결정한다. 주사 직전 및 주사 후 10, 30 및 60분에 혈액 샘플을 취하고 방사면역 분석 시험에 의해서 혈액내 GH 수준을 측정한다. 이러한 함성 펩티드에 대한 생체내 시험은 각각이 놀랍게도 hpGRF(1-40)-OH에 의한 것보다 훨씬 더 큰 생화학적 효능을 가짐을 나타낸다. 이들 합성 GRF 유사체는 실질적으로 더 긴 효능의 지속기간을 갖느데, 이것은 IV 주사후 30분과 60분 후에 측정할 경우 뇌하수체 GH의 혈액 수준에서 보여진다. 생체내 시험에서 GH의분비를 검출하기에 유효한 것으로 알려진 다른 공지된 GRF는 이러한 결과를 확인하기 위해 이용된다. 체중 kg 당 이러한 펩티드 약 500 나노그램 내지 약 50마이크로그램의 투여량이 GH 분비를 일으키는데 효과적인 것으로 보여진다.
이러한 합성 hGRF 유사제와 가능하게는 rGRF 유사체는 내과의사가 GH 생산을 높이고 싶어하는 인간 적용에 있어서 유용해야만 한다. 이러한 유사체에 의한 GH 분비의 촉진은 내부 GRF 의 생산부족에 의해 야기되는 완전한 또는 상대적인 GH 결핍증세를 갖는 환자에게 있어 중요하다. 또한 증가된 GH 분비 및 그것의 성장에 있어서의 부수적인 증가는 정상적인 GH 수준을 갖는 인간 또는 동물에서 얻어질 수 있을 것이다. 또, 투여는 신체 지방 함량을 변화시켜야 하며 다른 GH-의존 대사성, 면역학적 및 발전학적 방법을 수정해야만 한다. 예컨데, 이러한 유사체들은 화상을 당한 것과 같은 환경하에서 인가의 신진대사 작용을 자극하는 수단으로서 유용할 수 있다. 또 다른 예로서, 이런 유사체들은 병아리, 칠면조, 돼지, 염소, 소 및 양과 같은 상업적인 온혈동물에게 투여될 수 있으며, 어류 및 다른 냉혈수산동물들, 예컨대 바다거북이 및 뱀자어, 및 양서류를 기르는 수중배양(aquiculture)에서 사용되어, 성장을 촉진시키고 펩티드의 유효량을 공급함으로써 얻어지는 지방에 대한 단백질의 비율을 증가시킨다.
인간에게 투여하기 위해서, 이런 합성 펩티드는 적어도 약 93%, 바람직하기로는 적어도 98%의 순도를 가져야만 한다. 이러한 적용을 위하여, 순도는 존재하는 모는 펩티드 단편의 정해진 중량%를 구성하는 의도된 펩티드를 의미한다. 성장을 촉진시키고 지방 함량을 감소시키기 위해 상업적 목적의 다른 동물에게 이런 합성 펩티드를 투여하기 위해서는, 약 5%만큼 낮거나, 또는 심지어 0.01% 만큼 낮은 순도가 허용될 수 있다.
제약학적 조성물을 형성하기 위해 제약학적 또는 수의학적으로 허용가능한 담체와 결화되는 이러한 합성 펩티드 또는 그 비독성염은 인간을 호함한 동물에게 정맥내, 피하내, 근육내, 경피적으로, 예컨대 비(비)내 또는 심지어 경구적으로 투여될 수 있다. 처리되는 숙주가 이런 치료학적 처리를 요하는 경우 GH의 방출을 자극하기 위해 이런한 투여를 내과의사가 이용할 수 있다. 필요 투여량은 처리되는 특정한 조건, 조건의 심각도 및 원하는 처리의 지속시간에 따라 변화할 것이다.
이런 펩티드들은 비독성 염, 예컨대 산부가염 또는 아연, 철 등과의 금속 착화합물(본 적용을 위해 염으로서 고려됨)의 형태로 종종 투여된다. 이런 산부가염의 예로는 히드로크로라이드, 히드로브로마이드, 황산염, 인산염, 말리에이트(maleate), 아세테이트, 벤조에이트, 숙시네이트, 말레이트(malate), 아스코르베이트, 타르트레이트 등이 있다. 만일 활성성분이 정제형태로 경구 투여되는 경우, 이러한 정제는 트라가칸트(tragacanth), 콘스타치 또는 젤라틴과 같은 결합제; 알긴산과 같은 붕해제; 및 마그네슘스테아레이트 같은 윤활제를 함유할 수 있다. 만일 액체형태의 투여가 바람직한 경우, 감미/또는 향미제가 사용될 수 있으며, 등장성 염류, 인산 완충 용액등으로 정맥내 투여할 수 있다.
펩타드는 내과의사의 지침에 따라 인간에게 투여되어야 하며, 제약학적 조성물은 통상 고체 또는 액체, 제약학적으로 허용가능한 담체와 결합되어 있는 펩티드를 보통 함유한 것이다. 보통 비경구적 투여량은 숙주의 체중 kg당 약 0.01-1ug의 펩티드일 것이다.
본 발명이 본 발명자에게 현재 알려진 가장 최선의 방식을 구성하는 바람직한 실지예와 관련하여 설명되었을지라도, 당업계에서 통상의 기술을 갖는 사람에게 자명한 바와 같은 여러 변화 및 변형은 여기 첨부된 청구범위에 기재된 발명의 영ㅇ역에서 벗어남 없이 가능하다는 사실이 이해되어야 한다. 예컨대, 펩티드 사슬에서의 변형, 특히 펩티드의 카르복시기 말단에서 시작하여 약 29-위치까지의 삭제는 종래의 실험관행에 따라 이루어질 수 있는데, 이는 펩티드 단편을 생산하기 위한 지금까지의 알려진 실험관행이며, 이러한 펩티드들은 본 발명의 영역안에 속한다고 본다. 또한, 말단의 한 쪽 또는 두개의 말단에서 첨가가 일어날 수 있고, 또는 쳅티드 화학의 전분야에서 잘 알려진 바와 같이, 천연발생의 잔기 대신 일반적으로 동등한 간기가 치환되어, 본 발명의 영역에서 벗어남 없이 청구된 폴리펩티드의 효능의 적어도 실질적인 부분을 갖는 다른 유사체를 생산할 수 있다. 더구나, 현재 당업계의 상황에 따라 C-말단에서 바람직한 -NH2 기에 변형이 일어날 수 있는데, 예컨대 C-말단의 아미노산 잔기의 카르복실 부분은 라디칼 -COOR, -CRO, -CONHNHR, -CON(R)(R')또는 -CH2OR 일 수 있어며, 이때 R 및 R' 은 저급알킬, 플루오로 저급알킬 또는 수소이고, 동등한 합성 펩티드를 얻은 이러한 변형이 본 발명에서 벗어나지 않은다.
본 발명의 다양한 특징은 하기 처구범위에서 강조된다.
Claims (18)
- 하기 서열을 갖는 합성 펩티으 또느 그의 비독성염: (B)R1-R2-R3-Ala-Ile-Phe-Thr-R8-Ser-(Q1)R10-Arg-R12-(Q2)R13-Leu-R15-Gln-Leu-R18-(Q3)Ala-Arg-R21-(Q4)R22-Leu-R24-R25-Ile-R27-R28-Arg-Gln-Gln-Gly(여기서 R1은 Try, D-Tyr, Met, Phe, D-Phe, pCl-Phe, Leu, His 또는 D-His; B는 H, CaMe, NaMe, 데스아미노, Ac 또는 For; R2 는 Ala, D-Ala, NMA 또는 D-NMA; R3 은 Asp 또는 D-Asp; R8 은 Ser, Asn, Lys, Arg, Asp 또는 Gln; R10 은 Try, D-Tyr 또는 Phe; R12 은 Arg 또는 Lys; R13 은 Ile, Val, Leu 또는 Ala; R15 은 Gly 또는 Ala; R18 은 Ser 또는 Ser; R21은 Lys, D-Lys, Arg 또는 D-Arg; R22 은 Leu, Ile, Ala 또는 Val; R24은 Gln 또는 His; R25 은 Asp 또는 Glu; R27 은 Met, D-Met, Ala, Nle, Ile, Leu, Nva, 또는 Val; R28은 Asn 또는 Ser 이며; Q1-!4 은 H 또는 CaMe이며, 단 R30 과 R32 사이의 잔기의 일부 또는 전부가 제거될 수 있으며, 또한 Q1-Q4 중의 하나 이상은 Came이며, 또는 R8 은 Lys 또는 Arg 이며, 또는 R21 은 D-Lys 또는 D-Arg이다.)
- 제 1 항에 있어서, R18 이 Ser 이며, R24 가 Gln이며, R25 가 Asp인 펩트드.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, R이 Lys 인 폡티드.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, R21이 D-Arg 인 폡티드.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, R21이 D-Lys 인 폡티드.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, R22이 Leu 인 폡티드.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, R27이 Nle 인 펩티드
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, R15 이 Ala 인 폡티드.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, R28이 Asn인 폡티드.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, Q1이 CaMe 인 폡티드.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, Q1이 Came 인 폡티드.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, Q3이 CaMe 인 폡티드.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, Q4이 CaMe 인 폡티드.
- 제 1 항에 있어서, 식(NaMetyr1, Asp8, Ala15, Nle27, Asn28］ -hGRF(1-29)-NH2를 갖는 펩티드.
- 제 1 항에 있어서, 식(NaMetyr1, Asp8, Ala15, Nle27, Asn28］ -hGRF(1-29)-NH2를 갖는 펩티드.
- 제 1 항에 있어서, 식(NaMetyr1, Asp8, Ala15, Nle27, Asn28］ -hGRF(1-29)-NH2를 갖는 펩티드.
- 제 1 항에 있어서, 식(NaMetyr1, Asp8, Ala15, Nle27, Asn28］ -hGRF(1-29)-NH2를 갖는 펩티드.
- 제 1 항에 있어서, 식(NaMetyr1, Asp8, Ala15, Nle27, Asn28］ -hGRF(1-29)-NH2를 갖는 펩티드.
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