PT87529B - Processo de preparacao de analogos do factor de libertacao de hormona de crescimento vii (flhc) - Google Patents
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Description
MEMÓRIA DESCRITIVA presente invento refere-se a pêptidos que possuem influência na função da glândula pituitária em seres humanos e ojj tros animais. Em particular, o presente invento refere-se a um pêptido que promove a libertação da hormona do crescimento pela glândula pituitária.
Antecedentes do Invento
Os fisiologistas reconhecem desde à longo tempo que o hi potálamo controla as funções secretoras da adenohipófise, produ zindo o hipotálamo substâncias especiais que estimulam ou inibem a secreção de cada uma das hormonas pituitárias. Um factor ini bidor hipotalâmica foi caracterizado em 1972 na forma de somatostatina a qual inibe a secreção da hormona do crescimento (HC). Em 1982, isolaram-se factores de libertação pancreáticos humanos (tumor) (FLHCph) a partir de extractos de tumores pancreáticos humanos, factores esses que foram purificados, caracterizados, sintetizados e testados, verificando-se que promovem a libertação da HC pela pituitária. Estes factores hipofisiotrâpicos foram reproduzidos por síntese completa e sintetizaram -se análogos das estruturas nativas. 0 factor de libertação da HC hipotalâmico humano tem precisamente a mesma estrutura; assim utilizar-se-á daqui em diante o termo FLHCh (liGRE”). Descrição Sumária do Invento
Foram agora sintetizados e testados polipéptidos sintéti. cos que libertam a HC a partir de células pituitárias em cultura, que possuem maior resistência à degradação enzimática no οχ ganismo, e que exibem uma potência muito substancialmente aumejn tada. Crê-se que estas propriedades vantajosas resultam do faç: to de os pêptidos possuírem uma forma alfa-helicoidal, de estabilidade aumentada. Estes pêptidos têm preferivelmente pelo me nos um resíduo nas posições 10, 13, 19 e 22 que se encontra substituído com um grupo metilo no seu átomo de carbono alfa (C*Me), e mais preferivelmente vários desses resíduos estão assim substituídos. D-Ala, h^CH^-D-AlaÍD-NMA) ou NMA podem ser substituídos na posição 2. Quer D-Lys, quer D-Arg encontram-se
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-4preferivelmente na posição 21, e Nle encontra-se preferivelmente presente na posição 27, Lys encontra-se preferivelmente substituído na posição 8, mas quer Arg, Ser, Glu ou Asp podem também encontrar-se substituídos. Os péptidos podem também pos suir um dos resíduos seguintes na posição 1: Tyr, D-Tyr, Met, Phe, D-Phe, pCl-Phe, Leu, His e D-His, resíduos esse que pode, opcionalmente ter um substituinte metilo, quer no carbono alfa quer no grupo alfa-amino, ou cujo grupo alfa-amino tenha sido eliminado (desamino); este residuo pode também apresentar o seu grupo alfa-amino acilado, preferivelmente por acetil (Ac) ou formil (for). Os péptidos podem opcionalmente apresentar D-Asp na posição 3 e/ou Arg na posição 12 e/ou Phe ou D-Tyr na posição 10 e/ou Ala na posição 15. Podem também possuir D-Met ou Nva ou outros resíduos em vez de Met na posição 27 e/ou Asn na posição 28. Os resíduos nas posiçães 13 e 22 podem ser qual, quer um dos seguintes: Leu, Ile, Ala e Vai.
As composiçSes farmacêuticas de acordo com o invento, incluem os análogos que têm entre cerca de 29 e 44 resíduos, em comprimento, ou um sal não tóxico de qualquer um deles, dispersos num veículo liquido ou sólido farmacêutica ou veterinariamente aceitável. Estas composiçães farmacêuticas podem ser uti. lizadas em medicina clínica tanto humana como veterinária, para administração com fins terapêuticos e também de diagnóstico. Além disso, as composiçSes do invento podem ser utilizadas para promover o crescimento de animais de sangue quente, incluindo aves e em aquicultura para animais de sangue frio, por exemplo peixes, enguias, etc..
Descrição detalhada das concretizaçSes preferidas
A nomenclatura utilizada para definir os péptidos é a ss pecificada por Schroder ά Lubke, The Peptides, Academic Press (1965), em que, de acordo com a representação convencional, o grupo amino do terminal N aparece à esquerda e o grupo carboxilo do terminal C aparece à direita. Por aminoácido natural pre tende-se referir um dos aminoácidos comuns e de ocorrência natu ral que se encontram nas proteínas, compreendendo Gly, Ala, Vai, Leu, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Phe,
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-5Tyr, Pro, Trp β His. Por Nle pretende-se representar a norleucina e por Nva a norvalina. Quando o resíduo aminoácido possui formas isoméricas representa-se a forma L do aminoácido a menos que se indique expressamente o contrário. D-NMA significa o isómero D da alanina em que o grupo alfa-amino foi substituído por metilo.
invento proporciona em geral pêptidos sintéticos possu indo a sequência (I) seguinte: (B)Ri-R2-R.5-Ala-Ile-Phe-Thr-Rg-Ser-(Q1)R10-Arg-R12-(Q2)R13-Leu-R15-Gln-Leu-R18-(Q3)Ala-Arg-R^-ÍQpR^-Leu-R^-R^-Ile-R^-R^-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-R.j^-Asn -Gln-Glu-Rjg-R^g-R^Q-Arg-R^-R^-j-R^ em que R.^ é Tyr, D-Tyr, Met, Phe, D-Phe, pCl-Phe, Leu, His ou D-His; B ê H, C^Me, N^Me, des.a
| mino, -Asp; | Ac ou For; R„ é Ala, D-Ala, NMA ou D-NMA; | R^ ô Asp ou Dê Tyr, D-Tyr ou | ||
| R8 | é Ser, Asn, Lys, Arg, Asp ou Gin; R^g | |||
| Phe; | r,2 | é | Arg ou Lys; R,, ê Ile, Vai, Leu ou Ala; R.^ é Gly | |
| ou Ala; | R18 | ê Ser ou Tyr; R21 é Lys, D-Lys, Arg | ou D-Arg; R22 | |
| ê Leu | , Ile, | Ala ou Vai; R^ é Gin ou His; R^ é | Asp ou Glu; | |
| R22 é | Met | , D | '-Met, Ala, Nle, Ile, Leu, Nva ou Vai; | R2g é Asn ou |
| Ser; | R34 | é | Ser ou Arg; R^g ê Arg ou Gin; R·^ ô | Gly ou Arg; |
| R4Q 6 | Ala | ou | Ser; R^2 ê Phe, Ala ou Vai; R^^ é | Asn ou Arg; R^ |
ê um aminoácido natural; sSo R ou ^Μθ» desde que no entanto um ou todos os resíduos entre R30 e R44* inclusivé, possam ser eliminados, e desde que também pelo menos um de seja
C^Me e/ou Rg seja Lys ou Arg e/ou R^ seja D-Lys ou D-Arg.
Preferivelmente, os pêptidos deverão possuir a sequência: (B)R^-R2-R;3-Ala-Ile-Phe-Thr-Rg-Ser-(Q1)R1g-Arg-RjL2-(Q2)R^2-Leu-Rl5-Gln-Leu-Ser-(Q-5)Ala-Arg-R2i-(QZt)R22~1-eu”^In“ftsP“^IB~R27” -R2g-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-R/iO42 R43R44 em Pus & Tyr, D-Tyr, Met, Phe, D-Phe, pCl-Phe, Leu, His ou D-His; B é H, C^Me, N°^Me, desamino, Ac ou For; R2 é Ala, D-Ala, NMA ou D-NMA; R^ é Asp ou D-Asp; Rg é Ser, Asn, Lys,
Arg, Asp ou Gin; R^g é Tyr, D-Tyr ou Phe; R^2 ê Arg ou Lys;
R13 é Ile, Vai, Leu ou Ala; R^^ é Gly ou Ala; R^ é Lys, D-Lys, Arg ou D-Arg; R22 ê Leu, Ile, Ala ou Vai; R27 é Met, D-Met,
Ala, Nle, Ile, Leu, Nva ou Vai; R2g ê Asn ou Ser; R^2 é Phe,
Ala ou Vai; R43 β Asn ou Arg; R^ é um aminoácido natural;
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-6Ql“Q^ são Η ou C^Me, desde que no entanto um ou todos os resídu. os entre R^g e R^^, inclusivé, possam ser eliminados. Preferivelmente, pelo menos um de Q-^-Q^ á C^Me; preferivelmente Rg é Lys ou Arg; e preferivelmente R21 é D-Lys ou D-Arg. 0 grupo carboxilo do resíduo aminoácido do terminal C pode ser qualquer um dos seguintes radicais: -COOR, -CRO, -CQNHNHR, -CON(r)(R') ou -CH20R, sendo R e R’ alquilo de baixo peso molecular, fluoro alquilo de baixo peso molecular ou hidrogénio; os grupos alqui lo de baixo peso molecular preferidos são o metilo, o etilo e o propilo. Quando Met aparece na posição 1, pode ser preferível ter outro resíduo na posição 27.
Os fragmentos que se prolongam desde o terminal N até ao residuo 29 possuem potência biológica, na efectivação da libertação da HC pela pituitária e os fragmentos biológicamente acti. vos com um comprimento de 29 ou 32 resíduos que possuam um terminal C que seja uma amida ou uma amida substituída são os mais preferidos. Quando o pêptido tem 40 ou mais resíduos não existe uma preferência clara pelo grupo no terminal C.
Os péptidos são sintetizados por um processo adequado, co mo técnicas exclusivamente em fase sólida, por técnicas parcia_l mente em fase sólida, por condensação de fragmentos ou por acoplamentos em solução clássicos. 0 emprego das técnicas de ADN recombinante recentemente desenvolvidas pode ser utilizado para preparar uma porção de um análogo contendo apenas resíduos de aminoácidos naturais, a qual pode então ser ligada a um péptido curto de terminal N. Por exemplo, as técnicas de síntese exclu sivamente em fase sólida estão estabelecidas no livro de texto Solid-Phase Peptide Synthesis”, Stewart & Young, Freeman & Co., San Francisco, 1969, e são exemplificadas pela descrição da Patente U.S. N9. 4 105 603 publicada em 8 de Agosto de 1978 por Vale e Co. A síntese clássica em solução encontra-se descrita em detalhe no tratado Methoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl): Synthese von Peptiden”, E. Wunsch (editor) (1974) Georg Thieme Verlag, Stuttgart, W, Ger. 0 processo de síntese por cori densação de fragmentos encontra-se exemplificado na Patente U.S. NS. 3 972 859 (3 de Agosto de 1976). Outras sínteses disponíveis são exemplificadas pelas Patentes U.S. NS. 3 842 067 (15
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ί'ΐ:-7de Outubro de 1974) e N9, 3 862 925 (28 de Oaneiro de 1975).
Comum a todas estas sínteses é a protecção dos grupos lá beis de cadeia lateral dos vários grupos aminoácidos, com grupos protectores adequados que impedem a ocorrência de reacção química nesse ponto até que o grupo seja por Fim removido. Usualmente é também comum a protecção de um grupo alfa-amino num aminoácido ou num fragmento, enquanto essa entidade reage no grupo carboxilo, seguida da remoção selectiva do grupo protector de alfa-amino para permitir a ocorrência da reacção subsequente nesse local. Assim, é comum, como passo de síntese, a produção de um composto intermediário que inclui cada um dos resíduos ami noácidos dispostos com a sequência desejada na cadeia peptídica, com grupos protectores de cadeia lateral ligados aos resíduos apropriados.
Relacionado com isto, pelo presente invento preparam-se intermediários de Fórmula (II): X3'-(B)R^(X ou X2)-R2~R3(X3)-Ala-Ile-Phe-Thr(X4)-Rg(X8) Ser(X4)-Rl0(X2)-Arg(X6)-R12(X6 ou X7)-(Q2)R13-Leu-R15-Gln(X5)-Leu-R18 (X2)-(Q3)Ala-Arg(X6)-R21(X6 ou X7)-(Q4)R22-Leu-R24(X5 ou X)-R25(X3)-Ile-R27-R2Q(X4 ou X5)-Arg(X6)-Gln(X5)-Gln(X5)-Gly-Glu(X3)-R34(X4 ou X6)-Asn(X5)-Gln(X5)-Glu (X3)-R38(X6 ou X5)-R39(X6)-R40(X2)-Arg(X6)-R42-R43 (X5 6 8 9 1 ou x°)-r44(x°)-x’ em que: Xx é hidrogénio ou um grupo protector de oí-amino. Os grupos protectores de c<_amino contemplados por X3· são os bem conhecidos como úteis na especialidade de síntese de polipôptidos por etapas. Entre as classes de grupos protectores de ot-amino que podem ser empregues como X1 encontram-se (l) grupos protectores aromáticos tipo uretano, como fluorenilmetiloxicarbonilo (FMOC), benziloxicarbonilo (Z) e Z substituído, como p-clorobenziloxicarbonilo, p-nitrobenziloxicarbonilo, p-bromobenziloxicarbonilo e p-metoxibenziloxicarbonilo; (2) grupos protectores uretano alifáticos, como t-butiloxicarbonilo (BOC), diisopropilmetiloxicarbonilo, isopropiloxicarbonilo, etoxicarbonilo, aliloxicarbonilo; e (3) grupos protectores cicloalquílicos do tipo uretano, como ciclopentiloxicarbonilo, adamantiloxicarbonilo e ciclo-hexiloxicarbonilo. 0 grupo protector
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-8de oC-amino preferido é o BOC, mesmo quando se emprega um resíduo N^Me-substituído na posição 1; claro que X^ê H quando B é desamino.
X é hidrogénio ou um grupo protector para o azoto do imi dazol de His, como Tos.
X pode ser um grupo protector adequado para o grupo hidroxilo fenfilico da Tyr, como tetra-hidropiranilo, terc-butilo, tritilo, Bzl, CBZ, 4Br-CBZ e 2,6-diclorobenzilo (DCB). 0 grupo 2 protector preferido é o 2,6-diclorobenzilo. X pode ser hidrogénio o que significa que não existe grupo protector de cadeia lateral no resíduo aminoácido, nessa posição.
X3 é hidrogénio ou um grupo protector formador de éster adequado, para o grupo carboxilo de Asp ou de Glu, como benzilo (OBzl), 2,6-diclorobenzilo, metilo e etilo.
X pode ser um grupo protector adequado para o grupo hidroxilo de Thr ou de Ser, como acetilo, benzoilo, terc-butilo, tritilo, tetra-hidropiranilo, Bzl, 2,6-diclorobenzilo e CBZ. 0 4 grupo protector preferido é Bzl. X pode ser hidrogénio, o que significa que não existe grupo protector no grupo hidroxilo.
X é hidrogénio ou um grupo protector adequado para o 5 grupo amido de cadeia lateral de Asn ou de Gin. X é de preferência xantilo (Xan).
X é um grupo protector adequado para o grupo guanido de Arg, como nitro, Tos, CBZ, adamantiloxicarbonilo e Boc, ou é hi. drogénio.
X é hidrogénio ou um grupo protector adequado para o grupo amino da cadeia lateral de Lys. Exemplos ilustrativos de grupos protectores para o grupo amino da cadeia lateral são 2-clorobenziloxicarbonilo(2-Cl-Z), Tos, t-amiloxicarbonilo e BOC.
θ
X é hidrogénio ou um grupo protector de cadeia lateral adequado, como acima especificado em geral.
grupo Met pode opcionalmente ser protegido por oxigénio, mas é de preferência deixado desprotegido.
A selecção de um grupo protector de amino de cadeia late
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-9ral não ê crítica, com a excepção de que se escolhe geralmente um grupo que não seja removido durante a desprotecção dos grupos ot-amino durante a síntese. No entanto, para alguns aminoácidos, por exemplo para His, a protecçâo não é geralmente necessária depois de se completar o acoplamento, e os grupos protectores podem ser os mesmos.
q
X é um grupo protector adequado para o grupo carboxilo do terminal C, como o grupo formador de éster X^, ou ê uma liga ção de ancoragem, usada na síntese em fase sólida para ligação 9 a um suporte sólido de resina, ou é des-X , caso em que o residuo na posição do terminal C possui um grupo carboxilo que é Y, como anteriormente definido. Quando se utiliza um suporte sóli do de resina, este pode ser qualquer um dos conhecidos na especialidade, como um que possua as fórmulas: suporte de resina-0 -CH2, suporte de resina -NH-benzo-hidrilamina (BHA) ou suporte de resina -NH-parametilbenzo-hidrilamina (MBHA), Quando se deseja a amida não substituída, é preferível utilizar a resina BHA ou MBHA, porque a clivagem origina directamente a amida. No caso em que se deseja a N-metilamida, esta pode ser produzida a partir de uma resina BHA-N-metil. Caso se desejem outras amidas substituídas, poderão utilizar-se os ensinamentos da Patente E.U. Na. 4 569 967, ou, caso se desejem ainda outros grupos que não o ácido livre na posição do terminal C, poderá ser preferível efectuar a síntese do pêptido usando métodos clássicos como os estabelecidos no texto de Houben-Weyl.
Na fórmula para o intermediário, pelo menos um dos gru9 pos X é um grupo protector ou X incluí um suporte de resina. Assim, o invento proporciona também um processo para a preparação de um péptido de interesse por (a) formação de um péptido possuindo pelo menos um grupo protector e a fórmula (ll): em que: X, X1, X2, X5, X4, X5, X6, X7 e X8 são cada um quer hidra 9 gênio quer um grupo protector e X ê, quer um grupo protector quer uma ligação de ancoragem a um suporte de resina ou é des9
-X , caso em que o resíduo na posição do terminal C, pode ter o grupo carboxi desejado; (b) remoção do grupo, ou grupos, protector ou da ligação de ancoragem do péptido de fórmula (II)5 θ (c) se desejado, conversão do pêptido resultante com a sequêr.
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-10cia (I) num seu sal não tóxico.
Na selecção de um grupo protector de cadeia lateral, par; ticular, a ser utilizado na sintese dos póptidos, seguem-se as regras gerais seguintes: (a) o grupo protector retém preferivelmente as suas propriedades protectoras e não é removido nas condições de acoplamento, (b) o grupo protector deverá ser estável face ao reagente e, com a excepção de Xan, é preferivelmente estável sob as condições reaccionais seleccionadas para a de remoção do grupo protector /o<-amino em cada um dos passos da síjn tese, e (c) o grupo protector da cadeia lateral deve ser removível, após se completar a síntese, compreendendo a sequência de aminoácidos desejada, em condições reaccionais que não alterem indesejável mente a cadeia peptídica.
Quando os póptidos não são preparados usando a tecnologia do ADN recombinante, são preferivelmente preparados usando a síntese em fase sólida, tal como descrita de forma geral por Merrifield, 3. Am, Chem, Soc., 85, p 2149 (1963), apesar de se poderem também utilizar outras sínteses químicas equivalentes, conhecidas na especialidade, como previamente mencionado. A síntese em fase sólida é iniciada a partir da posição do terminal C do péptido por acoplamento de um °L-aminoácido protegido a uma resina adequada. Este material de partida pode ser prep.a rado por ligação de um aminoácido ©t-amino protegido, por uma ligação éster, a uma resina clorometilada ou a uma resina hidro ximetilo ou por uma ligação amida a uma resina BHA ou MBHA. A preparação da resina hidroximetilo, encontra-se descrita por Bodansky e col. em, Chem. Ind. (London) 38, 1597-98 (1966). As resinas clorometiladas são comercializadas pelo Bio Rad Laboratories, Richmond, Califórnia e pelo Lab. Systems, Inc. A prep.a ração dessas resinas encontra-se descrita por Steiuart e col., Solid Phase Peptide Synthesis (Freeman & Co., San Francisco 1969), capitulo 1, pg. 1-6. Os suportes das resinas BHA e MBHA encontram-se comercialmente disponíveis e são em geral utilizados apenas quando o polipêptido desejado, a sintetizar, possui uma amida não substituída na posição do terminal C.
aminoácido do terminal C, por exemplo Asn, protegido
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-11por BOC e por Xan, pode ser primeiro acoplado à resina clorometilada de acordo com o processo estabelecido em Chemistry Letters, K. Horiki e col,, 165-168 (1978), usando KF em DMF, a cer ca de 60SC, durante 24 horas, com agitação, quando por exemplo se pretende sintetizar um análogo ácido livre com 43 resíduos do FLHC de ratazana (FLHCr). Após o acoplamento do aminoácido pro tegido por BOC ao suporte de resina, o grupo protector de c^-ami. no é removido, usando ácido trifluoroacético (TFA) em cloreto de metileno ou apenas TFA. A desprotecção á efectuada a uma temperatura compreendida entre cerca de 09C e a temperatura ambiente. Outros reagentes padrão de clivagem, como HC1 em dioxa. no, e condições de remoção de grupos protectores de o<-amino es. pacíficos, podem ser utilizados, como descrito por Schroder & Lubke, em The Peptides, 1 pág. 72-75 (Academic Press 1965).
Após a remoção do grupo protector de ot-amino, os aminoácidos protegidos na cadeia lateral ou em ol-amino restantes são acoplados por etapas na ordem desejada para obter o composto intermediário anteriormente definido ou, como alternativa à adição de cada aminoácido separadamente, na síntese, alguns deles podem ser acoplados com outro, antes de se efectuar a adição ao reactor em fase sólida. A selecção de um reagente de acoplamento apropriado pertence â experiência da especialidade. Particularmente apropriada como reagente de acoplamento é a N,N'-diciclo-hexilcarbodiimida (DCCl).
Os reagentes activadores utilizados na síntese, em fase s lida, dos pêptidos são bem conhecidos na especialidade dos pópt dos. Exemplos de reagentes activadores adequados são as carbodiimidas, como a Ν,Ν'-diisopropilcarbodiimida e a N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida. Outros reagentes activadores e a sua utilização no acoplamento de pêptidos encontram-se descritos por Schroder & Lubke supra, no Capítulo III e por Kapoor, 3. Phar. Sei., 59, pág. 1-27 (1970).
Cada um dos aminoácidos ou sequência de aminoácidos, pro. tegidos, é introduzido no reactor de fase sólida num excesso de quatro vezes ou superior, e o acoplamento pode ser efectuado num meio de dimetilformamida (DMF): CH2C12 (l:l) ou apenas em DMF
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Wís
-12ou CF^C^. Nos casos em que ocorre um acoplamento incompleto, o processo de acoplamento é repetido antes de se efectuar a remoção do grupo protector de ol-amino, que precede 0 acoplamento do aminoácido seguinte. 0 sucessc da reacção de acoplamento em cada passo da síntese, se processa manualmente, é preferivelmente monitorado pela reacção da ninidrina, como descrito por E. Kaiser e col., Anal. Biochem. 34, 595 (1970). As reacções de acoplamento podem ser processadas automaticamente, como num siri tetizador automático Beckman 990, usando um programa como o des. crito em Rivier e col., Biopolymers, 1978, 17, pág. 1927-1938.
Apôs a sequência de aminoácidos desejada ter sido comple. tada, o péptido intermediário pode ser removido do suporte de resina por tratamento com um reagente, como um fluoreto de hidrogénio líquido, o qual não só cliva o pêptido da resina como também cliva todos os grupos protectores de cadeia lateral X, , X3, X4, X3, X6, X? e Χθ s a ligação de ancoragem X^ e também a ligação do grupo protector de ot-amino, se este tiver sido uti lizado, para obter um pêptido na forma do ácido livre. Se o grupo Met estiver presente na sequência, 0 grupo protector BOC é preferivelmente removido em primeiro lugar usando ácido trifluoroacético (ATF)/etanoditiol antes de se efectuar a clivagem do péptido da resina com HF para eliminar uma potencial S-alqui. lação.
Ao utilizar fluoreto de hidrogénio para a clivagem, inclui-se anisol e sulfureto de etilo e metilo no vaso reaccional como instrumentos de limpeza.
Exemplo I seguinte estabelece um processo preferido p.a ra a síntese de pêptidos pela técnica de fase sólida. Entender, -se-â com certeza que a sintese de um pêptido correspondente de cadeia maior, ô efectuada pela simples adição do número de amino ácidos requesitado ao terminal C da cadeia. Considera-se presejn temente que os fragmentos biologicamente activos deverão conter a sequência indicada na região do terminal N, e a adição de resíduos â região do terminal N não é considerada vantajosa.
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46634
-13EXEMPLO I
A síntese do pêptido /N^MeTyr^, Asp8, Ala^, Nle27, Asn28J/-FIiHC!h(l-29)-NH2 possuidor da fórmula: N^MeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-T yr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Asn-Arg-NH2 é conduzida por etapas usando um sintetizador de pêptidos Beckman 990 numa resina MBHA comercialmente disponível como descrito na generalj. dade em Vale e col. Patente U.S, Ne. 4 292 313. 0 acoplamento de BOC-Arg(Tos) à resina resulta na substituição de cerca de 0,35 mmol de Arg por grama de resina.
Após desbloqueamento e neutralização, a cadeia peptidica ê construída passo a passo na resina. 0 desbloqueamento, neutralização e adição de cada aminoácido é efectuado de acordo com o procedimento estabelecido detalhadamente em Rivier, 0,
3. Amer. Chem. Soc., 96, 2986-2992 (1974). Todos os solventes utilizados são cuidadosamente desarejados por aspersão com um gás inerte, por exemplo hélio ou azoto, para assegurar a ausência de oxigénio que pode originar indesejavelmente a oxidação do enxofre do resíduo Met.
desbloqueamento ê preferivelmente efectuado de acordo com o Esquema A que se segue:
ESQUEMA A
Reagente Tempo de mistura (Min.)
| 1. | 60% TFA/2% etanoditiol | 10 |
| 2. | 60% TFA/2% etanoditiol | 15 |
| 3. | IPA/l% etanoditiol | 0,5 |
| 4. | EtjN (10%) em CH2C12 | 0,5 |
| 5. | MeOH | 0,5 |
| 6. | Et-jN (10%) em CH2C12 | 0,5 |
| 7. | MeOH (duas vezes) | 0,5 |
| 8. | CH2C12 (duas vezes) | 0,5 |
Os acoplamentos são preferivelmente efectuados de acordo com o estabelecido no Esquema B que se segue:
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-14ESQUEMA Β
Reagente Tempo de mistura (Min.)
| 9. | DCCI | - |
| 10. | aminoácido-BOC | 50-90 |
| 11. | MeOH (duas vezes) | 0,5 |
| 12. | CH2C12 (duas vezes) | 0,5 |
| 13. | Ac 0 (3M) em CFLCl | 15,0 |
| 14. | CH2C12 | 0,5 |
| 15. | MeOH | 0,5 |
| 16. | Ch^C^ (duas vezes) | 0,5 |
Sumariamente, utiliza-se uma a duas moles de aminoácido protegido com BOC, em cloreto de metileno, por cada grama de rei sina, juntamente com um equivalente de DCCI 1,0 molar em cloreto de metileno, durante duas horas. No acoplamento de BOC-Arg(Tos) utiliza-se uma mistura a 50/ de DMF e cloreto de metileno.
áter de Bzl é utilizado como grupo protector para o hidroxilo de cadeia lateral para Ser e Thr. 0 grupo amido de Asn ou de Gin ê protegido por Xan quando se utiliza preferivelmente o acoplamento DCC. 0 éster de p-nitrofenilo (ONp) pode também ser utilizado para activar a extremidade carboxilo de Asn ou Gin, e por exemplo, BOC-Asn(ONp) pode ser acoplado durante a noite usando um equivalente de HOBt numa mistura a 50/ de DMF e clore to de metileno, caso em que não ê adicionado DCC. 0 2-cloro-benziloxicarbonilo (2C1-Z) ê utilizado como grupo protector pa ra a cadeia lateral de Lys. Utiliza-se Tos para proteger o gru po guanido de Arg e o azoto do imidazol de His, e o grupo carba xilo da cadeia lateral de Glu ou Asp ô protegido com OBzl. 0 grupo hidroxilo fenfilico de Tyr é protegido com 2,6-diclorobenzilo (DCB). No final da síntese, obtém-se a seguinte composição: B0C-NdMeTyr(X2)-Ala-Asp(X3)-Ala-Ile-Phe-Thr(X4)-Asp(X3)-Ser(X4)-T yr(X2)-Arg(X^)-Lys(X7)-Val-Leu-Ala-Gln(X5)-Leu-Ser(X4)-Ala-Arg(X6)-Lys(X7)-Leu-Leu-Gln(X5)-Asp(X3)-Ile-Nle-Asn(X5)-Arg(X6)-X9 em que X2 é DCB, X3 é OBzl, X4 é Bzl, X5 é Xan, X6 é Tos,
X7 é 2C1-Z e X9 é suporte de resina NH-MBHA. 0 grupo Xan pode ter sido parcial ou totalmente removido por tratamento com TFA,
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-15utilizado para desbloquear o grupo protector de °t-amino.
Para clivar e desproteger o conjunto péptido protegido-resina, este ô tratado com 1,5 ml de anisolo, 0,5 ml de sulfureto de etilo e metilo e 15 ml de fluoreto de hidrogénio (HF), por grama de pôptido-resina, a 20SC durante meia hora e a OSC durante mais meia hora. Após eliminação do F sob vácuo elevado o pêptido-resina restante é lavado alternadamente com éter dietílico seco e com clorofórmio e o péptido ê então extractado com ácido acético aquoso 2 N desgaseificado e separado da resina por filtração.
péptido clivada e desprotegido ô então dissolvido em ácido acético 0-5/ e submetido a purificação a qual pode incluir filtração em gel fino, Sephadex G-50.
péptido é então adicionalmente purificado por cromatografia HPLC, preparativa ou semi-preparativa, como descrito em Rivier e col., Peptides: Structure and Sâaloqical Function, (1979) pg. 125-8 e Marki e col. 3. Am. Chem. Soc. 103, 3178 (l98l). E_n chem-se cartuchos, conforme a Waters Associates prep LC-500, com 15-20yit de Silica Ο^θ de Vydac (300A). Gera-se um gradiente de CHjCN em TEAP com um programador de gradiente Eldex de baixa pressão, como descrito em Rivier, 3., £. Liq. Chromatography 1, 343-367 (1978). As fracçães cromatográficas são cuidadosamante monitorizadas por HPLC recolhendo-se apenas as fracçães que apresentem uma pureza substancial. A dessalinização das fracçães purificadas, independentemente testadas quanto à pureza, é conseguida usando um gradiente de CH^CN em TFA 0,1/. 0 corte central ô então liofilizado para originar o péptido desejado, cuja pureza pode ser superior a 98/.
EXEMPLO II
A síntese de um péptido amidado com 40 resíduos /C^MeHis1, D-NMA^, D-Lys^^_7-FLHCh(l-40)-NH2 possuindo a fórmula: H-C^eHis-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-S er-T yr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-D-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-NH2 é conduzida por etapas usando um sintetizador de péptidos Beckman 990 numa
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-16resina MBHA, como descrito na generalidade em Vale e col., Patente U.S. NS. 4 292 313. Determina-se por CCF (cromatografia em camada fina) e HPLC que o péptido ê substancialmente puro.
EXEMPLO III
A síntese de /”D-NMA2, D-Lys21, Nle27_7-FLHCr(l-43)-0H possuindo a fórmula: H-His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-5er-5Br—Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-T yr-Ala-Arg-D-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-OH é conduzida por etapas usando um sintetizador de péptidos Beckman 990, usando uma resina clorometilada com acoplamento inicial como descrito em Chemistry Letters, supra, e em seguida como descrito genericamente no Exemplo I. Determina-se por CCF e HPLC que o péptido ê substancialmente puro.
EXEMPLO IV
A síntese do fragmento análogo de FLHCh hf^MeTyr1, Lys8, Ala1^, Nle27, Asn28_7-FLHCh(l-29)-NH2 possuindo a fórmula:
N^MeT yr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Lys-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Asn-Arg-F^ é conduzida por etapas usando um sintetizador de péptidos Beckman 990 numa resina MBHA, como no Exemplo I. Determina-se por CCF e HPLC que este análogo é substancialmente puro.
A síntese é repetida mudando o resíduo do terminal N para produzir N^MeHis1, Lys8, Alalí5, Nle27, Asn28_7-FLHCh(l-29)-nh2.
EXEMPLO V
A síntese do fragmento análogo de FLHCh /N^MeTyr1, D-Lys21, Nle27J7-FLHCh(l-29)-NH2 possuindo a fórmula: N^MeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-D-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-NH2 é conduzida por etapas usando um sintetizador de péptidos Beckman 990, numa resina MBHA como no Exemplo I. Determina-se por CCF e HPLC que o péptido é substancialmente puro.
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-17EXEMPLO VI
A sintese de /N^MeHis1, D-NMA2, Lys8, D-Arg21, Nle27_7~ -FLHCr(l-29)-NH2, possuindo a fórmula: N^Me-His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Lys-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-T yr-Ala-Arg-D-Arg-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-NH2 é conduzida por etapas,usando um sintetizador de Beckman 990 numa resina MBHA como no Exemplo I. Determina-se por CCF e HPLC que o pêptido é substancialmente puro.
EXEMPLO VII
A sintese de /O^MeTyr1, D-Tyr10, D-Lys21, Nle27_7-FLHCh(l-29)-NH2 possuindo a fórmula: N^MeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-D-T yr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-D-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-NH2 é conduzida por etapas, usando um sintetizador de pêptidos/^W^1 numa resina MBHA como no Exemplo X, Determina-se por CCF e HPLC que o pêptido é substancialmente puro.
EXEMPLO VIII
A síntese de D-NMA2, Asp8, D-Lys21, Nva27_7-FLHCr(l-29)-NH2 possuindo a fórmula: H-His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-D-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Nva-Asn-Arg-NH2 é conduzida por etapas, usando um sintetizador de póptidos Beckman 990, numa resina MBHA como no Exemplo I. Determina-se por CCF e HPLC que o pêptido é subs tancialmente puro.
EXEMPLO IX
A síntese de /~D“Phel, D-NMA2, Glu8, C^MeTyr10, Ile13, D-Lys2\_7-FLHCh(l-32)-NH2 possuindo a fórmula: H-D-Phe-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Glu-Ser-C^MeT yr-Arg-Lys-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-D-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2 é conduzida por etapas, usando um sintetizador de péptidos Beckman 990, numa resina MBHA como descrito na generalidade em Vale e col. Patente U.S. N9. 4 292 313. Determina-se por CCF e HPLC que o pêptido ê substancialmente puro.
634
46634
Λ
-18EXEMPLO X
A síntese de /“pCl-Phe1, D-NMA2, D-Lys21, Vai22, Asp25, Ile27_7-FLHCr(l-29)-NH2 possuindo a fórmula: H-pCl-Phe-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-T yr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu_Tyr-Ala-Arg-D-Lys-Val-Leu-His-Asp-Ile-Ile-Asn-Arg-NH2 é conduzida por etapas, usando um sintetizador de pêptidos Beckman 990, numa resina MBHA, como descrito na generalidade no Exemplo I. Determina-se por CCF e HPLC que o péptido é substancialmente pu. ro.
EXEMPLO XI
A síntese de £~C^i^eLeu^t D-NMA2, D-Asp5, Lys8, D-Lys21, Ala22__7-FLHCh(l-32)-NH2 possuindo a fórmula: H-C^MeLeu-D-NMA-D-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Lys-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-D-Lys-Ala-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2 é conduzida por etapas, usando um sintetizador de pêptidos Beckman 990, numa resina MBHA como no Exemplo I. Determina-se por CCF e HPLC que este análogo é substancialmente puro.
EXEMPLO XII
A síntese de /D-Tyr1, D-NMA2, D-Asp5, C00 Me-D-Tyr10, Ala15, D-Arg21, C^MeVal22, D-Met27_7-FLHCh(l-29)-NH2 possuindo a fórmula: H-D-Tyr-D-NMA-D-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-C^Me-D-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-D-Arg-C^MeVal-Leu-Gln-Asp-Ile-D-Met-Ser-Arg-NH2 é conduzida por etapas, usando um sintetizador de pêptidos Beckman 990, numa resina MBHA, como no Exemplo I. Determina-se por CCF e HPLC que este análogo é substancialmente puro.
EXEMPLO ΧΙΠ
A síntese de /D-His1, D-NMA2, Lys8, Leu15, D-Lys21, Ala27_7-FLHCr(l-29)-NH2 possuindo a fórmula: H-D-His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Lys-Ser-Tyr-Arg-Arg-Leu-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-D-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Ala-Asn-Arg-NH2 é conduzida por etapas, usando um sintetizador de pêptidos Beckman 990, numa resina MBHA, como descrito na generalidade no Exemplo I. Determina-se por CCF e HPLC que o péptido é substancialmente puro
634
46634
-19EXEMPLO XIV
A síntese de um fragmento análogo de FLHCr, isto é de /WsTyr1, D-NMA2, Glu8, Ala13, D-Arg21, C*MeIle22_7-FLHCr(l-29)-NH2 possuindo a fórmula: N^MeTyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Glu-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-D-Arg-C^Melle-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-NH,-, ê conduzida por etapas usando um sintetizador de páptidos Beckman 990 numa resina MBHA, como no Exemplo I. Determina-se por CCF e HPLC que o pépti do á substancialmente puro*
EXEMPLO XV
A síntese de /c^MeLeu1, D-NMA2, Leu13, C^MeAla19, D-Lys21, C^MeAla22, Ala27__7-FLHCr-(l-29)-NH2 possuindo a fórmula: H-C^MeLeu-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Leu-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-C^MeAla-Arg-D-Lys-C^MeAla-Leu-His-Glu-Ile-Ala-Asn-Arg-NH2 é conduzida por etapas, usando um sintetizador de páptidos Beckman 990 numa resina MBHA, como no Exemplo I. Detejç mina-se por CCF e HPLC que o pêptido é substancialmente puro.
EXEMPLO XVI
A síntese de /c^ePhe1, NMA2, Lys8, Arg12, Ile13, C^MeAla19, Ile27_y-FLHCh(l-29)-NH2 possuindo a fórmula: H-C^ePhe1-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Lys-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-CoiMeAla-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Ile-Ser-Arg-NH2 á conduzida por etapas, usando um sintetizador de páptidos Beckman 990 numa resina MBHA como descrito na generalidade em Vale e col. Patente U.S. N9. 4 292 313. Determina-se por CCF e HPLC que o péptido é substancialmente puro.
EXEMPLO XVII
A síntese de /desamino D-Tyr1, D-NMA2, Arg8, Phe18, C^MeVal13, Leu27, Asn28_J7-FLHCh (l-29)-NH2 possuindo a fórmula: desNH2-D-T yr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Arg-Ser-Phe-Arg-Lys-C^MeVal-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NH2 é conduzida por etapas, usando um sintetizador de páptidos Beckman 990, numa resina MBHA, como descrito na generalidade em Vale e col., Patente U.S. N9. 4 292 313. Determi na-se por CCF e HPLC que o péptido é substancialmente puro.
634
46634 ,r^àgS»···
-20EXEMPLO XVIII
A síntese de /“D-NMA2, C^MeTyr10, C^MeVal13, C^MeLeu22, Nle27, Asn28_7-FLHCh(l-29)-NH2 possuindo a fórmula: H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala- Ile-Phe-T hr-Asn-Ser-C^eT yr-Arg-Lys-C^eVal-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-C^eLeu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Asn-Arg-NH2 é conduzida por etapas, usando um sintetizador de pépti. dos Beckman 990, numa resina MBHA, como descrito na generalidade em Vale e col., Patente U.S. N9. 4 292 313. Determina-se por CCF e HPLC que o péptido é substancialmente puro.
EXEMPLO XIX
A síntese de /“C^.ePhe1, D-NMA2, C^eTyr10, rtelle13, Val27__7-FLHCh(l-29)-NH2 possuindo a fórmula: H-C^ePhe-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-C^MeTyr-Arg-Arg-C^MeIIe-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Val-Asn-Arg-NH2 é conduzida por etapas, usando um sintetizador de péptidos Beckman 990, numa resina MBHA, como no Exemplo I. Determina-se por CCF e HPLC que o péptido ê substancialmente puro.
EXEMPLO XX
A síntese de /~desaminoD-Met1, D-NMA2, cSleTyr^^, C^MeVal13, C^MeAla1^, Asn2a__7-FLHCh(l-44)-NH2 possuindo a fórmula: desNH2-D-Met-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-C°cMeT yr-Arg-Lys-C^eVal-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-C^eAla-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Asn-Arg-NH2 é conduzida por etapas, usando um sintetizador de péptidos Beckman 990, numa resina MBHA, como descrito na generalidade em Vale e col., Patente U.S. NS. 4 292 313. De termina-se por CCF e HPLC que o péptido é substancialmente puro.
EXEMPLO XXI
A síntese de /N^eHis1, D-NMA2, Ce<MeVal13-Nle27_7-FLHCh (l-29)-NH2 possuindo a fórmula: N^MeHis-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-C^MeVal-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-NH2 é conduzida por etapas, usando um sintetizador de péptidos Beckman 990, numa resina MBHA, como descrito na generalidade em Vale e col., Patente U,
S. NS, 4 292 313. Determina-se por CCF e HPLC que o péptido é substancialmente puro.
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46634
........«pa*
-21EXEMPLO XXII
A síntese do fragmento análogo de FLHCh /For-Tyr1, D-NMA2, C^MeTyr10, C^MeAla19, Leu27, Asn28_7-FLHCh(l-32)-NH2 pos suindo a fórmula: For-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-C^MeTyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-C^MeAla-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2 ê conduzida por etapas, usando um sintetizador de Beckman 990, numa resina MBHA, como no Exemplo I. Determina-se por CCF e HPLC que este análogo é substancialmente puro.
EXEMPLO XXIII
A síntese de /~D-NMA2, Lys12, C^Melle13, C^MeAla19, Nle27_7-FLHCr(l-29)-NH2, possuindo a fórmula: H-His-D-NMA-Asp-Ala-Ils-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Lys-C^Melle-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-CotMeAla-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-NH2 ô conduzida por etapas, usando um sintetizador de péptidos Beckman 990, numa resina MBHA, como no Exemplo I. Determina-se por CCF e HPLC que o pêptido é substancialmente puro.
EXEMPLO XXIV
A síntese do fragmento análogo de FLHCh /~D-NMA , Arg z, C^MeLeu22, Ile27_7-FLHCh(l-29)-NH2 possuindo a fórmula: H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Arg-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-C0<!MeLeu-Leu-Gln-Asp-Ile-Ile-Ser-Arg-NH2 ô conduzida por etapas, usando um sintetizador de péptidos Beckman 990, numa resina MBHA, como no Exemplo I. Determina-se por CCF e HPLC que o pêptido ê substancialmente puro.
EXEMPLO XXV
A síntese de /D-Phe1, D-NMA2, C^MeVal13, Ala15, C^MeLeu22, D-Met27_7-FLHCh(l-29)-NH2 possuindo a fórmula: H-D-Phe-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-T yr-Arg-Lys-C^MeVal-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-C0<MeL8u-Leu-Gln-Asp-Ile-D-Met-Ser-Arg-NH2 é conduzida por etapas usando um sintetizador de péptidos Beckman 990, numa resina MBHA, como no Exemplo I. Determina-se por CCF e HPLC que este análogo é substancialmente puro.
634
46634
......
-22EXEMPLO XXVI
A síntese de £~D-NMfi2, D-Arg21C^MeLeu22J7-FLHCh(l-32)-NH9 possuindo a fórmula: H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn* /
-Ser-T yr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-D-Arg-C^MeLeu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Nl·^ é conduzida por etapas, usando um sintetizador de Beckman 990, numa resina MBHA como no Exemplo I. Determióa-se por CCF e HPLC que este análogo é substancialmente puro.
EXEMPLO XXVII
A síntese de /desaminoHis^, D-NMA2, Lys&, Asp23__7-FLHCr (l-29)-NH2 possuindo a fórmula: desNI^His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Lys-Ser-T yr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-T yr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Asp-Ile-Met-Asn-Arg-I^ é conduzida por etapas, usando um sintetizador de pêptidos Beckman 990, numa resina MBHA, como no Exemplo I. Determina-se por CCF e HPLC que o pêptido ê substancialmente puro.
EXEMPLO XXVIII
A sintese de /Ac-D-His^, D-NMA2, Arg^, C^MeTyr^, Nle27_T-FLHCr(l-29)-NH2 possuindo a fórmula: Ac-D-His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Arg-Ser-C^MeT yr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-NH2 é conduzida por etapas, usando um sintetizador de pêptidos Beckman 990, numa resina MBHA, como descrito na generalidade no Exemplo I. Determina-se por CCF e HPLC que o pêptido é substancialmente puro.
EXEMPLO XXIX
A síntese de /~D-Ala2, D-Asp3, C^MeTyr^θ, C^MeAla^f C^MeLeu22, Leu27_7-FLHCh(l-32)-NH2 possuindo a fórmula: H-Tyr-D-Ala-D-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-C^MeT yr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-C* MeAla-Arg-Lys-C^MeLeu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2 ê conduzida por etapas, usando um sintetizador de pêptidos Beckman 990, numa resina MBHA, como no Exemplo I. Determina-se por CCF e HPLC que este análogo é substancialmente puro.
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46634
-23EXEMPLQ XXX
A síntese de/-D-Tyr1, D-NMA2, D-ftsp3, Lys8, C^Me-D-Tyr10, Ala15, D-Met27_7-FLHCh(l-29)-NH2 possuindo a fórmula: H-D-Tyr-D-NMA-D-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Lys-Ser-C^Me-D-T yr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-D-Met-Ser-Arg-NH2 é conduzida por etapas, usando um sintetizador de péptidos Beckman 990, numa resina MBHA, como no Exemplo I. Determina-se por CCF β HPLC que este análogo é substancialmente puro.
EXEMPLO XXXI
A síntese de /“O-His1, D-NMA2, Arg8, Leu13, C^MeAla19, Nle27_7-FLHCr(l-32)-NH2 possuindo a fórmula: H-D-His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Arg-Ser-Tyr-Arg-Arg-Leu-Leu-Gly-Gln-Leu—Tyr-C^MeAla-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2 é conduzida por etapas usando um sintetizador de pépti dos Beckman 990, numa resina MBHA, como descrito na generalidade no Exemplo I. Determina-se por CCF e HPLC que o péptido é substancialmente puro.
EXEMPLO XXXII
A síntese de um fragmento análogo do FLHCr, isto é, ^(desaminoTyr1, CoLMeLeu22_7-FLHCr(l-29)-NH2 possuindo a fórmula: desNH2Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-T yr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-C^MeLeu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-I^ é conduzida por etapas, usando um sintetizador de péptidos Beckman 990, numa resina MBHA, como no Exemplo I. Detrfrmina-<e por CCF e HPLC que o péptido é substancialmente puro.
EXEMPLO XXXIII
A síntese de /-Ac-D-Tyr1, D-NMA2, C^eTyr10, C^MeVal13, C^eAla19, C^eLeu22, Nle27__7-FLHCh(l-29)-NH2 possuindo a fórmu la: Ac-D-T yr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-C^MeTyr-Arg-Lys-C^MeVal-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-C^MeAla-Arg-Lys-C^MeLeu-Leu-Gln-Asja -Ile-Nle-Ser-Arg-NH2 é conduzida por etapas, usando um sintetiza dor de péptidos Beckman 990, numa resina MBHA, como descrito na generalidade em Vale e col., Patente U.S, N9. 4 292 313. Detej? mina-se por CCF e HPLC que o péptido ê substancialmente puro.
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46634
EXEMPLO XXXIV
A síntese de /C^MeLeu1, D-NMA2, Glu8, C^eAla19, Glu25, Ile27_7-FLHCr(l-29)-NH2 possuindo a fórmula: H-C^MeLeu-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Glu-Ser-T yr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-C°^MeAla-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Ile-Asn-Arg-NH2 ê conduzida por etapas, usando um sintetizador de péptidos Beckman 990, numa resina MBHA, como no Exemplo I. Determina-se por CCF e HPLC que o pêptido é substancialmente puro.
EXEMPLO XXXV
A síntese de /^For-D-Tyr1, D-NMA2, C^MeVal13, C^MeAla19, Arg2!, cSleLeu22, Asn28_7-frLHCh(l-29)-NH2 possuindo a fórmula: For-D-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-T yr-Arg-Lys-C^MeVal-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-C^MeAla-Arg-Arg-C^eLeu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met. -Asn-Arg-NH2 ê conduzida por etapas, usando um sintetizador de péptidos Beckman 990, numa resina MBHA, como descrito na genera lidade em Vale e col., Patente U.S. Ns. 4 292 313. Determina-se por CCF e HPLC que o péptido ê substancialmente puro.
EXEMPLO XXXVI
A síntese de /~NMA2, C^MeVal13, Nle27_7-FLHCh(l-29)-NH2 possuindo a fórmula: H-Tyr-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-C^eVal-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-NH2 é conduzida por etapas, usando um sintetizador de péptidos Beckman 990, numa resina MBHA, como descrito na generalidade em Vale e col., Patente U.S. N9.
292 313. Determina-se por CCF e HPLC que o péptido é substan cialmente puro. 0 sal acetato ê então preparado por dissolução do péptido em água e adição de ácido acético 1 Ν. A solução re sultante é liofilizada para originar o sal acetato.
EXEMPLO XXXVII
A síntese do análogo do FLHCh /D-NMA2, Arg8, C^MBAla^9, CotMeLeu22NlB27_7“*r'HCh(l-32)-NH2 possuindo a fórmula: H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Arg-Ser-T yr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-C^MeAla-Arg-Lys-C^MeLeu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2 é conduzida por etapas usando um sintetizador
634
46634 ,,7
-25de péptidos Beckman 990, numa resina MBHA, como no Exemplo I.
Determina-se por CCF e HPLC que este análogo é substancialmente puro.
EXEMPLO XXXVIII
A síntese de /~Lys% Arg21, Nle27_7-FLHCr(l-29)-NH2» pos. suindo a fórmula: H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Lys-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-T yr-Ala-Arg-Arg-Leu-Leu-His-GluYGwo-Nle-Asn-Arg-NH2 é conduzida por etapas, usando um sintetizador de péptidos Beckman 990, numa resina MBHA, como no Exemplo I. Determina-se por CCF e HPLC que o péptido é substancialmente pu ro.
EXEMPLO XXXIX
A síntese do análogo de FLHCh /”D-NMA7, C^MeVal1^, C^MeAla19, cSleLeu22, Nle27, Asn2^__7-FLHCh(l-29)-NH2 possuindo a fórmula: H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-C^MsVal-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-C^MeAla-Arg-Lys-C^MeLeu-Leu-Gln-As^ -Ile-Nle-Asn-Arg-NH2 é conduzida por etapas, usando um sintetizador de péptidos Beckman 990, numa resina MBHA, como no Exemplo I. Determina-se por CCF e HPLC que o péptido é substancial, mente puro.
EXEMPLO XL
A síntese de /“D-Ala2, D-Lys21, Nle27_7-FLHCh(l-29)-NH2 possuindo a fórmula: H-Tyr-D-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-D-Lys-Leu-Leu-Gln-Glu-Ile-Nle-Ser-Arg-f^ é conduzida por etapas, usando um sintetizador de péptidos Beckman 990, numa resina MBHA, como no Exemplo I. Determina-se por CCF e HPLC que o péptido é substarj cialmente puro.
EXEMPLO XLI
A síntese de /Met1, C^MeAla19, Arg21,Nle27_7-FLHCr(l-29)-NH2 possuindo a fórmula: H-Met-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-T yr-C^MeAla-Arg-Arg-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-NH2 é conduzida por etapas, usando um sintetizador de péptidos Beckman 990, numa resina MBHA, como no Exemplo I. Determina-se por CCF e HPLC que o péptido é subs.
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-26tancialmente puro.
EXEMPLO XLII
A síntese de /“pCl-Phe1, D-NMA2, C*MeTyr10, C^MeAla19, Arg21, Nle27_7-FLHCr(l-43)-QH possuindo a fórmula: H-pCl-Phe-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-C^MeTyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-T yr-C^MeAla-Arg-Arg-Leu-Leu-His-Asp-Ile-Nle-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-OH é conduzida por etapas, usando um sintetizador de pêptidos Beckman 990, numa resina clorometilada, como no Exemplo III. Dete£ mina-se por CCF e HPLC que o pêptido é substancialmente puro.
Os pêptidos sintéticos preparados nos Exemplos são compa rados com FLHChp(l-40)-0H sintético em análises in vitro e mostram exibir em geral grandes potências para a secreção da HC e actividades intrínsecas semelhantes. Todos estes pêptidos sintéticos são considerados biologicamente activos e potencialmente úteis para estimular a libertação da HC pela pituitária.
Para determinar a eficácia relativa de certos pêptidos sintéticos representativos, na promoção da libertação da hormona de crescimento, efectuam-se ensaios in vitro usando FLHChp(l-40)-0H como padrão, em comparação com concentrações equimolares dos análogos representativos sintetizados. Utilizam-se cul. turas que incluem glandulas pituitárias de ratos, removidas trôs a cinco dias antes da análise. Essas culturas são conside. radas óptimas para a secreção da hormona do crescimento e são utilizadas para testes comparativos, da forma descrita na generalidade em Vale e col., Endocrinology» 91, 562-572 (1972) e mais particularmente descrita em Vale e col., Endocrinology,
112, 1553-1555 (1983). A incubação com a substância a testar é efectuada durante 3 a 4 horas, e alíquotas do meio de cultura são removidas e processadas para medição dos seus teores em HC imunoreactiva (HC ir) por análise radioimunológica bem caracterizada.
Os resultados deste teste comparativo, para concentrações equimolares, são apresentados na Tabela I,
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46634
-27TABELA I
Péptido Comparação %
FLHCh(l-40)-0H (padrão para este teste) 100% /N^MeTy r1, Asp8, Ala15, Nle27, 192%
Asn28J7-FLHCh(l-29)-NH2
N^MeTyr1, Lys8, Ala15, Nle27, 556%
Asn28_7-FLHCh(l-29)-NH2.
I /“N^eTyr1, D-Lys21, Nle27_7 172%
-FLHCh(l-29)-NH2.
/N*MeTyr, D-Tyr10, D-Lys21, Nle27_7- 40%
FLHCh(l-29)-NH2.
Em adição aos testes in vitro para a secreção da hormona de crescimento, experiências in vivo em que se infectam os páptidos sintéticos por via intravenosa em ratos macho anestesiados com uretano e, determinam que estes suprimem a secreção espontânea da HC sem abolir a resposta ao FLHC exógeno. Amostras sanguíneas são tomadas imediatamente antes e 10, 30 e 60 minutos após as injecções e os níveis de HC no sangue são medidos por análise radioimunológica. Estes testes in vivo dos pêptidos sintéticos revelam, surpreendentemente, que todos eles possuem uma potência biológica muito superior à exibida por FLHChp(l-40)-0H. Estes análogos sintéticos do FLHC possuem uma duração de eficácia substancialmente superior, que é revelada nos ní veis sanguíneos da HC pituitária quando medida 30 e 60 min após a injecção IV. Outros testes in vivo do FLHC que se sabe serem eficazes para detectar a secreção da HC, são utilizados para confirmar estes resultados. As dosagens compreendidas entre cerca de 500 nanograma e cerca de 50 micrograma destes pêptidos por kg da peso, são consideradas eficazes para provocar a secreção da HC.
Estes análogos sintéticos do FLHCh e possivelmente do FLHCr, deverão ser úteis para aplicações humanas no caso em que o mêdido deseje elevar a produção da HC. A estimulação da se67 634
46634 ,/ , ,-ί*’'
-28ereção da HC por esses análogos tem interesse em pacientes que apresentem uma deficiência de HC completa ou relativa, provocada pela subprodução do FLHC endógeno. Mais ainda, é provável que a secreção aumentada da HC e o aumento de crescimento a ela associado, possam ser obtidos em humanos ou animais com níveis de HC normais. Além disso, a administração deverá alterar o te or de gordura do organismo e modificar outros processos metabólicos, imunológicos e de desenvolvimento dependentes da HC. Por exemplo, estes análogos podem ser úteis como meios de estimulação de processos anabólicos em humanos que se encontram sob ci.r cunstâncias como as que se seguem à ocorrência de queimaduras. Como outro exemplo, estes análogos podem ser administrados a animais de sangue quente comerciais, como galinhas, perús, porcos, cabritos, gado e carneiros, e podem ser utilizados em aqui, cultura na criação de peixes e outros animais marinhos de sangue frio, por exemplo tartarugas e enguias e anfíbios, para ace lerar o crescimento e aumentar a razão proteínas/gordura ganha pela alimentação de quantidades eficazes dos péptidos.
Para administração a humanos, estes péptidos sintéticos deverão ter uma pureza de pelo menos 93/ e preferivelmente de pelo menos 98/. A pureza, para os fins do presente invento, refere-se ao péptido pretendido constituir a percentagem mássica estabelecida, de entre todos os péptidos e fragmentos peptidicos presentes. Para a administração desses péptidos sintéticos a animais comerciais e outros, de forma a promover o cresci mento e reduzir o teor em gorduras, pode ser aceitável uma pure za tão baixa como 5/ ou mesmo tão baixa como 0,01/.
Estes péptidos sintéticos ou os seus sais não tóxicos com binados com um veículo farmacêutico ou veterinariamente aceitável para formar uma composição farmacêutica, podem ser administrados a animais, incluindo humanos, por via intravenosa, por via subcutânea, por via intramuscular, por via percutânea, por exemplo intranasalmente, ou mesmo por via oral. A administração pode ser empregue por um médico para estimular a libertação da HC quando o hospedeiro a tratar requerer esse tratamento terapêutico. A dosagem requerida variará com a situação particular a tratar, com a gravidade dessa situação e com a duração do
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46634 „ny
-29tratamento desejado.
Esses pêptidos são geralmente administrados na forma de sais não tóxicos, como sais de adição de ácido ou complexos metálicos, por exemplo com zinco, ferro ou semelhantes (os quais são consideradas como sais para os propósitos do presente inver» to). Ilustrativos desses sais de adição de ácido são os sais hidrocloreto, hidrobrometo, sulfato, fosfato, maleato, acetato, citrato, benzoato, succinato, malato, ascorbato, tartarato e se. meihantes. Se se pretender administrar oralmente o ingrediente activo na forma de comprimidos, estes poderão conter um ligante, como tragacanto, amido de milho ou gelatina; um agente desinte grante, como ácido alglnicoj e um lubrificante, como estearato de magnésio. Se se pretender uma administração em forma líquida, poderá utilizar-se adoçamento e/ou aromatização e pode efeç tuar-se a administração intravenosa em meio salino isotónico, em soluções tampão de fosfato ou semelhantes.
Os pêptidos deverão ser administrados a humanos sob a vi. gilância de um médico, e as composiçães farmacêuticas conterão usualmente o pêptido em conjunção com um veículo farmaceuticamente aceitável convencional, na forma sólida ou líquida. Usualmente, a dosagem parentérica estará compreendida entre cerca de 0,01 e cerca de 1 micrograma de pêptido por kilograma de peso do hospedeiro.
Apesar de o invento ter sido descrito com respeito às suas concretizações preferidas, as quais constituem o melhor mé. todo presentemente conhecido pelos autores do invento, deverá entender-se que se podem efectuar várias mudanças e modificações, como será óbvio para qualquer entendido na especialidade, sem sair do âmbito do invento o qual está estabelecido nas reivindicações em anexo. Por exemplo, podem efectuar-se modificações na cadeia péptidica, particularmente delecções começando no terminal carboxilo do pêptido e estendendo-se até cerca da posição 29, de acordo com as práticas experimentais conhecidas até à data, para originar pêptidos ou fragmentos peptidicos que retenham todas, ou porções substanciais da potência biológica do pêptido, e esses pêptidos são considerados como fazendo par67 634
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-30te do âmbito do invento. Além disso, podem fazer-se adições a qualquer um dos terminais, ou a ambos, e/ou resíduos geralmente equivalentes podem ser substituídos por resíduos de ocorrência natural, tal como é bem conhecido na especialidade da química dos péptidos, para produzir outros análogos possuindo pelo menos uma porção substancial da potência do polipéptido referido nas reivindicações, sem sair do âmbito do invento. Mais ainda, p£ dem efectuar-se modificações no grupo-N^ preferido na posiçSo do terminal C, de acordo com o desenvolvimento da especialidade hoje em dia, por exemplo o grupo carboxilo do resíduo aminoácido na porção do terminal C pode ser o radical -COOR, -CRO, -CONHNHR, -CON(R)(R·) ou -CI^OR, sendo R e R’, alquilo de baixo peso molecular, fluoro-alquilo de baixo peso molecular ou hidro génio, sem sair do âmbito do invento, uma vez que essas modificações resultam em péptidos sintéticos equivalentes.
Várias características do invento são postas em relevo nas reivindicações que se seguem.
Claims (10)
1 - Processo para a preparação de um péptido e dos seus sais não tóxicos, o qual possui a sequência I:
(8)R1-R2-R3-Ala-Ile-Phe-Thr-Rg-Ser-(Q|)R|Q-ArQ-R12'*^2^13”l“elJ“
-R15-Gln-Leu-R18-(Q3)Ala-Arg-R21-(Q4)R22-Leu-R24-R25-Ile-R27-R28-Arg-Gln-Gln«Gly-Glu-R34-Asn-Gln-Glu-R38'”R39”R4o'“Arg-R4234
R24 é Gin ou His; R25 é Asp ou Glu; R27 é Met, R28 é Asn ou Ser; Rj4
-R43-R44 em que R^ é Tyr, D-Tyr, Met, Phe, D-Phe, pCl-Phe, Leu, His ou D-His; B ê H, C^Me, N^Me, desamino, Ac ou For; R2 é Ala, D-Ala, NMa ou D-NMA; R^ ê Asp ou D-Asp; Rg ê Ser, Asn, Lys, Arg, Asp ou Gin; Rjg é Tyr, D-Tyr ou Phe; R12 é Arg ou Lys; R|3 é Ile, Vai, Leu ou Ala; R^ é Gly ou Ala; R^g é Ser ou Tyr; R^ é Lys, D-Lys, Arg ou D-Arg 5 R22 é Leu, Ile,
Ala ou Vai;
D-Met, Ala, Nle, Ile, Leu, Nva ou Vai; é Ser ou Arg; R^g é Arg ou Gin; R^9 é Gly ou Arg; ou Ser; R42 ô Phe, Ala ou Vai; R« é Asn ou Arg; R44 é um aminoácido natural; Qj_~G4 são quer H quer C^Me, desde que, no entanto, qualquer um, ou todos, os resíduos entre R^g e R^g» in clusivé, possam ser deleccionados, e desde que também pelo menos um de seja C^Me e/ou Rg seja Lys ou Arg e/ou R2| seja
D-Lys ou D-Arg caracterizado por compreender (i) o acoplamento dos aminoácidos individuais ou dos péptidos de cadeia curta, pa ra formar um composto possuindo pelo menos um grupo protector e a fórmula (II) seguinte, ou uma sua versão apropriadamente encurtada:
X1-(B)R1(X ou X2)-Ro-Rx(X3)-Ala-Ile-Phe-Thr(X4)-Rg(X8)-Ser(X4)ol' 2 /_2 -R (Xz)-Arg(Xb)-R f2 (X* .^2k« ou X )-(Q2)RjL3-Leu-R|g-Gln(X'7)-Leu-R^g(X2)-(Q3)Ala-Arg(X6)-R21(X6 ou X7)-(Q4)R22-Leu-R24(X5 ou X)-R25« (X3)-Ile-R27-R28(X4 ou X5)-Arg(X6)-Gln(X5)-Gln(X5)-Gly-Glu(X3)-R34(X4 ou X6)-Asn(X5)-Gln(X5)-Glu(X3)-R38(X6 ou X5)-RJ9(X6)-R4o(X2)-Arg(X6)-R42-R43(x5 ou X6)-R44(X8)-X9 em que (X), (X1), (X2), (X3), (X4)» (X5), (X6), (X7) θ (X8) São cada um, quer hidrogénio quer ura grupo protector e em que (X ) é amida ou hidrjs xilo ou um grupo protector, e (ii) o tratamento com um reagente adequado para remover o grupo ou grupos protectores do referido composto de fórmula (II) para proporcionar um péptido possuindo
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4 - Processo de acordo caracterizado por R22 ser Leu
5 - Processo de acordo *'Γ
-32a sequência (I) e, se desejado, (iii) a reacção do péptido resultante com um ácido adequado ou composto semelhante, para fojç mar um seu sal de adição, não tóxico.
2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por R^g ser Ser, R^ ser Gin, R2^ ser Asp, ser Ser, R38 ser Arg, R^g ser Gly e R^g ser Ala.
3 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por R21 ser D-Arg ou D-Lys.
com as reivindicações 1, 2 ou 3, e R2? ser Nle.
com qualquer uma das reivindicações 1-
4, caracterizado por ^
5 ser ftía·
6 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por R2g ser Asn.
7 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por pelo menos um de Q^, Q2, e Q4 ser um C^Me.
8 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o péptido possuir uma fórmula seleccionada entre as se. guintes 5 /“N^MeTyr1, Asp8, Ala15, Nle27, Asn28_7-hGRF(l-29)-NH2, /N^MeTyr1, Lys8, Ala15, Nle27, Asn28_7-hGRF(l-29)-NH2, /“N^MeTyr1, D-Lys21, Nle27_7-hGRF(l-29)-NH2 e /“N^MeTyr, D-Tyr10, D-Lys21, Nle27_7-hGRF(l-29)-NH2.
9 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7, caracterizado por os resíduos 30-44 terem sido deleccionados.
10 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado por X1 ser hidrogénio ou um grupo pro, tector c<-amino; X ser hidrogénio ou um grupo protector para o grupo hidroxilo fenólico de TyrJ X3 ser hidrogénio ou um gru po protector para 0 grupo carboxilo de Asp ou Glu; X4 ser hidrogénio ou um grupo protector para 0 grupo hidroxilo alcoólica
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-335 de Thrí X ser hidrogénio ou um grupo protector para o grupo hi dróxilo alcoólico de Serí X6 ser hidrogénio ou um grupo proteç.
tor para o guanidino de Arg; X ser hidrogénio ou um grupo pr_o 8 tector para o grupo amino da cadeia lateral de Lys; X ser hidrogénio ou um grupo protector de cadeia lateral adequado; X ser hidrogénio ou um grupo protector para o azoto do imidazole g de His; e X ser seleccionado na classe constituída por suporte resina e suporte resina -NH.
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