DE3850015T2

DE3850015T2 - Zyklische GRF-Analoga.

Info

Publication number: DE3850015T2
Application number: DE3850015T
Authority: DE
Inventors: Arthur Martin Felix; Edgar Philip Heimer Edg Heimer
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1987-09-18
Filing date: 1988-09-13
Publication date: 1994-10-20
Anticipated expiration: 2008-09-14
Also published as: EP0307860A2; AU609878B2; IE882835L; JPH01129000A; JP2715472B2; CN1032014A; ES2054754T3; PH25715A; PT88532B; DE3850015D1; AU2234688A; ATE106895T1; DK519088A; IE64494B1; CN1030255C; PT88532A; NZ226178A; EP0307860B1; EP0307860A3; DK519088D0

Description

Es wird angenommen, daß das Wachstum bei Tieren über eine Kaskade biologisch regulatorischer Moleküle gesteuert wird. Der Hypothalamus produziert eine Substanz, die Wachstumshormon freisetzender Faktor (GRF) genannt wird, die wiederum auf die Hypophyse einwirkt, um die Freisetzung von Wachstumshormon zu bewirken. Die Hypophyse wird unter negativer Feedback-Kontrolle gehalten durch Somatostatin und den Insulin-Wachstumsfaktor (IGF). Es wurde gefunden, daß GRF außerordentlich aktiv ist und die Freisetzung von Wachstumshormon in das Blut in der Größenordnung von ug pro ml stimulieren kann. GRF kann therapeutisch in den meisten Bereichen angewendet werden, die heute als Kandidaten für die Anwendung des Wachstumshormons betrachtet werden, z. B. zur Behandlung von hypophysärem Zwergwuchs und Diabetes, die durch anormale Wachstumshormon-Produktion entstehen, zur Verbesserung der Wundheilung, Behandlung von Brandwunden oder Verlangsamung des Alterungsprozesses.
Die erfolgreiche Isolierung von GRF basiert teilweise auf der Entdeckung, daß Pankreastumoren, die mit Akromegalie in Verbindung stehen, ektopisch große Mengen an GRF erzeugten. Drei Formen von GRF mit homologer Aminosäuresequenz aber verschiedener Länge (44, 40 und 37 Aminosäuren) wurden isoliert.
Die amidierte Form des GRF's mit 44 Aminosäuren wird als Stammolekül angesehen. Eine große Vielzahl synthetischer Analoge wurde hergestellt. Sie bestehen aus Polypeptiden mit einer Aminosäuresequenz, die äquivalent ist zu der des ursprünglich isolierten GRF oder von biologisch aktiven Fragmenten oder Analogen davon mit dem Austausch verschiedener Aminosäuren. Die Veränderungen wurden spezifisch eingeführt, um synthetische Analoge zu liefern mit biologischen Eigenschaften, die besser waren als die des Stammmoleküls. Daher bestand der Wunsch, GRF-Analoge zu entwickeln, die eine maximale biologische Aktivität inbezug auf Wirksamkeit, Effektivität und Stabilität aufweisen.
Bis jetzt haben alle bekannten GRF-Analogen eine lineare Konfiguration. Zum Beispiel offenbart EP-A-0 292 334 verschiedene lineare synthetische GRF-Analoge, die wirksam sein sollen für die Stimulation der Freisetzung von hypophysärem Wachstumshormon bei Tieren, einschließlich Menschen. Im allgemeinen sind lineare Peptide sehr flexible Moleküle und haben keine wohldefinierte Konformation. Jede Aminosäure in einem linearen Peptid wird dem umgebenden Milieu ausgesetzt, was zu einer höheren Empfindlichkeit gegenüber einem enzymatischen und chemischen Abbau führt.
Ein cyclisches Peptid (Lactam) ist ein Peptid, bei dem das Carboxyende der Seitenkette einer sauren Aminosäure (z. B. Asp oder Glu) an das Aminoende der Seitenkette einer basischen Aminosäure (z. B. Lys) unter Erzeugung einer Amidbindung gebunden ist.
Die biologischen Eigenschaften cyclischer Peptide werden oft verändert im Hinblick auf die ihrer linearen Analoge. Cyclische Peptide sind oft viel steifer, mit wohldefinierten Formen und inneren Aminosäureresten, die vom umgebenden Milieu abgeschirmt sind. Diese Veränderungen spiegeln sich in den biologischen Eigenschaften des Peptids wieder. Die Wirkungsdauer cyclischer Peptide wird länger sein, da die kompakte Struktur sie weniger empfänglich für einen chemischen oder enzymatischen Abbau macht. Die biologische Verfügbarkeit des cyclischen Peptids wird erhöht aufgrund von Veränderungen der Gewebeverteilung, die durch die Abschirmung der inneren Aminosäurereste verursacht wird. Weiterhin führt die wohldefinierte Konformation des cyclischen Peptids zu einer größeren Spezifität für den Zielrezeptor, wodurch die Wahrscheinlichkeit von unerwünschten biologischen Nebenwirkungen vermindert wird. Im Fall linearer Peptide besteht z. B. allgemein für ein gegebenes lineares Peptid eine Kreuzreaktivität mit zentralen und peripheren Rezeptoren und es gibt auch eine erhebliche Kreuzreaktivität eines gegebenen Peptids mit Rezeptoren für andere Peptide.
Die vorliegende Erfindung ist auf lineare und cyclische Analoge von GRF mit der spezifischen hier angegebenen Aminosäuresequenz gerichtet, einschließlich der pharmazeutisch annehmbaren Salze davon.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf ein Verfahren zur Stimulierung der Freisetzung von Wachstumshormon bei einem Patienten gerichtet durch Verarbeitung einer wirksamen Menge der erfindungsgemäßen Verbindungen an den Patienten.
Die folgenden Symbole und die folgende Terminologie, wie sie in dieser Beschreibung verwendet werden, sollen wie folgt definiert werden:
1. cyclisches Peptid - oder Lactam bedeutet ein Peptid, worin das Carboxyende einer Seitenkette einer sauren Aminosäure (z. B. Asp oder Glu) an das Aminoende einer Seitenkette einer basischen Aminosäure (z. B. Lys) über eine Amidbindung (Lactam) gebunden ist.
2. bedeutet, daß die achte Aminosäure "A" in der Peptidkette an die zwölfte Aminosäure "B" in der Kette gebunden ist, was eine cyclische Lactamstruktur liefert.
3. GRF bedeutet menschlicher Wachstumshormon freisetzender Faktor, der ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz ist
4. [Leu²&sup7;]GRF bedeutet ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die der von GRF entspricht, wobei an Position 27 ein Methioninrest durch einen Leucinrest ersetzt wurde. Solche Analoge von GRF werden allgemein angezeigt, indem die substituierte Aminosäure in Klammern vor dem GRF angegeben wird.
5. GRF (1-29) bedeutet ein Fragment des GRF-Peptids mit den ersten 29 Aminosäuren der vollständigen Sequenz. Im allgemeinen entsprechen die in Klammern angegebenen Zahlen, die dem GRF folgen, den Positionen der Aminosäuren der ursprünglichen GRF-Sequenz, und geben das N-Ende und das C-Ende des Fragments an.
6. des NH&sub2;Tyr¹ bedeutet, daß die aminoterminale NH&sub2;-Gruppe des Tyrosinrests an Position 1 entfernt ist.
7. OcHex bedeutet Cyclohexylrest
8. DIEA bedeutet Diisopropylethylamin
9. DTE bedeutet Dithioethan.
Fig. 1 zeigt die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen bei der Freisetzung von Wachstumshormon aus Rattenhypophysenzellen. Mit je zwei Hypophysen-("Pit")- Drüsen (Verdünnung 1 : 4) wurde jeder Filter getränkt bei dem Filtertest, bei dem die biologische Aktivität im allgemeinen gemessen wird. Die folgenden spezifischen Abkürzungen werden verwendet:
"rGH" bedeutet rekombinantes Wachstumshormon, "[A15 cyclo 8-12]GRF-(1-29)-NH2" bedeutet Cyclo8,12[Asp&sup8;,Ala¹&sup5;]-GRF-(1- 29)-NH&sub2;, "Cyclo(8-12) [D-Ala2 Ala15]GRF(1-29)-NH2" bedeutet Cyclo8,12[D-Ala²,Asp&sup8;,Ala¹&sup5;]-GRF(1-29)-NH&sub2;, "Cyclo(8- 12) [DesNH2Tyr1 D-A2 A15](1-29)-NH2" bedeutet Cyclo8,12- [desNH&sub2;Tyr¹,D-Ala²,Asp&sup8;,Ala¹&sup5;]-GRF(1-29)-NH&sub2; und "Cyclo(8- 12) [DesNH2Tyr1A15](1-29)-NH2" bedeutet Cyclo8,12- [desNH&sub2;Tyr¹,Asp&sup8;,Ala¹&sup5;)-GRF(1-29)-NH&sub2;.
Die vorliegende Erfindung umfaßt cyclische Peptide der Formel
worin
R¹ = Tyr, desNH&sub2;-Tyr, Ac-Tyr, His, N-Methyl-L-Tyr
R² = Ala, D-Ala, N-Methyl-D-Ala ist
R³ = Gly, Ala, Leu, Val, Ile, Nle, NVal, β-Ala, α-Aib
R&sup4; = Met, Leu, Nle, Ile
R&sup5; = Ser, Asn
R&sup6; = eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln- Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu oder von Fragmenten davon, worin das Fragment in der Anzahl um 1 bis 15 Aminosäuren vom Carboxylende her reduziert ist,
X = OH, NH&sub2;, N(R&sup7;)(R&sup8;), worin R&sup7;und R&sup8;H oder Niedrigalkylreste sind;
H = Asp, Glu, α-Aminoadipinsäure, α-Aminopimelinsäure
B = Lys, Orn, Diaminopropionsäure, Diaminobuttersäure,
wobei das Carboxyende der Seitenkette von A über eine Amidbindung an das der Seitenkette am von B gebunden ist, und die pharmazeutisch annehmbaren Salze davon.
Bevorzugt sind Peptide der Formel I, worin R¹= Tyr, desNH&sub2;-Tyr, N-Methyl-L-Tyr; R²= Ala, D-Ala; R³= Ala und X = NH&sub2;.
Weiter bevorzugt ist ein Peptid der Formel I wie oben, worin A = Asp; B = Lys (und das Seitenkettencarboxyende von Asp kovalent an das Seitenkettenaminoende von Lys über eine Amidbindung gebunden ist); R&sup4; = Met; R&sup5; = Ser und R&sup6; = Arg.
Besonders bevorzugt ist ein Peptid, worin R¹= Tyr, R² = Ala und R³= Ala mit der Formel
Besonders bevorzugt ist auch ein Peptid, worin R²= D-Ala mit der Formel
Ebenso bevorzugt sind auch Peptide der Formel I worin R¹ = desNH&sub2;Tyr.
Besonders bevorzugt ist ein solches Peptid, worin R² = Ala, wobei das Peptid die Formel hat:
Ebenso besonders bevorzugt ist ein solches Peptid, worin R² = D-Ala mit der Formel
Die Peptide können mit geeigneten Methoden synthetisiert werden, z. B. ausschließlich mit Festphasensynthese, Teilfestphasenmethoden, Fragmentkondensation oder der klassischen Lösungssynthese. Gentechnologie kann auch verwendet werden für Analoge, die nur natürliche Aminosäurereste enthalten. Die Peptide der Erfindung werden vorzugsweise hergestellt mit der Festphasenpeptidsynthese, wie von Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149 (1963) beschrieben. Die Synthese wird mit Aminosäuren ausgeführt, die am α-Aminoende geschützt sind. Trifunktionelle Aminosäuren mit labilen Seitenketten werden auch mit geeigneten Gruppen geschützt, die verhindern, daß eine chemische Reaktion an dieser Stelle während des Aufbaus des Peptids auftritt. Die α-Aminoschutzgruppe wird selektiv entfernt, um nachfolgende Kupplungsreaktionen am Aminoende zuzulassen. Die Bedingungen für die Entfernung der α-Aminoschutzgruppe verursachen nicht die Abspaltung der Seitenketten-Schutzgruppen.
Die α-Aminoschutzgruppen sind solche, die auf diesem Gebiet der stufenweisen Synthese von Peptiden bekannt sind, einschließlich Gruppen wie acylartigen Schutzgruppen (z. B. Formyl-, Trifluoracetyl-, Acetylgruppen), Schutzgruppen vom aromatischen Urethantyp (z. B. Benzyloxycarbonyl- (cbz) und substituierte Benzyloxycarbonylgruppen), aliphatische Urethanschutzgruppen (z. B. t-Butyloxycarbonyl-(Boc), Isopropyloxycarbonyl-, Cyclohexyloxycarbonylgruppen) und alkylartige Schutzgruppen (z. B. Benzyl-, Triphenylmethylgruppen). Die bevorzugte Schutzgruppe ist Boc. Die Seitenketten-Schutzgruppen für Tyr schließen Tetrahydropyranyl-, tert.-Butyl-, Trityl-, Benzyl-, Cbz-, 4-Br-Cbz- und 2,6-Dichlorbenzylgruppen ein. Die bevorzugte Seitenkettenschutzgruppe für Tyr ist die 2,6-Dichlorbenzylgruppe. Die Seitenkettenschutzgruppen für Asp schließen Benzyl-, 2,6- Dichlorbenzyl-, Methyl-, Ethyl- und Cyclohexylgruppen ein. Die bevorzugte Seitenketten-Schutzgruppe für Asp ist die Cyclohexylgruppe. Die Seitenketten-Schutzgruppen für Thr und Ser schließen Acetyl-, Benzoyl-, Trityl-, Tetrahydropyranyl-, Benzyl-, 2,6-Dichlorbenzyl- und Cbz-Gruppen ein. Die bevorzugte Schutzgruppe für Thr und Ser ist die Benzylgruppe. Die Seitenkettenschutzgruppen für Arg schließen Nitro-, Tosyl-(Tos)-, Cbz-, Adamantyloxycarbonyl- oder Boc- Gruppen ein. Die bevorzugte Schutzgruppe für Arg ist Tos. Die Seitenketten-Aminogruppe von Lys kann mit Cbz, 2-Cl-Cbz, Tos oder Boc geschützt werden. 2-Cl-Cbz ist die bevorzugte Schutzgruppe für Lys. Die Auswahl der Seitenketten-Schutzgruppen basiert auf folgenden Überlegungen: Die Seitenketten-Schutzgruppe bleibt während des Kuppelns intakt und wird nicht während des Abspaltens der aminoterminalen Schutzgruppen oder unter Kupplungsbedingungen abgespalten. Die Seitenketten-Schutzgruppe muß nach Abschluß der Synthese von dem endgültigen Peptid entfernbar sein unter Reaktionsbedingungen, die das Peptid nicht verändern.
Die Festphasensynthese wird gewöhnlich vom Carboxyende des zu synthetisierenden Peptids her durchgeführt, indem die α-aminogeschützte (seitenkettengeschützte) Aminosäure an einen geeigneten festen Träger gekuppelt wird. Eine Esterbindung wird geformt, wenn die Bindung an ein chlormethyliertes oder Hydroxymethylharz erfolgt und das entstehende Zielpeptid wird eine freie Carboxylgruppe am C-Ende haben. Alternativ wird ein Benzhydrylamin- oder p-Methylbenzhydrylaminharz verwendet, in welchem Fall eine Amidbindung gebildet wird und das entstehende Zielpeptid eine Carboxamidgruppe am C-Ende haben wird. Diese Harze sind im Handel erhältlich und ihre Herstellung wird von Stewart et al., in "Solid Phase Peptide Synthesis" (2. Ausgabe, Pierce Chemical Co., Rockford, IL., 1984) beschrieben.
Im Fall von Arg als der C-terminalen Aminosäure (geschützt an der Seitenkette mit Tos und an der α-Aminofunktion mit Boc) kann diese Aminosäure an das Benzhydrylaminharz gekuppelt werden unter Verwendung verschiedener Aktivierungsmittel einschließlich Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), N,N'-Diisopropylcarbodiimid oder Carbonyldiimidazol. Nach Bindung an den Harzträger wird die α-Aminoschutzgruppe entfernt unter Verwendung von Trifluoressigsäure (TFA) oder HCl in Dioxan bei einer Temperatur zwischen 0 und 25º. Dimethylsulfid wird zu dem TFA zugegeben nach Einführung von Methionin (Met), um eine mögliche S-Alkylierung zu unterdrücken. Nach Entfernung der α-Aminoschutzgruppe werden die verbleibenden geschützten Aminosäuren stufenweise in der erforderlichen Reihenfolge gekuppelt, um die gewünschte Peptidsequenz zu erhalten. Verschiedene Aktivierungsmittel können für die Kupplungsreaktionen verwendet werden, einschließlich DCC, N,N'-Diisopropylcarbodiimid, (Benzotriazol-1-yl-oxy)[tris(dimethylamino)]phosphoniumhexafluorphosphat (BOP) und DCC-Hydroxybenzotriazol (HOBt). Jede geschützte Aminosäure wird im Überschuß verwendet (> 2,5 Äquivalente) und die Kupplungen werden gewöhnlich in Dimethylformamid (DMF), CH&sub2;Cl&sub2; oder Mischungen davon durchgeführt. Es wird in jeder Stufe durch Ninhydrin-Reaktion überwacht, wie weit die Kupplungsreaktion abgeschlossen ist, wie von Kaiser et al., Anal. Biochem., 34, 595 (1970) beschrieben. Im Falle einer unvollständigen Kupplung wird die Kupplungsreaktion wiederholt. Die Kupplungsreaktionen können automatisch z. B. an Syntheseautomaten wie dem Vega 250 Syntheseautomat von Applied Biosystems oder anderen im Handel erhältlichen Geräten durchgeführt werden. Der Verlauf eines typischen Synthesezyklus bei der Synthese von erfindungsgemäßen Peptiden ist in Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1 Verlauf eines typischen Synthesezyklusa Stufe Reagenz Zeit Stufen werden wiederholt
a Lösungsmittel für alle Waschgänge und Kupplungen wurden bemessen bezogen auf Volumen mit 15 bis 20 ml/g Harz
b Kaiser-Ninhydrintest
c DMF/CH&sub2;Cl&sub2; für Boc-Arg(Tos)-OH
Nach dem gesamten Zusammenbau des zu synthetisierenden Peptids wird das Peptidharz zuerst mit TFA/Dithioethan und als zweites mit einem Reagenz, wie flüssigem HF, 1 bis 2 Stunden bei 0ºC umgesetzt, was das Peptid von dem Harz abspaltet und alle Seitenketten-Schutzgruppen entfernt.
Die Cyclisierung von Seitenkette zu Seitenkette auf den festen Träger erfordert die Verwendung eines orthogonalen Schutzschemas, das die selektive Spaltung der Seitenketten- Funktionen der sauren Aminosäuren (z. B. Asp) und der basischen Aminosäuren (z. B. Lys) ermöglicht. Die 9-Fluorenylmethyl-(OFm)-Schutzgruppe für die Seitenkette von Asp und die 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-(Fmoc)-Schutzgruppe für die Seitenkette von Lys können für diesen Zweck verwendet werden. In diesen Fällen werden die Seitenketten-Schutzgruppen (OFm und Fmoc) des Boc-geschützten Peptidharzes selektiv mit Piperidin in DMF entfernt. Die Cyclisierung wird an dem festen Träger erreicht unter Verwendung verschiedener Aktivierungsmittel, einschließlich DCC, DCC/HOBt oder BOP. Die HF-Reaktion wird an dem cyclisierten Peptidharz wie oben beschrieben durchgeführt.
Die Reinigung der erfindungsgemäßen Polypeptide kann bewirkt werden unter Anwendung von in der Peptidchemie wohlbekannten Verfahren. Die erfindungsgemäßen Polypeptide können gereinigt werden unter Verwendung von präparativer HPLC; jedoch können auch andere bekannte chromatographische Verfahren wie Gelpermeation, Ionenaustausch und Aufteilungs-Chromatographie oder Gegenstromverteilung angewendet werden.
Die vorliegende Erfindung kann verwendet werden, um die Freisetzung von Wachstumshormon bei einem Patienten zu stimulieren durch Verabreichen einer wirksamen Menge der Peptide gemäß Formel I an den Patienten.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide haben eine Wachstumshormon freisetzende Aktivität. Pharmazeutische Zusammensetzungen gemäß der Erfindung schließen Analoge mit einer Länge von etwa 29 bis 44 Aminosäuren oder ein nicht toxisches Salz irgendeines dieser Analoge, dispergiert in einem pharmazeutisch oder veterinärpharmazeutisch annehmbaren flüssigen oder festen Träger, ein. Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen können für therapeutische oder diagnostische Zwecke in der Human- und Veterinärmedizin verwendet werden. Sie sind z. B. nützlich zur Behandlung von wachstumsabhängigen Störungen wie hypophysärem Zwergwuchs und Diabetes, die durch anormale Wachstumshormon-Produktion entstehen. Weiterhin können sie auch verwendet werden, um das Wachstum zu stimulieren oder die Futterverwertung bei Tieren zu verbessern, die zur Fleischproduktion aufgezogen werden, um die Milchproduktion zu verbessern und die Eiproduktion zu stimulieren.
Geeignete Dosierungen der erfindungsgemäß zu verabreichenden Polypeptide hängen von dem jeweiligen Patienten und genauer von dem Grad der Insuffizienz der Wachstumshormon- Produktion und dem Behandlungszustand ab. Ein Fachmann kann die geeigneten Dosierungen bestimmen, auf Basis der bekannten bei normalem Wachstum zirkulierenden Gehalte von Wachstumshormon und der Wachstumshormon freisetzenden Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide bestimmen. Genauer kann ein Dosierungsbereich von 0,04 ug/kg/Tag bis etwa 20,0 ug/kg/Tag, bezogen auf das Körpergewicht des Patienten verwendet werden, um die Freisetzung des Wachstumshormons zu stimulieren. Die Dosierungen, die angewendet werden, um die Wachstumsaktivität bei Vieh zu stimulieren, werden beträchtlich höher sein (pro kg Körpergewicht), als die Dosierungen, die angewendet werden, um das normale Wachstum wiederherzustellen in Fällen von Wachstumshormonmängeln wie dem hypophysären Zwergwuchs bei Menschen. Bei Vieh kann allgemein eine Dosierung im Bereich von 0,4 ug/kg/Tag bis etwa 100 ug/kg/Tag subcutan verwendet werden, um die Freisetzung von hypophysärem Wachstumshormon zu stimulieren.
So kann die vorliegende Erfindung verwendet werden, um mit Wachstum in Beziehung stehende Störungen zu behandeln, die durch eine ungenügende Produktion von Wachstumshormon gekennzeichnet sind, was umfaßt, daß man eine Menge der Analoge der Erfindung verabreicht, die ausreicht, um die Produktion von Wachstumshormon auf solche Pegel zu stimulieren, die mit normalen Wachstum verbunden sind.
Normale Pegel von Wachstumshormon variieren für einzelne Personen beträchtlich und für jede gegebene Person variieren die Pegel für zirkulierendes Wachstumshormon beträchtlich während des Tagesverlaufs. Es wurde berichtet, daß bei erwachsenen Menschen die normalen Serumpegel für Wachstumshormon von etwa 0 bis 10 ng/ml variieren. Für Kinder wurden normale Serumgehalte an Wachstumshormon berichtet, die von etwa 0 bis 20 ng/ml variieren.
Um hypophysären Zwergwuchs wirksam mit den beschriebenen Analogen zu behandeln, wird die Behandlung im Verlauf des normalen Wachstums durchgeführt. Bei weiblichen Personen erstreckt sich dieser Zeitraum im allgemeinen nicht viel weiter als bis zum Einsetzen der Menstruation. Daher sollte die Behandlung von weiblichen Personen ungefähr im Alter von 12 bis 16 Jahren durchgeführt werden, abhängig von der einzelnen Person. Bei männlichen Personen kann die Stimulation des Wachstums über einen beträchtlich längeren Zeitraum nach der Pubertät möglich sein. So kann eine wirksame Behandlung von männlichen Personen normalerweise bis zu etwa 18 bis 19 Jahren und in einigen Einzelfällen bis zu etwa 25 Jahren möglich sein.
Es wird auch ein Verfahren zur Erhöhung der Wachstumsrate von Tieren zur Verfügung gestellt, indem eine Menge des Analogs verabreicht wird, die ausreicht, um die Produktion des Wachstumshormons zu stimulieren auf einen Pegel, der höher ist als der, der mit normalem Wachstum verbunden ist.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können in Form von human- oder veterinärpharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht werden, die mit üblichen pharmazeutischen Formulierungstechniken hergestellt werden können. Zusammensetzungen, die für die orale, intravenöse, subcutane, intramuskuläre, intraperitoneale, intranasale oder transdermale Verabreichung geeignet sind, können angewendet werden. Eine geeignete Dosierungsform für die pharmazeutische Verwendung ist etwa 0,01 bis etwa 0,5 mg erfindungsgemäße Verbindung, die zur Rekonstitution mit sterilem Wasser oder Kochsalzlösung lyophilisiert sein kann. Der pH der Zusammensetzung sollte unter etwa 5,0 gehalten werden, um die Stabilität des Analogen aufrechtzuerhalten. Serumalbumin der zu behandelnden Art (z. B. Humanserumalbumin im Fall von Menschen, Rinderserumalbumin in Fall von Kühen usw.) kann auch vorhanden sein zusammen mit anderen bekannten pharmazeutischen Hilfsstoffen.
Die vorliegende Erfindung wird im Zusammenhang mit den folgenden Beispielen beschrieben, die nur der Erläuterung dienen.

Beispiel 1

Synthese von Cyclo8,12[Asp&sup8;,Ala¹&sup5;]-GRF(1-29)-NH&sub2;

Herstellung von Boc-Arg(Tos)-Benzhydrylaminharz

Benzhydrylaminharz (60 g, 0,7 mÄq/g, 42 mÄq) wurde mit jeweils 900 ml CH&sub2;Cl&sub2;, MeOH, CH&sub2;Cl&sub2;, 25% Et&sub3;N in CH&sub2;Cl&sub2; (dreimal), CH&sub2;Cl&sub2;&sub1; MeOH und CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen. Boc-Arg (Tos)-OH (35,95 g, 84 mmol, 2 Äq) in DMF (80 ml)-CH&sub2;Cl&sub2; (600 ml) wurde zugegeben, 5 Minuten geschüttelt und DCC (17,3 g, 84 mmol, 2 Äq) zugegeben und 24 Stunden lang umgesetzt. Das entstehende Boc-Arg(Tos)-BHA-Harz wurde mit DMF, CH&sub2;Cl&sub2;, MeOH und CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen. Die Aminosäureanalyse eines Aliquots zeigte eine Substitution von 0,38 mmol/g. Das Harz wurde mit 300 ml 50% Ac&sub2;-O-Pyridin 2 Stunden lang bei 25ºC acetyliert und mit CH&sub2;Cl&sub2;, MeOH, CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen und im Vakuum getrocknet, was 70 g Boc-Arg(Tos)-BHA-Harz ergab (Substitution: 0,6 mÄq/g).

Herstellung von [Asp&sup8;(OFm),Lys¹²(Fmoc),Ala¹&sup5;]-GRF(1-29)benzhydrylaminharz

Bei dem Boc-Arg(Tos)-BHA-Harz (70 g, 0,6 mÄq/g, 42 mÄq) wurden die Schutzgruppen abgespalten und es wurde gemäß dem in Tabelle 1 angegebenen Verlauf neutralisiert. Trifunktionelle Aminosäuren wurden wie folgt geschützt: Boc-Arg(Tos), Boc-Asp(OcHex), Boc-Glu-(OBzl), Boc-Lys( 2cl-Z), Boc- Ser(Bzl), Boc-Thr(Bzl), Boc-Tyr-(2,6-Cl&sub2;Bzl), Boc-Asp&sup8;(OFm) und Boc-Lys¹²(Fmoc). Ausnahmen von dem Verlauf erfolgten für das Kuppeln von Boc-Gln-OH (Positionen 24 und 16) und für das Kuppeln direkt anschließend an Gln (Positionen 23 und 15), wobei drei Äquivalente des symmetrischen Anhydrids in DMF verwendet wurden (doppelt gekuppelt). In speziellen Fällen, in denen ein drittes Kuppeln erforderlich war, wurde der HOBt-Ester hergestellt unter Verwendung von jeweils 2,5 Äquivalenten Boc-Aminosäure, 1-Hydroxybenzotriazol und DCC, das in DMF (120 ml) voraktiviert, filtriert (Entfernung von Dicyclohexylharnstoff) und mit Toluol auf 1,2 l verdünnt war. Das Kuppeln erfolgte zwei Stunden lang und 1,5% Diisopropylethylamin wurden zugegeben und weitere 15 Minuten umgesetzt.
Ein Teil des Zwischenprodukts [Ala¹&sup5;]-GRF(13-29)-BHA-Harz (1,88 g, 0,714 mmol) wurde entfernt und stufenweise wurde die Festphasensynthese wie oben beschrieben fortgesetzt. Nach Einbau von Lys¹²(Fmoc) wurde Stufe 6 ersetzt durch 0,6% DIAE/CH&sub2;Cl&sub2;. Das Kuppeln mit Boc-Asn-OH (6 Äquivalente) wurde durchgeführt durch Voraktivierung mit 1-Hydroxybenzotriazol (6,6 Äquivalente) und DCC (6 Äquivalente).

Herstellung von Cyclo8,12(Asp&sup8;,Ala¹&sup5;)-GRF(1-29)-NH&sub2;

Nach dem Zusammensetzen von Boc-[Asp&sup8;(OFm),Lys¹² (Fmoc), Ala¹&sup5;]-GRF(1-29)-BHA-Harz (2,72 g, 0,714 mmol) wurden bei dem Harz die Schutzgruppen mit 20% Piperidin/DMF 20 Minuten lang abgespalten, was Boc-[Asp&sup8;,Ala¹&sup5;]-GRF(1-29)-BHA- Harz ergab. Ein Teil (1,40 g, 0,40 mmol) wurde durch Reaktion mit BOP-Reagenz (443 mg, 1,0 mmol, 2,5 Äq) in DMF (40 ml), das Et&sub3;N (157 ul, 1,12 mmol, 2,8 Äq) enthielt, 4 Stunden lang cyclisiert. Nach Waschen wurde die Cyclisierung zwei weitere Male 11 Stunden lang und 3 Stunden lang (negativer Kaiser-Ninhydrintest) wiederholt und das Peptidharz gewaschen, getrocknet und mit HF (ungefähr 20 ml), das DTE (1 ml/g Harz) enthielt, bei 0 zwei Stunden lang gespalten. Nach dem Verdampfen von HF folgte Waschen mit EtOAc, Extraktion mit TFA (6 · 5 ml), Verdampfen und Verreiben mit Ether.

Reinigung und Charakterisierung von Cyclo8,12(Asp&sup8;,Ala¹&sup5;]- GRF(1-29)-NH&sub2;

Das rohe Produkt (708 mg) wurde in 20 ml H&sub2;O (0,025% TFA) suspendiert, gerührt, zentrifugiert, filtriert und auf eine Synchropak RP-P-Säule (2,0 · 50 cm) aufgetragen [Elutionsbedingungen: Elutionsmittel (A) H&sub2;O (0,025% TFA)-(B) ACN (0,025% TFA); linearer Gradient 20 bis 45% (B) in 120 Minuten, Durchflußrate 4 ml/min]. Die Fraktionen wurden in Intervallen von einer Minute gesammelt. Die Fraktionen 82 bis 89 wurden zusammengefaßt und lyophilisiert, was 84 mg halbreines Produkt ergab. Nebenbanden wurden erhalten von den Fraktionen 90 bis 93 (33 mg). Das halbreine Material (84 mg) wurde nochmals gereinigt auf einer Nucleosil-C&sub1;&sub8; Säule (1,0 · 50 cm; 5 u) [Elutionsbedingungen: Elutionsmittel (A) H&sub2;O (0,1% TFA)-(B) ACN (0,1% TFA); linearer Gradient 20 bis 40% (B) in 120 Minuten; Durchflußrate 3 ml/min]. Die Fraktionen wurden in Intervallen von einer Minute gesammelt. Die Fraktionen 120 bis 121 wurden zusammengefaßt und lyophilisiert, was ein homogenes Produkt (9 mg) ergab und die Fraktionen 122 bis 138 ergaben 42 mg eines Produktes, das > 97% rein war.
Mit analytischer HPLC wurde gezeigt, daß das Produkt homogen war. Aminosäureanalyse (6M HCl, 1100, 24 Stunden): Asp, 2,72; Thr, 0,96; Ser, 2,98; Glu, 2,14; Ala, 4,00; Val, 0,96; Met, 0,97; Ile, 1,89; Leu, 4,28; Tyr, 2,01; Phe, 0,98; Lys, 2,06; Arg, 3,04.

Beispiel 2

Synthese von Cyclo8,12(desNH&sub2;Tyr¹,D-Ala²,Asp&sup8;,Ala¹&sup5;)-GRF(1- 29)-NH&sub2;

Ein Teil des Zwischenproduktes [Ala¹&sup5;]-GRF(13-29)-BHA-Harz (5,1 g, 1,63 mmol) wurde entfernt und stufenweise eine Festphasensynthese durchgeführt gemäß dem in Tabelle 1 angegebenen Verlauf. Nach Einbau von Lys¹²(Fmoc) wurde die Stufe 6 ersetzt durch 0,6% DIEA/CH&sub2;Cl&sub2;. Die Synthese wurde fortgesetzt, was 6,4 g Boc-[Asp&sup8;(OFm),Lys¹²(Fmoc),Ala¹&sup5;]- GRF(3-29)-BHA-Harz lieferte. Ein Anteil von 1,0 g (0,255 mmol) wurde einem Zyklus der Festphasensynthese unterzogen mit Boc-D-Ala-OH, was Boc-[D-Ala²,Asp&sup8; (OFm), Lys¹²(Fmoc),Ala¹&sup5;]-GRF(2-29)-BHA-Harz lieferte. Ein Anteil von 0,5 g wurde einem letzten Zyklus mit desNH&sub2;Tyr-OH unterzogen, was [desNH&sub2;Tyr¹,D-Ala²,Asp&sup8;(OFm),Lys¹²(Fmoc), Ala¹&sup5;]-GRF(1-29)-BHA-Harz lieferte, bei dem die Schutzgruppen mit 20% Piperidin/DMF 20 Minuten lang abgespalten wurden und das mit BOP-Reagenz (170 mg, 0,384 mmol, 3 Äq) in DMF (20 ml), das DIEA (0,3 ml, 2,2 mmol) enthielt, 2 Stunden lang cyclisiert wurde. Die Cyclisierung wurde wiederholt mit frischem BOP-Reagenz (negativer Kaiser-Ninhydrintest) und das Peptid gewaschen, getrocknet und mit HF ( 10 ml) bei 0 2 Stunden lang gespalten (wie oben). Nach dem Verdampfen von HF wurde mit EtOAc gewaschen, mit TFA extrahiert, verdampft und mit Ether verrieben, was 229 mg rohes Produkt ergab. Die Reinigung wurde durchgeführt mit präparativer HPLC, wie oben für Cyclo8,12[Asp&sup8;,Ala¹&sup5;]- GRF(1-29)-NH&sub2; beschrieben.

Beispiel 3

Synthese von Cyclo8,12(desNH&sub2;Tyr¹,Asp&sup8;,Ala¹&sup5;)-GRF(1-29)-NH&sub2;

Ein Anteil von 1,0 g (0,255 mmol) von Boc-[Asp&sup8;(OFm),Lys¹²- (Fmoc),Ala¹&sup5;]-GRF(3-29)-BHA-Harz wurde zwei Zyklen der Festphasensynthese mit Boc-L-Ala-OH und anschließend desNH&sub2;Tyr-OH unterzogen, was [desNH&sub2;Tyr¹,Asp&sup8; (OFm),Lys¹²- (Fmoc),Ala¹&sup5;]-GRF(1-29)-BHA-Harz lieferte, bei dem die Schutzgruppen mit 20% Piperidin/DMF 20 Minuten lang abgespalten wurden und das mit BOP-Reagenz (170 mg, 0,384 mmol, 3 Äq) in DMF (20 ml), das DIEA (0,3 ml, 2,2 mmol) enthielt, 2 Stunden lang cyclisiert wurde. Die Cyclisierung wurde mit frischem BOP-Reagenz (negativer Kaiser-Ninhydrintest) wiederholt und das Peptid gewaschen, getrocknet und mit HF ( 10 ml) 2 Stunden lang bei 00 gespalten (wie oben). Nach dem Verdampfen von HF wurde mit EtOAc gewaschen, mit TFA extrahiert, verdampft und mit Ether verrieben, was 450 mg rohes Produkt lieferte. Die Reinigung wurde durchgeführt mit präparativer HPLC, wie oben für Cyclo8,12[Asp&sup8;,Ala¹&sup5;]- GRF(1-29)-NH&sub2; beschrieben.

Beispiel 4

Synthese von Cyclo8,12(D-Ala²,Asp&sup8;,Ala¹&sup5;]-GRF(1-29)-NH&sub2;

Ein Anteil von 0,5 g Boc-[D-Ala²,Asp&sup8;(OFm),Lys¹²(Fmoc),- Ala¹&sup5;]-GRF(2-29)-BHA-Harz von Beispiel 2 wurde einem letzten Zyklus mit Boc-Tyr[2,6-Cl&sub2;Bzl]-OH unterzogen, was Boc- [D-Ala²,Asp&sup8;(OFm),Lys¹²(Fmoc),Ala¹&sup5;]-GRF(1-29)-BHA-Harz ergab, bei dem die Schutzgruppen mit 20% Piperidin/DMF 20 Minuten lang abgespalten wurden und das mit BOP-Reagenz (170 mg, 0,384 mmol, 3 Äq) in DMF (20 ml), das DIEA (0,3 ml, 2,2 mmol) enthielt, 2 Stunden lang cyclisiert wurde. Die Cyclisierung wurde mit frischem BOP-Reagenz (negativer Kaiser-Ninhydrintest) wiederholt und das Peptid gewaschen, getrocknet und mit HF ( 10 ml) bei 0º 2 Stunden lang gespalten (wie oben). Nach dem Verdampfen des HF wurde mit EtOAc gewaschen, mit TFA extrahiert, verdampft und mit Ether verrieben, was 198 mg rohes Produkt lieferte. Die Reinigung wurde durchgeführt mit präparativer HPLC, wie oben für Cyclo8,12[Asp&sup8;,Ala¹&sup5;]-GRF(1-29)-NH&sub2; beschrieben.

Beispiel 5

Synthese von Cyclo8,12[N-Nethyl-Tyr¹,D-Ala²,Asp&sup8;,Ala¹&sup5;]- GRF(1-29)-NH&sub2;

Ein Anteil von 0,5 g Boc-[D-Ala²,Asp&sup8;(OFm),Lys¹²(Fmoc),- Ala¹&sup5;]-GRF(2-29)-BHA-Harz (von oben) wurde einem letzten Zyklus mit Boc-N-Methyl-L-Tyr-(2,6-Cl&sub2;Bzl)-OH unterzogen, was Boc-[N-Methyl-L-Tyr¹(2,6-Cl&sub2;Bzl),D-Ala²,Asp&sup8;(OFm),- Lys¹²(Fmoc),Ala¹&sup5;]-GRF(1-29)-BHA-Harz lieferte, bei dem mit 20% Piperidin/DMF 20 Minuten lang die Schutzgruppen abgespalten wurden und das mit BOP-Reagenz (170 mg, 0,384 mmol, 3 Äq) in DMF (5 ml), das DIEA (0,103 ml, 0,765 mmol, 6 Äq) enthielt, zwei Stunden lang cyclisiert wurde. Die Cyclisierung wurde zwei weitere Male mit frischem BOP-Reagenz (negativer Ninhydrintest) wiederholt und das Peptid gewaschen, getrocknet und mit HF ( 10 ml) 2 Stunden lang bei 0º gespalten (wie oben). Nach dem Verdampfen von HF wurde mit EtOAc gewaschen, mit TFA extrahiert, verdampft und mit Ether verrieben, was 219 mg rohes Produkt lieferte. Die Reinigung wurde durchgeführt mit präparativer HPLC, wie oben für Cyclo8,12[Asp&sup8;,Ala¹&sup5;]-GRF(1-29)-NH&sub2; beschrieben.
Obwohl die Erfindung in Verbindung mit der bevorzugten Ausführungsform beschrieben wurde, ist nicht vorgesehen, den Schutzbereich der Erfindung auf die spezielle angegebene Form zu begrenzen, sondern im Gegenteil sollen Alternativen, Modifikationen und Äquivalente, die im Bereich und dem Prinzip der Erfindung liegen, wie sie in den beigefügten Ansprüchen definiert ist, eingeschlossen sein.

Claims

1. Ein zyklisches Peptid mit der Formel

worin

R¹= Tyr, desNH&sub2;-Tyr, Ac-Tyr, His, N-Methyl-L-Tyr

R² = Ala, D-Ala, N-Methyl-D-Ala

R³= Gly, Ala, Leu, Val, Ile, Nle, NVal, α-Ala, α-Aib

R&sup4;= Met, Leu, Nle, Ile

R&sup5;= Ser, Asn

R&sup6;= eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg- Ala-Arg-Leu oder Fragmenten davon, wobei das Fragment vom Carboxylende um eine bis fünfzehn Aminosäuren, verkürzt ist

X = OH, NH&sub2;, N(R&sup7;) (R&sup8;) mit R&sup7; und

R&sup8; = H oder niederes Alkyl

A = Asp, Glu, α-Aminopimelinsäure, α-Aminoadipinsäure

B = Lys, Orn, Diaminopropionsäure, Diaminobuttersäure

wobei das Seitenkettencarboxylende von A durch eine Amidbindung an das Seitenkettenaminoende von B gebunden ist, und pharmazeutisch annehmbare Salze davon.

2. Das Peptid von Anspruch 1, worin R¹ = Tyr, desNH&sub2;-Tyr, N-Methyl-L- Tyr; R² = Ala, D-Ala; R³ = Ala; und X = NH&sub2;.

3. Das Peptid von Anspruch 2, worin A = Asp; B = Lys (und das Seitenkettencarboxylende von Asp kovalent als eine Amidbindung an das Seitenkettenaminoende von Lys gebunden ist); R&sup4; = Met; R&sup5; = Ser; und R&sup6; = Arg.

4. Das Peptid von Anspruch 3, worin R¹ = Tyr.

5. Das Peptid von Anspruch 4, worin R² = Ala und diese Verbindung die Formel hat:

6. Das Peptid von Anspruch 4, worin R² = D-Ala und diese Verbindung die Formel hat:

7. Die Verbindung von Anspruch 3, worin R¹ = desNH&sub2;-Tyr.

8. Die Verbindung von Anspruch 7, worin R² = Ala und diese Verbindung die Formel hat:

9. Die Verbindung von Anspruch 7, worin R² = D-Ala und diese Verbindung die Formel hat:

10. Die Verbindung von Anspruch 3, worin R¹ = N-Methyl-L-Tyr.

11. Die Verbindung von Anspruch 10, worin R² = Ala und diese Verbindung die Formel hat:

12. Die Verbindung von Anspruch 10, worin R² = D-Ala und diese Verbindung die Formel hat:

13. Verbindungen wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12 beansprucht zur Verwendung als therapeutisch aktive Substanzen.

14. Verwendung von in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12 beanspruchten Verbindungen zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von mit dem Wachstum in Verbindung stehenden durch Wachstumshormonmangel bei Menschen charakterisierten Krankheiten.

15. Ein Verfahren zur Herstellung von wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12 beanspruchten Verbindungen dadurch gekennzeichnet, daß ein ausreichend seitenkettengeschütztes, trägergebundenes Polypeptid mit entsprechender Aminosäuresequenz das durch Festphasenpeptidsynthese synthetisiert worden ist mit flüssigem HF behandelt wird und, falls gewünscht, daß ein solches Peptid in ein pharamazeutisch sinnvolles Salz überführt wird.

16. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Menge einer wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12 beanspruchten Verbindung und einen nicht toxischen pharmazeutisch annehmbaren flüssigen oder festen Träger enthält.

17. Die Verwendung einer wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12 beanspruchten Verbindung zur Behandlung von Tieren, um ihr Wachstum zu fördern.