DD248126A1 - Verfahren zur herstellung von d-para-ethylphenylalanin hoch 6-lh-rh-analoga - Google Patents

Abstract

Verfahren zur Herstellung eines LH-RH-Analogens der allgemeinen FormelpGluHisTrpSerTyrXLeuArgProY12345678910worin X - D-para-EthylphenylalaninundY - GlyNH2 oder NHR1worin R1-Alkyl, vorzugsweise Ethyl- undi-Propyl und Zykloalkyl-, vorzugsweiseZyklopropyl bedeutetoder ein nichttoxisches, pharmzeutisch verwendbares Salz hiervon, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Fragmente 1 bis 3 und 4 bis 10 bzw. 4 bis 9 am polymeren Traeger aufgebaut werden, das Fragment 1 bis 3 vom Traeger abgeloest und mit der am Traeger gebundenen Sequenz 4 bis 10 bzw. 4 bis 9 gekuppelt wird. Das neue LH-RH-Analogen findet als Brunstsynchronisationsmittel in der industriellen Tierproduktion als auch in der diagnostischen und therapeutischen Medizin Anwendung.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von D-para-Ethylphenylalanin⁶-LH-RH-Analoga. Das erfindungsgemäß hergestellte LH-RH-Analogon findet als Brunstsynchronisationsmittel in der Vererinärmedizin sowie unter anderem als Mittel bei /Fertilitätsstörungen in der Humanmedizin Anwendung.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bereits bekannt, daß LH-RH und seine Analoga sowohl konventionell als auch am polymeren Träger nach verschiedenen Verfahren hergestellt werden können. Entsprechende Angaben sind im DD 135078 enthalten.

Ziel der Erfindung

Auf Grund der Bedeutung von LH-RH sowohl in der industriellen Tierproduktion als Brunstsynchronisationsmittel als auch in der diagnostischen und therapeutischen Medizin besteht ein beträchtliches Interesse an der Herstellung neuer Verbindungen mit im Vergleich zum natürlichen Hormon verbesserten Eigenschaften. Eine Annäherung an dieses Ziel konnte die selektive Modifikation oder den selektiven Ersatz von Aminosäureresten des LH-RH durch andere Aminosäuren erreicht werden. Wenn sich auch in den meisten Fällen modifizierte Peptide als weniger aktiv erwiesen haben, so ergab jedoch der Ersatz des Glycylrestes in der 6-Stellung von LH-RH durch D-Aminosäuren eine verstärkte Wirksamkeit.

A.Arimura et al.: Endocrinology 95,1174(1974)

J.A.Vilchez — Martinez et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun.59,1226(1974) A.V.Schally u. D. H. Cay: DE-OS 2625843 vom 9.6.1976

D.H.Coyu. A.V.Schally: Annals of Clinical Res. 10,139(1978)

Das Ziel der Erfindung ist es, ein LH-RH-Analogon zu finden, das wesentlich aktiverund länger wirksam ist als das natürliche LH-RH.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein LH-RH-Analogon zu finden, das eine erhöhte Wirksamkeit und verlängerte Wirksamkeitsdauer gegenüber LH-RH besitzt.

Derartige Eigenschaften haben auch praktische Bedeutung, da die Kosten zur Herstellung der Verbindung verringert werden und die längere Wirkungsdauer für den Anwender von großem Nutzen ist. Die Auswahl der erfindungsgemäßen Verbindungen erfolgte aus Verbindungen folgender Formel:

ρ Glu-His-Trp-Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro-Y _f 1 23 4. 567 8 9 10

X = D-para-Ethylphenylalanin und Y = GIy NH₂ oder NH-R₁, worin R₁ = Alkyl, vorzugsweise Ethyl-, Isopropyl- und Cycloalkyl-, vorzugsweise Cyclopropylbedeutet;

oder einem nicht-toxischen, pharmazeutisch verwendbaren Salz davon.

Wirksamkeit und die langanhaltende Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen können durch pharmkologische Standard-Untersuchungen bestimmt werden, wie es beispielsweise A. Arimura et al. Endocrinology 95,1174 (1974) angegeben hat. Die Testung der LH-Spiegel wird im Radioimmunoassay mittels eines Schaf-Anti-LH/Schaf-LH-Systems durchgeführt, wobei als Standard die Referenzpräparation NIAMDD-Rat LH-RP₁ dient. Die statistische Sicherung der Resultate erfolgt mittels des t-Testes nach Student bzw. modifiziert nach Welch und die Berechnung des Aktivitätsquotienten nach Borth et al. Arch. Gynäk. 188,497 (1957).

Beispielsweise zeigen nach der dort beschriebenen Versuchsanordnung Ratten, denen 50 ng bzw. 250 ng der Verbindungen subcutan injiziert wurden, eine dosisabhängige starke LH-freisetzende Wirkung mit einem Maximum zwischen der ersten und zweiten Stunde nach der Injektion, wobei noch nach bis zu 6 Stunden eine beträchtliche Wirksamkeit vorliegt. Dagegen wird bei dergleichen Dosis von LH-RH (50 ng, 250 ng; subcutan) das Maximum nach etwa 20 Minuten erzielt und nach einer Stunde läßt sich keine von der NaCI-Gruppe unterscheidbare Aktivität registrieren. Berechnet man für die verschiedenen Dosisgruppen das Verhältnis der Wirkungsflächen von Standard (LH-RH) und LH-RH-Analogon während der Testierungszeit von 6 Stunden, so kann bei Injektion von 50ng eine ca. 31fach stärkere, bei Injektion von 250ng eine ca. 43fach stärkere Wirkung des Analogons, D-p-Ethylphenylalanin⁶-LH-RH angenommen werden. Die Synthese des erfindungsgemäßen Peptids erfolgt unter Verwendung bekannter Kupplungsmethoden an polymeren Trägern, wie es beispielsweise im DD 135078 beschrieben wurde. Durch Verwendung eines geeigneten Trägermaterials erfolgt die Herstellung des Tripeptids pGlu-His-Trp nach der Festphasenmethode, die Umsetzung des am Träger aufgebauten und gebundenen Heptapeptids Ser-Tyr-D-pEt-phe-Leu-Arg-Pro-Gly bzw. des Hexapeptids Ser-Tyr-D-pEt-phe-Leu-Arg-Pro mit vom Träger abgelösten Tripeptid zum geschützten am Träger gebundenen LHRH-Analoga. Nach Abspaltung der Schutzgruppen und des aufgebauten Peptides vom Träger durch Behandlung mit verflüssigtem HF liegt ein relativ reines Produkt in hoher Ausbeute vor.

Der Aufbau des Peptids erfolgt an polymeren Trägern bekannter Art, deren Grundgerüst aus vernetzten Polyvinyl-Kohlenwasserstoffen besteht. Mittels geeigneter Methoden werden aktive Zentren in das Polymere eingeführt, an die die C-terminale geschützte Aminosäure oder ein entsprechendes Di-oder Tripeptid gebunden wird, das dann die Basis für den weiteren Peptidaufbau darstellt. Als reaktive Zentren werden vorzugsweise die Benzhydrylamin- oder die Chlormethyl-Gruppe verwendet. Die herstellung der LHRH-Analoga wird in mehreren Teilschritten durchgeführt.

An einem Benzhydrylaminharz wird die Aminosäure Glycin in geeigneter geschützter Form unter Verwendung bekannter Kupplungsmethoden, vorzugsweise der DCC- oder der symmetrischen Anhydridmethode verankert und nacheinander werden die Aminosäuren Pro, Arg, Leu, D-pEt-phe, Tyr und Ser oder entsprechende Peptidfragmente in geeigneter geschützter Form nach gleichen Methoden verknüpft

Beim Aufbau der verkürzten Sequenz

Ser-Tyr-D-pEt-phe-Leu-Arg-Pro

wird anein chlormethyliertes Harz ein in geeigneter Form geschütztes Pro nach bekannten Methoden gebunden und die anderen Aminosäuren oder entsprechende Peptidfragmente in geeigneter geschützter Form nacheinander angekuppelt.

Das Tripeptid pGlu-His-Trp wird am Chlormethylharz aufgebaut, wobei Trp in geeignet geschützter Form als Cs-SaIz o.a. mit dem Chlormethylharz verknüpft wird. Die anderen Aminosäuren His und pGlu werden in geschützter Form unter Verwendung oben angeführter Kondensationsmethoden nacheinander verknüpft. Das Tripeptid wird vom Träger abgelöst und mit dem.sich am Benzhydrylaminharz befindenden geschützten Heptapeptid bzw. mit dem sich am Chlormethyl-Harz befindenden Hexapeptid gekuppelt. Die LHRH-Analoga werden entweder unter gleichzeitiger Abspaltung der Schutzgruppen vom Träger mittels verflüssigten HF oder durch Ablösung des Peptids auf bekannte Weise, vorzugsweise durch Ammonolyse und anschließende Abspaltung der Seitenkettenschutzgruppen, bevorzugt mit verflüssigtem HF, freigesetzt.

Die so erhaltenen LHRH-Analoga haben bereits einen Gehalt von 70-80%. Zur Anwendung im veterinärmedizinischen Bereich genügt eine Reinigungsoperation zum Beispiel in Form einer Fällung als schwerlösliches Säureadditionssalz mit anschließender Freisetzung mittels Ionenaustauscher. Man erhält so ein biologisch hochaktives Präparat.

Für diagnostische und therapeutische Zwecke wird eine weitere Reinigungsoperation, z. B. eine säulenchromatographische Reinigung, durchgeführt.

Nachfolgendes Formelschema soll der näheren Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens an Hand der Synthese der LH-RH- Analogasequenz dienen.

	GIy-NH P
Trp P	+ Boc-Pro
+ Boc-His	+ Boc-Arg(NO2)
+ pGlu	+ Boc-Leu
	+ Boc-D-pEt-phe
pGlu—His—Trp—	+ Boc-Tyr
+ HF	+ Boc-Ser(-OBzl)
pGlu-His-Trp-OH	Ser(-OBzl)-Tyr-D-pEt-phe-Leu-Arg(NO2)-Pro-Gly-NH-P
pG I u-H is-Trp-Se r(-0 BzI	)-Tyr-D-pEt-phe-Leu-Arg(NO2)-Pro-Gly-NH-P + HF
LHRH-
Analogon

Bei der Synthese werden an der Reaktion nichtbeteiligte, freie funktioneile Gruppen zweckmäßigerweise geschützt, insbesondere mittels durch Hydrolyse oder Reduktion oder flüssigen Fluorwasserstoff leicht abspaltbare Reste, wobei die für die Peptidsynthese bekannten Gruppen verwendet werden, z. B. die Benzyl-, p-Chlorbenzyl-, 2,6-Dichlorbenzyl-, p-Nitrobenzyl-, p-Methoxybenzyl-, Benzhydryl-, tertiär-Butyl-, Tosyl-, Dinitrophenyi- und die Nitro-Gruppe. Als Aminoschutzgruppen sind beispielsweise zu nennen:

Aliphatische Oxycarbonylgruppen, wie z. B. Cyclohexyloxycarbonyl-Adamantyloxycarbonyl- und in erster Linie tertiär-Butoxycarbonyl-(Boc-), oder sich von der Kohlensäure bzw. Thiokohlensäure ableitende Gruppen, wie gegebenenfalls im aromatischen Rest substituierte Carbobenzoxygruppen (z. B. Carbobenzoxy-, p-Brom- oder p-Chlorcarbobenzoxy-, p-Methoxycarbobenzoxy-), ferner o-Nitrophenylsulfenyl- und gegebenenfalls substituierte Aralkylgruppen (z. B. Diphenylmethyl- oder Triphenylmethylgruppen). Zur Abspaltung der α-Amino-Schutzgruppen während der Synthese finden Trifluoressigsäure/ Dichlormethan,Trifluoressigsäure, HCI in Eisessig oder Dioxan bevorzugt Anwendung. Andere Spaltungsreagentien und deren Abspaltungsbedingungen zur Entfernung spezifischer Amino-Schutzgruppen sind in E.SCHRÖDER und K.LÜBKE, The Peptides I, Academic Press, 1965, S.72-75, beschrieben.

Nachdem das gewünschte Peptid aufgebaut wurde, kann die Bindung mit dem polymeren Trägermaterial auf bekannte Weise, wie mit Bromwasserstoff/Eisessig, durch Alkoholyse, Hydrazinolyse, Hydrogenolyse bevorzugt, aber durch Ammonolyse oder mit Hilfe von verflüssigtem Fluorwasserstoff bei 0°C bis Raumtemperatur, gegebenenfalls unter Zusatz von z.B. Anisol oder/und Mercaptoäthanol aufgespalten werden.

Ausführungsbeispiel

Die Erfindung soll nachstehend an Hand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden'

Beispiel 1

lOgBenzhydrylaminharz, hergestellt nach I. RIVIER et al., J. Med.Chem. 16,545 (1973) bzw. P. PIETTA et al., J. Org.Chem. 39,44 (1974) wurden mit 5,3g Boc-Gly in Methylenchlorid unter Zusatz von 6,2g Dicyclohexylcarbodiimid umgesetzt. Der Gehalt an Boc-Gly betrug 0,96mMol/g Harz. Die folgenden Aminosäuren oder deren Anhydride wurden in 3facher Menge eingesetzt: Boc-Pro, Boc-Arg(NO₂), Boc-Leu, Boc-D-pEt-phe, Boc-Tyr, Boc-Ser(-OBzl). Nach der Kondensation mit Boc-Gly kam folgender Waschzyklus zur Anwendung:

1. 3 χ 80 ml Methylenchlorid (je 3')

2. 3 x 80ml Dioxan (je 3')

3. 1 x 80ml4NHCL/Dioxan(10')

4. 1 x 80ml4NHCI/Dioxan(25')

5. 3 x 80ml Dioxan (je 3')

6. 3 x 80 mi Methylenchlorid (3')

7. 3 χ 80ml Chloroform-Methanol (2:1) (3')

8. 3 x 80ml Chloroform (3')

9. 2 x 80ml Chloroform-Triäthylamin (9:1) (je 5') 10. 3 x 80mi Chloroform (3')

1.1. 3 χ 80ml Methylenchlorid (3')

Nach Ankondensation des Boc-O-Benzylserins resultierten ISgO-Benzylseryl-tyrosyl-D-pEthyl-phenylalanyl-leucyl-nitroarginylprolyl-glycinharz.

Beispiel 2

3g Boc-Tryptophan-Harz, hergestellt aus dem Chlormethylharz (.7 % Cl) und dem Cs-SaIz des Boc-Tryptophans mit einem Gehalt von 0,91 mMol/g Harz wurde nach der Methode der symmetrischen Anhydride nach jeweiliger Deblockierung mit der dreifachen Menge der Anhydride derfolgenden Aminosäuren umgesetzt:

Boc-His, p-Glu.

Der Waschzyklus entspricht dem aus Beispiel 1.

Die Menge an p-Glu-His-Trp- P betrug 3,45g

Tg Tripeptid-Harz wurden nach SAKAKIBARAmit 15ml HF und 1,5ml Anisol bei 0⁰C umgesetzt.

Nach Abdestillation der HF wurde mit Ether gewaschen und der Rückstand mit 1%iger Essigsäure gelöst. Durch Austausch mit Wofatit AD 41 (Acetatform) wurde in das Tripeptidacetat überführt und anschließend lyophilisiert. Die Menge an p-Glu-His-Trp betrug 220 mg.

Beispiel 3

Pyroglutamylhistidinhydrazid wurde nach GILLESEN et al. HeIv. Chim. Acta 53,60(1970) hergestellt und nach Überführung in das Azid nach GILLESEN et al., HeIv. Chim. Acta 53, 60 (1970) mit Tryptophanbenzylester nach US-PS 3888838 zum Pyroglutamylhistidyl-tryptophanbenzylester umgesetzt. Die Hydrierung erfolgte nach H. SievertsSon et al. J. Med. Chem. 15,222 (1972) mit Palladium-Bariumsulfat als Katalysator.

Beispiel 4

1 g des unter Beispiel 1 angeführten O-Benzylseryl-tyrosyl-D-pEthyl-phenylalanyl-leucyl-nitroarginyl-prolyl-plycinharzes mit einem Gehalt von 0,96mMol/g Harz wurde in Demethylformamid mit 2,88 mMol des nach Beispiel 2 bzw. 3 erhaltenen Pyroglutanyl-histidyl-tryptophans unter Zusatz von 2,88mMol Dicyclohexylcarbodiimid umgesetzt. Nach Waschung mit Dimethylformamid, Chloroform-Methanoi (2:1) und Methylenchlorid betrug die Gesamtmenge 1,2g.

1,2g Dekapeptidpolymer wurden nach SAKAKIBARA mit 15ml HF und 1,5ml Anisol (und/oder Mercaptoäthanol o.a.) 1 Stunde bei 0°C umgesetzt. Nach Abdestillation der HF wurde der Rückstand mit Ether gewaschen und in 1 %iger Essigsäure gelöst. Durch Austausch mit Wofatit AD 41 wurde in das Dekapeptidacetat überführt und anschließend lyophilisiert. Es wurden 334mg LH-RH-Analogon-diacetatmonohydrat erhalten.

Beispiel 5

250 mg rohes Analogon wurden zur Reinigung in 10 ml Wasser gelöst, mit 0,25ml Essigsäure versetzt und mit 25 ml gesättigter, wäßriger Styphninsäurelösung gefüllt. Die Fällung wurde mit Styphninsäurelösung gewaschen, in einem Aceton-Wasser-Gemisch (1:1) aufgelöst und mit Wofatit AD 41 (Acetatform) in LH-RH-Analogon-diacetat rückgeführt. Nach Lyophilisation wurden 188mg reines Analogon erhalten.

Beispiel 6

1 ,Og der nach Beispiel 5 erhaltenen Substanz werden für diagnostische und therapeutische Zwecke durch Gradientenelution mit Triethylamin-Essigsäure-Puffern (0,01/0,4m, pH4,5) an Carboxymethylcellulose (Säulengröße 2 χ 30cm) chromatographiert.

Die Ermittlung der Fraktionen erfolgt durch UV-Messung bei 278nm und Dünnschichtchromatographie (Laufmittel I:

Chloroform-Methanol-30%ige Essigsäure 60:45:20; Laufmittel II: n-Butanol-Essigsäure-Wasser4:1:5). Das bei einer Elutio'nskonzentration von 0,22-0,25 man Triethylamin-Essigsäure-Puffer gesammelte Produkt wird im Vakuum eingeengt und dann lyophilisiert.

Das Analogon wird in der Diacetatform erhalten.

Ausbeute: 0,683g

Optische Drehung: [a]⁽54_6nm: —60°± 0,5 (c = 1,1%ige Essigsäure)

RrWerte bei der Dünnschichtchromatograph'ie:

Laufmittel I: 0,49

Laufmittel II: 0,13

Aminosäureanalyse:

	GIu	His	Trp	Ser	Tyr	p-Et-phe	Leu	Arg	Pro	GIy
theoret. Wert	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1
gefunden	[1,0]	1,02	0,97	0,85	0,98	1,01	1,0	1,04	1,0	1,02

Claims (1)

1. Verfahren zur Herstellung eines LH-RH-Analogons der allgemeinen Formel

   p-GIu-His-Trp-Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro-Y ,
   1 2 3 4 5 6 7 .8 9 10 .'

   worin X— D-para-Ethylphenylalanin
   und Y — GIy-NH₂ oder-NH-Ri ,

   worin R₁-Alkyl, vorzugsweise Ethyl- und i-Propyl- und Cycloalkyl-, vorzugsweise Cyclopropyl bedeutet

   oder ein nichttoxisches, pharmazeutisch verwendbares Salz davon, gekennzeichnet dadurch, daß die. Synthese durch die Kupplung zweier an geeigneten Trägermaterialien synthetisierter Peptidfragmente 1 bis 3 und 4 bis 10 bzw. 4 bis 9, wobei die Fragmente durch Kupplung der ersten C-terminalen in geeigneter Form geschützten Aminosäure oder eines kurzkettigen Peptides an einem polymeren Träger und schrittweise Kupplung der in geeigneter Form geschützten Aminosäuren und bzw. oder Peptidfragmente unter Verwendung bekannter Kondensationsmethoden synthetisiert werden, wonach die Sequenz 1 bis 3 vom Träger abgelöst und eine Kupplung mit dem sich noch am polymeren Träger befindenden Hepta- bzw. Hexapeptid der Sequenz 4 bis 10 bzw. 4 bis 9, zum Deka- bzw. Nonapeptid durchgeführt und das erhaltene LH-RH-Analogon vom polymeren Träger abgespalten wird.