DE2435027C2 - Nonapeptidamide und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Description

bedeutet

2. Nonapeptidamide nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R¹ His bedeutet

3. Nonapeptidamide nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R² Tyr bedeutet

4. Nonapeptidamide nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß R³ Leu bedeutet

5. Nonapeptidamid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R¹ His, R² Tyr, R³ Leu und R⁴ die Äthylgruppe bedeuten.

6. Nonapeptidamid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R¹ His, R² Tyr, R³ Leu und R⁴ n-Propyl bedeuten.

7. Nonapeptidamid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R¹ His, R² Tyr, R³ Leu und R⁴ 2-Hydroxyäthyl bedeuten.

8. Nonapeptidamid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R' His, R² Phe, R³ Leu und R⁴ Äthyl bedeuten.

9. Nonapeptidamid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R¹ His, R² Tyr, R³ Nie und R⁴ Äthyl bedeuten.

10. Verfahren zur Herstellung der Nonapeptidamide der allgemeinen Formel

(PyrJGIu-R'-Trp-Ser-RMDJ-Ala-R^Arg-Pro-NH-R⁴

in der R¹, R², R³ und R⁴ die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen haben, dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise L-Pyroglutaminsäure oder ein der in Anspruch 1 angegebenen Aminosäuresequenz entsprechendes, N-terminal einen L-Pyroglutaminsäurerest aufweisendes Peptidfragment mit einer Aminkomponente, die dem restlichen Teil des gewünschten Nonapeptidamids entspricht, kondensiert, wobei die Reaktionspartner gegebenenfalls eine oder mehrere Schutzgiuppen enthalten, und die gegebenenfalls vorhandenen Schutzgruppen abspaltet.

Die Erfindung betrifft neue Nonapeptidamide mit starker ovulationsinduzierender Wirksamkeit, welche die allgemeine Formel

(Pyr)Glu-R'-Trp-Ser-R^J-(DJ-Ala-Ri-Arg-Pro-NH-R⁴

(D

worin R¹ His, Tyr, Trp oder p-Amino-L-phenylalanyl, R² Tyr oder Phe, R³ Leu, He oder Nie und R⁴ Alkyl mit I bis Kohlenstoffatomen, 2-Hydroxyäthyl, 2-Hydroxy-npropyl oder 3-Hydroxy-n-propyl bedeutet, und Verfah

ren zu deren Herstellung,

Im folgenden werden die Aminosäuren und Peptidemit Abkürzungen bezeichnet, welche auf diesem Gebiet allgemein üblich sind und vom Committee on Biochemical Nomenclature of IUPAC-IUB empfohlen bzw. bewilligt wurden. Die Aminosäuren haben, wenn nicht anders angegeben, jeweils L-Konfiguration,

Nachstehend sind Beispiele für die im folgenden verwendeten Abkürzungen angeführt:

AIa:	Alanin
Arg:	Arginin
BOC:	t-Butoxycarbonyl
BzI:	Benzyl
DCC:	N.N'-Dicyclohexylcarbodiimid
His:	Histidin
HONB:	N-Hydroxy-5-norbornen-23-
	dicarboximid
HOSu:	N-Hydroxysuccinimid
IBOC:	Isobornyloxycarbonyl
He:	isoleucin
Leu:	Leucin
Nie:	Norleucin
OMe:	Methylester
OBzI:	Benzylester
ONB:	N-Hydroxy-S-norbornen^-
	dicarboxiimidester
OSu:	N-Hydroxysuccinimidester
Phe:	Phenylalanin
p.NH2-Phe:	p-Aminophenylalanin
Pro:	Prolin
(Pyr)Glu:	Pyroglutaminsäure
Ser:	Serin
Tor:	Tosyl
Trp:	Tryptophan
Tyr:	Tyrosin
Z:	Benzyloxycarbonyl

Als Beispiele für die mit R⁴ bezeichnete gerad- oder verzweigtkettige Alkylgruppe mit 1 -3 Kohlenstoffatomen, welche wie nachstehend angegeben durch eine Hydroxylgruppe substituiert sein kann, seien Methyl, Äthyl, n-Propyl, i-Propyl, 2-Hydroxyäthyl, 2-Hydroxy-npropyl, 3-Hydroxy-n-propyl genannt

Es ist schon lange bekannt, daß der Hypothalamus Faktoren enthält, welche auf höherer Ebene die Sekretion von tropischen Hormonen durch die Hypophyse steuern. Kürzlich wurde folgend auf die Isolierung eines Hypotrophin freisetzenden HoriE^nes (TRH) ein Hormon, welches die Freisetzung von Gelbkörperbildunp induzierendem, »luteinisierendem« Hormon fördert, in reiner Form aus Schweinen und Schafen extrahiert. Es erwies sich als ein Dekapeptid der Formel H-(Pyr)GIu-His-Trp-Ser-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2.

-,5 (A. V. Schally et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 43, 1334 [1971]; R. Guillemin et al., Proc. Nat. Acad. Sei., U.S.A., 69,278 [1972]).

Aufgrund dieser Erkenntnis wurde eine Anzahl von ähnlichen Peptiden hergestellt, an welchen biologische

bo Untersuchungen vorgenommen wurden. Dennoch wird die physiologische Wirksamkeit der Peptide durch selbst geringfügige Modifikationen der oben angeführten Aminosäurezusammensetzung stark beeinträchtigt und die oben angeführte chemische Struktur ist als

hi wesentlich zur Fintfaltung der maximalen physiologischen Wirksamkeit anzusehen. (A. V. Schally et al., Biochem. Biophys. Res. Coinmun., 4,366 [ 1972]).

Ks ist nun gelungen, die Nonapepticlderivate der

Formel (I) herzustellen und es wurde überraschend gefunden, daß diese Verbindungen eine wesentlich stärkere ovulationsinduzierende Wirkung besitzen als die in der Natur vorkommenden Deoapeptide, Weiters wurde gefunden, daß diese Verbindungen durch ihre Wirkung auf die Hypophyse die Ausscheidung von lutenisierendem und foUikelstimuUerendem Hormon fördern. Es wurde weiters gefunden, daß diese Verbindungen nicht nur als Medikamente für den menschlichen Gebrauch, z.B. für die Diagnose der Hypophysenfunktion, gegen Gonadotropinmangel und für die Therapie von Amenorrhöe, aber auch als tierärztliche Medikamente, vor allem für die Viehzucht, verwendet werden können. Die vorliegende Erfindung beruht auf diesen unerwarteten Erkenntnissen.

Hauptziel der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung neuer Nonapeptidamide der allgemeinen

Tabelle 1

IO

15 Formel (I) mit starker ovulationsinduzierender Wirkung,

Die Erfindung betrifft die in den Ansprüchen dargelegten Gegenstände,

Zur Vereinfachung wird mit Reaktionskomponente (A) L-Pyroglutaminsäure oder ein Peptidfragment mit einer N-endständigen L-Pyroglutaminsäure-Einheit, das gleichzeitig von dort an die Aminosäuren-Sequenz der allgemeinen Formel (I) aufweist und die mit der Reaktionskomponente (A) zu kondensierende Amin-Komponente Reaktionskomponente (B), die dem Rest des Nonapeptidamidderivates der Formel (I) entspricht, bezeichnet Dabei können die Reaktionskomponenten (A) und (B) gegebenenfalls geschützt sein.

Aus der nachstehenden Tabelle sind grundsätzliche Kombinationen der Reaktionskomponenten (A) und (B) ersichtlich.

Kombination Reaktionskotnponeme (A)

(B)

(Pyr)Glu-OH

(Pyr)Glu-R,-OH

(Pyr)Glu-R,Trp-OH

(Pyr)GIu-R_l-Tφ-Ser-OH

(Pyr)Glu-R,-Trp-Ser-R₂-OH

(Pyr^jlu-RrTrp-Ser-Rj-iDJ-Ala-OH

(Pyr)Glu-R,-Tcp-Ser-il₂-(D)-AIa-R₃-OH

H-R,-Trp-Ser-R_r(D)-Ala-R3-Arg-Pro-NH-R4 H-Trp-Ser-RrCDJ-Ala-Rj-Arg-Pro-NH-Rj H-Ser-R_r(D)-Aia-R₃-Arg-Pro-NH-R₄ H-R₂-(D)-AIa-R₃-ArS-PrO-NH-R₄ H-(D)-Ala-R₃-Arg-Pro-NH-R4 H-R₃-Arg-Pro-NH-R₄ H-Arg-Pro-NH-R₄

H-PrO-NH-R₄

(Pyr)Glu-R,-Trp-Ser-R₂-(D)-Ala-R₃-Arg-Pro-OH NH₂-R₄

Es ist auch bekannt, daß eine geschützte L-Glutamylgruppe der Formel (II)

RCO - CH₂ - CH₂CH(NH₂)CO -

(11)

40

worin R eine Alkoxygruppe, wie z. B. Methoxy, Äthoxy, i-Propoxy, n-Propoxy, n-Butoxy, oder dergleichen, eine Aralkyloxygruppe, wie z.B. Benzyloxy, oder dergleichen oder Amino ist, leicht in die L-Pyroglutamylgruppe selbst umgewandelt werden kann:

co

in)

und zwar durch Behandlung mit einer Base, wie z. B. Ammoniak oder dergleichen, oder eine Säure, wie z. B. Essigsäure oder dergleichen, und daß die Gruppe (II) in dieser Hinsicht der L-Pyroglutamylgruppe selbst äquivalent ist. Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren ist anzunehmen, daß das L-Pyroglutamyl (d.h. H-(Pyr)Glu-) der Reaktionskomponente (A) nicht nur die L-Pyroglutamylgruppe selbst, sondern auch die geschützte L-Glutamylgruppe der Formel (II) umfaßt. Wenn das H-(Pyr)Glu- der Reaktionskomponente (A) die Gruppe (II) bedeutet, kann die Gruppe (II) nach an sich bekannten Verfahren leicht in die L-Pyroglutamylgruppe selbst umgewandelt werden.

Die erfindungsgemäße Kondensationsreaktion kann nach jedem beliebigen, für die Herstellung von Peptidbindungen üblichen Kondensationsverfahren durchgeführt werden. Dazu gehören das Azid-, Chlorid-, Säureanhydrid-, gemischte Säureanhydrid-, DCC-, aktive Esterverfahren, das Verfahren mit Woodwardreagens K, das Carbodiimidazolverfahren, das Oxidations-Reduktions-Verfahren, das DCC/HON B-Verfahren oder dergleichen. (The Peptides, Vol. I [1966], Schröder and Lubke, Academic Press, New York, USA. and BE-Patent7 96 399).

Vor der Kondensationsreaktion können die Carboxyl- und Aminogruppen, weiche an der beabsichtigten Reaktion nicht teilhaben sollen, geschützt werden, auch ist es möglich, die an der Reaktion teilnehmenden Carboxyl- und/oder Aminogruppen nach an sich bekannten Verfahren zu aktivieren. Die Carboxylgruppen im Ausgangsmaterial können in Form von Metallsalzen (wie z. B. von Natrium- oder Kaliumsalzen) oder von Estern (wie z. B. Methyl-, Äthyl-, Benzyl-, p-Nitrobenzyl-, tert.-Butyl- oder tert.-Amyl-Estern) geschützt werden.

Als Schutzgruppen für die Aminogruppen in den Ausgangsmaterialien können alle bei der Herstellung von Peptiden üblichen Schutzgruppen für Aminogruppen, wie z. B. Benzyloxycarbony!, tert.-Butoxycarbonyl, Isobornyloxycarbonyl, oder dergleichen, verwendet werden. Die Hydroxylgruppe des Serins kann durch eine herkömmliche Schutzgruppe wie Benzyl, tert.-Butyl und andere ätherbildende Gruppen geschützt werden. Die Hydroxylgruppe des Tyrosins kann ebenfalls durch Benzyl, tert.-Butyl und andere äthcrbildende Gruppen geschützt werden. Die Guanidingruppc des Arginins kann mit Gruppen wie z. B. Nitro, Tosyl.

Carbobenzoxy, Isobornyloxycarbonyl oder Adamantyloxycarbonyl geschützt werden. Als Beispiele for aktivierte Carboxylgruppen in den Ausgangsreagenzien sind die entsprechenden Säureanhydride, Azide und aktiven Ester (Ester mit Alkoholen, wie z, B, Pentachlorphenol, 2,4,5-TrichIorphenol, 2,4-Dinitrophenol, Cyanrnetnylalkohol, p-NitrophenoI, N-Hydroxy-5-Norbornen-2,3-Dicarboximid, N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxyphtnalimid oder N-Hydroxybenztriazol oder dergleichen), m nennen. Die aktivierten Aminogruppen in den Ausga»tgsmaterialien können z. B, in Form des entsprechenden Phosphorsäureamides vorliegen.

Aus der folgenden Tabelle sind Beispiele für Kombinationen derartiger Formen von Carboxyl- und Aminogruppen in den Materialien (A) und (E) ersichtlich.

Tabelle 2	Reaktionsmittel A COOH	NH2	B COOH	NH2
Kombinations- beispiele	frei aktiviert frei	geschützt geschützt geschützt	geschützt frei geschützt	frei frei aktiviert
1* 2 3

Anmerkung: In dem mit * bezeichneten Fa!! ist im Reaktionssystem vorzugsweise ein DehydralisierusgsTiiliel, wie z. B. ein Carbodiimidreagenz wie Dicyclouexylcarbodiimid, vorhanden. Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann wie folgt dargestellt werden:

(Pyr)Glu-R,-Trp + Ser-Rj-Schutzgruppe

I Kondensation
(z. B. DCC/H0NB)

(Pyr)Glu-R,-Trp + Ser-R^-Schutzgruppe

Entfernung einer Schutzgruppe
(z. B. katalytische Reduktion
mit Pd Katalysator)

(Pyr)Glu-R,-Trp + Ser-R₂

NO₂

Z-iDJ-Ala-Rj-Arg-Pro-NH-R,

Entfernung einer Schutzgruppe
(z. B. in Gegenwart von HBr)

NO₂
(D)-Ala-Rj-Arg-Pro-NH-R4

Kondensation (z. B. in Gegenwart von DCC-HONB oder DCC/l-Hydroxybenztriazol)

NO₂

(Pyr)GIu-R|-Trp-Ser-R_r(D)-Ala-R₃-Arg-Pro-NH-R4

Entfernung einer Schutzgruppe (z. B. in Gegenwart von SnCl₂ in Ameisensäure/Wasser, katalytische Reduktion nr'. Pd Katalysator oder HF)

(Pyr)Glu-RrTrp-Ser-R₂-(D)-Ala-R₃-Arg-Pro-NH-R4

Diese Reaktion kann in Gegenwart eines Lösungsmittels durchgeführt werden, welches als geeignet für die Kondensationsreaktion zur Herstellung von Peptiden bekannt ist. So z. B. können wasserfreies oder wässeriges Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Pyridin, Chloroform, Dioxan, Dichlormethan, Tetrahydrofuran und Gemische dieser Lösungsmittel verwendet werden.

Die Reaktionstemperatur wird innerhalb eines Bereiches gewählt, welcher für Reaktionen zur Bildung von Peptidbindungen geeignet ist, d. h. üblicherweise

mi innerhalb eines Bereiches von etwa -2O⁰C bis etwa + 30° G. Die Ausgangsmaterialien (geschützten Peptide) der erfindungsgemäßen Verbindungen können leicht nach Festphasen-Syntheseverfahren hergestellt werdsn.

Nach Beendigung der Kondensationsreaktion kön-

h^r> nen die gegebenenfalls im Produkt vorhandenen Schutzgruppen nach an sich bekannten Verfahren wieder entfernt werden. Als Beispiele für solche Verfahren sind katalytische Reduktion in Gegenwart

eines Katalysators wie Palladiumschwarz, Palladium auf Kohle oder Platin, Hydrolyse mit Fluorwasserstoff oder Trifluoressigsäure und Reduktion mit metallischem Natrium in flüssigem Ammoniak zu nennen.

Das so hergestellte Peptid der allgemeinen Formel (I) kann aus dem Gemisch der Reaktionsprodukte nach für die Gewinnung von Peptiden bekannten Verfahren wie Extraktion, Verteilung, Säulenchromatographie oder dergleichen gewonnen werden.

Die Peptide der allgemeinen Formel (I) können auch in Form eines Salzes gewonnen werden.

Beispiele für Säuren, welche mit Peptiden der allgemeinen Formel (I) Salze bilden können, sind anorganische Säuren wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Perchlorsäure, rauchende Salpetersäure, Thiocyansäure, Schwefel- und Phosphorsäure und organische Säuren wie Ameisen-, Essig-, Propion-, Glycol-, Milch-, Brenztrauben-, Oxal-, Malon-, Bernstein-, Malein-,

Sulfanilsäure.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide der allgemeinen Formel (I) besitzen LH-RH-Wirkung (d. h. die Wirkung eines ein luteinisierendes Hormon freisetzenden Hormons) und können daher die Ausscheidung von LH (luteinisierendem Hormon) und SFH (follikelstimulierendem Hormon) fördern. Die Polypeptide der allgemeinen Formel (I) werden daher als Medikamente zur Ovulationsförderung bei Frauen und Tieren wie Ratten, Schafen, Schweinen, Kühen, Stuten. Wachteln oder Hennen verwendet. Sie können auch für andere pharmazeutische Zwecke verwendet werden, für welche bisher herkömmliche LH-RH-. LH- und FSH-Präparate eingesetzt wurden.

Da die LH-RH-Wirkung der Polypeptide der allgemeinen Formel (I) etwa 20mal größer ist als jene der in der Natur vorkommenden, kann die Dosierungsmenge für jede Anwendung auf der Basis des oben angeführten Vielfachen bestimmt werden, wobei auch andere Faktoren wie der Empfänger der Verabreichung und die Krankheitsart in Betracht gezogen werden. Eine geeignete Dosierungsmenge kann z. B. innerhalb eines Bereiches von täglich etwa 2 ng bis 2 μg pro Kilogramm Körpergewicht gewählt werden.

Die Polypeptide der allgemeinen Formel (I) werden üblicherweise nicht peroral, sondern durch Injektion, rektal oder vaginal verabreicht, obgleich sie in manchen Fällen auch peroral verabreicht werden.

Als Beispiele für geeignete Dosierungsformen sind Injektionen, Suppositorien, Pessare und Pulver zu nennen. Die Injektionen können durch Lösen von etwa 10 γ bis 100 γ des Polypeptides der allgemeinen Formel (I) in I ml physiologischer Salzlösung hergestellt

in werden. Die Polypeptide der allgemeinen Formel (I) können auch unter Zugabe von Mannitol als Hülle in lyophilisierte Ampullenprodukte übergeführt werden und sind in dieser Form jederzeit als Injektionen verwendbar.

i) Die im erfindungsgemäßen Verfahren als Ausgangsstoffe eingesetzten Peptide können nach jedem beliebigen, für die Herstellung von Peptiden geeigneten Verfahren hergestellt werden.

Relative ovulationsinduzierende Wirkung der Peptide der allgemeinen Formel (I)

Die ovulationsinduzierende Wirkung wird an Sprague-Dawley-Ratten (weiblich mit 4-Tage-Cyclus) ermittelt, wobei die Verbindung am diöströsen Tag subkutan um 14.30 ' 'hr injiziert wurde, die ovulierten Ova in der Ampilla des Eileiters wurden am Morgen des darauffolgenden Tages untersucht. Die Ergebnisse (EDso) wurden mit jenen des LH-RH selbst verglichen. Nachstehend sind die Versuchsergebnisse der untersuchten Verbindungen angeführt.

Die physikalischen Daten der in Zeile 6 auf S. 13 aufgeführten Verbindungen sind die folgenden:

[<%] y = 49.9° (C= 0.5 in 5% Essigsäure) Rf¹ = 0,11.Rf² = 0.48

Aminosäureanalyse: His 0,91, Arg 039, Trp 0,83. Ser

1,02,

GIu 1.11, Pro 1.00. AIa 1,00, Leu 1,00, Tyr 0,96. n- Propylamin 0,98 (Ausbeute 91 %).

Vergleichsversuch	(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu - Arg-Pro-Gly-NH2	R-	Rj	(natürliches LH-RH)	100%
	Ri	Tyr	Leu	R4
Peptide	His	Tyr	Leu	Äthyl	6100%
der allgemeinen	His	Tyr	Leu	n-Propyl	480C ,-
Formel (I)	His	Tyr	Leu	2-Hydroxyäthyl	4300%
	His	Phe	Leu	iso-Propyl	3600%
	His	Phe	Leu	Äthyl	5810%
	His	Tyr	NIe	n-Propyl	2900%
	His	Phe	He	Äthyl	4800%
	His	Tyr	Leu	Äthyl	3200%
	Tyr	Tyr	Leu	Äthyl	2010%
	p-NH,-Phe	Äthyl	2150%

Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachstehenden Beispiele näher erläutert.

in den Beispielen bedeuten folgende Abkürzungen den Rf-Wert bei Dünnschichtchromatographie an Silikagel mit den folgenden Lösunsmittelsystemen:

Rf-: in Äthylacetat zu Pyridin zu Essigsäure zu Wasser

60:20:6:10 R": in n-Buianol zu Äihyiaceiat zu Essigsäure zu Wasser

1:1:1:1:1

Rf¹: in n-Butanol zu Essigsäure zu Wasser

4:1:1:1 Rf⁴: in Chloroform zu Methanol zu Essigsäure

9 :1 :0,5

Nachstehend werden die in den Beispielen verwendeten eingetragenen Handelsnamen erklärt:

eiiiJ: Filterhilfsmittel erzeugt von Johns—Manville USA

Biogel P-2: Materialien für Gelfiltration hergestellt von BIO. RADUSA

Cephadex LH-20: Verestertes Dextrangel hergestellt von Pharmacia Fine Chemicals, Schweden
Amberlite XAD-2: Polystyrolharz
Amberlite IRA-410: stark basisches Anionenaustauscherharz

Amberlite CO-410: stark basisches Anionenaustauscherharz

Amberiiie CG-45: schwach basisches Änionenaiisiauscherharz

Alle diese Harze werder von Rohm & Haas Co Ltd. USA hergestellt.

Beispiel I

Herstellung von (Pyr)Giu-His-Trp-Ser T >r-(DJ-Ala-Leu-Arg-Pro-NHCHj-CH,'

(a) Herstellung von (Pyr)-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH

'n 100 ml Methanol werden 8.0 g Z Ser-Tyr-OMe gelöst, dann wird unter Zugabe von 500 mg Palladiumschwarz die katalytische Reduktion bei Umgebungs-Temperatur und Druck durch Einleiten von Wasserstoffgas in die Lösung innerhalb von 4 Stunden vorgenommen. Danach wird der Katalysator abfiltriert. Das Methanol wird unter vermindertem Druck bei niederer Temperatur abdestilliert und der Rückstand in 30 ml Dimethylformamid gelöst. Dann werden der Lösung 6.78 g kristallines (Pyr)Glu-His-Trp-OH zugegeben, danach mit Eis gekühlt. Dann werden 5,4 g HONB und 5.0 g DCC zugegeben, das ganze Gemisch wird auf einem Eisbad β Stunden iang und dann bei Kaumtemperatur 10 Stunden lang gerührt.

Der als Nebenprodukt anfallende Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Filtrat bei vermindertem Druck eingeengt. Nach Zugabe von 100 ml Äther wird der entstandene Niederschlag abfiltriert, mit Äther gewaschen und getrocknet. Die Ausbeute beträgt 12.2 g. Dieses Produkt wird in einer Mischung aus Äthylacetat zu Pyridin zu Essigsäure zu Wasser (60:20:6:10) gelöst

Die Lösung wird über eine mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch gefüllte Silikagel-Kolonne (63 cm Durchmesser χ 19 cm) geleitet und die Kolonne mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch eluiert, wobei (Pvr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OMe in den 1480-1800-ml-Fraktionen erhalten wird. Das Eluat wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt und gründlich mit Wasser gewaschen. Die Ausbeute beträgt 83 g. Dünnschichtchromatographie dieses Produktes an Silikagel ergibt einen einzigen Pauly- und Ehrlichpositiven Fleck jeweils bei Rf = 0,29, RP=0,68 und RP=0,43.

In 50 ml Methanol werden 7,2 g dieses Produktes gelöst, dann werden allmählich unter Eiskühlung 30 ml t ι-* i^stnuniiijrurGAiu 2ug£g£uen. um die Hydrolyse einzuleiten. Die Lösung wird 3 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Danach werden 30 ml IN Salzsäure zugegeben und die Lösung wird gekühlt, worauf sich ein Niederschlag bildet. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit kaltem Wasser gewaschen und getrocknet. Das Produkt wird in 5%igem wässerigem Äthanol gewaschen und die Lösung über eine Kolonne (3 cm Durchmesser χ 25 cm) aus Amberlite XAD-2 geleitet. Die Elution wird nach dem Gradientenverfahren unter Einsatz von 5% Äthanol (800 ml) und 90% Äthanol (800 ml) durchgeführt. Die Fraktionen der to gewünschten Verbindung werden vereinigt, unter vermindertem Druck eingeengt, um das Äthanol zu entfernen, und lyophilisiert.

Ausbeute: 5,9 g Rf = 0,01, Rf² = 0,62, Rf¹ = 0,34.

'' Riementaranalyse für C)₄HJsNeOq · H2O

Berechnet: C 56,65, H 5,59, N 15.55.
gefunden: C 56.39, H 5,70, N 15,52.

Aminosäure: (Hydrolyse mit 5,7 N Salzsäure in Gegen-.•ti wart von Thioglycolsäure): GIu 1,05; His 0,98; Trp 0,95; Ser 0.98; Ty r 1,03.

(b) Herstellung von
Z-(D)-Ala-Leu-Arg(NOj)-PrO-NH-CH₂-CH₁

In einem Gemisch von 30 ml Dioxan und 10 ml Dimethylformamid werden 1,14 g H-Leu-Arg(NO₂)-PrO-NH-CH₂-CHj und 447 mg Z-(D)-AIa-OH gelöst. Der Lösung werden 400 mg HONB zugegeben und das Gemisch wird rasch abgekühlt. Nach Zugabe von 460 mg DCC wird das Gemisch 20 Stunden lang gerührt. Der als Nebenprodukt anfallende Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Filtrat wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird in Äthylacetat unter Wärmezufuhr gelöst, die Lösung wird mit einer 4%igen wässerigen Natriumbicarbonatlösung und dann mit Wasser gewaschen, worauf sie über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt wird.

Der Rückstand wird nochmals in einer kleinen Menge Äthylacetat unter Erhitzen gelöst und die Lösung wiiu abfiltriert, um die kleine Menge an unlöslichen buDstanzen zu entfernen. Das Fiiirai wird
gelassen, worauf sich Nadelkristalle bilden. Diese Kristalle werden abfiltriert, mit Äthylacetat gewaschen und getrocknet. Die Ausbeute beträgt 130 g.

Fp.: 183-184°C[«]? = -49,2° (c=0,5.Methanol)

Elementaranalyse für C30H47O8N9
Berechnet: C 54,45. H 7.16.
gefunden: C 54,42, H 7,28.

Rf= 0,78, RP = 0,90, Rf⁴ = 0,65

N 19,05,
N 18,86.

" (c) Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-

(D)-Ala-Leu-Arg-Pro-NH-CHrCH₃

In 20 ml Essigsäure werden 155 mg kristallines e.n Z-(D)-Ala-Leu-Arg(NO2)-Pro-NH-CHrCH3 gelöst, dann wird nach Zugabe von 100 mg Palladiumschwarz die katalytische Reduktion bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck innerhalb von 5 Stunden durchgeführt Der Katalysator wird abfiltriert, das Filtrat wird nach Zugabe von 0,45 ml 1 N Salzsäure bei vermindertem Druck zur Trockne eingeengt Der Rückstand wird in 10 ml Wasser gelöst und lyophilisiert Das zurückbleibende, weiße, flaumige Produkt und 141 mg (PyrJGlu-

His-Trp-Ser-Tyr-OH werden in 10 ml Dimethylformamid gelöst und dann werden 60 mg HONB zugegeben. Unter Eiskühlung werden sodann 0,25 ml einer 10%igen Lösung von N-Äthylmorpholin in Dimethylformamid und 50 mg DCC zugegeben. Das Gemisch wird unter Eiskühlung 5 Stunden lang und danach bei Raumtemperatur 10 Stunden lang gerührt. Das Dimethylformamid wird unter veriHndertem Druck abdestilliert und es werden dann 20 mi Wasser zugegeben. Die unlöslichen Substanzen werden abfiltriert und das Filtrat wird über eine Kolonne (1 cm χ 5 cm) aus Amberlite IRA-140 in Acetatform geleitet, welche dann mit 50 ml Wasser gewaschen wird. Die auslaufenden Wasser und das Waschwasser werden vereinigt und über eine Kolonne (1,5 cm Durchmesser χ 25 cm) aus Carboxymethylcellulose geleitet. Die Elution wird nach den Gradientenverfahren unter Verwendung von 0,005 M Ammoniumacetat (300 ml) und 0,175 M Ammoniumacetat (300 ml) durchgeführt. Die 170 ml bis 240-ml-Fraktionen werden vereinigt und lyophilisiert. Man erhält 208 mg eines weißen, flaumigen Pulvers. Das Dünnschichtchromatogramm dieses Produktes zeigt eine Verunreinigung mit einem hohen Rf-Wert. Daher wird es über eine Kolonne (2 cm Durchmesser χ 20 cm) aus Amberlite XAD-2 weiter gereinigt, indem eine wässerige Lösung des weißen flaumigen Produktes über eine Kolonne aus mit Wasser zubereitetem Amberlite XAD-2 geleitet und die Elution nach dem Gradientenverfahren unter Verwendung von Wasser (250 ml) und 75% Äthanol (280 ml) vorgenommen wird. Die 170 ml —250-ml-Fraktionen werden vereinigt und nach Entfernen des Äthanols durch Destillation bei vermindertem Druck lyophilisiert. Die Ausbeute beträgt 129 mg.

Rf =0,062; RP = 0358.

[ex]? = -47,0° fc=0,5.5% wässerige Essigsäurelösung).

Aminosäiireanalyse (Hydrolyse mit HCI in Thioglycolsäure): GIu 038; His 1,05; Trp 1,04; Ser 0,97; Tyr 0,97; AIa 1,00; Leu 1,04; Arg 1.03; Pro 1,00; Äthylamin 1,02 (86% Ausbeute)!

Nach einem ähnlichen Verfahren wird ein Polypeptid-

diinu uci roiiiici \r jiyvjiu-i na-11 p-^cf - ι yr-(O)-Äia- Leu-Arg-Pro-NHCH₃ unter Verwendung von Z-(D)-Ala-Leu-Arg(NO2)-Pro-NH-CH₃ statt Z-(D)-Ala-Leu-Arg(NO2)-Pro-NH-CH₂-CH₃ als einem der Ausgangstoffe in der oben angeführten Variante b) hergestellt. Dieses Produkt besitzt folgende physikalische und chemische Eigenschaften:

[λ]ϊ· = -48,1° (t=0,6,5%ige Essigsäure) Rf =0,055; RP = 0335.

Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit HCl in Gegenwart von Thioglycolsäure): GIu 1,00; His 1,02; Trp 0,89; Ser 0,90; Tyr 038; AIa 1,00; Leu 1,00; Arg 1,04; Pro 1,02; Methylamin 037 (843% Ausbeute).

Beispiel 2

Herstellung von (Pyr)Glu-H:s-Trp-Ser-TyrtDVAIa-Leu-Arg-Pro-NH-CHz-CHz-CHj.

(a) Herstellung von Z-(D)-Ala-Leu-Arg(NO2)-PrO-NH-CH₂-CH₂-CH₃

g g

in Eisessig werden 720mg Z-Leu-Arg(NO2)-Pv>>NH-CH2-CH2-CH3 gelöst Die Lösung wird 40 min lang geschüttelt, dann werden 20 ml troekener Äther zugegeben. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und mit trockenem Äther gewaschen. Das dabei erhaltene Pulver wird unter vermindertem Druck in

·, einem Exsikkator über Natriumhydroxid getrocknet. Das trockene Pulver wird in 5 ml Dimethylformamid gelöst und die Lösung wird nach Zugabe von 230 mg Z-(D)-AIa-OH und 200 mg HONB mit Eis gekühlt, wonach eine 10%ige Lösung von Triäthylamin in Dimethylformamid zugegeben wird. Dieser Lösung werden 230 mg DCC zugegeben und das Gemisch wird bei Raumtemperatur 10 Stunden lang gerührt. Der Großteil des Dimethylformamids wird unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand wird durch

η Zugabe von 50 ml Äthylacetat gelöst. Die unlöslichen Substanzen werden abfiltriert und das Filtrat wird dreimal mit einer 4%igen wässerigen Natriumbicarbonat-Lösung und zweimal mit Wasser gewaschen. Die Lösung wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrock-

>(> net und das Athylacetat abdestilliert. Der Rückstand wird in Äther eingebracht und das entstandene Pulver abfiltriert.

Das Pulver wird in Athylacetat unter Erhitzen gelöst und durch erneutes Ausfällen mit Äther gereinigt.

2% Nach dem soeben beschriebenen Verfahren werden 723 mg [«] -■ = -48,0° (t= 1,0, Methanol) erhalten.

Elementaranalyse für C₃IH₄ Berechnet: C 5:5,18. gefunden: C 54,89.

Rf⁴ = 0,62

H 7,17, H 7,32,

N 18,68, N 18,44.

(b) Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-(D)-AIa-LeUAr₈-PrO-NH-CH₂CH₂-CH₃

In einem Gemisch von 10 ml Essigsäure und 10 ml Methanol werden 150 mg des wie oben in a) beschrieben hergestellten Z-(D)-Ala-Leu-Arg(NO₂)-PrO-NH-CH₂-CH₂-CH₃ unter Verwendung von Palladium auf Kohle als Katalysator innerhalb von 4 Stunden katalytisch reduziert. Der Katalysator wird abfiltriert und das Lösungsmittel wird vom Filtrat unter vermindenem Druck aödesiiiiieri. Der Rückstand wird in 0,4 ml eines Gemisches aus 1 N Salzsäure und 10 ml Wasser gewaschen und die Lösung wird lyophilisiert. Nach diesem Verfahren erhält man ein weißes, flaumiges Pulver.

Dieses Produkt und 141 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH werden in 10 ml Dimethylformamid gelöst, danach werden 60 mg HONB und 0,25 ml einer 10%igen Lösung von N-Äthylmorpholin in Dimethylformamid zugegeben. Das Gemisch wird auf —2" C gekühlt und 55 mg DCC zugegeben. Das Gemisch wird unter Eiskühlung 5 Stunden lang und dann bei Raumtemperatur 12 Stunden lang gerührt

Nach beendeter Reaktion wird das Dimethylformamid bei vermindertem Druck abdestilliert und der Rükstand in 20 ml Wasser gelöst Die kleine Menge an unlöslichen Stoffen (Dicyclohexylharnstoff) wird abfiltriert und das Filtrat über eine Kolonne (1 cm Durchmesser χ 4 cm) Amberlite IRA-410 in Acetatform geleitet, welche Kolonne dann mit Wasser gewaschen wird. Die auslaufenden Laugen und das Waschwasser werden vereinigt und über eine Kolonne (U cm Durchmesser χ 25 cm) Carboxymethylcellulose geleitet

Nach Waschen mit 0,005 M Ammoniumacetatpuffer wird die kontinuierliche Elution unter Einss'z von

306 ml 0,005 M Ammoniumacetatpuffei- (Ph 6,8) und 300 ml 0,2 M Ammoniumacetalpuffer (Ph 6,9) vorgenommer. Die 160-ml-bis-230-ml-Fraktionen warden vereinigt, lyophilisiert, unter den oben angeführten Bedingungen nochmals chromatographierf und ein zweites Mal lyophilisiert Das Produkt wird in eine Kolonne (3 cm Durchmesser χ 50 cm) Biogel P-2 (5%ige Essigsäure als Eluent) eingebracht und das das gewünschte Produkt enthaltende Eluat wird lyophilisiert. Nach diesem Verfahren erhält man 201 mg eines weißen, flaumigen Pulvers.

[a]: = -46,8° (c=O,5,5°/o Essigsäure)
Rf² = 0,37;RP=0,08.

Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit 5,7 N Salzsäure in Gegenwart von Thioglycolsäure): His 0,97; Arg 0,97; Trp 0,91; Ser 0,91; GIu 1,00; Pro 1,00; AIa 0,98; Leu 0,97; Tyr 0,94(86,1% Ausbeute).

[α]? = -47,2° (C= 0$, Methanol)

Elementaranalyse für C30H47O9N9
Berechnet: C 53,16, H 639,
gefunden: C 52,84, H7^6,

RF=0.47

N 18,60,
N i8,2i.

Beispiel 3

Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-(D)-Ala-Leu-Arg-Pro-NH-CH₂-CH₂-OH

(a) Herstellung von
Z-(D)-Ala-Leu-Arg(NO₂) PrO-NH-CH₂-CH₂-OH

In 3 ml einer 20%igen Lösung von Bromwasserstoff in Dioxan werden 722 mg Z-Leu-Arg(NO₂)-Pro-NH-CH₂-CH₂-OH gelöst. Die Lösung wird 60 min lang geschüttelt, dann werden 30 ml Trockenäther zugegeben. Der Niederschlag wird durch Dekantieren gesammelt mit trockenem Äther gewaschen und bei vermindertem Druck in einem Exsikkator über Natriumhydroxid gut getrocknet.

Das Produkt wird in 5 ml Dimethylformamid gelöst, danach werden 230 mg Z-(D)-AIa-OH und 210 mg HONB zugegeben. Nach Eiskühlung werden 0,16 ml

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Gemisch wird unter Eiskühlung 1 Stunde lang und bei Raumtemperatur 4 Stunden lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wird abfiltriert und das Filtrat in 100 ml Chloroform eingebracht Die Lösung wird mit einer 4%igen wässerigen Natriumbicarbonat- Lösung und dann mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und bei vermindertem Druck zur Trockne eingeengt Der Rückstand wird in einem Lösungsmittelgemisch von Chloroform, Methanol und Essigsäure (9:1:04) gelöst und die Lösung wird über eine Kolonne (3 cm Durchmesser χ 40 cm) Silikagel, welche mit dem oben angeführten Lösungsmittel versetzt wurde, geleitet und mit dem gleichen Lösungsmittel entwickelt Die einen Rf-Wert von 0,47 aufweisenden Fraktionen werden gesammelt bei vermindertem Druck zur Trockene eingeengt und mit Äther gewaschen. Nach diesem Verfahren erhält man 640 mg Pulver.

(b) Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-(D)-Ala-Leu-Arg-Pro-NH2-CH₂-OH

In 10 ml Essigsäure werden 154 mg Z-(D)-AIa-LeU-Arg(NO₂)-Pro-NH-CH2-CH₂-OH unter Einsatz von Palladiumschwarz als Katalysator S Stu.iden lang katalytisch reduziert. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat wird bei vermindertem Druck zur Trockene eingeengt. Nach Zugabe von 10 ml Waspsr

ίο und 0,45 ml 1 N Salzsäure wird das Konzentrat lyophilisiert. Das pulvcrförmigc Lyophilisat und 140 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH werden in 10 ml Dimethylformamid gelöst, danach erfolgt die Zugabe von 60 mg HONB und 0,25 ml einer 10%igen Lösung von

r> N-Äthylmorphoün in Dimethylformamid. Das Gemisch wird auf -2° C gekühlt und 60 mg DCC werden zugegeben. Dann wird das Gemisch unter Eiskühlung 6 Stunden lang und bei Raumtemperatur 12 Stunden lang gerührt. Nach beendeter Reaktion wird das Dimethylformamid unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand in 10 ml Wasser gelöst Die unlöslichen Substanzen werden abfiltriert und das Filtrat wird über eine Kolonne (1 cm Durchmesser χ 4 cm) Amberlite IRA-410 in Acetatform geleitet, so daß das Produkt /um Acetat umgewandelt wird. Danach wird das Salz in einer Kolonne Car Carboxymethylcellulose und in einer Kolonne von Amberlite XAD-2, wie in Beispiel 1 beschrieben, gereinigt. Nach dem Lyophilisieren erhält man ein weißes, flaumiges Pulver. Die Ausbeute beträgt

so 146 mg.

[«]!■· = -48,1° Cc=0,5,5% Essigsäure)
RP = 0,31; Rf =0,025

Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit 5,7 N Salzsäure in Gegenwart von Thioglycolsäure): His 1,00; Arg 0,98; Trp 0,98; Ser 0,92; GIu 1,00; Pro 1,00; AIa 039; Leu 1.00; Tyr 0,98 (87% Ausbeute).

Beispiel 4

Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-(D)-Aia-Lcu-Ai g-rr υ-Νί ί-Cl i\C! \jp

! \jp

(a) Herstellung von Z-(DVAIa-LeU-Arg(NO₂)-Pro-NH-CH(CH₃)2

720mg Z-Leu-Arg(NO₂)-Pro-NH-CH(CH₃)2 werden wie in Beispiel 2(a) beschrieben behandelt und dann mit Hilfe von DCC und HONB mit Z-(D)-AIa-OH in einem Gemisch aus 5 ml Dimethylformamid und 10 ml Dichlormethan kondensiert Das Produkt wird mit Äthylacetat extrahiert man erhält 690 mg eines Pulvers.

[*]? =-483° (c= 1,0, Methanol)

Elementaranalyse für C31 H^OgNg

Berechnet: C 55,18, H 7,17, N 18,68
gefunden: C 54,78 H 7,09, N 18,22.

RP = 0,61

(b) Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-(D)-Ala-Leu-Arg-Pro-NH-CH(CH₃)2

Genau nach dem in Beispiel 2(b) beschriebenen Verfahren wird die oben angeführte Verbindung aus Z-TDVAIa-LeU-ArHiNO₂)PrO-NH-CH(CHj)₂ und

(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH in einer Ausbeute von 128 mg hergestellt

[_Ä]» = -474° fc=0,5,5%ige Essigsäure)

RP=0,375, RP =0,08

Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit 5,7 N Salzsäure in Gegenwart von Thioglycolsäure): His 0,99; Arg 038; Trp 0,89; Ser 034; GIu 1,00; Pro 1,00; AIa 1,00; Leu 1,02; Tyr 038 (863% Ausbeute). ι ο

15

Beispiel 5

Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-(D)-AIa-Leu-Arg-ProNH-CH2-CH₃

(a) Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-OH

In 100 ml Methanol werden 4,0 g Z-Ser-Phe-OMe gelöst Die Lösung wird 1,5 Stunden lang mit 500 g Palladiumschwarz bei Atmosphärendruck katalytisch reduziert Der Katalysator wird abfiltriert und das Methanol aus dem Filtrat bei vermindertem Druck abgedampft, der Rückstand wird in 25 ml Dimethylformamid gelöst Der Lösung werden 4,1 g (Pyr)-Glu-His Trp-OH, dann 3,8 g HONB und 3 g DCC bei -5°C zugegeben. Das Gemisch wird bei —5° C 2 Stunden danach bei 0°C 2 Stunden und schließlich bei Raumtemperatur 8 Stunden lang gerührt

Der entstandene Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Filtrat bei vermindertem Druck zur Trockene eingeengt Der Rückstand wird mit Äthylacetat trituriert und das entstandene Pulver abfiltriert Die Ausbeute beträgt 6,7 g. Das Pulver wird in 30 ml eines Gemisches aus Methanol und Chloroform (15:85) gelöst und die Lösung wird über eine Kolonne (6 cm Durchmesser χ 12 cm) gefüllt mit Methanol und Chloroform (15 :85) versetztem Silikagel geleitet Die Kolonne wird mit 600 ml eines Gemisches aus Methanol und Chloroform (15:85), 11 eines Gemisches aus Methanol und Chloroform (25:75) und 11 eines Gemisches aus Methanol und Chloroform (30:70) eluiert Jene Fraktionen, welche mit von 400 ml des Gemisches aus Methanol und Chloroform (25 :75) bis 700 ml des Gemisches aus Äthanol und Chloroform (30:70) eluiert wurden, werden vereinigt und bei vermindertem Druck zur Trockene eingeengt Der so Rückstand wird mit Äthylacetat aufgeschlämmt (trituriert) und das entstandene Pulver abfiltriert, man erhält (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-OMe mit einer Ausbeute von 4,2 g RP -03

In 20 ml Methanol werden 34 g der oben hergestellten Verbindung suspendiert, die Suspension wird auf O⁰C gekühlt, dann werden 8 ml N Natriumhydroxidlösung zugegeben. Das Gemisch wird eine Stunde lang gerührt und mit 8 ml N Salzsäure neutralisiert Das Methanol wird unter vermindertem Druck abdestilliert und dem Rückstand kaltes Wasser zugegeben. Die entstandenen Niederschläge werden abfiltriert, mit kaltem Wasser gewaschen und getrocknet, um die gewünschte Verbindung zu erhalten.

65

Rf² = 0,61.

[λ] 5» - - 33° (C" 0,55, Eisenessig)

(b) Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-(D)-Ala-Leu-Arg(NO₂)-Pro-NH-CH2CH3

In 15 ml einer 25%igen Lösung von Bromwasserstoff in Eisessig werden 1,6 g Z-(D)-AIa-LeU-Arg(NO₂)-Pro-NH-CH₂CH₃ gelöst und die Lösung wird bei Raumtemperatur 50 min lang gerührt Dann werden der Lösung 150 ml trockener Äther zugegeben und die entstandenen Niederschläge werden abfiltriert, getrocknet und in 30 ml Wasser gelöst Die Lösung wird über eine Kolonne (23 cm Durchmesser χ 15 cm) Amberlite CG-410 (freie Base) geleitet die Kolonne wird gut mit einer Mischung aus Methanol und Wasser (30:70) gewaschen. Die auslaufende Lauge und das Waschwasser werden vereinigt und das Ganze wird eingeengt um das Methanol zu entfernen. Der Rückstand wird lyophilisiert, man erhält H-(D)-AIa-LeU-ATg(NO₂J₂-PrO-NHCH₂CH₃ mit einer Ausbeute von 1,2 g RP=0,21. RP=0,64.

In 5 ml Dimethylformamid werden 225 mg der oben erhaltenen Verbindung und 280 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-OH gelöst dann werden 150 mg HONB zugegeben. Das Gemisch wird auf - 10⁰C gekühlt und 90 mg DCC werden zugegeben. Die Mischung wird bei -10⁰C 2 Stunden , bei 0⁰C 4 Stunden und bei Raumtemperatur 12 Stunden lang gerührt Die entstandene Mischung wird abfiltriert, um den Dicyclohexylharnstoff zu entfernen, dann wird dem Filtrat Äthylacetat zugegeben. De> entstandene Niederschlag wird abfiltriert, getrocknet und in einem Gemisch aus Äthanol und Wasser (20 :80) unter Erhitzen gelöst Die Lösung wird stehen gelassen, um feine Kristalle zu erhalten, diese werden abfiltriert. Die Ausbeute beträgt 389 mg.

[λ] r = -43,6" Cc=O₁11, Methanol) RP= OARP=0,74.

(c) Herstellung von (PyrJC-lu-His-Trp-Ser-Phe-(D)-Ala-Leu-Arg-Pro-NH-CH2CH₃

(I) In 10 ml einer 60%igen wässerigen Ameisensäurelösung werden 150 mg der Verbindung (H-(D)-Ala-Leu-ATg(NOz)-PrO-NH-CH₂CH₃) gelöst welche wie in b) oben beschrieben hergestellt wurde, dann erfolgt die Zugabe von 300 mg SnCl₂ · H₂O. Das Gemisch wird 2,5 Stunden lang auf 80 bis 85⁰C erwärmt und bei vermindertem Druck zur Trockene eingeengt Der Rückstand wird mit 30 ml heißem Wasser von 80°C extrahiert und filtriert Das Filtrat wird über eine Kolonne (3 cm Durchmesser χ 15 cm) Amberlite XAD-2 (etwa 200 mesh) geleitet

Die Kolonne wird mit Wasser gewaschen und der Gradientenelution mit 300 ml Wasser und 300 ml 100%igem Äthanol unterworfen. Die gewünschte Verbindung liegt in den 130 ml-220-ml-Fraktionen vor, welche gesammelt und unter vermindertem Druck eingeengt werden, um Äthanol zu entfernen. Der Rückstand wird Ober eine Kolonne (2 cm Durchmesser χ 30 cm) von Carboxymethylcellulose geleitet Die Kolonne wird der Gradientenelution mit Ammoniumacetat von 0,005 bis 0,2 M (pH-Wert 6,8) unterzogen. Die gewünschte Verbindung liegt in den 360 ml-500-ml-Fraktionen vor, welche vereinigt und lyophilisiert werden und letztlich ein weißes, flaumiges Pulver mit einer Ausbeute von 112 mg ergeben.

130 248/159

[«]? = -44,3° (c=0,53,in5% Essigsäure),

RP =0,088, RP=0,73,

Aminosäureanalyse: His 0,96; Arg 1,04; Τφ 0,92; Ser 0,96; GIu 039; Pro 1,08; Ala 1,00; Phe 1.00; Äthylamin 1,04 (85% Ausbeute).

(II) In einem Gemisch aus 1 ml Eisessig und 20 ml Methanol werden 100 mg der wie unter b) beschrieben hergestellten Verbindung gelöst, danach erfolgt die Zugabe von 100 mg Palladiumschwarz. Das Gemisch wird zwei Tage lang der katalytischer) Reduktion mit Palladiumschwarz unterworfen. Danach wird abfiltriert, um den Katalysator zu entfernen. Das Filtrat wird bei vermindertem Druck zur Trockne eingeengt Der Rückstand wird in 3 ml 0,005 M wässeriger Ammoniumacetatlösung gelöst Die Lösung wird über eine Kolonne (2 cm Durchmesser χ 30 cm) Carboxymethylcellulose geleitet und der Gradientenelution unter den wie oben unter (I) angeführten Bedingungen unterzogen. Die 350 ml-460-ml-Frakiionen werden vereinigt und lyophilisiert um die gewünschte Verbindung zu erhalten, deren Rf-Wert und spezifische Rotation mit jenen der wie oben unter (I) beschrieben hergestellten Verbindungen identisch sind.

(HI) In 5 ml wasserfreiem Fluorwasserstoff mit einem Gehalt von 0,2 ml Anisol und 0,1 ml Mercaptoäthanol wird die wie oben unter b) hergestellte Verbindung gelöst und das Gemisch wird bei O⁰C 40 min lang gerührt Das Gemisch wird bei vermindertem Druck zur Trockene eingeengt um HF zu entfernen. Der Rückstand wird in 10 ml Wasser gelöst und die unlöslichen Stoffe werden mit Celite* (eingetragene Marke eines von Johns—Manville, USA hergestellten Produktes) abfiltriert. Das Filtrat wird über eine Kolonne (1 cm Durchmesser χ 10 cm) Amberlite CG-410 in Acetatform geleitet und die Koolonne wird mit Wasser gewaschen. Die Abwässer und das Waschwasser werden über eine Kolonne (2 cm Durchmesser χ 30 cm) geleitet Die Kolonne wird der Gradientenelution unter den in (I) angeführten Bedingungen unterzogen. Die 340 ml-460-ml-Fraktionen werden vereinigt und lyophilisiert, um die gewünschte Verbindung zu erhalten. (Ausbeute 42 mg).

Die wie oben beschrieben hergestellte Verbindung ist aufgrund des Rf-Wertes der spezifischen Drehung und des EDso-Wertes der ovulationsinduzierenden Wirksamkeit mit der nach dem oben unter (i) angeführten Verfahren hergestellten Verbindung identisch.

Beispiel 6

Herstellung des (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-(D)-Ala-Nle-Arg-Pro-NHCH₂CH₃

(a) Herstellung des
Z-Nle-Arg(NO₂)-Pro-NH-CH₂CH₃

Die entstandene Harnstoffverbindung wird abfiltriert und das Filtrat einer Lösung des oben angeführten Niederschlages in I ml Dimethylformamid zugegeben, danach werden 0,28 ml Triäthylamin zugetropft Das Gemisch wird 12 Stunden lang gerührt und destilliert, um das Lösungsmittel zu entfernen. Der Rückstand wird mit 100 ml Chloroform extrahiert Der Extrakt wird mit einer 5%igen wässerigen Natriumbicarbonatlösung, Wasser, 0,5 N Salzsäure und Wasser gewaschen und

ίο über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet Das Chloroform wird abdestilliert Der Rückstand wird in Äther zerrieben bzw. aufgeschlämmt und mit Äther nochmals aus Äthanol ausgefüllt Die gewünschte Verbindung fällt mit einer Ausbeute von 410 mg an.

15 Fp.: 109-lll°C(Zersetzung),
[α]? =-50,4° (c= OAÄthanol).

Elementaranalyse für C27H42O7N8 · 1/2H₂O
*o Berechnet: C 54,07, H7", N 18,68,

gefunden: C 53,79, H 7,09, N 18,24.

(b) Herstellung von
Z-(D)-Ala-Nle-Arg(NO2)-Pro-NH-CH₂CH3

25 In 5 ml einer 25%igen Lösung von Bromwasserstoff in Eisessig werden 200 mg Z-Nle-Arg(NO₂)-Pro-NH-CH₂CH₃ gelöst die Lösung wird 40 min lang bei Raumtemperatur gerührt, dann werden 50 ml trockener Äther zugegeben. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert mit Wasser gewaschen und getrocknet Der Niederschlag wird über eine Kolonne (1 cm Durchmesser χ 5 cm) Amberlite IRA-410 (freie Form) mit 40%igem wässerigem Methanol als Entwickler geleitet um den Bromwasserstoff zu entfernen. Das Methanol wird aus den ausfließenden Laugen abdestilliert und der Rückstand wird lyophilisiert. Es werden 120 mg eines Pulvers erhalten. In einem Gemisch von 20 ml Dichlormethan und 5 ml Dimethylformamid werden das wie oben beschrieben hergestellte Pulver und 44,7 mg Z-(D)-AIa-OH gelöst Während des Abkühlens der Lösung auf O⁰C werden 40 mg HONB und 46 mg DCC zugegeben. Das Gemisch wird 12 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt Der entstandene Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Filtrat bei vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird in 120 ml Äthylacetat gelöst und die Lösung mit einer 4°/bigen wässerigen Lösung von Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und bei vermindertem Druck zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wird in einer kleinen Menge Äthanol gelöst und mit Äther ausgefällt die Ausfällung wird wiederholt um die gewünschte Verbindung in Pulverform mit einer Ausbeute von 132 mg zu erhalten.

In 4 ml einer 25%igen Lösung von Bromwasserstoff in Eisessig werden 477,5 mg Z-Arg(NO₂)-Pro-NH-CH₂CH₃ gelöst und die Lösung wird bei Raumtemperatur 30 min lang gerührt, danach erfolgt die Zugabe von eo trockenem Äther. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und bei vermindertem Druck über Natriumhydroxid getrocknet.

Andererseits werden 2653 mg Z-NIe-OH in einem Gemisch von je 2 ml Äthylacetat und Dioxan gelöst, während des Abkühlens der Mischung auf O⁰C werden 187 mg HONB und 226 mg DCC der Lösung zugegeben und das Gemisch wird 3 Stunden lang gerührt.

[λ]? = -48,5° (c=0,5,Methanol).

Elementaranalyse für CMH47O8N9

Berechnet: C 54,45, H 7,16, N 19,05,
gefunden: C 54,48, H 7,23, N 18,72.

Rf' = 0,79, RP = 0,92, Rf⁴ = 0,66

(c) Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-(D)-Ala-Nle-Arg-Pro-NHCH₂CH₃

In 5 ml einer 25%igen Lösung von Bromwasserstoff in Eisessig werden 100 mg Z-(D)-AIa-NIe-Ar^NO₂)-

PrO-NH-CH₂CH₃ gelöst und die Lösung wird bei Raumtemperatur 50 min lang geröhrt und dann mit 40 ml Äther versetzt Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und bei vermindertem Druck über Natriumhydroxid getrocknet Das Produkt wird über eine Kolonne Amberlite CG-45 in freier Form mit 40%igem wässerigem Methanol geleitet, um den Bromwasserstoff zu entfernen. Das Methanol wird aus den auslaufenden Laugen bei vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand lyophilisiert Das Lyophilisat und 100 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH werden in 4 ml Dimethylformamid gelöst Nach Zugabe von 45 mg HONB wird das Gemisch auf —5 bis —7°C abgekühlt und mit 40mg DCC versetzt Das Gemisch wird 5 Stunden lang unter Eiskühlung und dann 10 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt Das Dimethylformamid wird abgedampft und 30 ml Äthylacetat werden dem Rückstand zugegeben. Das Gemiscb wird abfiltriert und der Filterkuchen getrocknet Das Produkt wird in 2 ml wasserfreiem Fluorwasserstoff mit einem Gehalt von 0,05 ml Anisol und 0,05 ml Mercaptoäthanol getrocknet und die Lösung wird 40 min lang bei 0⁰C gerührt Der Fluorwasserstoff wird bei vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand wird in 10 ml Wasser gelöst Danach werden die unlöslichen Substanzen abfiltriert und das Filtrat wird über eine Kolonne (1 cm Durchmesser χ 5 cm) Amberlite IRA-410 in Acetatform geleitet wodurch das Produkt in das Acetat umgewandelt wird. Der Effluent wird über eine Kolonne (1,5 cm Durchmesser χ 30 cm) Carboxymethylcellulose geleitet und die .Kolonne wird der Gradientenelution mit 400 ml 0,005 M Ammoniuciacetat und 400 ml 0,2 M Ammoniumacetat unterzogen. Die 290 ml—320 ml-Fraktionen, welche die maximale Absorption im UV-Absorptionsspektrum zeigen, werden vereinigt und lyophilisiert wobei ein weißes, flaumiges Pulver erhalten wird. Die Ausbeute beträgt 105 mg.

Rf =0,063, RP-0,360,

[«]? = -46,0° (C=03,5% wässerige Essigsäure)

Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit 5,7 N Salzsäure in Gegenwart von Thioglycolsäure): GIu 1,10; His l,02;Trp 0,91; Ser 038; Tyr 1,00; AIa 1,00; Nie 1,02; Arg 0,98; Pro 0,97; Ä thylamin 1,04 (84% Ausbeute).

Beispiel 7

Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-(D)-Ala-Ile-Arg-Pro-NHCH₂CH3

than (3 min χ 3 Mal), Nw (Pyr)-Glu-OH wird so wie es ist, ohne BOC-Gruppe eingesetzt und die Kondensationsreaktion wird in Dimethylformamid mit DCC durchgeführt

Schließlich wird das Harz mit Äthanol Chloroform, Dimethylformamid und Äther gewaschen und getrocknet Ausbeute: 4,12 g. Die folgenden BOC-Aminosäuren werden eingesetzt: BOC-ArgCTos), BOC-Ue, BOC-(D)-AIa, BOC-Phe, BOC-Ser(Bzl), BOC-Trp, BOC-His(Tos).

ίο 3 g des wie oben hergestellten Harzes werden in 20 ml Dimethylformamid suspendiert und die Lösung wird bei 20⁰C mit Äthylamin gesättigt Das Gemisch wird 40 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt das Harz abfiltriert und das Filtrat bei vermindertem Druck zur Trockene eingeengt Der Rückstand wird mit Äther trituriert man erhält 720 mg rohes (Pyr)Glu-His(Tos)-

Tip-Sei^BzQ-Phe-iDJ-Ala-lle-ArgCrosJ-Pro-NH-CH₂CH₃ in Pulverform. Dieses Pulver wird in einem Gemisch aus Äthylacetat Pyridin, Essigsäure und Wasser (60 :20 :6 :10) gelöst und die Lösung über eine Kolonne (3 cm Durchmesser χ 20 cm) Silikagel, welches mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch versetzt war, geleitet Die Kolonne wird mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch eluiert Die Fraktionen, welche bei Dünnschichtchromatographie an Silikagel mit Methanol-Chloroform (15 :85) einen Rf-Wert von 0,4 zeigen, werden vereinigt und bei vermindertem Druck zur Trockene eingeengt Der Rückstand wird mit Äthylacetat trituriert und das entstandene Pulver abfiltriert Ausbeute: 240 mg. Das Pulver wird in 5 ml HF mit einem Gehalt von 0,05 ml Thioglycolsäure und 0,2 ml Anisol gelöst und die Lösung 1 Stunde lang bei 0⁰C gerührt Das HF wird abgedampft und der Rückstand in 10 ml Wasser gelöst Die Lösung wird über eine Kolonne (1 cm Durchmesser χ 10 cm) Amberlite IRA 410 in Acetatform geleitet Die ablaufenden Laugen werden durch je zweimaliges Leiten über eine Kolonne (2 cm Durchmesser χ to cm) mit Amberlite XAD-2 und eine Kolonne (i,9cm Durchmesser χ 25 cm) Carboxymethylcellulose und einmaliges Leiten über eine Kolonne (1 cm Durchmesser χ 60 cm) Cephadex LH-20 gereinigt und lyophilisiert Es wird ein weißes, flaumiges Pulver erhalten.

Ausbeute 42 mg. Rf =0,071, RP=037.

Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit Salzsäure in Gegenwart von Thioglycolsäure): GIu 1,01; His 033; Trp 0,92; Ser 0,99; Phe 1,00; AIa 1,03; lie 0,98; Arg 1,00; Pro 1,08; Äthylamin 1,04(88% Ausbeute).

3 g BOC-Pro-Harz (Proiingehalt 0314 Millimol/g) werden in einen Reaktionsautomaten zur Peptidherstellung (APS-800; Shimidzu Seisakusho, Ltd. Japan) eingebracht und mit Dichlormethan 12 Stunden lang aufgequollen, danach werden Aminosäuren in der nachstehenden Reihenfolge eingebracht: Dichlormethan (3min χ 3Mal)-*50% Trifluoressigsäure/Dichlormethan (10 min und 30 min, 2 Mal) -* Däehlörme- than (3 min χ 3MaI)-* Äthanol (3 min χ 3 Mal)-» Dichlormethan (3 min χ 3MaI)- 10% Triäthylamin/-Chloroform(10min)-* Chloroform(3min χ 3Mal)-» Dichlormethan (3 min χ 2 Mal)-» BOC-Amino sowie -» Anhydrid (nach herkömmlichen Verfahren aus « BOC-Aminosäure und DCC hergestellt) (30 min u. 60 min, 2 Mal) -» Acetylierung (Dichlormethan, Triäthylamin und Säureanhydrid) (1 Stunde) Dichlorme-

Beispiel 8

Herstellung von (Pyr)Glu-Tyr-Trp-Ser-Tyr-(D)-AIa-Leu-Arg-Pro-NHCH₂CH₃

(a) Herstellung von BOC-Tyr-(OBzl)-(D)-Aia-OBzl

In 100 ml Acetonitril werden 11,1g BOC-Tyr-(OBzI)-OH und 10,9 g (D)-Ala-OBzl-p-toluol-sulfonat gelöst. Die Lösung wird auf 0°C gekühlt und mit 6,8 g DCC, 4,5 g HONB und 4,34 ml Triäthylamin versetzt. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 10 Stunden lang gerührt, dann wird die ausgefällte Harnstofverbindung abfiltrier;. Das Filtrat wird destilliert und der Rückstand wird mit 200 ml Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wird mit einer 5%igen wässerigen Natriumhydrogencarbonatlösung, weiter mit 0,1 N Salzsäure und

Wasser gewaschen und dann Ober Na₂SO₄ getrocknet Das Äthyiacetat wird abdestilliert, der Rückstand wird aus Petroläther kristallisiert und danach aus Ätbylacetat/Petroläther urokristallisiert

Ausbeute: 13,5 g

Fp.: 113-114° C,

[«] 5 = +18,4° (c= 1, Methanol),

Rf⁴=0,76.

Elementaranalyse für C31H36O6N2

Berechnet: C 69,90, H 6,81, N 5,26, gefunden: C 69,72, H 6,75, N 5,42.

(b) Herstellung von BOC-Ser-Tyr-(OBzl)-(D)-AIa-OBzI

Ir 100 ml Trifluoressigsäure werden 11g BOC-Tyr(OBzl)-(D)-Ala-OBzl gelöst Die Lösung wird 30 min lang bei Raumtemperatur stehen gelassen, danach wird das Lösungsmittel bei vermindertem Druck abdestilliert

Der Rückstand wird über Natriumhydroxid bei vermindertem Druck in einem Exsikkator getrocknet

Gleichzeitig werden 4,1 g BOC-Ser und 4,0 g 2,4-Dinitrophenol in 50 ml Tetrahydrofuran gelöst diese Lösung wird auf 0⁰C gekühlt und nach Zugabe von 4,5 g DCC bei 0⁰C 2 Stunden lang gerührt

Der ausgefällte Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und die vorher hergestellte Aminokomponente (H-Tyr(OBzl)-(D)-Ala-OBzl) wird im Filtrat gelöst Die Lösung wird auf 0⁰C abgekühlt und 4,2 ml Triäthylamin werden zugetropft Danach wird die Lösung bei Raumtemperatur 5 Stunden lang gerührt dann wird das Tetrahydrofuran bei vermindertem Druck abdestilliert Der Rückstand wird in 200 ml Äthylacetat gelöst die Lösung mit einer 5%igen Natriumhydrogencarbonatlösung, O₁ ¹ N Salzsäure und Wasser gewaschen und über Na2SO4 getrocknet Das Äthylacetat wird abdestilliert der Rückstand Wird aus Petroläther kristallisiert und aus Äthylacetat/Petroläther umkristallisiert.

Ausbeutest g, Rf*=037,

[«] S =* -4,1° (c = 1, Methanol), Fp.:124-125°C.

Elementaranalyse für C34H41O8N3

Berechnet: C 65,89, H 6,67, N 6,78, gefunden: C 65,82, H 639, N 6,50.

(c) Herstellung des BOC-Ser'Tyr-(D)-Ala-Leu-Arg-(NO₂)-Pro-NHCH₂CH3

In 100 ml Methanol werden 2,16 g BOC-Ser-Tyr(OBzl)-(D)- AIa-OBzI gelöst dann wird innerhalb von 4 Stunden die katalytische Reduktion mit Palladiumschwarz durchgeführt und nach Ablauf dieses Zeitraumes der Katalysator abfiltriert Das Methanol wird abdestilliert und der Rückstand in 10 ml Dimethylformamid gelöst In dieser Lösung werden 1,6 g H-Leu-ArgiNO₂)-Pro-NHCH₂CH₃ und 690 mg HONB gelöst, die Lösung wird auf 0⁰C gekühlt und ohne Rühren mit 795 mg DCC versetzt Diese Mischung wird bei O⁰C 2 Stunden und bei Raumtemperatur 5 Stunden lang gerührt Die ausgefällte Harnstoffverbindung wird abfilmen und das Dimethylformamid bei vermindertem Druck abdestilliert Der Rückstand wird mit 50 ml n-Butanol extrahiert und mit einer 5%igen wässerigen Natriumhydrogencarbonatlösung, 0,1 N Salzsäure und Wasser gewaschen. Das n-Butanol wird abdestilliert und

der Rückstand mit Äther versetzt (verfestigt) und aus Äthanol/Äther ausgefällt Die Ausbeute beträgt 2^5 g.

RP=030,

Fp.: 149-151°C(Zersetzung), [_a] » 26,6° (c= 1, Methanol).

Elementaranalyse für C39H63O12N11 · 3/2H₂O Berechnet: C 51,75, H 735, N 17,02, gefunden: C 51,89, H 730, N 16,72

(d) Herstellung von Z.-(Tyr)- :rp-OBzi

In einem Lösungsmittelgemisch aus Dioxan-Äthylacetat (5OmI-IOmI) werden 9,0 g Z-TyT-(Z)-OH und 10,Tg Trp-OBzl-p-toluolsulfonat gelöst die Lösung wird auf 0⁰C gekühlt und mit 3,93 g HONB, 4,53 g DCC und 3,0 ml Triäthylamin versetzt Das Gemisch wird 5 Stunden lang gerührt und nach Ablauf dieses Zeitraumes die ausgefällte Harnstoff verbindung abfiltriert Das Lösungsmittel wird bei vermindertem Druck abdestiliiert und der Rückstand mit 200 ml Äthylacetat extrahiert Der Extrakt wird mit einer 5%igen wässerigen Natriumhydrogencarbonatlösung, 1 N SaIzsäure und Wasser gewaschen und über Na₂SO₄ getrocknet Das Äthylacetat wird abdestilliert und der Rückstand aus Petroläther kristallisiert und aus Äthylacetat/Petroläther urnkristallisiert Man erhält 13 g Ausbeute,

Rf=0,88,

Fp.: 103-104⁰C,

[«] _? = _4,7« (c= 1, Methanol).

Elementaranalyse für C₄₃H₃BO₈N₃

Berechnet: C 71,16, H 542, N 5,79, gefunden: C 71,11₁ H 5,29, N 5,76.

(e) Herstellung von Z-(Pyr)Glu-Tyr-Trp

In 100 ml Methanol werden 53 g Z-Tyr(Z)Trp-OBzl gelöst und innerhalb von 5 Stunden wird in Gegenwart "υπ Palladiumschwarz die katalytische Reduktion vorgenommen. Dann wird der Katalysator abfiltriert und das Methanol bei vermindertem D.-uck abdestilliert Der Rückstand wird in 20 ml Dimethylformamid gelöst und mit 339 g Z-(Pyr)-Glu-ONB und 1,12 ml Triäthylamin versetot Das Gemisch wird bei Raumtemperatur

eo 12 Stunden la.ig gerührt nach Ablauf dieses Zeitraumes wird das Dimethylformamid destilliert Danach wird der Rückstand mit 100 ml Äthylacetat und 100 ml Wasser versetzt. Die Wasserschicht wird mit 1 N Salzsäure angesäuert und mit 100 ml n-Butanol extrahiert, der Extrakt wird mit Wasser gewaschen und das n-Butanol wird letztlich audestilüert Der Rückstand wird mit Äther trituriert, und es wird ein Pulver erhalten, welches erneut aus Äthanol-Äther umgefällt wird.

Ausbeute: 4,5 g

Rf =0,63,

Fp.: 165-169° C (Zersetzung),

[λ]ϊ =-4,8' (c= 0,5, Methanol).

Elementaranalyse für C₃₃H₃₂O₈N₄ · H₂O

Berechnet: C 62,85, H 5,43, N 8,89,
gefunden: C 62,96, H 5,35, N 8,76.

(f) Herstellung von (Pyr)Glu-Tyr-Trp-Ser-Tyr-(D)-Ala-Leu-Arg-Pro-NHCH₂CHj

In 20 ml Methanol werden 184 mg Z-(Pyr)-Glu-Tyr-Trp gelöst und in Gegenwart von Palladiumschwarz wird innerhalb von 3 Stunden die Hydrierung vorgenuriinieii. N'ac'ri Äbniinereri ties Kaialysaiurs wird das Methanol bei vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand in 2 ml Dimethylformamid gelöst. Gleichzeitig werden 316 mg BOC-Ser-Tyr-(D)-Ala-Leu-Arg(NOj)-PrO-NHCH₂CH₃ mit 10 ml Trifluoressigsäure in Gegenwart von 0,36 ml 1 N Salzsäure 40 min lang behandelt. Die Trifluoressigsäure wird abdestilliert und der Rückstand mit Äther trituriert und in einem Exsikkator gründlich über Natriumhydroxid getrocknet. Dieses Pulver und 81 mg HONB werden in der vorher zubereiteten Dimethylformamidlösung gelöst und dann auf -2°C gekühlt. Diese Lösung wird mit 93 mg DCC und 0,05 ml N-Äthylmorpholin versetzt und das entstandene Gemisch bei 0°C 2 Stunden und danach bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die ausgefällte Harnstoffverbindung wird abfiltriert und das Filtrat wird mit 50 ml Äther versetzt. Der Niderschlag wird sodann abfiltriert. Ausbeute: 350 mg. Dieses Produkt wird unter Verwendung des Entwicklerlösungsgemisches gemäß Rf¹ über 7 g Silikagel geleitet. Die Fraktionen mit einem großen Gehalt an der gewünschten Verbindung werden vereinigt, danach wird das Lösungsmittel abdestilliert. Der Rückstand wird mit Äthylarptai tritnriprt Ausheule? 270 mg. 150 m; diese·: Produktes werden mit 4 ml wasserfreiem Hydrogenfluorid in Gegenwart von 0,1 ml Anisol und 0,1 ml 2-Mercaptoäthanol bei 0^cC eine Stunde lang behandelt, nach Ablauf dieses Zeitraumes wird das Hydrogenfluorid bei vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wird in einem Exsikkator über Natriumhydroxid getrocknet, mit 50 ml Wasser extrahiert und der Extrakt über eine Kolonne (1 cm Durchmesser χ 5 cm) Amberlite IRA^l"- in Acetatform geleitet. Die ablaufenden Laugen und das Waschwasser werden vereinigt und über eine Kolonne (1,5 cm Durchmesser χ 19 cm) Carboxymethylcellulose geleitet Die Elution wird nach dem linearen Gradientenverfahren unter Einsatz von 0,005 N Ammoniumacetat (280 m!) bis 0,15 N Ammoniumacetat (280 ml) durchgeführt die UO ml— 210-ml-Fraktionen werden vereinigt und lyophilisiert. man erhält 95 mg des gewünschten Produktes.

Beispiel 9

Herstellung von (Pyr)Glu-p-NH₂-Phe-Trp-Ser-Tyr-(D)-Ala-Leu-Arg-Pro-NH-CH₂-CH₃,

(a) Herstellung von BOC-p-NO₂-Phe-OH

In einer Mischung von 40 ml 1 N wässeriger Lösung von Natriumhydroxid und 150 ml Dimethylformamid werden 6,3 g p-NO₂-Phe-OH und 13,3 g tert.-Butylpentachlorphenylcarbonat gelöst. Nach Zugabe von 5 m¹ Triäthylamin wird die Lösung bei Raumtemperatur 4f Stunden lang reagieren gelassen. Das Lösungsmitte wird abdestilliert und der Rückstand wird in Wassei gelöst, gefolgt von einer Extraktion mit Äther. Dei pH-Wert der Wasserschicht wird mit Zitronensäure aul 3 eingestellt und die Schicht wird mit Äthylaceta' extrahiert. Danach wird die organische Schicht übei

wassci if eiern

IviagilCMümaülläi gcirGCiCnCi UHu uä;

Rf =035.

[φ = -39,0° (C= 03,5% Essigsäure),

Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit 5,7 N HCI
Gegenwart von 4%iger Thioglycolsäure bei il0*C): Arg 1,07; Trp 1,03; Ser 0,89: GIu 1,00; Pro 1.00; AIa 1.00; Leu l,00;Tyr 2,00; Äthylamin 1,05.(81% Ausbeute).

Lösungsmittel abdestilliert. Der Rückstand wird mit Petroläther trituriert und abfiltriert. Das Produkt wire dann mittels Säulenchromatographie an Silikage gereinigt und die das gewünschte Produkt enthaltender Fraktionen werden vereinigt und destilliert, um da! Lösungsmittel zu entfernen. Der Rückstand wird au! Äther/Petroläther kristallisiert.

Ausbeut! 3.8 g

Fp.:103-IO4°C.

[λ] ν' = -32,0^c ^c=0.75, Dimethylformamid).

Ri* = 0.61.

Elementaranalyse für ChHiSOsN₂

Berechnet: C 54,19, H 5.85. N 9,03.
gefunden: C 54,21, H 5,86. N 9.21.

(b) Herstellung von BOC-p-NH₂-Phe-OH

In 80 ml Methanol werden 2,0 g BOC-p-NO₂-Phe-OH gelöst, danach wird in Gegenwart von Palladiumschwarz als Katalysator bei Raumtemperatur innerhalb von 8 Stunden die katalytische Reduktion durchgeführt Nach Ablauf dieses Zeitraumes wird der Katalysatoi abfiltriert und das Lösungsmittel abdestilliert. Dei Rückstand wird mit Petroläther trituriert und abfiltriert das entstandene Produkt wird aus Äthylacetat/Petrol äther umkristallisiert.

Ausbeute: 1,5 g;
Fp.: 121⁰C:

[λ]ϊ· 2,2° (c= 1.0, Dimethylformamid);

Rf⁴ = 0,40.

N 959,
N 9,71

Elementaranalyse für C₁₄

Berechnet: C 5958, H 7,19,
gefunden: C 59,47, H 7,20,

(c"; Herstellung von BOC-p-NH-Z-Phe

In 20 ml einer 1 N wässerigen Lösung von Natrium hydrogencarbonat werden 13 g BOC-p-NHrPhe-OH gelöst dann werden unter heftigem Rühren unc in 65 Eiskühlung 1.1 g Benzyioxycarbonylchlorid zugegeben -): Während der dreistündigen Reaktion werden 30 mi Wasser zugegeben. Danach wird das Reakrionsgemiscr mit 1 N Salzsäure versetzt um den pH-Wert auf S

einzustellen und der entstandene ölige Niederschlag wird mit Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschicht wird gesammplt, mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Schließlich wird das Lösungsmittel abdestilliert und der Rückstand mit Petroläther trituriert, um ein Rohprodukt zu erhalten. Dieses Produkt wird aus Äther/Petroläther uf_v!iristallisiert.

Ausbeute: 1,84 g;
Fp.: 156- 157°C;

[«]■;■ 3.34° ^-=0,7, Dimethylformamid);

Rf₄ = 0,67.

Elementaranalyse für C22

Berechnet: C 63,75, H 6.32. N 6.76.
gefunden: C 63.76, 116.25. N 6,36.

(d) Herstellung von BOC-Trp-Ser-Tyr-(D)-AIa-Leu-

Arg(NO₂)-Pro-NH-CH2-CH,

In 5 ml Dimethylformamid werden 466 mg H-Ser-Tyr-(D)-Ala-Leu-Arg(NO₂)-Pro-NH-CH₂-CH₎ gelöst. Nach Zugabe von 370 mg BOC-Trp-ONB wird die Lösung bei Raumtemperatur 3 Stunden lang Hingesetzt. Dann wird das Lösungsmittel abdestilliert und der Rückstand mit Äthylacetat versetzt. Das entstandene Pulver wird abfiltriert, in Äthylacetat gekocht, abgekühlt, und stehen gelassen, der Niederschlag abfiltriert.

Ausbeute: 590 mg:

Fp.: 189-IW C (Zersetzung)

[ix] = -43,8* (c = 0,b. Dimethylformamid).

Rf¹ = 0,32.

Elementaranalyse fürCy)Fl;)Oi)Ni3 · 2 H₂O
Berechnet: C 54.58. H 7.06, N 16.55,
gefunden: C 54.84. H 6.90. N 16.54.

(e) Herstellung von BOC-p-NH-Z-Phe-Trp-Ser-Tyr-

(U)-Ala-Leu-Arg-(NU:)-

Elementaranalyse für C₆₇H₈^O₁₅Ni₅ · 2 H₂O
Berechnet: C 58,29, H 6,65, N 15,22,
gefunden: C 58,18, H 6,69, N 14,81.

(f) Herstellung von (PyrJGlu-p-NHrPheTrp-Ser-Tyr-(D)-Ala-Leu-Arg(NO₂)-Pro-NH-CH₂-CH₃

In Gegenwart von Mercaptoäthanol werden 470 mg BOC-p-NH₂-Z-Phe-Trp-Ser-Tyr-(D)-Ala-Leu-

Arg(NO₂)-Pro-NH-CH₂CH₃ bei Raumtemperatur 30 min lang behandelt, dann wird Äther zugegeben. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und in einem Exsikkator über Natriumhydroxid getrocknet. Danach wird das Produkt in 6 ml Dimethylformamid gelöst und

ι "i die Lösung mit 0.045 ml N-Äthylmorpholin neutralisiert. Nach Zugabe von 185 mg IBOC-(Pyr)-Glu-OSu wird die Lösung 48 Stunden lang bei Raumtemperatur umgesetzt, das Lösungsmittel wird abdestilliert und der Rückstand mit Äthylarelat Iriliiriert. Das entstanden?

jo Pulver wird abfiltriert und man erhält nach diesem Verfahren 425 mg

In Gegenwart von Mercaptoäthanol werden 560 mg BOC-Trp-Ser-Tyr-(D)-Ala-Leu-Arg(NO₂)-Pro-NH-CH2-CH) mit 5 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 30 min lange behandelt, nach Ablauf dieses Zeitraumes wird Äther zugegeben. Der entstandene Rückstand wird abfiltriert und in einem Exsikkator über Natriumhydroxid getrocknet. Das Produkt wird in 5 ml Dimethylformamid gelöst und die Lösung mit 0,1 ml N-Äthylmorpholin neutralisiert.

Dieser Lösung werden eine Dimethylformamidlösung von BOC-p-NH-Z-Phe-ONB, welche aus 217 mg BOC-p-NH-Z-Phe und 145 mg HONB nach dem DCC-Verfahren hergestellt wurde, zugegeben. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 12 Stunden lang umgesetzt, nach Ablauf dieses Zeitraumes das Lösungsmittel abdestilliert Dann wird der Rückstand mit Äthylacetat versetzt und der entstandene Feststoff abfiltriert

Ausbeute: 518 mg,

Fp.: 119-120° C (Zersetzung).

[α]ί? = -29,7° (c= 0,6, Dimethylformamid),

Rf¹=037.

lBOC-iPyrJGlu-p-NH-Phe-Trp-Ser-Tyr-iDJ-Ala-Leu-Arg(NO₂)-Pro-N H-CH₂-CH₁

Rf⁴ = 0,28. 375 g dieses Produktes werden mit 5 ml wasserfreiem HF in Gegenwart von Mercaptoäthanol und Anisol bei O⁰C I Stunde lang behandelt. Nach Abdestillieren des HF wird der Rückstand in Wasser

in gelöst und mit Äther extrahiert. Die Wasserlösung wird über eine Kolonne (0.9 cm Durchmesser χ 15 cm) Amberlite IR-410 in Acetatform geleitet, die ablaufenden Laugen und das Waschwasser werden vereinig! und lyophilisiert. Das Produkt wird in 0.005 M Ammonium-

1Ί acetatpuffer gelöst und über eine Kolonne (1,8 cm Durchmesser χ 19 cm) Carboxymethylcellulose geleitet. Die Elution erfolgt nach dem linearen Gradientenverfahren unter Einsatz von 0,005 M (300 ml) bis 0.2 M (300 ml) Ammoniumacetatpuffer, danach werden die

in 90 ml— 140-ml-Fraktionen zusammengegeben und lyophilisiert.

Ausbeute: 170 mg,

[_Λ] 41,8° (c=0,56,5% Essigsäure),

Rf¹ =0,16.

Elementaraiialyse WrC₅₈H₇₈Oi₂Ni₅ · 3CH₃COOH ·
4H₂O

Berechnet: C 53,77, H 6,91. N 14,70,
"'· gefunden: C 54,09, H 6.58, N 14,84.

Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit 5,7 N Salzsäure in

Gegenwart von 4%iger Thioglycolsäure bei 110° C innerhalb von 24 Stunden): Arg 0.97; Trp 0,84;

ü p-NH₂-Phe 0,97; Ser 1,00; GIu 1,00; Pro 0,99; AIa 1,02;

Leu 1.02:Tyr 1.08:Äthy!amin 1,00.

Beispiel 10

Herstellung von (Pyr)GIu-Trp-Trp-Ser-Tyr-(DJ-Ala-Leu-Arg-Pro-NH-CHzCHj

(a) Herstellung von Z-(Pyr)GIu-Trp-OBzl

Eine Lösung von Z-(Pyr)Glu-ONB (1,7 g) und H-Trp-OBzi p-Toiuoisuifonat (2,i g) in 50 mi Acetonitril werden 0,61 ml Triäthylamin zugegeben und das Gemisch wird 12 Stunden lang bei Raumtemperatur

gerührt, dann im Vakuum zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wird in 100 ml Äthylacetat gelöst, mit 1 N HCI und 5%igem wässerigem NaHCO₃ gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und zur Trockene eingeengt, dann aus Petroläther kristallisiert und aus Äthylacetat/Petrolather umkristallisiert.

Ausbeute: 1,7 g,

Fp.: 129-130" C,

[«]>· = +3,1° (c= 1,0 in Dimethylformamid),

Rf⁴ = 0,42.

Elementaranalyse für C₃I

Berechnet: C 69,00, H 5.42, N 7.79, gefunden: C 68,85, H 5,48, N 7.63.

(b) Herstellung von BOC-Trp-Ser-Tyr-(D)-Ala-

Leu-ArgfNO,)-PrO-NH-CH₂CH,

BOC-Ser-Tyr-(D)-Ala-Leu-Arg(NO₂)-Pro-NH-CH₂CH₃ (670 mg) wird mit IO ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 20 min lang behandelt, diese Lösung wird mit 50 ml trockenem Äther versetzt, um einen feinkörnigen Feststoff zu erhalten, welcher im Vakuum über NaOH-Pellets getrocknet wird. Das so erhaltene Pulver wird in 5 ml Dimethylformamid gelöst und dieser Lösung werden 0,11 ml Triäthylamin zusammen mit aus BOC-Trp-OH (243 g) und HONB (150 mg) nach dem DCC-Verfahren hergestelltem BOC-Trp-ONB zugegeben. Dieses Gemisch wird 12 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und das entstandene Produkt durch Zugabe von 50 ml Äthylacetat ausgefällt, der Niederschlag wird abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Durch nochmaliges Ausfällen aus Dimethylformamid-Äthylacetat wird er gereinigt.

Ausbeute: 720 mg; Fp.: 190-193° C;

[λ] = -42.4° (c= 0,5 in Dimethylformamid).
Rf-* = η 97

Elementaranalyse dür C₅₀H₇₃OuNuH₂O

Berechnet: C 55,49, H 6,98 N 16,82, gefunden: C55.14, H 7,16, N 16.76.

(c) Herstellung von (Pyr)Glu-Trp-Trp-Ser-Tyr-

(D^AIa-Leu-Arg-Pro-NH-CHzCHj

Z-(Pyr)Glu-Trp-OBzl (wie oben erhalten) (215 mg) werden in 50 ml Methanol gelöst und dann in Gegenwart von Palladiumschwarz als Katalysator 3 Stunden lang hydriert- Dann wird die Lösung filtriert, um den Katalysator zu entfernen, und zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wird mit Äther gewaschen und abfiltriert, um die entsprechende freie Säure zu erhalten.

BOC-Trp-Ser-Ty r-( D)-AIa- Leu-A rg(NO₂)- Pro- N H -CH₂CH₃ (426 mg) wird mit 5 ml Trifluoressigsäure in Gegenwart von 0,1 ml 2-Mercaptoäthanol und 0,4 ml N-HCI bei Raumtemperatur 30 min lang behandelt, diese Lösung wird mit trockenem Äther versetzt, um einen feinkörnigen weißen Feststoff zu erhalten, welcher abfiltriert und über NaOH-Pellets im Vakuum getrocknet wird, um die entsprechende freie Base zu gewinnen.

Das so erhaltene Pulver wird im 2 ml Dimethylformamid zusammen mit 0,06 ml N-Äthylmorpholin gelöst, dann werden die oben beschriebene, freie Säure und 102 mg HONB zugegeben. Dieses Gemisch wird auf 0⁰C gekühlt und mit 1IO mg DCC versetzt. Die Lösung wird 2 Stunden lang bei 0⁰C und weitere 10 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Dann wird das Reaktionsgemisch abfiltriert, um den entstandenen Dicyclohexylharnstoff zu entfernen und das Filtrat wird im Äthylacetat verdünnt, um einen feinkörnigen Feststoff zu erhalten, welcher als Rohprodukt abfiltriert wird. Das entstandene rohe, geschützte Nonapeptidäthylamid wird an einer Kolonne von Silikage! (Lösungsmittelsystem Äthylacetat zu Pyridin zu Essigsäure zu H:O = 60:20::6:10) gereinigt. Die Fraktionen, in welchen mittels Dünnschichtchromatographie das reine Produkt nachgewiesen wurde, werden kombiniert und eingeengt, wobei 250 mg Rückstand erhalten werden, welcher mit 5 ml HF in Gegenwart von 0,1 ml Anisol und 0,1 ml 2-Mercaptoäthanol bei 0°C 60 min lang behandelt wird, worauf man im Vakuum das HF entfernt. Der Rückstand wird in 20 ml Wasser gelöst und über eine Kolonne (1 χ 10 cm) Amberlite CG-410 in Acetatform geleitet, die Kolonne wird gründlich mit Wasser gewannen. Das Eluat und Wasch wasser werden kombiniert und der Chromatographie an einer Carboxymethylcellulose-Kolonne (1,2 cm Durchmesser χ 30 cm) nach einem Gradientenelulions-Verfahren (pH-Wert 6,8, Ammoniumacetatpuffer 0,005 M/0,15 M = 300 ml/300 ml) unterworfen. Das reine Peptid wird in den 160ml-260-ml-Fraktionen eluiert, welche miteinander kombiniert und auf ein konstantes Gewicht lyophilisiert werden.

Ausbeute: 100 mg;

[*],· 47,2° (C= 0,25 in 5% Essigsäure);

Rf =0,31, Rf² = 0,76.

Aminosäureanalyse: His 0,96; Arg 1,01; Trp 11,89; GIu 032; Ser0,96; Pro 1,11; AIa 1,00; Leu l,02;Tyr 1,05(86% Ausbeute).

Claims (1)

Patentansprüche;

1. Nonapeptidamide der allgemeinen Formel

(PyrJGlu-R'-Trp-Ser-RHDJ-Ala-RS-Arg-Pro-NHR<

worin

R¹ His, Tyr, Trp oder p-Amino-L-phenylalanyl,

R² Tyr oder Phe,

R³ Leu, He oder Nie und

R⁴ eine Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, 2-Hydroxyäthyl, 2-Hydroxy-n-propyl oder 3-Hydroxy-n-propyl