DE3587016T2

DE3587016T2 - Nona- und dekapeptidanaloga von lhrh, welche als lhrh-antagonisten dienen.

Info

Publication number: DE3587016T2
Application number: DE8585114386T
Authority: DE
Inventors: John Joseph Nestor; Brian Henry Vickery
Original assignee: Syntex USA LLC
Current assignee: Syntex USA LLC
Priority date: 1984-11-13
Filing date: 1985-11-12
Publication date: 1993-06-03
Anticipated expiration: 2005-11-13
Also published as: AU4982085A; EP0182262B1; CA1303627C; DE3587016D1; AU594652B2; NZ214154A; ZA858675B; DK521285D0; US4690916A; EP0182262A2; EP0182262A3; IE59709B1; IE852815L; ATE84797T1; DK521285A; JP2542362B2; JPS61122297A

Description

Luteinisierendes Hormon (LH) und follikulär stimulierendes Hormon (FSH) werden unter der Steuerung des Releasinghormons LHRH, das in der Hypothalamusregion erzeugt wird, aus dem Hypophysenvorderlappen freigesetzt. LH und FSH wirken auf die Gonaden ein, um die Synthese von Steroidhormonen zu stimulieren und Gametenreifung zu stimulieren. Die pulsierende Freisetzung von LHRH und dadurch die Freisetzung von LH und FSH steuert den Reproduktionszyklus in Haustieren und Menschen.
LHRH wirkt auch indirekt auf die Plazenta und die Gonaden, indem es die Freisetzung von Choriongonadotropin (hCG) verursacht.
Antagonisten von LHRH sind für die Steuerung der Fruchtbarkeit nützlich. Derartige Antagonisten hemmen die Ovulation bei weiblichen Tieren und Menschen und unterdrücken die Spermatogenese bei männlichen Tieren und Menschen. Mit diesen Wirkungen verwandt ist die Suppression von normalen zirkulierenden Spiegeln von Sexualsteroiden gonadischen Ursprungs, was in der Verringerung von Hilfsorgangewicht und -Funktion bei männlichen und weiblichen Tieren und Menschen resultiert. Bei Haustieren fördert diese Wirkung die Gewichtszunahme bei einer festen Futterzufuhrsituation, stimuliert bei trächtigen Tieren einen Abort und wirkt allgemein als chemisches Sterilisierungsmittel.
Das natürliche Releasinghormon LHRH ist ein Decapeptid, das aus natürlich vorkommenden Aminosäuren (die außer der achiralen Aminosäure Glycin die L-Konfiguration aufweisen) aufgebaut ist. Seine Sequenz ist wie folgt:
Viele Analoga dieses natürlichen Materials sind untersucht worden, und von der sehr großen Mehrheit von ihnen hat sich herausgestellt, daß sie von unzureichender biologischer Wirksamkeit sind, um klinisch von Nutzen zu sein. Von gewissen ausgewählten Modifikationen hat sich herausgestellt, daß sie eine agonistische Wirkung auf die biologische Wirksamkeit aufweisen. Die bei weitem signifikanteste Verbesserung wird erhalten, wenn man den Rest in der Stellung 6 von Gly in einer D-Aminosäure ändert.
Zusätzlich zu Agonisten sind Analoga hergestellt worden, die kompetitive Antagonisten zu LHRH sind; alle diese erfordern die Entfernung oder den Ersatz des Histidinrestes an der Stellung 2; Vale W. et al., Science, 176: 933 (1972). Im allgemeinen scheint es, daß eine D-Aminosäure, die an dieser Position in die Sequenz eingefügt wird, die beste Wirkung ergibt; Rees, R.W.A. et al., J. Med. Chem., 17: 1016 (1974).
Es ist auch gezeigt worden, daß das Hinzufügen einer Modifikation an der Stellung 6, die ohne die Modifikation an der Stellung 2 in der oben angeführten agonistischen Wirkung resultiert, die antagonistische Wirkung der 2-modifizierten Analoga vergrößert; Beattie, C.W. et al., J. Med. Chem., 18: 1247 (1975); Rivier J. et al., Peptides 1976, S. 427, Editions de l'Universit de Bruxelles, Belgium (1976).
Vor dem Hintergrund dieser zwei Hauptveränderungen, die in einer potenten Reihe von LHRH-Antagonisten resultieren, können zusätzliche Inkremente in der antagonistischen Wirkung durch eine Modifikation der Stellungen 1, 3 und/oder 10 in dem bereits 2,6-modifizierten Peptid erhalten werden. Coy, D.H. et al., Peptides 1976, S. 462, Editions de l'Universit de Bruxelles, Belgium (1976); Rivier, J.E. et al., Life Sci. 23: 869 (1978); Dutta, A.S. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 81: 382 (1978), Humphries, J. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 85: 709 (1978). Es ist auch gezeigt worden, daß eine N-Acylierung der Aminosäure in der Stellung 1 hilfreich ist; Channabasavaia, K. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 81: 382 (1978); Coy, D.H. et al., Peptides. - Structure and Biological Function, S. 775, Pierce Chemical Co. (1979). Zusätzlich ist (N-Ac-D-p-Cl-Phe¹, D-p-Cl-Phe², D-Trp³, D-Arg&sup6;, D-Ala¹&sup0;) LHRH von D.H. Coy, Endocrinology, 110, 1445 (1982) publiziert worden. In einem anderen Fall ist von einer D-Ala&sup4;-Modifikation in LHRH berichtet worden, daß eine antagonistische Wirkung beibehalten wird. Siehe E. Pedroza, J.A. Martinez, D.H. Coy, A. Arimura und A.V. Schally; Int. J. Fert.; 23, 294 (1978). Auch von einer Modifikation an der Stellung 7 bezüglich D-Trp ist gezeigt worden, daß sie eine antiovulatorische Wirkung beibehält, siehe Folkers, F.A. Bowers, C.Y.; Shieh, H.M., Yin-Zen, L., Shao-Bo, X., Tang., D.F.L., Li-Yu, C.; Biochem. Biophys. Res. Conven. 123:1221 (1984).
Da Antagonisten durch Konkurrieren mit LHRH um die geeigneten Rezeptoren funktionieren, sind hohe Dosen dieser Verbindungen erforderlich, um das natürliche Peptid auszublocken. In Anbetracht dieser Tatsache ist es besonders wünschenswert, Antagonisten mit einem sehr hohen Grad an Potenz und verlängerter Wirkung zu erhalten. Die Fähigkeit, langsam aus Depotformulierungen freigesetzt zu werden, wird auch wichtig sein.
EP-A-97031 offenbart Nonapeptid- und Decapeptidanaloga von LHRH, die als LHRH-Antagonisten nützlich sind und eine Struktur aufweisen, die jener der Verbindungen der vorliegenden Erfindung ähnlich ist, mit Ausnahme des Aminoacylrests an der Stellung 6.
D.H. Coy et al., Biochemistry, Band 14 (9), 1975, 1848-1851, beschreiben C- terminal fluorierte Analoga von LHRH.
Die vorliegende Erfindung betrifft neue, hochpotente Nonapeptid- und Decapeptid-Analoga von LHRH, in denen ein Ersatz an der Stellung 2 (was dementsprechend das Peptid in die Antagonistenreihe überführt) durch den Ersatz des Glycinrestes an der Stellung 6 durch einen neuen Halogen-niederalkyl-guanidinosubstituierten Aminosäurerest, der nicht in der Natur vorkommt, wirksamer gemacht wird. Diese Verbindungen sind potente LHRH-Antagonisten. Andere Verbesserungen durch Substitutionen an 1, 2, 3, 4, 7 und/oder 10 werden ebenfalls offenbart. Die Erfindung ist auch auf verschiedene Verfahren zur Verwendung dieser Verbindungen und auf pharmazeutische Zusammensetzungen dafür gerichtet. Ein weiterer Aspekt der Erfindung beinhaltet Verfahren zur Herstellung der neuen oben beschriebenen Verbindungen.

Beschreibung der Analoga

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Nonapeptid- und Decapeptidanaloga von LHRH, die die Formel
aufweisen, und die pharmazeutisch annehmbaren Salze davon, worin:
A einen aus der aus N-Ac-D,L-Δ3,4-Prolyl, N-Ac-D,L-Prolyl, N-Ac-L-Alkylprolyl, N-Ac-D,L-Phenylalanyl, N-Ac-D,L-p-Cl-Phenylalanyl, N-Ac-D,L-Seryl, N- Ac-D,L-Threonyl, N-Ac-D,L-Alanyl, N-Ac-3-(1-Naphthyl)-D,L-alanyl, N-Ac-3-(2- Naphthyl)-D,L-alanyl, N-Ac-3-(2,4,6-Trimethylphenyl)-D,L-alanyl und N-Ac-3-(4- Trifluormethylphenyl)-D,L-alanyl bestehenden Gruppe ausgewählten Aminoacylrest darstellt;
B einen aus der aus D-Phenylalanyl, D-p-Cl-Phenylalanyl, D-p-Br-Phenylalanyl, D-p-F-Phenylalanyl, D-p-Nitrophenylalanyl, 3-(3,4,5-Trimethoxyphenyl)-D- alanyl, 2,2-Diphenylglycin, D-α-Methyl-p-Cl-phenylalanyl und 3-(2,4,6-Trimethylphenyl)-D-alanyl bestehenden Gruppe ausgewählten Aminoacylrest darstellt;
C einen aus der aus D-Tryptophanyl, D-Phenylalanyl, D-Pentamethylphenylalanyl, 3-(3-Pyridyl)-D-alanyl, 3-(1-Naphthyl)-D-alanyl und 3- (2- Naphthyl)-D-alanyl bestehenden Gruppe ausgewählten Aminoacylrest darstellt;
D einen aus der aus L-Seryl und D-Alanyl bestehenden Gruppe ausgewählten Aminoacylrest darstellt;
E einen aus der aus L-Phenylalanyl und L-Tyrosyl bestehenden Gruppe ausgewählten Aminoacylrest darstellt;
F ein Aminoacylrest ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Resten besteht, welche durch die folgenden Strukturformeln dargestellt werden:
worin n 1 bis 5 ist; R&sub1; Halogenniederalkyl ist; R&sub2; Wasserstoff, Methyl oder Ethyl ist; R&sub3; R&sub1;, Methyl, Ethyl oder -CH&sub2;CH&sub2;OH ist;
G einen aus der aus L-Tryptophanyl, L-Nal (2), L-Leucyl, L-Norleucyl und L- Norvalyl bestehenden Gruppe ausgewählten Aminoacylrest darstellt;
H D-Alaninamid, D-Leucinamid, Glycinamid oder -NHR&sub5; darstellt, worin R&sub5; Niederalkyl oder NHCONH&sub2; ist; und die pharmazeutisch annehmbaren Salze davon.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch Verbindungen der Formel
und die pharmazeutisch annehmbaren Salze davon, worin:
A einen aus der aus N-Ac-D,L-Δ3,4-Prolyl, N-Ac-D,L-Prolyl, N-Ac-L-Alkylprolyl, N-Ac-D,L-Phenylalanyl, N-Ac-D,L-p-Cl-Phenylalanyl, N-Ac-D,L-Seryl, N- Ac-D,L-Threonyl, N-Ac-D,L-Alanyl, 3-(1-Naphthyl)-D,L-alanyl, 3-(2-Naphthyl)- D,L-alanyl, 3-(2,4,6-Trimethylphenyl)-D,L-alanyl und 3-(4-Trifluormethylphenyl)- D,L-alanyl bestehenden Gruppe ausgewählten Aminoacylrest darstellt;
B einen aus der aus D-Phenylalanyl, D-p-Cl-Phenylalanyl, D-p-Br-Phenylalanyl, D-p-F-Phenylalanyl, D-p-Nitrophenylalanyl, 3-(3,4,5-Trimethoxyphenyl)-D- alanyl, 2,2-Diphenylglycin, D-α-Methyl-p-Cl-phenylalanyl und 3-(2,4, 6-Trimethylphenyl)-D-alanyl bestehenden Gruppe ausgewählten Aminoacylrest darstellt;
C einen aus der aus D-Tryptophanyl, D-Phenylalanyl, D-Pentamethylphenylalanyl, 3-(3-Pyridyl)-D-alanyl, 3-(1-Naphthyl)-D-alanyl und 3- (2- Naphthyl)-D-alanyl bestehenden Gruppe ausgewählten Aminoacylrest darstellt;
D einen aus der aus L-Seryl und D-Alanyl bestehenden Gruppe ausgewählten Aminoacylrest darstellt;
E einen aus der aus L-Phenylalanyl und L-Tyrosyl bestehenden Gruppe ausgewählten Aminoacylrest darstellt;
F ein Aminoacyl ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Resten besteht, welche durch die folgenden Strukturformeln dargestellt werden:
worin n 1 bis 5 ist; R&sub1; Halogenniederalkyl ist; R&sub2; Wasserstoff, Methyl oder Ethyl ist;
R&sub3; R&sub1;, Methyl, Ethyl oder -CH&sub2; CH&sub2; OH ist;
G einen aus der aus L-Tryptophanyl, L-Nal(2), L-Leucyl, L-Norleucyl und L- Norvalyl bestehenden Gruppe ausgewählten Aminoacylrest darstellt;
H D-Alaninamid, D-Leucinamid, Glycinamid oder -NHR&sub5; darstellt, worin R&sub5; Niederalkyl oder NHCONH&sub2; ist; und die pharmazeutisch annehmbaren Salze davon.
Der Ersatz des L-Histidylrestes, der sich in der Stellung 2 in LHRH befindet, durch einen der hierin aufgeführten Reste ist ein Erfordernis, um das Peptid in einen LHRH-Antagonisten zu überführen. Der Ersatz des Glycidylrestes in der Stellung 6 in LHRH durch einen der als F aufgeführten Reste ergibt eine dramatische Verbesserung der antagonistischen Wirkung. Die Substitutionen, die hierin an den Positionen 1, 2, 3, 4, 7 und 10 offenbart sind, sind bei der Verbesserung der antagonistischen Wirkung weiter hilfreich.

Abkürzungen und Definitionen

Wie oben dargelegt und zur Zweckmäßigkeit der Beschreibung dieser Erfindung werden die herkömmlichen Abkürzungen für die verschiedenen gewöhnlichen Aminosäuren verwendet, wie sie auf dem Peptidgebiet allgemein anerkannt sind und wie sie von der IUPAC-IUB-Kommission für biochemische Nomenklatur, Biochemistry, 11, 1726 (1972) empfohlen werden. Diese stellen L-Aminosäuren dar, mit Ausnahme der achiralen Aminosäure Glycin und mit der weiteren Ausnahme irgendwelcher unnatürlicher oder natürlicher Aminosäuren, die achiral sind oder andernfalls als D- bezeichnet sind. Alle Peptidsequenzen, die hierin erwähnt sind, werden gemäß der allgemein anerkannten Konvention, wonach die N-terminale Säure links und die C- terminale Säure rechts steht, geschrieben.
Gewisse andere Abkürzungen sind beim Beschreiben der Erfindung nützlich. Die vorliegende Erfindung verwendet Ersatz durch Aminosäuren, die nicht in der Natur vorkommen. Besonders häufig verwendete unter diesen sind die folgenden:

Aminosäurerest Abkürzung

3-(2-Naphthyl)-D-alanyl D-Nal(2)
3-(p-Fluorphenyl)-D-alanyl D-p-F-Phe
3-(p-Chlorphenyl)-D-alanyl D-p-Cl-Phe
3-(p-Bromphenyl)-D-alanyl D-p-Br-Phe
3-(2,3,4,5,6-Pentamethylphenyl)-D-alanyl D-Me&sub5;Phe
3-(2,4,6-Trimethylphenyl)-D-alanyl D-Tmp
3-(3,4,5-Trimethoxyphenyl)-D-alanyl D-Tmo
3-(p-Trifluormethylphenyl)-D-alanyl D-Ptf
3-(3-Pyridyl)-D-alanyl D-Pal(3)
NG,NG'-Bis(2,2,2-trifluorethyl)-D-homoarginin D-FDeh
NG-Methyl,NG'(2,2,3,3,3-pentafluorptoppyl)- D-homoarginin D-mPfh
Als weitere Zweckmäßigkeit werden, da von der Aminosäuresequenz von LHRH gezeigt worden ist, daß sie
(pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH&sub2;,
ist, Nona- und Decapeptide, in denen die Aminosäurereste an speziellen Stellen in der Sequenz durch andere Aminosäurereste oder andere Einheiten ersetzt worden sind, durch Angeben der Natur der Substitution, hochgestellt indiziert durch die Stelle, gefolgt von LHRH als Stammverbindung, abgekürzt.
Dementsprechend wird z. B. die Sequenz
(pyro) Glu-D-p-F-Phe-Trp-Ser-Tyr-D-FDeh-Leu-Arg-Pro-Gly-NH&sub2;,
in der Gly an der Stellung 6 durch D-FDeh ersetzt worden ist und His an der Stellung 2 durch D-p-F-Phe ersetzt worden ist, als [D-p-F-Phe², D-FDeh&sup6;]L·RH dargestellt; und die Sequenz NA-Ac-Pro-D-p-F-Phe-Trp-Ser-Tyr-D-FDeh-Leu-Arg-Pro-Gly-NH&sub2;,
wird dargestellt als:
[N-Ac-Pro¹, D-p-F-Phe², D-FDeh&sup6;, Pro&sup9;-NHEt]zHRH.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "pharmazeutisch annehmbare Salze" auf Salze, die die gewünschte biologische Wirkung der Stammverbindung beibehalten und nicht irgendwelche unerwünschten toxikologischen Wirkungen aufweisen. Beispiele für derartige Salze sind (a) Säureadditionssalze, die mit anorganischen Säuren, z. B. Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure und dgl. gebildet werden; und Salze, die mit organischen Säuren, wie z. B. Essigsäure, Oxalsäure, Weinsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Gluconsäure, Zitronensäure, Äpfelsäure, Ascorbinsäure, Benzoesäure, Gerbsäure, Pamoasäure, Alginsäure, Polyglutaminsäure, Naphthalinsulfonsäuren, Naphthalindisulfonsäuren, Polygalacturonsäure, gebildet werden;
(b) Salze mit mehrwertigen Metallkationen, wie z. B. Zink, Calcium, Wismut, Barium, Magnesium, Aluminium, Kupfer, Kobalt, Nickel, Cadmium und dgl.; oder mit einem organischen Kation, das aus N,N'-Dibenzylethylendiamin oder Ethylendiamin gebildet wird; oder (c) Kombinationen von (a) und (b), z. B. ein Zinktannatsalz und dgl.
"Halogenniederalkyl" bezieht sich auf einen Niederalkylrest, der mit Halogengruppen substituiert ist, insbesondere jene, die eine, zwei oder drei Halogengruppen am ω-Kohlenstoff aufweisen. Die Halogengruppe kann Fluor, Chlor oder Brom sein. Diese Gruppe wird durch Trifluormethyl, 2,2,2-Trifluor-ethyl, 3,3,3-Trifluorpropyl, 2,2,2-Trichlorethyl und dgl. beispielhaft erläutert.
Für den Zweck dieser Erfindung bezieht sich die Abkürzung "AlkylPro" auf den cis-5-Alkyl-L-prolyl-Rest, worin Alkyl das gleiche wie das oben definierte "Niederalkyl" ist. Spezieller ist "MePro" cis-5-Methyl-L-prolyl, "EtPro" ist cis- 5-Ethyl-L-prolyl und "ButPro" ist cis-5-n-Butyl-L-prolyl.
Die Abkürzung "N-Ac" bezieht sich spezifisch auf den N-Acetylaminosäurerest, im Einklang mit allgemein akzeptierter Nomenklatur.

Bevorzugte Ausführungsformen der Verbindungen

Verbindungen, die bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind, sind diejenigen, worin A N-Ac-L-Pro, N-Ac-D-Ser, N-Ac-D-p-Cl-Phe, N-Ac- D-Nal(2) ist; B D-p-F-Phe oder D-p-Cl-Phe ist; C D-Trp, D-Nal(2), D-Phe oder D- Pal(3) ist; D Ser ist; E Tyr ist; F die Verbindung der Formel (II) ist, worin n 3 oder 4 ist und Halogenniederalkyl Trifluormethyl, 2,2,2-Trifluorethyl, 3,3,3- Trifluorpropyl, 2,2,3,3,3-Pentafluorpropyl oder 3,3,3-Trichlorpropyl ist.
Bevorzugtere Ausführungsformen hierin sind:
A ist N-Ac-D-Nal (2) oder N-Ac-D-p-Cl-Phe, B ist D-p-F-Phe oder D-p-Cl-Phe, C ist D-Nal(2), D-Pal(3) oder D-Trp, D ist Ser, E ist Tyr, F ist D-FDeh oder D-mPfh, G ist D-Leu, D-Trp, oder D-Nal(2) und H ist D-AlaNH&sub2;, GlyNH&sub2; oder NHEt; am bevorzugtesten sind die Verbindungen
N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-FDeh-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH&sub2;,
N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-FDeh-Trp-Arg-Pro-D-AlaNH&sub2;,
N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-FDeh-Nal(2)-Arg-Pro-D-AlaNH&sub2;,
N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-FDeh-L-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH&sub2;,
N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-FDeh-L-Trp-Arg-ProD-AlaN-H&sub2; und
N-Ac-D-Nal(2)D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-mPfh-Nal(2)-Arg-Pro-D-AlaNH&sub2;.
In allen obigen Ausführungsformen kann die Verbindung als das entsprechende pharmazeutisch annehmbare Salz hergestellt werden.

Testverfahren

Die Verbindungen dieser Erfindung und insbesondere die Salze derselben weisen eine überraschend potente und langanhaltende LHRH-antagonistische Wirkung auf.
Primäre Maße der Potenz sind die Fähigkeit, Ovulation in Ratten zu hemmen, wie durch das Verfahren von Corbin, A. und Beattie, C.W., Endocrine Res. Commun., 2:1 (1975) getestet, und die Fähigkeit, die LH-Freisetzung und Ovulation im Kaninchen zu hemmen, siehe Phelps, C.P. et al., Endocrinology 100:1526 (1977).
Andere Bioassays, die für LHRH-Antagonisten und für die Verbindungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind:
(a) die Hemmung der LHRH-induzierten FSH- und LH-Freisetzung in der Ratte, in vivo; Vilchez-Martinez, J.A. et al., Endocrinology, 96: 1130 (1975); und
(b) die Hemmung der LH- und FSH-Freisetzung durch dispergierte Hypophysenvorderlappen-Zellkulturen, wie durch Radioimmunoassay gemessen. (Vale, W. et al., Endocrinology 91: 562 (1972).

Antagonistische Wirkungen und Nützlichkeiten

Die folgenden Nützlichkeiten ergeben sich aus der antagonistischen Wirkung der Verbindungen hierin: - weibliche Kontrazeption; - Ovulationsunterdrückung oder -verzögerung; - Induktion der Geburt; - Synchronisierung von Ovulation; - Östrus-Supression; - Wachstumsförderung bei weiblichen Tieren; - Luteolyse, Menses-Induktion; - einen frühen Abort im ersten Trimester herbeiführendes Mittel; - Therapie für Endometriose; - Therapie für Brust und Zysten; - Therapie für das polyzystische Ovariumsyndrom (Stein-Leventhal); - Therapie für benigne Prostatahypertrophie; - männliche Kontrazeption; - Gonadenschutz während Krebstherapie; - Therapie für Krankheiten, die aus exzessiver Gonadenhormonproduktion in beiden Geschlechtern resultieren; - Trächtigkeitsbeendigung bei Haustieren; - funktionelle Kastration bei männlichen Nahrungsmittel-liefernden Tieren; - Suppression von Proöstrus-Blutverlust bei Hunden; - Suppression von Menopause-Symptomen.
Der Aspekt der vorliegenden Erfindung, der spezielle Verwendungen für die oben beschriebenen Verbindungen betrifft, bezieht sich auf diese Nützlichkeiten, insbesondere: Ovulationshemmung und Behandlung von Endometriose bei weiblichen Tieren oder Menschen und Hemmung von Spermatogenese und Behandlung von Prostatatumoren bei männlichen Tieren oder Menschen.
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine wirksame Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die dieselbe enthält, an das Subjekt, das einer solchen Behandlung bedarf oder sie wünscht, verabreicht. Diese Verbindungen oder Zusammensetzungen können, abhängig von der speziellen Endverwendung, auf irgendeinem einer Vielfalt von Wegen verabreicht werden, einschließlich oral, parenteral (einschließlich subkutaner, intramuskulärer und intravenöser Verabreichung), vaginal (insbesondere für die Kontrazeption), rektal, bukkal (einschließlich sublingual), transdermal oder intranasal. Der geeignetste Weg in irgendeinem gegebenen Fall hängt von der Verwendung, dem speziellen aktiven Bestandteil, dem beteiligten Subjekt und der Beurteilung des Arztes ab. Die Verbindung oder Zusammensetzung kann auch mittels Retard-, Depot- oder Implantat-Formulierungen verabreicht werden, wie unten näher beschrieben.
Im allgemeinen ist es für die oben beschriebenen Verwendungen zweckmäßig, den aktiven Bestandteil in Mengen zwischen ungefähr 0,01 und 10 mg/kg Körpergewicht pro Tag, vorzugsweise zwischen ungefähr 0,01 und 5,0 mg/kg Körpergewicht pro Tag, zu verabreichen. Diese Verabreichung kann durch eine einzige tägliche Verabreichung, durch Verteilung auf mehrere Verabreichungen oder durch langsame Freigabe getätigt werden, um die wirksamsten Ergebnisse zu erzielen.
Die genaue Dosis und das genaue Dosierungsschema zur Verabreichung dieser Verbindungen und Zusammensetzungen hängt notwendigerweise von den Bedürfnissen des individuellen Subjekts, das behandelt wird, der Art der Behandlung, dem Grad der Beeinträchtigung oder des Bedarfs und natürlich der Beurteilung des Arztes ab. Im allgemeinen erfordert eine parenterale Verabreichung eine niedrigere Dosierung als andere Verabreichungsmethoden, die mehr von der Absorption abhängen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft pharmazeutische Zusammensetzungen, die als aktiven Bestandteil eine erfindungsgemäße Verbindung enthalten, wobei die Zusammensetzungen eine solche Verbindung in Mischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren, nicht toxischen Träger umfassen. Wie oben erwähnt, können solche Zusammensetzungen zur Verwendung für eine parenterale (subkutane, intramuskuläre oder intravenöse) Verabreichung insbesondere in Form von flüssigen Lösungen oder Suspensionen; für die Verwendung bei der vaginalen oder rektalen Verabreichung insbesondere in halbfesten Formen, wie z. B. Cremes und Suppositorien; für die orale oder bukkale Verabreichung speziell in Form von Tabletten oder Kapseln; oder intranasal insbesondere in Form von Pudern, Nasentropfen oder Aerosolen hergestellt werden.
Die Zusammensetzungen können bequem in Einheitsdosierungsform verabreicht werden und durch irgendeines der auf dem pharmazeutischen Gebiet wohlbekannten Verfahren, wie z. B. in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA., 1970, beschrieben, hergestellt werden. Formulierungen für die parenterale Verabreichung können als gewöhnliche Hilfsstoffe steriles Wasser oder Kochsalzlösung, Polyalkylenglykole, wie z. B. Polyethylenglykol, Öle pflanzlichen Ursprungs, hydrierte Naphthaline und dgl. enthalten. Formulierungen für die vaginale oder rektale Verabreichung, z. B. Suppositorien, können als Hilfsstoffe z. B. Polyalkylenglykole, Vaseline, Kakaobutter und dgl. enthalten. Formulierungen für die Inhalationsverabreichung können fest sein und als Hilfsstoffe z. B. Lactose enthalten, oder sie können wäßrige oder ölige Lösungen zur Verabreichung in Form von Nasentropfen sein. Für die bukkale Verabreichung schließen typische Hilfsstoffe Zucker, Calciumstearat, Magnesiumstearat, vor-gelatinierte Stärke und dgl. ein.
Es ist besonders wünschenswert, die erfindungsgemäßen Verbindungen dem Subjekt über längere Zeiträume, z. B. über Zeiträume von 1 Woche bis zu 1 Jahr, aus einer einzigen Verabreichung zuzuführen. Vielfältige Retard-, Depot-oder Implantat-Dosierungsformen können verwendet werden. Zum Beispiel kann eine Dosierungsform ein pharmazeutisch annehmbares, nicht-toxisches Salz der Verbindung, das einen niedrigen Grad an Löslichkeit in Körperflüssigkeiten aufweist, enthalten, beispielsweise (a) ein Säureadditionssalz mit einer mehrbasigen Säure, wie z. B. Phosphorsäure, Schwefelsäure, Zitronensäure, Weinsäure, Gerbsäure, Pamoasäure, Alginsäure, Polyglutaminsäure, Naphthalin-mono- oder -di-sulfonsäuren, Polygalacturonsäure und dgl.; (b) ein Salz mit einem mehrwertigen Metallkation, wie z. B. Zink, Calcium, Wismut, Barium, Magnesium, Aluminium, Kupfer, Kobalt, Nickel, Cadmium und dgl., oder mit einem organischen Kation, gebildet aus z. B. N,N'-Dibenzylethylendiamin oder Ethylendiamin; oder (c) Kombinationen von (a) und (b), z. B. ein Zinktannatsalz. Zusätzlich können die erfindungsgemäßen Verbindungen oder vorzugsweise ein relativ unlösliches Salz, wie die eben beschriebenen, in ein Gel, z. B. ein Aluminiummonostearatgel mit z. B. Sesamöl, zur Injektion geeignet formuliert werden. Besonders bevorzugte Salze sind Zinksalze, Zinktannatsalze, Pamoatsalz und dgl. Ein anderer Typ einer Depotformulierung mit langsamer Freigabe zur Injektion würde die Verbindung oder das Salz in einem sich langsam abbauenden, nicht-toxischen, nicht antigenen Polymer, wie z. B. einem Polymilchsäure/Polyglykolsäure-Polymer, dispergiert oder eingekapselt enthalten, wie z. B. in US-3 773 919 beschrieben. Die Verbindungen oder vorzugsweise relativ unlösliche Salze, wie z. B. die oben beschriebenen, können auch in Cholesterinmatrix-Pellets formuliert werden, insbesondere zur Verwendung bei Tieren. Zusätzliche Retard-, Depot- oder Implantat-Formulierungen, wie z. B. Liposomen, sind in der Literatur wohlbekannt. Siehe z. B. Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, Herausgeber J.R. Robinson, Marcel Dekker, Inc., New York, 1978. Eine spezielle Referenz unter Bezug auf Verbindungen vom LHRH-Typ kann z. B. in US-4 010 125 gefunden werden.

Synthese der Peptide

Die erfindungsgemäßen Polypeptide können durch irgendwelche Verfahren, die auf dem Gebiet der Peptid-Technik bekannt sind, synthetisiert werden. Eine ausgezeichnete Zusammenfassung der vielen so verfügbaren Verfahren kann in J.M. Stuart und J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969, und J. Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, Band 2, Seite 46, Academic Press (New York), 1973 für die Festphasen-Peptidsynthese und E. Schroder und K. Lubke, The Peptides, Band 1, Academic Press (New York), 1965 für die klassische Lösungssynthese gefunden werden.
Im allgemeinen umfassen diese Verfahren die aufeinanderfolgende Addition von einer oder mehreren Aminosäuren oder geeignet geschützten Aminosäuren an eine wachsende Peptidkette. Normalerweise wird entweder die Amino- oder die Carboxylgruppe der ersten Aminosäure durch eine geeignete Schutzgruppe geschützt. Die geschützte oder derivatisierte Aminosäure kann dann entweder an einen inerten festen Träger gebunden oder in Lösung verwendet werden, indem man die nächste Aminosäure in der Sequenz mit der geeignet geschützten komplementären (Amino- oder Carboxyl-) Gruppe unter Bedingungen, die für die Bildung der Amidverknüpfung geeignet sind, hinzufügt. Die Schutzgruppe wird dann aus diesem neu hinzugefügten Aminosäurerest entfernt, und die nächste (geeignet geschützte) Aminosäure wird dann hinzugefügt, usw. Nachdem alle gewünschten Aminosäuren in der richtigen Sequenz verknüpft worden sind, werden irgendwelche verbleibenden Schutzgruppen (und jedwelcher feste Träger) nacheinander oder gleichzeitig entfernt, um das End-Polypeptid zu liefern. Durch eine einfache Modifikation dieses allgemeinen Verfahrens ist es möglich, mehr als eine Aminosäure zu einem Zeitpunkt zu einer wachsenden Kette hinzuzufügen, z. B. durch Kuppeln (unter Bedingungen, die chirale Zentren nicht racemisieren) eines geschützten Tripeptids mit einem geeignet geschützten Dipeptid, um nach Schutzgruppenentfernung ein Pentapeptid zu bilden.

Bevorzugte Syntheseausführungsformen

Ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen beinhaltet eine Festphasen-Peptidsynthese
In diesem besonders bevorzugten Verfahren wird die α-Aminofunktion der Aminosäuren durch eine säuren- oder basenempfindliche Gruppe geschützt, während die funktionellen Seitenkettengruppen frei oder geschützt sein können. Derartige Schutzgruppen für die α-Aminofunktion sollten die Eigenschaften aufweisen, unter den Bedingungen der Peptidbindungsbildung stabil zu sein, während sie leicht ohne Zerstörung der wachsenden Peptidkette oder Racemisierung irgendeines der darin enthaltenden chiralen Zentren entfernbar sein sollten. Geeignete Schutzgruppen sind t-Butyloxycarbonyl (Boc), Benzyloxycarbonyl (Cbz), Biphenylisopropyloxycarbonyl, t-Amyloxycarbonyl, Isobornyloxycarbonyl, 1,1-Dimethyl-3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl, o-Nitrophenylsulfenyl, 2-Cyano-t-butyloxycarbonyl, 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl und dgl., besonders t-Butyloxycarbonyl (Boc).
Besonders bevorzugte Seitenketten-schützende Gruppen sind für Arginin: Nitro, p-Toluolsulfonyl, 4-Methoxybenzolsulfonyl, Cbz, Boc und Adamantyloxycarbonyl; oder die Guanidinofunktion kann ungeschützt sein und als Boc-Arg-OH (das Tetraphenylboratsalz) inkorporiert sein; für Tyrosin: Benzyl, Brombenzyl, 2,6- Dichlorbenzyl, Isopropyl, Cyclohexyl, Cyclopentyl und Acetyl; für Serin: Benzyl und Tetrahydropyranyl; für Histidin: Benzyl, p-Toluolsulfonyl und 2,4- Dinitrophenyl.
Die C-terminale Aminosäure wird an einen geeigneten festen Träger gebunden. Geeignete feste Träger, die für die obige Synthese nützlich sind, sind jene Materialien, die gegenüber den Reagenzien und Reaktionsbedingungen der stufenweisen Kondensations-Schutzgruppenentfernungsreaktionen inert sind sowie in den verwendeten Medien unlöslich sind. Geeignete feste Träger sind Chlormethylpolystyrol-Divinylbenzol-Polymer, Hydroxymethylpolystyrol-Divinylbenzol- Polymer und dgl., insbesondere Chlormethylpolystyrol-1% Divinylbenzol-Polymer. Für den speziellen Fall, in dem das C-Ende der Verbindung Glycinamid ist, ist ein besonders nützlicher Träger das Benzhydrylaminopolystyrol-Divinylbenzol-Polymer, das von P. Rivaille et al., Helv. Chim. Acta., 54, 2772 (1971) beschrieben wird. Das Binden des Harzes vom Chlormethylpolystyrol-Divinylbenzol-Typ wird mittels der Reaktion der Nα-geschützten Aminosäure, insbesondere der Boc-Aminosäure, als ihr Cäsium-, Tetramethylammonium-, Triethylammonium-, 1,5-Diazabicyclo[5.4.0]undeca-5-en- oder ähnliches Salz in Ethanol, Acetonitril, N,N-Dimethylformamid (DMF) und dgl., besonders das Cäsiumsalz in DMF, mit dem Chlormethylharz bei einer erhöhten Temperatur, z. B. zwischen ungefähr 40 und 60ºC, vorzugsweise ungefähr 50ºC, über ungefähr 12 bis 48 Stunden, vorzugsweise ungefähr 24 Stunden, bewerkstelligt. Die Nα-Boc-Aminosäure wird mittels eines N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC)/1-Hydroxybenzotriazol (HBT)-vermittelten Kuppelns über ungefähr 2 bis ungefähr 24 Stunden, vorzugsweise ungefähr 12 Stunden, bei einer Temperatur zwischen ungefähr 10 und 50ºC, vorzugsweise 25ºC, in einem Lösungsmittel, wie z. B. Dichlormethan und DMF, vorzugsweise Dichlormethan, an das Benzhydrylaminharz gebunden. Das Kuppeln von aufeinanderfolgenden geschützten Aminosäuren kann in einer automatischen Polypeptidsynthesevorrichtung, wie sie im Stand der Technik wohl bekannt ist, durchgeführt werden. Die Entfernung der Nα-schützenden Gruppen kann in Gegenwart von beispielsweise einer Lösung von Trifluoressigsäure in Methylenchlorid, Chlorwasserstoff in Dioxan, Chlorwasserstoff in Essigsäure oder einer anderen starken Säure-Lösung, vorzugsweise 50% Trifluoressigsäure in Dichlormethan, bei ungefähr Umgebungstemperatur durchgeführt werden. Jede geschützte Aminosäure wird vorzugsweise in ungefähr 2,5-molarem Überschuß eingeführt, und das Kuppeln kann in Dichlormethan, Dichlormethan/DMF-Mischungen, DMF und dgl., besonders in Methylenchlorid, bei ungefähr Umgebungstemperatur durchgeführt werden. Das Kupplungsmittel ist normalerweise DCC in Dichlormethan, aber es kann N,N'-Diisopropylcarbodiimid (DIC) oder ein anderes Carbodiimid entweder allein oder in Gegenwart von HBT, N- Hydroxysuccinimid, anderen N-Hydroxyimiden oder Oximen sein. Alternativ können geschützte aktive Aminosäureester (z. B. p-Nitrophenyl, Pentafluorphenyl und dgl.) oder symmetrische Anhydride verwendet werden.
Am Ende der Festphasensynthese wird das voll geschützte Polypeptid vom Harz entfernt. Wenn die Verknüpfung mit dem Harzträger vom Benzylestertyp ist, wird die Spaltung mittels Aminolyse mit einem Alkylamin oder Fluoralkylamin für Peptide mit einem Prolin-C-Ende oder durch Aminolyse mit beispielsweise Ammoniak/Methanol oder Ammoniak/Ethanol für Peptide mit einem Glycin-C-Ende bei einer Temperatur zwischen ungefähr 10 und 50ºC, vorzugsweise ungefähr 25ºC, über zwischen ungefähr 12 und 24 Stunden, vorzugsweise ungefähr 18 Stunden, erzielt. Alternativ kann das Peptid durch Umesterung, z. B. mit Methanol, gefolgt von Aminolyse, vom Harz entfernt werden. Das geschützte Peptid kann an diesem Punkt durch Kieselgelchromatographie gereinigt werden. Die Entfernung der Seitenketten-Schutzgruppen aus dem Polypeptid wird durch Behandeln des Aminolyseprodukts mit beispielsweise wasserfreier flüssiger Flußsäure in Gegenwart von Anisol oder einem anderen Carbonium-Abfänger, Behandeln mit Flußsäure/Pyridin- Komplex, Behandeln mit Tris(trifluoracetyl)bor und Trifluoressigsäure, durch Reduktion mit Wasserstoff und Palladium auf Kohle oder Polyvinylpyrrolidon oder durch Reduktion mit Natrium in flüssigem Ammoniak, vorzugsweise mit flüssiger Flußsäure und Anisol, bei einer Temperatur zwischen ungefähr -10 und +10ºC, vorzugsweise ungefähr 0ºC, über zwischen ungefähr 15 Minuten und 1 Stunde, vorzugsweise ungefähr 30 Minuten, durchgeführt. Für die Glycin-terminalen Peptide auf den Benzhydrylaminharzen können die Harzabspaltungs- und Schutzgruppen-Entfernungsstufen in einer einzigen Stufe, die flüssige Flußsäure und Anisol, wie oben beschrieben, verwendet, kombiniert werden. Das voll von den Schutzgruppen befreite Polypeptid wird dann durch eine Aufeinanderfolge chromatographischer Schritte, die irgendeine oder alle der folgenden Typen verwenden: Ionenaustausch auf einem schwach basischen Harz in der Acetatform; hydrophobe Adsorptionschromatographie auf nicht-derivatisiertem Polystyrol-Divinylbenzol (z. B. Amberlite XAD); Kieselgel-Adsorptionschromatographie; Ionenaustauschchromatographie auf Carboxymethylcellulose; Verteilungschromatographie, z. B. auf Sephadex G-25, oder Gegenstromverteilung; Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), insbesondere Umkehrphasen-HPLC auf einer Säulenpackung mit Octyl- oder Octadecylsilyl-siliciumdioxid-gebundener Phase, gereinigt.
Falls eine racemische Aminosäure in der 1-, 2-, 3- oder 6-Stellung verwendet wird, werden die diastereomeren Nonapeptid- oder Decapeptid-Endprodukte aufgetrennt, und das gewünschte Peptid, das eine D-Aminosäure in der geeigneten Stellung enthält, wird isoliert und gereinigt, vorzugsweise während des oben beschriebenen chromatographischen Verfahrens.
Die Herstellung von Peptiden mit C-terminalen Azaglycinamiden wird vorzugsweise unter Verwendung klassischer Peptidlösungssynthese unter Verwendung bekannter Peptidzwischenprodukte bewerkstelligt. Dies ist in Beispiel 3 in größerer Einzelheit beschrieben.
Dementsprechend betrifft die Erfindung in einem anderen Aspekt ein Verfahren zur Herstellung von erfindungsgemäßen Verbindungen und der pharmazeutisch annehmbaren Salze davon, umfassend:
Entfernen von Schutzgruppen und gegebenenfalls kovalent gebundenem festen Träger von einem geschützten Polypeptid, um eine Verbindung der Formel (I) oder ein Salz derselben zu liefern; oder Zusammenkuppeln in der erforderlichen Reihenfolge von zwei Fragmenten der gewünschten Verbindung der Formel (I); oder
(a) Überführen einer Verbindung der Formel (I) in ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder
(b) Überführen eines Salzes einer Verbindung der Formel (I) in ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder
(c) Überführen eines Salzes einer Verbindung der Formel (I) in ein freies Polypeptid der Formel (I).
Man wird erkennen, daß die neuen Halogen-niederalkylguanidino-substituierten Aminosäuren, die in dieser Erfindung verwendet werden, um den Glycinrest an der Stellung 6 von LHRH zu ersetzen, nützliche Zwischenprodukte sind und als solche einen wichtigen Teil dieser Erfindung bilden.
Bevorzugte Zwischenprodukte schließen jene der Formel (II) ein, worin n 3 oder 4 ist, R Trifluormethyl, 2,2,2-Trifluorethyl, 3,3,3-Trifluorpropyl, 2,2,3,3,3-Pentafluorpropyl oder 3,3,3-Trichlorpropyl ist.
Solche Zwischenprodukte der Formel II können durch zwei Verfahren hergestellt werden. Ein Verfahren folgt den klassischen Peptidsyntheseverfahren. Eine ω-Amino-α-aminosäure wird mit geeigneten Schutzgruppen derart behandelt, daß die Säurefunktion und die α-Aminogruppe geschützt werden, aber daß sie die omega- Aminofunktion für eine weitere Behandlung verfügbar belassen. Diese geschützte Verbindung wird dann mit N,N'-Dialkylcarbodiimid in einem geeigneten Lösungsmittel umgesetzt. Die Reaktion wird bei einer Temperatur zwischen ungefähr 22- 150ºC über bis zu ungefähr 6 Stunden durchgeführt. Das Lösungsmittel wird dann entfernt. Um das N,N'-Dialkylharnstoff-Nebenprodukt zu entfernen, wird der Rückstand in einem zweiten Lösungsmittel, wie z. B. Dimethylformamid, suspendiert, und die Suspension wird filtriert, um das gewünschte Produkt als Festkörper zu gewinnen. Alternativ kann der entsprechend N,N'-Halogendialkylthioharnstoff mit der ω-Funktion einer geeignet geschützten Aminosäure (z. B. CBZ-Lys-OBZ1) in Gegenwart von HgCl&sub2; umgesetzt werden.
Alternativ wird Lysindihydrochlorid oder ein geeignetes Homologes mit einem S-Methyl-dialkyl-isothioharnstoff·HI oder der entsprechenden freien Base in Gegenwart einer Lösung einer starken Base, wie z. B. Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder dgl., umgesetzt. Die Reaktion wird am besten bei Raumtemperatur bis 90ºC, vorzugsweise 60ºC, über mehrere Tage, d. h. 2-6 Tage, bei einem pH von ca. 10,5 bewirkt. Zusätzlicher Thioharnstoff kann, falls benötigt, nach der anfänglichen Reaktionsperiode dazugegeben werden. Ein Dialkyldicarbonat und Base, wie z. B. Magnesiumoxid, wird dann in einem organischen Lösungsmittel, wie z. B. Dioxan, zugegeben, um mit der u-Aminofunktion des Produkts und den α-α-Funktionen des überschüssigen Ausgangsmaterials zu reagieren. Das Reaktionsprodukt wird dann durch Extraktion, eine Ionenaustauscherharzbehandlung und andere geeignete chromatographische Mittel aufgearbeitet. Die folgenden Beispiele erläutern die Herstellung von Verbindungen innerhalb des Bereichs dieser Erfindung.

HERSTELLUNG 1

Eine Mischung von 17,5 g NaHCO&sub3;, 125 ml Methylenchlorid und 2,65 ml Thiophosgen wurde auf 0ºC abgekühlt, und eine Lösung von 9,4 g CF&sub3;CH&sub2;NH&sub2;·HCl in 50 ml Wasser wurde tropfenweise dazugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 2 Stunden bei 0ºC und dann über Nacht bei Raumtemperatur aufbewahrt.
Die Mischung wurde zwischen Methylenchlorid und Wasser verteilt. Die Methylenchloridlösung wurde über Magnesiumsulfat getrocknet. Die Methylenchloridlösung wurde filtriert und zu einem Öl konzentriert. Das Öl wurde aus Ethylacetat/Hexan kristallisiert, um 6,5 g N,N'-Bis-(2,2,2-trifluorethyl)thioharnstoff vom Fp. 154-5ºC zu liefern.
Eine Lösung von 3,36 g des obigen Thioharnstoffs in 10 ml Methanol wurde mit 0,96 ml CH&sub3;I behandelt. Die Reaktionsmischung wurde 1 Stunde bei 70ºC erwärmt. Zusätzliche 0,96 ml CH&sub3;I wurden hinzugefügt, und man rührte 2 Stunden bei 70ºC, dann über Nacht bei Raumtemperatur weiter.
Das Lösungsmittel wurde im Vakuum verdampft, und der Rückstand wurde aus MeOH/Diethylether kristallisiert, um S-Methyl-N,N'-bis(2,2,2-trifluorethyl)iso-thiouroniumiodid, Fp. 145-6ºC, zu liefern.
Auf ähnliche Weise werden unter Einsetzen von:
2,2, 2-Trichlorpropylamin, Trifluormethylamin, 2,2,3,3,3-Pentafluorpropylamin und dgl. erhalten: S-Methyl-N,N'-bis(2,2,2-trichlorpropyl)-iso-thiouroniumiodid, S-Methyl-N,N'-bis(trifluormethyl)-iso-thiouroniumiodid und S-Methyl-N,N' -bis (2,2,3,3, 3-pentafluorpropyl)-iso-thiouroniumiodid.

HERSTELLUNG 2

Eine Mischung von 5,42 g Benzyl-Nα-benzyloxycarbonyl-D-lysinattoluolsulfonat (B. Bezas und L. Zervas, J. Am. Chem. Soc., 83, 719 (1961)) und 1,72 ml Diisopropylethylamin in 60 ml Dioxan wird mit 3,6 g S-Methyl-N,N'-bis(2,2,2-trifluorethyl)isothioharnstoff geschaffen. Die Reaktionsmischung wird 6 Stunden bei 100ºC gerührt, auf Raumtemperatur abgekühlt und zu einem Festkörper konzentriert. Der Festkörper wird in 20 ml warmem DMF suspendiert, filtriert, und das Filtrat wird zu einem Festkörper konzentriert. Benzyl-Nα-benzyloxycarbonyl-N,N'-guanidinobis (2,2,2-trifluorethyl)-D-homoargininattoluolsulfonat wird als weißer Festkörper durch Kristallisation aus Methanol/Ethylacetat erhalten.
Auf ähnliche Weise werden durch Verwendung des obigen Verfahrens, aber durch Einsetzen von:
N,N'-Bis(2,2,2-trichlorpropyl)carbodiimid; N,N'-Bis(trifluormethyl)carbodiimid; N,N'-Bis(2,2,3,3,3-pentafluorpropyl)carbodiimid; und dgl., erhalten: Benzyl-Nα-benzyloxycarbonyl-N,N'-guanidino-bis(2,2,2-trichlorpropyl)-D- homoargininat; Benzyl-Nα-benzyloxycarbonyl-N,N'-guanidino-bis(trifluormethyl)-D-homoargininat; und Benzyl-Nα-benzylorycarbonyl-N,N'-guanidino-bis(2,2,3,3,3-pentafluorpropyl)- D-homoargininat.
Auf ähnliche Weise, aber durch Ersetzen des D-Lysinats durch Benzyl-Nαbenzyloxycarbonyl-D-ornithinat kann man die entsprechenden D-Arginin-Analoga als ihre Toluolsulfonatsalze erhalten.

HERSTELLUNG 3

Eine Lösung von 6 g Benzyl-Nα-benzyloxycarbonyl-N,N'-guanidino-bis(2,2,2- trifluorethyl)-D-homoarginat in 150 ml Ethanol, die 1 g 10% Pd/C-Katalysator enthielt, wurde 3 Stunden bei Umgebungsdruck mit Wasserstoffgas behandelt. Zusätzliche 0,4 g 10% Pd/C wurden zugegeben und die Hydrogenolyse wurde zusätzliche 3 Stunden fortgesetzt.
Die Reaktionsmischung wurde durch Celite filtriert und zur Trockne konzentriert, um N,N-Guanidino-bis-(2,2,2-trifluorethyl)-D-homoarginin als weißen Schaum mit [α]25/D -6,1º (C 0,6, MeOH) zu liefern.
Eine Lösung von 1,96 g der oben genannten freien Aminosäure in einer Mischung von 8 ml 1N NaOH und 8 ml Dioxan wurde mit 1,05 g Di-t-Butyldicarbonat und 0,16 g MgO 1 Stunde bei 0ºC und 3 Stunden bei Raumtemperatur behandelt. Die Mischung wurde filtriert, zur Trockne konzentriert, mit Wasser verdünnt und mit Diethylether gewaschen. Die wäßrige Schicht wurde bei 0ºC mit 1N HCl auf einen pH von 3,5 angesäuert und dann mit Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetatschicht wurde mit Wasser, gesättigtem NaCl gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Der Ethylacetatextrakt wurde filtriert und konzentriert, um einen weißen Schaum zu ergeben. Der Schaum wurde mit Ag3 (Cl&supmin;)-Harz digeriert, um 1,4 g Nα-t-Butoxycarbonyl-N,N'-guanidino-bis-(2,2,2-trifluorethyl)-D-homoarg-ininhydrochlorid mit Fp. 122-130ºC, [α]25/D -2,2º (C 0,5, MeOH) zu ergeben.
Auf ähnliche Weise wurden unter Einsetzen der Produkte der Herstellung 2 die entsprechenden Boc-geschützten Homoarginin- und Arginin-Derivate erhalten.

HERSTELLUNG 4

cis-5-Alkylprolin-Verbindungen können durch das folgende Verfahren hergestellt werden:
In einen 200 ml-Rundkolben werden (S)-3-(Benzyloxycarbonyl)-5-oxo-4- oxazolidinpropionsäure und 63 ml wasserfreies Benzol gegeben. Zu dieser Lösung werden 13,9 g Phosphorpentachlorid bei 0ºC gegeben. Die Reaktionsmischung wird 1 Stunde bei 0ºC gerührt, währenddessen sich das ganze Phosphorpentachlorid löst. Das Benzollösungsmittel wird unter Vakuum und Coverdampfung mit zwei 25 ml-Proben trockenem Benzol entfernt, und der Rückstand wird unter Vakuum getrocknet, um einen hellen Festkörper zu ergeben. Der helle Festkörper wird in 30 ml Hexamethylphosphoramid suspendiert, und 9,4 ml Tetramethylzinn und 40 mg PhCH&sub2;Pd(PPh&sub3;)&sub2;Cl werden dazugegeben. Die Reaktionsmischung wird 4 Stunden bei 65ºC erwärmt. Zusätzliche 2 ml Tetramethylzinn werden am Ende dieses Zeitraums hinzugefügt, und die Reaktionsmischung wird bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Hach Verdünnen mit Wasser und Extraktion mit Ethylacetat wird die Ethylacetatschicht mit Wasser, 5%igem Natriumbicarbonat, Wasser, 5%igem Natriumbisulfat, Wasser und gesättigtem Natriumchlorid gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Die Lösung wird filtriert und konzentriert, um 16 g gelbes Öl zu ergeben, welches unter Verwendung von Ethylacetat/Hexan (4/6) als Elutionsmittel durch eine Kieselgelsäule geschickt wird. Konzentrieren der geeigneten Fraktionen ergibt 15 g eines hellgelben Öls, das aus Ethylacetat/Hexan umkristallisiert wird, um 14,3 g (S)-3-(Benzyloxycarbonyl)-4-(3-oxobutyl)-5-oxazolidinon als weißen Festkörper (74% Ausbeute) mit einem Fp. von 64-65ºC, [α]25/D = +102º (C = 1,1, CH&sub2;Cl&sub2;) zu erzeugen.
Anal.: Berechn. für C&sub1;&sub8;H&sub1;&sub7;NO&sub5;:
C, 61,85; H, 5,84; N, 4,81.
Gefunden: C, 61,54; H, 5,89; N, 4,84.
Durch Wiederholung des obigen Verfahrens auf ähnliche Weise und durch Ersatz des Tetramethylzinns durch ein stöchiometrisches Äquivalent des geeigneten Tetraalkylzinns werden die folgenden Verbindungen hergestellt:

(a) Mit Tetraethylzinn:

(S)-3-(Benzyloxycarbonyl)-4-(3-oxopentyl)-5-oxazolidinon mit Fp. 45-46ºC; [α]25/D= 82,5º (C 0,7, CH&sub3;OH).
Anal.: Berechn. für C&sub1;&sub6;H&sub1;&sub9;NO&sub5;(305,336):
C, 62,94; H, 6,37; N, 4,59.
Gefunden: C, 63,02; H, 6,15; N, 4,48.

(b) Mit Tetrabutylzinn:

(S)-3-(Benzyloxycarbonyl)-4-(-3oxoheptyl)-5-oxazolidinon als Öl; [α]25/D 67,9º (C 0,12, CH&sub3;OH).
Anal.: Berechn. für C&sub1;&sub8;H&sub2;&sub3;NO&sub5; EtOAc(421,494):
C, 62,69; H, 7,41; N, 3,32.
Gefunden: C, 62,50; H, 7,29; N, 3,39.
10 g des (S)-3-(Benzyloxycarbonyl)-4(3-oxobutyl)-5-oxazolidinons aus Beispiel 4 werden in 480 ml destilliertem Tetrahydrofuran, gefolgt von 160 ml Ammoniak, bei 0ºC gelöst. Die Reaktionsmischung wird 5 Stunden bei 0º, dann über Nacht bei Umgebungstemperatur gerührt. Nach Abziehen des Lösungsmittels unter Vakuum bis zur Trockne liefert die Reaktionsmischung einen weißen Festkörper, der aus heißem Ethylacetat umkristallisiert wird, um 8,8 g (S)-2-(Benzyloxycarbonylamino)-5-oxo-hexanamid als weißen Festkörper (82% Ausbeute), Fp. 142- 144º, zu ergeben;
[α]25/D = -4,0º (C 0,4, CH&sub3;OH).
Anal.: Berechn. für C&sub7;H&sub9;NO&sub2;:
C, 60,4; H, 6,4; N, 10,0.
Gefunden: C, 60,44; H, 6,53; N, 10,05.
Durch Wiederholen des obigen Verfahrens auf ähnliche Weise und Einsetzen eines stöchiometrischen Äquivalents der entsprechenden Zwischenprodukte aus dem vorvorhergehenden Absatz werden die folgenden Verbindungen hergestellt:
(S)-2-Benzyloxycarbonylamino-5-oxoheptanamid mit Fp. 133-135ºC; [α]25/D -4,17º (C 0,8, CH&sub3;OH).
Anal.: Berechn. für C&sub1;&sub5;H&sub2;&sub0;N&sub2;O&sub4; (292,341)
C, 61,63; H, 6,90; N, 9,58.
Gefunden: C, 61,51; H, 6,75; N, 9,16.
(S)-2-Benzyloxycarbonylamino-5-oxo-nonamid mit Fp. 162-163ºC; [α]25/D -4,32º (C 0,6, CH&sub3;OH).
Anal.: Berechn. für C&sub1;&sub7;H&sub2;&sub4;N&sub2;O&sub4; (320,395):
C, 63,73; H, 7,55; N, 8,74.
C, 63,62; H, 7,56; N, 8,82.
Zu einer Lösung von 2,8 g (S)-2-Benzyloxycarbonylamino-5-oxohexanamid aus dem vorangehenden Absatz in einer Mischung von 60 ml Methanol und 7,5 ml Eisessig werden unter Stickstoff 1,5 g Palladiumdiacetat gegeben. Diese Reaktionsmischung wird 4 Stunden unter Atmosphärendruck hydriert, zu welcher Zeit eine Dünnschichtchromatographie-Analyse zeigt, daß die Reaktion beendet war. Die Reaktionsmischung wird dann durch Celite filtriert und mit Methanol gewaschen. Die Reaktionsmischung und die Waschlösungen werden zur Trockne konzentriert, um 1,7 g gelbes Öl zu ergeben, welches mit 1 ml einer Mischung von Chlorwasserstoffsäure und Ethylacetat behandelt wird, um das Hydrochloridsalz zu erzeugen. Dieses Öl wird mit Methanol/ Ethylether digeriert, um 1,3 g gelben Festkörper zu erzeugen; Fp. 174-176ºC; [α]25/D = -33º (C 0,96, CH&sub3;OH). Der gelbe Festkörper aus (S)-cis- 5-Methylprolinamid (als Hydrochloridsalz) wird durch eine Bio-Rex 70-Säule (ein schwach saures Carbonsäure-Zonenaustauscherharz) unter Eluieren mit zuerst 300 ml Wasser, gefolgt von einer 1%-igen Lösung von Ammoniumhydroxid, geschickt. Konzentrieren der geeigneten Fraktionen ergibt 0,9 g gelben Festkörper, der aus Methylenchlorid umkristallisiert wird, um 0,64 g (S)-cis-S-Methylprolinamin als gelben Festkörper (50% Ausbeute); Fp. 55-56ºC, zu ergeben.
Durch Wiederholung des obigen Verfahrens auf ähnliche Weise und Einsetzen eines stöchiometrischen Äquivalents des entsprechenden Zwischenprodukts werden nach Reduktion die folgenden Verbindungen hergestellt:
(S)-cis-5-Ethylprolinamid, Fp. 63-65ºC; und
(S)-cis-5-Butylprolinamid, Fp. 74-75ºC.

HERSTELLUNG 5

4,9 g Boc-Glycin wurden in einer Mischung von 50 ml Ethanol und 50 ml destilliertem Wasser gelöst. Der pH der Lösung wurde mit wäßrigem Cäsiumbicarbonat auf 7 gebracht. Das Lösungsmittel wurde dann unter Vakuum entfernt.
Hach 18 Stunden Trocknen unter Hochvakuum wurde der Rückstand in 150 ml trockenem DMF gelöst. 25 g chlormethyliertes Polystyrol - 1% Divinylbenzol (Merrifield)-Harz (entsprechend 25 mmol Chlorid) wurden dazugegeben. Die Mischung wurde 24 Stunden bei 50ºC geschüttelt, filtriert, und das Harz wurde dann nacheinander mit DMF, Wasser und Ethanol gewaschen. Das Harz wurde 3 Tage unter Vakuum getrocknet, um 28,34 g Boc-Gly-O-Harz zu liefern.

BEISPIEL 1

In das Reaktionsgefäß eines Beckman 990-Peptide Synthesizer wurden 0,5 g (0,5 mmol) Benzhydrylaminharz (Beckman) gegeben. Aminosäuren wurden mittels eines Syntheseprogramms wie folgt nacheinander zu diesem Harz hinzugefügt: Stufe CH&sub2;Cl&sub2;-Wäsche 50% CF&sub3;CO&sub2;H/CH&sub2;Cl&sub2;-Schutzgruppenentfernung 10% Triethylamin/CH&sub2;Cl&sub2; Nα-Boc-Aminosäure-Lösung N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid-Lösung CH&sub2;Cl&sub2;-Spülung und Halten-Kupplung CH&sub2;Cl&sub2;-Spülungszugabe Ethanol-Wäsche 1 mal 1,5 Min. Zugabe Kupplungsreaktion
Die Stufen 1-13 vollenden einen Kupplungszyklus für eine Aminosäure, und die Vollständigkeit der Reaktion wird durch das Ninhydrin-Verfahren von E. Kaiser et al., Anal. Biochem., 34, 595 (1970) überprüft.
Das Harz wurde nacheinander mit einem 2,0- bis 2,5-fachen Überschuß jeder geschützten Aminosäure und DCC mit oder ohne Zugaben, wie z. B. 1-Hydroxybenzotriazol (HBT) gekuppelt. Dementsprechend wurde das Harz während aufeinanderfolgender Kupplungszyklen mit 0,237 g Boc-D-Ala-OH und 0,155 g BTH
0,269 g Boc-Pro-OH,
0,536 g Boc-Arg(Tos)-OH,
0,312 g Boc-Leu-OH·H&sub2;O,
0,488 g Boc-D-FDeh-OH·HCl und 0,155 t BTH,
0,44 g Boc-Tyr(2,6-dichlorbenzyl)-OH und 0,155 g BTH,
0,375 g Boc-Ser(Benzyl)-OH,
0,380 g Boc-D-Trp-OH,
0,375 g Boc-D-p-Cl-Phe-OH und 0,155 g BTH,
0,275 g Boc-D-Hal(2)-OH und 0,155 g BTH und
2,0 ml Essigsäureanhydrid
behandelt.
Das Harz wurde aus dem Reaktionsgefäß entfernt, mit CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen und im Vakuum getrocknet, um 1,6 g geschütztes Polypeptidharz zu liefern. Das geschützte Peptid wurde durch Behandlung mit 25 ml wasserfreiem flüssigen HF in Gegenwart von 3,2 ml Anisol (Abfänger) in einem Kel-F-Reaktionsgefäß bei 0ºC über 1 Stunde vom Harz entfernt und von den Schutzgruppen befreit. Das HF wurde unter Vakuum verdampft, und der Rückstand aus N-Ac-D-Hal (2) -D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-FDeh- Leu-Arg-Pro-D-AlaNH&sub2; als sein HF-Salz wurde mit Ether gewaschen. Der Rückstand wurde dann mit Eisessig extrahiert. Der Essigsäureextrakt wurde lyophilisiert, um das Rohmaterial zu liefern.
Das Rohmaterial wurde durch Schicken in Wasser über eine Säule von AG3X (ein schwach basisches tertiäres Aminharz), das in seine Acetatform überführt worden war, in das Acetatsalz überführt. Lyophilisieren des Eluats lieferte 0,6 g des rohen Peptidacetatsalz als weißen Festkörper.
Das rohe Peptid wurde durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie an einer 2,5·100 cm-Säule aus Licroprep Rp-18 (25-40 um), die zum Laufpuffer 55% CH&sub3;CH/45%H&sub2;O (0,06 M in NH&sub4;OAc, pH 7) äquilibriert war, gereinigt. Die Haupt- UV-Absorptions(280 nm)-Bande, die bei ungefähr 4 Säulenvolumen eluiert wurde, wurde gesammelt, zur Trockne konzentriert und 3 mal aus destilliertem Wasser lyophilisiert, um 124 mg reines N-Ac-D-Hal(2)-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-FDeh- Leu-Arg-Pro-D-AlaNH&sub2;, [α]22/D = -15,4º (C 0,5, HOAc) zu liefern.
Auf ähnliche Weise verfahrend, aber unter Einsetzen der geeigneten A-, B-, C-, E-, G- oder F-Aminosäure anstelle der aufgeführten werden die entsprechenden D-AlaNH&sub2;-Decapeptide hergestellt.

BEISPIEL 2

Für die Synthese von Analoga mit einem C-terminalen Pro-NHCH&sub2;CH&sub3;wurde ein mit dem in Beispiel 1 beschriebenen identisches Syntheseprogramm verwendet. Das Beckman 990-Synthesizer-Reaktionsgefäß wurde mit 2,13 g Boc-Pro-O-Harz, hergestellt durch die Reaktion von äquimolaren Verhältnissen des trockenen Cäsiumsalzes von Boc-Pro-OH mit Chlormethylpolystyrol/1% Divinylbenzol (Lab Systems, Inc.), beladen. Die vom Boc-Pro-O-Harz genommene Menge enthielt 1,4 mmol Prolin.
Das Harz wurde nacheinander mit einem 2,0- bis 2,5-fachen Überschuß jeder geschützten Aminosäure und DCC gekuppelt. Dementsprechend wurde das Harz während aufeinanderfolgender Kupplungszyklen mit
1,49 g Boc-Arg(Tos)-OH,
0,87 g Boc-Leu-OH H&sub2;O,
1,34 g Boc-FDeh,
0,38 g HBT,
1,23 g N-Boc-0-2,6-Dichlorbenzyl-L-tyrosin und
0,38 g HBT,
1,03 g Boc-Ser(Benzyl)-OH,
1,07 g Boc-D-Trp-OH,
1,05 g Boc-D-p-Cl-Phe-OH
1,10 g Boc-D-Hal(2)-OH und
2 ml Essigsäureanhydrid
umgesetzt.
Das Harz wurde aus dem Reaktionsgefäß entfernt, mit CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen und im Vakuum getrocknet, um das geschützte Polypeptidharz zu liefern.
Das geschützte Polypeptid wurde durch Aminolyse mit 50 ml Ethylamin über 18 Stunden bei 2ºC vom Harz abgespalten. Man ließ das Ethylamin verdampfen, und das Harz wurde mit Methanol extrahiert. Das Methanol wurde verdampft, um das geschützte Peptidethylamid zu liefern. Das Peptid wurde durch Behandeln des Rückstands mit 3 ml Anisol und 30 ml redestilliertem (über CoF&sub3;) wasserfreiem flüssigen HF bei 0ºC über 30 Minuten in einem Kel-F-Reaktionsgefäß von den Schutzgruppen befreit. Das HF wurde unter Vakuum verdampft, und der Rückstand wurde mit Ether gewaschen. Der Rückstand wurde in 2M Essigsäure gelöst und lyophilisiert, um 0,82 g rohes N-Ac-D-Hal(2)-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-FDeh- Leu-Arg-Pro-NHEt als sein Essigsäuresalz zu liefern.
Die Endreinigung wurde durch präparative Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie einer 200 mg-Probe an einer 2,5·100 cm-Säule von octadecylsilyliertem Siliciumdioxid (Merck, Lichroprep C&sub1;&sub8; 40 u unter Verwendung von 55% CH&sub3;CH/- 45% H&sub2;O als Elutionsmittel, das 0,06 M bezüglich NH&sub4;OAc war (pH 7), erzielt.

BEISPIEL 3

Verbindungen der Formel I, worin H -NH-CONH&sub2; ist, können durch klassische Lösungssynthese hergestellt werden.
Zum Beispiel kann das folgende Verfahren, worin "AzaGlyNH&sub2;" -NH-NH-CONH&sub2; ist, verwendet werden, um das Peptid als das freie Peptid oder Salz herzustellen.
Das Kuppeln der einzelnen Fragmente kann durch das Acylazid-Verfahren (J. Honzel et al., Coll. Czech. Chem. Comm., 26, 2333 (1971)), durch DCC/HBT-Kuppeln oder andere racemisierungsfreie Fragmentkupplungsverfahren vonstatten gehen. Die Verbindung (2) ist bekannt: A.S. Dutta et al., J. Chem. Soc. Perkin I, 1979, 379, und die Verbindung (1) kann durch zu jenen in Beispiel 1 analogen Verfahren hergestellt werden. Die Verbindung (3) wird durch Entfernen des Cbz und der Nitrogruppen durch Hydrogenolyse, gefolgt vom Kuppeln mit N-Boc-FDeh unter Verwendung von DCC/HBT oder einem anderen im Stand der Technik bekannten Kupplungsmittel hergestellt. Siehe Dutta et al., oben, bezüglich einer ähnlichen LHRH-Analogon-Synthese.
Oft sind die auf diesem Weg gekuppelten Fragmente Peptide oder Aminosäuren. Alternativ kann die N-terminale Nonapeptidsäure durch das Festphasen- oder Lösungsverfahren hergestellt werden und anschließend durch das Dicyclohexylcarbodiimidhydroxybenzotriazol- oder ein anderes Kupplungsverfahren an Semicarbazid-HCl gekuppelt werden.

BEISPIEL 4

A. Eine Lösung von 0,1 g des Fluorwasserstoffsalzes von N-Ac-D-Hal(2)- D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-FDeh-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH&sub2; (siehe Beispiel 1) wird in 50 ml Wasser gelöst und durch eine Säule von 50 g Dowex 3-Anionenaustauscherharz, die vorher mit Essigsäure äquilibriert und mit entionisiertem Wasser gewaschen worden war, geschickt. Die Säule wird mit entionisiertem Wasser eluiert, und das Eluat wird lyophilisiert, um das entsprechende Essigsäuresalz zu liefern.
Durch Wiederholen des obigen, wobei andere Säuren anstelle von Essigsäure während der Äquilibrierung des Harzes eingesetzt werden, können z. B. die entsprechenden Salze mit Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure, Benzoesäure und dgl. erhalten werden.
Auf ähnliche Weise können die Säureadditionssalze der anderen zu LHRH analogen, hierin beschriebenen Peptide hergestellt werden.
B. Im Fall von Salzen mit niedriger Wasserlöslichkeit können diese durch Ausfällen aus Wasser unter Verwendung der gewünschten Säure hergestellt werden. Zum Beispiel:
Zinktannatsalz - eine Lösung von 10 mg N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser- Tyr-D-FDeh-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH&sub2;-Essigsäuresalz in 0,1 ml Wasser wurde mit einer Lösung von 8 mg Gerbsäure in 0,08 ml 0,25 M NaOH behandelt. Eine Lösung von 5 mg ZnSO&sub4;-Heptahydrat in 0,1 ml Wasser wurde unmittelbar zu der Lösung des LHRH- Analogons gegeben.
Die resultierende Suspension wurde mit 1 ml Wasser verdünnt und der Niederschlag wurde zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert, und der Rückstand wurde 2 mal mit 1 ml-Portionen Wasser durch Zentrifugieren des Niederschlags und Dekantieren des Überstands gewaschen. Der Niederschlag wurde im Vakuum getrocknet, um 15 mg des gemischten Zinktannatsalzes des oben benannten LHRH-Analogons zu liefern.

BEISPIEL 5

Eine Lösung von 10 mg N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-FDeh-Leu- Arg-Pro-D-AlaNH&sub2; in 25 ml Wasser wird durch eine 50 g-Säule von Dowex 1 (stark basisches quartäres Ammonium-Anionenaustauscherharz), die mit NaOH-Lösung äquilibriert worden war, geschickt, um Hydroxid zum Gegenion zu machen. Die Säule wird mit 150 ml Wasser eluiert, und das Eluat wird lyophilisiert, um 45 mg des entsprechenden Polypeptids als freie Base zu liefern.
Auf ähnliche Weise können andere Säureadditionssalze von Verbindungen der Peptide hierin in die entsprechenden freien Basen überführt werden.

BEISPIEL 6

Biologische Wirkung

Die nützliche Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen wird durch die folgenden Ergebnisse, die im Standard-Ovulationstest von A. Corbin und C. W. Beattie, Endocr. Res. Commun., Band 2, Seite 1, 1975 erhalten wurden, erläutert. Verbindungsstruktur Proöstrus Diöstrus Propylenglykol/Kochsalzlösung Maisöl
IN DEN OBEN AUFGEFÜHRTEN TESTS WURDEN KEINE TOXISCHEN WIRKUNGEN BEOBACHTET.

Claims

1. Verbindung der Formel

und die pharmazeutisch annehmbaren Salze davon, worin:

A einen aus N-Ac-D,L-Δ3,4-Prolyl, N-Ac-D,L-Prolyl,

N-Ac-L-Alkylprolyl, N-Ac-D,L-Phenylalanyl,

N-Ac-D,L-p-Cl-Phenylalanyl, N-Ac-D,L-Seryl,

N-Ac-D,L-Threonyl, N-Ac-D,L-Alanyl,

N-Ac-3-(1-Naphthyl)-D,L-alanyl,

N-Ac-3-(2-Naphthyl)-D,L-alanyl,

N-Ac-3-(2,4,6-Trimethylphenyl)-D,L-alanyl und

N-Ac-3-(4-Trifluormethylphenyl)-D,L-alanyl

ausgewählten Aminoacylrest darstellt;

B einen aus D-Phenylalanyl, D-p-Cl-Phenylalanyl, D-p-Br-Phenylalanyl, D-p-F-Phenylalanyl, D-p-Nitrophenylalanyl, 3-(3,4,5-Trimethoxyphenyl)- D-alanyl, 2,2-Diphenylglycin, D-α-Methyl-p-Clphenylalanyl und 3-(2,4,6-Trimethylphenyl)-D-alanyl ausgewählten Aminoacylrest darstellt;

C einen aus D-Tryptophanyl, D-Phenylalanyl, D-Pentamethyl-phenylalanyl, 3-(3-Pyridyl)-D-alanyl, 3-(1-Naphthyl)-D-alanyl und 3-(2-Naphthyl)-D-alanyl ausgewählten Aminoacylrest darstellt;

D einen aus L-Seryl und D-Alanyl ausgewählten Aminoacylrest darstellt;

E einen aus L-Phenylalanyl und L-Tyrosyl ausgewählten Aminoacylrest darstellt;

F einen aus den Resten, die durch die folgenden Strukturformeln dargestellt werden:

worin n 1 bis 5 ist; R&sub1; Halogenniederalkyl ist; R&sub2; Wasserstoff, Methyl oder Ethyl ist; R&sub3; R&sub1;, Methyl, Ethyl oder -CH&sub2;CH&sub2;OH ist; ausgewählten Aminoacylrest darstellt;

G einen aus L-Leucyl, L-Norleucyl, L-Tryptophanyl, L- Nal(2) und L-Norvalyl ausgewählten Aminoacylrest darstellt;

H D-Alaninamid, D-Leucinamid, Glycinamid oder -NHR&sub5; darstellt, worin R&sub5; Niederalkyl oder NHCONH&sub2; ist;

oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.

2. Verbindung der Formel

und die pharmazeutisch annehmbaren Salze davon, worin:

A einen aus N-Ac-D,L-43,4-Prolyl, N-Ac-D,L-Prolyl, N-Ac-L-Alkylprolyl, N-Ac-D,L-Phenylalanyl, N-Ac-D,L-p-Cl-Phenylalanyl, N-Ac-D,L-Seryl, N-Ac-D,L-Threonyl, N-Ac-D,L-Alanyl, 3-(1-Naphthyl)-D,L-alanyl, 3-(2-Naphthyl)-D,L-alanyl, 3-(2,4,6-Trimethylphenyl)-D,L-alanyl und 3-(4-Trifluormethylphenyl)-D,L-alanyl ausgewählten Aminoacylrest darstellt;

B einen aus D-Phenylalanyl, D-p-Cl-Phenylalanyl, D-p-Br-Phenylalanyl, D-p-F-Phenylalanyl, D-p- Nitrophenylalanyl, 3-(3,4,5-Trimethoxyphenyl)- D-alanyl, 2,2-Diphenylglycin, D-α-Methyl-p-Clphenylalanyl und 3-(2,4,6-Trimethylphenyl)-D-alanyl ausgewählten Aminoacylrest darstellt;

D einen aus L-Seryl und D-Alanyl ausgewählten Aminoacylrest darstellt;

E einen aus L-Phenylalanyl und L-Tyrosyl ausgewählten Aminoacylrest darstellt;

F ein Aminoacyl ist, das aus den Resten ausgewählt ist, die durch die folgenden Strukturformeln dargestellt werden:

worin n 1 bis 5 ist; R&sub1; Halogenniederalkyl ist; R&sub2; Wasserstoff, Methyl oder Ethyl ist; R&sub3; R&sub1;, Methyl, Ethyl oder -CH&sub2; CH&sub2; OH ist;

oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.

3. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, worin n 3 oder 4 ist.

4. Verbindung nach Anspruch 3, die N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl- Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-FDeh-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH&sub2; oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon ist.

5. Verbindung nach Anspruch 3, die N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl- Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-FDeh-Trp-Arg-Pro-D-AlaNH&sub2; oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon ist.

6. Verbindung nach Anspruch 3, die N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl- Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-FDeh-Nal(2)-Arg-Pro-D-AlaNH&sub2; oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon ist.

7. Verbindung nach Anspruch 3, die N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl- Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-mPfh-Nal(2)-Arg-Pro-D-AlaNH&sub2; oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon ist.

8. Verbindung nach Anspruch 3, die N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl- Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-mPfh-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH&sub2; oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon ist.

9. Verbindung nach Anspruch 3, die N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl- Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-FDeh-L-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH&sub2; oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon ist.

10. Verbindung nach Anspruch 3, die N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl- Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-FDeh-L-Trp-Arg-Pro-D-AlaNH&sub2; oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon ist.

11. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung von irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10 in einer Mischung mit mindestens einem pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoff.

12. Verbindung nach den Ansprüchen 1 bis 10 zur Verwendung als LHRH-Antagonist.

13. Verwendung einer Verbindung gemäß den Ansprüchen 1 bis 10 zur Herstellung eines Medikaments, das LHRH- antagonistische Wirkung aufweist.

14. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß Anspruch 1 oder 2, umfassend

das Entfernen von Schutzgruppen und gegebenenfalls eines kovalent gebundenen festen Trägers von einem geschützten Polypeptid, um eine Verbindung der Formel (I) oder ein Salz davon zu liefern; oder das Zusammenkuppeln von zwei Fragmenten der gewünschten Verbindung der Formel (I) in der erforderlichen Sequenz; oder

(a) das Überführen einer Verbindung der Formel (I) in ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder

(b) das Überführen eines Salzes einer Verbindung der Formel (I) in ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder

(c) das Überführen eines Salzes einer Verbindung der Formel (I) in ein freies Polypeptid der Formel (I).

15. Verbindung der Formel (II):

worin n 1 bis 5 ist; R&sub1; Halogenniederalkyl ist; R&sub2; Wasserstoff, Methyl oder Ethyl ist; R&sub3; R&sub1;, Methyl, Ethyl oder -CH&sub2;CH&sub2;OH ist.