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Polypeptide und Verwendung derselben
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Beschreibung Sowohl die theoretische Aussicht einer Überbevölkerung
als auch moderne wirtschaftliche Erfordernisse zeigen gelegentlich einen Bedarf
nach einer geeigneten Geburtenkontrolle auf. Zur Geburtenkontrolle bedient man sich
immer mehr chemischer Maßnahmen einschließlich der Verwendung von Steroiden, Antisteroiden,
Polypeptiden, Antikörpern und Proteinen sowie von Verbindungen, die die Freigabe
oder Synthese des Gelbkörperhormons (luteinizing hormone), das auch als Lutropin
(LH) bezeichnet wird, blockieren.
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Von zahlreichen Polypeptiden ist es bekannt, daß sie empfängnisverhütende
Eigenschaften aufweisen. So ist beispielsweise aus der US-PS 4 016 259 ein als empfängnisverhUtendes
Mittel verwendbares Tetrapeptid der Modifizierungen unter worfenen grundlegenden
Aminosäuresequenz bekannt: Thr-Pro-Arg-Lys. Aus den US-PS 3 855 199, 3 886 135,
3 886 137, 3 928 307, 3 937 695, 3 940 380 und 3 941 763 sind Polypeptide bekannt,
die entweder bei Säugetieren eine den Eisprung verhindernde Aktivität aufweisen
oder die LaH- (Lutropin-) Freigabe inhibieren. Diese Polypeptide besitzen die grundlegende
Aminosäuresequenz p-Glu-D-Phe-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2, , wobei in
den Aminosäuresequenzen Substitutionen bzw. Weglassungen erfolgen. Aus der US-PS
3 915 947 ist eine empfängnisverhtltende Verbindung der Sequenz L-Prroglu-L-Tp-L-Ser-L-Tyr-D-Ala-L-Leu-L-Arg-L-Pro-NHCH2CH3
bekannt.
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Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, preisgUnstig und in großen
Mengen noch stärker wirksame Verbindungen mit minimalen Nebenwirkungen an die Hand
zu geben.
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Die Erfindung umfaßt eine Reihe von durch Festphasen-Peptidsyntheseverfahren
hergestellten Polypeptiden. Diese Polypeptide unterscheiden sich in struktureller
Hinsicht von sämtlichen bekannten empfängnisverhütenden Polypeptiden. Die erfindungsgemäßen
Polypeptide blockieren die Wirkung von Humanchoriogonadotropin <hCG) und LH in
den ersten Tagen der Schwangerschaft, indem sie erfolgreich mit diesen natUrlichen
Hormonen in den Rezeptorzellen im Ovarium (ovary) konkurrieren. Weiterhin besitzen
diese Verbindungen die Kraft, die hCG-Wirkung zu einem beliebigen Zeitpunkt im ersten
Trimester der Schwangerschaft zu blockieren und ferner die LH-Wirkung auf die Samen
(tests) zu inhibieren.
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Folglich unterscheiden sich die mit den natürlichen Hormonen konkurrierenden
erfindungsgemäßen Verbindungen in ihrem Wirkungsmechanismus von den bekannten Polypeptiden,
die die Freigabe oder Synthese von LH blockieren.
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Da die synthetischen Peptide erfolgreich mit den natUrlichen Hormonen
LH und hCG in den Rezeptorzellen in den Ei-und Samenzellen (ovaries and testes)
unter Blockierung ihrer stimulierenden Wirkung konkurrieren, eignen sie sich zum
Zwecke einer Empfängnisverhütung. Wenn sie beispielsweise an nicht-sochwangere Frauen
während des Oestrus oder Menstruationszyklus verabreicht werden, beendigen die betreffenden
Verbindungen den Zyklus durch Blockieren der W-Wirkung. Wenn andererseits die betreffenden
Verbindungen zu einem frühen Schwangerschaftszeitpunkt oder am Ende des Menstruationszyklus
gegeben werden, blockieren sie die Wirkung des von den Chorionzellen des betruchteten
Eis kommenden Gonadotropin-hCGs und verhindern entweder eine Implantation oder beendigen
die Schwangerschaft, wenn sich das Ei von selbst in den Uterus implantiert hat.
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Gegenstand der Erfindung sind durch Festphasen-Peptidsynthese herstellbare
und die genannten Eigenschaften aufweisende Polypeptide der Formel R1 -R2-R3, worin
bedeuten: R1 D-Ser-Arg, Ser-Arg oder -Arg; R2 Tyr-Cly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys, Ala-Tyr-Pro-Thr-fro-Ala-Arg-Ser-Lys,
Tyr-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys Lys, Tyr-Gly-Lys-Pro-Val-Arg-Ser-Lys, Tyr-Gly-Pro,
Tyr-Gly-Pro-Val-Gly, Val-Leu-Pro, Val-Leu-Val-Gly Ala-Tyr-Pro, Leu-Pro-Gly-Pro,
Val-Leu-Gln-Gly, Ala-Tyr-Pro-Arg-Leu-Pro-Gly, Ala-Tyr-Pro-Arg-Val-Leu-Gln-Gly oder
Ala- Tyr-Pro -Arg-Val -Leu-Pro und R3 Val-NH2, -Val, Lys-NH2, -Lys, -Thr, r-NH2,
-Ser, Ser-NH2, -Pro oder -Pro-NH2, und deren pharmakologisch akzeptable Salze.
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Besonders vorteilhafte Polypeptide der angegebenen Formel sind Verbindungen
der Sequenz R1-Tyr-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-R4, worin R1 die angegebene Bedeutung
besitzt und R4 -Val-NH2 oder -Val bedeutet, Verbindungen der Sequenz R1-Ala-Tyr-Pro-Thr-Pro-Ala-Arg-Ser-Lys-R5,
worin R1 die angegebene Bedeutung besitzt und R5 -Lys-NH2 oder -Lys bedeutet, Verbindungen
der Sequenz R1-Tyr-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-R5, worin R1 und R5 die angegebene
Bedeutung besitzen, Verbindungen der Sequenz R1 -Tyr-Gly-Lys-Pro-Val-Arg-Ser-Lys-R5,
worin R1 und R5 die angegebene Bedeutung besitzen, Verbindungen der Sequenz R1 -Tyr-Gly-R6,
worin R1 die angegebene Bedeutung besitzt und R6 Pro-R4 oder Pro-Val-Gly-R4 mit
R4 in der angegebenen Bedeutung darstellt, Verbindungen der Sequenz R1-Val-Leu-Val-Gly-R4,
worin R1 und R4 die angegebene Bedeutung besitzen, Verbindungen
der
Sequenz R1-Leu-Pro-Gly-Pro-R7, worin R1 die angegebene Bedeutung besitzt und R7
Ser-NH2 oder -Ser bedeutet, Verbindungen der Sequenz R1-Val-Leu-Gln-Gly-R4, worin
R1 und R4 die angegebene Bedeutung besitzen, Verbindungen der Sequenz R1-Ala-Tyr-Pro-Arg-Leu-Pro-Gly-,
worin R1 die angegebene Bedeutung besitzt und R8 Pro NH2 oder -Pro bedeutet, Verbindungen
der Sequenz R1 R1-Ala-Tyr-Pro-Arg-Val-Leu-Gln-Gly-R4, worin R1 und R4 die angegebene
Bedeutung besitzen, Verbindungen der Sequenz R1-Ala-Tyr-Pro-Arg-Val-Leu-Pro-R4,
worin R1 und R4 die angegebene Bedeutung besitzen, und Verbindungen der Sequenz
R1-Ala-Tyr-Pro- worin R1 die angegebene Bedeutung besitzt und R9 -Thr oder Thr-NH2
bedeutet, sowie die pharmakologisch akzeptablen Salze dieser Pblypeptide.
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Insbesondere wurden folgende Polypeptide synthetisiert: D-Ser-Arg-Tyr-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys
-Lys -Val -NH , D-Ser-Arg-Ala-Tyr-Pro- mr-Pro-Ala-Arg-Sbr-Lys-Lys- , D-Ser-Arg-Tyr-Gly-Lys-Pro-Val-Oly-Lye-Lys-Lys-Lys-NH2
D-Ser-Arg-Tyr-Gly-Lys-Pro-Val-Arg-Ser-Lys-Lys-N, D-Ser-Arg-Tyr-Gly-Pro-Val-NH2,
D-Ser-Arg-Tyr-Gly- Pro -Val -Gly-Val-NH2 und D-Ser-Arg-Val-Leu-Pro-Val-NH2.
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Ein Vorteil der erfindungsgemäßen Peptide ist, daß sie in Farm pharmakologisch
akzeptabler Salze verabreicht werden kennen. Diese Salze besitzen In vorteilhafter
Weise eine erhöhte Wasserlöslichkeit und eignen sich besonders gut zur parenteralen
Verabreichung . Beispiele fUr solche Salze sind die Natrium-, Kalium oder Kalziumsalze
oder die acetate und Chloride.
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Wegen der unbekannten Faltung der dreidimensionalen Strukturen der
kugelförmigen Modelle von LH und hCG ist das aktive Zentrum dieser Hormone unbekannt.
Weiterhin wird ihr Wirkungsmechanismus noch diskutiert. Vermutlich ähnelt die Struktur
sequenz der erfindungsgemäßen Polypeptide zu einem merklichen Teil dem aktiven Zentrum
der Hormone @H und hCG. Dies gilt insbesondere SUr die Sequenz Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Ser,
die den AA-Resten 132 bis 138 in der ß-Untereinheit des hCG's entspricht, für die
Sequenz Arg-Val-Leu-Gln-Gly-Val-NH2, die den AA-Reston 43 bis 48 in
der
ß-Untereinheit des hCG's entspricht, und die Sequenz Arg-Val-Leu-Pro-Val, die den
AA-Resten 43 bis 47 in der ß-Untereinheit des LH's entspricht. Die Sequenz Ser-Arg-Ala-Tyr-Pro-Thr
entspricht den AA-Resten 38 bis 43 in der a-Untereinheit des lH's. Die Sequenz Ser-Arg-Ala-Tyr-Pro
entspricht den AA-Resten 34 bis 38 in der a-Untereinheit des hCG's. Es erscheint
wahrscheinlich, daß diese Sequenzen in der a- und ß-thitereinheit des LH's und hCG's
in dem aktiven Zentrum der Hormone beteiligt sind.
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Folglich dürften die folgenden Verbindungen die geschilderten Eigenschaften
und eipfängnisverhUtenden Wirkungen entfalten: D-Ser-Arg-Val-Leu-Gln-Gly-Val-NH2
und deren pharmakologisch akzeptable Salze, D-Ser-Arg-Ala-Tyr-Pro-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-NH2
und deren pharmakologisch akzeptable Salze, D-Ser-Arg-Ala-Tyr-Pro-Arg-Val-Leu-Gln-Gly-Val-
und deren pharmakologisch akzeptable Salze, D-Ser-Arg-Ala-Tyr-Pro-Arg-Val-Leu-Pro-Val-NH2
und deren pharmakologisch akzeptable Salze, D-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Ser-NH2 und
deren pharmakologisch akzeptable Salze, D-Ser-Arg-Val-Leu-Pro-Val-und deren pharmakologisch
akzeptable Salze und D-Ser-Arg-Ala-Tyr-Pro-Thr-NH2, und deren pharmakologisch akzeptable
Salze.
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Aus Vereinfachungsgründen werden fUr die Aminosäuren deren Standardabkürzungen
verwendet, nämlich: Ala - Alanin Arg = Arginin Gly P Glycin Gln = Glutamin Leu -
Leucin
Lys = Lysin Pro = Prolin Ser = Serin Thr = Threonin Tyr
= Tyrosin Val 8 Valin Sämtliche Aminosäuren besitzen in den angegebenen Formeln
ihre natürliche Konfiguration, ausgenommen in einigen Fällen Ser, was dann durch
D-Ser zum Ausdruck gebracht wird.
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Bei den synthetisierten Peptiden ist die endständige Aminosäure vorzugsweise
ein D-Ser-Isomeres anstelle der natürlichen Ser-Konfiguration, bei dem endständigen
Carboxylrest handelt es sich vorzugsweise um einen Amidrest. Diese beiden Strukturvariationen
senken die Abbaugeschwindigkeit durch proteolytische Enzyme, obwohl keine dieser
Strukturvariationen ein wesentliches Merkmal der Struktur ist.
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Die SUr eine Empfängnisverhütung wirksamste Verbindung ist das im
folgenden als F bezeichnete Polypeptid der Sequenz D-Ser-Arg-Tyr-Cly-Pro-Val-Gly-Val-NH2.
Die Spezifität dieser Aminosäuresequenz ergibt sich daraus, daß das Peptid D-Ser-Pro-Val-Gly-Val-NH,
ohne die Arg-Tyr-Gly-Aminosäuresequenz hinsichtlich einer Inhibierung der hCG- oder
IJI-Wirkung relativ unwirksam ist. Vermutlich stellt das Synthesepeptid D-Ser-Arg-Tyr-Cly-Ru,
-Val-NH2 deshalb einen hCG-und LH-Inhibitor dar, weil es die Arg-Tyr-Gly-Aminosäuresequenz
enthält.
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Erfindungsgemäß ist eine große Zahl weiterer Modifizierungen und Aminosäuresubstitutionen
denkbar. Da die Stellen einer Einwirkung sämtlicher proteolytischer Enzyme bekannt
sind,
kann der Fachmann andere Aminosäuren, D-Isomere oder Modifikationen der Aminosäuren
einbauen, um das jeweilige Polypeptid gegenüber enzymatischer Spaltung widerstandsfähig
zu machen und um dessen Lebensdauer zu verlängern. Insbesondere fällt unter diesem
Gesichtspunkt auch das Peptid D-Ser-Arg-Val -Leu-Val-Gly-Val-NH2 unter die Erfindung.
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In den Verbindungen der Sequenz R1-Tyr-Gly-R6 kann beispielsweise
Tyr durch Ala, Val oder Leu ersetzt werden. Das Gly kann durch Tyr, Leu oder Pro
ersetzt werden. Ferner kann Val-NH2 durch Pro-NH2, Gly, -Thr oder Thr-NH2 ersetzt
werden. Beispiele für erfindungsgemäß denkbare Polypeptide sind somit D-Ser-Arg-Ala-Tyr-Pro-Thr
und deren pharmakolowisch akzeptable Salze sowie D-Ser-Arg-Val-Leu-Pro-Val-NH2 und
deren pharmakologisch akzeptable Salze.
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Die erfindungsgemäßen synthetischen Polypeptide der For"i R1 -R2-R3,
worin R1, R2 und R3 die angegebene Bedeutung besitzen, und deren pharmakologisch
akzeptable Salze eignen sich, wenn sie in das körpereigene System in wirksamer Menge
eingeführt werden, zur Verhinderung oder Beendigung einer Schwangerschaft bei Säugetieren
und Frauen. Weiterhin läßt sich bei Verwendung dieser erfindungagemäßen Polypeptide
oder von deren pharmakologisch akzeptablen Salzen auch eine zeitweilige Sterilität
bei Säugetieren und Frauen hervorrufen.
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Die erfindungsgemäßen Polypeptide eignen sich vermutlich deshalb zur
Verhinderung oder Beendigung einer Schwangerschaft bei Säugetieren und Frauen, weil
sie Antikörper gegen LH oder hCG erzeugen und auf diese Weise entweder einen LH-induzierten
Folikelsprung oder die Erhaltung der Schwangerschaft
durch hCG
inhibieren. Es existiert die Möglichkeit zur Erzeugung der Antikörper bei Menschen,
die tUr das hCG des frühen Schwangerschaftsstadiums spezifisch sind, ohne daß eine
Reaktion mit LH stattfindet oder der normale Menstruationezyklus gestört wird. So
können Frauen gegen Schwangerschaft geimpit werden, indem ihnen die erfindungsgemäßen
Verbindungen in einem geeigneten Hilfsmittel einmal alle 6 Monate oder einmal pro
Jahr zur Erhaltung des Antikörperspiegels verabreicht werden.
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Folglich betrifft die Erfindung auch die Verwendung der erfindungsgemäßen
Polypeptide der Formel R1-R2-R3, worin R1 R2 und R3 die angegebene Bedeutung besitzen,
oder von deren pharmakologisch akzeptablen Salzen zur Verhinderung oder Beendigung
einer Schwangerschaft durch Erzeugung von Antikörpern (bei Säugetieren oder Frauen)
gegen LH oder hCG durch Binden (der erfindungsgemäßen Polypeptide) an ein geeignetes
Hilfsmittel und Einfahren einer wirksamen Menge der erhaltenen Verbindung in das
körpereigene System.
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Maßnahmen zur Herbeifuhrung solcher Bindungen sind bekannt (vgl. 13
Contraception", 153 (1976)). Gesäß dieser Literaturstelle wurden bei Rhesusaffen
Antikörper gegen hCG und Tetanustoxoid erzeugt, indem eine an Tetanustoxoid gekuppelte
B-Untereinheit von hCG injiziert und Glutaraldehyd als Kupplungsmittel verwendet
wurde.
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Das Polypeptid E2 inhibiert auch ovarielle Glucose-6-phosphatdehydrogenase
und somit auch auf RNS basierende Synthesewege sowie die Biosynthese von Proteinen
und Steroide.
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Da die erfindungsgemäßen Verbindungen Inhibitoren für die stimulierende
Wirkung von LH und hCG darstellen, betrifft die Erfindung weiterhin die Verwendung
der erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel R1 -R2-R3, worin R1, R2 und R3 die
angegebene Bedeutung besitzen, oder von ihren pharmakologisch akzeptablen Salzen
zur Unterdrückung von Krebstumoren (bei Menschen), die durch Gonadotropine stimuliert
wurden oder die Gonadotropine abscheiden. Diesbezügliche Tumore sind beispielsweise
throphoblastische Tumore, Choriokarzinom und bestimmte Uterus-, Brust-, Eistock-,
Hoden-und Prostatatumore.
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Bei der diesbezüglichen Verwendung der erfindungsgemäßen Polypeptide
werden diese in wirksamer Menge in das körpereigene System des Patienten eingeführt.
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Da die erfindungsgemäßen Verbindungen auch zur Erzeugung von Antikörpern
gegen Gonadotropine bei an Krebs leidenden Patienten herangezogen werden können,
besteht die Erfindung schließlich auch noch in der Verwendung der erfindungsgemäßen
Polypeptide der Formel R1 -R2-R3, worin R1, R2 und R3 die angegebene Bedeutung besitzen,
oder von ihren pharmakologisch akzeptablen Salzen zur Erzeugung von Antikörpern
gegen Gonadotropine bei von Krebs befallenen Patienten, wobei die erfindungsgemäßen
Polypeptide kovalent an ein geeignetes Hilfsmittel gebunden werden und dann eine
wirksame Menge der 3eweils erhaltenen Verbindung in das körpereigene System des
Patienten eingeführt wird. Bezüglich der Bindung der Polypeptide an ein Hilfsmittel
vgl. 13 wContraception" 153 (1976).
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Zur Synthese von Polypeptiden aus Aminosäuren stehen zahlreiche Verfahren
zur Verfügung. Die Chemie und die Maßnahmen fUr die Festphasensynthese von Polypeptiden
aus Aminosäuren werden in den verschiedensten Literaturstellen beschrieben (vgl.
insbesondere Stuart & Young "Solid Phase Peptide Synthesis" (1968)). Die zur
Durchtuhrung dieser Synthesen benötigten Vorrichtungen, Aminosäuren und sonstigen
Chemikalien stehen im Handel zur VerfUgung.
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Die folgenden von der IUPAC-IUB-Kommission für die Biochemische Nomenklatur
vorgeschlagenen Abkürzungen werden verwendet (vgl. 241 "J. Biol. Chem." 241 (1966)
und 242 *J.
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Biol. Chem." 55 (1967)): Aoc tert. -Amyloxycarboxyl Boc tert. Butyloxycarboxyl
Bzl Benzyl CH2Cl2 Methylenchlorid C1-Z Chlorcarbobenzoxy DCC Dicyclohexylcarbodiimid
DCHA Dicyclohexylamin DMF Dimethyl formamid MeOH Methanol TBA tert. -Butylamin TEA
Triäthylamin TFA Trifluoressigsäure (wasserfrei) To s p- Toluolsulfonyl Z Carbobenzoxy
Eine "Aminosäure" wird durch u " abgekürzt.
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Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher voranschaulichen.
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Da, um einer enzymatischen Spaltung zu widerstehen, zweckmäßigerweise
ein C-endständiges Amid verwendet werden soll> wird bei der Festphasenpeptidsynthese
ein handelsUbliches Benzydrylamin-Harz (BHA) verwendet. Wenn andererseits eine endständige
freie Carboxylgruppe benötigt wird, kann ein anderes handelsUbliches Harz verwendet
werden.
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Beispiel 1 (Synthese von D-Ser-Arg-Tyr-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Val-NH2)
A. Kupplung der ersten Boc-AA an das BHA-Harz 3 g BHA-Harz werden in ein 50 ml fassendes,
aus Polypropylen bestehendes Reaktionsgefäß mit einer Filterscheibe gefüllt, worauf
75 ml einer 25 vol.-%igen Lösung von Triäthylamin (TEA) in CHzC12 zugegeben werden.
Nun wird das Ganze 10 min lang zur Freisetzung des freien Amins gerUhrt. Nach dem
Abziehen der TEA-Lösung wird das Harz 4-mal mit jeweils 20 ml CH2C12 gewaschen.
Danach werden 571 mg bzw. 2,5 Milliäquivalente (mÄq) pro g Harz Boc-Val in 5 ml
CH2C12 zugegeben, worauf das Ganze kurz gemischt wird. Das Kupplungsmittel DCC in
CH2C12 wird in einer zu Boc-Val äquimolaren Menge (2,5 mMol/g Harz) zugegeben, worauf
2 h lang gemischt wird. Nach dem Vermischen wird das Lösungsmittel abgezogen und
das Harz dreimal mit jeweils 20 ml CH2C12 gewaschen. Zur Beseitigung restlicher
Aminogruppen an dem Harz werden 75 ml 25%iger TEA-Lösung in CH2C12 zugegeben, worauf
10 min lang gemischt wird. Nach dem Abziehen der TEA-Lösung werden 10 Mol/Aminmol
Essigsäureanhydrid in CH2C12 zugegeben und 10 min lang eingemischt. Schließlich
wird dreimal mit Jeweils 20 ml CH2C12 gewaschen. Anschließend wird noch dreimal
mit jeweils 20 ml MeOH gewaschen.
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Nach beendetem Waschen werden die Lösungsmittel abgezogen und das
zurückbleibende Harz im Vakuum getrocknet. Ein Salze quoter Teil des Harzes wird
mit HC1 hydrolysiert. Eine AA-Analyse zeigt, daß an das Amin 0,35 mÄg Val gekuppelt
ist.
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B. Kunpplung der zweiten Aminosäure Lvs als Boc-Lvs (Cl-Z).TBA Die
Boc-Lys- (C1-Z-) Säure wird vor dem Kuppeln aus dem handelsüblichen TBA-Salz hergestellt,
indem 2 g des pulverisierten TBA-Salzes in 10 ml Äthylacetat suspendiert und danach
12 mAq (12 ml) 1n-wäßriger Schwefelsäure zugegeben werden. Danach wird die Lösung
geschüttelt, bis das Salz vollständig in Lösung gegangen ist. Dio beiden erhaltenen
Schichten werden voneinander getrennt, worauf die wäßrige Schicht zweimal mit frischem
Äthylacetat extrahiert wird.
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Die Äthylacetatextrakte werden miteinander vereinigt und zweimal mit
Wasser und einmal mit gesättigter Natriumchlo- -ridlösung gewaschen. Danach werden
die gewaschenen Extrakte über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Beim Einengen
der getrockneten Lösung erhält man einen öligen RUckstand, die freie Boc-Lys-Sätire,
die danach in CH2C12 gelöst wird.
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Die Wegnahme der Schutzgruppe und die Aminosäurekupplung von 3 g der
Harz-Val- und Boc-Lys-Säure werden wie folgt durchgeführt: (1) dreimaliges Waschen
mit jeweils 20 ml CH2C12; (2) zweiminütiges Vorwaschen mit 20 ml 25%iger TFA in
CH2C12; (3) 30-minüt£ges Waschen mit 20 ml TFA/ CH2Cl2; (4) fünfmaliges Waschen
mit 20 ml CH2C12; (5) 2-minütiges Vorwaschen mit 20 ml 10%iger TEA in CH2Cl2; (6)
10-minUtiges
Waschen mit 20 ml TEA/CH2Cl2; (7) 5-maliges Waschen mit jeweils 20 ml CH2Cl2; (8)
Zugabe von 931 mg der vorher zubereiteten Boc-Lys- (C1-Z-) Lösung in etwa 5 ml CH2C12;
(9) Zugabe und Einmischen von etwa 2,5 mÄq (1,25 ml) 2m-DCC in CH2C12; (10) 90-minütiges
Vermischen; (11) dreimaliges Waschen mit jeweils 20 ml CH2Cl2; (12) dreimaliges
Waschen mit jeweils 20 ml MeOH; (13) dreimaliges Waschen mit jeweils 20 ml CH2Cl2;
(14) 2-miniltiges Vorwaschen mit 20 ml 10% TEA/CH2C12; (15) 10-minütiges Waschen
mit 20 ml TEA/CH2C12; (16) fünfmaliges Waschen mit jeweils 20 ml CH2C12; (17) Zugabe
und Einmischen von 931 mg der vorher zubereiteten Boc-Lys- (C1-Z-) Lösung in CH2Cl2;
(18) Zugabe von 2,5 mÄq DCC in CH2C12; (19) 90-minUtiges Vermischen; (20) dreimaliges
Waschen mit jeweils 20 ml CH2C12; (21) dreimaliges Waschen mit jeweils 20 ml MeOH
und (22) dreimaliges Waschen mit jeweils 20 ml CH2C12.
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Die geschilderten 22 Stufen werden für jede Aminosäure des Peptids
der Sequenz D-Ser-Arg-Tyr-Gly-Lys -Pro -Val -Gly-Lys -Lys-Val-NH2 wiederholt. Cekuppelt
wird die folgende Sequenz Boc- oder Aoc-Aminosäuren in den angegebenen Mengen: 931
mg Boc-Lys (Z); 460 mg Boc-Gly; 570 mg Boc-Val; 538 mg Boc-Pro; 931 mg Boc-Lys (C1-Z);
460 mg Boc-Gly; 929 mg Boc-Tyr (Bzl); 883 mg Aoc-Arg; 738 mg Boc-D-Ser (Bzl).
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Wenn die Boc-D-Ser (Bzl) als DCHA-Salz erhalten wird, muß die Boc-D-Ser(Bzl)-Säure
von dem sCHA-Salz vor dem Kuppeln getrennt werden. Dies wird nach dem zur Trennung
der Boc-Lys(Cl-Z)-Säure von dem TBA-Salz geschilderten Verfahren bewerkstelligt.
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Das endgUltig erhaltene Peptidharz wird nach Durchführung der Stufe
22 mit MeOH gewaschen, dann getrocknet und
schließlich in einem
Glas-Exsilkkator im Kühlschrank gelagert. Sein Gewicht beträgt 3710 g. Nach Entfernung
der Schutzgruppen wird ein aliquoter Teil (1,85 g) des die genannten 11 Aminosäuren
enthaltenden Peptidaarzes durch Behandeln mit etwa 15 ml flüssigen Fluorwasserstoffs
mit 5 ml Anisol während 1 h bei 00C gespalten. Der Fluorwassorstoff wird durch Vakuumdestillation,
das Anisol mittels Äthylacetat und durch Filtrieren entfernt.
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Zum Abfiltrieren des Peptids von dem Harz wird das Harz mehrere Male
mit kleinen Volumina 50%iger Essigsäure gewaschen. Die vereinigten Filtrate werden
dann zur Gewinnung des gewUnschten Peptids lyophilisiert.
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Zur Reinigung wird das Peptid in einem Mindestvolumen 0,5m-Essigsäure
gelöst und auf einer Sephadex-G-25F-Säule eines Durchmessers von 1,6 cm und einer
Länge von 190 cm, die mit 0,5m-Essigsäure ins Gleichgewicht gesetzt wurde, einer
Gelfiltration unterworfen. Das Eluieren des Peptids erfolgt mit demselben Lösungsmittel,
es wird durch UV-Analyse überwacht. Die dem Hauptpeak entsprechenden Fraktionen
werden gesammelt und lyophilisiert, wobei 200 mg eines weißen flokkigen Pulvers
erhalten werden.
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Zur weiteren Reinigung durch Saulenverteilungs chromatographie (vgl.
Yomashiro in 201 Nature" 76 (1964)) wird eine Sephadex-G-25F-Verteilungssäule eines
Durchmessers von 1,5 cm und einer Länge von 190 cm hergestellt und mit einer unteren
Phase und dann einer oberen Phase aus dem BAW-Lösungsmittelsystem (n-Butanol t Essigsäure
t Wasser a 4 : 1 : 5; VH - 120 ml) ins Gleichgewicht gesetzt. Das bei der Gelfiltration
erhaltene lyophilisierte Peptid wird in
1,5 ml der oberen Phase
appliziert. Beim Eluieren mit der oberen Phase erhält man eine Hauptpeptidzone,
die sich an dem beschriebenen Ort befindet. Nach dem Sammeln und Lyophilisieren
erhält man 90 mg eines weißen flaumigen Pulvers.
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Die Aminosäureanalyse der Hydrolysate dieses Produkts mit Hilfe eines
handelsUblichen Analysators zeigt fUr die folgenden Aminosäuren Verhältnisse, die
nahe an den erwarteten Werten liegen: Ser(1), Arg(1), Tyr(1), Lys(3), Pro(1), Val(2),
Gly(2), NH3(1). 20 µ g des Peptids sind in sauren, neutralen und basischen dilnnschichtchromatographischen
Systemen homogen, wenn sie unter W-Lioht, Joddampf und Pauly-Reagens nach dem von
Monahan und Mitarbeitern in 47 "Biochem. Biophys. Res. Cummun." 551 (1972) beschriebenen
Verfahren untersucht werden.
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Die im vorliegenden Beispiel veranschaulichte Synthese läßt sich auf
sämtliche erfindungsgemäßen Polypeptide anwenden, wobei man lediglich geeignete
Boc- oder Aoc-Aminosäuren in der richtigen Reihenfolge einsetzen muß. So werden
beispielsweise bei der Herstellung des Polypeptids D-Ser-Arg-Al a-Tyr-Pro-Thr-Pro
-Ala-Arg-Ser-Lys -Lys -NH2 in der ange -gebenen Reihenfolge die folgenden Boc-Aminosäuren
verwendet: Boc-Lys (Cl-Z); Boc-Lys (Cl-Z); Boc-Ser (Bzl); Aoc-Arg (Tos); Boc-Ala;
Boc-Pro; Boc-Thr (Bzl); Boc-Pro; Boc-Tyr (Bzl); Boc-Ala; Aoc-Arg (Tos); Boc-D-Ser
(Bzl). In sämtlichen Stufen, in denen die Zugabe einer Boc- oder Aoc-AA erfolgt,
wird die AA in einer Menge von 2,5 mÄq pro g Harz zugesetzt.
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Beispiel 2 Die inhibierende Aktivität der beim LH-induzierten Eisprung
(ovulation)
synthetisierten Verbindungen wird bei weiblichen Ratten getestet: Jungfräuliche
weibliche Sprague-Dawley-Ratten eines Gewichts von 230 bis 280 g mit zwei aufeinanderfolgenden
4-tägigen Vaginalzyklen werden in einem belüfteten Raum gehalten, wobei das Licht
von 5 Uhr früh bis 7 Uhr abends eingeschaltet ist. Am frühen Nachmittag des Proöstrus
erhalten die Ratten eine Injektion von mindestens 31,5 mg/kg Nembutal, um sie bewußtlos
zu machen. Die Bewußtlosigkeit blockiert die endogene LH-Freigabe der Ratten. Zwischen
1.30 Uhr und 2.00 nachmittags werden in die Halsschlagader 10 p g Lutropin (NIH-LH
S17) des National Institute of Health bzw. 5 p g Humanchoriogonadotropin, hCG CR
117, des National Institute of Health injiziert. Eine min später wird eines der
erfindungsgemäßen Synthesepolypeptide, nämlich D-Ser-Arg-Ala-Tyr-Pro - Thr-Pro -Ala-Arg-Ser-Lys
-Lys -NH, D-Ser-Arg-Tyr-Gly-Lys -Pro -Val -Gly-Lys -Lys -Lys -Lys -NH, D-Ser-Pro-Val-Gly-Val-NH2
oder D-Ser-Arg-Tyr-Gly-Pro-Val-Gly-Val-NH2, in physiologischer Kochsalzlösung in
die Ratte injiziert.
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Weitere Synthesepeptide werden 20 bzw. 40 min danach injiziert.
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Vergleicharatten, die lediglich Nembutal erhielten, zeigen keinen
Eisprung. Bei sämtlichen Ratten, die nach der Nembutalgabe LH oder hCG erhielten,
ist die Bildung von 8 bis 12 Eiern feststellbar. Am nächsten Vormittag zwischen
10.00 und 11.00 Uhr werden die Ratten seziert, worauf die Eier in den Fallopio'schen
Röhren mit Hilfe eines schwachen Mikroskops gezählt werden.
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Die wirksame Mindestdosis wird nicht bestimmt, das Polypeptid E2 blockiert
jedoch vollständig eine Ovulation, wenn
es 1 min, 20 min bzw. 40
min nach der LH-Gabe in einer Menge von 50 bis 200 µ g pro Ratte injiziert wird.
Die anderen erfindungsgemäßen Verbindungen sind etwas weniger wirksam. Ein Beispiel
fUr die Versuchsergebnisse ist in der folgenden Tabelle I zusammengefaßt. Die Verbindungen
sind wie folgt abgekürzt: E2 D-Sor-Arg-Tyr-Gly-Pro-Val-Gly-Val-NH2 I D-Ser-Arg-Ala-Tyr-Pro-Thr-Pro-Ala-Arg-Ser-Lys-Lys-III
D-Sor-Arg-Tyr-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-E1 D-Ser-Pro-Val-Gly-Val-NH2.
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Tabelle I Wirkung von Inhibitorverbindungen auf eine durch Lutropin
induzierte Ovulation bei durch Nembutal blockierten Ratten Ver- Dosis Anzahl der
Versuchs- durchschnittliche Anbindung µ g tiere zahl der Eier LH LH + Verbindung
LH LH + Verbindung E2 200 6 8 10 0 E2 100 3 8 11 0 E2 50 1 2 10 0 I 100 4 4 11 8
I 50 2 2 10 6 I 20 2 3 12 10 III 300 1 3 12 5 III 200 1 3 12 10 III 100 1 3 12 10
E1 100 3 2 12 8 Beispiel 3 Es wird ein in-vitro-Versuch durchgefiihrt, um die Wirkung
der
erfindungsgemäßen Verbindungen auf die Lutropin-Stimulierung der RNS-Synthese in
Gelbkörper-Chromatin zu bestimmen. E2 und die anderen erfindungsgemäßen Verbindungen
inhibieren die Lutropin-Stimul ierung der RNS-Synthese durch DNA-abhängige RNS-Polymerasen,
die mit dem aus den Nuklei des Corpus Luteum des Eistocks (ovary) hergestellten
Chromatins vergesellschaftet sind. Das die DNA-abhängigen RNS-Polymerasen enthaltende
Chromatin erhält man aus gereinigten Nuklei, die in üblicher bekannter Weise aus
Rinder-Corpus-Luteum isoliert wurden. Die Verfahren und Substanzen zur in-vitro-Synthese
von RNS- finden sich bei NcKerns und Ryschkewitsch in 478 nBiochlm. Biophys. Acta
68 (1977).
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Bei diesen Versuchen wird der Einfluß von Lutropin, E1 einer Kombination
aus Lutropin und q , h einer Kombination aus Lutropin und E2, der Verbindung IV
und einer Kombination aus Lutropin und der Verbindung IV auf die RNS-Synthese der
Wirkung im Rahmen eines Blindversuchs gegen Ubergestellt. In jedem Gemisch wird
zur Überwachung bzw.
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Verfolgung des Einflusses auf die RNS-Synthese radioaktives [8-14C3-Adenosintriphosphat
verwendet. In jedem speziellen Fall wird ein eine hohe Ionenstärke aufweisender
Inkubationspuffer entsprechend den Angaben bei McKerns und Ryschkewitsch, der die
Polymerase II begUnstigt, verwendet.
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Bei der Polymerase II handelt es sich um eine Verbindung, die mRNS
synthetisiert. Die Inkubation dauert bei einer Temperatur von etwa 250C etwa 5 min.
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Während der Inkubation wird das radioaktive Adenosintriphosphat in
die RNS des Cbromatins in vitro eingebaut.
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Nach der Inkubation wird die RNS aus dem Chromatin isoliert und die
Radioaktivität in einem FlUssigszintillationsspektrometer ermittelt.
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Die in Tabelle II angegebenen Werte entsprechen dem Mittel aus drei
gut übereinstimmenden Werten. Lutropin und die erfindungsgemäßen Verbindungen liegen
in einer Endkonzentration von 10 9 M vor. Wie aus den Ergebnissen zu entnehmen ist,
werden bei einem Blindversuch 230 Picomole (pMol) des radioaktiv markierten ATP
in die RNS eingebaut.
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Der Zusatz von Lutropin erhöht diesen Einbau stark, nämlich auf 1290
pMole. Der Einbau in Gegenwart von Lutropin und der Verbindung E2 wird jedoch wieder
auf einen Wert nahe dem Blindwert reduziert. Wie die Ergebnisse zeigen, sind die
anderen erfindungsgemäßen Verbindungen weniger wirksam als E2.
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Tabelle II Wirkung der Inhibitorverbindungen auf die Lutropin-Stimulierung
der RNS-Synthese in Corpus-Luteum-Chromatin pMole an eingebauter t8-14c]-ATP Blindversuch
230 Lutropin 1290 E1 420 Lutropin + E1 1190 E2 220 Lutropin + E2 260 Blindprobe
1790 Lutropin 3100 Verbindung IV 2070 Lutropin + Verbindung IV 2400
Die
Verbindungen E1 und E2 entsprechen den im Beispiel 2 verwendeten Verbindungen E1
und E2. Die Verbindung IV entspricht D-Ser-Arg-Tyr-Gly-Lys-Pro-Val-Arg-Ser-Lys-Lys-
.