Die vorliegende Erfindung betrifft Peptidverbindungen, die eine pharmakologische Wirkung aufweisen, und pharmazeutische Präparate, welche sie enthalten.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Peptidderivat aus der Reihe von (i) einem Calcitoninpeptid und einem LHRH-Antagonistpeptid, das an eine Aminogruppe hiervon gebunden enthält mindestens
a) einen Rest a1), wobei a1) für den Rest eines Zuckers steht, welcher einen O-Glykosylrest tragen kann, wobei die Reste von einem reduzierenden Monosaccharid, Disaccharid oder Oligosaccharid oder einem Aminosäure-, Carbonsäure-, reduzierten oder veresterten Derivat hiervon abgeleitet sind, oder a1) für einen Rest, der einen derartigen Zucker enthält, steht, oder a1) für den Rest einer Uronsäure, Polyhydroxymonocarbonsäure, Polyhydroxydicarbonsäure oder einen Rest der Formeln le1 oder Ie2 steht;
EMI1.1
worin
Y1 und Y2 wie in Anspruch 1 definiert sind, und
c für 2, 3 oder 4 steht, oder
b) einen Rest der Formel (b1) oder (b2)
EMI2.1
worin ein Symbol aus Y1 und Y2 Wasserstoff und das andere Hydroxy ist oder beide jeweils Wasserstoff sind, f und g unabhängig voneinander je 0 oder 1 sind,
und die physiologisch-annehmbaren Aether und die physiologisch-hydrolysierbaren und -annehmbaren Ester davon, oder
c) eine Kombination von a) und b) und
(ii) einem Calcitoninpeptid, das
d) mindestens ein Formyl gebunden an eine Aminogruppe anders als eine N-terminale Aminogruppe, oder
e) mindestens eine C3-5Alkylgruppe gebunden an eine Aminogruppe anders als eine N-terminale Aminogruppe, oder
f) eine Kombination von a), b), d) und e) enthält, mit den Massgaben, dass,
i) wenn das Calcitoninpeptid mindestens einen Rest a1) enthält,
dieser Rest an eine omega -Aminogruppe einer in Stellung 24 stehenden omega -aminosubstituierten Seitenkette durch eine Kupplung gebunden ist, die keiner direkten N-glykosidischen Bindung entspricht, und
ii) wenn der LHRH-Antagonist mindestens einen Rest a1) enthält, dieser Rest ein Amadori-Zuckerrest ist, gebunden an eine omega -Aminogruppe einer in Stellung 8 stehenden omega -aminosubstituierten Seitenkette durch eine Kupplung, die keiner direkten N-glykosidischen Bindung entspricht,
in freier Form oder in Salz- oder Komplexform.
Im folgenden werden diese Verbindungen als erfindungsgemässe Verbindungen bezeichnet.
In den erfindungsgemässen Verbindungen kann der Rest a1) an eine Aminogruppe entweder direkt durch eine Kupplung, die keiner direkten N-glykosidischen Bindung entspricht, oder indirekt über ein Brückenglied gebunden sein.
Der hierin verwendete Begriff "Zucker" umfasst irgendein Monosaccharid oder Oligosaccharid, insbesondere eine Monoose, Diose oder Triose oder ein Derivat hiervon, beispielsweise ein Aminosäurederivat und/oder Carbonsäurederivat und/oder ein reduziertes und/oder verestertes Derivat hiervon. Die Zucker können Heptosen, Hexosen und/oder Pentosen enthalten, welche als Pyranosen oder Furanosen vorkommen können.
In den folgenden Formeln ist der Zuckerrest der Einfachheit halber lediglich durch die Struktur der Pyranose oder Furanose wiedergegeben. Natürlich gehören zur Erfindung auch die offenkettigen Strukturen.
Beispiele von Resten a1) umfassen:
A) einen Rest der Formel (Ia)
EMI4.1
der für den über die CH2-Gruppe an die NH-Gruppe eines Peptids (wie oben definiert) gebundenen Desoxyrest einer Ketose steht,
vorzugsweise einen Rest der Formel (Ia1)
EMI4.2
worin
einer der Reste Ga und Gb Wasserstoff und der andere OH ist, einer der Reste Gc und Gd Wasserstoff und der andere OH oder O-Glykosyl ist, wobei der Glykosylrest von einem reduzierenden Monosaccharid, Disaccharid oder Oligosaccharid abgeleitet sein kann,
einer der Reste Ge und Gf Wasserstoff und der andere OH ist, einer der Reste Gg und Gh Wasserstoff und der andere Wasserstoff oder CH2OH ist, wobei die Reste Ga bis Gh beispielsweise so ausgewählt sind, dass der Rest der Formel (Ia1) einem Rest entspricht, der durch eine Amadori-Umlagerung aus einem natürlich oder synthetisch zugänglichen Monosaccharid, Disaccharid, oder Oligosaccharid erhalten werden kann, z.B. Desoxyfruktosyl, Desoxytagatosyl, Desoxysorbosyl, alpha -Glukosyl(1-4)-desoxyfruktosyl, alpha -Glukosyl(1-4)- alpha -glukosyl(1-4)-desoxyfruktosyl,
oder einen Rest der Formel (Ia2)
EMI5.1
worin
Ga, Gb, Gc und Gd wie oben definiert sind, einer der Reste Ge und Gf Wasserstoff und der andere Wasserstoff, COOH, CH2OH, CH2-O-P(O)-(OH)2 oder CH2O-Glykosyl ist, wobei der Glykosylrest von einem reduzierenden Monosaccharid, Disaccharid oder Oligosaccharid erhältlich ist,
wobei die Reste Ga bis Gf beispielsweise so ausgewählt sind, dass der Rest der Formel (Ia2) einem Rest entspricht, der durch eine Amadori-Umlagerung aus einem natürlichen oder einem synthetisch zugänglichen Monosaccharid, Disaccharid oder Oligosaccharid erhalten werden kann, oder
B) einen Rest der Formel (Ib)
EMI6.1
der für den über die freie Bindung an der NH-Gruppe eines Peptids (wie oben definiert) gebundenen Desoxyrest einer Aldose steht, vorzugsweise einen Rest der Formel (Ib1)
EMI6.2
worin
einer der Reste Ga oder Gb Wasserstoff und der andere eine freie Bindung ist,
einer der Reste Gc oder Gd Wasserstoff und der andere OH ist,
einer der Reste Ge oder Gf Wasserstoff und der andere OH oder O-Glykosyl ist, wobei der Glykosylrest von einem reduzierenden Monosaccharid, Disaccharid oder Oligosaccharid abgeleitet sein kann,
einer der Reste Gg und Gh Wasserstoff und der andere CH2OH oder CH2-O-Glykosyl ist, wobei der Glykosylrest von einem reduzierenden Monosaccharid, Disaccharid oder Oligosaccharid abgeleitet sein kann, wobei die Reste Ga bis Gh beispielsweise so ausgewählt sein können, dass der Rest der Formel (Ib1) einem Rest entspricht, der durch eine Heyns-Umlagerung aus einer natürlichen oder einer synthetisch zugänglichen Monoketose, Diketose oder Oligoketose erhalten werden kann, beispielsweise D-Fructose, Lactulose, L-Sorbose,
D-Tagatose oder D-Ribulose,
oder einen Rest der Formel (Ib2)
EMI7.1
sein, worin
Ga, Gb, Gc und Gd wie oben definiert sind,
einer der Reste Ge und Gf Wasserstoff und der andere CH2OH oder CH2-O-Glykosyl ist, wobei der Glykosylrest von einem reduzierenden Monosaccharid, Disaccharid oder Oligosaccharid abgeleitet sein kann,
wobei die Reste Ga bis Gf beispielsweise so ausgewählt sein können, dass der Rest der Formel (Ib1) einem Rest entspricht, der durch eine Heyns-Umlagerung aus einer natürlichen oder einer synthetisch zugänglichen Monoketose, Diketose oder Oligoketose erhalten werden kann, beispielsweise D-Fructose, Lactulose, L-Sorbose, D-Tagatose oder D-Ribulose; oder
C) einen Rest der Formel (Ic)
G3-CO- (Ic)
worin
G3CO der Rest einer Uronsäure, z.B. Glucuronsäure oder Galacturonsäure, einer Polyhydroxymonocarbonsäure oder einer Polyhydroxydicarbonsäure, z.B. Gluconsäure, Glucarsäure, Chinasäure, Acetylmuraminsäure, Acetylneuraminsäure oder D-Glucosaminsäure ist, und
D) einen Rest der Formeln (Id1) bis (Id4)
EMI8.1
worin
Q, Q min , Q min min und Q min min min für Gruppen stehen, die den Peptidrest mit dem Rest a1) verbinden, z.B. Q vorzugsweise -CbH2b-CO-(b ist 1 bis 6) oder CO oder CS, Q min vorzugsweise -CbH2b-CO-, der Radikal einer Dicarbonsäure oder ein Rest
EMI9.1
-NHQ min min und -NHQ min min min vorzugsweise jeweils das Radikal einer
omega -Aminocarbonsäure sind, und G4, G min 4, G min min 4 und G min min min 4 eine wie oben für G1 oder G2 angegebene Bedeutung haben; oder
E) einen Rest der Formeln (Ie1) oder (Ie2) wie oben beschrieben.
Unter Amadori-Zuckerrest, wie in den LHRH-Antagonisten der Erfindung in Stellung 8 vorhanden sein kann, wird ein Zuckerrest verstanden, der durch eine Amadori- oder Heyns-Umlagerung erhalten werden kann, beispielsweise einen Rest der Formeln (Ia) oder (Ib), z.B. (Ia1), (Ia2), (Ib1) oder (Ib2), oder der Formeln (Id3) oder (Id4) wie oben angegeben. In dem Amadori-Zuckerrest der Formeln (Id3) oder (Id4) stehen -NH-Q min min - oder -NH-Q min min min - vorzugsweise für einen -NH-CbH2b-CO-Rest, worin b vorzugsweise eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist.
Zusätzlich zu dem Amadori-Zuckerrest in Stellung 8 oder zu den Resten (b1) und/oder (b2) können die LHRH-Antagonisten der Erfindung einen der zwei Reste der obigen Formeln (Ia) bis (Id) enthalten, beispielsweise in Stellung 1 und/oder Stellung 5 und/oder Stellung 6. Vorzugsweise tragen die LHRH-Antagonisten der Erfindung entweder einen Amadori-Zuckerrest in Stellung 8 und einen zweiten Amadori-Zuckerrest in Stellung 6, oder einen Rest der Formeln (b1) oder (b2) in Stellung 8 und gegebenenfalls einen zweiten Rest der Formeln (b1) oder (b2) in Stellung 6, oder zwei Reste der Formeln (b1) und/oder (b2) in Stellung 8 und gegebenenfalls einen oder zwei Reste der Formeln (b1) und/oder (b2) in Stellung 6, oder einen, zwei oder mehr Reste der Formeln (b1) oder (b2) an irgendeine der freien Aminogruppen in Stellung 1 und/oder Stellung 5 und/oder Stellung 6.
In dem Rest der Formel (b1) steht g vorzugsweise für 0 oder g und f stehen beide für 0. In dem Rest der Formel (b2) ist f vorzugsweise 0.
Der Rest der Formel (b1) ist ganz bevorzugt.
Unter dem Ausdruck "physiologisch annehmbare Äther" wie für die erfindungsgemässen Verbindungen angewandt, die mindestens einen Rest der Formel (b1) oder (b2) enthalten, werden Aether verstanden, worin die Hydroxygruppen des Rests (b1) oder (b2) veräthert sind und die zu keinen Nebeneffekten bei einer gewünschten Dosishöhe führen. Solche umfassen geradkettige, verzweigte oder zyklische Äther wie beispielsweise C1-4Alkylaether, z.B. Verbindungen, worin ein oder alle OH-Gruppen methyliert, oder zyklische Äther worin 2 benachbarte OH-Gruppen durch
z.B.
EMI10.1
substituiert sind.
Unter dem Ausdruck "physiologisch-hydrolysierbare und annehmbare Ester" wie für die erfindungsgemässen Verbindungen angewandt, die mindestens einen Rest der Formel (b1) oder (b2) enthalten, werden Ester verstanden, worin zwei oder alle Hydroxygruppen verestert sind und die unter physiologischen Bedingungen hydrolysierbar sind, wobei eine Säure erhalten wird, welche zu keinen ungewünschten Nebeneffekten bei einer gewünschten Dosishöhe führt. Geeignete Ester umfassen z.B. Ester mit aliphatischen Carbonsäuren, die 1 bis 6 C-Atome enthalten.
Die erfindungsgemässen Verbindungen umfassen auch solche, worin irgendeine der freien Hydroxygruppen im Rest der Formel (b1) oder (b2) glykosilisch an ein reduzierendes Monosaccharid, Disaccharid oder Oligosaccharid oder einem Aminozucker gebunden sein können.
Je nach Substitution, können die Reste der Formel (b1) oder (b2) ein oder zwei asymetrische Kohlenstoffatome enthalten und somit können die erfindungsgemässen Verbindungen in einzelnen isomeren Formen als auch als Razemat oder Diastereoisomere (ohne die Stereochemie des peptidischen Anteils in Betracht zu nehmen) vorliegen. Razemische und diastereoisomere Mischungen können nach an sich bekannten Methoden in einzelnen isomeren Formen getrennt werden. Alternativ können auch optisch isomere Ausgangsmaterialien eingesetzt werden. Die Erfindung umfasst alle diese Formen.
C3-5Alkyl kann geradkettig oder verzweigt sein. Bevorzugt ist C3-4Alkyl, besonders Isopropyl.
In Übereinstimmung mit den besonderen Feststellungen der vorliegenden Erfindung, betrifft die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt:
i) ein Calcitonin, worin mindestens eine der freien Aminogruppen anders als an der N-terminalen Aminogruppe formyliert ist, vorzugsweise in Stellung 7 und/oder 11 und/oder in Stellung 18 und/oder in Stellung 24;
ii) ein Calcitoninpeptid, worin mindestens eine der freien Aminogruppen durch einen oder zwei Reste der Formeln (b1) und/oder (b2), besonders (b1), vorzugsweise in Stellung 11 und/oder in Stellung 18 und/oder in Stellung 24 modifiziert ist;
iii) ein Calcitoninpeptid, worin mindestens eine der freien Aminogruppen anders als die N-terminale Aminogruppe durch C3-5Alkyl, vorzugsweise in Stellung 11 und/oder in Stellung 18 und/oder in Stellung 24 modifiziert ist;
iv) ein Calcitoninpeptid, das in Stellung 24 einen Rest a1) trägt, wobei der Rest an die omega -Aminogruppe einer omega -aminosubstituierten Seitenkette und gegebenenfalls in Stellung 11 und/oder in Stellung 18 gebunden ist;
v) ein Calcitoninpeptid, worin eine, mehrere oder alle im Peptid vorhandenen freien Aminogruppen durch eine Kombination aus Formyl, C3-5Alkyl, Reste der Formeln (b1), (b2) und/oder (a) wie oben definiert, vorzugsweise in Stellung 11 und/oder in Stellung 18 und/oder in Stellung 24 modifiziert sind, vorzugsweise die Peptide, die in den Stellungen 11 und 18 durch Formyl und in Stellung 24 durch einen Rest a1) wie definiert substituiert sind.
Alle bekannten natürlichen Calcitonine sind Polypeptide, die eine Aminosäuresequenz von 32-Aminosäuren enthalten. Sie werden gemäss der IUPAC-IUP-Methode [Biochem. J. (1984) 219, 345-377] bezeichnet.
Die Stellung jeder Aminosäure in der Calcitoninpeptidkette wird gemäss den anerkannten Vorschriften numeriert, wobei mit Stellung 1 für Cys an einem Ende der Kette angefangen und mit Stellung 32 für Pro an dem anderen Ende der Kette beendet wird. In der Fortsetzung wird das gleiche Numerierungssystem für jede Peptidkette angewandt, auch wenn sie weniger als die 32 Aminosäureinheiten, die in den natürlichen Calcitoninen vorhanden sind, enthält, wobei die Stellung jeder fehlenden Aminosäure auf die ursprüngliche Numerierung verweist. Beispielsweise, in den erfindungs gemässen Verbindungen, verweist die Nummer 24 auf die Stellung 24 in der Calcitoninpeptidkette wie oben definiert, unabhängig davon, ob die Verbindungen 32 Aminosäuren oder weniger enthalten.
Unter dem Begriff Calcitoninpeptid werden sowohl die natürlich vorkommenden Calcitonine, wie sie aus natürlichen Quellen, Zellkulturen und dergleichen extrahiert oder synthetisch hergestellt werden können, als auch Derivate und Analogon, die eine hypocalcemische Wirkung oder eine calcitoninähnliche Wirkung aufweisen, verstanden. Calcitonin mit vollständiger Kette können beispielsweise durch eine Brücke im allgemeinen zwischen die Stellungen 1 und 7 der Polypeptidkette gekennzeichnet werden. Alternativ oder zusätzlich dazu können durch Leucin in Stellung 9, und/oder Glycin in Stellung 28 und/oder Prolin in Stellung 32 gekennzeichnet werden.
Zu Derivaten und Analogen dieser Calcitonine gehören vor allem natürliche Calcitoninstrukturen, bei denen ein oder mehrere Aminosäurereste durch ein oder mehrere andere Aminosäurereste ersetzt sind und/oder die Brücke S-S durch eine Alkylenbrücke ersetzt ist und/oder ein oder mehrere Aminosäurereste weggelassen sind (Desaminoacylderivate).
Eine Aminosäure wird als "natürlich" bezeichnet, wenn sie aus dem Bereich der Aminosäuren kommt, die durch den genetischen Kode des lebenden Organismus bereitgestellt werden, und als "synthetisch", wenn sie ausserhalb dieses Bereiches ausgwählt wird.
Beispiele von omega -aminosubstituierten Seitenketten in Stellung 24 der erfindungsgemässen Calcitonine umfassen einen Rest der Formel IX
EMI13.1
worin Z für -W-NRcRd;
EMI14.1
oder
EMI14.2
worin W Arylen, Aralkylen oder eine divalente alicyklische oder aliphatische Gruppe, vorzugsweise Phenylen, Cyclohexylen oder gegebenenfalls durch O oder S unterbrochenes C1-6Alkylen, besonders C2-5Alkylen, ganz bevorzugt Propyl oder Butyl bedeutet;
Rc und Rd unabhängig voneinander jeweils Wasserstoff, einen Rest a1), einen Rest der Formeln (b1) oder (b2), Formyl oder C3-5Alkyl bedeutet;
Re für C2-5Alkyl, vorzugsweise Äthyl steht.
Bevorzugte Calcitonine der Erfindung sind Verbindungen der Formel X,
EMI14.3
worin
o eine ganze Zahl von 1 bis 5 bedeutet,
R für H oder R min CO steht, wobei R min CO der Acylrest einer Carbonsäure ist,
Y3 der am alpha -Kohlenstoffatom einer alpha -Aminosäure befindliche Rest ist,
Y4 für
EMI15.1
-CH2-S-S-CH2-CH2-COOH, -(CH2)s-COOH, -CH2-S-Y5, oder den am alpha -Kohlenstoffatom einer alpha -Aminosäure befindlichen Rest steht,
oder ein Y3 und Y4 zusammen eine Disulfid- oder (CH2)4-Brücke bilden, wenn o 3 oder 5 ist,
Y5 Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls durch Methyl oder Methoxy substituiertes Benzyl oder CH3CONH-CH2-ist,
A6 für Thr oder D-Thr steht,
s eine ganze Zahl von 3 bis 5 ist,
A8 den Aminoacylrest einer neutralen, lipophilen L- alpha -Aminosäure bedeutet,
A9 der Aminoacylrest einer neutralen lipophilen L- oder D- alpha -Aminosäure ist,
Z1 ein Polypeptidrest ist,
der sich in den Stellungen 10 bis 23 eines natürlichen Calcitonins oder eines Derivates oder Analogen hiervon mit hypocalcemischer Wirkung befindet, und entweder
Z3 ein Polypeptidrest ist, der sich in den Stellungen 24 bis 31 eines natürlichen Calcitonins oder eines Derivates oder Analogen hiervon mit hypocalcemischer Wirkung befindet,
oder Z3
EMI15.2
ist,
worin Z wie oben definiert ist, und
Z2 für ein Polypeptid steht, das sich in den Stellungen 25 bis 31 eines natürlichen Calcitonins oder eines Derivates oder Analogen hiervon mit hypocalcemischer Wirkung befindet,
wobei die 1 bis 5 Reste Y3 in der Formel X unabhängig voneinander gleiche oder unterschiedliche Bedeutungen haben können und mit Ausnahme des Aminoacylrestes A8 alle Aminosäurereste in der Formel X die L-Konfiguration oder D-Konfiguration haben können,
wobei die Verbindung der Formel X durch Formyl und/oder C3-5Alkyl an einer oder mehreren Aminogruppen in einer oder mehreren Seitenketten, und/oder durch mindestens einen Rest der Formel (b1) oder (b2) an einer N-terminalen Aminogruppe und/oder an einer oder mehreren Aminogruppen in einer oder mehreren Seitenketten, substituiert ist,
mit der Massgabe, dass Z3 für
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steht,
worin Z -W-NRcRd bedeutet, wenn die Verbindung der Formel X in Stellung 24 durch mindestens einen Rest a1) substituiert ist, in freier Form oder in Salz- oder Komplexform.
Unter Z1 in der Formel X sind solche Peptidreste zu verstehen, welche in den verschiedenen bekannten Calcitoninen, z.B. in Human-, Salm-, Aal-, Huhn-, Rind-, Schaf-, Ratte- oder Schwein-Calcitonin, sowie in den Derivaten und Analoga dieser Calcitonine mit ähnlicher biologischer Wirkung, z.B. in den Stellungen 10 bis 23, und unter Z3 solche Peptidreste wie z.B. in den Stellungen 24 bis 31 oder 25 bis 31 vorkommen. Diese Peptidreste Z1, Z2 und Z3 können normalerweise 14, 7 bzw. 8 Aminosäuren enthalten; jedoch können sie auch eine entsprechend kleinere Zahl von Aminosäureresten bei Weglassen eines oder mehrerer Aminosäureresten (des-Aminoacylderivate) enthalten.
Z1 steht vorzugsweise für
a) Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-,
worin Z3 -Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr oder
EMI17.1
ist.
b) Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-,
worin Z3 -Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr oder
EMI17.2
ist.
In Z1 kann ein bevorzugter Aminosäurerest in Stellung 10 auch Aib (Aminoisobuttersäurerest) oder DAla sein.
Ein bevorzugter Aminosäurerest in Stellung 17 in Z1 kann auch Aib sein.
R min CO ist vorzugsweise HCO oder der Acylrest einer aliphatischen, cycloaliphatischen, aromatischen oder heterocyclischen Carbonsäure.
R min steht vorzugsweise
a min ) für Wasserstoff oder für gesättigtes oder ungesättigtes, geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 17 C-Atomen, besonders für gesättigtes Alkyl mit 3 bis 9 C-Atomen,
b min ) für Cycloalkyl mit 5 bis 7 C-Atomen oder für Cycloalkylalkyl, worin die Cycloalkylgruppe 5 bis 7 C-Atome und der Alkylrest 1 oder 2 C-Atome enthält,
c min ) für Adamantyl, Adamantylmethyl oder Adamantyläthyl, oder
d min ) für Phenyl, Benzyl oder Phenäthyl.
In den oben erwähnten Bedeutungen für R min können die Alkyl-, Cycloalkyl- oder Phenylreste durch übliche Substituenten substituiert sein, z.B. durch Halogen, NO2, OH, Alkoxy, usw.
Der Rest R min CO kann z.B. der alpha -Desaminorest einer natürlichen oder synthetischen alpha -Aminosäure sein. Für R min sind besonders die Bedeutungen a min ), b min ) und c min ) bevorzugt.
Y3 und Y4 als sich am alpha -C-Atom einer alpha -Aminosäure befindlichen Reste stehen besonders für die am alpha -C-Atom einer natürlichen alpha -Aminosäure gebundenen Reste, jedoch kommen auch Reste anderer alpha -Aminosäuren, z.B. des 3-Cyclohexylalanins oder der alpha -Aminoisobuttersäure, alpha -Aminobuttersäure oder (L-)- alpha -Aminokorksäure, in Betracht.
Falls o in der Formel X 5 bedeutet, bilden vorzugsweise Y3 am terminalen N (Stellung 1) und Y4 in Stellung 7 zusammen eine Disulphid- oder Tetramethylenbrücke oder Y3 in Stellung 1 und Y4 jeweilig -(CH2)5-COOH oder ein Derivat hiervon. Der zweite bis zu dem fünften Y3 haben auch vorzugsweise eine Bedeutung wie danach angegeben, wenn o 4 ist.
Falls o in der Formel X 4 bedeutet, steht,
a) der N-terminale Aminoacylrest (übereinstimmend mit dem zweiten Aminosäurerest in der Sequenz der natürlichen Calcitonine) bevorzugt für Ser, Gly oder Ala,
b) der zweite Aminoacylrest (übereinstimmend mit dem dritten Aminosäurerest in der Sequenz der natürlichen Calcitonine) bevorzugt für Asn oder Ser,
c) der dritte Aminoacylrest (übereinstimmend mit dem vierten Aminosäurerest in der Sequenz der natürlichen Calcitonine) bevorzugt für Leu, Asn, Ser, Phe, D-Leu oder den Rest des Cyclohexylalanins,
d) der vierte Aminoacylrest (übereinstimmend mit dem fünften Aminosäurerest in der Sequenz der natürlichen Calcitonine) bevorzugt für Ser oder Ala.
Falls o in der Formel X für 3 steht, haben der N-terminale, der zweite und der dritte Aminoacylrest die gleichen bevorzugten Bedeutungen wie oben für den Fall, dass o = 4 unter b) angegeben. Y3 an dem terminalen N und Y4 können auch eine Disulphid- oder Tetramethylenbrücke zusammen bilden.
Falls o in der Formel X für 2 steht, haben der N-terminale und der zweite Aminoacylrest bevorzugt die gleichen bevorzugten Bedeutungen wie oben für den Fall, dass o = 4 under c) bzw. d) angegeben.
Falls o in der Formel X für 1 steht, steht der N-terminale und der zweite Aminoacylrest bevorzugt für Ser oder Ala.
A6 steht bevorzugt für Thr;
EMI20.1
steht bevorzugt für Cys, ein wie oben für Y4 angegebenes Derivat des Cysteins oder einen neutralen lipophilen alpha -Aminoacylrest, besonders für Ala oder einen anderen neutralen lipophilen alpha -Aminoacylrest, ganz besonders für Ala;
wenn
EMI20.2
in Stellung 7 steht, kann es auch einen Rest der Formel IX wie oben definiert bedeuten, oder gegebenenfalls in N<d> oder N< epsilon > durch C1-6Alkanoyl substituiertes Orn oder Lys;
A8 steht für den Aminoacylrest einer neutralen, lipophilen alpha -Aminosäure, besonders für Val oder Gly,
A9 steht ebenfalls für den Aminoacylrest einer neutralen, lipophilen alpha -Aminosäure, besonders für Leu oder Phe.
In den Verbindungen der Formel X steht o bevorzugt für 2, wobei R H oder R min CO bedeutet oder ganz besonders steht o für 1 und R für R min CO.
Alle Aminosäurereste haben vorzugsweise die L-Konfiguration.
Das natürliche Luteohormon freisetzende Hormon LHRH ist ein Dekapeptid, das aus natürlich vorkommenden Aminosäuren besteht. LHRH-Antagonisten umfassen Analogen und Derivate hiervon, worin eine oder mehrere Aminosäurereste weggelassen und/oder durch ein oder mehrere andere Aminosäurereste ersetzt und/oder ein oder mehrere funktionelle Gruppen durch ein oder mehrere andere funktionelle Gruppen ersetzt und/oder ein oder mehrere Gruppen durch ein oder mehr sonstige isosterische Gruppen ausgetauscht sind und/oder worin die C-terminale Sequenz abgeändert ist.
Beispiele einer omega -aminosubstituierten Seitenkette in Stellung 8 der LHRH-Antagonisten der Erfindung umfassen Seitenketten, worin die omega -Aminogruppe an die alpha -Stellung der in Stellung 8 stehenden Aminosäure durch ein Brückenglied gebunden ist. Das Brückenglied kann z.B. eine der für W oben angegebenen Bedeutung haben.
Bevorzugte LHRH-Antagonisten der Erfindung sind Verbindungen der Formel XI,
R1 - A1 - B1 - C1 - D1 - E1 - F1 - G1 - H1 - I1 - K1 - NH2 (XI)
worin die einzelnen Symbole folgende Bedeutungen haben:
R1 steht für H oder eine Acylgruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen, Carbamoyl, einen Rest a1) oder einen Rest (b1) oder (b2)
A1 bedeutet D-Phe, das gegebenenfalls im Phenylring durch Halogen, CF3, C1-3Alkyl und/oder C1-3Alkoxy substituiert ist, alpha - oder beta -Naphthylalanin, D-Trp, das gegebenenfalls in den Stellungen 5 oder 6 durch Halogen oder C1-3Alkoxy substituiert ist und/oder in der Stellung 1 durch Formyl oder Acetyl substituiert ist, D- oder L-Pro, D- oder L-3,4-Dehydroprolin, D- oder L-Ser, D- oder L-Thr, D- oder L-Ala, D-Pyroglutamin, 3-(9-Anthryl)-D,L-alanyl, 3-(2-Fluorenyl)-D,L-alanyl oder 3-(Het)-D,L-alanyl, worin Het ein heterocyklischer Arylrest aus der Reihe von
EMI21.1
ist, worin
A2 und A3 unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, C1-4Alkyl, Chlor und Brom ausgewählt sind, und A4 O, S oder N ist,
B1 steht für D-Phe, das im Phenylring gegebenenfalls durch Halogen, NO2, C1-3Alkyl oder C1-3Alkoxy substituiert ist, D- alpha -Methylphenylalanin, das in Stellung 4 gegebenenfalls durch Cl substituiert ist, 2,2-Diphenylglycin oder 3-(2-Naphthyl)-D-alanin,
C1 bedeutet D-Trp, das gegebenenfalls in den Stellungen 5 oder 6 durch Halogen, NO2 und /oder C1-3Alkoxy und/oder in der Stellung 1 durch HCO oder CH3CO substituiert ist, 3-(2- oder 1-Naphthyl)-D-alanin, 3-D-Pyridylalanin, D-Tyr, D-Phe, das gegebenenfalls durch Halogen, C1-3Alkyl und/oder C1-3Alkoxy substituiert ist, D-3-Pz-Ala, D-Tin-Glu oder D-Nic-Lys,
D1 ist L-Ser,
E1 bedeutet Tyr oder Phenylalanin, das im Phenylring gegebenenfalls durch Halogen,
C1-3Alkyl und/oder C1-3Alkoxy substituiert ist, Orn, Lys, Lys-Nic, MPic-Lys, Lys-Pic, Mpic-Lys, DMG-Lys, Pmc-Lys, Pzc-Lys, His, Dpo, Arg, 3-(3-Pyridyl)-Ala, Trp, N-(3-Pyridyl)acetyl-Lys oder Glu(pMeO-phenyl), Cit, HOBLys oder PzACAla, wobei die freie Aminogruppe in diesen Aminosäureeinheiten gegebenenfalls durch einen Rest a1) oder mindestens einen Rest (b1) oder (b2) substituiert ist,
F1 steht für D-Phe, das im Phenylring gegebenenfalls durch Halogen, NO2, C1-3Alkyl oder C1-3Alkoxy substituiert ist, D-Trp, das gegebenenfalls in den Stellungen 5 oder 6 durch Halogen, NO2 und/oder C1-3Alkoxy und/oder in der Stellung 1 durch Formyl oder Acetyl substituiert ist, 3-(2-Naphthyl)L-alanyl, D-Tyr, D-Lys-Nic, D-MNic-Lys, D-MPic-Lys, D-Pmc-Lys, D-Pzc-Lys, D-Bz-Lys, D-ILys, AnGlu, D-NACAla, D-PzACAla, D-PmACAla, D-3-(3-Pyridyl)-Ala, D-His (subst.
H oder Benzyl), D-Arg, D-homo-Arg(Et2), D-Cit, D-HCi, D-Lys-Pic, D-Cit(C1-3alkyl), D-HCi(C1-3alkyl), D-Glu(AA) oder alpha -Amino- omega -ureido-C2-4alkancarbonsäure, wobei die freie Aminogruppe in diesen Aminosäureeinheiten gegebenenfalls durch einen Rest a1) oder mindestens einen Rest (b1) oder (b2) oder einen Rest
EMI23.1
substituiert ist,
worin W min C1-6Alkylen, Methoxy-C1-4alkylen, Methylthio-C1-4alkylen oder Cyclohexylen,
Ra und Rb unabhängig voneinander Wasserstoff, ein Rest a1), ein Rest der Formel (b1) oder (b2) oder
ein Symbol aus Ra und Rb Wasserstoff und das andere C2-5Alkanoyl, Benzoyl oder Phenylpropionyl ist,
G1 ist Leu, Nle, Nval, N- alpha -MethylLeu, Trp, Phe, Met, Tyr, Val, Ile, alloIle, Abu, Ala oder
EMI23.2
worin W min wie oben definiert ist,
H1 ist
EMI23.3
worin W wie oben definiert ist, vorzugsweise Phenylen, Cyclohexylen, Methoxy-C1-4Alkylen oder Methylthio-C1-4Alkylen, R min a und R min b unabhängig voneinander Wasserstoff, ein Amadori-Rest, vorzugsweise der Formeln (Ia1), (Ia2), (Ib1), (Ib2), (Id3) oder (Id4), oder ein Rest der Formel (b1) oder (b2), Arg, IOrn, ILys oder Cyp-Lys ist,
I1 ist Pro, Hydroxyprolin, 3,4-Dehydroprolin, Pip und
K1 ist D-Ala, D-Leu, Gly, D-Ser oder Sar, in freier Form oder in Salz- oder Komplexform.
Bei den LHRH-Antagonisten der Erfindung sind die folgenden Bedeutungen entweder einzeln oder in irgendeiner Kombination oder Unterkombination bevorzugt:
R1 Acetyl ist;
A1 D-Phe, D-Phe(p-Cl), D-Phe(p-F), Cl2-Phe oder D-2-Nal ist;
B1 D-Phe, D-Phe(p-Cl) oder D-Phe(p-F) ist;
C1 D-Trp, D-2-Nal, D-3-Pal oder D-Phe ist;
D1 Ser ist;
E1 Tyr, Nic-Lys, MNic-Lys, Pic-Lys, Pzc-Lys, Arg, 3-Pal, Orn, Lys oder durch einen Amadori-Zuckerrest wie oben definiert oder durch mindestens einen Rest der Formel (b1) oder (b2) an die Aminogruppe der Seitenkette substituiertes Orn oder Lys ist;
F1 D-3-Pal, DPhe, D-Orn, D-Lys, D-His (subst.
H oder Benzyl), D-Nic-Lys, D-MNic-Lys, D-Pic-Lys, D-PzcLys, cis-D-PzACAla, D-Trp, D-Tyr, D-2-Nal, D-Arg, D-Cit, D-HCi, D-homoArg-(Et2) oder durch einen Amadori-Zuckerrest wie oben definiert oder durch mindestens einen Rest der Formel (b1) oder (b2) an die Aminogruppe der Seitenkette substituiertes D-Orn oder D-Lys ist;
G1 Leu, Nle, Val oder Phe ist;
H1
EMI24.1
ist,
worin W min wie oben definiert ist, R min a und R min b unabhängig voneinander Wasserstoff, ein Amadori-Zuckerrest der Formel (Ia1), (Ia2), (Ib1), (Ib2), (Id3) oder (Id4), oder ein Rest der Formel (b1) oder (b2) sind;
I1 Pro ist;
K1 D-Ala, D-Ser oder Gly ist.
Es ist zu verstehen, dass, wenn die Verbindungen der Formel X oder XI mindestens einen Rest der Formel (b1) oder (b2) enthalten, diese auch die physiologisch-hydrolysierbaren und annehmbaren Ester davon, wie oben angegeben, umfassen.
In der vorliegenden Beschreibung und in den Ansprüchen bedeutet der Ausdruck "Halogen" vorzugsweise Fluor, Chlor oder Brom.
Die erfindungsgemässen Verbindungen können in freier Form oder in einer pharmazeutisch akzeptablen Salz- bzw. Komplexform vorliegen. Als Säureadditionssalze kommen solche mit organischen Säuren, polymeren Säuren oder anorganischen Säuren in Frage. Als Beispiele für Säureadditionssalze seien die Hydrochloride und Acetate genannt. Unter Komplexen sind solche an sich bekannten Verbindungen zu verstehen, die beim Zusatz anorganischer Substanzen, wie Salze oder Hydroxide (z.B. Ca-, Zn-Salze) und/oder beim Zusatz polymerer organischer Stoffe entstehen.
Die erfindungsgemässen Verbindungen können hergestellt werden, indem
i) wenigstens eine Schutzgruppe, die an einem geschützten erfindungsgemässen Peptid vorhanden ist, entfernt wird; oder
ii) zur Herstellung eines erfindungsgemässen Peptids, das mindestens einen Rest der Formel (b1) oder (b2) enthält, eine Verbindung der Formel (III),
EMI26.1
worin
f wie oben definiert ist,
entweder g 0 oder 1 ist,
Y1 und Y2 eine der oben angegebenen Bedeutungen haben, und
Z4 -CHO ist,
oder g 1 ist,
Z4 CH2OH ist und -CY1Y2- zusammen Carbonyl bilden,
wobei die freien Hydroxygruppen dieser Verbindung veräthert oder verestert sein können,
mit einer Verbindung der Formel (IV),
P-NH2 (IV)
worin P ein Calcitoninpeptidrest oder ein LHRH-Antagonistrest ist, dessen freie Aminogruppen in geschützter Form sind,
einer reduktiven Aminierung unterzogen wird und dann gegebenenfalls die Stufe i) des Verfahrens durchgeführt wird; oder
iii) zur Herstellung einer Calcitoninverbindung mit mindestens einer an eine Aminogruppe anders als eine N-terminale Aminogruppe gebundenen Formyl- oder C3-5Alkylgruppe,
eine Verbindung der Formel IV wie oben definiert mit einer Verbindung der Formel (V),
Z5-CHO (V)
worin Z5 Wasserstoff oder C3-5Alkyl bedeutet
oder mit einem Chloroformiat umgesetzt wird,
und dann gegebenenfalls die Stufe i) des Verfahrens durchgeführt wird;
oder
iv) zwei Peptideinheiten, wovon jede mindestens eine Aminosäure in geschützter oder ungeschützter Form und eine Peptideinheit einen Rest a) bis f) wie in Anspruch 1 definiert enthält, durch eine Amidbindung verbunden werden, wobei die Peptidbindung in einer Weise erfolgt, dass sich die gewünschte Aminosäuresequenz ergibt, und dann gewünschtenfalls die Stufe i) des Verfahrens durchgeführt wird; oder
v) eine funktionelle Gruppe eines ungeschützten oder geschützten Peptids in eine andere funktionelle Gruppe umwandelt oder entfernt wird, so dass sich ein ungeschütztes oder ein geschütztes Peptid ergibt und im letztgenannten Fall die Stufe i) des Verfahrens durchgeführt wird;
oder
vi) zur Herstellung eines Calcitoninpeptides oder LHRH-Antagonists, das mindestens einen Rest a1) enthält, wenigstens ein gegebenenfalls geschützter Rest a1) in ein geschütztes oder ungeschütztes Peptid eingeführt wird und dann gegebenenfalls die Stufe i) des Verfahrens durchgeführt wird; oder
vii) die optischen Isomeren von einer gemäss einer Stufe (i) bis
(vi) hergestellten Isomerenmischung getrennt werden; und die Verbindung in freier Form, in Form eines Salzes oder Komplexform isoliert wird.
Das obige Verfahren kann beispielsweise analog zu den in den nachstehenden Beispielen beschriebenen Verfahren ausgeführt werden.
Die Verfahrensstufen i), iv), v) und vii) können nach an sich in der Peptidchemie bekannten Methoden durchgeführt werden.
Gewünschtenfalls können bei diesen Umsetzungen Schutzgruppen, die sich bei Peptiden oder Zucker eignen, für funktionelle Gruppen verwendet werden, die nicht an der Umsetzung teilnehmen. Unter solchen Schutzgruppen werden auch Polymerharze mit funktionellen Gruppen verstanden.
Die Herstellungsstufe ii) kann in üblicher Weise wie für die reduktive Aminierung einer Aldose oder Ketose durchgeführt werden. Die reduktive Aminierung lässt sich beispielsweise mit NaBH3CN bewerkstelligen. Hierbei ist ein saurer pH-Wert, beispielsweise von 5-7 bevorzugt. Die Temperatur kann zwischen Raumtemperatur bis 100 DEG C betragen. Die Umsetzung kann auch vorteilhaft in Gegenwart eines inerten Lösungsmittels, beispielsweise wie Wasser, ein Alkohol, Dioxan oder Dimethylformamid oder eine Mischung hiervon durchgeführt werden.
Die Herstellungsstufe iii) kann in üblicher Weise wie für beispielsweise die Formilierung oder reduktive Alkylierung ausgeführt werden. Die Umsetzung kann beispielsweise in Gegenwart von NaBH3CN, vorzugsweise in einem sauren pH, bei einer Temperatur und Lösungsmittelbedingungen, z.B. wie oben für die Herstellungsstufe ii) beschrieben, durchgeführt werden.
Die erfindungsgemässen Verbindungen oder Peptidfragmente, die einen Rest der Formel (Ia) tragen, können hergestellt werden, indem ein geschütztes Peptid oder Peptidfragment, das eine freie Aminogruppe enthält, in einem leicht sauren Medium mit einem reduzierenden Monosaccharid, Disaccharid oder Oligosaccharid oder einer entsprechenden Uronsäure oder einem Ester hiervon (Amadori-Umlagerung) ungesetzt wird und dann gewünschtenfalls die Schutzgruppen entfernt werden.
Diese Umsetzung kann in einer für die Amadori-Umlagerung üblichen Weise durchgeführt werden. Die zugesetzte Säure kann beispielsweise Eisessig sein. Bei der Umsetzung mit einer Uronsäure kann auf eine zusätzliche Säure verzichtet werden. Vorzugsweise wird mit einem Überschuss an Kohlenhydrat gearbeitet, der beispielsweise 10 Äquivalente auf 1 Äquivalent der Peptidverbindung ausmacht. Die Umsetzung wird in einem polaren Lösungsmittel, wie Methanol, vorzugsweise bei Temperaturen von etwa 50 bis 70 DEG C durchgeführt.
Die erfindungsgemässen Verbindungen oder Peptidfragmente, die einen Rest der Formel (Ib) tragen, können dadurch hergestellt werden, dass ein geschütztes Peptid oder Peptidfragment, das eine freie Aminogruppe aufweist, in einem schwach sauren Medium mit einer Ketose (Heyns-Umlagerung) umgesetzt wird. Diese Umsetzung kann unter den gleichen Bedingungen wie die Amadori-Umlagerung (siehe oben) durchgeführt werden.
Die erfindungsgemässen Verbindungen oder Peptidfragmente, die einen Rest der Formel (Ic) tragen, können dadurch hergestellt werden, dass ein geschütztes Peptid oder Peptidfragment, das eine freie Aminogruppe aufweist, mit einer Säure der Formel G3-COOH oder einem reaktionsfähigen Derivat einer solchen Säure umgesetzt wird und dann gewünschtenfalls die Schutzgruppe oder die Schutzgrupppen entfernt werden. Hierbei handelt es sich um eine übliche Amidierungsreaktion, die in an sich bekannter Weise durchgeführt werden kann. Die Amide können beispielsweise mit den freien Säuren in Gegenwart von Hydroxybenzotriazol und Dicyclohexylcarbodiimid hergestellt werden.
Die erfindungsgemässen Verbindungen oder Peptidfragmente, die einen Rest der Formeln (Id1), (Id2), (Id3) oder (Id4) tragen, können dadurch hergestellt werden, dass
a) das Peptid oder Peptidfragment zuerst mit dem Brückenglied umgesetzt und das Produkt dann mit dem Zucker zur Reaktion gebracht wird oder
b) der Zucker zuerst mit dem Brückenglied umgesetzt und das glykosylierte Brückenglied dann mit dem Peptid oder Peptidfragment zur Reaktion gebracht wird.
Diese Umsetzungen können in bekannter Weise durchgeführt werden.
Die erfindungsgemässen Verbindungen oder Peptidfragmente, die einen Rest der Formel (Id1) tragen, worin Q für -CO- oder -CS- steht, können beispielsweise dadurch hergestellt werden, dass man das entsprechende Glykosylisocyanat oder Glykosylisothiocyanat der Formel
EMI31.1
worin L für O oder S steht und
G4 wie oben definiert ist
und worin die in der Gruppe G4 vorhandenen freien Hydroxylgruppen geschützt sind, nämlich beispielsweise acyliert sind, an ein Peptid oder Peptidfragment in geschützter Form kuppelt und dann die Schutzgruppen abspaltet.
Diese Umsetzung kann zur Herstellung von Harnstoffderivaten in üblicher Weise durchgeführt werden.
Die erfindungsgemässen Verbindungen oder Peptidfragmente, die einen Rest der Formel (Id3) oder (Id4) tragen, können beispielsweise unter Anwendung einer Amadori-Umlagerung oder einer Heyns-Umlagerung hergestellt werden, wie dies beispielsweise oben für die Herstellung von einem Rest oder Formel (Ia) oder (Ib) tragenden Verbindungen beschrieben worden ist.
Eine erfindungsgemässe Verbindung oder ein Peptidfragment, die einen Rest der Formel (Ie1) oder (Ie2) tragen, lässt sich beispielsweise herstellen, indem
a min ) eine Aldose, Desoxyaldose oder Ketose mit dem Peptid oder Peptidfragment, das eine freie Aminogruppe trägt, einer reduktiven Aminierung, z.B. wie oben in der Stufe ii) beschrieben, unterzogen wird oder
b min ) die Hemiacetalgruppe einer einen Rest der Formel (Ia) oder (Ib) tragenden Verbindung reduziert wird, wobei jeder Reaktant gewünschtenfalls temporär geschützt sein kann.
Die Peptidfragmente, die einen Rest der Formel a), (b1) oder (b2) enthalten und als Ausgangsmaterial in der obigen Herstellungsstufe iv) verwendet werden, können unter Verwendung eines "Bausteines" hergestellt werden, z.B. eine entsprechende alpha -Aminosäure, deren Seitenketteaminogruppe durch diesen Rest substituiert ist, vorzugsweise eine Lys- oder Orneinheit, die in N< epsilon > bzw. N<d> durch einen Rest a) oder vorzugsweise durch einen oder zwei Reste der Formel (b1) oder (b2) substituiert ist. Ein solcher Baustein kann hergestellt werden, indem die entsprechende Aminosäure (oder Peptidfragment) in geschützter Form analog zu bekannten Methoden umgesetzt wird, z.B. durch reduktive Aminierung zur Einführung der Reste der Formel (b1) oder (b2), beispielsweise wie oben oder nachträglich in den Beispielen beschrieben.
Der Baustein kann für die Peptidsynthese in Lösung oder in Festphasenverfahren eingesetzt werden.
Die Calcitoninpeptide, die in Stellung 24 einen alpha -Aminosäurerest
EMI32.1
worin Z min W-NH2, besonders einen omega -Amino-C1-6alkylrest bedeutet, in freier Form oder in Salz- oder Komplexform und als Ausgangsmaterial, z.B. in der Herstellungsstufe ii) oder iii) eingesetzt werden, sind neu und gehören auch zur Erfindung. Diese Peptide können nach im allgemeinen für die Herstellung von Verbindungen dieses Typs bekannten Methoden, z.B. in Lösung oder durch Festphaseverfahren, hergestellt werden.
Insofern die Herstellung der Ausgangsprodukte nicht besonders beschrieben wird, sind die Verbindungen bekannt oder können nach an sich bekannten Methoden hergestellt und gereinigt werden.
In den nachfolgenden Beispielen erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden und sind die [ alpha ]D-Werte unkorrigiert. Die folgenden Abkürzungen werden verwendet:
<tb><TABLE> Columns=3
<tb> <SEP>BOC <SEP>= <SEP>tert.-Butyloxycarbonyl
<tb> <SEP>DMF <SEP>= <SEP>Dimethylformamid
<tb> <SEP>MeOH <SEP>= <SEP>Methanol
<tb> <SEP>AcOH <SEP>= <SEP>Essigsäure
<tb> <SEP>Bu<t> <SEP>= <SEP>tert.Butyl
<tb> <SEP>Fmoc <SEP>= <SEP>9-Fluorenylmethoxycarbonyl
<tb> <SEP>DCM <SEP>= <SEP>Dichloromethan
<tb> <SEP>Abu <SEP>= <SEP>2-Aminobuttersäure
<tb> <SEP>AnGlu <SEP>= <SEP>4-(4-Methoxyphenylcarbamoyl)-2-aminobuttersäure
<tb> <SEP>BzLys <SEP>= <SEP>N< epsilon >-Benzoyllysin
<tb> <SEP>Cit <SEP>= <SEP>Citrullin = 2-Amino-5-ureidopentansäure
<tb> <SEP>HCi <SEP>= <SEP>Homocitrullin = 2-Amino-6-ureidohexansäure
<tb> <SEP>CypLys <SEP>= <SEP>N< epsilon >-Cyclopentyllysin
<tb> <SEP>DMGLys <SEP>=
<SEP>N< epsilon >-(N,N-Dimethylglycyl)lysin
<tb> <SEP>HOBLys <SEP>= <SEP>N< epsilon epsilon >-(4-Hydroxybenzoyl)lysin
<tb> <SEP>Ilys <SEP>= <SEP>N< epsilon epsilon >-Isopropyllysin
<tb> <SEP>IOrn <SEP>= <SEP>N<d>-Isopropylornithin
<tb> <SEP>MNicLys <SEP>= <SEP>N< epsilon >-(6-Methylnicotinoyl)lysin
<tb> <SEP>MPicLys <SEP>= <SEP>N< epsilon >-(6-Methylpicolinoyl)lysin
<tb> <SEP>NACAla <SEP>= <SEP>3(4-Nicotinoylaminocyclohexyl)alanin
<tb> <SEP>2-Nal <SEP>= <SEP>3-(2-Naphtyl)alanin
<tb> <SEP>NicLys <SEP>= <SEP>N< epsilon >-Nicotinoyllysin
<tb> <SEP>NicOrn <SEP>= <SEP>N<d>-Nicotinoylornithin
<tb> <SEP>Nle <SEP>= <SEP>Norleucin, 2-Aminohexansäure
<tb> <SEP>NMeLeu <SEP>= <SEP>N-Methylleucin
<tb> <SEP>Nval <SEP>= <SEP>Norvalin,
2-Aminopentansäure
<tb> <SEP>3-Pal <SEP>= <SEP>3-(3-Pyridyl)alanin
<tb> <SEP>pClPhe <SEP>= <SEP>3-(4-Chloro)phenylalanin
<tb> <SEP>PicLys <SEP>= <SEP>N< epsilon >-Picoloyllisin
<tb> <SEP>Pip <SEP>= <SEP>Piperidin-2-carbonsäure
<tb> <SEP>PmcLys <SEP>= <SEP>N< epsilon >-(4-Pyrimidinylcarbonyl)lysin
<tb> <SEP>PmACAla <SEP>= <SEP>3[4(4-Pyrimidinylcarbonyl)aminocyclohexyl]alanin
<tb> <SEP>PzACAla <SEP>= <SEP>3(4-Pyrazinylcarbonylaminocyclohexyl)alanin
<tb> <SEP>3-PzAla <SEP>= <SEP>3-Pyrazinylalanin
<tb> <SEP>PzcLys <SEP>= <SEP>N< epsilon >-Pyrazinylcarbonyllysin
<tb> <SEP>Sar <SEP>= <SEP>N-Methylglycin
<tb> <SEP>TinGly <SEP>= <SEP>3-Thienylglycin
<tb> <SEP>(AA) <SEP>= <SEP>p-Methoxy-phenyl
<tb></TABLE>
Alle Peptide werden als Polyacetate-polyhydrate erhalten mit einem Peptidgehalt von 70 bis 90%. Die HPLC-Analyse ergibt, dass die Polypeptide weniger als 5% an anderen Peptiden enthalten.
Der in den nachfolgenden Beispielen angeführten Faktor "F" gibt den Peptidgehalt in den erhaltenen Produkten an (F = 1 kommt mit einem 100% Peptidgehalt überein). Die Differenz zu 100% besteht aus Essigsäure und Wasser.
BEISPIEL 1:
CH3CO-D-2-Nal-DPhe(p-Cl)-DTrp-Ser-Tyr-DLys(CH2-CHOH-CH2OH)-Leu-Lys(CH2-CHOH-CH2OH)-Pro-DAla-NH2
300 mg CH3CO-D-2-Nal-DPhe(p-Cl)-DTrp-Ser-Tyr-DLys-Leu-Lys-Pro-DAla-NH2 und 90 ml D-(+)-Glycerinaldehyd werden in MeOH in Gegenwart von Natriumphosphatpuffer bei pH 6 gelöst. Insgesamt werden 260 mg NaCNBH3 dazugegeben, der pH der erhaltenen Mischung wird bei 5-6 durch Zugabe von 10% H3PO4 gehalten und die Mischung bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Anschliessend wird die Mischung mit Wasser verdünnt und der pH auf 8-9 durch Zugabe von 1 N Ammoniumhydroxid eingestellt. Die leicht trübe Lösung wird langsam auf eine Duolitesäule filtriert und die Säule mit Wasser gespült. Das adsorbierte Produkt wird mit einem Dioxan/Wasser/AcOH-Gemisch eluiert und das erhaltene Eluat wird im Vakuum eingeengt, mit Wasser verdünnt und dann lyophilisiert.
Das Lyophilisat wird gereinigt 1. durch Chromatographie an Kieselgel in einem Gemisch von CHCl3/MeOH/AcOH/Wasser und 2. durch HPLC auf einer RP-18-Säule (Acetonitril-2% H3PO4). Die Fraktionen, die die Titelverbindung enthalten, werden vereinigt und durch ein Ionenaustauscherharz (AG3-X4) in Acetatform filtriert. Die Titelverbindung wird im Vakuum eingeengt, mit Wasser verdünnt und lyophilisiert.
[ alpha ]20_D = -34 DEG (c = 0,1 in 95% AcOH), F = 0,83.
BEISPIEL 2:
CH3CO-Dphe(p-Cl)-DPhe(p-Cl)-DTrp-Ser-Tyr-DLys(R2)-Leu-Lys(R2)-Pro-DAla-NH2
EMI36.1
420 mg CH3CO-DPhe(p-Cl)-DPhe(p-Cl)-DTrp-Ser-Tyr-DLys-Leu-Lys-Pro-DAla-NH2 werden in einer Mischung von 15 ml MeOH und 15 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer bei pH 5,5 gelöst und unter Argonatmosphäre gesetzt. 300 mg Glykolaldehyd und insgesamt 720 mg NaCNBH3 werden dazu gegeben und die erhaltene Mischung wird für 1 Stunde bei Raumtemperatur und anschliessend während ca. 15 Stunden bei 50 DEG C gerührt. Der pH der Mischung wird auf 2 durch Zugabe von 1N HCl eingestellt und die Mischung für eine Stunde bei pH 2 weitergerührt. Nach Verdünnen mit Wasser und einer kleinen Acetonitrilmenge, wird die Mischung auf eine Reversed Phase (RP)-18 HPLC-Säule (z.B. HDSIL-18-10-100) gegeben und das adsorbierte Produkt wird mit einem Acetonitrilgradienten in 2% H3PO4 auf die RP-18-Säule eluiert.
Die die Titelverbindung enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und durch ein schwach basisches Ionenaustauscherharz in Acetatform (BioRad AGX4, Acetat) filtriert. Das Eluat wird im Vakuum eingeengt, der Rückstand mit Wasser verdünnt und dann lyophilisiert. Die erhaltene Titelverbindung hat einen
[ alpha ]20_D = -20 DEG (c = 1 in 95% AcOH).
BEISPIEL 3:
CH3CO-D-2-Nal-DPhe(p-Cl)-DTrp-Ser-Tyr-DTrp-Leu-Lys(CH2-CHOH-CH2OH)-Pro-DAla-NH2
Das Verfahren des Beispiels 1 wird wiederholt.
[ alpha ]20_D = -33 DEG (c = 0,1 in 95% AcOH).
BEISPIEL 4:
EMI37.1
R = N< epsilon >-1-Desoxy-fructosyl
120 mg CH3CO-DPhe(p-Cl)-DPhe(p-Cl)-DTrp-Ser-Tyr-DLys-Leu-Lys-Pro-DAla-NH2 und 310 mg D(+)Glucose in 24 ml DMF/AcOH 15:1 werden während 4 Stunden bei 55 DEG C gerührt. Das Umsetzungsgemisch wird mit Äther ausgefällt und filtriert. Der Rückstand wird in Wasser gelöst, auf pH 7-7,5 mit verdünntem Ammoniumhydroxid eingestellt, und durch Adsorption auf Duolite ES 861 und Elution mit einem Gradienten von H2O -> Dioxan-H2O-AcOH gereinigt. Das Eluat wird im Vakuum eingeengt und dann lyophilisiert.
Das Lyophilisat wird gereinigt durch
1. Chromatographie an Kieselgel in einem Gemisch von CHCl3/MeOH/AcOH/H2O als Eluat oder durch Reversed-Phase Chromatographie an eine Octadecyl-Silica-Kolonne;
2. Adsorption auf Duolite ES 861 und Elution mit einem Dioxan/Wasser/AcOH-Gemisch wie oben beschrieben.
Die die Titelverbindung erhaltenen Fraktionen werden vereinigt, eingeengt und lyophilisiert, was zu der Titelverbindung führt.
[ alpha ]20_D = -37 DEG (c = 0,5 in 95% AcOH)
BEISPIEL 5:
EMI38.1
R = N< epsilon >-1-Desoxyfructosyl
Die Titelverbindung wird auf analoger Weise wie im Beispiel 1 beschrieben hergestellt.
[ alpha ]20_D = -34 DEG (c = 0,5 in 95% AcOH).
BEISPIEL 6
Beim Wiederholen des Verfahrens aus Beispiel 4 können folgende Verbindungen hergestellt werden:
CH3CO-A-DPhe(p-Cl)-DTrp-Ser-Tyr-F-Leu-H-Pro-DAla-NH2
EMI38.2
Die in den obigen Beispielen verwendeten Ausgangsmaterialien werden auf analoge Weise, wie z.B. in USP 4 628 044 beschrieben, hergestellt.
BEISPIEL 7:
EMI39.1
R = N< epsilon >-1-Deoxyfructosyl
Man löst 10,3 g N< alpha >-Isocaproyl-des(1-4)-[Ala<7>,Lys<2><4>)salmcalcitonin polyacetat und 1,8 g D(+)-Glucose in einem Gemisch von 94 ml DMF und 6 ml Essigsäure. Nach 2 Stunden, bei 50 DEG C, fällt man das Produkt durch Zugabe von Ether vollständig aus, nutscht ab, wäscht mit Ether nach und trocknet im Vakuum. Zur Reinigung löst man ca. 5-10 g des Produktes in Wasser, gibt die Lösung auf eine Umkehrphasensäule 4 x 25 cm, C-18 auf Kieselgel und chromatographiert mit einem Gradienten aus Wasser und 0-80% eines Lösungsmittelgemisches bestehend aus 38 Teilen Wasser, 60 Teilen Acetonitril und 2 Teilen 85%-iger Phosphorsäure. Die Fraktionen, welche das reine Produkt enthalten, werden vereinigt, über eine Säule von ca. 100 ml eines schwach basischen Ionenaustauschers in der Acetatform filtriert und mit Wasser nachgewaschen.
Man lyophilisiert das Filtrat und erhält die Titelverbindung als Polyacetat, Polyhydrat.
[ alpha ]20_D = -36,8 DEG (c = 0,3 in CH3COOH 95%), F = 0,73
FAB-Massenspektroskopie: 3541 (MH<+>).
Das verwendete Ausgangsprodukt kann wie folgt hergestellt werden:
EMI40.1
Dieses Peptid wird stufenweise auf einem Polystyrolharz als Träger aufgebaut. Die Boc-Gruppe wird als Schutzgruppe für die "-Aminogruppen verwendet und die funktionellen Gruppen in den Seitenketten wie folgt geschützt: Lys(2-Chlorbenzyloxycarbonyl), Ser(Benzyl), Thr(Benzyl), His(Tosyl), Tyr(4-Bromobenzyloxycarbonyl), Cys(4-Methylbenzyl), Glu(Benzyl).
Amino-4-methylphenyl-methyl-co(polystyrol-divinylbenzol)-harz (= MBHA-Harz) (0,7 mmol/g) werden dem nachfolgenden Behandlungszyklus, Stufen 1 bis 7, unterworfen:
(1) DCM
(2) Trifluoressigsäure (50%) in DCM
(3) DCM
(4) Diisopropyläthylamin (10%) in DMF
(5) DMF
(6) vorher hergestelltes symmetrisches Anhydrid (2,8 mmol per g Ausgangsharz) einer Boc-Aminosäure in DMF
(7) DMF
Die Volumen der Waschlösungen und Reagenzien betragen 5 bis 20 ml pro Gramm des Ausgangsharzes.
Jede Stufe wird so oft wiederholt als notwendig ist, entweder für die vollständige Reaktion des Harzes (Stufen 2, 4, 6) oder für die vollständige Entfernung des vorhergehenden Reagenzes vom Harz (Stufen 1, 3, 5, 7). Nach jedem Zyklus werden Proben des Harzes genommen und auf Vollständigkeit der Reaktion mittels des Ninhydrintestes geprüft.
Die symmetrischen Anhydride der Boc-Aminosäuren werden gerade vor Verwendung hergestellt durch Reaktion der Boc-Aminosäure (2,8 mmol pro g Harz) und DCCI (1,4 mmol pro g Harz) in DCM, welches soviel DMF enthält als notwendig ist für die vollständige Auflösung der Boc-Aminosäure. Das Gemisch wird filtriert, weiteres DMF dem Filtrat zugegeben, das Volumen durch Verdampfen des DCM bei einer Temperatur nicht höher als 15 DEG C verringert und die erhaltene Lösung in der Stufe 6) verwendet.
Der Zyklus der Reaktionen 1) bis 7) wird für alle Aminosäurereste in der Weise wiederholt, dass die Aminosäuresequenz der Formel I erhalten wird, wobei jedoch Boc-Gln-OH und Boc-Arg(Tos)-OH in der Stufe 6) als vorher hergestellte Ester mit 1-Hydroxybenzotriazol in DMF eingesetzt werden.
Im letzten Zyklus, in der Stufe 6), werden Isocapronsäure, Diisopropylcarbodiimid und 1-Hydroxybenzotriazol (für alle 3,5 mmol pro g des Ausgangsharzes) in DMF dem Harz zugegeben. Nach 15 Stunden wird das Harz gewaschen mit DMF und DCM getrocknet.
Zu dem Peptidharz (1 g) gibt man p-Kresol (1 g), Dimethylsulfid (1 ml) und HF (10 ml). Nach einer Stunde bei 0 DEG C werden die flüchtigen Bestandteile bei 0 DEG C abdestilliert. Der Rückstand wird mit Aethylacetat gewaschen, mit mehreren Portionen Essigsäure (10%) in Wasser extrahiert und der wässrige Extrakt lyophilisiert. Das lyophilisierte Produkt wird gereinigt durch "reversed-phase"-Chromatographie auf einer Octadecyl-Silicasäule, welche mit einem Gradient von Acetonitril in Phosphorsäure (2%) eluiert wird. Fraktionen, welche die Verbindung in reiner Form enthalten, werden zusammengefügt, durch ein schwach basisches Ionenaustauscherharz in Acetatform filtriert, lyophilisiert und getrocknet.
Die Titelverbindung a) wird als weisses, flockiges Pulver erhalten.
[ alpha ]20_D = -34,3 DEG (c = 0,26 in AcOH 95%), F = 0,78.
FAB-Massenspektroskopie: 3054 (MH+).
BEISPIEL 8:
N< alpha >-Fmoc-N< epsilon >-2,3-0,0 min -isopropyliden-2,3-dihydroxy-(2S)-propyl-lysin
4 g Fmoc-Lys-OH,HCl werden in 80 ml MeOH/H2O gelöst und der pH auf 5 mittels eines Phosphatpuffers eingestellt. Nach Zugabe von 2,6 g 2,3-0,0 min -Isopropyliden-D-glycerinaldehyd und 3,1 g NaCNBH3, wird die Mischung 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die pH-Erhöhung, die gegebenenfalls während der Umsetzung stattfindet, wird durch Zugabe von 10% H3PO4 eingestellt. Am Ende der Umsetzung (Dünnschichtchromatographie) wird der pH auf 3 durch HCl eingestellt, die Mischung wird mit Wasser verdünnt und dann mit einem CH2Cl2/Isopropanolgemisch (4/1 v/v) extrahiert. Nach Chromatographie auf Kieselgel wird die Titelverbindung in Form eines amorphen Produktes erhalten.
[ alpha ]20_D = + 0,3 DEG (c = 1 in DMF).
Die folgende Verbindung kann auch als Nebenprodukt erhalten werden:
N< alpha >-Fmoc, N< epsilon >, N< epsilon >-Bis-(2,3-0,0 min -isopropyliden-2,3,dihydroxy-(2S)propyl)-lysin.
[ alpha ]20_D = 0 DEG (c = 1 in DMF).
BEISPIEL 9:
N< alpha >-Fmoc-N< epsilon >-2,3,-0,0 min -isopropyliden-2,3-dihydroxy-(2S)-propyl-N< epsilon >-BOC-lysin
2,4 g der Verbindung von Beispiel 8 werden in 200 ml DMF/H2O (3/1 V/V) gelöst und nach Zugabe von 4,3 g NaHCO3 werden noch 2,3 g BOC2O zugefügt. Nach 30 Minuten wird die Mischung mit Wasser verdünnt, der pH auf 3 durch HCl eingestellt und die Mischung mit CH2Cl2 extrahiert. Die organische Phase wird getrocknet, eingeengt und der Rückstand durch Chromatographie auf Kieselgel (Elution mit CH2Cl2/MeOH 8/2) gereinigt, wobei die Titelverbindung erhalten wird.
[ alpha ]20_D = -8,3 DEG (c = 1 in DMF).
BEISPIEL 10:
EMI43.1
R = N< epsilon >-1-Deoxyfructosyl
Diese Verbindung wird in zu Beispiel 7 analoger Weise ausgehend von N< alpha >-Isocaproyl-des(1-4-[Ala<7>,Aib<10,17>,Lys<2><4>]salmcalcitonin hergestellt.
[ alpha ]20_D = -39,0 DEG (c = 0,22 in 95% AcOH), F = 0,85.
FAB-MS: 3516,1 (MH+)
(Die Herstellung des Ausgangsmaterials wird in Beispiel 16 beschrieben).
BEISPIEL 11:
EMI44.1
R = N< epsilon >-1-Deoxyfructosyl
Diese Verbindung wird in zu Beispiel 7 analoger Weise ausgehend von N< alpha >-Isocaproyl-des(1-4)-[Ala<7>,Aib<10,17>Lys(For)<11,18>,Lys<2><4>]-salmcalcitonin hergestellt.
[ alpha ]20_D = -60,7 DEG (c = 0,29 in 95% AcOH), F = 0,90.
FAB-MS: 3280 (MH<+>)
(Die Herstellung des Ausgangsmaterials wird in Beispiel 24 beschrieben).
BEISPIEL 12:
EMI45.1
80 mg N alpha -Isocaproyl-des(1-4)-[Ala<7>,Lys<2><4>]salmcalcitonin, 53 mg 2,4,5-Trichlorphenylformiat und 0,081 ml N-Äthyldiisopropylamin in 8 ml DMF werden 15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Hierauf werden 200 ml Ether zugegeben, die Ausfällung wird filtriert, mit Ether gewaschen und getrocknet. Das Produkt wird durch Reversed-Phase-Chromatographie auf C-18 Kieselgel unter Verwendung eines Gradienten von Acetonitril in 2% Phosphorsäure gereinigt. Fraktionen, welche die Verbindung in reiner Form enthalten, werden vereinigt, durch ein schwach basisches Ionenaustauscherharz in Acetatform filtriert und mit Wasser gewaschen. Das Filtrat wird lyophilisiert, wobei die Titelverbindung als Polyacetat, Polyhydrat erhalten wird.
[ alpha ]20_D = -28,3 DEG (c = 0,24 in 95% AcOH), F = 0,93.
FAB-Massenspektroskopie: MH<+> = 3138,1.
BEISPIEL 13:
EMI45.2
Diese Verbindung wird in zu Beispiel 12 analoger Weise ausgehend von N< alpha >-Isocaproyl-des(1-4)-[Ala<7>]salmcalcitonin hergestellt.
[ alpha ]20_D = - 26,5 DEG (c = 0,2 in 95% AcOH), F = 0,99.
FAB-MS: 3138,7 (MH<+>).
EMI46.1
Diese Verbindung wird in zu Beispiel 7a) analoger Weise hergestellt.
[ alpha ]20_D = -32,2 DEG (c = 0,3 in 95% AcOH), F = 0,87.
BEISPIEL 14:
EMI46.2
Diese Verbindung wird in zu Beispiel 12 analoger Weise ausgehend von N< alpha >-Isocaproyl-des(1-4)-[Ala<7>,Aib<10,17>,Lys<2><4>]salmcalcitonin hergestellt.
[ alpha ]20_D = -36,5 DEG (c = 0,26 in 95% AcOH), F = 0,98.
(Die Herstellung des Ausgangsmaterials wird in Beispiel 16 beschrieben).
BEISPIEL 15:
EMI46.3
R = (2S)-2,3-Dihydroxypropyl-
100 mg N< alpha >-Isocaproyl-des(1-4)-[Ala<7>]salmcalcitonin, 16,4 mg NaCNBH3 und 11,7 mg D-(+)-Glycerin-aldehyd werden in 2 ml Methanol und 1 ml Wasser gelöst, die Mischmenge auf pH 6 durch Zugabe von 0,1 N HCl eingestellt und 30 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Umsetzungsgemisch wird auf pH 2 durch HCl angesäuert, 2 Stunden gerührt und anschliessend werden die Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird auf einer C-18 Kieselgelsäule unter Verwendung eines Gradienten von Acetonitril in 10 mM NaH2PO4 chromatographiert. Fraktionen, welche die Verbindung in reiner Form enthalten, werden vereinigt, durch ein schwach basisches Ionenaustauscherharz in Acetatform filtriert und mit Wasser gewaschen. Das Filtrat wird lyophilisiert, wobei die Titelverbindung als Polyacetat, Polyhydrat erhalten wird.
[ alpha ]20_D = -23,9 DEG (c = 0,1 in 95% AcOH), F = 0,79.
FAB-MS: 3230,6 (MH<+>).
Die folgenden Beispiele 16, 17, 18 und 20 werden in zu Beispiel 15 analoger Weise hergestellt:
BEISPIEL 16:
EMI47.1
R = CH2CH2-OH
Ausgehend von N< alpha >-Isocaproyl-des(1-4)-[Ala<7>,Aib<10,17>Lys<2><4>]salmcalcitonin und unter Verwendung eines 20 mal molaren Überschusses von Glykolaldehyd und NaBH3CN bei pH 5 und 45 DEG C während 15 Stunden wird die Titelverbindung nach Reinigung erhalten.
[ alpha ]20_D = -72,0 DEG (c = 0,3 in 95% AcOH), F = 0,77.
a) Das Ausgangsmaterial N< alpha >-Isocaproyl-des(1-4)-[Ala<7>,Aib<10,17>,Lys<2><4>]salmcalcitonin wird in zu Beispiel 7a analoger Weise unter Verwendung von Boc-Lys(2-chlorobenzyloxy-carbonyl)-OH zur Einführung in Stellung 24 und Boc-Aib-OH zur Einführung in den Stellungen 17 und 10 der stufenweise Synthese hergestellt.
BEISPIEL 17:
EMI48.1
R = CH2CH2OH
Ausgehend von N alpha -Isocaproyl-des(1-4)-[Ala<7>,Aib<10,17>,Lys(For)-<11,18>,Lys<2><4>]salmcalcitonin und unter Verwendung der Bedingungen aus Beispiel 16 wird die Titelverbindung hergestellt.
[ alpha ]20_D = -63,9 DEG (c = 0,3 in 95% AcOH), F = 0,76.
BEISPIEL 18:
EMI48.2
R = 2,3-0,0 min -Isopropyliden-(2S)-2,3-dihydroxy-propyl
Die Titelverbindung wird ausgehend von N< alpha >-Isocaproyl-des(1-4)-[Ala<7>Aib<10,17>,Lys(For)<11,18>,Lys<2><4>]-salmcalcitonin und dem 2,3-0,0 min -Isopropylidenderivat des D(+)-Glyceraldehyd, mit Trennung der mono-substituierten Verbindung von der di-substituierten durch Reversed-Phase-Chromatographie unter Verwendung eines Gradienten von Acetonitril in 10 mM Natriumdihydrogenphosphat hergestellt.
[ alpha ]20_D = -59,0 DEG (c = 0,14 in 95% AcOH), F = 0,94.
FAB-MS: 3203 (MH<+>).
BEISPIEL 19:
EMI49.1
R = (2S)-2,3-Dihydroxypropyl-
Die Titelverbindung wird durch Behandlung der Verbindung des Beispiels 18 mit einer Mischung von 5% Wasser in TFA 10 Minuten bei Raumtemperatur, Ausfällung durch Zugabe von Ether und Reinigung gemäss Beispiel 15 hergestellt.
[ alpha ]20_D = -65,8 DEG (c = 0,11 in 95% AcOH), F = 0,97.
FAB-MS: 3162 (MH<+>).
BEISPIEL 20:
EMI49.2
R = 2,3-0,0 min -Isopropyliden-(2S)-2,3-dihydroxy-propyl
Die Titelverbindung wird nach dem Beispiel 18 durch Trennen der disubstituierten Verbindung von dem Reaktionsgemisch hergestellt.
[ alpha ]20_D = -57,6 DEG (c = 0,1 in 95% AcOH), F = 0,94.
FAB-MS: 3318 (MH<+>).
BEISPIEL 21:
EMI50.1
R = (2S)-2,3-Dihydroxypropyl-
Diese Verbindung wird ausgehend von dem Beispiel 20 nach dem Verfahren von Beispiel 19 hergestellt.
[ alpha ]20_D = -49,5 DEG (c = 0,06 in 95% AcOH), F = 0,89.
FAB-MS: 3234,2 (MH<+>).
BEISPIEL 22:
EMI50.2
R = N< epsilon >-Isopropyl
150 mg N< alpha >-Isocaproyl-des(1-4)-[Ala<7>,Aib<10,17>,Lys<2><4>]salmcalcitonin des Beispiels 16 und 187 mg NaBH3CN werden in einer Mischung von 3 ml Methanol, 7 ml Phosphatpuffer bei pH 5,0 und 3 ml Aceton gelöst und 16 Stunden bei 45 DEG C gerührt. Die Reaktionsmischung wird mit 50 ml Wasser verdünnt, durch eine Säule von Polystyrolabsorptionsharz filtriert, mit Wasser gewaschen und mit 60% Äthanol in Wasser eluiert. Fraktionen, die die Verbindung enthalten, werden vereinigt und lyophilisiert. Der Rückstand wird über eine C-18 Kieselgelsäule mit einem Gradienten aus Wasser und Acetonitril in 2% H3PO4 chromatographiert. Die Fraktionen, welche das reine Produkt enthalten, werden vereinigt, über eine
Säule eines basischen Ionenaustauschers in der Acetatform filtriert und mit Wasser gewaschen. Man lyophilisiert das Filtrat und erhält die Titelverbindung als Polyacetat, Polyhydrat.
[ alpha ]20_D = -76,7 DEG (c = 0,23 in 95% AcOH), F = 0,71.
FAB-MS: 3158 (MH<+>).
(Die Herstellung des Ausgangsmaterials wird in Beispiel 16 beschrieben).
BEISPIEL 23:
EMI51.1
R = N< epsilon >-Isopropyl
Diese Verbindung wird in zu Beispiel 22 analoger Weise ausgehend von N< alpha >-Isocaproyl-des(1-4)-[Ala<7>,Aib<10,17>,Lys(For)<11,18>,Lys<2><4>]salmcalcitonin hergestellt.
[ alpha ]20_D = -71,2 DEG (c = 0,11 in 95 % AcOH), F = 1,00.
FAB-MS: 3128,6 (MH<+>).
(Die Herstellung des Ausgangsmaterials wird in Beispiel 24 beschrieben).
BEISPIEL 24:
EMI52.1
Man verfährt analog zu Beispiel 7a unter Verwendung von Boc-Lys(For)-OH zur Einführung in den Stellungen 11 und 18, von Boc-Aib-OH in den Stellungen 10 und 17, und von Boc-Lys(2-chlorbenzyloxycarbonyl)-OH in Stellung 24 in der stufenweise Synthese. Durch Reinigung, wie in Beispiel 18 beschrieben, erhält man die Titelverbindung.
[ alpha ]20_D = -76,5 DEG (c = 0,12 in 95% AcOH), F = 0,90.
FAB-MS: 3088 (MH<+>).
BEISPIEL 25:
N(alpha)-Isocaproyl-Ser5-Thr-Ala7-Val-Leu-Aib10-Lys(R)11-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-Aib17-Lys(R)18-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Lys(R)24-Thr-Asn- Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2
R = N< epsilon >-(2S)-2,3-Dihydroxypropyl
Dieses Peptid wird stufenweise auf einem Polystyrolharz als Träger aufgebaut. Die Fmoc-Gruppe wird als Schutzgruppe für die alpha -Aminogruppen verwendet und die funktionellen Gruppen in den Seitenketten wie folgt geschützt: Ser(tBu), Thr(tBu), Tyr(tBu) und Glu(OtBu). N< epsilon >-(2S)-2,3-Dihydroxypropyl-lysin wird mit Verwendung von N< alpha >-Fmoc, N< epsilon >-Boc, Ne-0,0 min -Isopropyliden-(ZS)2,3-dihydroxypropyl-lysin, dessen Herstellung in Beispiel 9 angegeben ist, eingeführt.
4-(2 min ,4 min -Dimethoxyphenyl-Fmoc-aminomethyl)-phenoxy-co(polystyroldivinylbenzol)-harz 0,4 mmol/g hergestellt wie in Tetrah. Letters, 28, 3787-3790 (1987) beschrieben werden dem nachfolgenden Behandlungszyklus, Stufen 1 bis 5, unterworfen:
1) Waschen mit DMF
2) Piperidin (20%) in DMF
3) DMF
4) Mischung von HOBt, Diisopropylcarbodiimid und Fmoc-Aminosäure (je 0,8 mmol pro Gramm Ausgangsharz)
5) DMF
Die Volumen der Waschlösungen und Reagenzien betragen 5 bis 20 ml pro Gramm des Ausgangsharzes. Jede Stufe wird so oft wiederholt als notwendig ist, entweder für die vollständige Reaktion des Harzes (Stufen 2, 4) oder für die vollständige Entfernung des vorhergehenden Reagenzes vom Harz (Stufen 3, 5). Nach jedem Zyklus werden Proben des Harzes genommen und auf Vollständigkeit der Reaktion mittels des Ninhydrintestes geprüft.
Der Zyklus der Reaktionen 1) bis 5) wird für alle Aminosäurereste in der Weise wiederholt, dass die Aminosäuresequenz der Titelverbindung erhalten wird.
Im letzten Zyklus, in der Stufe 4), werden Isocapronsäure, Diisopropylcarbodiimid und 1-Hydroxybenzotriazol (für alle 3,5 mmol pro g des Ausgangsharzes) in DMF dem Harz zugegeben. Nach 15 Stunden wird das Harz mit DMF und DCM gewaschen und getrocknet.
Das Peptidharz (1 g) wird in einer Mischung von 5 % Wasser in TFA suspendiert. Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur, werden die Harzbestandteile abfiltriert und mit 95% TFA gewaschen. Das Produkt wird von den vereinigten Filtraten durch Zugabe von Ether ausgefällt, filtriert, mit Ether gewaschen und getrocknet. Das Produkt wird auf einer C-18-Kieselgelsäule mit einem Gradienten von Acetonitril in 2% H3PO4 chromatographiert. Fraktionen, welche die Verbindung in reiner Form enthalten, werden vereinigt, durch ein basisches Ionenaustauscherharz in Acetatform filtriert und lyophilisiert. Die Titelverbindung wird als Polyacetat, Polyhydrat erhalten.
[ alpha ]20_D = -73 DEG (c = 0,36 in 95% AcOH).
F = 0,91.
FAB-MS: 3253,1 (MH+).
Abkürzungen:
Lys(For) = N epsilon -Formyl-lysin
Aib = alpha -Amino-isobuttersäure
BOBt = 1-Hydroxybenzotriazol
Die erfindungsgemässen Verbindungen und die physiologisch verträglichen Säureadditionssalze bzw. Komplexe dieser Verbindungen weisen im Tierversuch interessante pharmakodynamische Eigenschaften auf. Sie können daher als Arzneimittel verwendet werden.
Die erfindungsgemässen Calcitoninverbindungen, insbesondere die Verbindungen der Formel X, senken den Calciumplasmaspiegel und bewirken als Antagonisten des Parathormons eine positive Calciumbilanz im Knochen.
Die hypocalcämische Wirkung der neuen Verbindungen kann in bekannter Weise, z.B. gemäss der Methode von M. Azria et al., berichtet beim Calcitonin 1984 Symposium, 24. Oktober, Mailand, und publiziert als "Short Communication" in der "Current Clinical Practice Series" Nr. 42, Excerpta Medica 1986, p. 104, gemessen werden. Bei dieser Methode wird eine Ca<2><+>-ion selektive Elektrode verwendet, um kontinuierlich das Gehalt an Calcium-ionen im Blut junger Kaninchen zu messen. Die Verbindungen werden i.v. verabreicht in einer Dosis von 0,02 bis ca. 20 mu g/kg. Die Messungen werden während 5 bis 10 Stunden durchgeführt und die "area under the curve" berechnet.
Die Verbindungen können auch in anderen Tests, z.B. im hypocalcämischen Standardtest von M. Kumar et al., J. Endocrinology (1965), 33, p. 469, bei Ratten und in gleicher Dosierung geprüft werden. Eine hypocalcämische Aktivität von 50 bis 7000 internationalen Einheiten pro mg wird in diesem Test für die erfindungsgemässen Verbindungen gemessen.
Die erfindungsgemässen Verbindungen sind somit indiziert bei allen Zuständen, bei welchen eine Senkung des Plasmacalciumspiegels bzw. Beeinflussung des Knochenstoffwechsels erwünscht ist, z.B. Hypercalcämien infolge Mangels des endogenen Thyreocalcitonins durch Ausfall von Schilddrüsengewebe oder Hyper funktion der Nebenschilddrüsen. Sie sind ferner indiziert bei allen Knochenaffektionen, die auf einem vermehrten Abbau beruhen oder bei welchen eine Calciumfixation im Knochen erwünscht ist, z.B. Osteoporose verschiedener Genese (z.B. postklimakterisch, posttraumatisch, bedingt durch Corticosteroidtherapie oder Inaktivität, bei malignen Erkrankungen usw.), Frakturen, Osteomalacie, Rachitis-und renal bedingte Osteodystrophie bei Schmerzen, z.B.
Knochenschmerzen zusammenhängend mit Osteoporose, neurodystropischen Krankheiten, Krankheit von Paget, sowie insbesondere zur Kombinationstherapie mit Calcium bzw. Phosphat bzw. Fluorid, bzw. einem oder mehreren Steroidhormonen bzw. Parathormon oder einem bioaktiven Fragment oder Analogon davon, bzw. Kombinationen davon.
Für die oben erwähnten Verwendungen beträgt die Tagesdosis etwa 2 mu g bis ca. 20 mg einer erfindungsgemässen Calcitoninverbindung, die als Einheitsdosis einmal pro Tag oder gewünschtenfalls jeden zweiten oder dritten Tag in Tagesdosen von ca. 0,5 mu g bis ca. 10 mg oder in Retardform verabreicht werden können.
Die erfindungsgemässen Calcitoninverbindungen hemmen auch die Pankreassekretion. Diese Hemmung kann in Tierversuchen z.B. mit der Methode beschrieben in Scand. J. Gastroint. 6, 423 (1975) durch S.J. Konturek et al. in gleicher Dosierung wie oben angegeben nachgewiesen werden.
Die erfindungsgemässen Verbindungen können daher z.B. auch bei akuter Pankreatitis und gastro-intestinalen Störungen, wie Geschwüren, Verwendung finden.
Für diese Verwendungen beträgt die Tagesdosis etwa 2 mu g bis ca. 20 mg einer erfindungsgemässen Calcitoninverbindung, die als Einheitsdosis einmal pro Tag oder gewünschtenfalls in Teildosen bis 4 mal täglich von ca. 0,5 mu g bis ca. 10 mg oder in Retardform verabreicht werden können.
Bevorzugt ist die Verbindung des Beispiels 11.
Die erfindungsgemässen LHRH-Antagonisten, besonders die Verbindungen der Formel XI, hemmen auch die Ausscheidung von Luteohormon, beispielsweise wie durch Hemmung der Ovulation bei Tieren gezeigt werden kann. Dieser Versuch wird unter Anwendung der in Experientia 30, 1174-1176 (1974) von M. Marko und E. Flückiger beschriebenen Testmethode bestimmt:
Hierzu werden erwachsene weibliche Ratten vom Stamm Ivanovas Wistar (Sprague Dawley, Iva: SDIV, 200 bis 250 g) unter Standardbedingungen gehalten: Das Licht ist 14 Stunden an (nämlich von 4 Uhr bis 18 Uhr), die Temperatur beträgt 24 DEG C, die relative Feuchtigkeit liegt bei 55 bis 60%, die Tiere erhalten Futter und Wasser ad libitum. Tieren mit regelmässigen 4-tägigen Zyklen verabreicht man am Tag des Eisprungs um 13 Uhr die jeweilige Verbindung durch subkutane Injektion oder auf oralem Weg. Am nächsten Tag tötet man die Tiere um 9 Uhr früh und zählt die Eier in beiden Eileitern mittels eines Seziermikroskops aus. Als Ovulationshemmung gilt nur, wenn keine Eier gefunden werden. Man bestimmt auch die mittlere Anzahl an Eiern pro ovulierender Ratte bei jeder Behandlungsgruppe.
Die erfindungsgemässen LHRH-Antagonisten sind im allgemeinen in einem Bereich von etwa 0,0005 bis etwa 10 mg pro kg wirksam.
Die die Ausscheidung von Luteohormon hemmende Wirkung dieser LHRH-Antagonisten kann auch in vitro wie folgt untersucht werden:
Es werden zunächst Kulturen von Pituitärzellen unter Anwendung des in Methods in Enzymology 37, 82-93 (1975) beschriebenen Verfahrens von W. Vale und G. Grant oder des bereits vorher in Life Sciences, 33, 233-240 (1983) von M. Marko und D. Römer beschriebenen Verfahrens zubereitet. Die Primärkulturen werden 4 Tage bei 37 DEG C in einem Inkubator gehalten. Hierauf werden die Zellen gewaschen und 3 Stunden in einem Medium bebrütet, das LHRH oder die Versuchsverbindung enthält. Am Ende der Inkubation wird die überstehende Flüssigkeit entfernt und durch einen speziellen Radioimmunversuch auf ihren Gehalt an LH geprüft. Bei diesem Versuch erweisen sich die LHRH-Antagonisten im allgemeinen in einem Konzentrationsbereich unter 10<-><7> M als wirksam.
Die erfindungsgemässen LHRH-Antagonisten sind somit indiziert für die Behandlung von Zuständen, wo eine Unterdrückung der gonadotropischen Ausscheidung medizinisch gewünscht ist, beispielsweise Pubertas praecox, Brustkrebs, Prostata Hypertrophie, Prostatakrebs, Endometriosis und Gonadotropin ausscheidende pituitäre Tumoren, und zur Ovulationshemmung bei Frauen und Spermatogenesishemmung bei Männern.
Für diese Verwendungen beträgt die Tagesdosis etwa 10 mu g bis 100 mg eines erfindungsgemässen LHRH-Antagonisten, die gewünschtenfalls in unterteilten Dosen 2- bis 4-mal täglich in Einheitsdosierungsform von etwa 2,5 mu g bis 50 mg Wirkstoff oder in Retardform zur Anwendung gelangen.
Bevorzugt ist die Verbindung des Beispiels 4.
Die erfindungsgemässen Verbindungen können in jeder pharmazeutisch annehmbaren Form verabfolgt werden, wie in freier Form, oder in Form eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes oder Komplexes. Solche Salze und Komplexe können auf an sich bekannte Weise hergestellt werden und besitzen eine Wirkung, die sich in derselben Grössenordnung bewegt wie die freien Verbindungen. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung der Erfindung in freier Form oder in Form eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes oder Komplexes zusammen mit einem pharmazeutischen Träger oder Verdünnungsmittel enthält. Solche Zusammensetzungen können auf an sich bekannte Weise hergestellt werden.
Die erfindungsgemässen Verbindungen können nach jedem herkömmlichen Weg verabfolgt werden, beispielsweise parenteral, beispielsweise in Form injizierbarer Lösungen oder Suspensionen, oder enteral, vorzugsweise oral, beispielsweise in Form von Tabletten oder Kapseln, nasal oder in Form von Suppositorien.
In Übereinstimmung mit dem Vorstehenden sieht die vorliegende Erfindung die Anwendung einer Verbindung der Erfindung, z.B. ein Calcitoninpeptid oder ein LHRH-Antagonist wie definiert, beispielsweise eine Verbindung der Formel X oder XI, oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes oder Komplexes als Pharmazeutika vor.
Eine Gruppe von erfindungsgemässen Verbindungen besteht aus Calcitoninen, die in Stellung 24 eine in alpha -Stellung durch einen omega -Amino-C1-6alkylrest weiter substituierte alpha -Aminosäure trägt und mindestens eine Formylgruppe, vorzugsweise in Stellung 24, enthält, in freier Form oder in Form eines Salzes oder Komplexes.
Eine weitere Gruppe von erfindungsgemässen Verbindungen besteht aus Calcitoninen die in Stellung 24 eine in alpha -Stellung durch einen omega -Amino-C1-6alkylrest weiter substituierte alpha -Aminosäure trägt und mindestens einen Zuckerrest, vorzugsweise in Stellung 24, enthält, in freier Form oder in Form eines Salzes oder Komplexes.
Eine weitere Gruppe von erfindungsgemässen Verbindungen besteht aus Calcitoninen die in Stellung 24 eine in alpha -Stellung durch einen omega -Amino-1-6Calkylrest weiter substituierte alpha -Aminosäure trägt und mindestens eine Formylgruppe und einen Zuckerrest, vorzugsweise in Stellung 24, enthält, in freier Form oder in Form eines Salzes oder Komplexes.
Eine weitere Gruppe von erfindungsgemässen Verbindungen betrifft LHRH-Antagonisten, die in Stellung 8 eine alpha -Aminosäure tragen, welche in alpha -Stellung durch eine in omega -Stellung durch einen Amadori-Zuckerrest substituierte omega -Amino-C1-6alkylseitenkette trägt, in freier Form oder in Form eines Salzes oder Komplexes.
In einer Reihe von spezifischen Ausführungen sieht die vorliegende Erfindung auch ein Calcitoninpeptid vor, das an eine Aminogruppe hiervon gebunden enthält mindestens
a) einen Zuckerrest, und/oder
b) einen Rest der Formel (b1) oder (b2) wie oben definiert,
mit der Massgabe, dass, wenn das Calcitoninpeptid mindestens einen Zuckerrest a) enthält, dieser Zuckerrest an eine omega -Aminogruppe einer in Stellung 24 stehenden omega -aminosubstituierten Seitenkette durch eine Kupplung gebunden ist, die keiner direkten N-glykosidischen Bindung entspricht.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Calcitoninpeptid, das
mit der Massgabe, dass wenn der LHRH-Antagonist mindestens einen Zuckerrest a) enthält, dieser Zuckerrest ein Amadori-Zuckerrest ist, gebunden an eine omega -Aminogruppe einer in Stellung 8 stehenden omega -aminosubstituierten Seitenkette durch eine Kupplung, die keiner direkten N-glykosidischen Bindung entspricht.